JP4532618B2

JP4532618B2 - Novel sugar primer

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Publication number: JP4532618B2
Application number: JP04828699A
Authority: JP
Inventors: 達也山形; チャンリーヤン; ワンライ−ジー; 嘉晃三浦; 英規中島; 元章三ツ木
Original assignee: 株式会社グライコメディクス
Priority date: 1999-02-25
Filing date: 1999-02-25
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2019-02-25
Also published as: JP2000247992A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖鎖生合成に使用しうる新規糖鎖プライマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
真核細胞の表面は、通常様々の糖により修飾されたり、被覆されている。これらの糖は、膜タンパク質や脂質との共有結合により形成された糖タンパク質や糖脂質のオリゴ糖側鎖として、あるいはプロテオグリカン分子の中の多糖側鎖として存在する。オリゴ糖側鎖の糖の配列は非常に多様であり、多様に枝別れし、共有結合して、互いにつながりあっている。そしてこれらの糖鎖は、細胞の認識・接着、情報伝達、及び細胞機能の制御に重要な役割を果たしている。このためこれらの糖鎖の機能の研究のためには、上記のように多様な配列を有する糖鎖を得る必要がある。糖鎖を得る方法としては従来、化学的に合成する方法；分解酵素による方法；そして糖転移酵素を用いる方法などがあるが、化学的に合成する方法では、何段階もの工程が必要であり、収量が低く、合成工程の設計が複雑であるなどの欠点がある。分解酵素による方法では、使用できる酵素が限られているうえ、糖の供与体が限られているという欠点がある。また糖転移酵素を用いる方法では、使用できる転移酵素が少なく、出発原料として使用する糖−ヌクレオチドが高価であるなどの欠点がある。
【０００３】
一方、ラクトシドプライマーをＢ１６マウスメラノーマ細胞やラットＰＣ１２細胞に与えると、内因性のグリコスフィンゴ脂質の生合成が阻害されるとともに、細胞がそのプライマーに糖を付加する（グリコシル化する）ことは、Biochem. Biophys. Res. Comm. 241, 698-703 (1997) (Miura, Y., et al.) 及びJ. Biochem. 124, 148-156 (1998) (Nakajima, H., et al.) に記載されているが、その付加効率や糖鎖生合成におけるその用途についてはあまり検討されていない。
【０００４】
上記のような理由から、従来の方法では、目的とする糖鎖を効率よく合成することが困難であり、所望の糖を所望の位置に含む糖鎖を、比較的簡単な工程により好収量で合成することができる方法が求められていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、従来の方法に比較して、比較的簡単な工程により好収量で所望の糖を所望の位置に含む糖鎖を合成することができる方法を求めて鋭意研究を行った結果、特定の官能基をその末端に有していてもよいアルキル鎖をオリゴ糖鎖に結合させた化合物を糖鎖プライマーとしてある種の細胞に与えると、細胞がこれを細胞内に取り込んで、オリゴ糖鎖の部分に更に糖を付加（グリコシル化）し、付加生成物を細胞内に蓄積せずに細胞外に分泌すること、また糖鎖プライマーを与える細胞の種類によって、付加される糖の種類が異なることが見出され、糖鎖プライマーの糖鎖の種類、そして糖鎖プライマーを与える細胞の種類を組み合わせることによって、所望の構造の糖鎖を細胞に生合成させることができることを見出して、本発明を完成させた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、式（Ｉ）：（Ｇ₁)_x（Ｇ₂)_y（Ｇ₃)_z−Ｌ−Ｘ
〔式中、Ｇ₁、Ｇ₂及びＧ₃は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり；Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ₂)_n−、−Ｓ−（ＣＨ₂)_n−、及び−ＮＨ−（ＣＨ₂)_n−から選択される連結基であり；Ｘは、−Ｎ₃、−ＮＨ₂、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、及び−Ｃ₁-Ｃ₄アルキルから選択される基であり；ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり；ｎは、８〜２０の整数である。ただしｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない〕で示される化合物に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の式（Ｉ）の化合物において、Ｇ₁、Ｇ₂及びＧ₃は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体である。単糖としては、いかなる単糖を使用することもできるが、なかでもペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。具体的には、Ｄ−グルコース（Ｇｌｃ）、Ｄ−及びＬ−ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｄ−マンノース（Ｍａｎ）、Ｄ−タロース（Ｔａｌ）などのアルドヘキソース；Ｄ−及びＬ−アラビノース（Ａｒａ）、Ｄ−キシロース（Ｘｙｌ）、Ｄ−及びＬ−リキソース（Ｌｙｘ）、Ｄ−リボース（Ｒｉｂ）などのアルドペントース；Ｄ−フルクトース（Ｆｒｕ）、Ｄ−プシコース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−タガトースなどのケトヘキソース；並びにＤ−リブロース、Ｄ−及びＬ−キシルロースなどのケトペントース、更にはＬ−フコース（Ｆｕｃ）、及びシアル酸（Ｓｉａ）を使用することができる。なかでもＤ−グルコース、Ｄ−及びＬ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−キシロースを挙げることができる。またその誘導体としては、上記の単糖のＮ−アシルアミノ糖（特にＮ−アセチルアミノ糖）、Ｏ−アシル糖（特にＯ−アセチル糖）、デオキシ糖、ウロン酸などを使用することができる。
【０００８】
また、（Ｇ₁)_x（Ｇ₂)_y（Ｇ₃)_zのｘ、ｙ及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数である。ｘ、ｙ及びｚは、それぞれ独立して、好ましくは０〜５、更に好ましくは０〜３、更に特に好ましくは０〜２である。ただしｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。
【０００９】
（Ｇ₁)_x（Ｇ₂)_y（Ｇ₃)_zの好ましい例としては、（Ｇｌｃ)₂；（Ｍａｎ)₂；（Ｇｌｃ)₁−（Ｍａｎ)₁；（Ｇａｌ)₁−（Ｇｌｃ)₁；（Ｇａｌ)₁；（Ｇｌｃ)₁；（Ｍａｎ)₁；及び（Ｘｙｌ)₁などを挙げることができる。なかでも特に好ましいのは、（Ｇ₁)_x（Ｇ₂)_y（Ｇ₃)_zが、Ｄ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇｌｃ、つまりラクトース基である式（Ｉ）の化合物である。
【００１０】
式（Ｉ）の化合物において、Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ₂)_n−、−Ｓ−（ＣＨ₂)_n−、及び−ＮＨ−（ＣＨ₂)_n−から選択される連結基であり、−Ｌ−は、好ましくは−Ｏ−（ＣＨ₂)_n−である。ここで、ｎは、８〜２０の整数であり、ｎは、好ましくは８〜１６、特に好ましくは１２である。ｎが、８未満である場合、又は２０を越える場合には、式（Ｉ）の化合物を糖鎖プライマーとして細胞に与えても、糖鎖プライマーに対する細胞の糖付加能は低い。
【００１１】
式（Ｉ）の化合物において、Ｘは、−Ｎ₃、−ＮＨ₂、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、及び−Ｃ₁-Ｃ₄アルキルから選択される基である。Ｃ₁-Ｃ₄アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、tert−ブチルなどが挙げられるが、メチルであるのが好ましい。なかでもＸは、−Ｎ₃、−ＮＨ₂、−ＯＨ、又は−ＣＯＯＨであるのが好ましく、−Ｎ₃又は−ＮＨ₂であるのが特に好ましく、−Ｎ₃であるのが更に特に好ましい。
【００１２】
上記の式（Ｉ）の化合物としては、以下の化合物を好ましい化合物として挙げることができる。
Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇｌｃα１−２Ｇｌｃα−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇｌｃα１−３Ｇｌｃα−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃα−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇｌｃα１−６Ｇｌｃα−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇｌｃα１−２Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇｌｃα１−３Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇｌｃα１−６Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇｌｃβ１−２Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇｌｃβ１−３Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇｌｃβ１−４Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇｌｃβ１−６Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｍａｎα１−２Ｍａｎα−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｍａｎα１−３Ｍａｎα−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｍａｎα１−６Ｍａｎα−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
ＧｌｃＮＡｃβ１−４Ｍａｎα−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
ＧｌｃＮＡｃβ１−６Ｍａｎα−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
ＧａｌＮＡｃα−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇａｌβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇａｌα−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
ＧａｌＮＡｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
ＧｌｃＮＡｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
ＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｍａｎβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；
Ｍａｎα−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃；及び
Ｘｙｌβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃
【００１３】
上記の式（Ｉ）の化合物のうち、以下の式：
【００１４】
【化１】

