JP4510045B2 - Method for purifying conjugated linoleic acid isomers and uses thereof - Google Patents
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Description
本発明は、共役リノール酸異性体の精製方法、更に具体的には共役リノール酸異性体の遊離体およびグリセリドエステル体の精製方法およびその用途に関するものであり、特に、この精製方法で得られた共役リノール酸異性体は食品として適用できるものである。 The present invention relates to a method for purifying a conjugated linoleic acid isomer, more specifically, a method for purifying a free form of a conjugated linoleic acid isomer and a glyceride ester, and uses thereof. Conjugated linoleic acid isomers can be applied as food.
近年、共役リノール酸は抗ガン作用、体脂肪低減作用、抗アレルギー作用等の多彩な生理作用を有し、注目されている。共役リノール酸はプロピレングリコールに代表される有機溶媒を使用するアルカリ共役化法（特許第3017108号公報）が知られている。この方法では、c9,t11-共役リノール酸（9cis,11trans-共役リノール酸）およびt10,cl2-共役リノール酸（10trans,12cis-共役リノール酸）が等量生成した混合物となる。 In recent years, conjugated linoleic acid has attracted attention because it has various physiological actions such as anticancer action, body fat reduction action, and antiallergic action. As the conjugated linoleic acid, an alkali conjugation method (Patent No. 3017108) using an organic solvent typified by propylene glycol is known. This method results in a mixture in which equal amounts of c9, t11-conjugated linoleic acid (9cis, 11trans-conjugated linoleic acid) and t10, cl2-conjugated linoleic acid (10trans, 12cis-conjugated linoleic acid) are produced.
従来、これら共役リノール酸の異性体混合物を精製する方法として、クロマトグラフィーによる方法が知られている。しかしこの方法では、溶剤およびカラムの使用等でコストがかかりすぎる問題がある。 Conventionally, a chromatographic method is known as a method for purifying an isomer mixture of these conjugated linoleic acids. However, this method has a problem that it is too expensive due to the use of a solvent and a column.
特表平11-514887号の公報には、リパーゼ存在下で共役リノール酸異性体混合物とオクタノールとを反応させ、オクタノールエステル画分における共役リノール酸異性体組成比を変えることが報告されている。しかし、この公報には、アルコールとしてメントール、ステロールの記載がなく、個々の異性体を精製する方法までも記載されていない。また、この公報には、リパーゼ存在下で加水分解し、t10,c12-共役リノール酸を多く含むグリセリドを製造しているが、あくまでもそのグリセド内の共役リノール酸異性体の組成を変えることが主目的であり、個々の異性体を精製する方法までも記載されていない。 Japanese Patent Publication No. 11-514887 discloses that a conjugated linoleic acid isomer mixture is reacted with octanol in the presence of lipase to change the composition ratio of the conjugated linoleic acid isomer in the octanol ester fraction. However, this publication does not describe menthol or sterol as alcohol, nor does it describe a method for purifying individual isomers. In this publication, glycerides containing a large amount of t10, c12-conjugated linoleic acid are produced by hydrolysis in the presence of lipase. It is the purpose, and no method for purifying individual isomers is described.
特開2001-169794号の公報は、リパーゼ存在下で直鎖高級アルコールと選択的エステル化反応させることによって、c9,tll-共役リノール酸含有脂肪酸を得る方法を記載しているが、tlO,c12-共役リノール酸異性体含有脂肪酸を得る方法は記載していない。 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-169794 describes a method for obtaining a c9, tll-conjugated linoleic acid-containing fatty acid by selective esterification with a linear higher alcohol in the presence of lipase. -A method for obtaining a fatty acid containing a conjugated linoleic acid isomer is not described.
更に、酵素を利用した共役ノール酸のエステルの製造方法について、特開2000-247965号公報、特開2002-60372号公報に記載がある。
前者の公報では、共役リノール酸とエステル化またはエステル交換するために用いられる水酸基またはエステル結合を1個以上有する有機化合物として、リン脂質、コレステロール、β-シトステロール等のステロール、ショ糖、乳糖等の糖類、アスコルビン酸等の有機酸が挙げられているが、このエステルを使用して共役リノール酸異性体を精製する方法に関しては記載がない。
Furthermore, the manufacturing method of the ester of the conjugated holic acid using an enzyme is described in Unexamined-Japanese-Patent No. 2000-247965 and Unexamined-Japanese-Patent No. 2002-60372.
In the former publication, as an organic compound having one or more hydroxyl groups or ester bonds used for esterification or transesterification with conjugated linoleic acid, sterols such as phospholipids, cholesterol, β-sitosterol, sucrose, lactose, etc. Although organic acids, such as saccharides and ascorbic acid, are mentioned, there is no description about the method of refine | purifying the conjugated linoleic acid isomer using this ester.
