JP4511365B2

JP4511365B2 - イノシトール化リン脂質

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Publication number: JP4511365B2
Application number: JP2004552671A
Authority: JP
Inventors: ダンカー，カースティン; ミッケレイト，ミハエル; ミュラー，ディエター; リュッター，ワーナー
Original assignee: シャーライト−ユニバーシターツメディジンベルリン
Priority date: 2002-11-20
Filing date: 2003-11-20
Publication date: 2010-07-28
Anticipated expiration: 2023-11-20
Also published as: ES2275127T3; DE60309345T2; US20060105996A1; EP1562609A1; EP1562609B1; EP1421941A1; WO2004045623A1; JP2006514625A; ATE343389T1; AU2003285337A1; DE60309345D1; US7465817B2; CA2506084A1

Description

本発明は、グリセロール主鎖のｓｎ−１又はｓｎ−２位に結合した置換された又は置換されていないポリヒドロキシル化脂肪族炭素環(polyhydroxylated aliphatic carbocycle)を有するリン脂質誘導体、前記リン脂質を含有する医薬組成物、前記リン脂質の製造方法及び前記リン脂質を含有する医薬に関する。

抗癌治療に現在用いられている細胞増殖抑制剤の大部分は、ＤＮＡに直接結合し（例えば、シスプラチン又はエピルビシン）又は細胞骨格を標的とし（例えば、ビンブラスチン）又は有糸分裂の紡錘体装置(spindle apparatus)を標的とする（例えば、タキソール）ことによって、細胞の周期進行を直接に阻害する。数年間で、リン脂質も細胞増殖及び細胞内シグナル伝達に関与していることが充分に立証された（Cullis,P.R.ら、Phospholipids and cellular regulation, I.Boca Raton(編),CRC Press,1-59(1985);Nishizuka,Y.,Science 258:607-614(1992)）。これらの過程を妨害しそして増殖阻害剤として作用する高い代謝安定性のリン脂質アナログが合成されてきた。これらの阻害剤は、前立腺癌、膀胱の尿路上皮性癌、副腎様の癌(hypernephroid carcinoma)及び奇形癌（Berdel,W.E.ら,J.Natl.Cancer Inst.66:813-817(1981);Berdel,W.E.ら,J.Cancer Res.43:5538-5543(1983);Herrmann,D.B.J.,Neumann,H.A.,Lipids 22:955-957(1987)）、種々のヒト及びネズミの白血病、ヒトの脳腫瘍、ヒトの肺癌（Berdel,W.E.ら,Cancer Res.43:541-545(1983);Scholar,E.M.Cancer Lett.33:199-204(1986)）、及び線維肉腫（Houlihan,W.J.ら,Lipids 22:884-890(1987)）を含む、多種多様の細胞に作用する。これらのリン脂質アナログの正確な作用機構は、なお依然として不明である。しかしながら、主として、前記化合物は、該化合物が蓄積しそして多種多様の鍵となる酵素を妨害する場所となる細胞膜中に吸収され、その大部分は膜に存在し、脂質代謝及び／又は細胞シグナル伝達機構に関与している（Arthur,G.,Bittman,R. Biochim.Biophys.Acta 1390:85-102(1998)）。

多くのリン脂質アナログは、その抗増殖(antiproliferative)効果の他に、細胞培養試験においてその溶解(lytic)特性によって示される如く、潜在的に有毒でもあり（Wieder,T.ら,J.Biol.Chem.273:11025-11031(1998);Wiese,A.ら, Biol.Chem.381:135-144(2000)）、従って、高い抗増殖能を有するが細胞毒性副作用が低いリン脂質アナログを合成するべき努力がなされてきた。

抗増殖剤としてのリン脂質アナログの開発は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ；図１）が宿主の防御機構における役割を担っているという観察から生まれた（Burdzky,K.ら,Z.Naturforsch.19b:1118-1120(1964)）。最も普通に用いられるリン脂質アナログは、リゾホスファチジルコリン及びリゾプレートレット(lysoplatelet)活性化因子（ｌｙｓｏ−ＰＡＦ）の誘導体である。エデルフォシン、１−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−メチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＥＴ−１８−ＯＣＨ３；図１）は、特異的に、腫瘍細胞の増殖、腫瘍細胞浸潤、及び転移を阻害しそしてマクロファージの殺腫瘍能を高めるＰＡＦ誘導化合物である（Houlihan,W.J.ら,Med.Res.Rev.15:157-223(1995)）。構造的に類似した長鎖のグリセロール不含のリン酸ベース(phosphobase)剤、例えば、治療可能性を有する唯一の化合物である、ヘキサデシル−ホスホコリン（ＨｅＰＣ；図１）もある。ＨｅＰＣは、現在、乳癌患者の皮膚転移（Unger,C.ら,Progr.Exp.Tumor Res.34:153-159(1992);Clive,S.,Leonard,R.C.F.,Lancet 349:621-622(1997)）及び内臓リーシュマニア症（Jha,T.K.ら,N.Engl.J.Med.341:1795-1800(1999)）の局所治療に用いられている。ネガティブな副作用、例えば、高い細胞毒性の理由から、細胞毒性が少ないリン脂質アナログを合成するべき努力がなされてきた。

その結果、新たな戦略が、グリセロール主鎖中に糖又は糖アルコールを導入することにより引き継がれた。ｓｎ−２位へのグルコースの導入は、グリセログルコホスホコリン（Ｇｌｃ−ＰＣ）並びに１−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−α−Ｄ−グルコ−ピラノシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｇｌｃ−ＰＡＦ；図１）を生じた（Mickeleit,M.ら,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.34:2667-2669(1995);Mickeleit,M.ら,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.37,351-353(1998)）。両化合物は水溶性でありそしてさらに以下で記載するように無毒性濃度で増殖阻害特性を示す。

他のグループによって、糖含有リン脂質アナログの使用も述べられてきた。ｓｎ−３ホスホコリン残基を異なる単糖類によって置換することにより、グリコシド化(glycosidated)されていないホスホコリン含有化合物と比較して、より効力のあるアナログが生じる（Marino-Albernas,J.R.ら,J.Med.Chem.39:3241-3247(1996);Samadder,P.,Arthur,G.Cancer Res.59:4808-4815(1998)）。

一方で、ホスフェート基でエステル化されたイノシトールを有する、ホスファチジルイノシトールの代謝は、細胞内メッセンジャー、例えば、イノシトール−１，４，５−トリホスフェートを遊離させることが周知である（Lehninger,A.L.ら,Prinzipien der Biochemie,Tschesche,H.(編),第２版,Spektrum Akademischer Verlag,298(1994)）。従って、ホスファチジルイノシトールは、細胞内シグナル伝達に関与している。イノシトール含有リン脂質は、正確な構造の情報がなくそして前後関係において(in contexts)本明細書に記載のものとは異なっているが、ＷＯ０１／８２９２１Ａ２、ＷＯ０２／０４９５９及び特開２００２０１０７９６Ａからも公知である。

しかしながら、前記のものより効果的でしかも同時に前記のいずれの欠点をも有さないリン脂質を発見することが、依然として望ましいままであった。

意外にも、本発明の発明者らは、イノシトール−ＰＡＦ（Ｉｎｏ−ＰＡＦ）を生じる、糖アルコールイノシトールの導入が、グルコース含有アナログよりはるかに強力に細胞の増殖に影響を与えることを見出した。従って、本発明は、脂肪酸分子の代わりに糖アルコールがホスファチジルコリン分子中に組み込まれた新規な種類のグリセロリン脂質を提供する。

