JP4768908B2

JP4768908B2 - Protein kinase inhibitor

Info

Publication number: JP4768908B2
Application number: JP2000299029A
Authority: JP
Inventors: 俊雄田中
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2020-09-29
Also published as: JP2002104973A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヌクレオチドアルキル誘導体の新しい用途に関する。さらに詳しく言えば、ヌクレオチドアルキル誘導体を含むプロテインキナーゼ阻害剤、および、制癌剤として使用するための該阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロテインキナーゼ（タンパク質リン酸化酵素）は、タンパク質のセリン、スレオニン、あるいはチロシンの水酸基をリン酸化する酵素であり、細胞の増殖や分化などのシグナル伝達を担う重要な酵素群である。これまでに２００種以上のプロテインキナーゼをコードする遺伝子がクローニングされているが、プロテインキナーゼは細胞内の殆どあらゆる場所に存在しており、細胞の増殖や分化あるいは機能発現などの様々な局面において調節や制御に深く関与しているものと考えられている。
【０００３】
近年、癌の分子生物学的研究の進展により、細胞の癌化に関与する遺伝子が明らかにされ、癌遺伝子の多くがプロテインキナーゼをコードしていることが判明した。
扁平上皮癌ではＥｒｂＢ−１（ＥＧＦ−Ｒ）が、乳腺癌、胃腺癌、卵巣癌ではＥｒｂＢ−２などのレセプター型チロシンキナーゼが増幅することが認められており、癌化との関係が示唆されている。乳癌の場合、チロシンキナーゼの増幅を認めた患者は、増幅のない患者に比べ明らかに予後不良であることから、これらレセプター型チロシンキナーゼは癌治療において重要な標的となると考えられる（Toi, M. et al., Eur. J. Cancer, 第26巻, 722頁, 1990年、Yoneda, T. et al.,Cancer. Res., 第51巻, 4430頁, 1991年）。
また、ヒトＣＭＬ（細胞媒介性リンパ球傷害反応）の９５％以上、ＡＬＬ（急性リンパ性白血病）では約２０％以上の症例で、９番と２２番の染色体長腕間の相互転座の結果、一方の染色体（Ｐｈ１染色体）上でａｂｌ遺伝子とｂｃｒ遺伝子の融合が起こることが知られている。このキメラ遺伝子産物は活性化されたチロシンキナーゼである。
【０００４】
非レセプター型チロシンキナーゼも様々な癌で活性化していることが知られており、例えば、慢性骨髄性白血病のＢｃｒ−ａｂｌや急性リンパ性白血病のＪａｋ−２、あるいは大腸癌などのｃ−Ｓｒｃやｃ−Ｙｅｓチロシンキナーゼなどが標的になると考えられており、それらに選択性を有する阻害剤も報告されている（Okabe, M. et al., Leukemia Lymph., 第12巻, 41頁, 1993年、Clark, J. W., Int. J. Cancer, 第65巻, 186頁, 1996年、Meydan, N. et al., Nature, 第379巻, 645頁, 1996年）。
【０００５】
癌遺伝子の活性化にしろ、癌制御遺伝子の不活性化にしろ、過剰あるいは異常なシグナルが核へ流入することが、癌化と密接に関与している。したがって、癌細胞で過剰に活性が発現されているシグナル伝達路に干渉する薬物は、新規な制癌剤として有用である。プロテインキナーゼは、そのような分子標的の一つであり、プロテインキナーゼ阻害活性を有する化合物の探索によって得られた物質は、制癌剤として有用である。
癌は、我が国では死亡率第１位の疾患である。近年、手術療法や放射線療法といった局所療法の進歩が癌患者の生存率の向上に寄与しつつあるものの、癌は転移により全身に広がった時点で発見されることも多く、癌治療方法の確立には、かかる全身性疾患となった癌への対応が急務である。この点で、制癌剤を中心とする化学療法の開発に寄せられる期待は、ますます高まっている。
また、癌細胞に関する分子生物学的アプローチの進展は、従来明らかにされていなかった制癌剤の作用機構の解明に重要な指針を与えてきている。
【０００６】
これらのことを契機として、プロテインキナーゼ阻害活性を有する制癌剤のスクリーニングが行われ、その結果、これまでにハービマイシンＡ（Uehara, Y. et al., Jpn. J. Cancer res., 第76巻, 672頁, 1985年）、アーブスタチン（Umezawa, H. et al., J. Antibiot., 第39巻, 170頁, 1986年）、ゲニステイン（Ogawara, H. et al., J. Antibiot., 第39巻, 606頁, 1986年）などの有望な医薬品候補物質が見出されるに至った。
【０００７】
一方、分子内にフッ素を有するフルオロウラシル化合物が制癌活性を有することは、これまでによく知られている。また、ウリジン５’−アルキルホスフェート類が酵母菌のαおよびαハプロイド（１倍体）細胞間の有性凝集を細胞の成長に影響を与えることなく阻害したり（FEMS Microbiol. Lett., 第147巻, 17頁, 1997年）、抗真菌活性を有する（特開平１０−２１８７７８号公報）ことが報告されている。さらに、本発明者らは、ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート類がカルシウム拮抗作用を有し、血小板凝集抑制剤として有用であることを見出している（特開２０００−２４７８９１号公報）。しかしながら、フッ素を含まないヌクレオシド５’−アルキルホスフェート誘導体についてのプロテインキナーゼ阻害活性は報告されておらず、該誘導体が制癌剤として有用であるとの報告もない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、制癌剤として有用な新規なプロテインキナーゼ阻害剤を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、種々のヌクレオシド誘導体について鋭意研究を重ねた結果、ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート誘導体、とりわけ、ウリジン５’−アルキルホスフェート誘導体（ＵＭＰＣ）が顕著なプロテインキナーゼ阻害活性を有する事実を見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（１）式（Ｉ）：
【００１０】
【化２】