また、後者の公報には、食品として許容可能なテルペンアルコール又はセスキテルペンアルコールとの共役リノール酸エステルの製造方法を記載しているが、その中にはtlO,c12-共役リノール酸異性体が多く含有された未反応の遊離脂肪酸を粗反応混合物から単離する方法だけを記載しており、c9,t1l-共役リノール酸含有脂肪酸を得る方法は記載していない。
本発明は、共役リノール酸異性体（遊離体およびグリセリドエステル体）を製造する技術、さらに具体的には、高純度、高収率で精製でき、食品用途で使用可能な共役リノール酸異性体、特にc9,tl1-共役リノール酸およびt10,cl2-共役リノール酸の精製方法およびそれぞれの高純度異性体を高割合で含むグリセリドの精製・製造技術を提供することを目的とするものである。 The present invention relates to a technique for producing conjugated linoleic acid isomers (free and glyceride ester), more specifically, a conjugated linoleic acid isomer that can be purified with high purity and high yield, and can be used in food applications. In particular, an object of the present invention is to provide a method for purifying c9, tl1-conjugated linoleic acid and t10, cl2-conjugated linoleic acid and a technology for purifying and producing glycerides containing the respective high-purity isomers in a high proportion.
上述の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、共役リノール酸異性体混合物とリパーゼを用いること、およびその反応条件（酵素の種類、加水分解率、エステル化率等）を適宜調節することによって上記の目的を達成でき、高純度、高収率で精製でき、食品用途で使用可能な共役リノール酸異性体、特にc9,tll-共役リノール酸およびt10,c12-共役リノール酸の精製方法およびそれぞれの異性体を高割合で含むグリセリドの精製・製造に成功し、この知見をもとに本発明を完成するに至った。 As a result of earnest research to achieve the above-mentioned purpose, by using a conjugated linoleic acid isomer mixture and lipase and appropriately adjusting the reaction conditions (enzyme type, hydrolysis rate, esterification rate, etc.) A method for purifying conjugated linoleic acid isomers, particularly c9, tll-conjugated linoleic acid and t10, c12-conjugated linoleic acid, which can achieve the above objectives, can be purified with high purity and high yield, and can be used in food applications The present inventors have succeeded in the purification and production of glycerides containing a high proportion of the isomers, and have completed the present invention based on this finding.
すなわち、本発明は、リパーゼの存在下、共役リノール酸の異性体混合物を構成成分とする脂肪酸混合物またはそのグリセリドエステル混合物を、有機溶媒を含まない反応系で共役リノール酸異性体に対する選択反応に付すことを特徴とする共役リノール酸異性体の精製方法（１）に関するものであり、この精製方法の具体的な態様において、食品分野で使用可能な方法として、選択的加水分解反応を利用する第１の方法、および選択的エステル化反応を利用する第２の方法がある。 That is, in the present invention, in the presence of lipase, a fatty acid mixture containing a conjugated linoleic acid isomer mixture or a glyceride ester mixture thereof is subjected to a selective reaction with respect to the conjugated linoleic acid isomer in a reaction system not containing an organic solvent. The conjugated linoleic acid isomer purification method (1) is characterized in that, in a specific embodiment of this purification method, as a method that can be used in the food field, a first method utilizing a selective hydrolysis reaction is used. And a second method utilizing a selective esterification reaction.
精製方法（１）における第１の方法としては、下記の方法が含まれる。
（２）リパーゼの存在下、共役リノール酸の異性体混合物を構成成分とするグリセリドを、有機溶媒を含まない反応系で加水分解することを特徴とする、上記(1)の精製方法。
（３）リパーゼの存在下、共役リノール酸の異性体混合物を構成成分とするグリセリドを、有機溶媒を含まない反応系で加水分解し、得られたグリセリドを、前記リパーゼの存在下で更に1回以上、加水分解することを特徴とする、上記(2)の精製方法。
（４）c9,tll-共役リノール酸を遊離脂肪酸画分中に濃縮し、t10,c12-共役リノール酸をグリセリド画分中に濃縮することを特微とする、上記(2)または(3)の精製方法。
（５）上記(4)の方法より得た遊離脂肪酸画分をグリセリンとエステル化することにより、c9,t11-共役リノール酸高含有グリセリドを得ることを特徴とする、上記(2)〜(4)のいずれかの精製方法。
（６）上記(4)の方法より得たグリセリド画分を加水分解することによって、t10,c12-共役リノール酸高含有脂肪酸を得ることを特徴とする、上記(2)〜(4)のいずれかの精製方法。
The following methods are included as the first method in the purification method (1).
(2) The purification method according to (1) above, wherein glycerides containing a conjugated linoleic acid isomer mixture as a constituent component are hydrolyzed in a reaction system not containing an organic solvent in the presence of lipase.
(3) In the presence of lipase, glyceride containing a mixture of isomers of conjugated linoleic acid as a constituent component is hydrolyzed in a reaction system not containing an organic solvent, and the resulting glyceride is further treated once in the presence of the lipase. The purification method according to (2) above, which comprises hydrolysis.