前記グリセロリン脂質は、増殖及び他の生理学的過程への顕著な効果を示す。とりわけ、本発明は、
グリセロール主鎖のｓｎ−１位又はｓｎ−２位に結合した置換された又は置換されていないポリヒドロキシル化脂肪族炭素環を有するリン脂質；
前記（１）に定義したリン脂質を含有する医薬組成物；
前記（１）に定義したリン脂質の製造方法であって、グリセロール前駆体化合物を、活性化された置換された又は置換されていないポリヒドロキシル化脂肪族炭素環化合物の前駆体化合物と反応させる（それによって前記炭素環化合物を直接に又はリンカー分子を介してグリセロール主鎖の酸素原子に結合させる）ことを特徴とする製造方法；
前記（１）に定義したリン脂質の用途であって、前立腺癌、膀胱の尿路上皮性癌、副腎様の癌、奇形癌、ヒト及びネズミの白血病、脳腫瘍、肺癌、線維肉腫、及び皮膚の過剰増殖疾病(hyperproliferative disease)の治療用医薬の製造のための使用；及び
前記（１）に定義したリン脂質を患者に投与することを特徴とする、前立腺癌、膀胱の尿路上皮性癌、副腎様の癌、奇形癌、ヒト及びネズミの白血病、脳腫瘍、肺癌、線維肉腫、及び皮膚の過剰増殖疾病の治療方法
を提供する。

ＤＮＡ合成を妨げず、又は細胞骨格に影響を及ぼさないが、他の標的に作用して、例えば、原形質膜の構造及び機能をリモデリングすることに導く特異的な抗癌剤に対する調査は、有望な将来性のある研究分野であると考えられる。既に確立された抗腫瘍リン脂質アナログに加え、新規な種類の合成リン脂質である、リゾホスファチジルコリンの糖アルコール含有アナログ、例えば、Ｉｎｏ−ＰＡＦを記載してきた。これらの型の化合物は細胞増殖を阻害しそしてインビトロで細胞マトリックス接着を活性化することが示された。

前記化合物の正確な作用機構はわかっていないが、前記化合物が、通常のリン脂質アナログによって影響を受ける以外の他のシグナル伝達経路に作用することは明らかと思われる。従って、これらの化合物は、他の公知の細胞増殖抑制薬剤と一緒に用いて薬剤耐性を相殺する(counteract)こともできる。

本発明のリン脂質の範囲内で、グリセロール主鎖の３個のＯＨ基を、連続する順序で、化学の分野で広く認められる表示名ｓｎ−１、ｓｎ−２及びｓｎ−３として示す。本発明の意味の範囲内で用語「リン脂質」は、当業界で一般的に認められるようにさらに置換されそして両親媒性を有する、ｓｎ−３位でリン酸化されたグリセロール主鎖からなる化合物をいう。

好ましい態様において、本発明のリン脂質は、下記式（Ｉ）：
（上記式中、
（ｉ）Ａは、独立して、場合により置換されているＣ_１−６アルキル基であるか、又は、２つのＡ残基が、場合により置換されている５〜７員環を形成していることがあり、
（ii）Ｒ及びＲ’の一方は、直接に又はリンカー分子を介してグリセロール主鎖の酸素原子に連結されているポリヒドロキシル化脂肪族炭素環又はその誘導体を含む第一の残基であり、そして前記の他方は、場合により不飽和の及び／又は場合により置換されているＣ_１−２０アルキル基、場合により不飽和の及び／又は場合により置換されているＣ_２−２６アシル基及び水素原子から選ばれる第二の残基であり、そして
（iii）ｎは、１〜５の範囲の整数である）
を有する。

用語「アルキル」又は「アルキル基」は、アルカンＣ_ｎの残基の任意の直鎖状又は分枝状の構造異性体を示し、ここで整数であるｎはアルキル鎖の炭素原子の数、すなわち、ＣＨ基、ＣＨ_２基及びＣＨ_３基の数を示す。用語「場合により不飽和のアルキル」又は「アルケン」は、モノ、ジ−、トリ−又はポリ不飽和アルケンを示す。

従って、本発明の範囲内で用語「場合により不飽和の及び／又は場合により置換されているＣ_１−２０アルキル」は、低級、例えば、Ｃ_１−６アルキル基、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｎｅｏ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基など及びさらに脂肪酸誘導（例えば、Ｃ_{１４−２０}）アルキル基及びアルケニル基、例えば、ミリスチル基、パルミチル基、ステアリル基、アラキジル(arachidyl)基、オレイル基、リナイル(linayl)基、リノレニル(linolenyl)基、アラキドンイル(arachidonly)基などを含む。

用語「アシル」は、カルボキシレート残基、すなわち、アルカン又はアルケンカルボン酸残基の任意の直鎖状又は分枝状構造異性体を示す。本発明に係るアルカンカルボン酸残基の中で、ラウロイル（ｎ−ドデカノイル）、ミリストイル（ｎ−テトラデカノイル）、パルミトイル（ｎ−ヘキサデカノイル）、ステアロイル（ｎ−オクタデカノイル）、アラキドイル（ｎ−エイコサノイル）及びリグノセロイル（ｎ−テトラコサノイル）(lignoceroyl(n-tetracosanoyl))が好ましい。本発明に係るアルケンカルボン酸残基の中で、パルミトレイノイル(palmitoleinoyl)、オレオイル(oleoyl)、リノロイル(linoloyl)、リノレノイル(linolenoyl)及びアラキドノイル（５，８，１１，１４−エイコサテトラエノイル）(arachidonoyl(5,8,11,14-eicosatetraenoyl))が好ましい。

Ａの定義の範囲内でＣ_１−６アルキル基は、前記のものを含む。５〜７員環は、窒素原子の他に、さらにヘテロ原子、例えば、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子を含むことができる。Ａの定義の範囲内で特に好ましい環は、ピロリジニル、ピペラジニル、モルホリニルなどである。

Ａ、Ｒ及びＲ’の定義の範囲内で基の任意の置換基は、ヒドロキシル基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、オキソ基、Ｃ_１−６アルコキシ基、カルボキシ基を含むが、これに限定されない。ポリヒドロキシル化脂肪族炭素環の置換基は、ヒドロキシ官能基のエステル、アセテート及びテル(ther)及び炭素環のＣ原子におけるオキソ及びハロゲン置換基を含む。

前記式（Ｉ）で表される化合物において、式中のＡがＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、Ｃ_３Ｈ_７及びＣＨ（ＣＨ_３）_２から選ばれ、好ましくは、ＡがＣＨ_３である化合物がとりわけ好ましい。式中のＲが第一の残基であり、すなわち、ポリヒドロキシル化脂肪族炭素環がｓｎ−２位に位置しており及び／又は第二の残基がＣ_{１０−２０}アルキル基、好ましくは、Ｃ_１６又はＣ_１８アルキル基である化合物がさらに好ましい。第一の残基が下記式：
（上記式中、Ｅは、Ｈ原子、Ｃ_１−４アルキル基、Ｃ_２−４アシル基、炭水化物基(carbohydrate moiety)などから選ばれ、好ましくは、ＥはＨ原子である）
の一つを有する化合物がなおさらに好ましい。
最後に、ｎ＝１である化合物が好ましい。

ポリヒドロキシル化脂肪族炭素環をグリセロール主鎖と連結するリンカー（以下で、しばしば「Ｌ」と呼ぶ）は、安定な結合を可能にするいずれかの官能構造(functional structure)である。適切なリンカーは、（ポリ）エーテル、（ポリ）ペプチド、グリコシド、（ポリ）エステル、アルキル又はアルケニルスペーサーなどであり、（ポリ）エーテルが最も好ましい。