【００１５】
で示されるＤ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃が、特に好ましい式（Ｉ）の化合物である。
【００１６】
本発明はまた、上記の式（Ｉ）で示される化合物の製造方法であって、式：
（Ｇ₁′)_x（Ｇ₂′)_y（Ｇ₃′)_z
（式中、Ｇ₁′、Ｇ₂′、Ｇ₃′は、それぞれ上記に記載の定義を有するＧ₁、Ｇ₂、Ｇ₃のヒドロキシル基が保護された基であり、ｘ、ｙ、及びｚは、上記に記載のとおりである）で示される化合物を臭素化して、−（Ｇ₃′)_zの末端の単糖のアノマー炭素に結合するヒドロキシル基が臭素化されている化合物である、式：
（Ｇ₁′)_x（Ｇ₂′)_y（Ｇ₃′)_z−Ｂｒ
（式中、Ｇ₁′、Ｇ₂′、Ｇ₃′、ｘ、ｙ、及びｚは、上記に記載のとおりである）で示される化合物を得；
得られた化合物を、テトラヒドロフランなどの溶媒中、ＨｇＢｒ₂−Ｈｇ（ＣＨ)₂又は銀トリフラートなどの存在下で、式：Ｈ−Ｌ−Ｘ′（式中、Ｌは、上記に記載のとおりであり、Ｘ′は、−ＯＨ又は−Ｃ₁-Ｃ₄アルキルである）で示される化合物と反応させて、保護基を有する式（Ｉ）の化合物（ここで、Ｘは、−ＯＨ又は−Ｃ₁-Ｃ₄アルキルである）である式：
（Ｇ₁′)_x（Ｇ₂′)_y（Ｇ₃′)_z−Ｌ−Ｘ′
（式中、Ｇ₁′、Ｇ₂′、Ｇ₃′、ｘ、ｙ、ｚ、Ｌ、及びＸ′は、上記に記載のとおりである）で示される化合物を得；
得られた化合物のうちＸ′が−ＯＨである化合物を、ピリジンなどの溶媒中、塩化メシルなどのメシル化剤と反応させることによってメシル化して、式：
（Ｇ₁′)_x（Ｇ₂′)_y（Ｇ₃′)_z−Ｌ−ＯＭｓ
（式中、Ｇ₁′、Ｇ₂′、Ｇ₃′、ｘ、ｙ、ｚ、及びＬは、上記に記載のとおりであり、Ｍｓは、メシル基である）で示される化合物を得；
得られた化合物を、ジメチルフランなどの溶媒中、アジ化ナトリウムなどのアジド化剤と反応させることによってアジド化して、保護基を有する式（Ｉ）の化合物（ここで、Ｘは、−Ｎ₃である）である式：
（Ｇ₁′)_x（Ｇ₂′)_y（Ｇ₃′)_z−Ｌ−Ｎ₃
（式中、Ｇ₁′、Ｇ₂′、Ｇ₃′、ｘ、ｙ、ｚ、及びＬは、上記に記載のとおりである）で示される化合物を得；
こうして得られた保護基を有する式（Ｉ）の化合物（ここで、Ｘは、−ＯＨ、−Ｃ₁-Ｃ₄アルキル、又は−Ｎ₃である）から、ナトリウムメチラート−メタノールなどの存在下で保護基を除去して、式（Ｉ）の化合物（ここで、Ｘは、−ＯＨ、−Ｃ₁-Ｃ₄アルキル、又は−Ｎ₃である）を得；
更に式（Ｉ）の化合物の基：Ｘを、−ＮＨ₂又は−ＣＯＯＨに変換することを含む方法に関する。
【００１７】
本方法において出発化合物として使用する式：（Ｇ₁′)_x（Ｇ₂′)_y（Ｇ₃′)_zで示される化合物は、公知の方法で合成することのできる式：（Ｇ₁)_x（Ｇ₂)_y（Ｇ₃)_zで示される化合物のヒドロキシル基を、例えばベンジル基などの保護基で保護することによって合成することができる。ベンジル基で保護する場合には、式：（Ｇ₁)_x（Ｇ₂)_y（Ｇ₃)_zで示される化合物を、ピリジンなどの溶媒中、塩化ベンジルなどのベンジル化剤と反応させる。
【００１８】
また本方法においては、Ｘが、−ＮＨ₂である式（Ｉ）の化合物は、上記で得られたＸが−Ｎ₃である式（Ｉ）の化合物から、当業者には公知の方法、例えばリンドラー触媒などを用いる接触還元により調製することができる。また、Ｘが、−ＣＯＯＨである式（Ｉ）の化合物は、上記のように合成したＸが−ＯＨである式（Ｉ）の化合物から、当業者には公知の方法、例えばＸが−ＯＨである式（Ｉ）の化合物をシアン化ナトリウム、トリフェニルホスフィン、ＣＣｌ₄と反応させて得られた対応するニトリル化合物を加水分解する方法；あるいはＸが−ＯＨである式（Ｉ）の化合物をハロゲン化水素などのハロゲン化剤によりハロゲン化し、グリニャール反応によりカルボキシル基を導入する方法で合成することができる。
【００１９】
上記の方法で得られた本発明の式（Ｉ）の化合物を糖鎖生合成用プライマーとして各種細胞の培地に添加して細胞を培養すると、細胞は、式（Ｉ）の化合物を取り込み、ゴルジ体において、式（Ｉ）の化合物の糖鎖部分に更に糖を付加してグリコシル化し、その糖付加生成物を細胞内には蓄積せずに細胞外に分泌する。細胞により付加される糖は、細胞により異なり、例えば、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞に式（Ｉ）の化合物を与えると、ノイラミン酸のアシル誘導体であるシアル酸（ＳＡ）が付加され、ラットＰＣ１２細胞に投与すると、ガラクトースが付加される。したがって、所望の糖を付加する細胞に、所望の糖鎖を有する式（Ｉ）の化合物を糖鎖プライマーとして与えることによって、所望の糖鎖を有する糖付加生成物を得、更に必要に応じてこの工程を繰り返すことによって、多様な糖鎖を有する糖付加生成物を合成することができる。このようにして多様な糖鎖を有する糖鎖ライブラリーを構築することも可能である。また糖付加生成物は、細胞内に蓄積されずに細胞外に分泌されるので、培地から容易に回収することができる。したがって、本発明の式（Ｉ）の化合物を糖鎖生合成用プライマーとして使用することによって、従来の方法に比較して、工程が比較的簡単で、効率的に高収量で、所望の糖を所望の位置に含む糖鎖を合成することができる。
【００２０】
上記のようにして細胞から得られた、糖の付加されたグリコシル化生成物は、付加された糖鎖に応じて、各種の用途に使用することができる。例えば用いた細胞が付加する糖鎖に特異的親和性を有するウイルスやタンパク質の中和に用いることができる。Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を用いた場合に得られるシアル酸付加生成物は、インフルエンザウイルスを中和することができ、ラットＰＣ１２細胞を用いた場合に得られるガラクトース付加生成物は、病原性大腸菌のＯ−１５７毒素やボツリヌス毒素を中和することができる。これら以外にも、付加する糖鎖に応じて、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞ではコレラ毒素、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞では破傷風毒素、ヒトＭＯＬＴ−４細胞では腸炎ビブリオの中和に使用できる糖付加生成物を得ることができる可能性があり、またヒトＨＬ−６０細胞を用いた場合は、抗炎症効果を有する糖付加生成物を得ることができる可能性がある。糖の付加されたグリコシル化生成物の可能性のある用途としては、上記のほか、生体防御系刺激剤製造のための用途、各種医薬品（抗炎症剤、抗菌剤、抗腫瘍転移剤、診断薬など）又は細胞培養基材の製造のための用途、及び標的細胞ターゲッティング性を利用した生体内薬物運搬体の製造のための用途を挙げることができる。また上述のように多様な糖鎖を有する糖鎖ライブラリーを構築することも可能であるため、糖鎖の機能研究など広範囲の研究に使用することができる。
【００２１】
したがって本発明は、式（Ｉ）で示される化合物を含む、糖鎖生合成用プライマー、及び該糖鎖生合成用プライマーの、ウイルス又は細菌毒素の中和物質、生体防御系刺激剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗腫瘍転移剤、診断薬、細胞培養基材あるいは生体内薬物運搬体の製造のための用途にも関する。
【００２２】
本発明は、また細胞を用いて糖鎖を生合成する方法に関し、本方法は、上述したように、特定の官能基をその末端に有していてもよいアルキル鎖をオリゴ糖鎖に結合させた化合物、特に式（Ｉ）で示される化合物を含む糖鎖生合成用プライマーの存在下で細胞を培養することによって、細胞に式（Ｉ）で示される化合物の糖鎖部分に糖を付加させてグリコシル化させ、培養培地から糖付加生成物を回収し、必要に応じて精製することを含む。そして本方法に使用することができる細胞としては、上述したＢ１６マウスメラノーマ細胞、ラットＰＣ１２細胞、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＭＯＬＴ−４細胞、及びヒトＨＬ−６０細胞を挙げることができる。
【００２３】
本発明の式（Ｉ）の化合物を糖鎖生合成用プライマーとして用いて得られる糖付加生成物のうち、そのアルキル鎖の末端に−ＣＨ₃などのＣ₁-Ｃ₄アルキルを有する化合物は、エンドグリコセラミダーゼ又はセラミドグリカナーゼなどの酵素により切断してオリゴ糖鎖のみとすることができ、各種用途に用いることができる。また、そのアルキル鎖の末端に−Ｎ₃、−ＮＨ₂、−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを有する糖付加生成物は、用途に応じて還元などの化学反応に付して、重合反応による糖鎖の高分子化や、その他の化合物との反応など広範囲の用途に使用することができる。
【００２４】
【実施例】
以下に記載する実施例及び試験例により本発明を詳細に説明する。
実施例１
Ｄ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−ＯＨの調製
工程１
ラクトースを無水ピリジンに懸濁し、次に塩化ベンジルを滴下により加えた。混合物を室温で１時間、次いで６０℃で５時間撹拌した。反応混合物を冷却し、氷水を加え、溶媒を留去してシロップ状の生成物を得、これをアセトン／メタノール（１：３）から結晶化して、式（ａ）：
【００２５】
【化２】