(4) The above (2) or (3), characterized in that c9, tll-conjugated linoleic acid is concentrated in the free fatty acid fraction and t10, c12-conjugated linoleic acid is concentrated in the glyceride fraction. Purification method.
(5) The above-mentioned (2) to (4), wherein a c9, t11-conjugated linoleic acid-rich glyceride is obtained by esterifying the free fatty acid fraction obtained by the method (4) with glycerin. ) Any one of the purification methods.
(6) Any of the above (2) to (4), wherein a fatty acid containing a high content of t10, c12-conjugated linoleic acid is obtained by hydrolyzing the glyceride fraction obtained by the method of (4) above. The purification method.
精製方法（１）における第２の方法としては、下記の方法が含まれる。
（７）リパーゼの存在下、共役リノール酸の異性体混合物を、有機溶媒を含まない反応系で、食品加工に利用できるアルコールと選択的エステル化することを特徴とする、上記(1)の精製方法。
（８）リパーゼの存在下、共役リノール酸の異性体混合物を、有機溶媒を含まない反応系で、食品加工に利用できるアルコールと選択的エステル化し、得られた遊離脂肪酸を、前記リパーゼの存在下で更に1回以上、食品加工に利用できるアルコールと選択的エステル化反応し、t10,c12-共役リノール酸を遊離脂肪酸画分中に濃縮することを特徴とする、上記(7)の精製方法。
（９）c9,tll-共役リノール酸を濃縮させたアルコールエステル画分を非選択的または選択的加水分解することによって、c9,t11-共役リノール酸高含有脂肪酸を得ることを特徴とする、上記(7)または(8)の精製方法。
（10）上記(8)または(9)の方法より得た遊離脂肪酸をグリセリンとエステル化することにより、t10,c12-共役リノール酸高含有グリセリドまたはc9,tll-共役リノール酸高含有グリセリドを得ることを特徴とする、共役リノール酸異性体の精製方法。
The following method is included as the second method in the purification method (1).
(7) Purification of (1) above, wherein the isomer mixture of conjugated linoleic acid is selectively esterified with an alcohol that can be used for food processing in a reaction system that does not contain an organic solvent in the presence of lipase. Method.
(8) In the presence of lipase, the isomer mixture of conjugated linoleic acid is selectively esterified with an alcohol that can be used for food processing in a reaction system that does not contain an organic solvent, and the resulting free fatty acid is converted into the presence of the lipase. The purification method according to (7) above, wherein a selective esterification reaction with alcohol that can be used for food processing is further performed once or more to concentrate t10, c12-conjugated linoleic acid in the free fatty acid fraction.
(9) C9, t11-conjugated linoleic acid-rich fatty acid is obtained by non-selective or selective hydrolysis of an alcohol ester fraction enriched with c9, tll-conjugated linoleic acid, The purification method of (7) or (8).
(10) A t10, c12-conjugated linoleic acid-rich glyceride or a c9, tll-conjugated linoleic acid-rich glyceride is obtained by esterifying the free fatty acid obtained by the method of (8) or (9) above with glycerin. A method for purifying conjugated linoleic acid isomers.
本発明はまた、上記(4)、(5)または(10)の方法より得られるグリセリド中のc9,tl1-共役リノール酸またはt10,c12-共役リノール酸が、両異性体の合計含量に対して70重量%以上含まれるグリセリドにも関する。
本発明はまた、上記の共役リノール酸異性体またはグリセリドを健康成分として含む脂肪含有食品にも関する。
The present invention also provides that c9, tl1-conjugated linoleic acid or t10, c12-conjugated linoleic acid in the glyceride obtained by the method of (4), (5) or (10) above is based on the total content of both isomers. It also relates to glycerides contained at 70% by weight or more.
The present invention also relates to a fat-containing food containing the conjugated linoleic acid isomer or glyceride as a health ingredient.
上述してきたように、本発明によれば、高純度、高収率で精製でき、食品用途で使用可能な共役リノール酸異性体、特にc9,tl1-共役リノール酸及びt10,cl2-共役リノール酸の精製方法及びそれぞれの異性体を高割合で含むグリセリドを提供することことができる。
また、共役リノール酸異性体（遊離体またはグリセリド）の製造において、反応条件を適宜変えることにより、特にc9,t11-共役リノール酸とt10,c12-共役リノール酸の含有割合を所望に調節することができる。
As described above, according to the present invention, conjugated linoleic acid isomers, particularly c9, tl1-conjugated linoleic acid and t10, cl2-conjugated linoleic acid, which can be purified with high purity and high yield and can be used in food applications. And a glyceride containing a high proportion of each isomer.
In addition, in the production of conjugated linoleic acid isomers (free form or glyceride), the content of c9, t11-conjugated linoleic acid and t10, c12-conjugated linoleic acid should be adjusted as desired by appropriately changing the reaction conditions. Can do.
