JP4512686B2 - Method and apparatus for fractional collection of fine particles - Google Patents
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Description
本発明は細胞などの微粒子の分別回収方法および回収装置、並びにこれらを利用したフローサイトメトリーおよびセルソーターに関する。 The present invention relates to a method and apparatus for fractional collection of fine particles such as cells, and a flow cytometry and cell sorter using them.
現在、細胞などの微粒子集団から特定の個々の細胞などを選り分ける方法としては、フローサイトメトリーを基礎としたセルソーティング技術が知られている(例えば、非特許文献1参照)。 Currently, a cell sorting technique based on flow cytometry is known as a method for selecting specific individual cells from a population of fine particles such as cells (see, for example, Non-Patent Document 1).
この技術では、予め蛍光色素などで標識した抗体を結合させた対象細胞の懸濁液を液流とし、まず、その流路内で該細胞に、標識した蛍光色素に応じて励起光を照射し、各細胞から発する蛍光乃至散乱光の波長や強度を解析して所望の細胞を識別する。次いで、上記光の強度や波長などの解析結果によって識別された特定の性質を有する細胞に電圧を印加して帯電させ、偏向電極を利用して上記で帯電された細胞の弁別、定量、統計解析などを行う。 In this technique, a suspension of target cells to which an antibody previously labeled with a fluorescent dye or the like is bound is used as a liquid flow, and first, the cells are irradiated with excitation light in accordance with the labeled fluorescent dye in the flow path. The desired cells are identified by analyzing the wavelength and intensity of the fluorescence or scattered light emitted from each cell. Next, voltage is applied to the cells having specific properties identified by the analysis results such as the light intensity and wavelength, and the cells are charged by using a deflection electrode, and the charged cells are discriminated, quantified and statistically analyzed. And so on.
この方法は、細胞を生存状態のまま大量且つ高速度で処理できる点より、免疫学的分野、血液学的分野、遺伝子工学的分野などにおいて、種々の培養細胞の採取・単離、特定細胞のクローニング・増殖、細胞表面に特定抗原を発現した細胞の分取などに、また、細胞膜分子の動態解析、細胞染色体の解析などに広く用いられている。特に、細胞動態の解析には不可欠な手段となりつつある。また、この技術は臨床分野でも、例えば尿中の有形成分の解析などに利用され始めている。 This method enables the collection and isolation of various cultured cells in the fields of immunology, hematology, genetic engineering, etc. It is widely used for cloning / proliferation, sorting of cells expressing a specific antigen on the cell surface, etc., and for analyzing the dynamics of cell membrane molecules and analyzing cell chromosomes. In particular, it is becoming an indispensable means for analyzing cell dynamics. In addition, this technique has begun to be used in the clinical field, for example, for analysis of formed components in urine.
上記フローサイトメトリーによるセルソーティング技術に利用される細胞解析および細胞分離装置を、セルソータ(蛍光活性化セルソータ、Fluolorescence-Activated Cell Sorter, FACS)と呼んでいる。この装置は、前記蛍光などの解析を行う解析部の下流に更にソーティング部を備えたものである。該ソーティング部としては、代表的には水滴荷電方式が知られている。 The cell analysis and cell separation device used in the cell sorting technique by flow cytometry is called a cell sorter (Fluorescence-Activated Cell Sorter, FACS). This apparatus further includes a sorting unit downstream of the analysis unit for analyzing the fluorescence and the like. As the sorting unit, a water droplet charging method is typically known.
この水滴荷電方式による細胞(微粒子)のソーティングは、例えば次の原理を基礎としている。即ち、レーザー光の照射により散乱光と蛍光とが検出された細胞に、これを含む水流が水滴に分かれる寸前に、プラスまたはマイナスの電荷を加えて荷電する。この帯電した細胞を含む水滴を、その落下の途中に電位差を有する2枚の偏光用電極板間に通過させと、該水滴は偏光板に引き寄せられて、その方向を偏向される。帯電されなかった細胞を含む水滴および所望の細胞以外の細胞を含む水滴は垂直に落下するので、所望の細胞のみを含む水滴を分離、回収することができる。 This sorting of cells (fine particles) by the water droplet charging method is based on, for example, the following principle. That is, a cell in which scattered light and fluorescence are detected by laser light irradiation is charged by adding a positive or negative charge immediately before the water stream containing the cell is divided into water droplets. When the water droplet containing the charged cell is passed between two polarizing electrode plates having a potential difference in the middle of dropping, the water droplet is attracted to the polarizing plate and deflected in the direction. Since water droplets containing uncharged cells and water droplets containing cells other than desired cells fall vertically, water droplets containing only desired cells can be separated and collected.
しかるに、このようなセルソーターを利用する技術では、一つの細胞(微粒子)を含む水滴を生成させるための超音波発生装置が必要であり、セルソーター自体非常に高価であることは勿論のこと、運転操作、メンテナンスなどが複雑であり、しかも一度に多種類の微粒子を分別することができないという欠点がある。即ち、電極板を利用する場合は、プラスまたはマイナスのいずれかに帯電させるしかなく、電気的に区別できる細胞はこの2種に限られる不利がある。更に、フローセルやノズルを使い回しするために不純物の混入のおそれがある。また、細胞分別で行われる細胞溶液の超音波による小滴化の際に、有害物質による雰囲気汚染などの問題も伴われる。 However, in the technology using such a cell sorter, an ultrasonic generator for generating water droplets containing one cell (fine particles) is necessary, and the cell sorter itself is very expensive as well as the operation operation. However, there are drawbacks in that maintenance and the like are complicated and many kinds of fine particles cannot be separated at once. That is, when an electrode plate is used, there is a disadvantage that only positive or negative charge is required, and cells that can be electrically distinguished are limited to these two types. Furthermore, there is a risk of impurities being mixed in since the flow cell or nozzle is used repeatedly. In addition, problems such as atmospheric contamination due to harmful substances are accompanied with ultrasonic droplet formation of cell solutions performed in cell sorting.
以上のように、セルソーターが特に高価であり、運転操作、メンテナンスが煩雑すぎる欠点、不純物が混入する欠点などを解決して、低コストで運転でき、不純物が混入しない方法として、ガラスや高分子材料の基板上に微小な流路を形成させて、その中で細胞などの微粒子を水流にのせてフローサイトメトリーを行い、所望微粒子を分別する技術(マイクロチップを利用する技術)が提案されている(例えば非特許文献2および非特許文献3参照)。 As described above, the cell sorter is particularly expensive, solves the drawbacks of operation and maintenance that are too complicated, the impurities are mixed, and the like. A technology (a technology using a microchip) has been proposed in which a minute flow path is formed on a substrate, and microparticles such as cells are placed in a water flow to perform flow cytometry, thereby separating desired particles. (For example, see Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3).
このマイクロチップを利用したセルソーティングは、T字型の流路を形成させて、分別したい細胞とそれ以外の細胞とを、細胞を液送している溶液の方向を切り替えること(流路選択制御)によって分別するものである。 Cell sorting using this microchip forms a T-shaped channel and switches the direction of the solution that is feeding the cells between the cells to be sorted and other cells (channel selection control). ).
しかしながら、現在提案されている該方法では、液の流れの切り替えは、一回しか行い得ず、それ故一種類の微粒子しか分離できない。液の流れの切り替えを複数回行えば複数の微粒子が分離できると考えられるが、実際には、液の流れの切り替えはその応答時間が遅過ぎるために、複数回の切り替えには複数の送液ポンプが必要となり、それらとチップとの接続、バルブの切り替えなどが複雑なものとなりすぎ、実用化は困難と考えられる。
本発明の目的は、従来のセルソーティング技術にみられる、例えば水滴を生成させるための装置が必要であることや多数の標的微粒子を一度に分別回収することができない等といった欠点を解消した改良されたソーティング技術、およびそのための微粒子の分別回収技術を提供することにある。 The object of the present invention is an improvement that eliminates the drawbacks of conventional cell sorting techniques, such as the need for an apparatus for generating water droplets and the inability to separate and collect a large number of target particles at once. And a sorting and collecting technique for fine particles.
本発明者は、従来公知のフローサイトメトリー、特に水滴荷電方式によるソーティング技術、および液の流れの切り替え(流路選択制御)によるソーティング技術に代わって、光圧(optical forceもしくはoptical pressure)を利用した微粒子のソーティング技術を開発するに初めて成功した。 The present inventor uses optical force or optical pressure instead of the conventionally known flow cytometry, particularly the sorting technique based on the water droplet charging method, and the switching technique based on the switching of the liquid flow (channel selection control). The first successful development of sorting technology for fine particles.
本発明は、下記項1-13に記載の発明を提供する。
項1． 光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分を含有する気体または液体の流路に、当該気体または液体の流れ方向に交差させてレーザービームを照射することによって、流路内の、光圧に応答する微粒子の運動方向のみを選択的にレーザービームの収束方向に偏向させて、当該微粒子を光圧に応答しない成分と分別して回収することを特徴とする、光圧に応答する微粒子の分別回収方法。
項2． 微粒子が、光圧に応答する有機もしくは無機高分子材料、金属、細胞、微生物および生体高分子からなる群から選ばれる項1に記載の分別回収方法。
項3． 光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分を含有する気体または液体の流路内の、光圧に応答する標的微粒子に対して、当該気体または液体の流れ方向に交差させてレーザービームを照射することによって、流路内の、当該標的微粒子の運動方向のみを選択的にレーザービームの収束方向に偏向させて、当該微粒子を、他の微粒子および光圧に応答しない成分と分別して回収することを特徴とする、標的微粒子の分別回収方法。
項4． 流路が液流によって形成されてなるものである、項3に記載の標的微粒子の分別回収方法。
項5． 標的微粒子が、光圧に応答する有機もしくは無機高分子材料、金属、細胞、微生物および生体高分子からなる群から選ばれる項3に記載の標的微粒子の分別回収方法。
項6． 標的微粒子が、細胞または微生物である、項3に記載の標的微粒子の分別回収方法。
項7． 項6に記載の標的微粒子の分別回収方法を、標的微粒子のソーティング方法として用いる、フローサイトメトリー。
項8． 光圧に応答する微粒子を回収するための回収部、レーザービーム照射部、並びに、当該回収部とレーザービーム照射部との間に、光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分を含有する気体または液体を流すための流路を備えた微粒子回収装置であって、
上記回収部が、流路側に開口を向けて配置された少なくとも1つのチャンバーを備え、
上記レーザービーム照射部が、少なくとも1つの照射口を備え、
当該レーザービーム照射口から、レーザービームを、上記流路に交差させて、上記回収部のチャンバーの開口に向けて、当該開口の後方に収束するように照射するものである、
微粒子回収装置。
項9． 回収部のチャンバーの開口とレーザービーム照射部の照射口とが、流路を隔てて、対向して設けられている項8に記載の微粒子回収装置。
項10． 2以上の照射口を有するレーザービーム照射部、および当該照射口の数に対応する数のチャンバーを有する回収部を備える、項8に記載の微粒子回収装置。
項11． 更に、流路を流れる気体または液体中の微粒子を検出して解析するための、検出および解析部を備える、項8に記載の微粒子回収装置。
項12． 検出および解析部がレーザービーム照射部と連動してなり、検出および解析部で得られるデータに基づいて標的微粒子を選択し、当該選択された標的微粒子に対してのみレーザービームの照射が行われるものである、項11に記載の微粒子回収装置。
項13． 項8に記載の微粒子回収装置をソーティング部として備える、セルソーター。
The present invention provides the invention described in Items 1-13 below.