（式中、Ｒは直鎖または分岐鎖状アルキル基を示す。）で表されるヌクレオチドアルキル誘導体を含むプロテインキナーゼ阻害剤、（２）Ｒが炭素数３０を超えないアルキル基である、上記（１）記載のプロテインキナーゼ阻害剤、（３）Ｒが炭素数４〜２４のアルキル基である、上記（２）記載のプロテインキナーゼ阻害剤、（４）Ｒが炭素数１６のアルキル基である、上記（３）記載のプロテインキナーゼ阻害剤、（５）ヌクレオチドアルキル誘導体が遊離形または生体内で遊離形を与え得る医薬的に許容される任意形で使用される、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載のプロテインキナーゼ阻害剤、（６）制癌剤として使用するための、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載のプロテインキナーゼ阻害剤を提供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
上記式（Ｉ）において、Ｒで示されるアルキル基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれであってもよい。その炭素数は、通常３０を超えることはなく、好ましくは４〜２４、更に好ましくは１６〜２０である。このようなアルキル基の具体例としては、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、エイコシルなどの直鎖状アルキル、または、ゲラニル、ファルネシルなどの分岐鎖状アルキルを挙げることができる。現時点で最も好ましいと考えられるものは、Ｒが炭素数１６のｎ−ヘキサデシル基を表す場合、すなわちウリジン５’−ヘキサデシルホスフェート（ＵＭＰＣ１６）である。
【００１２】
有効成分としてのヌクレオチドアルキル誘導体は、遊離形のみならず、医薬的に許容される限り、水和物、塩、エステルなど、生体内で遊離形を与えることのできる任意の形で使用されてよい。したがって、以下の記載において、式（Ｉ）の化合物は、遊離形のみならず、そのような医薬的に許容される任意形をも包括して意味するものとする。
【００１３】
上記式（Ｉ）の化合物であるヌクレオチド５’−アルキル誘導体は、一般に対応するヌクレオチド５’−モノホスフェート（式（Ｉ）において、Ｒ＝Ｈに相当する化合物）から自体常套の方法（FEBS Lett., 第94巻, 339-341頁, 1978年、Life Sci., 第43巻, 437-444頁, 1988年、FEBS Lett., 第352巻, 353-355頁, 1994年）により合成することができる。例えば、ウリジン５’−アルキル誘導体の場合、ウリジン５’−モノホスフェートおよび種々の直鎖状または分岐鎖状アルキルアルコールをｔ−ブチルアルコールに溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で反応させることにより、製造することができる。反応温度は、溶媒の種類により異なるが、通常６０〜１００℃、好ましくは７０〜９０℃であり、反応時間は、反応温度により異なるが、通常２〜２０時間、好ましくは６〜８時間である。
【００１４】
本明細書において「癌」とは、その最も広い意味で使用するものであり、腫瘍、新生組織形成、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫などを包含する。また、本明細書において「制癌」とは、癌性病変の予防、癌性病変の進行の遅延、癌性病変の生成の抑制、癌性病変の減少、または癌性病変の除去を意味する。
本明細書において「プロテインキナーゼ」とは、他のタンパク質をリン酸化する酵素の一群を意味し、チロシンキナーゼ、カルモジュリンキナーゼＩＩＩ、Ａキナーゼ、Ｃキナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、セリン／トレオニンキナーゼなどが含まれる。
【００１５】
癌細胞は、正常細胞に比べ急速な増殖をするのが特徴と考えられている。制癌剤は、この特徴を利用して増殖性の細胞に対し毒性を持つ薬剤を用いる化学療法である。本発明のプロテインキナーゼ阻害剤は、癌細胞の増殖を抑制したり、アポトーシスを誘導する制癌剤として用いることができ、良性腫瘍並びに肉腫、白血病、リンパ腫およびがん腫などの悪性腫瘍（癌）等の治療のため、通常全身的または局所的に、一般的には経口または非経口の形で投与される。
本発明の式（Ｉ）の化合物を投与する際には、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射剤、点滴剤、口腔剤、経直腸剤、あるいは経皮投与により、すなわち薬剤を適用するのに都合のよい一般的な方法で投与することができる。
【００１６】
経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれ、カプセル剤には、軟カプセル剤および硬カプセル剤が含まれる。液体組成物には、例えば、シロップ、懸濁液、エマルジョンが含まれる。
固体組成物は、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤と混合される。組成物は、常法にしたがって、不活性な希釈剤以外の一般的な添加物、例えば、潤滑剤、崩壊剤、安定化剤、溶解補助剤を含有していてもよい。
【００１７】
錠剤は、化合物をそのまま、または賦形剤、結合剤、崩壊剤若しくはその他の適当な担体を加えて均等に混和し、慣用的な固体処方の製造方法により製造することができる。このような担体の例は、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、ラクトース、シュークロースおよびセルロースを包含する。また、必要に応じて着色剤、矯味剤などを加えることができ、さらに、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸溶性のフィルムで剤皮を施してもよいし、また２以上の層で皮膜してもよい。
【００１８】
