JP4528443B2

JP4528443B2 - Cyclic prosaposin derived peptides and uses thereof

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Publication number: JP4528443B2
Application number: JP2000567569A
Authority: JP
Inventors: デービッドイーライト; ジョンエスオーブライエン
Original assignee: ミエロスコーポレーション
Priority date: 1998-08-28
Filing date: 1999-08-20
Publication date: 2010-08-18
Anticipated expiration: 2019-08-20
Also published as: CA2341810A1; PL346346A1; JP2002523518A; HUP0103265A2; HUP0103265A3; PL204359B1; JP2010150272A; BR9913490A; EP1105420A1; ZA200102489B; IL141586A0; WO2000012553A1; KR20010079695A; CN1324367A; CZ2001655A3; AU751034B2; AU5690599A

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は、神経栄養性鎮痛ペプチドに関する。より具体的には、本発明は、サポシンC の活性領域に由来する、神経栄養効果および鎮痛効果を有する環状ペプチドに関する。
【０００２】
（背景技術）
神経栄養因子はニューロン細胞集団の生存、標的神経支配および/ または機能に影響を及ぼす能力を持つタンパク質またはペプチドである（Barde 、Neuron 2：1525-1534 、1989）。神経栄養因子の有効性はインビトロでもインビボでも詳細に記録されている。例えば神経成長因子（NGF ）は前脳コリン作動性、末梢および感覚ニューロンの栄養因子として作用し（Hefti ら、Neurobiol. Aging 10 ：515-533 、1989）、末梢神経への自然発生的損傷および物理的外傷による損傷を逆転させることができる（Richら、J. Neurocytol. 16 ：261-268 、1987）。脳由来神経栄養因子（BDNF）は末梢感覚ニューロン、黒質のドーパミン作動性ニューロン、中枢コリン作動性ニューロンおよび網膜神経節の栄養因子である（Henderson ら、Restor. Neurol. Neurosci. 5 ：15-28 、1993）。BDNFは、インビトロとインビボの両方で自然発生的細胞死を防止することが示されている（Hofer ら、Nature 331：262-262 、1988）。毛様体神経栄養因子（CNTF）はインビトロでヒヨコ胚毛様体神経節の生存を促進し、培養された交感感覚および脊髄運動ニューロンの生存を支える（Ipら、J. Physiol. Paris 85：122-130 、1991）。脱髄は多くの中枢神経系（CNS ）障害に共通する欠損であり、なかでも多発性硬化症（MS）は最も一般的である。完全な能力障害につながりうる慢性障害であるMSは、軸索はほとんど無傷のままで、ミエリン鞘への損傷を特徴とする。現在のところMSの効果的な治療法はない。脱髄が関与する他の中枢神経系障害には、急性散在性脳脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症、急性出血性白質萎縮症、進行性多巣性白質脳炎、異染性白質萎縮症および副腎白質萎縮症がある。また末梢神経系（PNS ）も、例えばギラン・バレー症候群で起こるように、脱髄を起こしうる（Pathologic Basis of Disease 、Robbins ら編、W.B. Saunders 、フィラデルフィア、1979、1578〜1582頁）。
【０００３】
糖尿病または化学療法によって起こるような末梢神経損傷および末梢神経障害は、最も一般的な末梢神経系障害を構成している。末梢神経系障害の現行の治療法は対症治療に過ぎず、病因を治療するものではない。
【０００４】
神経障害性疼痛は、神経の圧迫または挫傷および脊髄への外傷性損傷などの神経損傷に起因し、しばしば持続性または慢性である。ほとんどの外傷性神経損傷は神経腫の形成も引き起こし、そこでは異所性神経再生の結果として疼痛が起こる。また、腫瘍増殖が隣接する神経、脳または脊髄を圧迫すると、癌関連神経障害性疼痛が起こる。神経障害性疼痛は糖尿病およびアルコール依存症などの疾患とも関係する。ほとんどの場合、神経障害性疼痛は現在の医薬には抵抗性である。これらの医薬には重篤な副作用もある。米国特許出願第08/611,307号には、個体にプロサポシンの活性断片の有効量を投与することによって神経障害性疼痛を軽減または防止する方法が記載されている。
【０００５】
プロサポシンは、リソソーム加水分解酵素によるスフィンゴ糖脂質の加水分解に必要な一群の4 種類の小さい耐熱性糖タンパク質の前駆体である（Kishimoto ら、J. Lipid Res. 33：1255-1267 、1992）。プロサポシンはリソソームでタンパク質分解によってプロセシングされて、サポシンA 、B 、C およびD を生成する（O'Brien ら、FASEB J. 5：301-308 、1991）。O'Brien ら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91：9593-9596 、1994）、米国特許第5,571,787 号およびPCT 出願公開WO95/03821は、プロサポシン、サポシンC が神経突起伸長を刺激し、髄鞘形成の増加を促進することを開示している。また、米国特許第5,571,787 号、第5,696,080 号、第5,714,459 号およびPCT 出願公開WO95/03821には、ヒトサポシンC のアミノ酸8 〜29からなる22マーペプチド（CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL；配列番号１）が神経突起伸長を刺激することが開示されている。またこれらの文献には、サポシンC の上記活性22マーに含まれる18マーペプチド（YKEVTKLIDNNKTEKEIL；配列番号2 ）（V がY で置換されている）も神経突起伸長を促進し、血液脳関門を横切る能力を持つことが開示されている。O'Brien ら（FASEB J. 9：681-685 、1995）は、上記の22マーがコリンアセチルトランスフェラーゼ活性を刺激し、ニューロン細胞死を防止することを示している。活性な神経突起形成性断片の位置はサポシンC のアミノ末端内にある直鎖状12マー配列（LIDNNKTEKEIL；配列番号３）に限局された（O'Brien ら、FASEB J. 9：681-685 、1994）。Liepinshら（Nature Struct. Biol. 4：793-795 ）は、NK- 溶解素の神経栄養活性ペプチドセグメント（残基17〜30）のループコンフォメーションを環状ペプチドによって模倣できることを示した。
【０００６】
ペプチドをインビボで治療的に使用する際の主な障害は, タンパク質分解に対するそれらの感受性である。本発明は、タンパク質分解に対して良好な耐性を有し、血液脳関門を横切ることができる環状プロサポシンペプチドミメティックを提供するものである。
【０００７】
（発明の開示）
本発明の一態様は、約11〜25個のアミノ酸を有し、X₁X₂X₃NNX₄TX₅X₆X₇X₈ という配列（ここにX₁は疎水性アミノ酸（アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンまたはメチオニン）、X₂は疎水性アミノ酸、X₃はアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン、N はアスパラギン、X₄は任意のアミノ酸、T はスレオニン、X₅はグルタミン酸またはアスパラギン酸、X₆は任意のアミノ酸、X₇は疎水性アミノ酸、X₈は疎水性アミノ酸である）を含む環状神経栄養性鎮痛ペプチドである。本ペプチドは配列番号：５または６に示すアミノ酸配列を持つことが好ましい。
【０００８】
本発明は、セプタムで密封されたバイアルに入った、徐放性物質と共に製剤化された、凍結乾燥形の、リポソーム形の、局部投与に適した形の、または単位剤形の、上記ペプチドを含有する組成物も提供する。
【０００９】
本発明のもう一つの態様は、約11〜25個のアミノ酸を有し、X₁X₂X₃NNX₄TX₅X₆X₇X₈ という配列（ここにX₁は疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンまたはメチオニン）、X₂は疎水性アミノ酸、X₃はアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン、N はアスパラギン、X₄は任意のアミノ酸、T はスレオニン、X₅はグルタミン酸またはアスパラギン酸、X₆は任意のアミノ酸、X₇は疎水性アミノ酸、X₈は疎水性アミノ酸である）を含む環状ペプチドの薬学上有効な脱髄抑制量を、脱髄を起こしている哺乳動物に投与することからなる、哺乳動物における髄鞘形成誘導または脱髄抑制法である。この好ましい態様の一側面では、脱髄が多発性硬化症、虚血性損傷または外傷性損傷に起因する。投与は静脈内、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、脳脊髄内または局部投与であることが好ましい。ペプチドは、薬学上許容されうる担体を使って投与することが有利である。ペプチドは、配列番号：５または６に示す配列を持つことが好ましい。この好ましい態様のもう一つの側面では、哺乳動物がヒトである。
【００１０】