Item 1. By irradiating a gas or liquid channel containing fine particles that respond to light pressure and a component that does not respond to light pressure with a laser beam intersecting the flow direction of the gas or liquid, Sorting of fine particles responding to light pressure by selectively deflecting only the direction of movement of the fine particles responding to the laser beam in the direction of convergence of the laser beam and separating the fine particles from components that do not respond to light pressure Collection method.
Item 2. Item 2. The method according to Item 1, wherein the fine particles are selected from the group consisting of organic or inorganic polymer materials that respond to light pressure, metals, cells, microorganisms, and biopolymers.
Item 3. The target particle that responds to the light pressure in the gas or liquid flow path containing the particle that responds to the light pressure and the component that does not respond to the light pressure is crossed in the flow direction of the gas or liquid. Irradiation selectively deflects only the movement direction of the target fine particles in the flow path in the laser beam convergence direction, and separates and collects the fine particles from other fine particles and components that do not respond to light pressure. A method for separating and collecting target fine particles.
Item 4. Item 4. The method for separating and collecting target fine particles according to Item 3, wherein the flow path is formed by a liquid flow.
Item 5. Item 4. The method for separating and recovering target particles according to Item 3, wherein the target particles are selected from the group consisting of organic or inorganic polymer materials that respond to light pressure, metals, cells, microorganisms, and biopolymers.
Item 6. Item 4. The method for separating and collecting target particles according to Item 3, wherein the target particles are cells or microorganisms.
Item 7. Item 7. A flow cytometry using the method for fractional collection of target particles according to Item 6 as a method for sorting target particles.
Item 8. Contains a collection unit for collecting fine particles that respond to light pressure, a laser beam irradiation unit, and a fine particle that responds to light pressure and a component that does not respond to light pressure between the collection unit and the laser beam irradiation unit. A particulate collection device having a flow path for flowing gas or liquid,
The recovery unit includes at least one chamber disposed with the opening facing the flow path side,
The laser beam irradiation unit includes at least one irradiation port,
From the laser beam irradiation port, the laser beam is irradiated so as to converge to the rear of the opening toward the opening of the chamber of the recovery unit, intersecting the flow path,
Particulate collection device.
Item 9. Item 9. The particulate collection device according to Item 8, wherein the opening of the chamber of the collection unit and the irradiation port of the laser beam irradiation unit are provided to face each other with a flow path therebetween.
Item 10. Item 9. The particulate collection device according to Item 8, comprising a laser beam irradiation unit having two or more irradiation ports, and a recovery unit having a number of chambers corresponding to the number of irradiation ports.
Item 11. Item 9. The particle collection device according to Item 8, further comprising a detection and analysis unit for detecting and analyzing particles in a gas or liquid flowing in the flow path.
Item 12. The detection and analysis unit works in conjunction with the laser beam irradiation unit, selects the target particle based on the data obtained by the detection and analysis unit, and the laser beam is irradiated only to the selected target particle Item 12. The particulate collection device according to Item 11, wherein
Item 13. Item 9. A cell sorter comprising the particulate collection device according to Item 8 as a sorting unit.
上記項1-2に記載する本発明の微粒子の分別回収方法および項8に記載する本発明の微粒子回収装置は、レーザービームの光圧を利用するものであり、該光圧に応答する微粒子をその回収対象として、これを光圧に応答しない成分(流路媒体として使用する気体および液体も、当該成分に含まれる)と分別して回収することができる。 The method for separating and collecting fine particles of the present invention described in the above item 1-2 and the fine particle collecting apparatus of the present invention described in the above item 8 utilize the light pressure of a laser beam, and fine particles that respond to the light pressure are collected. As the collection target, this can be collected separately from components that do not respond to light pressure (gases and liquids used as flow path media are also included in the components).
また上記項3-6に記載する本発明の標的微粒子の分別回収方法および項13に記載する本発明のセルソーターは、例えば、従来公知のフローサイトメトリーおよびセルソーターで採用されている検出および解析技術によって光圧に応答する標的の微粒子のみを選択して、上記項1-2および項8と同様にレーザービームを照射することによって、当該標的微粒子のみを他の成分(これには、光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分が含まれる)と分別して回収することができる。 In addition, the method for fractionating and recovering target fine particles of the present invention described in the above item 3-6 and the cell sorter of the present invention described in the item 13 include, for example, detection and analysis techniques employed in conventionally known flow cytometry and cell sorters. By selecting only the target fine particles that respond to the light pressure and irradiating the laser beam in the same manner as in the above items 1-2 and 8, the target fine particles alone are mixed with other components (this includes the response to the light pressure). And fine particles and components that do not respond to light pressure).
これらの本発明の方法および装置、特に項3-6および項13に記載する方法および装置によれば、大きさや構造(物理的性質)などの相違または標識物質の相違などに応じて、各種の性質や機能を有する多様な細胞の集団から任意の複数種の細胞(標的細胞)を、それぞれ生きている状態で、しかも破壊、その他の損傷を与えることなく、分別回収することができる。従って、本発明方法および装置は、特定細胞のクローニング、増殖・分化因子受容体遺伝子のクローニングなどの支援技術として有用である。また、細胞の諸機能の解析、細胞膜分子、染色体DNA分子などの細胞動態の解析にも有効に利用することができる。更に、細胞工学分野に限らず、例えば臨床分野などにおいても、例えば尿中の有形成分の解析にも有効に利用できる。 According to the method and apparatus of the present invention, particularly the method and apparatus described in Item 3-6 and Item 13, depending on differences in size and structure (physical properties) or differences in labeling substances, Arbitrary plural types of cells (target cells) can be separately collected from a population of diverse cells having properties and functions without damaging or otherwise damaging them. Therefore, the method and apparatus of the present invention are useful as support techniques for cloning of specific cells, cloning of growth / differentiation factor receptor genes, and the like. It can also be used effectively for analysis of cell functions, analysis of cell dynamics such as cell membrane molecules and chromosomal DNA molecules. Furthermore, not only in the field of cell engineering, but also in the clinical field, for example, it can be effectively used for the analysis of tangible components in urine, for example.
また、本発明の装置はマイクロチップの形態にすることもでき、また本発明の方法も、こうしたマイクロチップを用いて容易に且つ簡便に実施することもできる。即ち、従来のFACSなどに比して、高価で煩雑な操作を必要としない利点がある。 Further, the apparatus of the present invention can be in the form of a microchip, and the method of the present invention can also be easily and simply performed using such a microchip. That is, there is an advantage that an expensive and complicated operation is not required as compared with the conventional FACS.
しかも、本発明装置を利用すれば、従来提案されているマイクロチップを用いて流体制御を行う技術では困難であった複数種の微粒子を、一度の操作で非常に迅速に(応答速度が速い)、精度よく効率的に弁別することができる。殊に、本発明装置を利用すれば、従来のマイクロチップを用いて流体制御を行う技術に比して、微量のサンプルを利用して簡便に上記微粒子の弁別を行い得る利点もある。 In addition, if the device of the present invention is used, a plurality of types of fine particles, which have been difficult to control by using a conventionally proposed microchip, can be obtained very quickly by one operation (fast response speed). It is possible to discriminate accurately and efficiently. In particular, the use of the apparatus of the present invention has an advantage that the fine particles can be easily discriminated using a small amount of sample as compared with the conventional technique of controlling the fluid using a microchip.
(1) 微粒子の分別回収方法
以下、本発明の微粒子の分別回収方法につき詳述する。
(1) Method for fractional collection of fine particles The method for fractional collection of fine particles of the present invention will be described in detail below.
本発明方法においては、まず光圧に応答する微粒子を含む気体または液体の流路に、該気体または液体の流れ方向に交差させてレーザービームを照射して、流路内を流れる回収すべき微粒子の運動方向をレーザービームの収束方向に偏向させることによって実施することができる。 In the method of the present invention, first, a gas or liquid flow path containing fine particles that respond to light pressure is irradiated with a laser beam so as to intersect the flow direction of the gas or liquid, and the fine particles to be collected flowing in the flow path. Can be implemented by deflecting the direction of motion of the laser beam in the direction of convergence of the laser beam.
この原理は次の通りである。即ち、照射されたレーザービームの照射領域に光圧に応答する微粒子が流れてくると、該照射領域内には光の場に不均一が生じているため、その中で微粒子はこれを取り囲む物質との間の屈折率、誘電率などの違いによって、これに作用する光の力(光の放射圧、誘電泳動力など)に差を生じる。この力の差によって、光圧に応答する微粒子は流体力学的流れ方向に逆らってビームの軸方向に沿って、光の場の密な位置に向かって移動するのである。この力を光圧(optical force)という。この光圧は、微粒子とそれを取り囲む物質との屈折率(もしくは誘電率)の値の差が大きいほど大きく、また、微粒子の体積が大きいほど大きい。例えば、ポリスチレン微粒子(たとえば直径が1μm)、大腸菌などの微生物乃至その細胞などを水中に懸濁させた液では、一般に大きな光圧が生じる。 The principle is as follows. That is, when fine particles that respond to light pressure flow in the irradiated region of the irradiated laser beam, the light field is uneven in the irradiated region, and the fine particles are the substances surrounding it. Due to the difference in refractive index, dielectric constant, and the like, there is a difference in the light force (light radiation pressure, dielectrophoretic force, etc.) acting on this. Due to this difference in force, the microparticles that respond to the light pressure move along the axial direction of the beam against the hydrodynamic flow direction toward a dense position of the light field. This force is called optical force. This light pressure increases as the difference in refractive index (or dielectric constant) between the fine particles and the surrounding material increases, and increases as the volume of the fine particles increases. For example, a liquid in which a microparticle of polystyrene (for example, a diameter of 1 μm), a microorganism such as Escherichia coli or a cell thereof is suspended in water generally generates a large light pressure.