【００２６】
で示されるベンジル基を有するラクトースを白色結晶として得た。α：β＝２：１であった。収量は、約９０％であった。
【００２７】
工程２
前の工程で得られたベンジル基を有するラクトースを酢酸中、臭化水素により、室温で２〜３時間処理した。混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈し、水及びＮａＨＣＯ₃水溶液で洗浄し、乾燥し、溶媒を留去して、式（ｂ）：
【００２８】
【化３】

【００２９】
で示される、グルコースのアノマー炭素に結合するヒドロキシル基が臭素化されている化合物を、無色のシロップ状物質として得た。H-1:δ 6.8, J_1,2=4.2 Hz（α異性体のみ）。
【００３０】
工程３
前の工程で得た化合物を、テトラヒドロフラン中、ＨｇＢｒ₂及びＨｇ（ＣＮ)₂ １．２当量の存在下、ＨＯ（ＣＨ₂)₁₂ＯＨ３〜４当量と、反応をＴＬＣで観察しながら反応させ、反応終了後、通常の処理を行い、カラムクロマトグラフィーで精製して、式（ｃ）：
【００３１】
【化４】

【００３２】
で示される化合物を得た。収量は、５０〜８０％であった。
【００３３】
工程４
前の工程で得た化合物を、ＭｅＯＮａ−ＭｅＯＨの存在下で脱ベンジル化して、式：
【００３４】
【化５】

【００３５】
で示されるＤ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−ＯＨを得た。
【００３６】
実施例２
Ｄ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃の調製
工程１〜３
実施例１と同様の操作を行って、上記の式（ｃ）で示される化合物を得た。
工程４
前の工程で得た化合物を、ピリジンに溶解し、塩化メシル２当量を加え、室温で反応混合物を撹拌した。通常の処理後、カラムクロマトグラフィーで精製して、式（ｄ）：
【００３７】
【化６】

【００３８】
で示される化合物を得た。
【００３９】
工程５
前の工程で得た化合物を、ジメチルフラン中、６０℃で、反応が終了するまで、ＮａＮ₃ ２当量と反応させた。通常の処理後、クロマトグラフィーで精製して、式（ｅ）：
【００４０】
【化７】

【００４１】
で示される化合物を得た。
【００４２】
工程６
前の工程で得た化合物を、ＭｅＯＮａ−ＭｅＯＨの存在下で脱ベンジル化して、式：
【００４３】
【化８】

【００４４】
で示されるＤ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃を得た。
得られた化合物の物性値は、以下のとおりである。
融点： 182.2〜182.5℃
元素分析（Ｃ₂₄Ｈ₄₅Ｎ₃Ｏ₁₁）：
計算値：Ｃ 52.26; Ｈ 8.22; Ｎ 7.62; Ｏ 31.90
実測値：Ｃ 51.99; Ｈ 8.08; Ｎ 7.38
ＭＳ： 552 (Ｍ+Ｈ)⁺
赤外スペクトル： 3,234cm^-1 (ＯＨ); 2,915cm^-1 (ＣＨ対称); 2,846cm^-1
(ＣＨ逆対称); 2,088cm^-1 (Ｎ³); 1,720cm^-1 (Ｃ＝Ｏ伸縮); 1,552cm^-1
¹ＨＮＭＲ：ＧｌｃＨ−１：4.15ppm (7.6Hz) (β); ＧａｌＨ−１：
4.18ppm (7.6Hz) (β); (ＣＨ₂)_n：1.08-1.35ppm広域シグナル
【００４５】
試験例１
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（理研細胞銀行）を１０％ＦＢＳ（GIBCO BRL）含有ＤＭＥＭ（大日本製薬株式会社）（ペニシリンＧカリウム１００U/ml、ストレプトマイシン０．１g/l、ＮａＨＣＯ₃３．７g/l添加）中で培養し、コンフレントになったら継代した。
本発明の式（Ｉ）の化合物のプライマー溶液調製のために、式：
【００４６】
【化９】