カプセル形である組成物は、慣用的なカプセル化操作を用いて製造できる。例えば、活性成分含有のペレットを標準担体の使用により調製し、次いで硬ゼラチンカプセルに充填することができる。別法として、いずれか適当な医薬担体、例えば、水性ガム、セルロース、シリケートまたは油を用いて分散液または懸濁液を調製し、ついで該分散液または懸濁液を軟ゼラチンカプセルに充填することができる。
【００１９】
経口投与のための液体組成物は、薬学的に許容される懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般に用いられる不活性な希釈剤を含んでいてもよい。このような組成物は、不活性な希釈剤以外に必要に応じて安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、分散安定剤またはその他の適当な添加剤を加えることができる。
【００２０】
本発明による非経口投与のための注射剤は、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳剤を包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤は、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤と混合される。水性の希釈剤としては、例えば、注射用水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、または生理食塩水とブドウ糖溶液の混合液が挙げられる。非水性の希釈剤としては、例えば、オリブ油、ゴマ油、ダイズ油、ツバキ油、ナタネ油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油のような植物油、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール類のような有機溶媒が挙げられる。このような組成物は、さらに抗酸化剤、キレート剤、緩衝剤、水溶性有機溶剤などの安定化剤、無痛化剤、保存剤、等張化剤、乳化剤、溶解補助剤のような添加剤を含んでいてもよい。
【００２１】
抗酸化剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸など、キレート剤としては、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸など、緩衝剤としてはクエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩などを挙げることができる。
懸濁剤、乳剤の調製においてはアラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ポリソルベート８０（登録商標）を初めとする多くの乳化剤が用いられる。
これらの非経口投与のための注射剤は、加熱法（乾熱法、高圧蒸気法、流通蒸気法、煮沸法、間けつ法）、ろ過法、照射法（放射線法、紫外線法、高周波法）などの公知の滅菌手段によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し（例えば、凍結乾燥法等により）、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用するような、用時溶解型の製剤とすることもできる。
【００２２】
本発明の式（Ｉ）の化合物の投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人患者一人あたり、一回につき、１００μｇから４００ｍｇの範囲で、一日一回から数回経口投与されるか、または、成人患者一人あたり、一回につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回非経口投与される。また、一日あたり４００ｍｇまでの用量で、連続的静脈内注入により投与してもよい。かくして、経口投与による一日の全用量は、１００μｇから２０００ｍｇの範囲にあり、非経口投与による一日の全用量は１０μｇ〜４００ｍｇの範囲にある。適当には、該化合物を連続的治療の期間中、例えば、一週間またはそれ以上の期間投与する。もちろん、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を超えて必要な場合もある。なお、本発明において、式（Ｉ）の化合物をプロテインキナーゼの阻害を目的として投与する場合、明らかな毒性は認められない。
以下に実施例において、製造例、製剤例および試験例をあげて本発明を詳しく説明するが、これらは単なる例示であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２３】
【実施例】
製造例：ウリジン５’−ヘキサデシルホスフェート（Ｒ＝Ｃ₁₆Ｈ₃₃：ＵＭＰＣ１６）の調製
ウリジン５’−モノホスフェート（６００μｍｏｌ）およびヘキサデシルアルコール（６ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのｔ−ブチルアルコールに溶解した後、３ｍｍｏｌのジシクロヘキシルカルボジイミドを加え、８０℃で２０時間加熱した。反応終了後、生成した沈殿を濾別し、ｔ−ブチルアルコールを減圧下に除去した。残渣をヘキサンおよびアセトンの混液（１：１）で数回洗浄し、乾燥した後、クロロホルムおよびメタノールの混液（９５：５）に溶解した。これを同溶液にて作成したシリカゲルカラムに負荷し、カラムを同液で充分洗浄してジシクロカルボジイミドを流出させた。以後、メタノールの濃度を順次、上昇させることによって、ウリジン５’−ヘキサデシルホスフェートを溶出した。溶出液から溶媒を減圧下に除去することにより、白色の沈殿を得た。対ウリジン５’−モノホスフェートあたりの収率は、３２．４％であった。
【００２４】
製剤例１：静脈注射剤
式（Ｉ）の化合物１〜４０ｍｇ
緩衝剤ｐＨ約７まで
溶媒１００ｍＬまで
