JP4516643B2

JP4516643B2 - Cationic polymer preparations to promote exchange between nucleotide sequences

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Publication number: JP4516643B2
Application number: JP26225599A
Authority: JP
Inventors: 厚丸山; 園鐘金; 敏宏赤池
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1999-09-16
Filing date: 1999-09-16
Publication date: 2010-08-04
Anticipated expiration: 2019-09-16
Also published as: JP2001078769A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの操作の際に使用するためのカチオン性高分子の調製物に関する。より具体的には、二重鎖ＤＮＡ鎖あるいはＲＮＡ鎖における特定部位のヌクレオチド配列を相同なヌクレオチド配列（もう一方のＤＮＡあるいはＲＮＡ鎖の対応部位に対しては相補配列である。）で交換する際に用いるカチオン性高分子の調製物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
相同的組換えは、二重鎖ＤＮＡにおける遺伝情報の再編成であり、遺伝情報の保存および複製のために生物界では普遍的に行われる生物現象である。その相同的組換えには、無数の塩基配列から相同な塩基配列を探し出し、相同鎖同士の交換プロセスが含まれる。今日までに、大腸菌内でこれらの機能をつかさどるタンパク質（ＲｅｃＡ）が同定され（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ.，１５５，７７−８５（１９７７）．Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｌ．ＵＳＡ，７４，５２８０−５２８４（１９７７）；Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ，７７，２６１１−２６１５（１９８０）など）、類似構造を持ち同様の機能を有するタンパク質が原核生物、真核生物（Ｃｅｌｌ，６９，４５７−４７０（１９９２）など）、ウイルス（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ.，１３，７４７３−７４８１（１９８５））など広い範囲で見出されている。また、これらＲｅｃＡタンパク質が、相同的組換えに深く関与していることが明らかとなりつつある。ＲｅｃＡタンパク質は、単鎖ＤＮＡに結合し複合体を形成し、この単鎖ＤＮＡと二重鎖ＤＮＡとの間における相同な塩基配列を探し出す。相同配列を見つけ出すと、単鎖ＤＮＡと二重鎖ＤＮＡとの複合体（三重鎖）形成を経て、ＤＮＡを放出する（ＴａｎｐａｋｕｓｈｉｔｓｕＫａｋｕｓａｎＫｏｓｏ．４４，６３１−６４２（１９９９））。このようにＲｅｃＡは二重鎖の一方を交換したヘテロ二重鎖を形成して行く。この過程には、ＡＴＰおよびＭｇ²⁺が補助因子として必要である。
【０００３】
一方、上述した二重鎖ＤＮＡ上のＤＮＡ鎖交換の原理は、高次構造を持つＲＮＡからの逆転写ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）やプラスミドＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅過程において重要なプロセスである。具体的には、これら二重鎖ＤＮＡや高次構造を有する単鎖ＲＮＡ鎖上の相補配列へのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にすること、さらには、目的とする増幅産物の合成が完了した時点で、加熱することにより鋳型となる単鎖ＤＮＡあるいは単鎖ＲＮＡを増幅産物である二重鎖ＤＮＡまたは二重鎖ＲＮＡ鎖から解離させることにより、次のプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする必要がある。
【０００４】
二重鎖ＤＮＡのＤＮＡ交換を加熱などの変性過程を行わずに人工的に達成した例としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）があり（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｐｇｙ，１４．１７００１７０４（１９９６）など）、このＰＮＡを用いた新しいＤＮＡおよびゲノム解析法が種種報告されている。しかしながら、ＰＮＡは低イオン濃度下ではＤＮＡ鎖交換を促進するが、生理的イオン濃度条件下では、その性能が極めて低下する。また、天然型ＤＮＡやＲＮＡと異なり、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼやリガーゼなどの基質とならない問題があり、ＰＮＡによるＤＮＡやゲノム解析に制約をもたらしているのが現状である。
【０００５】
このようなＰＮＡの問題点を克服した例としては、ペプチド-ＤＮＡ複合体がある（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ.，１２１，２０１２−２０２０（１９９９））。しかしながら、Ｍｇイオン存在下ではＤＮＡ鎖交換活性が阻害されるため、ＤＮＡポリメラーゼなどのＭｇイオン依存型酵素との併用が制限される。
【０００６】
上述のように、生体内でＲｅｃＡが行っている機能を模写し、多種多様な条件下において十分な機能を発揮できるものは報告されていない。
【０００７】