より好ましい態様において、リン脂質は式（III）で表される残基である。式（III）で表される残基は、シス(cis)−イノシトール、エピ(epi)−イノシトール、アロ(allo)−イノシトール、ネオ(neo)−イノシトール、ミオ(myo)−イノシトール、ムコ(muco)−イノシトール、チロ(chiro)−イノシトール又はシロ(scyllo)−イノシトールを含み、そして好ましくは、ミオ−イノシトールである。本発明のさらにより好ましい態様において、リン脂質は、下記式：
（上記式中、Ｄは、前記定義した第二の残基であり、そしてＥ、Ａ、Ｌ及びｎは前記定義の通りである）
で表される式（Ｖ）に相当する。最も好ましいのは、図１に示した化合物Ｉｎｏ−Ｐａｆ（又は、「Ｉｎｏ−Ｃ２−ＰＡＦ」と呼ぶことがある）である。

立体異性形成性(stereogenic)炭素原子を含む本発明のリン脂質はいずれも、対応するラセミ体、並びに、命名法についてのＣａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ法に従ってＲ型又はＳ型で定義される立体異性形成性炭素原子から生じる可能なすべての立体配置異性体を含む。とりわけ、リン脂質のグリセロール主鎖のｓｎ−２位の炭素原子の立体配置は、Ｒ又はＳであることができ、好ましくは、Ｒである。

炭素−炭素二重結合を含む本発明のリン脂質はいずれも、Ｅ／Ｚ異性から生じるすべての可能な立体配置異性体を含むことがさらに理解される。

本発明のリン脂質の製造方法は、好ましくは、下記式（Ｉ）：
（上記式中、ＯＲ又はＯＲ’の少なくとも一方は、脱離基又は−Ｏ⁻（又はそれぞれのＯ原子に結合した適切に誘導体化された(derivatized)リンカー基）を表し、そして他方の変数は前記定義の通りであるか、又はその保護された型である）
で表される前駆体化合物を、官能型の第一の残基と反応させることを特徴とする。特に好ましい化合物Ｉｎｏ−ＰＡＦは、下記反応工程式に従って合成することができる。

（ａ）Ｃ_１８Ｈ_３７Ｂｒ，ＮａＨ；（ｂ）ＡｃＯＨ；（ｃ）ＤＨＰ，ｐ−ＴｏｓＯＨ；（ｄ）臭化アリル，ＮａＨ；（ｅ）ｉ：Ｏ_３，ｉｉ：ＮａＢＨ_４；（ｆ）ｐ−ＴｏｌＳＯ_２Ｃｌ，ＮＥｔ_３，ＤＭＡＰ；（ｇ）ペンタ−ベンジルイノシトール［８］，ＫＨＭＤＳ，１８−Ｃｒ−６；（ｈ）ピリジニウムｐ−トルエンスルホネート；（ｉ）ｉ：ＰＯＣｌ_３，ＮＥｔ_３，ｉｉ：コリントシレート，ｉｉｉ：ＮａＨＣＯ_３，Ｈ_２Ｏ；（ｋ）Ｈ_２，Ｐｄ／Ｃ５％

Ｉｎｏ−ＰＡＦ〔７〕は、Ｄ−マンニトールから３段階で容易に得ることができる（Ｒ）−（−）−１，２−Ｏ−イソプロピリデングリセロール〔１〕から合成することができる。最初に、グリセロール〔１〕を、ステアリルブロミドによるエーテル化、それに続く酸性条件下でのイソプロピリデン基の開裂及び生じる第一級アルコール基のテトラヒドロピラノイルエーテルとしての保護によって、第二級アルコール〔２〕に変換する。Ｃ_２−リンカーフラグメントを導入するために、アルコール〔２〕を臭化アリルでエーテル化する。得られたアリルエーテルをオゾンで処理しそして引き続いてホウ水素化ナトリウムにより還元する。得られた第一級アルコールのｐ−トルエンスルホニルクロリドとの反応は、トシレート〔３〕を与える。このトシレート〔３〕は、６段階の手順（Gigg,R.,Warren,C.D.,Chem.Soc.(C):2367-2371(1969)）を経てミオ−イノシトールから予め合成した１，２，３，４，５−Ｏ，Ｏ，Ｏ，Ｏ，Ｏ−ペンタベンジル−ミオ−イノシトール〔８〕により置換する。得られたイノシトールエーテル〔４〕は、酸性条件下で脱保護して第一級アルコール〔５〕を得る。引き続くアルコール〔５〕と塩化ホスホリル及びコリントシレートとの反応は、ホスファチジルコリン〔６〕を生じる。〔６〕の最終的水素化は、目標化合物Ｉｎｏ−ＰＡＦ〔７〕を与える。

本発明の目的で、用語「Ｉｎｏ−ＰＡＦ」及び「Ｉｎｏ−Ｃ２−ＰＡＦ」は同義語として用い、すなわち、同じ化合物を表す。

本発明の意味の範囲内で「医薬組成物」及び「医薬」は、本発明に係るリン脂質１種類以上及び場合により、薬学的に許容することができる担体、希釈剤などを含む。前記薬学的に許容することができる担体の中に、脂質ナノサスペンション、リポソーム、生分解性微小粒子などがある。

グリコシド化リン脂質アナログにおけるグリコシド化の効果を、ヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ細胞）及び鱗状の癌腫細胞系（ＳＣＣ−２５）の無血清細胞培養において測定した。Ｇｌｃ−ＰＣ並びにＧｌｃ−ＰＡＦは、それぞれのＬＤ_５０未満の半抑制濃度（ＩＣ_５０）を用いて、マイクロモル(μmolar)の範囲でＨａＣａＴ細胞の細胞増殖を阻害することが示された（表１）。

細胞毒性及び抗増殖能の直接比較は、Ｇｌｃ−ＰＣがとりわけＬＤ_５０とそのＩＣ_５０との間で大きな差を示すのに対して、抗腫瘍リン脂質ＨｅＰＣで処理した細胞ではＩＣ_５０が極めてＬＤ_５０に近いことを示した。

ＳＣＣ−２５細胞において、グリコシド化リン脂質アナログの抗増殖効果ははるかに強力である。とりわけ、Ｇｌｃ−ＰＡＦは、これらの腫瘍細胞に対してサブマイクロモルの範囲で作用する。

Ｇｌｃ−ＰＡＦ及びＧｌｃ−ＰＣの毒性は、細胞膜(cellular membrane)中への物質のインターカレーションによって媒介される。蛍光共鳴エネルギー移動(fluorescence resonance energy transfer)（ＦＲＥＴ）分光分析法(spectroscopy)を用いて、両方の化合物がリポソーム中にインターカレートされること及びインターカレーションがアルキル側鎖の長さに依存していることが明確に証明された。高濃度では、このことが原形質膜の損傷(lesion)の形成及び最終的に細胞の急速な溶解に導く。（Wiese,A.ら,Biol.Chem.381:135-144(2000)）。同様にＦＲＥＴ分析に示されている、Ｇｌｃ−ＰＡＦと比較したときのＧｌｃ−ＰＣの低い細胞毒性は、エーテル脂質の高い安定性及び強固さ(rigidity)によるものかもしれない（Eibl,H.,Angew.Chem.96:247-262(1996)）。

既に記載したように、ＨａＣａＴ細胞の増殖は無毒性濃度で阻害されたので、リン脂質アナログの抗増殖効果は、単純なその溶解特性の結果であるとは思われない。

グルコースに代えてｌｙｓｏ−ＰＡＦのｓｎ−２位へのイノシトールの導入（Ｉｎｏ−ＰＡＦ）は、抗増殖効果を高め（ＩＣ_５０＝１．７μＭ）そしてＧｌｃ−ＰＡＦと比較して、毒性効果を低減する（ＬＤ_５０＞１０μＭ）（Fischerら、未発表データ）。この理由により、Ｉｎｏ−ＰＡＦは抗増殖薬の開発に対して有望な候補である。