上記の製剤例１において、緩衝剤の具体例としてはクエン酸塩、リン酸塩および水酸化ナトリウム／塩酸を、溶媒の具体例としては水を挙げることができる。
【００２５】
製剤例２：錠剤
式（Ｉ）の化合物１〜４０ｍｇ
希釈剤／充填剤５０〜２５０ｍｇ
結合剤５〜２５ｍｇ
崩壊剤５〜５０ｍｇ
滑沢剤１〜５ｍｇ
上記製剤例２において、希釈剤／充填剤の具体例としては微結晶セルロース、ラクトースおよび澱粉を、結合剤の具体例としてはポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを、崩壊剤の具体例としてはナトリウム澱粉グリコレートおよびクロスポビドンを、滑沢剤の具体例としてはステアリン酸マグネシウムおよびステアリルフマル酸ナトリウムを挙げることができる。
【００２６】
製剤例３：経口用懸濁液
式（Ｉ）の化合物１〜４０ｍｇ
沈殿防止剤０．１〜１０ｍｇ
希釈剤２０〜６０ｍｇ
保存剤０．０１〜１．０ｍｇ
緩衝剤ｐＨ約５〜８まで
共溶媒０〜４０ｍｇ
香料０．０１〜１．０ｍｇ
着色剤０．００１〜０．１ｍｇ
上記製剤例３において、沈殿防止剤の具体例としてはキサンチンガムおよび微結晶セルロースを、希釈剤の具体例としてはソルビトール溶液、典型的には水を、保存剤の具体例としては安息香酸ナトリウムを、緩衝剤の具体例としてはクエン酸塩を、共溶媒の具体例としてはアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびシクロデキストリンを挙げることができる。
【００２７】
試験例１：ＵＭＰＣ１６のプロテインキナーゼ阻害活性の測定
本発明のヌクレオチドアルキル誘導体のプロテインキナーゼ阻害活性は、文部省がん特定総合がん・制がん剤スクリーニング委員会が策定した平成１１年度版「制がん剤の分子標的スクリーニング−その概要と利用法−」中の「プロテインキナーゼ阻害活性の検定」に記載の方法に基づいて、癌細胞ＮＩＨ３Ｔ３／ｖ−ｓｒｃの細胞破砕液を用いた複数のプロテインキナーゼ活性の同一ゲル上検出法（Fukazawa, H. et al., Anal. Biochem., 第212巻, 106頁, 1993年、Pei-Ming Li et al., Anticancer Res., 第13巻, 1957-1964頁, 1993年）により、検定した。
上記の実験系では、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のｖ−ｓｒｃトランスフォーマントを低張緩衝液中で破砕後、遠心、除核し、酵素液とする。これにＤＭＳＯに溶解した検体、ｃＡＭＰ、ホルボールエステル、［γ³²Ｐ］ＡＴＰを加え、２５℃で２０分間反応させる。反応停止後、リン酸化されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、オートラジオグラフィーで解析する。この方法により、Ａキナーゼ、Ｃキナーゼ、ｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼ、およびカルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩＩの少なくとも４種類のプロテインキナーゼ活性を同時に検出することができる。
活性の評価は、検体を最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬになるように加え、リン酸化の阻害の有無と阻害パターンを判定する。阻害活性が認められた場合、３段階の希釈系列を作製する。
具体的には以下のように行った。
ｖ−ｓｒｃでトランスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞を１ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＭｇＣｌ₂およびプロテアーゼ阻害剤であるアンチパイン、ロイペプチン、ペプスタチンＡをそれぞれ２５μｇ／ｍＬずつを含有する低張緩衝液中で１０分間氷冷した。膨潤した細胞を室温で２分間攪拌混合し、懸濁した。次に、２０ｍＭになるようにＨｅｐｅｓ緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ７．４）を添加した後、核を沈殿させるために５００ｇで５分間遠心分離した。上清を回収して、最終濃度が２０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭのＮａ₃ＶＯ₄、１０ｍＭのβ−グリセロホスフェート、１ｍＭのＮａＦ、および２．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質となるように調製した。除核したフラクション２０μＬに対し、種々のキナーゼ活性化剤およびＵＭＰＣ１６のＤＭＳＯ溶液を５μＬ添加した。５μＬの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（７５μＭ、１０μＣｉ）を添加してキナーゼ反応を開始させ、２５℃で１５分間インキュベートした。活性化剤の最終濃度は、ホルボールエステル（ＰＭＡ）１μＭ、ＣａＣｌ₂ １０μＭ、ＤＭＳＯ１０％（ｖ／ｖ）、ｃＡＭＰ２０μＭとした。また、ＵＭＰＣ１６の最終濃度は、０．１、１、１０、１００μｇ／ｍＬとした。反応は、４倍濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液１０μＬを添加するか、あるいは沸騰した湯浴中で５分間熱することにより終了させた。熱処理した混合物を室温で冷却し、変性したタンパク質を沈殿させるために１５，０００ｇで３０分間遠心分離した後、上清に４倍濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル用緩衝液１０μＬを混合した。リン酸化されたタンパク質を９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６ｃｍ長）を用いて分離し、オートラジオグラフィーにより可視化した。
得られた結果を表１に示した。
【００２８】
【表１】