【００４７】
で示されるＤ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃ ０．００７０ｇをＤＭＳＯ１２７μlに溶解して、１００mMのプライマー溶液を得た。
実験用培地としては、フェノールレッドの入っていない液体培地であるＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（ＨＥＰＥＳ１５mM含有、GIBCO BRL）にインスリン５mg/ml（和光純薬）、トランスフェリン５mg/ml（和光純薬）及びＳｅＯ₂ ５０μlを添加してＴＩ／ＤＦ培地を得た。調製しておいた１００mMＤ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃のＤＭＳＯ溶液を培地に加えて、最終濃度が５０μMとなるように調整した。コントロール用培地としては、プライマーを含有しないＴＩ／ＤＦ培地を用いた。
１００mmψのシャーレに実験用培地５mlを入れ、４．０×１０⁶個のＢ１６マウスメラノーマ細胞を蒔き、シャーレを５％ＣＯ₂インキュベーターに入れ、３７℃で２４時間又は４８時間培養した。
所定時間の経過後、氷上で反応を停止させ、培養上清をパスツールピペットで回収し（培地画分）、細胞層を冷ＰＢＳ２mlで２回洗浄し、洗浄液は、培地画分に含めた。細胞が残っているシャーレに０．２５％ＥＤＴＡ／ＰＢＳ２mlを入れ、インキュベーター(３７℃)に２分間入れて細胞をはがしたのち、細胞懸濁液を１５ml遠心分離管に入れた。シャーレを冷ＰＢＳ２mlで２回洗浄し、洗浄液を細胞懸濁液の入っている遠心分離管に入れ、１，０００rpmで５分間遠心分離した。上清を培地画分として回収した。ペレットに冷ＰＢＳ２．１mlを入れてよく懸濁し、エッペンドルフチューブに入れて、２，５００rpmで５分間遠心分離した。上清を培地画分として回収し、残りを細胞画分として得た。
【００４８】
培地画分からの糖脂質の抽出
ＳｅｐＰａｋＣ−１８カラム（Waters）にメタノール１０mlを通し、更にmilliＱ超純水１０mlを通して平衡化した。インターナルマーカーとして１００mMｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドのmilliＱ超純水溶液２．５μlを培地画分試料に加え、試料をカラムに通した。メタノール２ml、次いでクロロホルム／メタノール（２／１）３mlで糖脂質を溶出し、溶出液を窒素ガス気流中で乾燥させた。
【００４９】
細胞画分からの糖脂質の抽出
インターナルマーカーとして１００μMｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドのメタノール溶液３００μlを各細胞画分試料に加え、クロロホルム６６６μl、メタノール３４μlを入れ、vortexで振とう撹拌し、更にソニケーターに３０分間かけて糖脂質を抽出し、１５，０００rpmで２５分間遠心分離した。上清をエッペンドルフチューブに回収し、窒素ガス気流中で乾燥した。細胞ペレットに、クロロホルム／メタノール／水（４／８／３）１mlを加え、vortexで振とう撹拌し、ソニケーターに３０分間かけて糖脂質を抽出し、１５，０００rpmで２５分間遠心分離した。上清をエッペンドルフチューブを用いて回収し、窒素ガス気流中で乾燥した。
【００５０】
培地画分及び細胞画分中の糖脂質の分離、同定
乾燥しておいた培地画分をクロロホルム／メタノール（２／１）で溶解し、ＨＰＴＬＣプレートに載せた。一方、乾燥しておいた細胞画分は、クロロホルム／メタノール（２／１）に溶解し、やはりＨＰＴＬＣプレートに載せた。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２％ＣａＣｌ₂水溶液（６０／３５／８）又はクロロホルム／メタノール／０．２５％ＫＣｌ（水溶液）（６０／３５／８）を使用した。各プレートには、検量線作成のために、ＧＭ３（Ｎｅｕ−Ａｃα２−３ラクトシルセラミド）、プライマー、及びオクチルグルコシドを所定の濃度で載せた。
【００５１】
プライマーに付加されたシアル酸の発色のためには、レゾルシノール／塩酸試薬（１０mlの水にレゾルシノール２００mgを溶解し、塩酸８０mlと０．１M硫酸銅０．２５mlを加え、水を加えて１００mlとした溶液）を用い、１１０℃のオーブンに２０〜３０分間入れて発色させた。また糖脂質の定量のためには、デンシトメーター（Bio 1D イメージアナライザー、Vilber Lourmat）を用い、ＧＭ３の検量線よりシアル酸付加生成物量とＧＭ３量、プライマーの検量線よりプライマー量、そしてオクチルグルコシドの検量線よりオクチルグルコシド量を算出した。
【００５２】
また瀧らのＴＬＣブロッティング法（Taki, T., et al. Anal. Biochem. 225, 24-27, 1995）によりシアル酸付加生成物と思われるバンドをＰＶＤＦ膜に移し、質量スペクトルにより分析した。また培地画分をＨＰＴＬＣプレート上で展開し、ニンヒドリン試薬によりアミンの検出を行った。
【００５３】
分析結果
本発明の式（Ｉ）の化合物のプライマーの存在下でＢ１６マウスメラノーマ細胞の培養を行った培地画分をＨＰＴＬＣにより分析したところ、本発明化合物のプライマーはＢ１６マウスメラノーマ細胞によりシアル酸でグリコシル化されることが認められた。一方、プライマーの存在下で培養を行った細胞画分を分析したところ、細胞画分には、シアル酸でグリコシル化されたプライマーは検出されず、シアル酸でグリコシル化されたプライマーは、細胞内には蓄積されずに、培地中に分泌されることが示された。
【００５４】
図１に示すように、質量分析によっても、予想生成物である、シアル酸でグリコシル化された化合物であるＳＡ−Ｄ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃の分子量８４２．８８とほぼ同じ分子量の位置（８４２．９２）にメインピークが現れたため、本発明化合物のプライマーであるＤ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃は、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞によりシアル酸でグリコシル化されることが認められた。
【００５５】
また図２に示すように、培地画分のＨＴＰＬＣによる分析により、２４時間及び４８時間の培養後で、培地に添加された本発明化合物のプライマーのうち２４時間後では４．８％、４８時間後では９．０％がシアル酸でグリコシル化されたことが認められた。
【００５６】
また、図３に示すように、４８時間培養後の培地画分には、培地に添加された本発明化合物のプライマーのうち７８％が未変化体のまま残留しており、本発明化合物のプライマーが、安定であることが示された。この結果により、本発明化合物のプライマーの存在下で４８時間以上培養することによって、本発明化合物のプライマーが更にシアル酸でグリコシル化されて、グリコシル化率が更に上昇する可能性が示された。
【００５７】
またニンヒドリン試薬によりアミンの検出を試みたところ、陰性であり、本発明のプライマーでは、シアル酸によりグリコシル化された後でも、そのアルキル鎖末端の−Ｎ₃は、還元されていないことが認められた。
【００５８】
更に図４に示すように、プライマーの存在下で培養することによって、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞自体のシアル酸付加能が上昇することが認められた。
【００５９】
【発明の効果】
上記の結果より、本発明の式（Ｉ）の化合物のプライマーは、高いグリコシル化率を有し、また安定であるために更に多量のグリコシル体を生成する可能性を有し、更に細胞のグリコシル化能を高めることが認められた。またアルキル鎖の末端に−Ｎ₃、−ＮＨ₂、−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを有する本発明の式（Ｉ）のプライマーは、グリコシル化後の生成物が、重合反応による糖鎖の高分子化や、その他の化合物との反応など広範囲の用途に使用することができるなどの利点を有することが示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、シアル酸でグリコシル化されたＤ−Ｇａｌβ１−４−Ｄ−Ｇｌｃβ−Ｏ−（ＣＨ₂)₁₂−Ｎ₃化合物であると予想される化合物の質量スペクトルを示す。
【図２】図２は、２４時間及び４８時間の培養後のプライマーのグリコシル化率を示す。
【図３】図３は、４８時間培養後の培地画分中のプライマー及びグリコシル化されたプライマーの存在比を示す。
【図４】図４は、プライマーの存在下での細胞のシアル酸付加能を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel sugar chain primer that can be used for sugar chain biosynthesis.
[0002]
[Prior art]
The surface of eukaryotic cells is usually modified or coated with various sugars. These sugars exist as oligosaccharide side chains of glycoproteins and glycolipids formed by covalent bonds with membrane proteins and lipids, or as polysaccharide side chains in proteoglycan molecules. Oligosaccharide side chain sugar sequences are very diverse, divergently branched and covalently linked together. These sugar chains play an important role in cell recognition / adhesion, information transmission, and control of cell functions. Therefore, in order to study the function of these sugar chains, it is necessary to obtain sugar chains having various sequences as described above. As a method for obtaining a sugar chain, there are conventionally a method of chemically synthesizing; a method using a degrading enzyme; and a method using a glycosyltransferase. However, the method of chemically synthesizing requires several steps. There are drawbacks such as low yield and complicated design of the synthesis process. In the method using a degrading enzyme, there are drawbacks in that the enzymes that can be used are limited and the sugar donors are limited. In addition, the method using glycosyltransferase has disadvantages such as few transferases can be used and sugar-nucleotide used as a starting material is expensive.
[0003]
On the other hand, when a lactoside primer is given to B16 mouse melanoma cells or rat PC12 cells, the biosynthesis of endogenous glycosphingolipids is inhibited and the cells add sugar (glycosylation) to the primer. Biochem. Biophys. Res. Comm. 241, 698-703 (1997) (Miura, Y., et al.) And J. Biochem. 124, 148-156 (1998) (Nakajima, H., et al.) Although described, its addition efficiency and its use in sugar chain biosynthesis have not been studied much.
[0004]
For the reasons described above, it is difficult to efficiently synthesize the target sugar chain by the conventional method, and the sugar chain containing the desired sugar at the desired position can be obtained in a good yield by a relatively simple process. There has been a need for a method that can be synthesized.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