また本発明は、変性を起こしやすい神経組織を、約11〜25個のアミノ酸を有し、X₁X₂X₃NNX₄TX₅X₆X₇X₈ という配列（ここにX₁は疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンまたはメチオニン）、X₂は疎水性アミノ酸、X₃はアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン、N はアスパラギン、X₄は任意のアミノ酸、T はスレオニン、X₅はグルタミン酸またはアスパラギン酸、X₆は任意のアミノ酸、X₇は疎水性アミノ酸、X₈は疎水性アミノ酸である）を含む環状ペプチドの有効神経変性抑制量と接触させることからなる、神経組織における神経変性抑制または神経突起伸長促進法も提供する。ペプチドは配列番号：５または６に示すアミノ酸配列を持つことが好ましい。投与は静脈内、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、脳脊髄内または局所投与であることが好ましい。ペプチドは薬学上許容されうる担体を使って投与することが有利である。この好ましい態様のもう一つの側面では、ペプチドがラメラ構造に封入される。哺乳動物はヒトであることが好ましい。
【００１１】
本発明のさらにもう一つの態様は、ニューロン変性を抑制するのに有効な量の環状ペプチドを神経障害性疼痛に苦しんでいる哺乳動物に投与する段階を含む、神経障害性疼痛の治療を必要とする哺乳動物における神経障害性疼痛治療法であって、前記ペプチドペプチドが約11〜25個のアミノ酸を有し、X₁X₂X₃NNX₄TX₅X₆X₇X₈ という配列（ここにX₁は疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンまたはメチオニン）、X₂は疎水性アミノ酸、X₃はアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン、N はアスパラギン、X₄は任意のアミノ酸、T はスレオニン、X₅はグルタミン酸またはアスパラギン酸、X₆は任意のアミノ酸、X₇は疎水性アミノ酸、X₈は疎水性アミノ酸である）を含む方法である。上記の投与段階は静脈内、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、脳脊髄内、局所または経口投与であることが好ましい。ペプチドは配列番号：５または６に示すアミノ酸配列を持つことが有利である。ペプチドは薬学上許容されうる担体を使って投与することが有利である。この好ましい態様のもう一つの側面では、ペプチドがラメラ構造に封入される。哺乳動物はヒトであることが好ましい。
【００１２】
また本発明は、約11〜25個のアミノ酸を有し、X₁X₂X₃NNX₄TX₅X₆X₇X₈ という配列（ここにX₁は疎水性アミノ酸（ロイシン、アラニン、イソロイシン、バリン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンまたはメチオニン）、X₂は疎水性アミノ酸、X₃はアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン、N はアスパラギン、X₄は任意のアミノ酸、T はスレオニン、X₅はグルタミン酸またはアスパラギン酸、X₆は任意のアミノ酸、X₇は疎水性アミノ酸、X₈は疎水性アミノ酸である）を含む、哺乳動物における髄鞘形成誘導または脱髄抑制用の環状ペプチドも提供する。本ペプチドは、配列番号：５または６に示す配列を持つことが好ましい。
【００１３】
本発明のもう一つの態様は、約11〜25個のアミノ酸を有し、X₁X₂X₃NNX₄TX₅X₆X₇X₈ という配列（ここにX₁は疎水性アミノ酸（ロイシン、アラニン、イソロイシン、バリン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンまたはメチオニン）、X₂は疎水性アミノ酸、X₃はアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン、N はアスパラギン、X₄は任意のアミノ酸、T はスレオニン、X₅はグルタミン酸またはアスパラギン酸、X₆は任意のアミノ酸、X₇は疎水性アミノ酸、X₈は疎水性アミノ酸である）を含む、神経変性抑制または神経突起伸長促進用の環状ペプチドである。本ペプチドは、配列番号：５または６に示す配列を持つことが好ましい。
【００１４】
また本発明は、約11〜25個のアミノ酸を有し、X₁X₂X₃NNX₄TX₅X₆X₇X₈ という配列（ここにX₁は疎水性アミノ酸（ロイシン、アラニン、イソロイシン、バリン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンまたはメチオニン）、X₂は疎水性アミノ酸、X₃はアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン、N はアスパラギン、X₄は任意のアミノ酸、T はスレオニン、X₅はグルタミン酸またはアスパラギン酸、X₆は任意のアミノ酸、X₇は疎水性アミノ酸、X₈は疎水性アミノ酸である）を含む、神経障害性疼痛治療用の環状ペプチドも提供する。本ペプチドは配列番号：５または６に示す配列を持つことが好ましい。
【００１５】
（好ましい態様の詳細な説明）
本発明は、約11〜25個のアミノ酸を有し、X₁X₂X₃NNX₄TX₅X₆X₇X₈ （配列番号：４）というコンセンサス配列（ここにX₁は疎水性アミノ酸（アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンまたはメチオニン）、X₂は疎水性アミノ酸、X₃はアスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン、N はアスパラギン、X₄は任意のアミノ酸、T はスレオニン、X₅はグルタミン酸またはアスパラギン酸、X₆は任意のアミノ酸、X₇は疎水性アミノ酸、X₈は疎水性アミノ酸である）を含む環状サポシンC 由来ペプチドを提供する。好ましい一態様として本ペプチドはシクロ-[LLDNNKTEKLY]（配列番号：５）またはシクロ-[LIDNNATEEIL]（配列番号：６）という配列を持つ。これらの環状プロサポシンペプチドミメティックは束縛された構造を持つので、対応する直鎖状ペプチドと比較して、酵素分解に対する耐性がかなり高く、血液脳関門を横切る能力も高い。本発明の環状ペプチドは、TXLIDNNATEEILY（ここにX はD-アラニンである）（配列番号：７）の配列を持つ既知の高活性直鎖状プロサポシンペプチドミメティック（「プロサプチド（prosaptide）」）と比較して、神経突起伸長を刺激するのに同じ程度に有効またはより有効である（実施例１）。さらに本発明の環状ペプチドはインビトロで神経細胞死を防止するのにプロサプチドより有効である（実施例２）。これらの環状ペプチドは遊離のアミノ末端およびカルボキシ末端を持たない。したがってそれらは、アミノ末端およびカルボキシ末端からペプチドを分解するアミノペプチダーゼ類およびカルボキシペプチダーゼ類によるインビボでの分解に対して、より耐性である。
【００１６】
活性な11マー領域（配列番号：４）を含有する環状サポシンC 由来ペプチドおよびその神経栄養性類似体は、末梢および中枢神経系への毒物、外傷、虚血、変性および遺伝による損傷が起こった後の機能回復を促進するのに役立つ。また、これらのペプチドは髄鞘形成を刺激し、脱髄疾患の影響を打ち消す。これらのペプチドは哺乳動物（好ましくはヒト）のニューロン組織でニューロンの成長を刺激し、髄鞘形成を促進し、神経保護を促進し、プログラム細胞死を防止する。本発明のペプチドは、運動、感覚、末梢、タキソール誘導性および糖尿病性神経障害を含む（ただしこれらに限らない）様々な神経障害の治療にも使用できる。本明細書において神経障害とは末梢神経系の機能障害または病的変化をいい、臨床的には感覚または運動ニューロン異常を特徴とする。本ペプチドは鎮痛薬として、特に哺乳動物（好ましくはヒト）における神経障害性疼痛（これは外傷性損傷の何日もまたは何ヶ月も後になって発症することがあり、しばしば持続性または慢性である）の治療にも有用である。
【００１７】
天然プロサポシン配列内の第２アスパラギン残基（配列番号：４の２番目の「N 」に相当）は、N-アセチルグルコサミンでグリコシル化されることが知られており、これはタンパク質分解に対して多少の耐性を与えうる。標準的方法（すなわちメリフィールド合成）により本願非天然サポシンC 由来ペプチド内のこのアスパラギン残基を様々な炭水化物（好ましくはグルコース）で合成的に修飾することも本発明の範囲に包含される。
【００１８】
本発明の一態様は、配列番号：４に示す活性環状11マー領域を包含するサポシンC 由来ペプチドの有効神経突起伸長または髄鞘形成促進量を分化または未分化神経細胞に投与することにより、それら分化または未分化神経細胞における神経突起伸長または髄鞘形成の増加を促進する方法である。
【００１９】
本発明のサポシンC 由来環状ペプチドは、例えば当該ペプチド内の1 または複数のリジンおよび/ またはアルギニン残基の置換、1 または複数のチロシンおよび/ またはフェニルアラニン残基の置換、1 または複数のフェニルアラニン残基の欠失および/ または1 または複数のアミノ酸の保存的置換によって、サポシンC 配列または配列番号：4 〜6 とは異なっていてもよい。リジン/ アルギニンおよびチロシン/ フェニルアラニン残基の置換または欠失は、それぞれトリプシンおよびキモトリプシンによるペプチド分解の感受性を低下させるだろう。本発明の環状神経栄養および髄鞘栄養性ペプチド配列は、好ましくは約50個までアミノ酸、より好ましくは約30個までのアミノ酸、最も好ましくは約11〜25個のアミノ酸を有し、その中に配列番号：４に示す配列を含む。
【００２０】
