JP4511980B2 - T−rflp法による硝化活性能力の測定方法 - Google Patents
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Description
方法が開示されている。また特許文献2では、硝化活性の測定値が所定値以上を維持するように、硝化工程への汚泥返送量を制御している。
生物的な硝化反応系内のバクテリアから抽出されたDNAのPCR(Polymerase Chain Reaction)産物を制限酵素で切断し、T−RFLP(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisms)法により解析し、硝化活性能力を測定する方法であって、
制限酵素としてHhaIを使用して得られるフラグメントサイズが28〜37baseのバクテリアの検出状況と、検出される全フラグメントの輝度の合計に対する目的フラグメントの輝度の割合で示される相対輝度により測定することを特徴とするT−RFLP法による硝化活性能力の測定方法。
生物的な硝化反応系が、少なくとも腐植土を使用した含窒素排液の生物的な汚水処理系であることを特徴とする請求項1記載のT−RFLP法による硝化活性能力の測定方法。
始めに、分子生物学的微生物群集解析手法として、T-RFLP法を採用するに際しての問題点を整理し、再現性及び普遍性のある手法にする上での予備的な検討、実験について説明する。
(Biochim. Biophys Acta. 1972 Dec 22;287(3);477-84 Estimation of the double-helical content in various single-stranded nucleic acids by treatment with a single strand-specific nuclease)がある。従って、この値を基に推定DNA量を算出する。
Terminal Restriction fragment length polymorphism(T-RFLP):an emerging method for characterizing diversity among homologous populations of amplification products Marsh著Techniques ,No.2,323-327,1999を参照できる。
Terminal Restriction Pattern Analysis of 16S rRNA Genes for the Characterization of Bacterial Communities of Activated 平石ら著 Sludges J.of Bioscience and Bioengineering , vol.90,No.2,148-156,2000を参照できる。
(1)DNAの抽出:抽出率は10%の抽出率を確保できる手法とし、PCR産物量に関しては、PCR産物の得られるDNAの抽出方法に従い、従来の抽出方法との比較において、T-RFLPフラグメント数とバリエーションが同等であることを確認する。
(2)PCR回数
(3)DAPIサンプルの分散方法
(4)T-RFLP:安定した分析条件検討及びラダーの作成を行う。
<DNA抽出に関する検討>
数種の菌株を入手し、その培養液からDNA抽出率について検討した。実際には、培養菌体の乾燥重量からDNA量を推測し、回収されたDNA量から抽出効率を求め10%を確保していれば十分抽出されているとみなすこととした。特に、DNA抽出の省力化を期待して、QIAGEN社のDneasy Tissue Kit を使用し、従来の抽出方法によるDNAを使用してのT-RFLPの結果と比較を行い、有効性を検討した。
購入菌株は汚泥から単離されたと報告のある菌株を中心に、微生物分類学での分類を考慮して選択し、JCM(理化学研究所)のコレクションより分譲したものを使用した。ただし、Bacillus菌株についてはSIGMAより販売されているものを使用した。(表1参照)
各菌株は指定の培地で調整したスラントにて培養後、一晩、指定の培地および温度で振とう培養し、遠心分離を行って菌体を回収し、滅菌水で洗浄して培地成分を除去後、DNA抽出に供した。
QIAGEN DNeasy Tissue Kit での検討では付属のプロトコールに従った。このプロトコールはグラム陰性菌と陽性菌では若干内容が異なる。そこで、全ての検討菌株について両方の手法で検討を行い抽出し、DNA回収率、回収したDNAによるPCRの可否等を検討した。
次に、T-RFLPを行ってフラグメント数の比較を行った。その結果を図2に示す。
従来法では抽出に供するサンプル量が固形分の湿重量で1gであるのに対し、キットを使用した場合は槽内水を含む0.3mlであることから、少ないサンプル量で全体を反映したデータを取得できるかという懸念があったが、本検討において、少ないサンプル量でも変わらないデータが取得できるものと判断した。
PCRを行うにあたって考慮しなければならない問題としてPCR回数がある。これは、ある回数以上PCRを行ってもPCR産物量は増えず、横ばいとなるためである。そこで、PCR回数を何回行ったPCR産物を使用するか、検討を行った。