従来、このような原理は、微粒子を捕捉するためのレーザートラッピング技術に応用された例がある(特許文献1、特許文献2など参照)。 Conventionally, there is an example in which such a principle is applied to a laser trapping technique for capturing fine particles (see Patent Document 1, Patent Document 2, and the like).
しかしながら、公知のレーザートラッピング技術は、あくまでも、レンズで絞り込んだレーザー光の焦点位置で微粒子を捕捉する技術であり、該技術によって微粒子の運動方向(流れ方向)を偏向させて微粒子を回収すること、即ち微粒子の流路にレーザービームを照射することによって微粒子をその流れ方向に逆らってビームの進行方向に偏向させて回収しようとする試みは従来知られていない。 However, the known laser trapping technology is a technology that captures fine particles at the focal position of the laser light narrowed down by the lens, and collects the fine particles by deflecting the movement direction (flow direction) of the fine particles by the technique. That is, no attempt has been made in the past to irradiate a fine particle flow path with a laser beam so as to deflect the fine particle in the beam traveling direction against the flow direction.
事実、例えば上記特許文献1に記載の技術は、微粒子の懸濁液をスライドガラス等のチャンバーに収容し、その懸濁液中サンプリングすべき微粒子にレーザービームを照射して捕捉するものでしかない。捕捉した微粒子は、静電力により電界方向に配向させ、しかる後レーザービーム又はチャンバーを移動させて輸送している。特許文献2に記載の技術も、微粒子をレーザービームでトラップして、その位置および向き(姿勢)を制御する装置に関するものでしかない。いずれも、レーザービームの光圧によって、微粒子の運動方向を偏向し、かつレーザービームの収束方向に微粒子を移動しようとするものではない。 In fact, for example, the technique described in Patent Document 1 described above is merely a method in which a suspension of fine particles is housed in a chamber such as a slide glass, and the fine particles to be sampled in the suspension are irradiated with a laser beam and captured. . The trapped fine particles are oriented in the direction of the electric field by electrostatic force, and then moved by moving the laser beam or the chamber. The technique described in Patent Document 2 is also only related to an apparatus that traps fine particles with a laser beam and controls the position and orientation (attitude) thereof. In either case, the movement direction of the fine particles is deflected by the light pressure of the laser beam and the fine particles are not moved in the convergence direction of the laser beam.
本発明方法において、流路に流す気体または液体は、上述したように、光圧が作用する(光圧に応答する)微粒子を含むものであればよい。即ち、流路に流す気体乃至液体は、光圧に応答する微粒子と光圧に応答しない成分とを含むものであればよい。なお、媒体として使用する気体乃至液体は、上記でいう光圧に応答しない成分に含まれる。気体乃至液体中に含まれる微粒子は、気体や液体などの媒体とは屈折率、誘電率などが相違し、これによって光圧に差を生じるものであればよい。該微粒子の代表例としては、細胞、微生物、生体高分子物質などが挙げられる。細胞には、動物細胞(赤血球など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類；タバコモザイクウイルスなどのウイルス類；イースト菌などの菌類などが含まれる。生体高分子物質には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。 In the method of the present invention, as described above, the gas or liquid flowing in the flow path only needs to contain fine particles on which the light pressure acts (responds to the light pressure). That is, the gas or liquid flowing through the flow path may be any material that contains fine particles that respond to light pressure and components that do not respond to light pressure. In addition, the gas thru | or liquid used as a medium are contained in the component which does not respond to the above-mentioned light pressure. The fine particles contained in the gas or liquid may have any refractive index and dielectric constant different from those of the medium such as gas or liquid, thereby causing a difference in light pressure. Representative examples of the fine particles include cells, microorganisms, and biopolymer substances. Cells include animal cells (such as red blood cells) and plant cells. Microorganisms include bacteria such as Escherichia coli; viruses such as tobacco mosaic virus; fungi such as yeast. Biopolymer substances include chromosomes, liposomes, mitochondria, organelles (organelles) that constitute various cells.
また本発明方法が適用できる光圧に応答する微粒子は、上記例示のものに限定されることなく、レーザートラッピング技術によってトラップされることの知られている各種の微粒子、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。 The fine particles responding to the light pressure to which the method of the present invention can be applied are not limited to those exemplified above, but various fine particles known to be trapped by the laser trapping technique, such as organic or inorganic polymer materials. Or metal. Organic polymer materials include polystyrene, styrene / divinylbenzene, polymethyl methacrylate, and the like. Inorganic polymer materials include glass, silica, magnetic materials, and the like. Metals include gold colloid, aluminum and the like.
上記微粒子は、通常、ナノメートルからマイクロメートルのオーダの粒径、より具体的には約20nm−50μmの粒径を有しているのが好ましい。その形状、大きさ、質量などは特に制限されない。一般にその形状は球形であるのが普通であるが、非球形であってもよい。 The fine particles preferably have a particle size on the order of nanometers to micrometers, more specifically about 20 nm-50 μm. The shape, size, mass, etc. are not particularly limited. In general, the shape is usually spherical, but may be non-spherical.
上記微粒子は、一般には、これを気体または液体等の媒体に混合して、気流もしくは液流の状態で前記流路に流すことができる。気流または液流を形成する媒体としては、従来のレーザートラッピング技術に利用されている各種の気体および液体を挙げることができる。液流を形成する好ましい媒体(液媒)としては、純水、PBS(リン酸塩緩衝生理食塩水)などを例示することができる。該媒体は、光圧に応答する微粒子との関連において、その屈折率などが当該微粒子のそれよりも小さいものであるのが好ましい(この意味で、本発明では「光圧に応答しない成分」という)。流路に流される特に好ましい液体としては、細胞を上記液媒に配合または懸濁させた懸濁液等を挙げることができる。該液流中の細胞数は、特に制限されるものではないが、一般には1×105〜1×107個/ml程度とするのが普通である。その流速は、レーザービームの照射によってその流れ方向を、レーザービームの収束方向に偏向できることを前提として、微粒子の種類、これに照射するレーザービームの種類などに応じて適宜決定できる。 In general, the fine particles can be mixed with a medium such as a gas or a liquid and allowed to flow through the flow path in a state of airflow or liquid flow. Examples of the medium that forms an air flow or a liquid flow include various gases and liquids used in the conventional laser trapping technology. Examples of a preferable medium (liquid medium) for forming a liquid flow include pure water and PBS (phosphate buffered saline). It is preferable that the medium has a refractive index smaller than that of the fine particles in relation to the fine particles that respond to light pressure (in this sense, the term “component that does not respond to light pressure” in the present invention). ). As a particularly preferable liquid to be flowed in the flow path, a suspension in which cells are mixed or suspended in the liquid medium can be exemplified. The number of cells in the liquid flow is not particularly limited, but is generally about 1 × 10 5 to 1 × 10 7 cells / ml. The flow velocity can be appropriately determined according to the type of fine particles, the type of laser beam applied to the particle, etc., on the premise that the flow direction can be deflected in the laser beam convergence direction by laser beam irradiation.
本発明方法において、利用されるレーザービームは、その種類、照射条件などにおいて、従来のレーザートラッピング技術に利用されるそれらと同様のものとすることができる。代表的なレーザービームとしては、例えばNd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet)レーザービーム(波長：1064nm)、Nd:VAN (neodymium-doped vanadate)レーザービーム(波長：1064nm)などを利用できる。このレーザービームは、生物に対する影響が少ない点で特に好適である。その照射条件は、具体的には、CW(continuous waveもしくは連続波)において100mW〜2Wの条件を利用することができる。レーザービームの照射は、間欠的にまたは連続して行うことができる。 In the method of the present invention, the laser beam used can be the same as that used in the conventional laser trapping technology in the type, irradiation conditions, and the like. As typical laser beams, for example, Nd: YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser beam (wavelength: 1064 nm), Nd: VAN (neodymium-doped vanadate) laser beam (wavelength: 1064 nm), or the like can be used. This laser beam is particularly suitable in that it has little influence on living things. As the irradiation condition, specifically, a condition of 100 mW to 2 W can be used in CW (continuous wave). The laser beam irradiation can be performed intermittently or continuously.
本発明ではこのレーザービームの照射を、微粒子を含む気体または液体の流れ方向に交差させて行うことが重要である。この照射によって、気流または液流中の微粒子は、その運動方向が、気体または液体の流れ方向に逆らって、レーザービームの進行方向(収束方向)に偏向されて、光圧に応答しない成分とは分別して回収可能となるのである。例えばレーザービームの収束方向に、流路側に開口を向けて適当な回収用チャンバーを配置すれば、目的とする微粒子のみが選択的に該チャンバー内に回収され、蓄積される(濃縮)。 In the present invention, it is important that the laser beam irradiation is performed so as to intersect the flow direction of the gas or liquid containing fine particles. By this irradiation, the fine particles in the air flow or liquid flow are deflected in the laser beam traveling direction (convergence direction) against the gas or liquid flow direction, and the component does not respond to the light pressure. It can be collected separately. For example, if an appropriate collection chamber is disposed in the direction of convergence of the laser beam with the opening directed toward the flow path, only the target particles are selectively collected and accumulated (concentrated) in the chamber.
尚、レーザービームの照射は、一般には気流または液流の方向に対して直角となる方向に行われるのが好ましいが、気流または液流の方向と交差する限り、即ち、微粒子の流れる方向が偏向される限り、特にその角度は重要ではない。 In general, laser beam irradiation is preferably performed in a direction perpendicular to the direction of airflow or liquid flow, but as long as it intersects the direction of airflow or liquid flow, that is, the direction of flow of the fine particles is deflected. As long as it is done, the angle is not particularly important.
光圧に応答する、異なる特性を有する複数の微粒子を標的とする場合、例えば、前記回収用チャンバーを並列させて複数個配置し、各チャンバーの開口に向けて、複数のレーザービームを照射すれば、これによって目的とする各微粒子(標的微粒子)の各々を、別々のチャンバー内に回収することができる。 When targeting a plurality of fine particles having different characteristics that respond to light pressure, for example, if a plurality of the collection chambers are arranged in parallel and a plurality of laser beams are irradiated toward the openings of the chambers, Thus, each target fine particle (target fine particle) can be collected in a separate chamber.