本発明での使用が考えられるこれらペプチド配列の他の変異体は、わずかな挿入、欠失および置換を含む。例えば保存的アミノ酸置換が考えられる。そのような置換の例は、側鎖の化学的性質が同類であるアミノ酸のファミリー内で行なわれる置換である。アミノ酸のファミリーには、塩基性荷電アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性荷電アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）および芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）がある。特に、保存的アミノ酸置換が、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの単独置換、またはグルタミン酸によるアスパラギン酸の単独置換、またはセリンによるスレオニンの単独置換からなる保存的アミノ酸置換、または構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の保存的置換がペプチドの性質に有意な影響を与えないことは、一般に認められている。配列番号：４を含有する環状サポシンC 由来配列は、活性および安定性の増加などの様々な目的を達成するために修飾することができる。結合性、疎水性、親水性を増加させるなどの目的を達成するために、このコンセンサス配列の外側に、天然サポシンC 配列、それら天然配列の保存的置換物または無関係なペプチド配列などといった他のアミノ酸が存在してもよい。活性な神経栄養領域の外側の配列は、通例、活性には必要でない。したがってほとんどの場合、本ペプチドはこれらの配列の同一性とは無関係に活性だろう。また、上記のペプチドを、本明細書に記載するプロトコルを使って、上記の活性に関してスクリーニングすることができる。
【００２１】
当業者は、神経突起伸長を刺激し、神経細胞死を防止し、髄鞘形成を促進し、脱髄を抑制し、神経障害性疼痛を軽減し、感覚神経障害を治療する上記環状ペプチドの能力を、実施例１〜９に記載の方法を使って容易に決定できる。これらのペプチドの髄鞘形成促進能力および脱髄抑制能力の測定方法は、下記実施例３および４に記載されている。
【００２２】
細胞成長培地で神経栄養活性を得るための本発明ペプチドの典型的最小量は、通常少なくとも約5ng/mlである。インビトロではこの量またはこれより多い量の本発明環状合成ペプチドの使用が考えられる。通例、これらペプチドは0.1 μg/ml〜約10μg/mlの範囲の濃度で使用されるだろう。特定の組織に有効な量は、実施例１に従って決定できる。
【００２３】
神経細胞は、本発明のペプチドをそれらの細胞に直接投与することにより、インビトロまたはエクスビボで処置できる。これは、例えば細胞をその細胞型に適した成長培地で培養した後、その培地に本ペプチドを添加することによって行なうことができる。処置すべき細胞が典型的には脊椎動物、好ましくは哺乳動物の生体内にある場合は、いくつかの技法の一つで本組成物を投与することができる。最も好ましくは、所望の局所ペプチド濃度を得るのに十分な量で、本組成物を血液または組織に直接注入する。リジンおよびアルギニン残基を欠くペプチドでは、タンパク質分解が減少する。CNS 障害の治療の場合、小さいペプチド（すなわち20マー以下）なら、まず間違いなく、血液脳関門を横切って中枢神経系に入るだろう（Banks ら、Peptides 13 ：1289-1294 、1992を参照されたい）。
【００２４】
本発明のペプチドを脂肪酸でエステル化して、従来の酸触媒エステル化によりペプチド脂肪酸エステルを形成させてもよい。もう一つの選択肢として、合成操作で付加される最後のアミノ酸自体を市販のエステル化アミノ酸にすると、エステル化反応の必要がなくなる。ペプチドエステル形成用として考えられる脂肪酸には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸およびリノール酸が含まれる。
【００２５】
また本発明ペプチドは、合成操作中に市販のアセチル化リジン、アルギニンまたはアスパラギン残基を組み込むことによってアセチル化してもよい。これらの修飾ペプチドは親化合物の活性を保っている。このような修飾は、疎水性が増加するので、血液脳関門を横切るペプチドの能力を助長するだろう。
【００２６】
神経障害の治療には、所望の局所ニューロトロフィン濃度を得るのに十分な量での直接頭蓋内注入または脳脊髄液への注入も使用できる。どちらの場合も、薬学上許容されうる注射用の担体を使用する。そのような担体には、例えばリン酸緩衝食塩水やリンゲル液がある。もう一つの選択肢として、直接局所注射または全身投与によって末梢神経組織に本組成物を投与することもできる。静脈内、脳脊髄内、筋肉内、皮内、皮下、頭蓋内、鼻腔内、硬膜外、局所および経口投与など、様々な従来の投与法が考えられる。鎮痛薬として使用する場合は、直接筋肉内または静脈内注射による投与が好ましい。
【００２７】
本発明のペプチド組成物は、患者に投与される一日投与量に等しい投与量の注射用組成物または局所製剤などの単位剤形で、または徐放性組成物として、包装し、投与することができる。PBS 中にまたは凍結乾燥状態で一日投与量の活性成分を含有するセプタム付きバイアルは単位投与量の一例である。神経疾患、脱髄の治療に関して、また一般に鎮痛薬として、または神経障害性疼痛の治療に関して、脊椎動物の体重に基づく本発明ペプチドの適切な一日全身投与量は、約0.01〜約10,000μg/kgの範囲にある。一日全身投与量は約0.1 〜1,000 μg/kgであることがより好ましい。一日全身投与量は約10〜100 μg/kgであることが最も好ましい。したがって典型的な体重70kgのヒトの場合、投与量は一日に約0.7 〜700,000 μg 、より好ましくは一日に約7 〜70,000μg 、もっとも好ましくは約700 〜7,000 μg/kgになりうる。局所投与される物質の一日投与量はおよそ１桁少ないだろう。経口投与も考えられる。
【００２８】
本発明の好ましい一態様では、本神経栄養ペプチドを、その植込みにより、インビボの神経細胞に局所的に投与する。本発明では、例えばポリ乳酸、ポリガラクト酸（polygalactic acid ）、再生コラーゲン、多重膜リポソームおよび他の数多くの従来のデポー剤が特に考えられる。注入ポンプ、マトリックス捕捉システムおよび経皮送達装置との併用も考えられる。ペプチドは植込みに先立って、米国特許第5,529,914 号に記載されているようなポリエチレングリコール相似被膜内に封入することもできる。
【００２９】
本発明の神経栄養ペプチドはミセルまたはリポソームに封入してもよい。リポソーム封入技術はよく知られている。リポソームは、標的組織を結合できるレセプター、リガンドまたは抗体を使用することにより、神経組織などの特定の組織に誘導することができる。これらの製剤の製造は当技術分野ではよく知られている（Radin ら、Meth. Enzymol. 98 ：613-618 、1983）。
【００３０】
現在のところ神経系の完全な機能的再生と構造的完全性の修復を促進できる市販の医薬はない。CNS の場合は特にそうである。神経栄養因子を使った末梢神経の再生は本発明の範囲に包含される。さらに神経栄養因子は、神経集団または脳の特定の領域の変性を伴なう神経変性疾患の治療にも、治療上役立ちうる。パーキンソン病の主因は、黒質のドーパミン作動性ニューロンの変性である。プロサポシンに対する抗体はヒト脳切片中の黒質のドーパミン作動性ニューロンを免疫組織化学的に染色するので、本発明の神経栄養ペプチドは、パーキンソン病の治療に治療上役立ちうる。中高年の視力喪失につながる眼の神経変性障害である網膜神経障害も、本発明のペプチドを使って治療できる。
【００３１】
脳内のニューロン集団に到達させるには、神経栄養因子を頭蓋内に投与する必要があるだろうと長い間考えられてきた。というのは、これらのタンパク質は血液脳関門を横切らないからである。米国特許第5,571,787 号は、サポシンC に由来するヨウ素化神経栄養性18マー断片が血液脳関門を横切ることを開示している。約22個までのアミノ酸を有する本発明のペプチドもこの関門を横切るだろうから静脈内投与することができ、短いペプチドほどより多くの輸送が起こる。運動ニューロンなどの他の神経ニューロン集団も、静脈内注射によって治療することができる。ただし、脳脊髄液への直接注入も代替経路として考えられる。
【００３２】
細胞は、髄鞘形成を促進するためまたは脱髄を防止するために、インビボ、エクスビボまたはインビトロで上述したように処置することができる。MS、急性散在性白質脳炎、進行性多巣性白質脳炎、異染性白質萎縮症および副腎白質萎縮症などの神経線維の脱髄が起こる疾患は、その疾患に冒された細胞に本発明の神経栄養ペプチドを投与することにより、減速または停止させることができる。脱髄疾患または他の神経損傷の逆転も考えられる。
【００３３】
本発明の組成物は、神経栄養因子および髄鞘形成促進物質の効果を研究するための研究手段として、インビトロで使用できる。しかしより実用的には、本発明の組成物は、実験用試薬および細胞成長培地の成分として、インビトロで成長を促進し神経細胞を維持するために使用できる。
【００３４】
本発明のペプチドは、Protein Technologies製Symphonyペプチド合成装置で当技術分野周知の自動固相プロトコル（Traeciakら、Tetrahedron Lett. 33：4557-4561 、1992）により、確立された方法とFmoc化学とを用いて、固体支持体上で合成される。環化されたペプチドはTFA/水/ トリイソプロピルシラン（95：2.5 ：2.5 ）を使って固体支持体から切り離した。そのペプチドを、0.3 ％トリフルオロ酢酸（TFA ）/ アセトニトリル溶液を溶離液とするC-18カラムでの逆相HPLCを使って精製した。配列番号：５（ペプチドA ）および６（ペプチドB ）に示すペプチドの質量スペクトル分析により、環状ペプチドが合成されたことを確認した［配列番号：５：MH⁺ 1333（理論値）、1333（実測値）；配列番号：６：MH⁺ 1127（理論値）、1127（実測値）］。
【００３５】
以下の実施例は例証であって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３６】
実施例１
インビトロでの神経突起伸長の刺激