本発明による共役リノール酸異性体の精製方法（上記精製方法(1)）は、具体的な態様において、基本的に、加水分解反応を利用する第１の方法、および選択的エステル化反応を利用する第２の方法があり得ることは前記したところである。
すなわち、本発明は、好ましい態様において下記の二つの方法を提供するものである。
The conjugated linoleic acid isomer purification method according to the present invention (the above purification method (1)) basically uses the first method utilizing hydrolysis reaction and the selective esterification reaction in a specific embodiment. As described above, there can be the second method.
That is, the present invention provides the following two methods in a preferred embodiment.
第1の方法は、共役リノール酸の異性体混合物を構成成分とするグリセリド（通常トリグリセリドを主成分とし、ジグリセリド、モノグリセリドも含む）をリパーゼの存在下、有機溶媒を含まない反応系で選択的に加水分解し、c9,tll-共役リノール酸を遊離脂肪酸として、またt10,c12-共役リノール酸を未分解グリセリド画分に回収する精製方法に関するものである。更に、c9,t11-共役リノール酸を含有する遊離脂肪酸はグリセリンとエステル化することによってグリセリドとしても提供できる。また、t10,cl2-共役リノール酸を含有する未分解グリセリド画分は、更に加水分解（選択的または非選択的）することによってt10,cl2異性体含有率の高い遊離脂肪酸として供給することもできる。 In the first method, a glyceride (usually triglyceride as a main component, including diglyceride and monoglyceride) containing an isomer mixture of conjugated linoleic acid as a constituent is selectively used in a reaction system that does not contain an organic solvent. The present invention relates to a purification method by hydrolyzing and recovering c9, tll-conjugated linoleic acid as a free fatty acid and t10, c12-conjugated linoleic acid in an undegraded glyceride fraction. Furthermore, free fatty acids containing c9, t11-conjugated linoleic acid can also be provided as glycerides by esterification with glycerin. The undegraded glyceride fraction containing t10, cl2-conjugated linoleic acid can also be supplied as free fatty acids with a high t10, cl2 isomer content by further hydrolysis (selective or non-selective). .
第２の方法は、共役リノール酸の異性体混合物を、リパーゼの存在下、有機溶媒を含まない反応系で食品加工に利用できるアルコール（好ましくはメントール、ステロ一ル、グリセリン等）で選択的エステル化し、t10,c12-共役リノール酸を未反応の遊離脂肪酸として、またc9,tl1-共役リノール酸をエステル体として回収し、得られたエステル体は更に加水分解して、c9,tll-共役リノール酸高含有遊離脂肪酸として回収する精製方法に関するものである。更に、得られたc9,t11-共役リノール酸またはt10,c12-共役リノール酸を高含有する脂肪酸は、グリセリンとエステル化することによってグリセリドとしても提供できる。 In the second method, a mixture of isomers of conjugated linoleic acid is selectively esterified with an alcohol (preferably menthol, sterol, glycerin, etc.) that can be used for food processing in a reaction system that does not contain an organic solvent in the presence of lipase. And t10, c12-conjugated linoleic acid is recovered as an unreacted free fatty acid and c9, tl1-conjugated linoleic acid is recovered as an ester, and the resulting ester is further hydrolyzed to c9, tll-conjugated linoleic acid. The present invention relates to a purification method for recovering as a high fatty acid-containing free fatty acid. Furthermore, the obtained fatty acid containing a high amount of c9, t11-conjugated linoleic acid or t10, c12-conjugated linoleic acid can be provided as a glyceride by esterification with glycerin.
以上のことから、本発明によれば、c9,t11-共役リノール酸またはtlO,c12-共役リノール酸のいずれかを高含有する食品用の脂肪酸およびグリセリドを製造することができる。 From the above, according to the present invention, it is possible to produce fatty acids and glycerides for foods containing a high content of either c9, t11-conjugated linoleic acid or tlO, c12-conjugated linoleic acid.
本発明において、共役リノール酸異性体の精製方法とは、共役リノール酸異性体の遊離体またはグリセリドエステル体の精製方法を意味する。
本発明で用いる共役リノール酸異性体混合物とは、遊離脂肪酸もしくはグリセリド（通常トリグリセリドを主成分とし、ジグリセリド、モノグリセリドも含む）の形態で、c9,tll-共役リノール酸およびt10,c12-共役リノール酸を主体的に含むものであればいずれの起源のものでも使用できるが、好ましくは共役リノール酸（またはグリセリド中の共役リノール酸）を脂肪酸混合物（またはグリセリド混合物中の脂肪酸）の全量に対して50%以上、より好ましくは60%以上、更に好ましくは70%以上含むものである。
なお、本明細書において、%表示は特に断りのない限り、あるいは%表示のみで明確な場合(加水分解率、エステル化率など)を除き重量%を意味する。
In the present invention, the method for purifying a conjugated linoleic acid isomer means a method for purifying a free form of a conjugated linoleic acid isomer or a glyceride ester.