キアゲンTaq Maste rMix Kit 50μl
4pM 27F 10μl
4pM 907R 10μl
4.5ng 分析するサンプル由来の鋳型DNA 4μl
DW 26μl
Total 100μl
4.5ng/μl DNA 4μl 95℃ 1分
4pmol/μl各プライマー7.5μl 47℃ 1分
PCR MIX kit 25μl 72℃ 1.5分
MiliQ 6μl 25回
長期間にわたって比較可能な分析結果を得るために、鋭意検討した結果、分析は以下の条件で行うこととした。
次に、本発明の測定方法について説明する。
(処理系)
実験系列は以下のように構成し、試験用サンプル汚泥は硝化槽から所定量採取した。
上記サンプル汚泥から単離した各菌株は指定の培地で調整したスラントにて培養後、一晩、指定の培地および温度で振とう培養し、遠心分離を行って菌体を回収し、滅菌水で洗浄して培地成分を除去後、DNA抽出に供した。
DNAの抽出はQIAGEN DNeasy Tissue Kitの陰性菌メソッドで行った。
キアゲンTaq Maste rMix Kit 50μl
4pM 27F 10μl
4pM 907R 10μl
4.5ng 分析するサンプル由来の鋳型DNA 4μl
DW 26μl
Total 100μl
4.5ng/μl DNA 4μl 95℃ 1分
4pmol/μl各プライマー7.5μl 47℃ 1分
PCR MIX kit 25μl 72℃ 1.5分
MiliQ 6μl 25回
最初にPCR産物はQIAGEN Purification Kit を用いて、PCRプライマーを除いた。次いで、PCR産物濃度を分光光度計(日立製作所製 Gene Spec III)で濃度を測定した。その測定濃度より、分析に供するPCR産物量が150ng/tubeになるようにサンプルを使用する。
実験系列(A系列)と対照系列(B系列)における、T-RFLPフラグメントサイズ33base付近のピーク面積比(%)をRun開始後、0日、33日、54日、62日後の各々について求め、さらにそれらに対応する最大硝化速度(at20℃)を求めた。
実験系列と対照系列に両方において、処理水中のアンモニア濃度を分析して調べ、それに対応するT-RFLPフラグメントサイズ33base付近検出状況と相対輝度(%)によって調べた。相対輝度(%)は検出される全フラグメントの輝度の合計に対する目的フラグメントの輝度の割合を日立電子エンジニアリングのフラグメント解析ソフト「FRAGRIS」で測定した。
サンプル中のバクテリアについて、予想されるフラグメントサイズを調べた結果を表
に示す。表5に示すように、フラグメントサイズ28はNitrosomonasのようなAOB(アンモニア酸化菌)であり、フラグメントサイズ37はNitrospira のようなNOB(亜硝酸酸化細菌)である。
PCRを行ってPCR産物の増え方をモニタリングして鋳型となったもともとのDNA量を推定する手法を採用してリアルタイム定量PCRを行った。
図10に示すアンモニア酸化系において、機能遺伝子として、アンモニア酸化細菌の機能遺伝子であるamoAと、亜硝酸酸化機能遺伝子であるNitorospira16Sの定量を行った。
図11(A)は汚泥ml当りのamoAのコピー数であり、図11(B)は汚泥VSS当りのamoAのコピー数である。図中のAは実験系列を示し、Bは対象系列を示す。
(A)は汚泥ml当りのNitorospira属(亜硝酸酸化細菌)16Sのコピー数であり、図12(B)は汚泥VSS当りのNitorospira属(亜硝酸酸化細菌)16Sのコピー数である。図中のAは実験系列を示し、Bは対象系列を示す。
10:無酸素槽
11:硝化槽
2:沈降槽
20:返送汚泥管
3:安定好気槽
4:接触槽
40:腐植土ペレット
41:導入管
42:返送管
Claims (2)
- 生物的な硝化反応系内のバクテリアから抽出されたDNAのPCR(Polymerase Chain Reaction)産物を制限酵素で切断し、T−RFLP(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisms)法により解析し、硝化活性能力を測定する方法であって、
制限酵素としてHhaIを使用して得られるフラグメントサイズが28〜37baseのバクテリアの検出状況と、検出される全フラグメントの輝度の合計に対する目的フラグメントの輝度の割合で示される相対輝度により測定することを特徴とするT−RFLP法による硝化活性能力の測定方法。 - 生物的な硝化反応系が、少なくとも腐植土を使用した含窒素排液の生物的な汚水処理系であることを特徴とする請求項1記載のT−RFLP法による硝化活性能力の測定方法。
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JP2001149094A (ja) * | 1999-11-26 | 2001-06-05 | Nissin Electric Co Ltd | 硝化細菌活性度の検査方法およびそれを用いた水処理方法 |
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