NS20Y 神経芽腫細胞を10％ウシ胎仔血清（FCS ）を含有するDMEM中で生育させた。細胞をトリプシンで取り出し、30mmペトリ皿中のカバーガラス上に播いた。20〜24時間後に、0.5 ％FCS と様々な濃度のペプチドA 、ペプチドB またはTX14(A) とを含有する2ml のDMEMで培地を置換した。細胞をさらに24時間培養し、PBS で洗浄し、ブアン溶液（飽和ピクリン酸水溶液/ ホルマリン/ 酢酸 15 ：5 ：1 ）で30分間固定した。固定液をPBS で除去し、神経突起伸長を位相差顕微鏡で採点した。１細胞径に等しいかそれより長い1 または複数のはっきりした神経突起を示す細胞を陽性と採点した。神経突起保有細胞のパーセンテージを決定するために各ペトリ皿の異なる部分で少なくとも200 細胞を採点し、測定を二連に行なった。
【００３７】
3 つのペプチド全てがNS20Y 細胞における神経突起伸長を誘導した。神経突起伸長を50％増加させるペプチド濃度であるT_1/2（ED₅₀）は、TX14(A) とペプチドB の場合、1.0ng/mlだった。ペプチドA のT_1/2は0.6ng/mlだった。このように、ペプチドB の有効性はTX14(A) と同じ程度であり、ペプチドA はTX14(A) より有効だった。これは、本発明の環化されたペプチドが、確立された基準「プロサプチド」と比較して優れた活性を持つことを示している。
【００３８】
実施例２
インビトロでの細胞死の防止
NS20Y 細胞を実施例１と同様に培養皿に播き、カバーガラス上、0.5 ％ウシ胎仔血清中で、TX14(A) 、ペプチドA またはペプチドB の存在下または不在下に2 日間生育させた。培地を除去し、0.2 ％トリパンブルー/PBS溶液を各ウェルに加えた。各ウェルの4 領域で400 細胞を数えて青く染色された死細胞を倒立顕微鏡で総数に対するパーセンテージとして採点した。二連の平均誤差は5 ％だった。TX14(A) 、ペプチドA およびペプチドB によりトリパンブルー陽性（死）細胞の数が減少した。TX14(A) の場合、神経細胞死の防止に関するT_1/2（ED₅₀）は1.0ng/mlだった。ペプチドA およびB はより強力で、T_1/2値はそれぞれ0.6ng/mlと0.8ng/mlだった。これは本環状ペプチドが、基準となる直鎖状「プロサポチド」と比較して、プログラム細胞死からの神経細胞の救出に並外れた活性を持つことを示している。
【００３９】
実施例３
エクスビボ髄鞘形成測定法
Satomi（Zool. Sci. 9：127-137 、1992）に従って新生仔マウス小脳外植片を調製する。新生仔マウス小脳が正常にニューロン分化を起こし、髄鞘形成が始まる期間中、培養しながら22日間にわたって、神経突起伸長と髄鞘形成を観察する。外植片の調製後2 日目に、11〜25個のアミノ酸を有し配列番号：４に示す配列を含有する環状サポシンC 由来ペプチド（10μg/ml）を加え（対照外植片３、処理外植片３）、神経突起の伸長と髄鞘形成を明視野顕微鏡でビデオカメラを使って評価する。8 日目に、ペプチドを含有する培養物は対照培養より薄く、より広く拡がっている。１５日目に、ペプチド処理した培養物は長い突起を持つ数多くの細胞を外植片の周辺部に含有し、無処理対照培養物ではこれがそれほどには目立たない。ペプチド処理した培養物は、22日の時点で対照外植片と比較して皮質下白質に有意に多い有髄軸索を含有する。このように本発明のペプチドは、エクスビボで、分化中の小脳における髄鞘形成の増加を誘導する。
【００４０】
実施例４
脱髄の防止
シュワン細胞死の防止は、脱髄の防止と関連している。シュワン細胞は、多くのミエリン鞘を含有する。11〜25個のアミノ酸を有し配列番号：４に示す配列を含有する環状サポシンC 由来ペプチドを培養シュワン細胞に添加すると、シュワン細胞死が用量依存的に減少し、ミエリン特異的な脂質であるスルファチドのシュワン細胞への組み込みが刺激される。これは、本発明の環状ペプチドがシュワン細胞死による脱髄を防止できることを示している。
【００４１】
実施例５
外傷性虚血性 CNS 損傷の治療におけるペプチドの使用
脊髄に外傷性損傷を持つヒトに、11〜25個のアミノ酸を有し配列番号：４に示す配列を含有する約100 μg/mlの環状サポシンC 由来ペプチドを、滅菌食塩溶液としてまたは損傷部位で当該ペプチドの遅い連続的放出が起こりうるようにデポー剤として、脳脊髄内注射または直接注射する。改善は運動神経機能の増加（すなわち四肢運動の増加）によって評価する。さらなる改善が起こらなくなるまで治療を続ける。
【００４２】
実施例６
脱髄障害の治療におけるペプチドの使用
初期MSと診断された患者に、11〜25個のアミノ酸を有し配列番号：４に示す配列を含有する環状サポシンC 由来ペプチドを、直接静脈内注射により、脳脊髄液に実施例３と同じ用量範囲を使って与える。投薬を2 〜5 日毎にまたは毎週1 回繰り返し、筋力、筋骨格協調および髄鞘形成の改善（MRI で決定されるもの）を観察する。
【００４３】
実施例７
Chung モデルラットにおける神経障害性疼痛の軽減
この実施例では、末梢神経障害疼痛のChung 実験モデルにおける、11〜25個のアミノ酸を有し配列番号：４に示す配列を含有する環状サポシンC 由来ペプチドのボーラス髄腔内注射の効果を説明する。各ペプチドを化学合成し、精製し、滅菌PBS に溶解し、中性pHに緩衝化する。Kim ら（Pain 50 ：355 、1992）が以前に記述した外科的処置を雄ラットに施して異痛症状態を誘発する。手術の2 週間後に脊椎カテーテルを導入する。5 日後に、ペプチドを0.007 、0.07および0.7 μg/ラットの量で投与する。次に、較正されたフォン・フライ毛を使って圧力閾値を決定する。加えた圧力に反応して足を引っ込めるのに動物が要する時間が長いほど、神経障害性疼痛は重症度が低い。本ペプチドは、閾値圧力を有意に増加させ、神経障害性疼痛の有意な軽減が示される。
【００４４】
実施例８
感覚神経障害の治療
感覚神経障害を誘発するためにマウスにタキソールを投与する。タキソール処置マウスに、50μg/kg、100 μg/kgまたは250 μg/kgの、11〜25個のアミノ酸を有し配列番号：４に示す配列を含有する環状サポシンC 由来ペプチドを投与する。感覚神経障害の指標として、温度感覚の喪失をHargreaves感覚試験装置を使って測定する。3 種類のペプチド用量は、タキソール処置マウスにおける温度感覚の喪失を防止または遅延するのに、それぞれ有効である。したがって、本発明の合成サポシンC 由来ペプチドは、感覚神経障害を有効に抑制する。
【００４５】
実施例９
糖尿病ラットにおける神経障害性疼痛の軽減
この実施例では、糖尿病性神経障害のラットモデルにおける、腹腔内投与による、11〜25個のアミノ酸を有し配列番号：４に示す配列を含有する環状サポシンC 由来ペプチドのkgの効果を説明する。
【００４６】
Calcutt ら（Pain 68:293-299 、1996）によって記述されているようにストレプトゾトシン（50mg/kg 体重、0.9 ％滅菌食塩水に新たに溶解したもの）の単回腹腔内注射で膵臓β細胞を除去しインスリン欠乏症を誘発することにより、ラットを糖尿病にする。2 日後に、血中グルコースレベルを測定することにより、ストレプトゾトシン注射ラットでの糖尿病を確認する。ラットでの糖尿病の研究における非空腹時高血糖症の一般に受け入れられている定義に従い、15mmol/l未満の血中グルコース濃度を持つストレプトゾトシン注射動物をそれ以降の研究から排除した。
【００４７】
8 週間の時点で、異痛症の指標として有害化学物質ホルマリンに対する行動反応を分析することにより、糖尿病ラットと対照ラットの両方を調べる（Calcutt ら、前掲、1996）。簡単に述べると、ラットの右後足の背面に、新たに調製したホルマリン（滅菌食塩水中の0.5 ％溶液50μl ）を皮下注射する。この濃度のホルマリンは、対照ラットでは最大下行動反応を誘発し、糖尿病ラットではQ 相と第2 相での痛感過敏の検出を可能にする（Calcutt ら、Eur. J. Pharmacol. 285：189-197 、1995）。動物を、足の継続的可視化が可能なように作られた観察箱に移す。各動物の処置群について知らされていない観察者により、1 分間の畏縮（flinch）の回数を5 分間隔で次の60分間にわたって数える。糖尿病ラットの研究について以前に定義されたように、第1 相は畏縮の初期測定（注射後1 〜2 分および5 〜6 分）と定義され、Q （静止）相は10〜11、15〜16および20〜21分に行なわれる測定と定義され、第2 相はその後の全注射後測定と定義される（例えばMalmbergら、Neurosci. Lett., 161 ：45-48 、1993を参照されたい）。各相での活性の比較は、その相内の測定点での畏縮を合計することによって行なわれる。糖尿病ラット５異常な畏縮反応。
【００４８】
糖尿病ラットを4 匹ずつの2 群に分け、それらに食塩水、または11〜25個のアミノ酸を有し配列番号：４に示す配列を含有する環状サポシンC 由来ペプチドを、それぞれ投与する。0.5 ％ホルマリンによる処置の2 時間前に、腹腔内投与により食塩水または200 μg/kgペプチドで糖尿病ラットを処置する。ペプチドの投与により、第1 相での異常な畏縮反応は完全に防止され、第2 相での反応は70％改善される。このようにペプチドの非経口投与は、疼痛を伴なう糖尿病神経障害のラットモデルにおいてホルマリン注射による疼痛を軽減し、運動ニューロン機能を改善する。
【配列表】

[0001]
(Technical field)
The present invention relates to neurotrophic analgesic peptides. More specifically, the present invention relates to a cyclic peptide having a neurotrophic effect and an analgesic effect derived from the active region of saposin C.