The conjugated linoleic acid isomer mixture used in the present invention is in the form of free fatty acid or glyceride (usually triglyceride as the main component, including diglyceride and monoglyceride), c9, tll-conjugated linoleic acid and t10, c12-conjugated linoleic acid Can be used from any source as long as it mainly contains conjugated linoleic acid (or conjugated linoleic acid in glycerides) with respect to the total amount of fatty acid mixture (or fatty acids in glyceride mixture). % Or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more.
In the present specification, “%” means “% by weight” unless otherwise specified, or unless clearly indicated only by “%” (hydrolysis rate, esterification rate, etc.).
上記のような遊離脂肪酸の実用的な好ましい例としては、リノール酸を含む食用油(サフラワー油、ヒマワリ油等)をプロピレングリコールなどの溶媒の存在下でアルカリ共役化（例えば特開平１０−１３０１９９号公報）して製造したc9,t11-およびt10,cl2-共役リノール酸異性体をそれぞれ30%以上含む遊離脂肪酸の混合物(例えばCLA-80:リノール油脂社製)、あるいはJ.Am.Oil Chem.Soc.,36,631,(1959)、第34回油化学討論会講演要旨集、p171(1995)に記載されたアルカリ共役化による共役リノール酸異性体混合物等があげられ、アルカリ共役化反応の原料としてリノール酸を用いた場合は、共役リノール酸含有量を更に増加させることができる。また、微生物等(例えば乳酸菌)によって生産される共役リノール酸含有油脂から得られた脂肪酸の混合物を用いてもよい(例えば、乳酸菌を用いた米国特許第6,060,304号公報参照)。また、リノール酸を高割合（例えば95%程度）で含むリノール酸高含有脂肪酸を原料として使用することにより、共役リノール酸高含有脂肪酸混合物を得ることができる。
上述のようにして得られる脂肪酸混合物中の共役リノール酸異性体含量は、一般的に10〜95%、好ましくは50〜95%、より好ましくは60〜95%、さらに好ましくは70〜95%程度であり、より実用的には50〜85%程度であり（両異性体の相互含量はほぼ等量）、残りの成分は他の脂肪酸（オレイン酸等）、未転化（非共役）リノール酸等である。
Practical and preferred examples of the free fatty acids as described above include an conjugated oil (such as safflower oil and sunflower oil) containing linoleic acid in the presence of a solvent such as propylene glycol (for example, JP-A-10-130199). A mixture of free fatty acids containing 30% or more of each of the c9, t11- and t10, cl2-conjugated linoleic acid isomers (for example, CLA-80: manufactured by Linol Oil & Fats Co., Ltd.), or J. Am. Oil Chem Soc., 36, 631, (1959), 34th Oil Chemistry Conference Abstract, p171 (1995), conjugated linoleic acid isomer mixture by alkali conjugation, etc. When linoleic acid is used, the conjugated linoleic acid content can be further increased. In addition, a mixture of fatty acids obtained from conjugated linoleic acid-containing oils and fats produced by microorganisms (eg, lactic acid bacteria) may be used (see, for example, US Pat. No. 6,060,304 using lactic acid bacteria). In addition, a conjugated linoleic acid-rich fatty acid mixture can be obtained by using, as a raw material, a linoleic acid-rich fatty acid containing linoleic acid in a high proportion (for example, about 95%).
The content of conjugated linoleic acid isomers in the fatty acid mixture obtained as described above is generally 10 to 95%, preferably 50 to 95%, more preferably 60 to 95%, still more preferably about 70 to 95%. More practically, it is about 50 to 85% (the mutual content of both isomers is almost equal), the remaining components are other fatty acids (oleic acid, etc.), unconverted (non-conjugated) linoleic acid, etc. It is.
本発明において「有機溶媒を含まない反応系」とは、n−ヘキサン、アセトン、ジエチルエーテル、トルエン等の有機溶媒(食品用途に使用できるアルコール（エタノールなど）を除く)を含まず、脂肪酸もしくはグリセリド、水、および酵素等で構成されている反応用混液をいう。 In the present invention, the “reaction system not containing an organic solvent” means an organic solvent such as n-hexane, acetone, diethyl ether, toluene, etc. (excluding alcohols (such as ethanol) that can be used for food), fatty acids or glycerides. , A reaction mixture composed of water, enzyme and the like.