As a result of earnest research, the present inventors have sought a method capable of synthesizing a sugar chain containing a desired sugar at a desired position with a good yield in a relatively simple process as compared with the conventional method. When a compound in which an alkyl chain that may have a specific functional group at its end is bound to an oligosaccharide chain is given to a certain cell as a sugar chain primer, the cell takes this into the cell and Add sugar (glycosylation) to the sugar chain part, secrete the addition product outside the cell without accumulating in the cell, and the type of sugar added depending on the type of cell to which the sugar chain primer is applied Are found to be different, and by combining the type of sugar chain of the sugar chain primer and the type of cell providing the sugar chain primer, it is found that the sugar chain of the desired structure can be biosynthesized in the cell, The present invention It was made.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present invention provides compounds of formula (I) :( G₁)_x(G₂)_y(G_Three)_z-L-X
[In the formula, G₁, G₂And G_ThreeAre each independently a monosaccharide residue of cyclic structure or a derivative thereof; L is —O— (CH₂)_n-, -S- (CH₂)_n-And -NH- (CH₂)_nA linking group selected from-; X is -N_Three, -NH₂, -OH, -COOH, and -C₁-C_FourX, y, and z are each independently an integer of 0 to 10; and n is an integer of 8 to 20. However, all of x, y and z are not 0 at the same time].
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the compound of formula (I) of the present invention, G₁, G₂And G_ThreeAre each independently a monosaccharide residue having a cyclic structure or a derivative thereof. Any monosaccharide can be used as the monosaccharide, but among these, pentose and hexose are preferably used. Either aldose or ketose can be used. Specifically, aldohexoses such as D-glucose (Glc), D- and L-galactose (Gal), D-mannose (Man), D-talose (Tal); D- and L-arabinose (Ara), Aldopentoses such as D-xylose (Xyl), D- and L-lyxose (Lyx), D-ribose (Rib); ketohexoses such as D-fructose (Fru), D-psicose, L-sorbose, D-tagatose And ketopentoses such as D-ribulose, D- and L-xylulose, as well as L-fucose (Fuc), and sialic acid (Sia). Among these, D-glucose, D- and L-galactose, D-mannose and D-xylose can be mentioned. As the derivatives thereof, the above monosaccharides such as N-acylamino sugar (particularly N-acetylamino sugar), O-acyl sugar (particularly O-acetyl sugar), deoxy sugar, uronic acid and the like can be used.
[0008]
Also, (G₁)_x(G₂)_y(G_Three)_zX, y and z each independently represent an integer of 0 to 10. x, y and z are each independently preferably 0 to 5, more preferably 0 to 3, and still more preferably 0 to 2. However, all of x, y and z are not 0 at the same time.
[0009]
(G₁)_x(G₂)_y(G_Three)_zPreferred examples of (Glc)₂; (Man)₂; (Glc)₁-(Man)₁; (Gal)₁-(Glc)₁; (Gal)₁; (Glc)₁; (Man)₁And (Xyl)₁And so on. Particularly preferred is (G₁)_x(G₂)_y(G_Three)_zIs D-Gal-D-Glc, a compound of formula (I) which is a lactose group.
[0010]
In the compound of formula (I), L represents —O— (CH₂)_n-, -S- (CH₂)_n-And -NH- (CH₂)_n-L- is preferably -O- (CH₂)_n-. Here, n is an integer of 8 to 20, and n is preferably 8 to 16, and particularly preferably 12. When n is less than 8 or exceeds 20, even if the compound of formula (I) is given to cells as a sugar chain primer, the ability of the cell to add sugar to the sugar chain primer is low.
[0011]
In the compounds of formula (I), X is —N_Three, -NH₂, -OH, -COOH, and -C₁-C_FourIt is a group selected from alkyl. C₁-C_FourExamples of alkyl include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, tert-butyl and the like, and methyl is preferred. In particular, X is -N_Three, -NH₂, -OH, or -COOH, preferably -N_ThreeOr -NH₂Is particularly preferably -N_ThreeIt is further particularly preferred that
[0012]
As the compound of the above formula (I), the following compounds can be mentioned as preferred compounds.
Galβ1-4Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Galβ1-3GlcNAcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Glcα1-2Glcα-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Glcα1-3Glcα-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Glcα1-4Glcα-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Glcα1-6Glcα-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Glcα1-2Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Glcα1-3Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Glcα1-4Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Glcα1-6Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Glcβ1-2Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Glcβ1-3Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Glcβ1-4Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Glcβ1-6Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
GlcNAcβ1-3Galβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Manα1-2Manα-O- (CH₂)₁₂-N_Three;
Manα1-3Manα-O- (CH₂)₁₂-N_Three;
Manα1-6Manα-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
GlcNAcβ1-2Manα-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
GlcNAcβ1-4Manα-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
GlcNAcβ1-6Manα-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Galβ1-4GlcNAcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
GalNAcα-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Galβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Galα-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
GalNAcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
GlcNAcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
GlcNAcα-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Manβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three;
Manα-O- (CH₂)₁₂-N_Three;as well as
Xylβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three
[0013]
Of the compounds of formula (I) above, the following formula:
[0014]
[Chemical 1]