[0002]
(Background technology)
A neurotrophic factor is a protein or peptide that has the ability to affect the survival, target innervation and / or function of a neuronal cell population (Barde, Neuron 2: 1525-1534, 1989). The effectiveness of neurotrophic factors has been documented in detail both in vitro and in vivo. For example, nerve growth factor (NGF) acts as a forebrain cholinergic, peripheral and sensory neuron trophic factor (Hefti et al., Neurobiol. Aging 10: 515-533, 1989), spontaneous damage and physical damage to peripheral nerves Trauma damage can be reversed (Rich et al., J. Neurocytol. 16: 261-268, 1987). Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is a trophic factor for peripheral sensory neurons, substantia nigra dopaminergic neurons, central cholinergic neurons and retinal ganglia (Henderson et al., Restor. Neurol. Neurosci. 5: 15-28 1993). BDNF has been shown to prevent spontaneous cell death both in vitro and in vivo (Hofer et al., Nature 331: 262-262, 1988). Ciliary neurotrophic factor (CNTF) promotes the survival of chick embryo ciliary ganglia in vitro and supports the survival of cultured sympathetic sensations and spinal motor neurons (Ip et al., J. Physiol. Paris 85: 122 -130, 1991). Demyelination is a deficiency common to many central nervous system (CNS) disorders, with multiple sclerosis (MS) being the most common. A chronic disorder that can lead to complete disability, MS is characterized by damage to the myelin sheath, with axons remaining almost intact. There is currently no effective treatment for MS. Other central nervous system disorders involving demyelination include acute disseminated encephalomyelitis, amyotrophic lateral sclerosis, acute hemorrhagic leukotrophy, progressive multifocal leukoencephalitis, metachromatic leukotrophy And adrenoleukodystrophy. The peripheral nervous system (PNS) can also cause demyelination, as occurs, for example, in Guillain-Barre syndrome (Pathologic Basis of Disease, edited by Robbins et al., W.B. Saunders, Philadelphia, 1979, pages 1578-1582).
[0003]
Peripheral nerve injury and peripheral neuropathy, such as those caused by diabetes or chemotherapy, constitute the most common peripheral nervous system disorders. Current treatments for peripheral nervous system disorders are only symptomatic treatments, not cures.
[0004]
Neuropathic pain results from nerve damage, such as nerve compression or contusion and traumatic damage to the spinal cord, and is often persistent or chronic. Most traumatic nerve injury also causes the formation of neuromas, where pain occurs as a result of ectopic nerve regeneration. Also, cancer-related neuropathic pain occurs when tumor growth compresses adjacent nerves, brain or spinal cord. Neuropathic pain is also associated with diseases such as diabetes and alcoholism. In most cases, neuropathic pain is resistant to current medications. These medications also have serious side effects. US patent application Ser. No. 08 / 611,307 describes a method of reducing or preventing neuropathic pain by administering to an individual an effective amount of an active fragment of prosaposin.
[0005]
Prosaposin is a group of four small thermostable glycoprotein precursors required for the hydrolysis of glycosphingolipids by lysosomal hydrolases (Kishimoto et al., J. Lipid Res. 33: 1255-1267, 1992). Prosaposin is proteolytically processed in lysosomes to produce saposins A, B, C and D (O'Brien et al., FASEB J. 5: 301-308, 1991). O'Brien et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9593-9596, 1994), US Pat. No. 5,571,787 and PCT application publication WO95 / 03821 are prosaposins, saposins C that stimulate neurite outgrowth It is disclosed to promote increased sheath formation. In addition, in US Pat. Nos. 5,571,787, 5,696,080, 5,714,459 and PCT application publication WO95 / 03821, a 22-mer peptide (CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL; SEQ ID NO: 1) consisting of amino acids 8-29 of human saposin C stimulates neurite outgrowth. Is disclosed. In these references, an 18-mer peptide (YKEVTKLIDNNKTEKEIL; SEQ ID NO: 2) (V is substituted with Y) contained in the above-mentioned 22-mer of saposin C also promotes neurite outgrowth and crosses the blood-brain barrier. It is disclosed that it has the ability. O'Brien et al. (FASEB J. 9: 681-685, 1995) show that the 22mer described above stimulates choline acetyltransferase activity and prevents neuronal cell death. The position of the active neurite-forming fragment was confined to a linear 12-mer sequence (LIDNNKTEKEIL; SEQ ID NO: 3) within the amino terminus of saposin C (O'Brien et al., FASEB J. 9: 681-685, 1994). Liepinsh et al. (Nature Struct. Biol. 4: 793-795) showed that the loop conformation of the NK-lysin neurotrophic peptide segment (residues 17-30) can be mimicked by cyclic peptides.
[0006]
The main obstacle to the therapeutic use of peptides in vivo is their sensitivity to proteolysis. The present invention provides cyclic prosaposin peptide mimetics that have good resistance to proteolysis and can cross the blood brain barrier.
[0007]
(Disclosure of the Invention)
One aspect of the invention has about 11-25 amino acids and X₁X₂X_ThreeNNX_FourTX_FiveX₆X₇X₈ Array (X here₁Is a hydrophobic amino acid (alanine, leucine, isoleucine, valine, tyrosine, tryptophan, phenylalanine or methionine), X₂Is a hydrophobic amino acid, X_ThreeIs aspartic acid, glutamic acid, lysine or arginine, N is asparagine, X_FourIs any amino acid, T is threonine, X_FiveIs glutamic acid or aspartic acid, X₆Is any amino acid, X₇Is a hydrophobic amino acid, X₈Is a cyclic neurotrophic analgesic peptide containing a hydrophobic amino acid. The peptide preferably has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6.
[0008]
The present invention provides the above peptides in a vial sealed with a septum, formulated with a sustained release substance, lyophilized, liposomal, suitable for topical administration or in unit dosage form. Compositions containing are also provided.
[0009]
Another embodiment of the present invention has about 11-25 amino acids and X₁X₂X_ThreeNNX_FourTX_FiveX₆X₇X₈ Array (X here₁Is a hydrophobic amino acid (leucine, isoleucine, valine, tyrosine, tryptophan, phenylalanine or methionine), X₂Is a hydrophobic amino acid, X_ThreeIs aspartic acid, glutamic acid, lysine or arginine, N is asparagine, X_FourIs any amino acid, T is threonine, X_FiveIs glutamic acid or aspartic acid, X₆Is any amino acid, X₇Is a hydrophobic amino acid, X₈A method of inducing myelination or demyelination in a mammal comprising administering a pharmaceutically effective demyelinating amount of a cyclic peptide comprising a hydrophobic amino acid to a demyelinating mammal is there. In one aspect of this preferred embodiment, the demyelination is due to multiple sclerosis, ischemic injury or traumatic injury. The administration is preferably intravenous, intramuscular, intradermal, subcutaneous, intracranial, intracerebral spinal or local. The peptide is advantageously administered using a pharmaceutically acceptable carrier. The peptide preferably has the sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6. In another aspect of this preferred embodiment, the mammal is a human.
[0010]
The present invention also relates to a nerve tissue that is prone to degeneration, having about 11 to 25 amino acids,₁X₂X_ThreeNNX_FourTX_FiveX₆X₇X₈ Array (X here₁Is a hydrophobic amino acid (leucine, isoleucine, valine, tyrosine, tryptophan, phenylalanine or methionine), X₂Is a hydrophobic amino acid, X_ThreeIs aspartic acid, glutamic acid, lysine or arginine, N is asparagine, X_FourIs any amino acid, T is threonine, X_FiveIs glutamic acid or aspartic acid, X₆Is any amino acid, X₇Is a hydrophobic amino acid, X₈There is also provided a method for inhibiting neurodegeneration or promoting neurite outgrowth in neural tissue, comprising contacting an effective neurodegeneration-suppressing amount of a cyclic peptide containing a hydrophobic amino acid). The peptide preferably has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6. Administration is preferably intravenous, intramuscular, intradermal, subcutaneous, intracranial, intracerebral spinal or topical. The peptide is advantageously administered using a pharmaceutically acceptable carrier. In another aspect of this preferred embodiment, the peptide is encapsulated in a lamellar structure. The mammal is preferably a human.