本発明に用いられるリパーゼは、その起源に特に制限されるものではなく、本発明における酵素反応性（加水分解およびエステル化反応）を有する限り各種微生物、動物、植物起源のいずれでもよい。本発明において、選択反応を行うときには共役リノール酸異性体特異性を有する酵素の使用が必須である。また、非選択反応では異性体特異性のない（もしくは小さい）酵素の使用が好ましいが、過剰量の使用あるいは反応時間を延長する等により反応率を高めることができれば、異性体特異性を有する酵素を用いることもできる。微生物起源のリパーゼとしては、Staphylococcus属、Pseudomonas属、Burkholderia属、Alcaligenes属、Rhizopus属、Rhizomucor属、Thermomyces属、Penicillium属、Aspergillus属、Candida属、Geotrichum属等に属する微生物に由来するものがあげられる。共役リノール酸異性体の選択性の観点からは、特にCandida rugosa（例えばLipase-OF、名糖産業(株)、Lipase-AY、天野エンザイム（株））、Geotrichum candidum等に由来するリパーゼ(c9,t11-共役リノール酸を基質として認識しやすい)が好ましく、特定の異性体含量が相対的に高い脂肪酸またはグリセリドを製造するのに適している。また、非選択反応には基本的にいずれの酵素も使用できるが、特にRhizomucor miehei、Rhizopus niveus、Thermomyces lanuginosa、Rhizopus oryzae、Aspergillus niger、Alcaligenes sp.由来のリパーゼなどが好ましく、Candida rugosaやGeotrichum candidumのリパーゼを過剰量用いた反応も有効である。動物起源のリパーゼとしては、例えば膵リパーゼ、消化管リパーゼ等が挙げられ、また、植物起源のリパーゼとしては、例えば、米ぬか、なたね種子、パーム果肉、ヒマ種子のリパーゼ等が挙げられる。これらの酵素は市販されたものをそのまま用いてもよいが、特に精製された市販品を用いる必要もなく、目的とする酵素の生産能を有する微生物菌体そのもの、その培養液、該培養液を処理して得られる粗酵素液や酵素を含む組成物等を
使用することもできる。
The lipase used in the present invention is not particularly limited to its origin, and may be any of various microorganisms, animals, and plants as long as it has enzyme reactivity (hydrolysis and esterification reaction) in the present invention. In the present invention, it is essential to use an enzyme having conjugated linoleic acid isomer specificity when performing a selective reaction. In non-selective reactions, it is preferable to use an enzyme with no (or small) isomer specificity. However, if the reaction rate can be increased by using an excessive amount or extending the reaction time, an enzyme with isomer specificity can be used. Can also be used. The lipase microbial origin, Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Burkholderia sp., Alcaligenes sp., Rhizopus spp, Rhizomucor genus Thermomyces genus, Penicillium genus, Aspergillus genus, Candida genus, include those derived from microorganisms belonging to the Geotrichum genus, etc. . From the viewpoint of the selectivity of the conjugated linoleic acid isomer, lipase derived from Candida rugosa (eg Lipase-OF, Meisei Sangyo Co., Ltd., Lipase-AY, Amano Enzyme Co., Ltd.), Geotrichum candidum, etc. t11-conjugated linoleic acid is easily recognized as a substrate) and is suitable for producing fatty acids or glycerides having a relatively high specific isomer content. Further, although the non-selective reaction essentially any enzyme can be used, in particular Rhizomucor miehei, Rhizopus niveus, Thermomyces lanuginosa , Rhizopus oryzae, Aspergillus niger, preferably the like Alcaligenes sp. Lipase, a Candida rugosa or Geotrichum candidum A reaction using an excessive amount of lipase is also effective. Examples of the lipase of animal origin include pancreatic lipase and gastrointestinal lipase. Examples of the lipase of plant origin include rice bran, rapeseed seed, palm pulp, and castor seed lipase. These enzymes may be used as they are, but there is no need to use a particularly purified commercial product, and the microbial cell itself having the ability to produce the target enzyme itself, its culture solution, A crude enzyme solution obtained by treatment, a composition containing an enzyme, or the like can also be used.
リパーゼの使用形態は遊離型のままでもよいが、固定化剤(イオン交換樹脂、多孔性樹脂、セラミックス、炭酸カルシウムなど)に固定して使用すればリパーゼが安定化され、繰り返し反応や長時問の連続使用を行っても再現性よく酵素活性が維持できる。遊離型酵素を使用するときは、一旦酵素を水に溶解し、酵素水溶液を所定の酵素量になるように反応液中に添加するのが好ましい。また、固定化酵素を使用するときには反応系に水を加える必要はなく酵素および基質を含む反応混合液を用いればよい。しかし、リパーゼの使用形態については特に制限されるものではない。 The lipase may be used in a free form, but if used by fixing it to a fixing agent (ion exchange resin, porous resin, ceramics, calcium carbonate, etc.), the lipase will be stabilized, and repeated reactions and long-term Enzyme activity can be maintained with good reproducibility even after continuous use. When a free enzyme is used, it is preferable that the enzyme is once dissolved in water and an aqueous enzyme solution is added to the reaction solution so as to have a predetermined enzyme amount. Moreover, when using an immobilized enzyme, it is not necessary to add water to the reaction system, and a reaction mixture containing the enzyme and the substrate may be used. However, the use form of lipase is not particularly limited.