一方、最近、本発明者を初めとする研究者らにより、くし型（ｃｏｍｂ-ｔｙｐｅ）のコポリマーが、生体内と同等の条件下でＤＮＡ二重鎖あるいは三重鎖の形成及び安定化を促進することが報告された（ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ.，８，３−６（１９９７）；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｍ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．３９，１３３−１３４（１９９８）；ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ.，９，２９２−２９９（１９９８））。また、上記の最後の論文では、上記コポリマー、特に高度にグラフト化されたコポリマーが低イオン強度媒体中でＤＮＡ鎖間のハイブリダイゼーションが促進されることも示唆されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、人工的に二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける特定部位におけるヌクレオチド配列を、それに相同なヌクレオチド配列で交換する際に、ＤＮＡやＲＮＡの加熱などの変性過程を必要とすることなく、反応プロセスの省略あるいは短縮、その他の条件の緩和を可能とするような手段を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上述したように、ある一定のくし型コポリマーは生体内と同等の条件下でＤＮＡ二重鎖あるいは三重鎖の形成及び安定化を促進し、しかも、ＤＮＡ鎖間のハイブリダイゼーションをも促進することが知られている。しかしながら、かような三重鎖ＤＮＡが特定のコポリマーによって安定化されるにもかかわらず、該コポリマーを初めとするカチオン性高分子は上記のような作用と共にまたは別個に単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡと二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡとの間の鎖交換をも促進しうることが、今回、見出された。
【００１０】
すなわち、本発明はかような知見に基くものである。
【００１１】
したがって、本発明によれば、二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける特定部位のヌクレオチド配列の該配列に相同のヌクレオチド配列による交換反応を促進するための、カチオン性高分子を有効成分とする調製物が提供される。
【００１２】
【発明を実施するための好ましい態様】
二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡとは、相補的な塩基（またはヌクレオチド）対、例えば、ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）及びグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）、ＲＮＡでは、Ａとウラシル（Ｕ）およびＧとＣとの対合により形成されるＤＮＡ間で、あるいはＲＮＡ間で形成された高次構造を保ちうる鎖を意味する。本発明の文脈上、このようなＤＮＡあるいはＲＮＡは生体成分から単離されたものであっても、また単離されることなく、生体組織片中に存在するものであってもよい。勿論のこと、合成された二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡも包含される。
【００１３】
かようなＤＮＡあるいはＲＮＡにおける特定部位のヌクレオチド配列とは、直鎖状になったＤＮＡあるいはＲＮＡの末端部位あるいは中間部位等のいかなる部位のヌクレオチド配列であってもよい。また、該配列に相同のヌクレオチド配列とは、配列を構成する塩基が実質的に同一であることを意味する。実質的に同一とは、上記特定部位のヌクレオチド配列とそれに対する相同配列はＡ、Ｔ、Ｇ及びＣのそれぞれが少なくとも９５％は連続する配列順において同一であるか、あるいはそのような配列においてＴがＵに置き代えられている場合をいう。
【００１４】
したがって、交換反応は、相補的な二本の鎖からなる二重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが、二本の鎖のうちの一本の鎖における特定部位のヌクレオチド配列がそれに相同のヌクレオチド配列を有する単鎖ＤＮＡまたはＲＮＡにより交換されることが意図されている。具体的な交換の様式としては、二重鎖ＤＮＡの特定部位のヌクレオチド配列が単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける相同のヌクレオチド配列により交換されるか、あるいは二重鎖ＲＮＡの特定部位のヌクレオチド配列が単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける相同のヌクレオチド配列により交換される場合が挙げられる。
【００１５】
単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける相同のヌクレオチド配列は、該単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡ分子全体を占めるものであっても、一部分を占めるものであってもよいが、一般的に全体を占めるものを強く意図している。
【００１６】
交換あるいは交換反応とは、二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの特定部位のヌクレオチド配列が、該配列に相同の単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにヌクレオチド配列により単に入れ替わり再構成されることを意味し、生来の特定部位のヌクレオチド配列の切断除を伴うものでない。
【００１７】
本発明に従えば、このような交換反応は、カチオン性高分子の存在下で効率よく起こすことができる。カチオン性高分子としては、上記交換反応に資するものであればいかなるポリマーであってもよいが、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン等のアミノ酸、グルコサミン等の糖、エチレンイミン、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルメタクノレート等の合成モノマー等のカチオン性基を形成しうるモノマーに由来するカチオン性ホモポリマー及びコポリマーを挙げることができる。
【００１８】
カチオン性高分子は、さらに、上記のカチオン性ホモポリマーあるいはコポリマーが親水性高分子で側鎖修飾されたグラフト型構造を有するものが好ましい。このような側鎖（グラフト鎖）としては、ポリエチレングリコール等の水溶性ポリアルキレングリコール、デキストラン、プルラン、アミロース、アラビノガラクタン等の水溶性多糖、セリン、アスパラギン、グルタミン、スレオニン等の親水性アミノ酸を含む水溶性ポリアミノ酸、アクリルアミド及びその誘導体をモノマーとして用い合成される水溶性高分子、メタクリル酸及びアクリル酸並びにその誘導体（例、ヒドロキシエチルメタクリレート）をモノマーとして用い合成される水溶性高分子、ポリビニルアルコール及びその誘導体からなる群より選ばれる１種以上の水溶性高分子により形成されるものを挙げることができる。
【００１９】
より好ましいカチオン性高分子としては、例えば、上記ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ.，９，２９２−２９９（１９９８）に記載されているような下記の一般式で表されるものを挙げることもできる。
【００２０】
【化１】