(2) 標的微粒子の分別回収方法
前述する本発明に従う微粒子の分別回収方法は、これを例えばフローサイトメトリーのソーティング方法に応用することができる。即ち、本発明方法は、フローサイトメトリーにおけるソーティング部としての従来の水滴荷電方式に代替することができる。本発明方法を利用したフローサイトメトリーによれば、所望の微粒子(標的微粒子)のみを選択的に分別回収(ソーティング)することができる。
(2) Method for fractional collection of target fine particles The method for fractional collection of fine particles according to the present invention described above can be applied to, for example, a sorting method for flow cytometry. That is, the method of the present invention can be replaced with a conventional water droplet charging method as a sorting unit in flow cytometry. According to flow cytometry using the method of the present invention, only desired fine particles (target fine particles) can be selectively separated (sorted).
本発明方法を応用したフローサイトメトリー(セルソーティング、FACS)は、例えば以下の如くして実施できる。 Flow cytometry (cell sorting, FACS) applying the method of the present invention can be performed, for example, as follows.
即ち、回収対象とする微粒子(光圧に応答する微粒子)を含む試料(気体または液体)について、予め公知のフローサイトメトリーの検出部および解析部における操作と同様の操作を行って散乱光(前方散乱光、側方散乱光)や蛍光などを検出、解析する。次いで、この微粒子を含む試料(気体または液体)を本発明方法に従って流路に流し、当該気体または液体の流れに交差させて、この流路内を通過する回収したい所望の微粒子(標的微粒子)に対して選択的にレーザービームを照射すれば、標的微粒子のみがその運動方向をレーザービームの収束方向に偏向されて、他の微粒子および光圧に応答しない成分とは分別して回収される。 That is, for samples (gas or liquid) containing fine particles to be collected (fine particles that respond to light pressure), the same operations as those in the known flow cytometry detection unit and analysis unit are performed in advance, and scattered light (forward (Scattered light, side scattered light) and fluorescence are detected and analyzed. Next, a sample (gas or liquid) containing the fine particles is caused to flow through the flow path according to the method of the present invention, crosses the flow of the gas or liquid, and passes to the desired fine particles (target fine particles) to be collected that pass through the flow path. On the other hand, when the laser beam is selectively irradiated, only the target fine particles are deflected in the moving direction of the laser beam and collected separately from other fine particles and components not responding to the light pressure.
上記標的微粒子の好ましい具体例としては、一般的なFACSに従って蛍光色素などで標識された抗体を結合(コーティング)させた細胞、同様に蛍光色素などで標識した生体高分子などを挙げることができる。これらの選択は、従来のFACSに準じて実施することができる。例えば、アルゴンレーザーを照射することによって、蛍光の強度および波長もしくは散乱光強度を検出し、得られる検出結果(データ)を解析することによって、標的微粒子とする特定の蛍光強度やその波長、散乱光強度などを有する微粒子を選択することができる。 Preferable specific examples of the target fine particles include cells bound (coated) with an antibody labeled with a fluorescent dye according to general FACS, and biopolymers similarly labeled with a fluorescent dye. These selections can be performed according to conventional FACS. For example, by irradiating an argon laser, the intensity and wavelength or scattered light intensity of the fluorescence is detected, and the detection result (data) obtained is analyzed to obtain the specific fluorescence intensity, its wavelength, and scattered light as the target fine particles. Fine particles having strength and the like can be selected.
また、細胞内部や表面上に存在する種々の被験対象、例えば細胞内で発現された蛋白質などを、二種以上の蛍光色素や例えばGFP(Green fluorescent protein,緑色発光蛋白質)などの発光蛋白質を用いて多重染色すれば、所望の発光波長を発する複数種の微粒子を、それぞれ標的微粒子として、同時に選択することができる。これらの操作は、従来公知のフローサイトメトリー乃至セルソーターの検出部および解析部における各操作と同様のものとすることができる(例えば、非特許文献1参照)。 In addition, various test subjects existing inside or on the surface of cells, such as proteins expressed in cells, are used with two or more fluorescent dyes or photoproteins such as GFP (Green fluorescent protein). If multiple staining is performed, a plurality of types of fine particles emitting a desired emission wavelength can be simultaneously selected as target fine particles. These operations can be the same as those in the conventionally known flow cytometry or cell sorter detection unit and analysis unit (see, for example, Non-Patent Document 1).
本発明ソーティング方法は、微少量の溶液を流路に流すサンプルとして使用して、その中の微粒子の検出および分別回収が可能な方法であるため、例えば、抗原抗体反応を利用する免疫検出系に好適に適用することができる。この場合、予め使用する抗体を蛍光物質で標識しておくことにより、抗原抗体反応等の免疫反応によって生じたマイクロメートルサイズの微粒子を、選択的に、レーザービーム照射によって流路からチャンバーに誘導することができ、該チャンバーに分別回収され、蓄積(濃縮)された微粒子を測定することによって、免疫反応物を高感度で検出することができる。特に、この方法において用いる抗体の種類に応じて異なる蛍光物質を利用することによって、蛍光強度や波長の相違に基づいて、同時に異なる複数種の抗原抗体反応物(すなわち、異なる細胞など)を分別回収して解析することができる(多重検出)。 Since the sorting method of the present invention is a method that allows detection and fractional collection of fine particles in a sample using a small amount of solution flowing through a flow path, for example, an immunodetection system using an antigen-antibody reaction. It can be suitably applied. In this case, by labeling the antibody to be used in advance with a fluorescent substance, micrometer-sized microparticles generated by an immune reaction such as an antigen-antibody reaction are selectively guided from the flow path to the chamber by laser beam irradiation. The immunoreactant can be detected with high sensitivity by measuring the microparticles separately collected and accumulated (concentrated) in the chamber. In particular, by using different fluorescent substances depending on the type of antibody used in this method, different types of antigen-antibody reactants (i.e. different cells, etc.) can be separated and collected simultaneously based on differences in fluorescence intensity and wavelength. (Multiple detection).
なお、蛍光標識によらない場合、蛍光物質に代えて、抗体の種類に応じて異なる大きさのビーズを用いることもできる。この場合、当該ビーズに抗体をコーティングした後、該抗体を血液などの検体サンプルと混合して免疫反応させ、得られた反応物(微粒子)を含む液体を流路に流すサンプルとして使用すると、微粒子の大きさの相違に基づいて、同時に異なる複数種の抗原抗体反応物(すなわち、異なる細胞など)を分別回収して解析することができる。 When not using a fluorescent label, beads of different sizes can be used depending on the type of antibody instead of the fluorescent substance. In this case, after the antibody is coated on the beads, the antibody is mixed with a specimen sample such as blood to cause an immunoreaction, and the resulting reaction product (microparticles) is used as a sample that flows into the flow path. Based on the difference in size, different types of antigen-antibody reaction products (that is, different cells, etc.) can be separately collected and analyzed at the same time.
(3) 微粒子回収装置
本発明の微粒子回収装置は、光圧に応答する微粒子を回収するための回収部と、レーザービーム照射部と、当該回収部とレーザービーム照射部との間に、光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分を含有する気体または液体を流すための流路とを備えている。上記回収部は流路側に開口を向けて配置された少なくとも一つのチャンバーを備えており、また上記レーザービーム照射部は少なくとも一つの照射口を備えている。更に上記レーザービーム照射口からのレーザービームの照射は、上記流路に交差させて、上記回収部のチャンバーの開口に向けて行われ、且つレーザービームが回収部のチャンバーの開口より遠方に収束するように行われる。
(3) Particulate Collection Device The particulate collection device of the present invention comprises a collection unit for collecting particulates responsive to light pressure, a laser beam irradiation unit, and a light pressure between the collection unit and the laser beam irradiation unit. And a flow path for flowing a gas or liquid containing a component that does not respond to light pressure and a component that does not respond to light pressure. The recovery unit includes at least one chamber disposed with an opening facing the flow channel side, and the laser beam irradiation unit includes at least one irradiation port. Further, laser beam irradiation from the laser beam irradiation port is performed toward the opening of the chamber of the recovery unit, intersecting the flow path, and the laser beam converges farther from the opening of the chamber of the recovery unit. To be done.
本発明の一実施態様である微粒子回収装置の概略図を図1および2に示す。当該図1および2は、後記実施例に詳述する蛍光ラテックスビーズ(直径約2μm)を回収するための、マイクロチップ形態の本発明装置の概略図である。図1(a)は微粒子回収装置の正面図である。図1(b)は、図1(a)中、点線で囲った部分を拡大した図であって、加えて、レーザービーム照射部(3)の照射口(3a)からレーザービーム(3b)を照射している様子を示すものである。 1 and 2 are schematic views of a fine particle recovery apparatus according to an embodiment of the present invention. FIGS. 1 and 2 are schematic views of the device of the present invention in the form of a microchip for recovering fluorescent latex beads (diameter of about 2 μm) described in detail in Examples below. FIG. 1 (a) is a front view of the particulate collection device. Fig. 1 (b) is an enlarged view of the portion surrounded by the dotted line in Fig. 1 (a) .In addition, the laser beam (3b) is irradiated from the irradiation port (3a) of the laser beam irradiation unit (3). It shows a state of irradiation.
また、図7は、上記図1および2に示される本発明微粒子回収装置の流路(2)と回収部(1)を正面から撮影した画像図である。この図7では、理解を容易にするために、流路(2)に赤インクを通液している。向かって右側および左側の赤スポット部が、それぞれ流路入口(5)および流路出口(6)であり、その間をつなぐ赤いラインが流路(2)である。当該微粒子回収装置(チップ)は、5mm厚のPDMS基板(60mm×24mm、5mm厚)に、図1(a)に示すように、流路入口(5)および流路出口(6)となる穴をあけ、両者をつなぐように50μm幅および25μm深さの溝を作成する(これが、流路(2)となる)。さらに当該溝に垂直になるように、35μm幅×35μm奥行きおよび25μm深さの溝を作成する(これが、チャンバー(1a、1b)となる)。次いで、当該基板の上から溝を覆うように、100μm厚のPDMS製のフィルム(60mm×24mm、5mm厚)を貼り合わせる。斯くして、微粒子回収装置の流路(流路(2))と回収部(回収チャンバー(1a、1b))が形成される。 FIG. 7 is an image of the flow path (2) and the recovery part (1) of the fine particle recovery apparatus of the present invention shown in FIGS. 1 and 2 taken from the front. In FIG. 7, for easy understanding, red ink is passed through the flow path (2). The red spot portions on the right side and the left side are the channel inlet (5) and the channel outlet (6), respectively, and the red line connecting between them is the channel (2). The fine particle collection device (chip) is provided on a 5 mm-thick PDMS substrate (60 mm × 24 mm, 5 mm thickness), as shown in FIG. A groove having a width of 50 μm and a depth of 25 μm is formed so as to connect the two (this is the flow path (2)). Further, a groove having a width of 35 μm × 35 μm and a depth of 25 μm is formed so as to be perpendicular to the groove (this is the chamber (1a, 1b)). Next, a 100 μm-thick PDMS film (60 mm × 24 mm, 5 mm thick) is bonded so as to cover the groove from above the substrate. Thus, the flow path (flow path (2)) and the recovery part (recovery chambers (1a, 1b)) of the fine particle recovery apparatus are formed.