[0011]
Yet another aspect of the present invention involves the treatment of neuropathic pain comprising administering to a mammal suffering from neuropathic pain an amount of a cyclic peptide effective to inhibit neuronal degeneration. A method of treating neuropathic pain in a mammal, wherein the peptide peptide has about 11 to 25 amino acids and X₁X₂X_ThreeNNX_FourTX_FiveX₆X₇X₈ Array (X here₁Is a hydrophobic amino acid (leucine, isoleucine, valine, tyrosine, tryptophan, phenylalanine or methionine), X₂Is a hydrophobic amino acid, X_ThreeIs aspartic acid, glutamic acid, lysine or arginine, N is asparagine, X_FourIs any amino acid, T is threonine, X_FiveIs glutamic acid or aspartic acid, X₆Is any amino acid, X₇Is a hydrophobic amino acid, X₈Is a hydrophobic amino acid). The administration step is preferably intravenous, intramuscular, intradermal, subcutaneous, intracranial, intracerebral spinal, topical or oral administration. Advantageously, the peptide has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6. The peptide is advantageously administered using a pharmaceutically acceptable carrier. In another aspect of this preferred embodiment, the peptide is encapsulated in a lamellar structure. The mammal is preferably a human.
[0012]
The present invention also has about 11-25 amino acids and X₁X₂X_ThreeNNX_FourTX_FiveX₆X₇X₈ Array (X here₁Is a hydrophobic amino acid (leucine, alanine, isoleucine, valine, tyrosine, tryptophan, phenylalanine or methionine), X₂Is a hydrophobic amino acid, X_ThreeIs aspartic acid, glutamic acid, lysine or arginine, N is asparagine, X_FourIs any amino acid, T is threonine, X_FiveIs glutamic acid or aspartic acid, X₆Is any amino acid, X₇Is a hydrophobic amino acid, X₈Are also provided for cyclic peptides for inducing myelination or inhibiting demyelination in mammals. The peptide preferably has the sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6.
[0013]
Another embodiment of the present invention has about 11-25 amino acids and X₁X₂X_ThreeNNX_FourTX_FiveX₆X₇X₈ Array (X here₁Is a hydrophobic amino acid (leucine, alanine, isoleucine, valine, tyrosine, tryptophan, phenylalanine or methionine), X₂Is a hydrophobic amino acid, X_ThreeIs aspartic acid, glutamic acid, lysine or arginine, N is asparagine, X_FourIs any amino acid, T is threonine, X_FiveIs glutamic acid or aspartic acid, X₆Is any amino acid, X₇Is a hydrophobic amino acid, X₈Is a cyclic amino acid for inhibiting neurodegeneration or promoting neurite outgrowth. The peptide preferably has the sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6.
[0014]
The present invention also has about 11-25 amino acids and X₁X₂X_ThreeNNX_FourTX_FiveX₆X₇X₈ Array (X here₁Is a hydrophobic amino acid (leucine, alanine, isoleucine, valine, tyrosine, tryptophan, phenylalanine or methionine), X₂Is a hydrophobic amino acid, X_ThreeIs aspartic acid, glutamic acid, lysine or arginine, N is asparagine, X_FourIs any amino acid, T is threonine, X_FiveIs glutamic acid or aspartic acid, X₆Is any amino acid, X₇Is a hydrophobic amino acid, X₈Cyclic peptides for the treatment of neuropathic pain are also provided. The peptide preferably has the sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6.
[0015]
(Detailed description of preferred embodiments)
The present invention has about 11-25 amino acids and X₁X₂X_ThreeNNX_FourTX_FiveX₆X₇X₈ (SEQ ID NO: 4) consensus sequence (here X₁Is a hydrophobic amino acid (alanine, leucine, isoleucine, valine, tyrosine, tryptophan, phenylalanine or methionine), X₂Is a hydrophobic amino acid, X_ThreeIs aspartic acid, glutamic acid, lysine or arginine, N is asparagine, X_FourIs any amino acid, T is threonine, X_FiveIs glutamic acid or aspartic acid, X₆Is any amino acid, X₇Is a hydrophobic amino acid, X₈Is a hydrophobic amino acid) and provides a cyclic saposin C-derived peptide. In a preferred embodiment, the peptide has the sequence cyclo- [LLDNNKTEKLY] (SEQ ID NO: 5) or cyclo- [LIDNNATEEIL] (SEQ ID NO: 6). Because these cyclic prosaposin peptide mimetics have a constrained structure, they are much more resistant to enzymatic degradation and more capable of crossing the blood brain barrier than the corresponding linear peptides. The cyclic peptide of the present invention is a known highly active linear prosaposin peptide mimetic ("prosaptide") having the sequence TXLIDNNATEEILY (where X is D-alanine) (SEQ ID NO: 7). Is as effective or more effective in stimulating neurite outgrowth as compared to (Example 1). Furthermore, the cyclic peptides of the present invention are more effective than propeptides in preventing neuronal cell death in vitro (Example 2). These cyclic peptides do not have a free amino terminus and a carboxy terminus. They are therefore more resistant to in vivo degradation by aminopeptidases and carboxypeptidases that degrade peptides from the amino and carboxy termini.
[0016]
Cyclic saposin C-derived peptide containing an active 11-mer region (SEQ ID NO: 4) and its neurotrophic analogs have been toxic, traumatic, ischemic, degenerative and genetic damage to the peripheral and central nervous system Helps to promote later functional recovery. These peptides also stimulate myelination and counteract the effects of demyelinating diseases. These peptides stimulate neuronal growth in mammalian (preferably human) neuronal tissue, promote myelination, promote neuroprotection, and prevent programmed cell death. The peptides of the invention can also be used to treat a variety of neurological disorders including, but not limited to, motor, sensory, peripheral, taxol-induced and diabetic neuropathy. As used herein, neuropathy refers to a dysfunction or pathological change in the peripheral nervous system, clinically characterized by sensory or motor neuron abnormalities. The peptide is an analgesic, particularly neuropathic pain in mammals (preferably humans), which can develop days or months after traumatic injury and is often persistent or chronic ) Is also useful for treatment.
[0017]
The second asparagine residue in the natural prosaposin sequence (corresponding to the second “N” in SEQ ID NO: 4) is known to be glycosylated with N-acetylglucosamine, which is proteolytic. Can give some tolerance. It is also within the scope of the present invention to synthetically modify this asparagine residue in the non-natural saposin C derived peptide of the present application with various carbohydrates (preferably glucose) by standard methods (ie Merrifield synthesis).
[0018]
One aspect of the present invention is to administer an effective neurite outgrowth or myelination promoting amount of a saposin C-derived peptide comprising the active cyclic 11-mer region shown in SEQ ID NO: 4 to differentiated or undifferentiated neurons. A method of promoting increased neurite outgrowth or myelination in differentiated or undifferentiated neurons.
[0019]
The saposin C-derived cyclic peptide of the present invention includes, for example, substitution of one or more lysine and / or arginine residues, substitution of one or more tyrosine and / or phenylalanine residues, and one or more phenylalanine residues in the peptide. And / or conservative substitution of one or more amino acids may differ from the saposin C sequence or SEQ ID NOs: 4-6. Substitution or deletion of lysine / arginine and tyrosine / phenylalanine residues will reduce the sensitivity of peptide degradation by trypsin and chymotrypsin, respectively. The cyclic neurotrophic and myelinotropic peptide sequences of the present invention preferably have up to about 50 amino acids, more preferably up to about 30 amino acids, most preferably about 11-25 amino acids, in which The sequence shown in SEQ ID NO: 4 is included.
[0020]
Other variants of these peptide sequences contemplated for use in the present invention include minor insertions, deletions and substitutions. For example, conservative amino acid substitutions are possible. Examples of such substitutions are those made within a family of amino acids whose side chain chemistry is similar. The family of amino acids includes basic charged amino acids (lysine, arginine, histidine), acidic charged amino acids (aspartic acid, glutamic acid), nonpolar amino acids (alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), non- There are charged polar amino acids (glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, tyrosine) and aromatic amino acids (phenylalanine, tryptophan and tyrosine). In particular, a conservative amino acid substitution is a conservative amino acid substitution consisting of a single substitution of leucine with isoleucine or valine, a single substitution of aspartic acid with glutamic acid, or a single substitution of threonine with serine, or a structurally related amino acid. It is generally accepted that similar conservative substitutions do not significantly affect peptide properties. The cyclic saposin C-derived sequence containing SEQ ID NO: 4 can be modified to achieve various purposes such as increased activity and stability. Outside this consensus sequence, other amino acids such as natural saposin C sequences, conservative substitutions of these natural sequences or irrelevant peptide sequences, etc. are used to achieve purposes such as increasing binding, hydrophobicity, hydrophilicity, etc. May be present. Sequences outside the active neurotrophic region are usually not required for activity. Thus, in most cases, the peptide will be active regardless of the identity of these sequences. The peptides described above can also be screened for the activities described above using the protocols described herein.