【００２１】
デキストラン側鎖修飾α-ポリ（Ｌ-リジン）
（以下、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘと略記する）
【００２２】
【化２】

【００２３】
デキストラン側鎖修飾ε-ポリ（Ｌ-リジン）
（以下、ε-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘと略記する）
【００２４】
【化３】

【００２５】
デキストラン側鎖修飾型ポリアリルアミン
（以下、ＰＡＡ-ｇ-Ｄｅｘと略記する）
上記のカチオン性高分子のうち、特に、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘ及びε-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘが本発明において好ましく使用できる。
【００２６】
かようなカチオン性高分子の分子量、また、側鎖修飾基それ自体の鎖長及びグラフトの程度は、具体的な使用目的により最適な値が変動するので限定できないが、当業者であれば、後述の実施例を参照に各最適値を選択することができるであろう。
【００２７】
本発明に従えば、上記カチオン性高分子を有効成分とする調製物が提供されるが、かような調製物は、目的とする交換反応に悪影響を及ぼさない限り、合成された高分子の粗製物あるいは精製された高分子と、必要により、緩衝剤、生理食塩水等から構成することができる。また、高分子は１種または２種以上の混合物であってもよい。
【００２８】
このようなカチオン性高分子は、本発明に従う交換反応においては、一般的に、交換反応に供される総（単鎖＋二重鎖）ＤＮＡあるいはＲＮＡにおけるホスフェートに対するカチオン性基の荷電比が０.１以上、好ましくは０.５〜１０００となるように選ばれる。一方、被交換反応に供される二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡに対する単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡのモル比率は約５を超えるように選ぶことが有利である。
【００２９】
交換反応は、二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡが熱変性しないような温度下で行うことができ、ＡＴＰやＭｇ²⁺などの補助因子を必要とすることなく行うことができる。上記温度は、生物細胞等に悪影響が生じない生理的に許容できる温度、例えば、約５℃〜約４０℃であることが好ましい。
【００３０】
本発明に従うカチオン性高分子は、上記の条件下で二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡにおける特定部位のヌクレオチド配列を単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの相同のヌクレオチド配列で効率よく交換できる。オリゴヌクレオチドは、５ｍｅｒ以上であれば理論上いかなる鎖長のものでもよい。なお、好ましくは１０ｍｅｒ以上５００ｍｅｒ以下の配列に本発明は適用できる。したがって、本発明のカチオン性高分子の調製物は、例えば、二重鎖ＤＮＡやＲＮＡに対するプライマーやプローブまたは、それ自体既知の標識や医薬等を担持するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、次いで二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの特定部位にハイブリダイズしたプライマーやプローブまたはオリゴヌクレオチドの機能を利用するＰＣＲ及びＲＴ-ＰＣＲプロセスやＤＮＡチップを用いるプロセス、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを利用する核酸分析において有用である。
【００３１】
また、２重鎖構造を持つｍＲＮＡ上へ特定の部位に対し、その相補的配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、デオキシリボザイム、３重鎖形成用オリゴヌクレオチドとの交換を促進し、これらオリゴヌクレオチドの遺伝子制御機能を向上させる上でも本発明によるカチオン性高分子は有用である。さらに、ゲノムＤＮＡ２重鎖上の特定の部位との相補的ヌクレオチド鎖の交換を生じさせることにより、（ＤＮＡ結合性タンパク質の結合を調整し）複写および転写課程を制御する上でも有用である。
【００３２】
【実施例】
以下、理解を容易にするため、二重鎖オリゴヌクレオチドと単鎖オリゴヌクレオチドの交換反応を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの反応は長鎖の二重鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡと単鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡとの間でも、同様に起こるものと理解されている。
【００３３】
実施例１：α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘによる単鎖ＤＮＡと二重鎖ＤＮＡとの間でのＤＮＡ鎖交換
下記表−１のオリゴヌクレオチドをＨｏｋｋａｉｄｏＳｙｓｔｅｍＳｃｉｅｎｃｅから購入し、高速液体クロマトグラフィーにより精製した。精製済みオリゴヌクレオチドを１０ｍＭの燐酸緩衝液（０.５ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ．pＨ７.２）に溶解し、ＵＶスペクトロスコピー（ＢｅｃｋｍａｎＤＵ６００）にてＵＶ吸収測定することにより、ＤＮＡ濃度を決定した。表−１のＥ−１とＥ−２の相補的配列を有するＤＮＡを等モル（１.５４μＭ）混合し、アニーリングすることにより、二重鎖ＤＮＡを調製した。
【００３４】
【表１】

【００３５】
α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘは、その合成、精製、分析を上記ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ.，８，３−６，（１９９７）に従って行って得られたカチオン性ポリマーを用いた。
【００３６】
ＤＮＡ交換実験は以下の手順で行った。１.５４μＭの二重鎖ＤＮＡ（ｄｕｐｌｅｘ）溶液１０μＬに一定量の単鎖ＤＮＡを添加し、［単鎖ＤＮＡ］／［二重鎖］のモル比率が５になるようにＤＮＡ溶液を調製した。このＤＮＡ混合溶液に、ポリマーアミノ基のＤＮＡ中ホスフェート基に対するモル比
【００３７】
【数１】