各図に示される本発明微粒子回収装置は、2つのチャンバー(図1(b)中、1aおよび1b)を有する微粒子回収部(図1(b)中、1)、1つの照射口(図1(b)中、3a)を有するレーザービーム照射部(図1(b)中、3)、並びに、当該微粒子回収部(1)とレーザービーム照射部(3)との間に流路(図1(b)中、2)を備えている。また、照射口(3a)は、あいだに流路(2)を介して、微粒子回収部のチャンバー(1a)の開口と対向するように配置されており、開口からチャンバー内にレーザービームが入るようになっている。さらに、回収するための標的微粒子を含む気体または液体試料は、図2中aから、流路入口(5)を介して流路(2)に入り、当該流路(2)を流路入口(5)から流路出口(6)方向に流れて、次いで当該流路出口(6)からbに排出されるように設計されている。なお、図1(b)において、(4)は微粒子回収装置の底面を構成する外壁である。当該外壁と微粒子回収部(1)との間に、流路(2)が構成されている。 The fine particle collection apparatus of the present invention shown in each figure has a fine particle collection part (in FIG. 1 (b), 1) having two chambers (in FIG. 1 (b), 1a and 1b), one irradiation port (FIG. 1). (b), 3a) a laser beam irradiation part (in FIG. 1 (b), 3), and a flow path (FIG. 1) between the particulate collection part (1) and the laser beam irradiation part (3). In (b), 2) is provided. In addition, the irradiation port (3a) is disposed so as to face the opening of the chamber (1a) of the particulate collection unit via the flow path (2), so that the laser beam can enter the chamber from the opening. It has become. Further, the gas or liquid sample containing the target fine particles to be collected enters the flow channel (2) from a in FIG. 2 through the flow channel inlet (5), and the flow channel (2) passes through the flow channel inlet ( It is designed to flow from 5) toward the channel outlet (6) and then discharged from the channel outlet (6) to b. In FIG. 1 (b), (4) is an outer wall constituting the bottom surface of the particulate collection device. A flow path (2) is formed between the outer wall and the particulate collection unit (1).
図1に示す微粒子回収部は、35μm×25μm(底面若しくは開口の面積)×35μm(開口部から底面までの長さ、奥行き)の容積を有するチャンバー(1a,1b)を有している。しかし、本発明装置の微粒子回収部に設けられるチャンバーの容積および開口の大きさは、これに限定されることなく、微粒子回収装置の使用目的、回収部の大きさ、その1チャンバー内に回収したい微粒子の大きさおよびその量や、照射するレーザービームの径などに応じて適宜選択設定することができる。また図1に示す流路(2)は、断面積が50μm×25μmの立方形の流路径を備えている。しかし、本発明装置の流路(2)の断面形状やその断面積(言い換えれば、流路径)は、これに限定されることなく、流路を流す気体および液体の別、および微粒子の大きさなどに応じて適宜選択設定することができる。 The fine particle collection unit shown in FIG. 1 has chambers (1a, 1b) having a volume of 35 μm × 25 μm (bottom surface or opening area) × 35 μm (length from opening to bottom surface, depth). However, the volume of the chamber and the size of the opening provided in the particulate collection unit of the present invention device are not limited to this, and the purpose of use of the particulate collection device, the size of the collection unit, and the desire to collect in one chamber It can be appropriately selected and set according to the size and amount of the fine particles, the diameter of the laser beam to be irradiated, and the like. Further, the channel (2) shown in FIG. 1 has a cubic channel diameter having a cross-sectional area of 50 μm × 25 μm. However, the cross-sectional shape of the flow path (2) of the present invention device and the cross-sectional area thereof (in other words, the flow path diameter) are not limited to this, the gas and liquid flowing through the flow path, and the size of the fine particles It can be appropriately selected and set according to the above.
当該微粒子回収装置による微粒子の回収は、例えば、以下のように実施される。まず、回収したい標的微粒子を含有する気体または液体試料(好ましくは液体試料)を、流路入口(5)から流路出口(6)に向けて、流路(2)内に流す。試料が流路(2)を流れている間に、照射口(3a)からチャンバー(1a)内に集光するように、レーザービーム(3b)を照射する。そうすると、照射口(3a)から出たレーザービームは、回収したい標的微粒子を含有する気体または液体試料が流れている流路(2)に照射される。このとき、当該流路(2)のレーザービーム照射領域に標的微粒子が入ると、当該標的微粒子はレーザービームの光圧の作用を受けて、その標的微粒子の進行方向がチャンバー(1a)方向に偏向され、かくしてチャンバー(1a)内に回収される。 The collection of fine particles by the fine particle collection apparatus is performed as follows, for example. First, a gas or liquid sample (preferably a liquid sample) containing target fine particles to be collected is flowed into the channel (2) from the channel inlet (5) toward the channel outlet (6). While the sample flows through the flow path (2), the laser beam (3b) is irradiated so that the sample is condensed into the chamber (1a) from the irradiation port (3a). Then, the laser beam emitted from the irradiation port (3a) is irradiated to the flow path (2) in which the gas or liquid sample containing the target fine particles to be collected flows. At this time, if the target fine particles enter the laser beam irradiation region of the flow path (2), the target fine particles are affected by the light pressure of the laser beam, and the traveling direction of the target fine particles is deflected in the direction of the chamber (1a). Thus, it is collected in the chamber (1a).
図2は、図1に示す微粒子回収装置について、レーザービーム照射部(3)をより詳細に記載する図である。但し、当該図2に示すレーザービーム照射部(3)を有する微粒子回収装置は、本発明の一態様であって、本発明はこれに特に制限されるものではない。図2において、(7)はNd:VANレザー、(8)はビームエキスパンダー、(9)は反射ミラー1、(10)は二色性ミラー2、(11)は二色性ミラー1、および(12)は対物レンズ1をそれぞれ示す。(13)は水銀ランプ、(14)はNDフィルター(neutral-density filter)を、および(15)は励起用バリアフィルターを示す。また、(16)は蛍光用バリアフィルター、(17)は反射ミラー2、(18)はレーザービームカットフィルター、および(19)はCCDカメラ1を示す。 FIG. 2 is a diagram describing the laser beam irradiation unit (3) in more detail with respect to the particulate collection device shown in FIG. However, the fine particle recovery apparatus having the laser beam irradiation section (3) shown in FIG. 2 is one embodiment of the present invention, and the present invention is not particularly limited thereto. In FIG. 2, (7) is Nd: VAN leather, (8) is a beam expander, (9) is a reflective mirror 1, (10) is a dichroic mirror 2, (11) is a dichroic mirror 1, and ( 12) shows the objective lens 1 respectively. (13) shows a mercury lamp, (14) shows an ND filter (neutral-density filter), and (15) shows an excitation barrier filter. Further, (16) shows a fluorescent barrier filter, (17) shows a reflection mirror 2, (18) shows a laser beam cut filter, and (19) shows a CCD camera 1.
当該図2に示す態様によれば、レーザービーム照射源であるNd:VANレザー(7)から発振されたレーザービームは、その進行方向前方に位置するビームエキスパンダー(8)によってそのビーム径が調整される。次いで、当該レーザービームは、反射ミラー1(9)、二色性ミラー2(10)および二色性ミラー1(11)によって屈曲されて、対物レンズ1(12)を通過し、照射口(3b)から、微粒子回収部のチャンバー(1a)の開口に向けて照射される。こうすることによって、Nd:VANレーザー(7)からのレーザービーム(3b)をチャンバー(1a)に集光させることができる。 According to the embodiment shown in FIG. 2, the beam diameter of the laser beam oscillated from the laser beam irradiation source Nd: VAN leather (7) is adjusted by the beam expander (8) positioned forward in the traveling direction. The Next, the laser beam is bent by the reflecting mirror 1 (9), the dichroic mirror 2 (10), and the dichroic mirror 1 (11), passes through the objective lens 1 (12), and the irradiation port (3b ) To the opening of the chamber (1a) of the particulate collection unit. By doing so, the laser beam (3b) from the Nd: VAN laser (7) can be condensed in the chamber (1a).
この時、チャンバーの開口より遠方、好ましくはチャンバーの底部付近にレーザービームが収束するように調整することが好ましい。なお、レーザービームの収束は、例えば上記の如く対物レンズを用いることによって行うことができる。図2中の対物レンズ1(12)は、上下移動自在となっており、その移動によってレーザービームの収束位置を上下に調節することが可能である。なお、上述するように、レーザービームの収束位置は、微粒子回収部(1)のチャンバーの開口より遠方であればよい。なお、開口より遠方であればチャンバー内および外を問わない。好ましくは、チャンバー内および外を問わず、チャンバーの底部付近である。 At this time, it is preferable to adjust so that the laser beam is converged far from the opening of the chamber, preferably near the bottom of the chamber. The convergence of the laser beam can be performed, for example, by using the objective lens as described above. The objective lens 1 (12) in FIG. 2 is movable up and down, and the convergence position of the laser beam can be adjusted up and down by the movement. As described above, the laser beam convergence position may be far from the opening of the chamber of the fine particle collection unit (1). Note that the inside and outside of the chamber are not limited as long as they are far from the opening. Preferably, it is near the bottom of the chamber regardless of inside or outside the chamber.
ここで、使用するレーザービームは、円形のものが普通であるが特にこれに限定されず、楕円形などのものであってもよい。 Here, the laser beam to be used is usually circular, but is not particularly limited thereto, and may be elliptical or the like.