ＰＫＡ：Ａキナーゼ、ＰＫＣ：Ｃキナーゼ、ＰＴＫ：チロシンキナーゼ、
ＣＡＭＫ：カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩＩ
＋＋：＞７０％阻害、＋：４０〜７０％阻害、−：＜４０％阻害（阻害なし）
表１に示されるように、ＵＭＰＣ１６は、濃度依存的に各種プロテインキナーゼ活性を阻害した。したがって、ＵＭＰＣ１６をはじめ、本発明の式（Ｉ）で表されるヌクレオチド５’−アルキル誘導体は、プロテインキナーゼ阻害剤として有用であり、さらに制癌剤として有用な物質であると考えられる。
【００２９】
【発明の効果】
本発明によれば、式（Ｉ）で表されるヌクレオチドアルキル誘導体を有効成分として用いることにより、新規なプロテインキナーゼ阻害剤が得られ、これは、制癌剤として有用である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to new uses for nucleotide alkyl derivatives. More particularly, it relates to protein kinase inhibitors comprising nucleotide alkyl derivatives and the inhibitors for use as anticancer agents.
[0002]
[Prior art]
Protein kinases (protein kinases) are enzymes that phosphorylate the hydroxyl groups of protein serine, threonine, or tyrosine, and are an important group of enzymes that are responsible for signal transduction such as cell growth and differentiation. So far, genes encoding more than 200 protein kinases have been cloned, but protein kinases are present almost everywhere in the cell and are regulated in various aspects such as cell proliferation, differentiation and functional expression. It is thought to be deeply involved in and control.
[0003]
In recent years, progress in molecular biological research on cancer has revealed genes involved in canceration of cells, and it has been found that many oncogenes encode protein kinases.
ErbB-1 (EGF-R) is found to be amplified in squamous cell carcinoma, and receptor tyrosine kinases such as ErbB-2 are amplified in breast, gastric and ovarian cancers, suggesting a relationship with canceration. ing. In the case of breast cancer, patients with tyrosine kinase amplification clearly have a poorer prognosis than patients without amplification, and these receptor tyrosine kinases are considered to be important targets in cancer treatment (Toi, M. et al., Eur. J. Cancer, 26, 722, 1990, Yoneda, T. et al., Cancer. Res., 51, 4430, 1991).
In addition, 95% or more cases of human CML (cell-mediated lymphocyte injury reaction) and about 20% or more cases of ALL (acute lymphocytic leukemia) result of reciprocal translocation between chromosomes 9 and 22 It is known that the fusion of the abl gene and the bcr gene occurs on one chromosome (Ph1 chromosome). This chimeric gene product is an activated tyrosine kinase.
[0004]
Non-receptor tyrosine kinases are also known to be activated in various cancers, such as Bcr-abl for chronic myeloid leukemia, Jak-2 for acute lymphoblastic leukemia, or c-Src such as colon cancer. c-Yes tyrosine kinase is considered to be a target, and inhibitors having selectivity for them are also reported (Okabe, M. et al., Leukemia Lymph., Vol. 12, p. 41, 1993) Clark, JW, Int. J. Cancer, 65, 186, 1996, Meydan, N. et al., Nature, 379, 645, 1996).
[0005]
Regardless of whether the oncogene is activated or the cancer regulatory gene is inactivated, the flow of excess or abnormal signals into the nucleus is closely related to canceration. Therefore, a drug that interferes with a signal transduction pathway in which excessive activity is expressed in cancer cells is useful as a novel anticancer agent. Protein kinases are one such molecular target, and substances obtained by searching for compounds having protein kinase inhibitory activity are useful as anticancer agents.
Cancer is the disease with the highest mortality rate in Japan. In recent years, advances in local therapies such as surgery and radiation therapy have been contributing to the improvement of the survival rate of cancer patients. However, cancer is often found when it spreads throughout the body due to metastasis. Therefore, there is an urgent need to deal with cancer that has become a systemic disease. In this respect, there are increasing expectations for the development of chemotherapy centered on anticancer drugs.
In addition, the progress of molecular biological approaches related to cancer cells has provided important guidelines for elucidating the mechanism of action of anticancer drugs, which has not been clarified so far.
[0006]
Based on these factors, screening for anticancer drugs having protein kinase inhibitory activity has been conducted. As a result, herbimycin A (Uehara, Y. et al., Jpn. J. Cancer res., Vol. 76, 672, 1985), avestatin (Umezawa, H. et al., J. Antibiot., 39, 170, 1986), genistein (Ogawara, H. et al., J. Antibiot., I. 39, 606, 1986) and other promising drug candidates have been found.
[0007]
On the other hand, it has been well known that fluorouracil compounds having fluorine in the molecule have anticancer activity. Uridine 5′-alkyl phosphates inhibit sexual aggregation between α and α haploid (haploid) cells of yeast without affecting cell growth (FEMS Microbiol. Lett., 147 Volume, p. 17, 1997), and reported to have antifungal activity (Japanese Patent Laid-Open No. 10-218778). Furthermore, the present inventors have found that nucleoside 5′-alkyl phosphates have calcium antagonistic activity and are useful as platelet aggregation inhibitors (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-247891). However, no protein kinase inhibitory activity has been reported for nucleoside 5′-alkyl phosphate derivatives that do not contain fluorine, and there is no report that the derivatives are useful as anticancer agents.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel protein kinase inhibitor useful as an anticancer agent.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies on various nucleoside derivatives in view of the above prior art, the present inventors have found that nucleoside 5′-alkyl phosphate derivatives, particularly uridine 5′-alkyl phosphate derivatives (UMPC) are prominent protein kinases. The fact that it has inhibitory activity was found, and the present invention was completed based on this finding.
That is, the present invention provides (1) Formula (I):
[0010]
[Chemical 2]