[0015]
D-Galβ1-4-D-Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_ThreeAre particularly preferred compounds of the formula (I).
[0016]
The present invention also provides a method for producing the compound represented by the above formula (I), wherein the compound represented by the formula:
(G₁′)_x(G₂′)_y(G_Three′)_z
(Where G₁', G₂', G_Three′ Are each G having the definition described above.₁, G₂, G_ThreeIs a protected group, and x, y, and z are as described above) are brominated to produce-(G_Three′)_zIs a compound in which the hydroxyl group bonded to the anomeric carbon of the monosaccharide at the end of is brominated.
(G₁′)_x(G₂′)_y(G_Three′)_z-Br
(Where G₁', G₂', G_Three′, X, y, and z are as described above)
The obtained compound was dissolved in a solvent such as tetrahydrofuran in HgBr.₂-Hg (CH)₂Or in the presence of silver triflate or the like, wherein the formula: HL-X ′ (wherein L is as described above, X ′ is —OH or —C₁-C_FourA compound of formula (I) having a protecting group, wherein X is —OH or —C₁-C_FourA formula that is alkyl):
(G₁′)_x(G₂′)_y(G_Three′)_z-L-X '
(Where G₁', G₂', G_Three', X, y, z, L, and X' are as described above);
Among the obtained compounds, a compound in which X ′ is —OH is mesylated by reacting with a mesylating agent such as mesyl chloride in a solvent such as pyridine to obtain the formula:
(G₁′)_x(G₂′)_y(G_Three′)_z-L-OMs
(Where G₁', G₂', G_Three′, X, y, z, and L are as described above, and Ms is a mesyl group).
The resulting compound is azidated by reaction with an azidating agent such as sodium azide in a solvent such as dimethylfuran to give a compound of formula (I) having a protecting group, wherein X is —N_ThreeIs an expression that is:
(G₁′)_x(G₂′)_y(G_Three′)_z-L-N_Three
(Where G₁', G₂', G_Three', X, y, z, and L are as described above)
The compound of formula (I) having a protecting group thus obtained (where X is —OH, —C₁-C_FourAlkyl or -N_ThreeIs removed in the presence of sodium methylate-methanol or the like to give a compound of formula (I) wherein X is —OH, —C₁-C_FourAlkyl or -N_ThreeObtained);
Furthermore, the group of the compound of formula (I): X₂Or to a process comprising converting to -COOH.
[0017]
Formula used as starting compound in this process: (G₁′)_x(G₂′)_y(G_Three′)_zThe compound represented by formula (G) can be synthesized by a known method:₁)_x(G₂)_y(G_Three)_zIt can be synthesized by protecting the hydroxyl group of the compound represented by the above with a protecting group such as a benzyl group. When protecting with a benzyl group, the formula: (G₁)_x(G₂)_y(G_Three)_zIs reacted with a benzylating agent such as benzyl chloride in a solvent such as pyridine.
[0018]
In this method, X is —NH.₂The compound of formula (I), wherein X obtained above is —N_ThreeFrom the compound of formula (I) can be prepared by methods known to those skilled in the art, for example, catalytic reduction using Lindlar catalyst. In addition, the compound of formula (I) in which X is —COOH can be synthesized from the compound of formula (I) in which X is —OH synthesized as described above by methods known to those skilled in the art, for example, X is —OH. The compound of formula (I) is sodium cyanide, triphenylphosphine, CCl_FourHydrolysis of the corresponding nitrile compound obtained by reacting with benzene; or the compound of formula (I) wherein X is —OH is halogenated with a halogenating agent such as hydrogen halide and a carboxyl group is introduced by a Grignard reaction Can be synthesized by the following method.
[0019]
When the compound of the formula (I) of the present invention obtained by the above method is added to a medium of various cells as a glycan biosynthesis primer and cultured, the cell takes up the compound of the formula (I), and the Golgi In the body, a sugar is further added to the sugar chain part of the compound of the formula (I) for glycosylation, and the sugar addition product is secreted outside the cell without accumulating in the cell. The sugar added by the cell differs depending on the cell. For example, when a compound of formula (I) is given to B16 mouse melanoma cells, sialic acid (SA), an acyl derivative of neuraminic acid, is added and administered to rat PC12 cells. Then, galactose is added. Therefore, a sugar addition product having a desired sugar chain is obtained by giving a compound of the formula (I) having a desired sugar chain as a sugar chain primer to a cell to which a desired sugar is added, and further if necessary. By repeating this step, sugar addition products having various sugar chains can be synthesized. In this way, it is also possible to construct a sugar chain library having various sugar chains. In addition, since the sugar addition product is secreted outside the cell without being accumulated inside the cell, it can be easily recovered from the medium. Therefore, by using the compound of formula (I) of the present invention as a primer for sugar chain biosynthesis, the desired sugar can be obtained in a relatively simple process and with a high yield efficiently compared to the conventional method. A sugar chain containing a desired position can be synthesized.
[0020]
The glycosylated product with added sugar obtained from the cells as described above can be used for various applications depending on the added sugar chain. For example, it can be used for neutralizing viruses and proteins having specific affinity for the sugar chain added by the cells used. The sialic acid addition product obtained when using B16 mouse melanoma cells can neutralize influenza virus, and the galactose addition product obtained when using rat PC12 cells is the O-of pathogenic E. coli. 157 toxin and botulinum toxin can be neutralized. In addition to these, depending on the sugar chain to be added, a sugar addition product that can be used for neutralization of cholera toxin in mouse Neuro2a cells, tetanus toxin in rat RBL-2H3 cells, and Vibrio parahaemolyticus in human MOLT-4 cells is obtained. In addition, when human HL-60 cells are used, a sugar addition product having an anti-inflammatory effect may be obtained. Possible uses of glycosylated products with added sugar include, in addition to the above, uses for the production of bioprotective stimulants, various pharmaceuticals (anti-inflammatory agents, antibacterial agents, antitumor metastasis agents, diagnostic agents) Or the use for the production of a cell culture substrate, and the use for the production of an in-vivo drug carrier utilizing the target cell targeting property. In addition, since it is possible to construct a sugar chain library having various sugar chains as described above, it can be used for a wide range of studies such as functional studies of sugar chains.
[0021]
Therefore, the present invention provides a sugar chain biosynthesis primer comprising the compound represented by formula (I), and a neutralizing substance of a virus or bacterial toxin, a biological defense system stimulator, an anti-inflammatory substance of the primer for sugar chain biosynthesis. The present invention also relates to uses for the manufacture of agents, antibacterial agents, antitumor metastasis agents, diagnostic agents, cell culture substrates or in vivo drug carriers.
[0022]
The present invention also relates to a method for biosynthesis of a sugar chain using cells, and as described above, this method binds an alkyl chain, which may have a specific functional group at its end, to an oligosaccharide chain. By culturing cells in the presence of a primer for glycan biosynthesis, particularly a glycan biosynthetic primer containing a compound represented by formula (I), the saccharide is added to the glycan portion of the compound represented by formula (I). Glycosylation and recovering the sugar addition product from the culture medium and purifying as necessary. Examples of cells that can be used in the present method include the aforementioned B16 mouse melanoma cells, rat PC12 cells, mouse Neuro2a cells, rat RBL-2H3 cells, human MOLT-4 cells, and human HL-60 cells. it can.
[0023]
Of the sugar addition products obtained by using the compound of formula (I) of the present invention as a primer for sugar chain biosynthesis, -CH is attached to the end of the alkyl chain._ThreeC such as₁-C_FourA compound having an alkyl can be cleaved with an enzyme such as endoglycoceramidase or ceramide glycanase to make only an oligosaccharide chain, and can be used for various applications. In addition, at the end of the alkyl chain,_Three, -NH₂, -OH or -COOH-containing sugar addition products are subjected to chemical reactions such as reduction depending on the application, and are used in a wide range of applications such as polymerization of sugar chains by polymerization reactions and reactions with other compounds. Can be used.
[0024]
【Example】
The present invention will be described in detail by the following examples and test examples.
Example 1
D-Galβ1-4-D-Glcβ-O- (CH₂)₁₂-OH preparation
Process 1
Lactose was suspended in anhydrous pyridine and then benzyl chloride was added dropwise. The mixture was stirred at room temperature for 1 hour and then at 60 ° C. for 5 hours. The reaction mixture is cooled, ice water is added and the solvent is distilled off to give a syrupy product which is crystallized from acetone / methanol (1: 3) to give the formula (a):
[0025]
[Chemical 2]