本発明装置の好ましい態様として、図1に示すように、微粒子回収部のチャンバーの開口とレーザービーム照射部の照射口とが、流路を隔てて対向して設けられている態様を挙げることができる。この態様によれば、レーザービームは、流路、言い換えれば標的微粒子を含む気体または液体の流れ(気流または液流)に直角となるように入射される。但し、これに限定されることなく、レーザービームが流路と交差して、微粒子回収部のチャンバーに開口に入射されるものであれば、微粒子回収部のチャンバーおよびレーザービーム照射部の照射口の配置は任意に設定することができる。 As a preferred embodiment of the device of the present invention, as shown in FIG. 1, there is an embodiment in which the opening of the chamber of the particulate collection unit and the irradiation port of the laser beam irradiation unit are provided facing each other with a flow path therebetween. it can. According to this aspect, the laser beam is incident so as to be perpendicular to the flow path, in other words, the flow of gas or liquid containing the target fine particles (air flow or liquid flow). However, the present invention is not limited to this, as long as the laser beam intersects the flow path and is incident on the opening of the particle collecting unit chamber. Arrangement can be arbitrarily set.
また、本発明微粒子回収装置の他の好ましい態様としては、2以上の照射口を備えるレーザービーム照射部と、当該照射口の数に対応する複数のチャンバーを備えた微粒子回収部とを備える態様を例示することができる。こうした装置によれば、光圧に応答する複数の標的微粒子を、各々別個のチャンバーに分別回収することができる。 In addition, as another preferable aspect of the fine particle recovery apparatus of the present invention, an aspect including a laser beam irradiation unit including two or more irradiation ports and a fine particle recovery unit including a plurality of chambers corresponding to the number of irradiation ports. It can be illustrated. According to such an apparatus, a plurality of target fine particles that respond to light pressure can be separately collected in separate chambers.
このような多重ソーティング装置の一例の概略図を図3に示す。該図において(101)は、回収したい標的微粒子を含む液体または気体試料を収納したリザーバを示す。当該図において (104-1)、(104-2)、(104-3)、・・・および(104-n)は、微粒子回収用のチャンバー〔(104-1a)、(104-2a)、(104-3a)、・・・および(104-na)〕を備えた微粒子回収部を示す〔図1でいう微粒子回収部(1)およびチャンバー(1a、1b)に対応する〕。また(105)はレーザービーム照射部を含むレーザービームコントローラーを示す(図1でいうレーザービーム照射部(3)に対応する)。ここで、レーザービーム照射部に設けられた複数の照射口〔(105-1)、(105-2)、(105-3)、・・・および(105-n)〕の数に対応して、微粒子回収部も複数のチャンバー〔(104-1a)、(104-2a)、(104-3a)、・・・および(104-na)〕を備えている。(2)は上記試料が流れる流路であり、(106)はそれを回収する排液用リザーバを示す。 A schematic diagram of an example of such a multiple sorting apparatus is shown in FIG. In the figure, (101) shows a reservoir containing a liquid or gas sample containing target fine particles to be collected. In the figure, (104-1), (104-2), (104-3), ... and (104-n) are particulate collection chambers [(104-1a), (104-2a), (104-3a),..., And (104-na)] are shown (corresponding to the particulate collection section (1) and chambers (1a, 1b) in FIG. 1). Reference numeral (105) denotes a laser beam controller including a laser beam irradiation unit (corresponding to the laser beam irradiation unit (3) in FIG. 1). Here, it corresponds to the number of the plurality of irradiation ports [(105-1), (105-2), (105-3),..., And (105-n)] provided in the laser beam irradiation unit. The fine particle collecting section also includes a plurality of chambers [(104-1a), (104-2a), (104-3a),..., And (104-na)]. (2) is a flow path through which the sample flows, and (106) is a drainage reservoir for collecting it.
かかる態様の本発明微粒子回収装置は、前述するレーザービーム照射部、微粒子回収部および流路に加えて、流路を流れる気体または液体中の光圧に応答する微粒子を、検出して解析するための検出および解析部を備えることが好ましい。この場合、当該検出および解析部に対して、レーザービーム照射部、微粒子回収部および流路から構成される装置部分をソーティング部ということもできる。当該ソーティング部と検出および解析部を備えるものが、セルソーターである。なお、図3中、(102)および(103)が検出部に相当し、(102)は検出用レーザー、(103)は検出器を示す。また図3中、解析部は(105)で示すレーザーコントローラー内に組み込まれている。 In this aspect, the particulate collection device of the present invention is for detecting and analyzing particulates that respond to the light pressure in the gas or liquid flowing in the flow path, in addition to the laser beam irradiation section, the particulate collection section, and the flow path described above. It is preferable to provide a detection and analysis unit. In this case, for the detection and analysis unit, an apparatus part including a laser beam irradiation unit, a fine particle collection unit, and a flow path can also be referred to as a sorting unit. A cell sorter includes the sorting unit and the detection and analysis unit. In FIG. 3, (102) and (103) correspond to detectors, (102) indicates a detection laser, and (103) indicates a detector. In FIG. 3, the analysis unit is incorporated in the laser controller indicated by (105).
ここで、検出および解析部は、従来公知のフローサイトメトリー乃至セルソーターで用いられる検出および解析部と同様のものとすることができる。例えば、検出部は、流路内を流れる試料(液体試料または気体試料、好ましくは液体試料)の流路(液流、気流)にレーザー光(例えば、アルゴン、ダイオード、ダイ、ヘリウムネオンなどのsingle laserまたはDual laser)を当てて、該流路を通過した微粒子から得られる、前方散乱光(FSC)若しくは側方散乱光(SSC)、または標的微粒子を予め蛍光物質で標識した場合は、当該蛍光標識した微粒子の各種蛍光を測定するための検出器を備えたものとすることができる。また、解析部は、上記検出器によって検出されたデータをデジタル変換してサイトグラム、ヒストグラムとして表示するための解析表示装置を備えたものとすることができる。なお、上記前方散乱光(FSC)は例えば細胞の大きさ、側方散乱光(SSC)は例えば細胞の内部構造の複雑さをそれぞれ反映して光強度が変化する。また、フローサイトメトリー乃至セルソーターで標的微粒子の標識に使用される蛍光物質もよく知られており、これらを本発明で同様に使用することができる(例えば、非特許文献1参照)。 Here, the detection and analysis unit can be the same as the detection and analysis unit used in a conventionally known flow cytometry or cell sorter. For example, the detection unit may include laser light (e.g., argon, diode, die, helium neon, etc.) in the flow path (liquid flow, air flow) of a sample (liquid sample or gas sample, preferably liquid sample) flowing in the flow path. laser or dual laser), the forward scattered light (FSC) or the side scattered light (SSC) obtained from the fine particles that have passed through the flow path, or the target fine particles when previously labeled with a fluorescent substance, the fluorescence A detector for measuring various fluorescence of the labeled microparticles can be provided. Further, the analysis unit may include an analysis display device for digitally converting data detected by the detector and displaying the data as a cytogram or a histogram. The forward scattered light (FSC) changes the light intensity, for example, reflecting the size of the cell, and the side scattered light (SSC), for example, reflects the complexity of the internal structure of the cell. In addition, fluorescent substances used for labeling target microparticles by flow cytometry or cell sorter are well known, and these can be used in the present invention as well (for example, see Non-Patent Document 1).
本発明の微粒子回収装置の好ましい一態様によれば、当該装置は、上記検出部および解析部が、ソーティング部におけるレーザービーム照射部と連動してなり、検出部で得られ解析部で解析されたデータに基づいて、流路の照射予定領域に、選択された標的微粒子が流れてきた時にのみ、当該標的微粒子に選択的にレーザービームが照射されるように設計される。 According to a preferred aspect of the particulate collection apparatus of the present invention, the detection unit and the analysis unit are linked with the laser beam irradiation unit in the sorting unit, and are obtained by the detection unit and analyzed by the analysis unit. Based on the data, the target fine particles are designed to be selectively irradiated with the laser beam only when the selected fine particles flow in the irradiation target region of the flow path.
このような好適な本発明微粒子回収装置を利用すれば、光圧に応答する複数の微粒子を含む試料(気体試料または液体試料)の中から、微粒子個々の特性に応じて、1または2以上の標的微粒子を、選択的に区別して各々分別回収することができる。 By using such a preferred particulate collection device of the present invention, one or two or more of samples (gas sample or liquid sample) containing a plurality of particulates that respond to light pressure, depending on the characteristics of the particulates. The target fine particles can be selectively separated and collected separately.
例えば、一例として図3に示す本発明装置を利用した標的微粒子の分別回収方法を説明すると次の通りである。 For example, as an example, a method for separating and collecting target fine particles using the apparatus of the present invention shown in FIG. 3 will be described as follows.
複数の異なる標的微粒子(例えば細胞、微生物または蛋白質など)のそれぞれに、蛍光標識した各抗体を抗原抗体反応等の免疫反応により結合させ、これを含む試料溶液(例えば細胞等の浮遊液)をノズル等を利用して高流速で線状に流し、これにレーザーを照射すると当該液流中を通過した標的微粒子から、散乱光と蛍光が発せられる。かかる光の強度や蛍光波長等を検出部で測定し、得られた結果を解析部で解析する。次いで得られた情報(データ)を元にしてレーザーコントローラー(105)によりレーザービームの照射位置および時期等を決定し、流路(2)を標的の微粒子が通過する時に、当該標的微粒子に選択的にレーザービームを照射する。レーザービームが照射された標的微粒子は、光圧によってその流れ方向が偏向し、回収部のチャンバー内に回収される。斯くして、回収する標的微粒子が複数ある場合であっても、それが発する散乱光や蛍光の強度や波長の違いに基づいて、それぞれ別個に分別し回収部(104-1)・・・および(104-n)の各チャンバーに回収することができる。なお、各チェンバーに回収された微粒子(例えば、細胞、微生物または蛋白質など)は、該チャンバー内で免疫反応の検出を行うかまたは各チェンバーに蓄積された微粒子を取り出して別個に常法に従う生化学的分析に供して免疫検定を行うこともできる。 Each of a plurality of different target microparticles (for example, cells, microorganisms, proteins, etc.) is bound to each fluorescently labeled antibody by an immune reaction such as an antigen-antibody reaction, and a sample solution (for example, a suspension such as a cell) containing the antibody is nozzleed When a laser beam is radiated into a linear flow at a high flow rate using the above-described method, scattered light and fluorescence are emitted from the target fine particles that have passed through the liquid flow. The light intensity, fluorescence wavelength, and the like are measured by the detection unit, and the obtained results are analyzed by the analysis unit. Next, based on the obtained information (data), the laser controller (105) determines the irradiation position and timing of the laser beam, and when the target particle passes through the channel (2), it is selective to the target particle. Irradiate the laser beam. The flow direction of the target fine particles irradiated with the laser beam is deflected by the light pressure and is collected in the chamber of the collection unit. Thus, even when there are a plurality of target fine particles to be collected, based on the difference in intensity and wavelength of the scattered light and fluorescence emitted from it, each is separately separated and collected (104-1) ... (104-n) can be collected in each chamber. Microparticles collected in each chamber (for example, cells, microorganisms, proteins, etc.) are detected by performing an immune reaction in the chamber or by taking out the microparticles accumulated in each chamber and separately performing biochemistry according to a conventional method. It is also possible to perform an immunoassay by subjecting to manual analysis.