充分に層化された表皮(well stratified epidermis)の形成に最終的につながる、ケラチノサイトの発生(development)及び分化は、細胞増殖の変異(modification)及び他の細胞と細胞外マトリックス成分との接着相互作用の変異を含む。表皮の悪性及び良性いずれの過剰増殖疾患においても、細胞増殖及び接着はいずれも損なわれる。

細胞マトリックス接着は、ヘテロダイマーの細胞表面レセプターのファミリーであるインテグリンにより媒介される。細胞外マトリックスの分子へのインテグリンの結合は、マイトジェン活性化(mitgen-acivated)プロテインキナーゼＲｈｏＡ及びプロテインキナーゼＣの活性化を含むシグナル伝達経路（アウトサイド−インのシグナル伝達 (outside-in signaling)）の誘導を引き起こす。逆に、細胞内からのシグナルは、インテグリンのリガンドに対するインテグリンの親和性を調節して、細胞の接着及び移動の変化（インサイド−アウトのシグナル伝達）をもたらすことができる。

皮膚において、インテグリンは、表皮真皮接合部(dermo-epidermal junction)の機能上の完全性の確立に重要な役割を果たし（Kaufmann,R.ら,Hautarzt 41:256-261(1990)）、そして皮膚の過剰増殖疾病においてインテグリンの発現パターンが変えられることが種々の報告に示されてきた（総説として次を参照されたい：De Luca,M.ら,J.Dermatol.21,821-828(1994)）。グリコシド化リン脂質アナログは、細胞増殖への効果の他に、ケラチノサイトの細胞マトリックス接着に影響を及ぼす。Ｇｌｃ−ＰＡＦ及び主としてＩｎｏ−ＰＡＦを用いた２時間のＨａＣａＴ細胞の処理は、細胞外マトリックス成分であるフィブロネクチン、ラミニン及びコラーゲンIVへの細胞接着を増加させる（図３）。この効果は、グリコシド化エーテル脂質への４８時間の長時間曝露後にも観察することができる（Fischerら、未発表データ）。このことは、記載した全てのマトリックス成分への細胞マトリックス接着を減少させることが示されてきた抗増殖薬ＨｅＰＣの作用とは明らかに対照的である（Schoen,M.ら,Brit.J.Dermatol.135:696-703(1996)）。

マトリックス接着の増加は、細胞表面でのβ１インテグリンの増加によっては達成されない。このことは、細胞マトリックス結合の活性化は、細胞膜中へのリン脂質アナログのインターカレーションにより惹起されるインサイド−アウト機構によって媒介されることができるという結論を導く。別の可能性は、変化した膜組成(membrane composition)が、インテグリンヘテロダイマーの活性化及び／又はクラスター形成を導くインテグリンレセプターのコンホーメーション変化を直接に誘導することができるというものである。

リン脂質アナログは原形質膜中に蓄積することができるので、該リン脂質アナログは膜貫通シグナル伝達への影響を有すると推定されている。Ｅｔ−１８−ＯＣＨ３のようなエーテル脂質は、リン脂質修飾(phospholipid-modifying)酵素、例えば、ホスファチジルイノシトール依存ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）及びホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）を阻害することが示された（詳しくは、Arthur,G.,Bittman,R.,Biochim.Biophys.Acta 1390:85-102(1998)に概説）。

グリコシド化リン脂質の正確な作用機構は、さらに解明されなければならない。増殖及び接着へのグリコシド化リン脂質の影響は、標的細胞の脂質マトリックス中へのインターカレーションから生じ、このようにしてシグナル伝達過程及びそれに続く生物学的応答に影響を与えるのかもしれない。

グリコシド化リン脂質アナログによって調節されるシグナルトランスダクション経路は、充分には調べられていない。プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の種々のイソ酵素は、細胞増殖のコントロールに必須の役割を果たしている（Clemens,M.J.ら,J.Cell Sci.103:881-887(1992)）。無毒性濃度のＧｌｃ−ＰＣを用いたＨａＣａＴ細胞の処理は、７０％までの分この酵素の活性を増加させる（Mickeleit,M.ら,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.34:2667-2669(1995)）。高濃度のＧｌｃ−ＰＣでは、前記増加はなくなる。さらに高い毒性濃度のＧｌｃ−ＰＣはインビトロでＰＫＣ活性を阻害しない。このことは、多くの公知の抗増殖剤とは対照的である。

Ｇｌｃ−ＰＡＦは、低濃度であるが抗増殖性である濃度においてアポトーシスを引き起こすことが示されている。アポトーシスを起こした細胞の数は、濃度依存性の増加を示す。高い毒性濃度では、サイトゾルヌクレオソームの存在により測定される、アポトーシス細胞数の著しい減少が生じる。このことは、細胞が前記高濃度での溶解により損傷を受けることも示している（Mickeleit,M.ら,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.37,351-353(1998)）。

Ｉｎｏ−ＰＡＦの利点は、次のように要約することができる：
Ｉｎｏ−ＰＡＦは、治療に用いられるＨｅＰＣより強い抗増殖効果を示す。
細胞マトリックス接着は、ＩｎｏＰＡＦ又はＨｅＰＣとのインキュベーション後に増加するが、後者は、遅効性の作用開始を示す。
接着の増大は、細胞表面上でβ１インテグリンの発現が高まることによるものではなく、インテグリンの誘導されたクラスター形成によるものである。
Ｉｎｏ−ＰＡＦを用いたＨａＣａＴ細胞の処理は、異なる効果、すなわち、接着に作用する最初の２時間以内の迅速な効果と移動及び増殖をもたらす４８時間後の遅い効果とをもたらす。

従って、本発明の医薬組成物は、前立腺癌、膀胱の尿路上皮性癌、副腎様の癌、奇形癌、ヒト及びネズミの白血病、脳腫瘍、肺癌、線維肉腫、及び皮膚の過剰増殖疾病の治療に適している。

以下の実施例によって、本発明をさらに説明するが、本発明を限定するように構成されるものではない。

実施例１：Ｉｎｏ−ＰＡＦの合成
原料、方法及び略語
無水溶媒を用いて保護雰囲気（窒素、不活性ガス又は適切な場合には乾燥管）下に、感湿反応を実施した。フラッシュカラムクロマトグラフィーとは、圧力下でのシリカゲル６０（それぞれ、ＡＳＴＭ、４０〜６３μｍ又は２３０〜４００メッシュ）上のカラムクロマトグラフィーを称する。溶媒Ａと溶媒Ｂとの混合物はＡ−Ｂとして示し、そして溶媒系が完全にＸ％Ａ−Ｂを特徴とするように混合物Ａ−Ｂ中の溶媒Ａの容量濃度をＸ％として示す。

ＤＣＭジクロロメタン
ＤＭＡＰＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン
ＤＭＦＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ｅｑｉｖ当量
ＥｔＯＨエタノール
ｈ時間
ＭｅＯＨメタノール
ＰＰＴＳピリジニウムｐ−トルエンスルホネート
ｐ−ＴｓＣｌｐ−トルエンスルホニルクロリド
ｐ−ＴｓＯＨｐ−トルエンスルホン酸
ｒｔ室温
ｓｍ出発原料
ＴＨＰテトラヒドロピラン
ＴＨＦテトラヒドロフラン