[0026]
A lactose having a benzyl group represented by the formula was obtained as white crystals. α: β = 2: 1. Yield was about 90%.
[0027]
Process 2
The lactose having a benzyl group obtained in the previous step was treated with hydrogen bromide in acetic acid at room temperature for 2-3 hours. CH mixture₂Cl₂Diluted with water and NaHCO_ThreeWash with aqueous solution, dry, evaporate the solvent to obtain the formula (b):
[0028]
[Chemical Formula 3]

[0029]
As a colorless syrup, a compound having a brominated hydroxyl group bonded to the anomeric carbon of glucose shown in FIG. H-1: δ 6.8, J_1,2= 4.2 Hz (alpha isomer only).
[0030]
Process 3
The compound obtained in the previous step was washed with HgBr in tetrahydrofuran.₂And Hg (CN)₂ In the presence of 1.2 equivalents, HO (CH₂)₁₂The reaction is carried out with 3 to 4 equivalents of OH while observing the reaction with TLC. After the reaction is completed, the reaction is carried out and purified by column chromatography to obtain the formula (c):
[0031]
[Formula 4]

[0032]
The compound shown by these was obtained. Yield was 50-80%.
[0033]
Process 4
The compound obtained in the previous step is debenzylated in the presence of MeONa-MeOH to give the formula:
[0034]
[Chemical formula 5]

[0035]
D-Galβ1-4-D-Glcβ-O— (CH₂)₁₂-OH was obtained.
[0036]
Example 2
D-Galβ1-4-D-Glcβ-O- (CH₂)₁₂-N_ThreePreparation of
Steps 1-3
The same operation as in Example 1 was performed to obtain the compound represented by the above formula (c).
Process 4
The compound obtained in the previous step was dissolved in pyridine, 2 equivalents of mesyl chloride was added, and the reaction mixture was stirred at room temperature. After usual treatment, purification by column chromatography gives formula (d):
[0037]
[Chemical 6]

[0038]
The compound shown by these was obtained.
[0039]
Process 5
The compound obtained in the previous step is NaN in dimethylfuran at 60 ° C. until the reaction is complete._Three Reacted with 2 equivalents. After usual treatment, purification by chromatography yields the formula (e):
[0040]
[Chemical 7]

[0041]
The compound shown by these was obtained.
[0042]
Step 6
The compound obtained in the previous step is debenzylated in the presence of MeONa-MeOH to give the formula:
[0043]
[Chemical 8]

[0044]
D-Galβ1-4-D-Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_ThreeGot.
The physical property values of the obtained compound are as follows.
Melting point: 182.2-182.5 ° C
Elemental analysis (C_{twenty four}H₄₅N_ThreeO₁₁):
Calculated: C 52.26; H 8.22; N 7.62; O 31.90
Found: C 51.99; H 8.08; N 7.38
MS: 552 (M + H)⁺
Infrared spectrum: 3,234cm^-1 (OH); 2,915cm^-1 (CH symmetry); 2,846cm^-1
(CH reverse symmetry); 2,088cm^-1 (N^Three); 1,720cm^-1 (C = O stretch); 1,552cm^-1
¹H NMR: Glc H-1: 4.15 ppm (7.6 Hz) (β); Gal H-1:
4.18ppm (7.6Hz) (β); (CH₂)_n: 1.08-1.35ppm wide area signal
[0045]
Test example 1
B16 mouse melanoma cells (RIKEN Cell Bank) containing 10% FBS (GIBCO BRL) in DMEM (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) (penicillin G potassium 100 U / ml, streptomycin 0.1 g / l, NaHCO 3_Three3.7 g / l added) and subcultured when confluent.
For the preparation of a primer solution of the compound of formula (I) of the present invention, the formula:
[0046]
[Chemical 9]