上記においては、レーザービーム照射口を回収チャンバーの数だけ用意することもできるが、これに代えて、既知のレーザー操作技術を利用してポリゴンミラーなどを用いて1本のレーザーの方向を変えて、レーザー照射位置および時期を走査、制御することも可能である。 In the above, it is possible to prepare as many laser beam irradiation ports as the number of collection chambers, but instead, change the direction of one laser using a polygon mirror using a known laser operation technique. It is also possible to scan and control the laser irradiation position and timing.
なお、個々の標的微粒子の回収は、レーザービーム照射口から発せられるレーザービームの光圧によって標的微粒子の流れ方向を偏向させた結果として行われるものである。標的微粒子の流れ方向を偏向させる位置は、レーザービーム照射口を制御することによって行うこともできるし、また照射口の位置は固定したままで回収部またはそのチャンバー位置を移動させることによって行うこともできる。 The collection of individual target fine particles is performed as a result of deflecting the flow direction of the target fine particles by the light pressure of the laser beam emitted from the laser beam irradiation port. The position for deflecting the flow direction of the target fine particles can be controlled by controlling the laser beam irradiation port, or can be performed by moving the collection unit or the chamber position while the irradiation port position is fixed. it can.
上記図3に示す装置は、複数の蛍光情報を有する細胞を、その蛍光情報ごとに別々のチャンバーに回収する場合(マルチソーティング)に応用できる。この場合も、各チャンバーに回収された各細胞の分析は、該チャンバー内で行うこともでき、またチャンバーから取り出して分析することもできる。このような本発明の装置を利用することによって一つの装置(例えば、チップ形態にした場合は一枚のチップ)で、同時に複数の異なる細胞を分別回収することができる。 The apparatus shown in FIG. 3 can be applied to a case where cells having a plurality of fluorescence information are collected in separate chambers for each fluorescence information (multi-sorting). Also in this case, analysis of each cell collected in each chamber can be performed in the chamber, or can be taken out from the chamber for analysis. By using such an apparatus of the present invention, a plurality of different cells can be separately collected at the same time with one apparatus (for example, one chip in the case of a chip form).
以上のように、本発明回収方法および装置は、光圧を利用することによって、光圧に応答する微粒子を、レーザービームの収束方向に偏向移動させることで、所望の回収チャンバーに回収することができるものである。また当該方法および装置は、従来のフローサイトメトリーやセルソーターにおける検出および解析技術を使用することにより、光圧に応答する複数の微粒子の中から、所望の標的微粒子を選別することもできる方法および装置である(多重分別回収)。当該本発明で利用する光圧は、それ自体制御容易であり、しかもその利用によって本発明の装置およびその周辺装置の簡略化をも図り得る利点がある。更に、本発明方法および装置を利用する微粒子のソーティング技術では、従来の水滴荷電方式のような水滴にするといった流体制御の必要がなく、少量の試料を利用して容易に所望の微粒子のソーティングを行い得る。 As described above, the recovery method and apparatus according to the present invention can recover fine particles that respond to light pressure in a desired recovery chamber by deflecting and moving the fine particles that respond to the light pressure in the laser beam convergence direction. It can be done. The method and apparatus can also select desired target fine particles from a plurality of fine particles that respond to light pressure by using detection and analysis techniques in conventional flow cytometry and cell sorters. (Multiple fraction collection). The light pressure used in the present invention is easy to control, and there is an advantage that the device of the present invention and its peripheral devices can be simplified by using the light pressure. Furthermore, in the fine particle sorting technology using the method and apparatus of the present invention, there is no need for fluid control such as the conventional water droplet charging method, and the desired fine particle can be easily sorted using a small amount of sample. Can be done.
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。 Examples are given below to illustrate the present invention in more detail.
実施例1
(1) 試験方法
この試験には図1および図2に示す本発明の微粒子回収装置(マイクロチップ形態)を利用した。
Example 1
(1) Test Method For this test, the microparticle recovery apparatus (microchip form) of the present invention shown in FIGS. 1 and 2 was used.
チップに設けられた微粒子回収部(1)は、微粒子を回収するための2つのマイクログローブ(35μm×35μm×25μm、チャンバー(1a),(1b))を備えている。また、微粒子を含有する試料を通液するマイクロチャネル(50μm幅×25μm深さ、流路(2))は、外壁(4)(PDMS製)によって外部と仕切られている。対物レンズ1(図2の12)の作動距離を考慮して、上記チャンバー(1a)(マイクログローブ)の底部付近にNd:VANレーザービーム(波長：1064nm)が収束するように、外壁(4)の厚さは300μmとした。 The fine particle collecting section (1) provided on the chip includes two micro gloves (35 μm × 35 μm × 25 μm, chambers (1a), (1b)) for collecting fine particles. In addition, a microchannel (50 μm width × 25 μm depth, flow path (2)) through which a sample containing fine particles is passed is partitioned from the outside by an outer wall (4) (manufactured by PDMS). Considering the working distance of the objective lens 1 (12 in FIG. 2), the outer wall (4) so that the Nd: VAN laser beam (wavelength: 1064 nm) converges near the bottom of the chamber (1a) (microglove). The thickness was 300 μm.
この試験には倒立蛍光顕微鏡(Axiovert135TV,Carl Zeiss)を、レーザー操作システムと結合させて用いた。Nd:VANレーザー(7)から照射されたレーザービームは、外壁(4)に面する顕微鏡対物レンズ(12)を用いて集光し、チャンバー(1a)内に導入した。なお、レーザー光路内にビームエキスパンダー(8)を挿入することで、ビーム径を調整し、同一の対物レンズにおいてレーザー焦点と観察面とを一致させた。 An inverted fluorescence microscope (Axiovert135TV, Carl Zeiss) was used in this test in combination with a laser operating system. The laser beam emitted from the Nd: VAN laser (7) was condensed using a microscope objective lens (12) facing the outer wall (4) and introduced into the chamber (1a). The beam diameter was adjusted by inserting a beam expander (8) in the laser optical path, and the laser focal point and the observation surface were matched in the same objective lens.
また、流路(2)を流れる微粒子の挙動を観察し、該微粒子の蛍光像を撮影するために、他の対物レンズ2(20)およびカラーCCDカメラ2(21)を、水平方向に設置した。当該CCDカメラ2(21)によって、流路(2)から進行方向を変えてチャンバー(1a)に導入される微粒子の映像を撮影することができる。また、回収したチャンバー内の微粒子を下方向から撮影できるように、CCDカメラ1(19)を配置した。 In addition, in order to observe the behavior of the fine particles flowing through the flow path (2) and take a fluorescent image of the fine particles, another objective lens 2 (20) and a color CCD camera 2 (21) were installed in the horizontal direction. . With the CCD camera 2 (21), it is possible to take an image of the fine particles introduced into the chamber (1a) while changing the traveling direction from the flow path (2). In addition, a CCD camera 1 (19) was arranged so that the collected fine particles in the chamber could be photographed from below.
この試験では直径2μmの蛍光ラテックスビーズ(Polysciences, Inc.)を光圧に応答する微粒子として用いた。該微粒子を超純水に1×105個/mlとなる濃度で懸濁させた液をサンプル液として利用した。該サンプル液は、シリンジポンプ(シリンジフィーダー)を利用して(a)を通じて流路入口(5)より流路(2)内に導入した。流路(2)内を流れるサンプル液の速度は、192μm/秒とした。流路(2)を通過したサンプル液は、流路出口(6)から(b)に回収した。 In this test, fluorescent latex beads having a diameter of 2 μm (Polysciences, Inc.) were used as microparticles that responded to light pressure. A liquid in which the fine particles were suspended in ultrapure water at a concentration of 1 × 10 5 particles / ml was used as a sample liquid. The sample solution was introduced into the channel (2) from the channel inlet (5) through (a) using a syringe pump (syringe feeder). The speed of the sample liquid flowing in the channel (2) was 192 μm / second. The sample liquid that passed through the channel (2) was collected from the channel outlet (6) to (b).
レーザービーム(3b)は、2つのチャンバー(1a、1b)の内の一つ(1a)に集光させた。このチャンバー(1a)を微粒子回収用チャンバーとし、他の一つ(1b)を負のコントロール用チャンバーとした。 The laser beam (3b) was focused on one (1a) of the two chambers (1a, 1b). This chamber (1a) was used as a particulate collection chamber, and the other (1b) was used as a negative control chamber.
(2) 結果
ある特定の蛍光ラテックスビーズAにスポットをあて、流路中での動きを追った図を図4に示す。図4中、黒矢印(上方向を示す)は、レーザービーム照射光の位置および照射方向を示し、白矢印はビーズAの位置および運動方向を示す。この図から、流路内を液流にのって流れてきたビーズA(図4の(a)参照、これをt=0とする。)は、レーザービーム照射領域にくると(図4の(b)参照、t=0.13)、運動方向がビームの進行方向に偏向し(図4の(c)参照、t=0.17)、回収部のチャンバー内に入ることがわかる(図4の(d)参照、t=0.21)。即ち、流路を流れる2μmの蛍光ビーズは、Nd:VANレーザービーム(1600mW)の照射領域に入ると、流体力学的な力および重力による流れに逆らって、光圧によってビームの光軸に沿って偏向してビーム照射の集束方向に移動して、チャンバーに回収される。
(2) Results FIG. 4 shows a diagram in which a spot is spotted on a specific fluorescent latex bead A and the movement in the channel is followed. In FIG. 4, black arrows (showing the upward direction) indicate the position and irradiation direction of the laser beam irradiation light, and white arrows indicate the position and movement direction of the beads A. From this figure, the bead A (see (a) of FIG. 4, which is assumed to be t = 0) flowing in the liquid flow in the flow path comes to the laser beam irradiation region (see FIG. 4). (b), t = 0.13), the direction of motion is deflected in the beam traveling direction (see (c) in FIG. 4, t = 0.17), and it can be seen that it enters the chamber of the recovery unit ((d in FIG. 4). ), T = 0.21). That is, when a 2 μm fluorescent bead flowing through the flow path enters the irradiation region of the Nd: VAN laser beam (1600 mW), it opposes the flow due to hydrodynamic force and gravity, and along the optical axis of the beam by light pressure. It deflects and moves in the focusing direction of beam irradiation and is collected in the chamber.