ＩＲ（赤外）分光分析法によって観察される最大吸光度の波数を、単位ｃｍ^−１でＶ_ｍａｘとして報告する。
^１Ｈ−ＮＭＲ（核磁気共鳴）分光分析法によって観察される化学シフトを単位ｐｐｍでδ_Ｈとして報告する。

１．１：５，６−Ｏ−イソプロピリデンアスコルビン酸〔１ａ〕の製造
Ｌ−アスコルビン酸（ブロンソン・ファーマスーティカルズ(Bronson Pharmceuticals)；１０ｇ、５５ミリモル、１当量）をアセトン（４０ｍＬ、０．５５モル、１当量）及び塩化アセチル（１ｍＬ、１５ミリモル、０．２７当量）と混合し、そして得られたスラリーを室温で２〜３時間攪拌した。７℃で４〜８時間放置した後、固体を濾別しそして少量の冷アセトンで洗浄した。減圧下に短時間乾燥させることにより粗製生成物（９．６３ｇ、８１％）を得た；融点１９５−２００℃。極微量の残留する酢酸は、前記生成物を周囲雰囲気に暴露すると加水分解を起こした。粗製生成物をアセトン／ヘキサンから再結晶させて表題化合物〔１ａ〕を得た；融点２１４−２１８℃（分解）（文献(Jung,M.E.;Shaw,T.E.,J.Am.Chem.Soc.102:6304-6311(1980))：融点２１７−２２２℃（分解）；Ｖ_ｍａｘ（ＫＢｒ）３３００、３０００、１７２０、１６３０、１３００（ｂｒ）、１１００ｃｍ^−１；δ_Ｈ（２５０ＭＨｚ、アセトン−ｄ_６、Ｍｅ_２ＳＯ−ｄ_６）３．９−４．６５（ｍ、６Ｈ、ＣＨＯ及びＯＨ）、１．３５（ｓ、６Ｈ、ＣＨ）；δ_Ｈ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、Ｍｅ_２ＳＯ−ｄ_６）６．１５（ｂｒｓ、２Ｈ、ＯＨ）、３．９８−４．６２（ｍ、４Ｈ、ＣＨＯ）、１．３５（ｓ、６Ｈ、ＣＨ_３）。
１．２：（Ｒ）−グリセロールアセトニド(Glycerol Acetonide) 〔１〕の製造
エタノール（３５０ｍＬ）中〔１ａ〕（４．１ｇ、１９ミリモル）の溶液を１時間にわたりエタノール（５０ｍＬ）中ＮａＢＨ_４（０．７２ｇ、１９ミリモル）の攪拌溶液に添加した。この少し曇った溶液を次に室温でさらに４時間攪拌し、その間にＮａＯＨの添加に続きＮａＯＨ水溶液（１Ｎ；５０ｍＬ）を添加することにより反応混合物のｐＨを塩基性にした。得られた混合物を室温で一夜間攪拌し、そして次に強い攪拌下に濃ＨＣｌ水(concentrated aqueous HCl)を滴下に添加するによりｐＨを正確に中性に調節した。乾燥した白色で粉状の固体が得られるまで、共沸蒸留によって水の残分を除去するためにエタノールを数回添加しながら真空中で溶媒を除去し、そして前記乾燥した白色で粉状の固体を酢酸エチル（２００ｍＬ）と混合し０℃まで冷却した。四酢酸鉛（酢酸から再結晶させた；２９．５ｇ、０．６６モル）を１回で添加した。得られた褐色から黄色のスラリーを０℃で１〜１．５時間そして次に室温で１〜２時間攪拌した。０℃まで冷却した後、スラリーをセライト(Celite)（登録商標）の詰め物(pad)を通して濾過した。この濾液を再び冷却しそして次にこの冷たい黄色の溶液を３０分間にわたりＥｔＯＨ（１５０ｍＬ）中ＮａＢＨ_４（７．２ｇ、１９ミリモル）の冷却溶液に添加すると、酢酸エチル溶液の添加後に濃灰色に変わりそして攪拌を助け発泡(foaming)を最少にするために時々ＥｔＯＨの添加を要することがあった。添加を完了した後、この灰色の溶液を攪拌しながら２〜２．５時間室温まで加温した後、ＮａＯＨ続いて水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ、１００ｍＬ）を添加することにより溶液を塩基性にした。得られた混合物を室温で３０分間攪拌し、次いでジエチルエーテル（１００ｍＬ）を添加し、層を分離し、そしてその水性層をジエチルエーテル（２×５０ｍＬ）で抽出した。一緒にした有機層をブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＮａＳＯ_４）そして室温において減圧下に容量約５０ｍＬまで濃縮した。ジエチルエーテル（１００ｍＬ）を添加し、その水性層をＮａＣｌで飽和し、そして層を分離した。その水性層をジエチルエーテル（４×５０ｍＬ）で抽出した。一緒にした有機層を乾燥させ（ＮａＳＯ_４）そして濃縮した。次いで、アセトン（２５ｍＬ）との共沸混合物を形成することにより残留する水を全て蒸留して除きそして透明な液体として（Ｒ）−グリセロールアセトニド〔１〕（１．３２ｇ、５３％）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５０ｇ；ＤＭＣ（３５０ｍＬ）で溶離して不純物除去；５％メタノール−ＤＭＣ（５００ｍＬ））によって生成物をさらに精製して（Ｒ）−グリセロールアセトニド〔１〕（１．２６ｇ、９７％）を得た；Ｖ_ｍａｘ３４２０、２９５０、１３８０、１２６０、１２１５、１１６０、１０５０ｃｍ^−１；δ_Ｈ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）、３．６−４．４（ｍ、５Ｈ、ＣＨＯ）、２．９５（ｂｒｓ、１Ｈ、ＯＨ），１．４３（ｓ、３Ｈ、ＣＨ_３）；サンプル１８４ｍｇを蒸留（２４℃（０．５トル））して透明な液体１６９ｍｇを得、これを旋光度の測定のためにＭｅＯＨ１．００ｍＬ中に溶解した：［α］^２４．８ _Ｄ−１０．７６（文献(Jung,M.E.;Shaw,T.E.,J.Am.Chem.Soc.102:6304-6311(1980))：逆のエナンチオマーについて［α］_Ｄ＋１０．７、ニート(neat)サンプルについて［α］_Ｄ−１３．２〕：［α］_５７８−１１．２７、［α］_５４６−１２．９９、及び［α］_４３６−２３．５９。

１．３：オクタデシルエーテル〔１ｂ〕の製造
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中ＮａＨ（８０％；０．５５ｇ、１７．４ミリモル、２当量）の攪拌懸濁液に、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中（Ｒ）−グリセロールアセトニド〔１〕（１．１５ｇ；１当量）の溶液を滴下に添加した。その後、ＴＨＦ（２５ｍＬ）中に溶解したオクタデシルブロミド（５．８ｇ、１７．４ミリモル、２当量）を滴下に添加しそして得られた混合物を８０℃で一夜間攪拌した。この反応混合物を０℃まで冷却しそして水を添加した。得られた混合物を濃縮しそしてその残留物を水及びジエチルエーテルで抽出しそして一緒にした抽出液を乾燥させた（ＭｇＳＯ_４）。得られた粗製生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（１０％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）によりさらに精製して表題化合物〔１ｂ〕を得た（２．０３ｇ、５．２８ミリモル、６１％）。

１．４：ジオール〔１ｃ〕の製造
酢酸（１５０ｍＬ）と水（５０ｍＬ）との混合物中アセトニド〔１ｂ〕（２．０３ｇ、５，２８ミリモル）の懸濁液を６０℃で３時間攪拌した。その後、溶媒を除去しそして極微量の水及び酢酸の全てを完全に除去するためにその残留物をトルエンで３回共沸蒸留した。白色の固体として表題化合物〔１ｃ〕（１．８２ｇ、５．２８ミリモル、定量(quantitative)）を得た；Ｒ_ｆ０．２（５０％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）。