[0047]
D-Galβ1-4-D-Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three 0.0070 g was dissolved in 127 μl of DMSO to obtain a 100 mM primer solution.
As the experimental medium, D-MEM / F-12 (HEPES 15 mM containing, GIBCO BRL), which is a liquid medium not containing phenol red, insulin 5 mg / ml (Wako Pure Chemical), transferrin 5 mg / ml (Wako Pure Chemical) And SeO₂ 50 μl was added to obtain TI / DF medium. Prepared 100 mM D-Galβ1-4-D-Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_ThreeWas added to the medium to adjust the final concentration to 50 μM. As a control medium, a TI / DF medium containing no primer was used.
Place 5 ml of experimental medium in a 100 mmφ petri dish, 4.0 × 10⁶Individual B16 mouse melanoma cells and petri dish with 5% CO₂It put into the incubator and culture | cultivated at 37 degreeC for 24 hours or 48 hours.
After a predetermined time, the reaction was stopped on ice, the culture supernatant was collected with a Pasteur pipette (medium fraction), the cell layer was washed twice with 2 ml of cold PBS, and the washing solution was included in the medium fraction. 2 ml of 0.25% EDTA / PBS was placed in a petri dish where the cells remained, and the cells were removed by placing them in an incubator (37 ° C.) for 2 minutes, and then the cell suspension was placed in a 15 ml centrifuge tube. The petri dish was washed twice with 2 ml of cold PBS, and the washing solution was put into a centrifuge tube containing a cell suspension and centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes. The supernatant was collected as a medium fraction. The pellet was well suspended in 2.1 ml of cold PBS, placed in an Eppendorf tube, and centrifuged at 2,500 rpm for 5 minutes. The supernatant was collected as a medium fraction, and the rest was obtained as a cell fraction.
[0048]
Extraction of glycolipids from medium fraction
10 ml of methanol was passed through a SepPak C-18 column (Waters) and equilibrated with 10 ml of milliQ ultrapure water. As an internal marker, 2.5 μl of milliQ ultrapure aqueous solution of 100 mM n-octyl-β-D-glucopyranoside was added to the medium fraction sample, and the sample was passed through the column. Glycolipids were eluted with 2 ml of methanol and then with 3 ml of chloroform / methanol (2/1), and the eluate was dried in a nitrogen gas stream.
[0049]
Extraction of glycolipids from cell fractions
As an internal marker, add 300 μl of 100 μM n-octyl-β-D-glucopyranoside in methanol to each cell fraction sample, add 666 μl of chloroform and 34 μl of methanol, shake with vortex and stir in a sonicator for 30 minutes. Was extracted and centrifuged at 15,000 rpm for 25 minutes. The supernatant was collected in an Eppendorf tube and dried in a nitrogen gas stream. To the cell pellet, 1 ml of chloroform / methanol / water (4/8/3) was added, and the mixture was shaken and stirred with a vortex. The glycolipid was extracted with a sonicator for 30 minutes and centrifuged at 15,000 rpm for 25 minutes. The supernatant was collected using an Eppendorf tube and dried in a nitrogen gas stream.
[0050]
Separation and identification of glycolipids in medium and cell fractions
The dried medium fraction was dissolved in chloroform / methanol (2/1) and placed on an HPTLC plate. On the other hand, the dried cell fraction was dissolved in chloroform / methanol (2/1) and again placed on the HPTLC plate. As a developing solvent, chloroform / methanol / 0.2% CaCl₂An aqueous solution (60/35/8) or chloroform / methanol / 0.25% KCl (aqueous solution) (60/35/8) was used. Each plate was loaded with GM3 (Neu-Acα2-3 lactosylceramide), a primer, and octylglucoside at a predetermined concentration for preparing a calibration curve.
[0051]
For color development of sialic acid added to the primer, resorcinol / hydrochloric acid reagent (200 mg of resorcinol dissolved in 10 ml of water, 80 ml of hydrochloric acid and 0.25 ml of 0.1 M copper sulfate were added, and water was added to make 100 ml. Solution) and placed in an oven at 110 ° C. for 20-30 minutes for color development. For quantification of glycolipids, a densitometer (Bio 1D image analyzer, Vilber Lourmat) is used. From the GM3 calibration curve, the amount of sialic acid addition product and GM3, from the primer calibration curve, the primer amount and octylglucoside The amount of octylglucoside was calculated from the calibration curve.
[0052]
In addition, the band considered to be a sialic acid addition product was transferred to a PVDF membrane by TLC blotting method (Taki, T., et al. Anal. Biochem. 225, 24-27, 1995) and analyzed by mass spectrum. The medium fraction was developed on an HPTLC plate, and amine was detected with a ninhydrin reagent.
[0053]
result of analysis
When the medium fraction obtained by culturing B16 mouse melanoma cells in the presence of the primer of the compound of formula (I) of the present invention was analyzed by HPTLC, the primer of the compound of the present invention was glycosylated with sialic acid by B16 mouse melanoma cells. It was recognized that On the other hand, when the cell fraction cultured in the presence of the primer was analyzed, no primer that was glycosylated with sialic acid was detected in the cell fraction. Was shown to be secreted into the medium without being accumulated.
[0054]
As shown in FIG. 1, by mass spectrometry, SA-D-Galβ1-4-D-Glcβ-O— (CH, which is a predicted product, a glycosylated compound with sialic acid, is also shown.₂)₁₂-N_ThreeSince a main peak appeared at a position (842.92) having a molecular weight almost the same as the molecular weight 842.88 of D-Galβ1-4-D-Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_ThreeWas found to be glycosylated with sialic acid by B16 mouse melanoma cells.
[0055]
Further, as shown in FIG. 2, by analysis of the medium fraction by HTPLC, after 24 hours and 48 hours of culture, among the primers of the compound of the present invention added to the medium, 4.8% and 48 hours after 24 hours. Later it was found that 9.0% was glycosylated with sialic acid.
[0056]
Further, as shown in FIG. 3, in the medium fraction after 48 hours of culture, 78% of the primer of the compound of the present invention added to the medium remained unchanged, and the primer of the compound of the present invention Was shown to be stable. From this result, it was shown that by culturing for 48 hours or more in the presence of the primer of the compound of the present invention, the primer of the compound of the present invention may be further glycosylated with sialic acid, thereby further increasing the glycosylation rate.
[0057]
In addition, an attempt to detect an amine with a ninhydrin reagent was negative. With the primer of the present invention, even after glycosylation with sialic acid, —N at the end of the alkyl chain was detected._ThreeWas found not to be reduced.
[0058]
Furthermore, as shown in FIG. 4, it was recognized that the ability to add sialic acid in B16 mouse melanoma cells per se was increased by culturing in the presence of primers.
[0059]
【The invention's effect】
From the above results, the primer of the compound of the formula (I) of the present invention has a high glycosylation rate and has the possibility of producing a larger amount of glycosyl form due to its stability. It has been observed to increase abilities. In addition, -N at the end of the alkyl chain_Three, -NH₂The primer of formula (I) of the present invention having —OH or —COOH is used for a wide range of applications such as the polymerization of sugar chains by polymerization reaction and the reaction with other compounds after the product of glycosylation. It has been shown to have advantages such as being able to.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows D-Galβ1-4-D-Glcβ-O— (CH₂)₁₂-N_Three1 shows a mass spectrum of a compound expected to be a compound.
FIG. 2 shows the rate of primer glycosylation after 24 and 48 hours of culture.
FIG. 3 shows the abundance ratio of primers and glycosylated primers in the medium fraction after 48 hours of culture.
FIG. 4 shows the ability of cells to add sialic acid in the presence of primers.

Claims

Formula (I): (G ₁ ) _x (G ₂ ) _y (G ₃ ) _z −L−X
[Wherein, G ₁ , G ₂ and G ₃ are each independently a monosaccharide residue having a cyclic structure or a derivative thereof; L represents —O— (CH ₂ ) _n —, —S— (CH ₂ ) _n — and —NH— (CH ₂ ) _n —; X is a —N ₃ group ; x, y, and z are each independently an integer of 0 to 10 N is an integer of 8-20. However, all of x, y, and z are not 0 at the same time], and (G ₁ ) _x (G ₂ ) _y (G ₃ ) _z is D-Galβ1-4-D- A compound that is Glcβ.

The compound according to claim 1, wherein n is 8-16.

The compound according to claim 2, wherein n is 12.

L is, -O- (CH ₂₎ _n - in which, the compound of any one of claims 1-3.

A compound of D-Galβ1-4-D-Glcβ-O— (CH ₂ ) ₁₂ —N ₃ .

A process for the preparation of a compound of formula (I) according to claim 1 comprising the formula:
(G ₁ ′) _x (G ₂ ′) _y (G ₃ ′) _z
(Wherein G ₁ ′, G ₂ ′, and G ₃ ′ are groups in which the hydroxyl groups of G ₁ , G ₂ , and G ₃ having the definitions of claim 1 are protected, respectively, x, y, And z is as defined in claim 1), wherein the hydroxyl group bonded to the anomeric carbon of the monosaccharide at the terminal of — (G ₃ ′) _z is brominated Is the formula:
(G ₁ ') _x (G ₂ ') _y (G ₃ ') _z -Br
Wherein G ₁ ′, G ₂ ′, G ₃ ′, x, y, and z are as described above;
The resulting compound of the formula: H-L-X '(wherein, L is are as defined in claim 1, X' is -O H) with a compound represented by, A compound of formula (I) having a protecting group, where X is —O 2 H :
(G ₁ ′) _x (G ₂ ′) _y (G ₃ ′) _z −L−X ′
(Wherein G ₁ ′, G ₂ ′, G ₃ ′, x, y, z, L, and X ′ are as described above);
The resulting compound is mesylated to give the formula:
(G ₁ ') _x (G ₂ ') _y (G ₃ ') _z -L-OMs
(Wherein G ₁ ′, G ₂ ′, G ₃ ′, x, y, z, and L are as described above, and Ms is a mesyl group);
The resulting compound is azidated to form a compound of formula (I) having a protecting group (where X is —N ₃ ):
(G ₁ ') _x (G ₂ ') _y (G ₃ ') _z -L-N ₃
(Wherein G ₁ ′, G ₂ ′, G ₃ ′, x, y, z, and L are as described above);
Compound (wherein, X is, - N ₃ a is) of formula (I) having the thus obtained protective group by removing the protecting group from a compound of formula (I) (wherein, X is, - N method comprising the Turkey give a is) _3.

A primer for sugar chain biosynthesis comprising the compound represented by formula (I) according to claim 1.