また、使用する酵素としてのリパーゼの量は、反応時間や反応温度などの反応条件により決定されるため特に規定されないが、一般的には反応混液lg当たり1単位(U)〜50,000U、好ましくは1U〜10,000U添加すればよく、適宜設定することができる。ここで、1Uとは、オリーブ油の加水分解反応において1分間に1μmo1の脂肪酸を遊離する酵素量である。 The amount of lipase as an enzyme to be used is not particularly defined because it is determined by reaction conditions such as reaction time and reaction temperature, but generally 1 unit (U) to 50,000 U per lg of reaction mixture, preferably What is necessary is just to add 1U-10,000U, and it can set suitably. Here, 1U is the amount of enzyme that liberates 1 μmol of fatty acid per minute in the hydrolysis reaction of olive oil.
第1の精製方法: 共役リノール酸異性体(CLA)混合物を構成成分としたグリセリドの選択的加水分解反応を利用する方法
＜選択的加水分解反応を利用したc9,tll-CLAとtlO,c12-CLAの精製＞
選択的加水分解に用いるリパーゼは、2つの異性体(c9,t11-CLAとt10,c12-CLA)に対する活性に大きな差を有する酵素であれぱ、微生物、動物、植物いずれの起源であっても良い。好ましくはCandida rugosaのリパーゼ(リパーゼOF,名糖産業;リパーゼAY,天野エンザイムなど)、Geotrichum candidumのリパーゼ、Pseudomonas属やBurkholderia属のリパーゼなどが好ましい。リパーゼの使用形態等は遊離型のままでもよいが、固定化剤(イオン交換樹脂、多孔性樹脂、セラミックス、炭酸カルシウムなど)に固定したものを用いてもよい。なお遊離型酵素を使用するときは、一旦酵素を水に溶かし、酵素水溶液を所定の酵素量になるように反応液中に添加するのが好ましい。
First purification method: A method using a selective hydrolysis reaction of glycerides comprising a conjugated linoleic acid isomer (CLA) mixture as a constituent <c9, tll-CLA and tlO, c12- using a selective hydrolysis reaction Purification of CLA>
The lipase used for selective hydrolysis is an enzyme with a large difference in activity against the two isomers (c9, t11-CLA and t10, c12-CLA), regardless of whether it originates from microorganisms, animals or plants. good. Preferred are Candida rugosa lipase (lipase OF, famous sugar industry; lipase AY, Amano enzyme, etc.), Geotrichum candidum lipase, Pseudomonas genus and Burkholderia lipase. The lipase may be used in a free form, or a lipase immobilized on a fixing agent (ion exchange resin, porous resin, ceramics, calcium carbonate, etc.) may be used. When a free enzyme is used, it is preferable that the enzyme is once dissolved in water and an aqueous enzyme solution is added to the reaction solution so as to have a predetermined enzyme amount.
使用するリパーゼ量は、反応時間や反応温度などの反応条件により決定されるため特に規定されないが、好ましくは反応混液1g当たり0.1単位(U)〜10,000U、より好ましくは1U〜1,000U添加すればよく、適宜設定することができる（lU＝前記に定義の通り）。また、通常グリセリド量に対して1〜1000重量%（好ましくは20〜800重量%）の水分量、5〜70℃（好ましくは20〜50℃）の温度条件で30分〜150時間（好ましくは2〜72時間）、振とうまたは攪拌することにより加水分解反応が進行する。
リパーゼによるグリセリドの加水分解率は、次式によって算出することができる。加水分解率(%)＝（Ｂ／Ａ）×100
（Ａ:基質として用いたグリセリドを構成している脂肪酸のモル量
Ｂ:反応によって遊離してきた遊離脂肪酸のモル量）
The amount of lipase to be used is not particularly defined because it is determined by reaction conditions such as reaction time and reaction temperature, but preferably 0.1 unit (U) to 10,000 U, more preferably 1 U to 1,000 U per 1 g of the reaction mixture. Well, it can be set as appropriate (lU = as defined above). In addition, the water content is usually 1 to 1000% by weight (preferably 20 to 800% by weight) with respect to the amount of glyceride, and the temperature is 5 to 70 ° C. (preferably 20 to 50 ° C.) for 30 minutes to 150 hours (preferably 2 to 72 hours), the hydrolysis reaction proceeds by shaking or stirring.