【００３８】
が２になるようにポリマーを添加した。さらに、最終的に１０ｍＭとなるようにＭｇＣｌ₂を添加し、各ＤＮＡ溶液が２５μＬとなるように緩衝溶液を添加した。この各サンプル溶液を３７℃及び１５℃でインキュベートした。所定時間後サンプルチャーブを氷冷することによりＤＮＡ鎖交換反応を停止した。その後、ＤＮＡとポリマーを解離させる目的で、サケ精子ＤＮＡ（５μＬ，１.７ｍｇ／ｍＬ）を添加した。ＤＮＡ交換量は、サンプルをＴＢＥ緩衝溶液中１３％ポリアクリルアミド電気泳動（１００Ｖ／ｃｍ，２時間）し、蛍光標識された二重鎖ＤＮＡのフラクションをＢｉｏｆｉｌＢｉｏｉｍａｇｅＡｎａｌｙｓｅｒで解析することにより求めた。また、ＤＮＡ交換率は、以下の式−１により算出した。
［式１］
ＤＮＡ鎖交換率（％）＝（１−［反応後の２重鎖の蛍光強度］／［反応前の２重鎖の蛍光強度］）×｛（２重鎖のモル数＋単鎖のモル数）／（単鎖のモル数）｝×１００
結果を図１に示す。３７℃においては、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘが存在しない場合、３０分インキュベートしても二重鎖ＤＮＡ中のＦＩＴＣ-ラベルＤＮＡの３０％が相同的単鎖ＤＮＡによって交換されたのみであったのに対し、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘ存在下においては、５分のインキュベーションでもＤＮＡ鎖交換率が９０％に達した。また、１５℃で同様の実験を行ったところ、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘが存在しない場合においては、ＤＮＡ交換率５０％に達するのに２４時間以上必要であったのに対して、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘが存在下においては、１時間でＤＮＡ交換率５０％に達した。
【００３９】
実施例２：α-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘのＤＮＡ鎖交換促進効果に及ぼすＭｇイオンの効果
実施例１と同じＤＮＡを、１０ｍＭＭｇＣｌ₂を含まない緩衝溶液と含む緩衝溶液に様々な単鎖ＤＮＡ／２重鎖ＤＮＡの比になるように調製し、これに荷電比が２になるようにα-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘを加えた。このサンプルを３７℃で３０分インキュベート後、実施例１と同等な方法でＤＮＡ交換率を求めた。
【００４０】
結果を図２に示すが、Ｍｇイオンの存否に関わらずα-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘが優れたＤＮＡ鎖交換促進能を有することが明らかになった。
【００４１】
実施例３：α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘ、α-ポリ（Ｌ-リジン）（α-ＰＬＬ）及びε-ポリ（Ｌ-リジン）（α-ＰＬＬ）によるＤＮＡ鎖交換の比較
α-ＰＬＬ及びε-ＰＬＬは、シグマアルドリッチジャパンおよび和光純薬工業より購入したものを用いた。α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘは、実施例１と同様のものを用いた。一方、ＤＮＡ鎖交換反応は、ポリマーの添加量及び反応時間以外は実施例１と同様に行った。すなわち、ポリマーは、系中に存在するＤＮＡ対するポリマーの電荷比が、０.５、１及び５になるように添加し、反応時間３０分で交換反応を施したのち、ＤＮＡ鎖交換率を求めた。
【００４２】
結果を、図３に示す。α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘでは電荷比０.５で約９０％の交換率を示したのに対して、α-ＰＬＬでは約６０％、α-ＰＬＬでは４０％と交換効率が低かった。しかし、いずれのＰＬＬでも、添加量を増やし電荷比５にすると、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘ（電荷比０.５のとき）と同等の交換率を示した。
【００４３】
実施例４：α-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘとＰＡＡ-ｇ-ＤｅｘのＤＮＡ鎖交換促進能の比較
上記ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ.，８，３−６，（１９９７）に記載の方法により、種々α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘを合成した（表−２）。また、ＰＡＡ-ｇ-ＤｅｘはＰＡＡ（日東紡績）とデキストランからα-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘと同様の手法で合成した（表−３）。
【００４４】
【表２】