この方法では、レーザービームを当てるか否かによって特定の標的微粒子を選別して個々のチャンバーに回収することができる。 In this method, specific target fine particles can be selected and collected in individual chambers depending on whether or not a laser beam is applied.
本方法における光学的回収能を確認するために、流路内を通過する蛍光ラテックスビーズが経時的にチャンバー内に回収蓄積(濃縮)できるか否かを調べた。即ち、レーザービームの照射を連続的に行って、チャンバー(1a)(35μm×35μm×25μm)内の蛍光強度を経時的に測定した。得られた結果を図5に示す。 In order to confirm the optical recovery ability in this method, it was examined whether or not the fluorescent latex beads passing through the flow channel could be recovered and accumulated (concentrated) in the chamber over time. That is, laser beam irradiation was continuously performed, and the fluorescence intensity in the chamber (1a) (35 μm × 35 μm × 25 μm) was measured over time. The obtained results are shown in FIG.
なお、蛍光強度は、ビデオテープに記録した画像をコンピュータに取り込んだ後、画像解析ソフト(NIH image: http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)を用いて、チャンバー内領域のビデオフレーム毎(30フレーム/秒)の蛍光強度を解析することにより求めた。その値は相対値(図5におけるa.u.はarbitrary unitの略である)を示す。 The fluorescence intensity is measured in the chamber area using the image analysis software (NIH image: http://rsb.info.nih.gov/nih-image/) after the image recorded on the video tape is taken into the computer. The fluorescence intensity was analyzed for each video frame (30 frames / second). The value indicates a relative value (a.u. in FIG. 5 is an abbreviation for arbitrary unit).
図5は、横軸に経過時間(秒)(レーザービームの照射時間)および縦軸に上記蛍光強度(単位：a.u.)をとり、チャンバー(1a)内の蛍光強度の推移を経時的に記載したグラフである。 In FIG. 5, the elapsed time (seconds) (laser beam irradiation time) is plotted on the horizontal axis and the fluorescence intensity (unit: au) is plotted on the vertical axis, and the transition of the fluorescence intensity in the chamber (1a) is described over time. It is a graph.
図5に示される結果から明らかなように、チャンバー(1a)内の蛍光強度は、90秒間に亘って、時間に比例して増加することがわかる。このことから、レーザービームを連続的に照射することによって、流路を通過する標的微粒子の流れを光圧によってチャンバー方向に偏向させて、当該チャンバー内に標的微粒子を回収蓄積(濃縮)できることがわかる。 As is apparent from the results shown in FIG. 5, it can be seen that the fluorescence intensity in the chamber (1a) increases in proportion to the time over 90 seconds. From this, it can be seen that by continuously irradiating the laser beam, the flow of the target fine particles passing through the flow path can be deflected toward the chamber by the light pressure, and the target fine particles can be collected and accumulated (concentrated) in the chamber. .
90秒後のCCDカメラによる撮影結果は図6に示されるとおりである。図6中、(a)は回収チャンバー(1a)を、(b)は回収チャンバー(1b)を示す。「白矢印 flow」は、流路内での、蛍光ラテックスビーズを含む液体(サンプル液)の流れ方向を示し、黒矢印はレーザービームの照射方向を示す。 Fig. 6 shows the result of taking a picture with a CCD camera after 90 seconds. In FIG. 6, (a) shows the collection chamber (1a) and (b) shows the collection chamber (1b). “White arrow flow” indicates the flow direction of the liquid (sample liquid) containing the fluorescent latex beads in the flow path, and the black arrow indicates the irradiation direction of the laser beam.
図6に示されるように、チャンバー(1a)は、その容積の約1/3まで蛍光ビーズで満たされた。これに対して、レーザービームの光圧が作用しない負のコントロールチャンバー(チャンバー(1b))では、蛍光は観察されず、ラテックスビーズは回収されていないことが確認された。この結果は、一連の回収および濃縮が、微粒子が光圧(レーザービーム照射による)を受けることによる偏向および移動に基づいて生じていることを裏付けるものである。 As shown in FIG. 6, chamber (1a) was filled with fluorescent beads to about 1/3 of its volume. In contrast, in the negative control chamber (chamber (1b)) where the light pressure of the laser beam does not act, fluorescence was not observed, and it was confirmed that latex beads were not collected. This result confirms that a series of recovery and concentration occurs based on the deflection and movement of the microparticles due to the light pressure (due to laser beam irradiation).
本発明は細胞などの微粒子の回収方法および回収装置並びにこれらを利用したフローサイトメトリーおよびセルソーターを提供する。 The present invention provides a method and apparatus for collecting fine particles such as cells, and a flow cytometry and cell sorter using them.
本発明の回収方法および装置は、例えば、細胞のクローニング、増殖・分化因子受容体遺伝子のクローニングなどの支援技術として有用である。また、細胞の諸機能の解析、細胞膜分子、染色体DNA分子などの細胞動態の解析にも有用である。更に、細胞工学分野に限らず、例えば臨床分野などにおいても有効に利用できる。 The recovery method and apparatus of the present invention are useful as an assisting technique for, for example, cell cloning and growth / differentiation factor receptor gene cloning. It is also useful for analyzing cell functions such as cell functions, cell membrane molecules, and chromosomal DNA molecules. Furthermore, it can be effectively used not only in the field of cell engineering but also in the clinical field, for example.
(1) 微粒子回収部
(1a),(1b) 微粒子回収部に設けられたチャンバー
(2) 流路
(3) レーザービーム照射部
(3a) レーザービーム照射口
(3b) レーザービーム
(1) Particulate collection unit
(1a), (1b) Chamber provided in the particulate collection section
(2) Flow path
(3) Laser beam irradiation part
(3a) Laser beam irradiation port
(3b) Laser beam
Claims (9)
上記回収部が、流路側に開口を向けて配置された少なくとも２つのチャンバーを備え、
上記レーザービーム照射部が1つの照射口を備え、
上記回収部のチャンバーの1つの開口とレーザービーム照射部の照射口とが、流路を隔てて、対向して設けられており、
当該レーザービーム照射口から、レーザービームを、上記流路に交差させて、上記回収部のチャンバーの開口に向けて、当該開口より遠方に収束するように照射し、
レーザービームの光圧によって流路内の光圧に応答する微粒子の流れ方向を偏向させて、レーザービーム照射部の照射口の位置は固定したままで回収部またはそのチャンバー位置を移動させることによって、上記光圧に応答する微粒子を回収部のチャンバー内に回収するものである、微粒子回収装置を用いて、
光圧に応答する微粒子および光圧に応答しない成分を含有する気体または液体の流路内の、光圧に応答する標的微粒子に対して、当該気体または液体の流れ方向に交差させてレーザービームを照射することによって、上記流路内の、当該標的微粒子の運動方向のみを選択的にレーザービームの収束方向に偏向させて、レーザービーム照射部の照射口に対向する回収部のチャンバー内に、当該微粒子を、他の微粒子および光圧に応答しない成分と分別して回収することを特徴とする、標的微粒子の分別回収方法。 Contains a collection unit for collecting fine particles that respond to light pressure, a laser beam irradiation unit, and a fine particle that responds to light pressure and a component that does not respond to light pressure between the collection unit and the laser beam irradiation unit. A particulate collection device having a flow path for flowing gas or liquid,
The recovery unit includes at least two chambers arranged with an opening facing the flow path side,
The laser beam irradiation unit has one irradiation port,
One opening of the chamber of the recovery unit and the irradiation port of the laser beam irradiation unit are provided to face each other across the flow path,
From the laser beam irradiation port, irradiate the laser beam so as to converge farther from the opening, crossing the flow path, toward the opening of the chamber of the recovery unit,
By deflecting the flow direction of the microparticles responding to the light pressure in the flow path by the light pressure of the laser beam, the position of the irradiation port of the laser beam irradiation part is fixed, and the collection part or its chamber position is moved, Using a particulate collection device that collects particulates that respond to the light pressure in the chamber of the collection unit,
The target particle that responds to the light pressure in the gas or liquid flow path containing the particle that responds to the light pressure and the component that does not respond to the light pressure is crossed in the flow direction of the gas or liquid. by irradiation, the flow path, only the direction of movement of the target particles to be selectively deflected in the converging direction of the laser beam, into the chamber of the collecting portion facing the irradiation port of the laser beam irradiation unit, the A method for separating and collecting target fine particles, wherein the fine particles are collected separately from other fine particles and components that do not respond to light pressure.
上記回収部が、流路側に開口を向けて配置された少なくとも２つのチャンバーを備え、
上記レーザービーム照射部が1つの照射口を備え、
上記回収部のチャンバーの1つの開口とレーザービーム照射部の照射口とが、流路を隔てて、対向して設けられており、
当該レーザービーム照射口から、レーザービームを、上記流路に交差させて、上記回収部のチャンバーの開口に向けて、当該開口より遠方に収束するように照射し、
レーザービームの光圧によって流路内の光圧に応答する微粒子の流れ方向を偏向させて、レーザービーム照射部の照射口の位置は固定したままで回収部またはそのチャンバー位置を移動させることによって、上記光圧に応答する微粒子を回収部のチャンバー内に回収するものである、微粒子回収装置。 Contains a collection unit for collecting fine particles that respond to light pressure, a laser beam irradiation unit, and a fine particle that responds to light pressure and a component that does not respond to light pressure between the collection unit and the laser beam irradiation unit. A particulate collection device having a flow path for flowing gas or liquid,
The recovery unit includes at least two chambers arranged with an opening facing the flow path side,
The laser beam irradiation unit has one irradiation port,
One opening of the chamber of the recovery unit and the irradiation port of the laser beam irradiation unit are provided to face each other across the flow path,
From the laser beam irradiation port, irradiate the laser beam so as to converge farther from the opening, crossing the flow path, toward the opening of the chamber of the recovery unit,
By deflecting the flow direction of the microparticles responding to the light pressure in the flow path by the light pressure of the laser beam, the position of the irradiation port of the laser beam irradiation part is fixed, and the collection part or its chamber position is moved, it is intended to recover the fine particles to respond to the chamber of the recovery unit to the light pressure, particle recovery device.
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