[0021]
Those skilled in the art have the ability of the above cyclic peptides to stimulate neurite outgrowth, prevent neuronal cell death, promote myelination, suppress demyelination, reduce neuropathic pain, and treat sensory neuropathy Can be readily determined using the methods described in Examples 1-9. Methods for measuring the ability of these peptides to promote myelination and suppress demyelination are described in Examples 3 and 4 below.
[0022]
A typical minimum amount of a peptide of the invention for obtaining neurotrophic activity in cell growth media is usually at least about 5 ng / ml. In vitro use of this or higher amounts of the cyclic synthetic peptides of the present invention is contemplated. Typically, these peptides will be used at concentrations ranging from 0.1 μg / ml to about 10 μg / ml. An effective amount for a particular tissue can be determined according to Example 1.
[0023]
Neurons can be treated in vitro or ex vivo by administering the peptides of the invention directly to those cells. This can be done, for example, by culturing the cells in a growth medium suitable for the cell type and then adding the peptide to the medium. If the cells to be treated are typically in a vertebrate, preferably a mammal, the composition can be administered by one of several techniques. Most preferably, the composition is injected directly into the blood or tissue in an amount sufficient to obtain the desired local peptide concentration. For peptides lacking lysine and arginine residues, proteolysis is reduced. For the treatment of CNS disorders, small peptides (ie 20mers or less) will most likely first enter the central nervous system across the blood brain barrier (see Banks et al., Peptides 13: 1289-1294, 1992). ).
[0024]
The peptide of the present invention may be esterified with a fatty acid to form a peptide fatty acid ester by conventional acid-catalyzed esterification. As another option, if the last amino acid added in the synthesis operation itself is a commercially available esterified amino acid, the need for an esterification reaction is eliminated. Fatty acids contemplated for peptide ester formation include lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid and linoleic acid.
[0025]
The peptides of the invention may also be acetylated by incorporating commercially available acetylated lysine, arginine or asparagine residues during the synthesis procedure. These modified peptides retain the activity of the parent compound. Such modifications will facilitate the ability of the peptide to cross the blood brain barrier as hydrophobicity is increased.
[0026]
For treatment of neurological disorders, direct intracranial injection or cerebrospinal fluid injection in an amount sufficient to obtain the desired local neurotrophin concentration can also be used. In either case, a pharmaceutically acceptable carrier for injection is used. Such carriers include, for example, phosphate buffered saline and Ringer's solution. As another option, the composition can be administered to peripheral nerve tissue by direct local injection or systemic administration. A variety of conventional administration methods are contemplated, including intravenous, intracerebral spinal, intramuscular, intradermal, subcutaneous, intracranial, intranasal, epidural, topical and oral administration. When used as an analgesic, administration by direct intramuscular or intravenous injection is preferred.
[0027]
The peptide composition of the present invention may be packaged and administered in unit dosage form such as injectable composition or topical formulation equivalent to the daily dose administered to a patient, or as a sustained release composition. Can do. A septum vial containing a daily dose of the active ingredient in PBS or lyophilized is an example of a unit dose. For the treatment of neurological diseases, demyelination, and generally as an analgesic or for the treatment of neuropathic pain, a suitable daily systemic dosage of the peptide of the invention based on the vertebrate body weight is about 0.01 to about 10,000 μg / It is in the range of kg. More preferably, the daily systemic dose is about 0.1 to 1,000 μg / kg. Most preferably, the daily systemic dosage is about 10-100 μg / kg. Thus, for a typical 70 kg human, the dosage may be about 0.7 to 700,000 μg per day, more preferably about 7 to 70,000 μg per day, most preferably about 700 to 7,000 μg / kg. The daily dose of locally administered substance will be approximately an order of magnitude less. Oral administration is also conceivable.
[0028]
In a preferred embodiment of the present invention, the neurotrophic peptide is locally administered to nerve cells in vivo by its implantation. In the present invention, for example, polylactic acid, polygalactic acid, regenerated collagen, multilamellar liposomes and many other conventional depots are particularly contemplated. Combinations with infusion pumps, matrix capture systems and transdermal delivery devices are also contemplated. Prior to implantation, the peptide can also be encapsulated in a polyethylene glycol-like coating as described in US Pat. No. 5,529,914.
[0029]
The neurotrophic peptide of the present invention may be encapsulated in micelles or liposomes. Liposome encapsulation technology is well known. Liposomes can be directed to specific tissues, such as neural tissue, by using receptors, ligands or antibodies that can bind the target tissue. The manufacture of these formulations is well known in the art (Radin et al., Meth. Enzymol. 98: 613-618, 1983).
[0030]
There are currently no over-the-counter medicines that can promote complete functional regeneration and structural integrity repair of the nervous system. This is especially true for the CNS. Regeneration of peripheral nerves using neurotrophic factors is within the scope of the present invention. In addition, neurotrophic factors can be therapeutically useful in the treatment of neurodegenerative diseases that involve degeneration of a neural population or specific areas of the brain. The main cause of Parkinson's disease is degeneration of nigral dopaminergic neurons. Because antibodies against prosaposin stain substantia nigra dopaminergic neurons in human brain sections immunohistochemically, the neurotrophic peptides of the present invention may be therapeutically useful in the treatment of Parkinson's disease. Retinal neuropathy, a neurodegenerative disorder of the eye that leads to middle-aged vision loss, can also be treated using the peptides of the present invention.
[0031]
It has long been thought that neurotrophic factors would need to be administered intracranial to reach neuronal populations in the brain. This is because these proteins do not cross the blood brain barrier. US Pat. No. 5,571,787 discloses that an iodinated neurotrophic 18-mer fragment derived from saposin C crosses the blood brain barrier. Peptides of the invention having up to about 22 amino acids will also cross this barrier and can be administered intravenously, with shorter peptides resulting in more transport. Other neuronal populations such as motor neurons can also be treated by intravenous injection. However, direct injection into the cerebrospinal fluid is also considered as an alternative route.
[0032]
The cells can be treated as described above in vivo, ex vivo or in vitro to promote myelination or prevent demyelination. Diseases that cause demyelination of nerve fibers, such as MS, acute disseminated leukoencephalitis, progressive multifocal leukoencephalitis, metachromatic leukotrophy, and adrenoleukodystrophy, can be applied to cells affected by the disease. By administering a neurotrophic peptide, it can be slowed or stopped. A reversal of demyelinating disease or other nerve damage is also conceivable.
[0033]
The composition of the present invention can be used in vitro as a research tool for studying the effects of neurotrophic factors and myelination promoting substances. More practically, however, the compositions of the present invention can be used as components of laboratory reagents and cell growth media to promote growth and maintain neurons in vitro.
[0034]
The peptides of the present invention use the established methods and Fmoc chemistry according to automated solid phase protocols well known in the art (Traeciak et al., Tetrahedron Lett. 33: 4557-4561, 1992) on a Symphony peptide synthesizer from Protein Technologies. And synthesized on a solid support. The cyclized peptide was cleaved from the solid support using TFA / water / triisopropylsilane (95: 2.5: 2.5). The peptide was purified using reverse phase HPLC on a C-18 column, eluting with a 0.3% trifluoroacetic acid (TFA) / acetonitrile solution. Mass spectral analysis of the peptides shown in SEQ ID NO: 5 (peptide A) and 6 (peptide B) confirmed that a cyclic peptide was synthesized [SEQ ID NO: 5: MH.⁺ 1333 (theoretical value), 1333 (actual value); SEQ ID NO: 6: MH⁺ 1127 (theoretical value), 1127 (actual value)].
[0035]
The following examples are illustrative and do not limit the scope of the invention.
[0036]
Example 1
Stimulation of neurite outgrowth in vitro
NS20Y neuroblastoma cells were grown in DMEM containing 10% fetal calf serum (FCS). Cells were removed with trypsin and plated on cover slips in 30 mm Petri dishes. After 20-24 hours, the medium was replaced with 2 ml of DMEM containing 0.5% FCS and various concentrations of peptide A, peptide B or TX14 (A). The cells were further cultured for 24 hours, washed with PBS, and fixed with a Buan solution (saturated picric acid aqueous solution / formalin / acetic acid 15: 5: 1) for 30 minutes. The fixative was removed with PBS and neurite outgrowth was scored with a phase contrast microscope. Cells showing one or more distinct neurites equal to or longer than one cell diameter were scored as positive. To determine the percentage of neurite-bearing cells, at least 200 cells were scored in different parts of each Petri dish and measurements were performed in duplicate.