【００４５】
ＤＮＡ鎖交換反応及び評価は、使用したポリマー（表−２、表−３）以外は実施例３と同様に行った。
【００４６】
結果を図４に示す。いずれのＤｅｘ含量およびいずれの電荷比においてもα-ＰＬＬを主鎖に持つα-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘの方が、ＰＡＡを主鎖に持つＰＡＡ-ｇ-ＤｅｘよりＤＮＡ鎖交換促進能が高いことが明らかとなった。
【００４７】
実施例５：他のカチオン性化合物とα-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘのＤＮＡ鎖交換促進能の比較二重鎖ＤＮＡを安定化することが知られているスペルミン（および相補的ＤＮＡ鎖の単鎖からのハイブリダイゼーションを著しく促進することが知られているカチオン性界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウムプロミド（ＣＴＡＢ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８．８２３７−８２４１（１９９１））、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘとε-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘの比較を行った。なお、ε-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘは、出発物質としてε-ＰＬＬを用い、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘ同様に合成した。スペルミンおよびＣＴＡＢはシグマアルドリッチジャパンより購入し、実施例３と同様な方法でＤＮＡ鎖交換反応および評価を行った。
【００４８】
結果を図５に示す。α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘがもっとも効果的に鎖交換反応を促進することがわかった。
【００４９】
【発明の効果】
以上本発明により、これまで変性を必要としたＰＣＲなどＤＮＡやＲＮＡのハイブリダイゼーションにおいて、プロセスの短縮、条件の緩和、さらには、非特異的結合を押さえることにより効率を向上させ、さらには、ＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖交換やインキュベーションの機能向上に伴う、アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ、リボザイムおよび三重鎖形成性オリゴヌクレオチド等による遺伝子発現調節機能の向上を可能にする。
【００５０】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】α-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘのＤＮＡ交換反応に関する結果を示す。Ｄｅｘで側鎖修飾したＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘが、きわめて良好なＤＮＡ鎖交換促進能を有することを示す図である。
【図２】α-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘのＤＮＡ鎖交換反応促進効果をＭｇイオン存否において検討した結果である。α-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘのＤＮＡ鎖交換反応促進効果は、Ｍｇイオンの存否に関わらず高く保持されていることがわかる。
【図３】ＰＬＬ、ε-ＰＬＬ及びα-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘのＤＮＡ交換試験に関する結果を示す。ＰＬＬ、ε-ＰＬＬもＤＮＡ鎖交換能を有するが、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘがより優れたＤＮＡ鎖交換作用を示す図である。
【図４】α-ＰＬＬ-ｇ-ＤｅｘとＰＡＡ-ｇ-Ｄｅｘの中のＤＮＡ鎖交換反応に与える影響を見たものである。ＰＡＡを主鎖とするＰＡＡ-ｇ-Ｄｅｘに比べα-ＰＬＬを主鎖とするα-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘはそのデキストラン含量に依存せず優れたＤＮＡ鎖交換促進能を発現することを示す図である。
【図５】種々のカチオン性化合物のＤＮＡ鎖交換反応に与える影響を見たものである。２重鎖安定下可能をもつスペルミンや相補的な単鎖のハイブリダイゼーションを著しく促進するＣＴＡＢに比べ、α-ＰＬＬ-ｇ-Ｄｅｘが優れたＤＮＡ鎖交換促進能を発現することを示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to the preparation of cationic polymers for use in the manipulation of double stranded DNA or RNA. More specifically, when exchanging the nucleotide sequence of a specific site in a double-stranded DNA strand or RNA strand with a homologous nucleotide sequence (a complementary sequence to the corresponding site of the other DNA or RNA strand). The present invention relates to a preparation of a cationic polymer used in the above.
[0002]
[Prior art]
Homologous recombination is the rearrangement of genetic information in double-stranded DNA, and is a biological phenomenon that is universally performed in the living world for the preservation and replication of genetic information. The homologous recombination includes a process of searching for a homologous base sequence from countless base sequences and exchanging homologous strands. To date, a protein (RecA) responsible for these functions in E. coli has been identified (Mol. Gen. Genet., 155, 77-85 (1977). Pro. Natl. Acad. Scl. USA, 74, 5280-). 5284 (1977); Pro. Natl. Acad Sci. USA, 77, 2611-2615 (1980), etc.), proteins having similar structures and similar functions are prokaryotic and eukaryotic (Cell, 69, 457-470). (1992), etc.) and viruses (Nucl. Acids Res., 13, 7473-7481 (1985)). In addition, it is becoming clear that these RecA proteins are deeply involved in homologous recombination. The RecA protein binds to a single-stranded DNA to form a complex, and searches for a homologous base sequence between the single-stranded DNA and the double-stranded DNA. When a homologous sequence is found, DNA is released through the formation of a complex (triple) of single-stranded DNA and double-stranded DNA (Tanpakushitsu Kakusan Koso. 44, 631-642 (1999)). Thus, RecA forms a heteroduplex in which one of the duplexes is exchanged. This process requires ATP and Mg ²⁺ as cofactors.
[0003]
On the other hand, the principle of DNA strand exchange on double-stranded DNA described above is an important process in the process of reverse transcription PCR (RT-PCR) from RNA having higher order structure and polymerase chain reaction (PCR) amplification from plasmid DNA. It is. Specifically, it enables the hybridization of a primer to a complementary sequence on a double-stranded DNA or a single-stranded RNA strand having a higher-order structure, and further, when the synthesis of the target amplification product is completed. Thus, it is necessary to allow hybridization of the next primer by dissociating the single-stranded DNA or single-stranded RNA as a template from the double-stranded DNA or double-stranded RNA strand that is the amplification product by heating. .
[0004]
An example of artificially achieving double-stranded DNA exchange without performing a denaturation process such as heating is peptide nucleic acid (PNA) (Nature Biotechnology, 14.1700 1704 (1996), etc.). Various new DNA and genome analysis methods used have been reported. However, PNA promotes DNA strand exchange under low ion concentration, but its performance is extremely reduced under physiological ion concentration conditions. In addition, unlike natural DNA and RNA, there is a problem that it does not serve as a substrate for DNA polymerase, RNA polymerase, ligase and the like, and the current situation is that it restricts DNA and genome analysis by PNA.
[0005]
An example of overcoming such problems with PNA is a peptide-DNA complex (J. Am. Chem. Soc., 121, 2012-2020 (1999)). However, since the DNA strand exchange activity is inhibited in the presence of Mg ions, combined use with Mg ion-dependent enzymes such as DNA polymerase is limited.
[0006]
As described above, there has been no report that replicates the function performed by RecA in a living body and can exhibit a sufficient function under various conditions.