(Wherein R represents a linear or branched alkyl group), a protein kinase inhibitor comprising the nucleotide alkyl derivative represented by (2), wherein R is an alkyl group having no more than 30 carbon atoms, 1) a protein kinase inhibitor according to (3), wherein R is an alkyl group having 4 to 24 carbon atoms, (4) R is an alkyl group having 16 carbon atoms, (1) to (4), wherein the protein kinase inhibitor according to the above (3), (5) the nucleotide alkyl derivative is used in a free form or in any pharmaceutically acceptable form capable of giving a free form in vivo. (6) The protein kinase inhibitor according to any one of (1) to (5) above for use as an anticancer agent. .
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the above formula (I), the alkyl group represented by R may be either linear or branched. The carbon number usually does not exceed 30, preferably 4 to 24, and more preferably 16 to 20. Specific examples of such alkyl groups include linear alkyl such as butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, decyl, undecyl, dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, eicosyl, or geranyl, farnesyl, etc. Mention may be made of branched alkyl. What is considered to be most preferable at the present time is when R represents an n-hexadecyl group having 16 carbon atoms, that is, uridine 5′-hexadecyl phosphate (UMPC16).
[0012]
The nucleotide alkyl derivative as an active ingredient may be used not only in the free form but also in any form capable of giving the free form in vivo, such as a hydrate, salt, ester, etc. as long as it is pharmaceutically acceptable. . Accordingly, in the following description, the compound of formula (I) is intended to mean not only the free form but also any such pharmaceutically acceptable form.
[0013]
Nucleotide 5′-alkyl derivatives that are compounds of formula (I) are generally prepared from the corresponding nucleotide 5′-monophosphate (compound corresponding to R = H in formula (I)) by a conventional method (FEBS Lett. 94, 339-341, 1978, Life Sci., 43, 437-444, 1988, FEBS Lett., 352, 353-355, 1994). it can. For example, in the case of a uridine 5′-alkyl derivative, it is produced by dissolving uridine 5′-monophosphate and various linear or branched alkyl alcohols in t-butyl alcohol and reacting them in the presence of dicyclohexylcarbodiimide. can do. The reaction temperature varies depending on the type of solvent, but is usually 60 to 100 ° C., preferably 70 to 90 ° C., and the reaction time varies depending on the reaction temperature, but is usually 2 to 20 hours, preferably 6 to 8 hours. .
[0014]
In the present specification, “cancer” is used in the broadest sense, and includes tumor, neoplasia, carcinoma, sarcoma, leukemia, lymphoma and the like. In addition, the term “anticancer” in the present specification means prevention of cancerous lesions, delay of progression of cancerous lesions, suppression of generation of cancerous lesions, reduction of cancerous lesions, or removal of cancerous lesions. .
As used herein, “protein kinase” refers to a group of enzymes that phosphorylate other proteins, and includes tyrosine kinase, calmodulin kinase III, A kinase, C kinase, MAP kinase, serine / threonine kinase, and the like.
[0015]
Cancer cells are thought to be characterized by rapid proliferation compared to normal cells. Anticancer drugs are chemotherapy using drugs that are toxic to proliferating cells using this feature. The protein kinase inhibitor of the present invention can be used as an anticancer agent that suppresses the proliferation of cancer cells or induces apoptosis, such as benign tumors and malignant tumors (cancers) such as sarcomas, leukemias, lymphomas, and carcinomas. For treatment, it is usually administered systemically or locally, generally in oral or parenteral form.
When administering the compound of formula (I) of the present invention, solid compositions, liquid compositions and other compositions for oral administration, injections, infusions, buccal preparations, oral preparations for parenteral administration. It can be administered rectally or transdermally, i.e. in a general manner convenient for the application of the drug.
[0016]
Solid compositions for oral administration include tablets, pills, capsules, powders, granules and the like, and capsules include soft capsules and hard capsules. Liquid compositions include, for example, syrups, suspensions, and emulsions.
In the solid composition, one or more active substances are mixed with at least one inert diluent. The composition may contain a general additive other than an inert diluent, for example, a lubricant, a disintegrant, a stabilizer, and a solubilizing agent, according to a conventional method.
[0017]
Tablets can be produced by a conventional solid formulation production method by mixing the compounds as they are, or by adding excipients, binders, disintegrants or other suitable carriers, and mixing them evenly. Examples of such carriers include magnesium stearate, starch, lactose, sucrose and cellulose. In addition, a colorant, a corrigent and the like can be added as necessary, and the coating may be applied with a gastric or enteric film such as sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, etc. Further, it may be coated with two or more layers.
[0018]
Compositions that are in capsule form can be prepared using conventional encapsulation procedures. For example, pellets containing the active ingredient can be prepared by use of a standard carrier and then filled into hard gelatin capsules. Alternatively, a dispersion or suspension is prepared using any suitable pharmaceutical carrier such as aqueous gum, cellulose, silicate or oil and then the dispersion or suspension is filled into soft gelatin capsules. Can do.
[0019]
Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable suspensions, emulsions, syrups, elixirs, and the like, and may include commonly used inert diluents. In addition to the inert diluent, such a composition may contain a stabilizer, a buffering agent, a corrigent, a preservative, a dispersion stabilizer or other appropriate additives as required.
[0020]
Injections for parenteral administration according to the present invention include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions. In aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, one or more active substances are mixed with at least one inert diluent. Examples of the aqueous diluent include water for injection, physiological saline, Ringer's solution, glucose solution, or a mixed solution of physiological saline and glucose solution. Non-aqueous diluents include, for example, olive oil, sesame oil, soybean oil, camellia oil, rapeseed oil, vegetable oils such as corn oil, peanut oil, and cottonseed oil, and organic solvents such as ethanol, propylene glycol, and polyethylene glycols. Can be mentioned. Such a composition further includes additives such as antioxidants, chelating agents, buffering agents, stabilizers such as water-soluble organic solvents, soothing agents, preservatives, isotonic agents, emulsifiers, and solubilizing agents. May be included.
[0021]
Examples of the antioxidant include sodium pyrosulfite and ascorbic acid, examples of the chelating agent include EDTA, thioglycolic acid, and thiolactic acid, and examples of the buffering agent include citrate, acetate, and phosphate.