[0037]
All three peptides induced neurite outgrowth in NS20Y cells. T, the peptide concentration that increases neurite outgrowth by 50%_1/2(ED₅₀) Was 1.0 ng / ml for TX14 (A) and peptide B. P of peptide A_1/2Was 0.6 ng / ml. Thus, peptide B was as effective as TX14 (A), and peptide A was more effective than TX14 (A). This indicates that the cyclized peptides of the present invention have superior activity compared to the established reference “proseptide”.
[0038]
Example 2
Prevention of cell death in vitro
NS20Y cells were seeded in culture dishes in the same manner as in Example 1 and grown on a cover glass in 0.5% fetal calf serum in the presence or absence of TX14 (A), peptide A or peptide B for 2 days. The medium was removed and 0.2% trypan blue / PBS solution was added to each well. Counting 400 cells in 4 areas of each well, the dead cells stained blue were scored as a percentage of the total number with an inverted microscope. The average error for duplicates was 5%. TX14 (A), peptide A and peptide B reduced the number of trypan blue positive (dead) cells. For TX14 (A), T for prevention of neuronal cell death_1/2(ED₅₀) Was 1.0 ng / ml. Peptides A and B are more potent and T_1/2The values were 0.6ng / ml and 0.8ng / ml, respectively. This indicates that this cyclic peptide has extraordinary activity in neuronal rescue from programmed cell death compared to the standard linear “prosapotide”.
[0039]
Example 3
Ex vivo myelination measurement method
Neonatal mouse cerebellar explants are prepared according to Satomi (Zool. Sci. 9: 127-137, 1992). During the period when neonatal mouse cerebellum normally undergoes neuronal differentiation and myelination begins, neurite outgrowth and myelination are observed over 22 days in culture. On the second day after preparation of the explant, a cyclic saposin C-derived peptide (10 μg / ml) containing 11 to 25 amino acids and containing the sequence shown in SEQ ID NO: 4 was added (control explant 3, treated Explants 3), neurite outgrowth and myelination are assessed with a bright field microscope using a video camera. On day 8, the culture containing the peptide is thinner and more widely spread than the control culture. On day 15, the peptide-treated culture contains many cells with long protrusions in the periphery of the explant, which is less noticeable in the untreated control culture. Peptide-treated cultures contain significantly more myelinated axons in subcortical white matter compared to control explants at 22 days. Thus, the peptides of the invention induce increased myelination in the differentiating cerebellum ex vivo.
[0040]
Example 4
Prevention of demyelination
Prevention of Schwann cell death is associated with prevention of demyelination. Schwann cells contain many myelin sheaths. When a cyclic saposin C-derived peptide having 11 to 25 amino acids and containing the sequence shown in SEQ ID NO: 4 is added to cultured Schwann cells, Schwann cell death is reduced in a dose-dependent manner and is a myelin-specific lipid. Incorporation of sulfatide into Schwann cells is stimulated. This indicates that the cyclic peptide of the present invention can prevent demyelination due to Schwann cell death.
[0041]
Example 5
Traumatic ischemic CNS Use of peptides in the treatment of injury
About 100 μg / ml of cyclic saposin C-derived peptide having 11-25 amino acids and containing the sequence shown in SEQ ID NO: 4 as a sterile saline solution or at the site of injury in humans with traumatic injury in the spinal cord Injected intracerebral spinal cord or directly as a depot so that slow continuous release of the peptide can occur. Improvement is assessed by an increase in motor function (ie, increased limb movement). Continue treatment until no further improvement occurs.
[0042]
Example 6
Use of peptides in the treatment of demyelinating disorders
A patient diagnosed with early MS has a cyclic saposin C-derived peptide containing 11 to 25 amino acids and containing the sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the cerebrospinal fluid directly by intravenous injection as in Example 3. Give using dose range. Dosing is repeated every 2-5 days or once weekly to observe improvements in muscle strength, musculoskeletal coordination, and myelination (as determined by MRI).
[0043]
Example 7
Chung Reduction of neuropathic pain in model rats
This example describes the effect of bolus intrathecal injection of a cyclic saposin C-derived peptide having 11-25 amino acids and containing the sequence shown in SEQ ID NO: 4 in a Chung experimental model of peripheral neuropathic pain . Each peptide is chemically synthesized, purified, dissolved in sterile PBS and buffered to neutral pH. Male rats undergo the surgical procedure previously described by Kim et al. (Pain 50: 355, 1992) to induce allodynia. A spinal catheter is introduced 2 weeks after surgery. Five days later, the peptide is administered in amounts of 0.007, 0.07 and 0.7 μg / rat. The pressure threshold is then determined using the calibrated von Frey hair. The longer the animal takes to retract the paw in response to the applied pressure, the less severe the neuropathic pain. The peptide significantly increases the threshold pressure and shows a significant reduction in neuropathic pain.
[0044]
Example 8
Sensory neuropathy treatment
Taxol is administered to mice to induce sensory neuropathy. Taxol-treated mice are administered 50 μg / kg, 100 μg / kg or 250 μg / kg of cyclic saposin C derived peptide containing 11-25 amino acids and containing the sequence shown in SEQ ID NO: 4. As an indicator of sensory neuropathy, loss of temperature sensation is measured using a Hargreaves sensory test device. The three peptide doses are each effective in preventing or delaying loss of temperature sensation in taxol-treated mice. Therefore, the synthetic saposin C-derived peptide of the present invention effectively suppresses sensory neuropathy.
[0045]
Example 9
Reduction of neuropathic pain in diabetic rats
This example illustrates the effect of kg of a cyclic saposin C-derived peptide having 11-25 amino acids and containing the sequence shown in SEQ ID NO: 4 by intraperitoneal administration in a rat model of diabetic neuropathy. .
[0046]
Remove pancreatic beta cells with a single intraperitoneal injection of streptozotocin (50 mg / kg body weight, freshly dissolved in 0.9% sterile saline) as described by Calcutt et al. (Pain 68: 293-299, 1996) Rats are rendered diabetic by inducing insulin deficiency. Two days later, diabetes is confirmed in streptozotocin-injected rats by measuring blood glucose levels. In accordance with the generally accepted definition of non-fasting hyperglycemia in a study of diabetes in rats, streptozotocin-injected animals with a blood glucose concentration of less than 15 mmol / l were excluded from further studies.
[0047]
At 8 weeks, both diabetic and control rats are examined by analyzing behavioral responses to the hazardous chemical formalin as an indicator of allodynia (Calcutt et al., Supra, 1996). Briefly, freshly prepared formalin (50 μl of a 0.5% solution in sterile saline) is injected subcutaneously into the back of the rat's right hind paw. This concentration of formalin elicits submaximal behavioral responses in control rats and allows detection of hyperalgesia in Q and phase 2 in diabetic rats (Calcutt et al., Eur. J. Pharmacol. 285: 189- 197, 1995). Animals are transferred to an observation box designed to allow continuous visualization of the paws. Count the number of 1-minute flinches over a next 60-minute interval at 5-minute intervals by an unaware observer of each animal treatment group. As previously defined for the study of diabetic rats, phase 1 is defined as the initial measurement of crimp (1-2 and 5-6 minutes after injection) and Q (resting) phase is 10-11, 15- Measured at 16 and 20-21 minutes, phase 2 is defined as subsequent post-injection measurements (see, eg, Malmberg et al. Neurosci. Lett., 161: 45-48, 1993) . The comparison of activity in each phase is performed by summing the crimps at the measurement points within that phase. Diabetic rat 5 abnormal crimp response.
[0048]
Diabetic rats are divided into 2 groups of 4 animals, and saline or a cyclic saposin C-derived peptide having 11 to 25 amino acids and containing the sequence shown in SEQ ID NO: 4 is administered to each group. Diabetic rats are treated with saline or 200 μg / kg peptide by intraperitoneal administration 2 hours prior to treatment with 0.5% formalin. Peptide administration completely prevents the abnormal crimp response in the first phase and improves the response in the second phase by 70%. Thus, parenteral administration of peptides alleviates pain from formalin injection and improves motor neuron function in a rat model of painful diabetic neuropathy.
[Sequence Listing]

Claims

Having about 11-25 amino acids and comprising the sequence X ₁ X ₂ X ₃ NNX ₄ TX ₅ X ₆ X ₇ X ₈ for use in promoting neurite outgrowth or for inhibiting neuronal cell death A cyclic peptide comprising:
X ₁ is a hydrophobic amino acid (leucine, alanine, isoleucine, valine, tyrosine, tryptophan, phenylalanine or methionine);
X ₂ is a hydrophobic amino acid,
X ₃ is aspartic acid, glutamic acid, lysine or arginine;
N is asparagine,
X ₄ is any amino acid,
T is threonine, X ₅ is glutamic acid or aspartic acid,
X ₆ is any amino acid,
X ₇ is a hydrophobic amino acid,
X ₈ is a hydrophobic amino acid ,
A peptide in which the cyclic peptide has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or 6 .

A composition in a septum-sealed vial comprising the peptide of claim 1.

A composition formulated with a sustained-release substance comprising the peptide according to claim 1.

A freeze-dried composition comprising the peptide according to claim 1.

A liposome-shaped composition comprising the peptide according to claim 1.