[0007]
On the other hand, recently, the present inventors and other researchers have shown that comb-type copolymers promote the formation and stabilization of DNA duplexes or triplexes under conditions equivalent to those in vivo. (Bioconjugate Chem., 8, 3-6 (1997); Nucleic Acids Sym. Ser. No. 39, 133-134 (1998); Bioconjugate Chem., 9, 292-299 (1998)). The last article also suggests that the above copolymers, especially highly grafted copolymers, promote hybridization between DNA strands in low ionic strength media.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention provides a reaction process without requiring a denaturation process such as heating of DNA or RNA when artificially exchanging a nucleotide sequence at a specific site in double-stranded DNA or RNA with a nucleotide sequence homologous thereto. It is an object to provide means capable of omitting, shortening, or relaxing other conditions.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As described above, certain comb copolymers promote the formation and stabilization of DNA duplex or triplex under the same conditions as in vivo, and also promote hybridization between DNA strands. Are known. However, even though such triplex DNA is stabilized by a specific copolymer, the cationic polymer including the copolymer may be double-stranded with single-stranded DNA or RNA together with the above-described action or separately. It has now been found that strand exchange with strand DNA or RNA can also be promoted.
[0010]
That is, the present invention is based on such knowledge.
[0011]
Therefore, according to the present invention, there is provided a preparation comprising a cationic polymer as an active ingredient for promoting an exchange reaction of a nucleotide sequence at a specific site in double-stranded DNA or RNA with a nucleotide sequence homologous to the nucleotide sequence. Is done.
[0012]
Preferred embodiments for carrying out the invention
Double-stranded DNA or RNA is a complementary base (or nucleotide) pair, for example, adenine (A) and thymine (T) and guanine (G) and cytosine (C) in DNA, and A and uracil in RNA. (U) and a strand that can maintain a higher-order structure formed between DNAs formed by pairing of G and C, or between RNAs. In the context of the present invention, such DNA or RNA may be isolated from a biological component or may be present in a biological tissue piece without being isolated. Of course, a synthesized double-stranded DNA or RNA is also included.
[0013]
Such a nucleotide sequence at a specific site in DNA or RNA may be a nucleotide sequence at any site such as a terminal site or an intermediate site of DNA or RNA that has been linearized. A nucleotide sequence homologous to the sequence means that the bases constituting the sequence are substantially the same. Substantially identical means that the nucleotide sequence of the specific site and its homologous sequence are at least 95% of each of A, T, G and C identical in the sequential order, or in such a sequence, T Is replaced by U.
[0014]
Therefore, the exchange reaction is a double-stranded DNA or RNA consisting of two complementary strands, a single strand having a nucleotide sequence homologous to a specific portion of the nucleotide sequence in one of the two strands. It is intended to be exchanged by DNA or RNA. As a specific mode of exchange, the nucleotide sequence at a specific site in double-stranded DNA is exchanged with a homologous nucleotide sequence in single-stranded DNA or RNA, or the nucleotide sequence at a specific site in double-stranded RNA is single-stranded. The case where it exchanges by the homologous nucleotide sequence in DNA or RNA is mentioned.
[0015]
Homologous nucleotide sequences in single-stranded DNA or RNA may occupy the entire single-stranded DNA or RNA molecule or may occupy a part, but generally strongly intend to occupy the whole. ing.
[0016]
The exchange or exchange reaction means that the nucleotide sequence of a specific site of double-stranded DNA or RNA is simply replaced by a single-stranded DNA or RNA homologous to the sequence by the nucleotide sequence and reconstructed. It is not accompanied by cleavage of the nucleotide sequence.
[0017]
According to the present invention, such an exchange reaction can be efficiently performed in the presence of a cationic polymer. The cationic polymer may be any polymer as long as it contributes to the exchange reaction. Examples of the cationic polymer include amino acids such as lysine, arginine and histidine, sugars such as glucosamine, ethyleneimine, diethylaminoethyl methacrylate, dimethylamino. Mention may be made of cationic homopolymers and copolymers derived from monomers capable of forming a cationic group, such as synthetic monomers such as ethyl methacrylate.
[0018]
The cationic polymer is preferably one having a graft type structure in which the above cationic homopolymer or copolymer is side chain modified with a hydrophilic polymer. Such side chains (graft chains) include water-soluble polyalkylene glycols such as polyethylene glycol, water-soluble polysaccharides such as dextran, pullulan, amylose, and arabinogalactan, and hydrophilic amino acids such as serine, asparagine, glutamine, and threonine. Water-soluble polymer synthesized using water-soluble polyamino acid, acrylamide and derivatives thereof as monomers, water-soluble polymer synthesized using methacrylic acid and acrylic acid and derivatives thereof (eg, hydroxyethyl methacrylate) as monomers, polyvinyl Mention may be made of those formed by one or more water-soluble polymers selected from the group consisting of alcohols and derivatives thereof.
[0019]
More preferable examples of the cationic polymer include those represented by the following general formula as described in Bioconjugate Chem., 9, 292-299 (1998).
[0020]
[Chemical 1]