１．５：アルコール〔２〕の製造
ＤＣＭ（１００ｍＬ）中ジオール〔１ｃ〕（２．５ｇ、７．２５ミリモル、１当量）の攪拌懸濁液に、室温でｐ−ＴｓＯＨを添加し、次いでＤＣＭ（３０ｍＬ）中ジヒドロピラン（０．６５ｍＬ、１当量）の溶液を滴下に添加した。３０分後、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液の添加により反応を急冷した。得られた混合物を水及びＤＣＭで抽出しそして一緒にした有機抽出液を乾燥させた（ＭｇＳＯ_４）。粗製生成物（ジオール〔１ｂ〕及び対応するモノ−及びジ−ＴＨＰエーテルの混合物）をカラムクロマトグラフィー（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）により精製して表題化合物〔２〕（９４０ｍｇ、２．７２ミリモル）、未反応出発原料及び対応するジ−ＴＨＰエーテルを得、後者は８０℃で一夜間ＭｅＯＨ中ＮＨ_４Ｃｌとの反応により出発原料に再循環させた。前記反応を１回繰り返して表題化合物（１．８８ｇ、４．３８ミリモル、６０％）を得た；Ｒ_ｆ０．１（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）。

１．６：アリルエーテル〔２ａ〕の製造
ＴＨＦ（１５ｍＬ）中アルコール〔２〕（２．５８ｇ、６．０１ミリモル、１当量）の溶液をＴＨＦ（５０ｍＬ）中ＮａＨ（３７０ｍｇ、１２．０２ミリモル、２当量）の攪拌溶液に滴下に添加した。その後、ＴＨＦ（５ｍＬ）中アリルブロミド（１ｍＬ；１．４５ｇ、１２．０２ミリモル、２当量）の溶液を添加しそして得られた混合物を８０℃で一夜間攪拌した。次いで、この反応混合物を室温まで冷却しそして水を添加し、溶媒を除去しそして得られた残留物をジエチルエーテルで抽出した。一緒にした有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）そしてその粗製生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（１４．３％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）によって精製して表題化合物〔２ａ〕（２．７ｇ、５，７６ミリモル、９６％）を得た；Ｒ_ｆ０．４（１４．３％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）。

１．７：アルコール〔２ｂ〕の製造
−７８℃の５０％ＤＣＭ−ＭｅＯＨ（２５０ｍＬ）中アリルエーテル〔２ａ〕（２．７ｇ、５．７６ミリモル、１当量）の攪拌溶液を、混合物が青色を呈すまでオゾンでパージした。その後、ＮａＢＨ_４（０．９ｇ、２３．０４ミリモル、４当量）を添加しそして得られた混合物を室温まで加温した。この反応を水の添加により急冷しそして得られた混合物をジエチルエーテルで抽出した。一緒にした抽出液を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）そしてこの粗製生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）によって精製して表題化合物〔２ｂ〕（２．６４ｇ、５，５８ミリモル、９７％）を得た；Ｒ_ｆ０．１（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）。

１．８：ｐ−トルエンスルホニルエステル〔３〕の製造
ＤＣＭ（３０ｍＬ）中アルコール〔２ｂ〕（６００ｍｇ、１．２６ミリモル、１当量）の攪拌溶液に、トリエチルアミン（５ｍＬ）及びＤＭＰＡ（触媒量）を添加した。得られた溶液に、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中ＴｓＣｌ（３６０ｍｇ、１．９ミリモル、１．５当量）の溶液を添加した。一夜間攪拌した後、水を添加し、得られた混合物をジエチルエーテルで抽出しそして一緒にした有機層を乾燥させた（ＭｇＳＯ_４）。この粗製生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）によって精製して表題化合物〔３〕（５７０ｍｇ、０．９ミリモル、７２％）を得た；Ｒ_ｆ０．２（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）。

１．９：ペンタベンジルイノシトール〔８〕の合成
１．９．１：アセトニド〔８ａ〕の製造
ＤＭＳＯ（７５ｍＬ）中ミオ−イノシトール（２０ｇ、０．１１モル、１当量）の攪拌溶液に、ジメトキシプロパン（７５ｍＬ；６３．７５ｇ、０．６１モル、５．５当量）及びｐ−ＴｓＯＨ（０．１５ｇ）を添加した。得られた混合物を１１０℃まで加熱しそして１．５時間後、生成したＭｅＯＨを蒸留して除いた。減圧下に過剰のジメトキシプロパンを除去した。再度ミオ−イノシトール（２０ｇ、０．１１モル）を添加しそして得られた混合物を１２０℃でさらに１４時間攪拌した。その後、Ｋ_２ＣＯ_３（０．１５ｇ）を添加しそして粘稠なシロップが形成されるまで溶媒を除去した。このシロップを煮沸ＥｔＯＨ（１．５Ｌ）中に溶解し、まだ熱いうちに濾過し、そしてこの濾液を容量３０ｍＬまで濃縮した。この生成物を結晶化した後、液体を濾別し、結晶をＥｔＯＨで洗浄しそして引き続きＥｔＯＨからの再結晶に５回付して白色固体として〔８ａ〕（９．９１ｇ、４５ミリモル、４１％）を得た（過剰のミオ−イノシトールはＥｔＯＨに可溶性でないので容易に回収することができる）。

１．９．２：テトラベンジルエーテル〔８ｂ〕の製造
短時間で５０℃まで加温したＤＭＦ（１０ｍＬ）中ＮａＨ（鉱油中８０％分散体；０．９ｇ、３０ミリモル、１．５当量）の懸濁液に、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中テトロール〔８ａ〕（１．１ｇ、５ミリモル、１当量）の攪拌溶液を滴下に添加した。その後、ＤＭＦ（５ｍＬ）中ベンジルブロミド（４．７５ｍＬ；４０ミリモル、２当量）の溶液を添加しそして得られた混合物を８０℃で一夜間攪拌した。この反応混合物を室温まで冷却し、同じ容量のジエチルエーテルで希釈しそして飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で洗浄した。この水性層をジエチルエーテルで抽出し、一緒にした有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）そして溶媒を除去した。この粗製生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）によって精製した。残留する極微量のベンジルブロミドを減圧下に除去して表題化合物〔８ｂ〕（２．１３ｇ、３．７ミリモル、７３．４％）を得た；Ｒ_ｆ０．３４（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）。

１．９．３：ジオール〔８ｃ〕の製造
ＭｅＯＨ中アセトニド〔８ｂ〕（１．０２ｇ、１．８ミリモル、１当量）の溶液を、ＨＣｌ水を添加することによりｐＨ２に調節しそして室温で一夜間攪拌した。その後、この反応混合物に飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を添加しそして減圧下に溶媒を除去した。得られた残留物をＤＣＭ中に溶解しそして乾燥させた（ＭｇＳＯ_４）。溶媒を除去しそしてその粗製生成物をＭｅＯＨから再結晶させて表題化合物〔８ｃ〕（０．７ｇ、１．３ミリモル、７２％）を得た；Ｒ_ｆ０．０４（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）。