In preparing suspensions and emulsions, many emulsifiers such as gum arabic, tragacanth, gelatin and polysorbate 80 (registered trademark) are used.
These injections for parenteral administration include heating methods (dry heat method, high pressure steam method, flow steam method, boiling method, intermittent method), filtration methods, irradiation methods (radiation method, ultraviolet method, high frequency method). It is sterilized by known sterilization means such as. They also produce a sterile solid composition (for example, by freeze-drying method) and are dissolved in sterile water for injection or other solvent before use. You can also
[0022]
The dose of the compound of formula (I) of the present invention varies depending on age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc., but is usually in the range of 100 μg to 400 mg per adult patient. It is administered orally once to several times a day or parenterally once to several times a day in the range of 10 μg to 100 mg per adult patient. It may also be administered by continuous intravenous infusion at doses up to 400 mg per day. Thus, the total daily dose by oral administration is in the range of 100 μg to 2000 mg, and the total daily dose by parenteral administration is in the range of 10 μg to 400 mg. Suitably the compound is administered for a period of continuous therapy, for example for a week or more. Of course, since the dose varies depending on various conditions, an amount smaller than the above dose may be sufficient or may be necessary beyond the range. In the present invention, when the compound of formula (I) is administered for the purpose of inhibiting protein kinase, no obvious toxicity is observed.
In the following Examples, the present invention will be described in detail with reference to Production Examples, Formulation Examples and Test Examples, but these are merely examples, and the present invention is not limited thereto.
[0023]
【Example】
Preparation Example: Preparation of uridine 5′-hexadecyl phosphate (R═C ₁₆ H ₃₃ : UMPC16) Uridine 5′-monophosphate (600 μmol) and hexadecyl alcohol (6 mmol) were dissolved in 20 mL of t-butyl alcohol. 3 mmol of dicyclohexylcarbodiimide was added and heated at 80 ° C. for 20 hours. After completion of the reaction, the produced precipitate was filtered off, and t-butyl alcohol was removed under reduced pressure. The residue was washed several times with a mixture of hexane and acetone (1: 1), dried, and then dissolved in a mixture of chloroform and methanol (95: 5). This was loaded onto a silica gel column prepared with the same solution, and the column was sufficiently washed with the same solution to discharge dicyclocarbodiimide. Thereafter, uridine 5′-hexadecyl phosphate was eluted by sequentially increasing the concentration of methanol. A white precipitate was obtained by removing the solvent from the eluate under reduced pressure. The yield per uridine 5′-monophosphate was 32.4%.
[0024]
Formulation Example 1: Intravenous Formula Compound (I) 1-40 mg
Buffering agent Up to about pH 7 Solvent up to 100 mL In Formulation Example 1 above, specific examples of the buffer include citrate, phosphate and sodium hydroxide / hydrochloric acid, and specific examples of the solvent include water. .
[0025]
Formulation Example 2: Compound 1 to 40 mg of tablet formula (I)
Diluent / filler 50-250mg
Binder 5-25mg
Disintegrant 5-50mg
Lubricant 1-5mg
In Formulation Example 2 above, specific examples of the diluent / filler are microcrystalline cellulose, lactose and starch, specific examples of the binder are polyvinylpyrrolidone and hydroxypropylmethylcellulose, and specific examples of the disintegrant are sodium starch glycosyl. Specific examples of the lubricant and crospovidone include magnesium stearate and sodium stearyl fumarate.
[0026]
Formulation Example 3: Oral suspension compound of formula (I) 1 to 40 mg
Precipitation inhibitor 0.1-10mg
Diluent 20-60mg
Preservative 0.01-1.0 mg
Buffering agent Co-solvent 0-40 mg up to pH about 5-8
Fragrance 0.01-1.0mg
Colorant 0.001-0.1mg
In Formulation Example 3, xanthine gum and microcrystalline cellulose are used as specific examples of the precipitation inhibitor, sorbitol solution, typically water, is used as a specific example of the diluent, and sodium benzoate is used as a specific example of the preservative. Specific examples of the buffer include citrate, and specific examples of the cosolvent include alcohol, propylene glycol, polyethylene glycol, and cyclodextrin.
[0027]
Test Example 1: Measurement of protein kinase inhibitory activity of UMPC16 The protein kinase inhibitory activity of the nucleotide alkyl derivative of the present invention was determined by the 1999 edition of the Molecular protein screening using cancer cell NIH3T3 / v-src using a cell lysate based on the method described in “Protein Kinase Inhibitory Activity Assay” On-gel detection of activity (Fukazawa, H. et al., Anal. Biochem., 212, 106, 1993, Pei-Ming Li et al., Anticancer Res., 13, 1957-1964 Page, 1993).
In the above experimental system, the vH-src transformant of NIH3T3 cells is disrupted in a hypotonic buffer, centrifuged and enucleated to obtain an enzyme solution. A sample dissolved in DMSO, cAMP, phorbol ester, and [γ ³² P] ATP are added to this and reacted at 25 ° C. for 20 minutes. After stopping the reaction, the phosphorylated protein is analyzed by SDS-PAGE and autoradiography. By this method, at least four types of protein kinase activities of A kinase, C kinase, src family tyrosine kinase, and calmodulin-dependent protein kinase III can be detected simultaneously.
For the evaluation of the activity, the specimen is added to a final concentration of 0.1 mg / mL, and the presence or absence of phosphorylation inhibition and the inhibition pattern are determined. If inhibitory activity is observed, a three-stage dilution series is prepared.
Specifically, it was performed as follows.
NIH3T3 cells transformed with v-src are hypotonic buffer containing 1 mM Hepes buffer (pH 7.4), 5 mM MgCl _2, and protease inhibitors antipain, leupeptin, and pepstatin A each at 25 μg / mL. Ice-cooled for 10 minutes in the liquid. The swollen cells were stirred and mixed at room temperature for 2 minutes and suspended. Next, Hepes buffer (200 mM, pH 7.4) was added to 20 mM, and then centrifuged at 500 g for 5 minutes to precipitate nuclei. The supernatant was collected and the final concentration was 20 mM Hepes buffer (pH 7.4), 10 mM MgCl ₂ , 0.1 mM Na ₃ VO ₄ , 10 mM β-glycerophosphate, 1 mM NaF, and 2.5 mg. / ML of protein was prepared. To 20 μL of the enucleated fraction, 5 μL of various kinase activators and UMPC16 in DMSO were added. 5 μL of [γ- ³² P] ATP (75 μM, 10 μCi) was added to initiate the kinase reaction and incubated at 25 ° C. for 15 minutes. The final concentration of the activator was phorbol ester (PMA) 1 μM, CaCl ₂ 10 μM, DMSO 10% (v / v), cAMP 20 μM. The final concentration of UMPC16 was 0.1, 1, 10, 100 μg / mL. The reaction was terminated by adding 10 [mu] L of 4X concentrated SDS-PAGE sample buffer or heating for 5 minutes in a boiling water bath. The heat-treated mixture was cooled at room temperature and centrifuged at 15,000 g for 30 minutes in order to precipitate the denatured protein, and then 10 μL of 4 times concentration of SDS-PAGE sample buffer was mixed with the supernatant. Phosphorylated proteins were separated using 9% SDS-PAGE (6 cm length) and visualized by autoradiography.
The obtained results are shown in Table 1.
[0028]
[Table 1]