[0021]
Dextran side chain modified α-poly (L-lysine)
(Hereinafter abbreviated as α-PLL-g-Dex)
[0022]
[Chemical 2]

[0023]
Dextran side chain modified ε-poly (L-lysine)
(Hereinafter abbreviated as ε-PLL-g-Dex)
[0024]
[Chemical 3]

[0025]
Dextran side chain modified polyallylamine (hereinafter abbreviated as PAA-g-Dex)
Among the above cationic polymers, in particular, α-PLL-g-Dex and ε-PLL-g-Dex can be preferably used in the present invention.
[0026]
The molecular weight of such a cationic polymer, the chain length of the side chain modifying group itself, and the degree of grafting cannot be limited because the optimum value varies depending on the specific purpose of use. Each optimum value could be selected with reference to the examples described below.
[0027]
According to the present invention, a preparation containing the cationic polymer as an active ingredient is provided. However, such a preparation is a crude product of the synthesized polymer as long as the target exchange reaction is not adversely affected. Or a purified polymer and, if necessary, a buffer, physiological saline or the like. The polymer may be one kind or a mixture of two or more kinds.
[0028]
In the exchange reaction according to the present invention, such a cationic polymer generally has a charge ratio of the cationic group to phosphate in the total (single strand + double strand) DNA or RNA subjected to the exchange reaction is 0. 0.1 or more, preferably 0.5 to 1000. On the other hand, it is advantageous to select the molar ratio of the single-stranded DNA or RNA to the double-stranded DNA or RNA subjected to the exchange reaction to exceed about 5.
[0029]
The exchange reaction can be performed at a temperature at which the double-stranded DNA or RNA is not thermally denatured, and can be performed without the need for cofactors such as ATP and Mg ²⁺ . The temperature is preferably a physiologically acceptable temperature that does not adversely affect biological cells and the like, for example, about 5 ° C. to about 40 ° C.
[0030]
The cationic polymer according to the present invention can efficiently exchange the nucleotide sequence of a specific site in double-stranded DNA or RNA with a homologous nucleotide sequence of single-stranded DNA or RNA under the above conditions. The oligonucleotide may have any theoretical length as long as it is 5 mer or longer. It should be noted that the present invention is preferably applicable to arrays of 10 mer to 500 mer. Accordingly, the preparation of the cationic polymer of the present invention is, for example, a primer or probe for double-stranded DNA or RNA, or hybridization of an oligonucleotide carrying a known label or medicine, and then double-stranded DNA. Alternatively, it is useful in PCR and RT-PCR processes utilizing the functions of primers, probes or oligonucleotides hybridized to specific RNA sites, processes using DNA chips, and nucleic acid analysis utilizing fluorescence in situ hybridization.
[0031]
In addition, it promotes the exchange of antisense oligonucleotides, ribozymes, deoxyribozymes, and triplex-forming oligonucleotides containing complementary sequences to specific sites on mRNA having a double-stranded structure, and these oligonucleotides The cationic polymer according to the present invention is also useful for improving the gene regulatory function. Furthermore, it is also useful in controlling the replication and transcription process (by adjusting the binding of DNA binding proteins) by causing a complementary nucleotide chain exchange with a specific site on the genomic DNA duplex.
[0032]
【Example】
Hereinafter, in order to facilitate understanding, the present invention will be specifically described with reference to an exchange reaction between a double-stranded oligonucleotide and a single-stranded oligonucleotide. It is understood that this also occurs between strand DNA or RNA.
[0033]
Example 1: DNA strand exchange between single-stranded DNA and double-stranded DNA using α-PLL-g-Dex The oligonucleotides shown in Table 1 below were purchased from Hokaido System Science and purified by high performance liquid chromatography. . The purified oligonucleotide was dissolved in 10 mM phosphate buffer (0.5 mM EDTA, 150 mM NaCl. PH 7.2), and the DNA concentration was determined by measuring UV absorption with UV spectroscopy (Beckman DU 600). Double-stranded DNA was prepared by mixing equimolar (1.54 μM) DNAs having complementary sequences of E-1 and E-2 in Table 1 and annealing.
[0034]
[Table 1]

[0035]
As the α-PLL-g-Dex, a cationic polymer obtained by carrying out the synthesis, purification, and analysis according to the above-mentioned Bioconjugate Chem., 8, 3-6, (1997) was used.
[0036]
The DNA exchange experiment was performed according to the following procedure. A fixed amount of single-stranded DNA was added to 10 μL of a 1.54 μM double-stranded DNA (duplex) solution, and a DNA solution was prepared so that the molar ratio of [single-stranded DNA] / [double-stranded] was 5. In this DNA mixed solution, the molar ratio of polymer amino group to phosphate group in DNA
[Expression 1]

[0038]
The polymer was added so as to be 2. Further, MgCl ₂ was added so that the final concentration was 10 mM, and a buffer solution was added so that each DNA solution was 25 μL. Each sample solution was incubated at 37 ° C and 15 ° C. After a predetermined time, the DNA strand exchange reaction was stopped by cooling the sample charb with ice. Thereafter, salmon sperm DNA (5 μL, 1.7 mg / mL) was added for the purpose of dissociating the DNA and the polymer. The amount of DNA exchange was determined by subjecting the sample to 13% polyacrylamide electrophoresis (100 V / cm, 2 hours) in a TBE buffer solution, and analyzing the fraction of fluorescently labeled double-stranded DNA with a Biofil Bioimage Analyzer. The DNA exchange rate was calculated by the following formula-1.
[Formula 1]
DNA strand exchange rate (%) = (1− [fluorescence intensity of duplex after reaction] / [fluorescence intensity of duplex before reaction]) × {(number of moles of duplex + number of moles of single chain) ) / (Number of moles of single chain)} × 100
The results are shown in FIG. At 37 ° C., in the absence of α-PLL-g-Dex, 30% of the FITC-labeled DNA in the double-stranded DNA was only replaced by the homologous single-stranded DNA even after 30 minutes of incubation. In contrast, in the presence of α-PLL-g-Dex, the DNA strand exchange rate reached 90% even after 5 minutes of incubation. Further, when the same experiment was conducted at 15 ° C., in the absence of α-PLL-g-Dex, it took 24 hours or more to reach a DNA exchange rate of 50%. In the presence of PLL-g-Dex, the DNA exchange rate reached 50% in 1 hour.
[0039]
Example 2: Effect of Mg ions on the DNA strand exchange promoting effect of α-PLL-g-Dex The same DNA as in Example 1 was mixed with various buffer solutions containing 10 mM MgCl ₂ and various single-stranded DNA / A double-stranded DNA ratio was prepared, and α-PLL-g-Dex was added so that the charge ratio was 2. After incubating this sample at 37 ° C. for 30 minutes, the DNA exchange rate was determined by the same method as in Example 1.
[0040]
The results are shown in FIG. 2, and it was revealed that α-PLL-g-Dex has an excellent ability to promote DNA strand exchange regardless of the presence or absence of Mg ions.
[0041]
Example 3: Comparison of DNA strand exchange by α-PLL-g-Dex, α-poly (L-lysine) (α-PLL) and ε-poly (L-lysine) (α-PLL) α-PLL and ε -PLL purchased from Sigma-Aldrich Japan and Wako Pure Chemical Industries. The same α-PLL-g-Dex as in Example 1 was used. On the other hand, the DNA strand exchange reaction was carried out in the same manner as in Example 1 except for the amount of polymer added and the reaction time. That is, the polymer is added so that the charge ratio of the polymer to DNA existing in the system is 0.5, 1 and 5, and after the exchange reaction is performed for 30 minutes, the DNA strand exchange rate is obtained. It was.
[0042]
The results are shown in FIG. The α-PLL-g-Dex showed an exchange rate of about 90% at a charge ratio of 0.5, whereas the exchange efficiency was low, about 60% for α-PLL and 40% for α-PLL. However, in any PLL, when the addition amount was increased to a charge ratio of 5, an exchange rate equivalent to α-PLL-g-Dex (when the charge ratio was 0.5) was shown.
[0043]
Example 4: Comparison of DNA strand exchange promoting ability of α-PLL-g-Dex and PAA-g-Dex According to the method described in Bioconjugate Chem., 8, 3-6 (1997), various α-PLL- g-Dex was synthesized (Table-2). PAA-g-Dex was synthesized from PAA (Nitto Boseki) and dextran in the same manner as α-PLL-g-Dex (Table 3).
[0044]
[Table 2]