１．９．４：アリルエーテル〔８ｄ〕の製造
トルエン（５ｍＬ）中ジオール〔８ｃ〕（０．４５ｇ、０．８３ミリモル、１当量）の攪拌溶液に、新たに砕いたＮａＯＨ（０．４５ｇ）及びアリルブロミド（０．１２ｍＬ、１．５ミリモル、１．８当量）を添加した。６５℃で約２時間（薄層クロマトグラフィー、５０％酢酸エチル−ｎ−ヘキサンによって監視）後、反応混合物を水で洗浄しそして乾燥させた（Ｋ_２ＣＯ_３）。フラッシュカラムクロマトグラフィー（５０％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）により、表題化合物〔８ｄ〕（１２０ｍｇ、０．２１ミリモル、２５％）を得た；Ｒ_ｆ０．６（５０％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）。

１．９．５：ペンタベンジルエーテル〔８ｅ〕の製造
５０℃のＮａＨ（鉱油中８０％分散体；０．０８ｇ）、アルコール〔８ｄ〕（１ｇ、１．７２ミリモル、１当量）及びＤＭＦ（３．５ｍＬ）の攪拌混合物にベンジルブロミド（０．３３ｍＬ；０．４４ｇ、２．６ミリモル、１．５当量）を滴下に添加した。約２時間（薄層クロマトグラフィー、２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサンによって監視）後、この反応混合物を室温まで冷却し、それに次いで水を滴下に添加した。得られた混合物をジエチルエーテルで抽出しそして一緒にした有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）そして溶媒を除去した。この粗製生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（１４．３％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）によって精製して表題化合物〔８ｅ〕（１．１ｇ、１．６４ミリモル、９５％）を得た；Ｒ_ｆ０．４５（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）。

１．９．６：ペンタベンジルイノシトール〔８〕の製造
アリルエーテル〔８ｅ〕（０．５ｇ、０．７４ミリモル、１当量）、１６．７％ＭｅＯＨ−水（６ｍＬ）、Ｐｄ／Ｃ（５％；２０ｍｇ）及びｐ−ＴｓＯＨ（２０ｍＬ）の混合物を煮沸温度で一夜間攪拌した（より良好な可溶化のために１，４−ジオキサンを添加することができる）。この反応混合物を室温まで冷却しそしてセライト（登録商標）を通して濾過した。この濾液を濃縮しそしてフラッシュカラムクロマトグラフィー（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）によって精製して表題化合物〔８〕（３４５ｍｇ、０．５５ミリモル、７４％）を得た。

１．１０：イノシトール誘導体〔４〕の製造
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中イノシトール〔８〕（６７５ｍｇ、１．０８ミリモル、１．２当量）及び１８−クラウン−６−エーテル（１８−Ｃｒ−６、３２０ｍｇ）の攪拌溶液に、ＫＨＭＤＳ溶液（ＴＨＦ中１５％；２．４ｍＬ）を添加した。得られた溶液を５５℃で１０分間加熱した。その後、ＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解したトシレート〔３〕（５７０ｍｇ、０．９ミリモル、１当量）を添加しそして得られた混合物を４０℃で３０分間攪拌した後、その反応を水の添加により急冷した。得られた混合物をジエチルエーテルで抽出しそして一緒にした有機層をブラインで洗浄しそして乾燥させた（ＭｇＳＯ_４）。濃縮後、粗製生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）によって精製して表題化合物〔４〕（６９０ｍｇ、０．６３ミリモル、７０％）を得た；Ｒ_ｆ０．２５（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）。

１．１１：アルコール〔５〕の製造
ＥｔＯＨ（１５ｍＬ）中ＴＨＰエーテル〔４〕（６９０ｍｇ、０．６３ミリモル、１当量）の攪拌溶液にＰＰＴＳ（６０ｍｇ、０．１当量）を添加しそして得られた混合物を５５℃で２時間攪拌した。溶媒を除去しそしてその粗製生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）によって精製して表題化合物〔５〕（５１０ｍｇ、０．５１ミリモル、８１％）を得た；Ｒ_ｆ０．１（２５％酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）。

１．１２：ホスホコリン〔６〕の製造
０℃のＤＣＭ（１５ｍＬ）中ＰＯＣｌ_３（０．１７ｍＬ、１．８５ミリモル、１．０５当量）及びトリエチルアミン（１ｍＬ）の攪拌溶液に、クロロホルム（１５ｍＬ）中アルコール〔５〕（１．７８ｇ、１．７７ミリモル、１当量）の溶液を添加した。得られた混合物を０℃でさらに３時間攪拌した後、ピリジン（５０ｍＬ）中コリントシレート（０．７ｇ、２．６６ミリモル、１．５当量）の溶液を０℃で直ちに添加した。その後、この反応混合物を一夜間、室温まで加温した。ｐＨがわずかに塩基性に変化するまで飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液を添加することにより反応を急冷し、そして得られた混合物を３５℃未満の温度で減圧下に濃縮した。得られた残留物を５０％トルエン−ＤＣＭ（１００ｍＬ）中に溶解し、濾過しそして再度濃縮した。ＴＨＦを用いて同じ手順を繰り返しそして最終的に得られた粗製生成物をさらにフラッシュカラムクロマトグラフィー（１７％→１００％ＭｅＯＨ−クロロホルム）によって精製して表題化合物〔６〕（１．４２ｇ、１．２１ミリモル、６８％）を得た；Ｒ_ｆ０．１（１００％ＭｅＯＨ）。

１．１３：ペントール〔７〕の製造
Ｐｄ／Ｃ（５％；触媒量）及び酢酸（触媒量）を含有するＭｅＯＨ（１５ｍＬ）中ベンジルエーテル〔６〕（１．４２ｇ、１．２１ミリモル）の溶液を水素の雰囲気（２バール）下に３日間攪拌した。反応を薄層クロマトグラフィー（１００％ＭｅＯＨ）によってモニターし、そして出発原料をもはや検出できなくなった後、反応混合物をセライト（登録商標）を通して濾過しそして溶媒を除去した。得られた濾液をＭｅＯＨ中に再溶解し、ペーパーフィルターを通して濾過し、そして溶媒を除去した。その残留物を、洗浄にＭｅＯＨを用い少量のシリカゲルの詰め物を通して精製した。溶媒を再度除去しそして得られた粗製生成物をＭｅＯＨ中に再溶解した。この生成物を、アセトンを添加し次いでその上澄みをデカンテーションしそして減圧下に乾燥させることによって沈殿させて、イノシトール−Ｃ２−ＰＡＦ〔７〕（５３０ｍｇ、０．７４ミリモル、６１％）を得た；Ｒ_ｆ＜０．１（１００％ＭｅＯＨ）；融点１９０−２１０℃（分解）；［α］^２０ _Ｄ−１．３（ｃ１、ＭｅＯＨ）。

実施例２：Ｉｎｏ−ＰＡＦの抗増殖効果の測定
実施例１において得られたＩｎｏ−ＰＡＦ、Ｇｌｃ−ＰＣ及びＧｌｃ−ＰＡＦ（Mickeleit,M.ら,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.34:2667-2669(1995)及び37:351-353(1998)に従って合成）、及びＨｅＰＣ（ヘキサデシルホスホコリン；ミルテホシン(Miltefosin)として市販）を、０．６〜５μＭの量で細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ（コル．(col.)）、ロシュにおいて試験した。アッセイの前に、無血清ケラチノサイト培地中に細胞を２時間保持した。アッセイは試験当り１０．０００個の細胞を用いて、少なくとも４連試験で実施した。