PKA: A kinase, PKC: C kinase, PTK: tyrosine kinase,
CAMK: Calmodulin-dependent protein kinase III
++:> 70% inhibition, +: 40-70% inhibition, −: <40% inhibition (no inhibition)
As shown in Table 1, UMPC16 inhibited various protein kinase activities in a concentration-dependent manner. Therefore, the nucleotide 5′-alkyl derivatives represented by the formula (I) of the present invention, including UMPC16, are useful as protein kinase inhibitors and are considered to be useful substances as anticancer agents.
[0029]
【The invention's effect】
According to the present invention, a novel protein kinase inhibitor can be obtained by using a nucleotide alkyl derivative represented by the formula (I) as an active ingredient, which is useful as an anticancer agent.

Claims

Formula (I):

(Wherein R represents a linear or branched alkyl group) and is selected from the group consisting of A kinase, C kinase, tyrosine kinase, and calmodulin-dependent protein kinase III. A protein kinase inhibitor that inhibits the activity of protein kinase.

The protein kinase inhibitor according to claim 1, wherein R is an alkyl group having no more than 30 carbon atoms.

The protein kinase inhibitor according to claim 2, wherein R is an alkyl group having 4 to 24 carbon atoms.

The protein kinase inhibitor according to claim 3, wherein R is an alkyl group having 16 carbon atoms.

The protein kinase inhibitor according to any one of claims 1 to 4, wherein the nucleotide alkyl derivative is used in a free form or in the form of a hydrate or a salt .

The protein kinase inhibitor according to any one of claims 1 to 5, for use as an anticancer agent.