[0045]
The DNA strand exchange reaction and evaluation were performed in the same manner as in Example 3 except for the polymers used (Table-2 and Table-3).
[0046]
The results are shown in FIG. Α-PLL-g-Dex having α-PLL in the main chain has higher ability to promote DNA strand exchange than PAA-g-Dex having PAA in the main chain at any Dex content and any charge ratio. Became clear.
[0047]
Example 5: Comparison of the ability of α-PLL-g-Dex to promote DNA strand exchange with other cationic compounds From spermine known to stabilize double-stranded DNA (and from single strands of complementary DNA strands) A cationic surfactant known to significantly promote the hybridization of cetyltrimethylammonium promide (CTAB) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88.8237-8241 (1991)), α- PLL-g-Dex and ε-PLL-g-Dex were compared, and ε-PLL-g-Dex was synthesized in the same manner as α-PLL-g-Dex using ε-PLL as a starting material. Spermine and CTAB were purchased from Sigma Aldrich Japan, and subjected to DNA strand exchange reaction and evaluation in the same manner as in Example 3.
[0048]
The results are shown in FIG. It has been found that α-PLL-g-Dex promotes the strand exchange reaction most effectively.
[0049]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, in the hybridization of DNA and RNA such as PCR, which has conventionally required denaturation, the efficiency is improved by shortening the process, relaxing the conditions, and suppressing non-specific binding. It is possible to improve the function of regulating gene expression by antisense DNA / RNA, ribozyme, triplex-forming oligonucleotide and the like accompanying the function improvement of strand and RNA strand exchange and incubation.
[0050]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results relating to the DNA exchange reaction of α-PLL-g-Dex. It is a figure which shows that PLL-g-Dex which carried out the side chain modification by Dex has the very favorable DNA strand exchange promotion ability.
FIG. 2 is a result of examining the effect of α-PLL-g-Dex in promoting the DNA strand exchange reaction in the presence or absence of Mg ions. It can be seen that the effect of α-PLL-g-Dex in promoting the DNA strand exchange reaction is maintained high regardless of the presence or absence of Mg ions.
FIG. 3 shows the results for DNA exchange tests of PLL, ε-PLL and α-PLL-g-Dex. Although PLL and ε-PLL also have a DNA strand exchange ability, α-PLL-g-Dex shows a more excellent DNA strand exchange action.
FIG. 4 shows the effect of α-PLL-g-Dex and PAA-g-Dex on the DNA strand exchange reaction. Diagram showing that α-PLL-g-Dex with α-PLL as the main chain expresses superior ability to promote DNA strand exchange independent of its dextran content, compared with PAA-g-Dex with PAA as the main chain It is.
FIG. 5 shows the effect of various cationic compounds on the DNA strand exchange reaction. It is a figure which shows that (alpha) -PLL-g-Dex expresses the superior ability of DNA strand exchange promotion compared with CTAB which remarkably accelerates | stimulates hybridization of spermine which has a double-strand stability, and complementary single strand. .

Claims

A method promoting exchange reaction with homologous nucleotide sequence to the sequence of the nucleotide sequence of a particular site in the double-stranded DNA or RNA, the main chain and a water-soluble polyalkylene glycol or water-soluble which the exchange reaction are derived from (i) poly-lysine A cationic polymer composed of a graft-type side chain derived from a polysaccharide , or
(Ii) a cationic polymer composed of a main chain derived from polyallylamine and a graft-type side chain derived from dextran,
Wherein the process occurs in the presence of

The method according to claim 1, wherein the cationic polymer is composed of a main chain derived from polylysine and a graft-type side chain derived from dextran or polyethylene glycol.

The method according to claim 1 or 2, wherein the exchange reaction has a fluorescence in situ hybridization (FISH), a polymerase chain reaction, a reverse transcription PCR (RT-PCR), or a double-stranded structure of a DNA chip and a target. The above method, which occurs upon hybridization with DNA.

3. The method according to claim 1, wherein the exchange reaction constitutes an antisense oligonucleotide, ribozyme or deoxyribozyme comprising a specific nucleotide sequence in an mRNA strand having a double-stranded structure and a complementary sequence thereof. The above method, which occurs between RNA and a single-stranded sequence selected from triplex-forming oligonucleotides.

3. The method according to claim 1 or 2, wherein the exchange reaction is caused by a specific nucleotide sequence in a DNA strand having a double-stranded structure and a nucleotide sequence homologous to the sequence, thereby causing gene expression and replication. The above method to adjust.