Ｉｎｏ−ＰＡＦ及びＧｌｃ−ＰＣは無毒性濃度で強い抗増殖効果を示す（図２）。

実施例３：Ｉｎｏ−ＰＡＦを用いたＨａＣａＴ細胞の処理はマトリックス接着に影響を与える
細胞マトリックス接着へのＧｌｃ−ＰＡＦ、Ｉｎｏ−ＰＡＦ及びＧｌｃ−ＰＣ（実施例２に詳細記載）の効果を試験するために、ＨａＣａＴ細胞を４℃で１５分間休止(rest)させそして３７℃で９０分間異なるＥＣＭタンパク質（コラーゲンIV、フィブロネクチン及びラミニン）に接着させた。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のタンパク質を、４℃で一夜間処理することによってプラスチック表面上に載せた。固定しそしてクリスタルバイオレット中で染色した後、発色(coloring)を５７０ｎｍで測定した。試験当り５０，０００個の細胞を用い、そして４連試験を実施した。２時間の処理は細胞マトリックス接着の増加を示し、４８時間後にはもはやこれを観察することができない。

Ｉｎｏ−ＰＡＦを用いたインキュベーションは、試験したマトリックスタンパク質への細胞マトリックス接着の濃度依存性の増加をもたらすが、Ｉｎｏ−ＰＡＦは細胞マトリックス接着に対して最も大きな影響を与えた。細胞マトリックス接着を媒介するレセプターであるインテグリンの表面発現はその物質によって影響を受けない。図３に示した結果は、４連で実施した少なくとも３回の試験の平均値である。

実施例４：Ｉｎｏ−ＰＡＦを用いたＨａＣａＴ細胞の処理
Ｉｎｏ−ＰＡＦ（実施例１に記載のように得た）を用いてＨａＣａＴ細胞を４８時間処理した。免疫蛍光測定に対して、細胞を５μＭのＩｎｏ−ＰＡＦで処理した。検出に用いた抗体は、細胞マトリックス接着を与える表面レセプターであるβ１−インテグリンに向けられたものであった。免疫蛍光アッセイはコラーゲンIVマトリックスについて実施した。５×１０^４個の細胞を９０分間接着するに任せ、そしてＫ２０−ＦＩＴＣ（抗β１）又はファロイジン−ＴＲＩＴＣでそれぞれ染色した。結果を図４に示す。

実施例５：ヘプトタクティック(haptotactic)移動アッセイ
Ｇｌｃ−ＰＡＦ、Ｉｎｏ−ＰＡＦ及びＧｌｃ−ＰＣ（実施例２に詳細記載）の移動への効果を調査するために、コラーゲンIVへのＨａＣａＴ細胞を用いたヘプトタクティック移動アッセイを実施した。移動アッセイは、トランスウェル(Transwell)（コスター社(Costar Corp.)、米国）モーティリティーチャンバー(motility chamber)を用いて実施した。膜の下面に室温で３０分間マトリックスタンパク質をコートしそして引き続いてＰＢＳで洗浄した。ウェル当り１×１０^５個の細胞を上面上の無血清培地に平板培養(plate)しそして１６時間移動するに任せた。上面上の細胞を取り除き、そして下面に移動した細胞を３％パラホルムアルデヒドで固定しそして０．１％クリスタルバイオレットで染色した。下面の細胞を、倍率２０×で格子(grid)１０×を用いてカウントした。フィルター当り４区画をカウントして平均した。

移動は濃度に依存して減少した。試験物質による細胞の処理は、処理２４時間後にマトリックス依存性の移動を５０％まで減少させることが判明した。

本明細書に記載したリン脂質アナログの化学構造を示す図である。実施例２による、他のリン脂質アナログと比較したＩｎｏ−ＰＡＦの抗増殖効果の測定を示す図である。実施例３に示したＨａＣａＴ細胞試験モデルによるＩｎｏ−ＰＡＦ（他のリン脂質アナログとの比較）の試験における細胞マトリックス付着活性を要約する図である。Ｉｎｏ−ＰＡＦを用いたＨａＣａＴ細胞の処理がどの程度インテグリンクラスター形成を誘導しそして細胞骨格に影響を与えるか（実施例４による処理及び視覚化）を示す図である。

Claims

下記式（Ｉ）の構造：
（上記式中、
Ａは、独立して、場合により置換されているＣ_１−６アルキル基であるか、又は、２つのＡ残基が、場合により置換されている５〜７員環を形成してもよく、置換基がヒドロキシ、ハロゲン、オキソ、Ｃ_１−６アルコキシおよびカルボキシから選択され、
Ｒ及びＲ’の一方が下記式（II）〜（IV）：
を有するポリヒドロキシル化脂肪族炭素環を含む第一の残基であり、上記式中、Ｅは、Ｈ原子、Ｃ_１−４アルキル基、Ｃ_２−４アシル基および炭水化物基から選ばれ、かつリン脂質のグリセロール主鎖の酸素原子に直接連結されるか、または（ポリ）エーテル、（ポリ）ペプチドもしくはグリコシドであるリンカー分子を介して連結され、
前記Ｒ及びＲ’の他方が、場合により不飽和の及び／又は場合により置換されているＣ_１−２０アルキル基、場合により不飽和の及び／又は場合により置換されているＣ_２−２６アシル基、ならびに水素原子から選ばれる第二の残基であり、置換基がヒドロキシ、ハロゲン、オキソ、Ｃ_１−６アルコキシおよびカルボキシから選択され、かつ
ｎは、１〜５の範囲の整数である）
を有する、リン脂質。
ＡがＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、Ｃ_３Ｈ_７及びＣＨ（ＣＨ_３）_２から選ばれる、請求項１に記載のリン脂質。
ＡがＣＨ_３である、請求項２に記載のリン脂質。
Ｒが第一の残基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のリン脂質。
第二の残基がＣ_{１０−２０}アルキル基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリン脂質。
第二の残基がＣ_１６またはＣ_１８アルキル基である、請求項５に記載のリン脂質。
第一の残基が式(III)の残基である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のリン脂質。
ＥがＨである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のリン脂質。
リンカーが（ポリ）エーテルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のリン脂質。
ｎ＝１である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のリン脂質。
前記式（III）で表される残基が、シス−イノシトール、エピ−イノシトール、アロ−イノシトール、ネオ−イノシトール、ミオ−イノシトール、ムコ−イノシトール、チロ−イノシトール又はシロ−イノシトールである、請求項７に記載のリン脂質。
前記式（III）で表される残基がミオ−イノシトールである、請求項１１に記載のリン脂質。
下記式（V）：
（上記式中、Ｄは、請求項１、５又は６に定義した第二の残基であり、Ａは請求項１、２又は３に定義した通りであり、Ｅは請求項１又は８に定義したとおりであり、ｎは請求項１又は１０に定義したとおりであり、及びＬは請求項１又は９に定義した化学結合又はリンカーである）
で表される式に相当する、請求項７に記載のリン脂質。
式中のＡがＣＨ_３であり、ｎが１であり、Ｌが−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｏ−であり、ＤがＣ_１８Ｈ_３７であり、及びＥがＨ原子である、請求項１３に記載のリン脂質。
請求項１〜１４のいずれかに定義したリン脂質を含む医薬組成物。
細胞増殖の阻害、抗癌剤としての細胞−細胞及び細胞−マトリックス接着の調節、及び細胞移動の抑制に適している、請求項１５に記載の医薬組成物。
前立腺癌、膀胱の尿路上皮性癌、副腎様の癌、奇形癌、ヒト及びネズミの白血病、脳腫瘍、肺癌、線維肉腫、及び皮膚の過剰増殖疾病の治療に適している、請求項１６に記載の医薬組成物。
前立腺癌、膀胱の尿路上皮性癌、副腎様の癌、奇形癌、ヒト及びネズミの白血病、脳腫瘍、肺癌、線維肉腫、及び皮膚の過剰増殖疾病の治療用医薬の製造のための、請求項１〜１４のいずれか一項に定義した化合物の使用。