The hydrolysis rate of glyceride by lipase can be calculated by the following formula. Hydrolysis rate (%) = (B / A) × 100
(A: molar amount of fatty acid constituting the glyceride used as a substrate
B: molar amount of free fatty acid released by reaction)
加水分解に用いる基質としてのグリセリドは、共役リノール酸の各異性体を含むものであれば特に制限はなく、共役リノール酸異性体の遊離体混合物をエステル化して得られたグリセリドを使用するのが実用的である。具体的には例えば、共役リノール酸としてc9,t11およびt1O,c12-CLA異性体をそれぞれ等量（例えば各30%以上）含む遊離脂肪酸の混合物をグリセリンでエステル化して得たグリセリドを使用することができる。エステル化は一般的な方法を使用できるが、後述するグリセリドの調製法および第２の精製方法におけるエステル化反応に準じて行うことができる。なお、このエステル反応において、トリグリセリドを主成分とするグリセリドを合成しやすい酵素、例えばRhizomucor miehei、Rhizopus oryzae、Rhizopus niveus、Thermomyces lanuginosa、Candida antarcticaのリパーゼ等の使用が好ましい。 The glyceride as a substrate used for the hydrolysis is not particularly limited as long as it contains each isomer of conjugated linoleic acid, and glyceride obtained by esterifying a free mixture of conjugated linoleic acid isomers is used. It is practical. Specifically, for example, using a glyceride obtained by esterifying a mixture of free fatty acids containing equal amounts of c9, t11 and t1O, c12-CLA isomers (for example, 30% or more each) as conjugated linoleic acid with glycerin Can do. A general method can be used for esterification, but the esterification can be performed according to the esterification reaction in the glyceride preparation method and the second purification method described later. In this ester reaction, it is preferable to use an enzyme that can easily synthesize glycerides mainly composed of triglycerides, such as lipases of Rhizomucor miehei , Rhizopus oryzae , Rhizopus niveus , Thermomyces lanuginosa , and Candida antarctica .
加水分解の基質として用いるグリセリドは、例えば後記調製例１のグリセリド標品（両異性体の割合は遊離脂肪酸混合物中の割合とほぼ同じ）を使用することができる。上述のようにして得られるグリセリド中の共役リノール酸グリセリド含量は、グリセリド中の全脂肪酸含量に対する共役リノール酸含量換算で、一般的に10〜95%、好ましくは50〜95%、より好ましくは60〜95%、さらに好ましくは70〜95%程度であり、より実用的には50〜85%程度であり（グリセリド中のc9,t11-およびt10,c12-両異性体の相互含量はほぼ等量）、残りの成分は共役リノール酸以外の脂肪酸（オレイン酸等の他の脂肪酸、非共役リノール酸）のグリセリドおよび遊離脂肪酸である。このようなグリセリドを加水分解の基質として用いるとき、c9,t11-CLAを基質として認識し易いリパーゼ、好ましくはCandida rugosa、Geotrichum candidumなどのリパーゼの使用が有効である。上記第１の精製方法に記載した条件下で加水分解率を通常50%以下、好ましくは40%以下、さらに好ましくは30%以下の低分解率に抑えることにより（例えばCLAグリセリドと水の等量混合物に混液1ｇ当たり0.5〜5.0UのCandida rugosaのリパーゼを加え、30〜45℃で10〜48時間撹拌しながら、反応を行うことにより）、遊離脂肪酸画分のc9,tll-CLAの純度（c9,tll-CLA含量とt1O,c12-CLA含量の合計に対するc9,t11-CLAの含量であり、以下特に断らない限り単にc9,t11-CLAの純度という）を70%以上に高めることができる。なおこの際、加水分解率の下限は好ましくは5〜10%程度である。一方、tlO,cl2-CLAはこの選択的加水分解により未反応のグリセリド画分に濃縮することができる。加水分解率を60〜80%に制御すると、未分解グリセリド中のtlO,c12-CLA純度(c9,11-CLA含量とt10,c12-CLA含量の合計に対するtlO,c12-CLAの含量であり、以下特に断らない限り単にtlO,cl2-CLAの純度という)を70%以上に高めることができる。ここで、上記２種の異性体以外の共役リノール酸異性体の含量は、通常共役リノール酸含有脂肪酸中1%程度である。 As the glyceride used as a substrate for hydrolysis, for example, the glyceride preparation of Preparation Example 1 described later (the ratio of both isomers is almost the same as the ratio in the free fatty acid mixture) can be used. The conjugated linoleic acid glyceride content in the glyceride obtained as described above is generally 10 to 95%, preferably 50 to 95%, more preferably 60 in terms of the conjugated linoleic acid content relative to the total fatty acid content in the glyceride. ~ 95%, more preferably about 70-95%, more practically about 50-85% (the mutual contents of c9, t11- and t10, c12-both isomers in glycerides are almost equal) ), The remaining components are glycerides and free fatty acids of fatty acids other than conjugated linoleic acid (other fatty acids such as oleic acid, non-conjugated linoleic acid). When such a glyceride is used as a hydrolysis substrate, it is effective to use a lipase that can easily recognize c9, t11-CLA as a substrate, preferably a lipase such as Candida rugosa or Geotrichum candidum . By controlling the hydrolysis rate to a low decomposition rate of usually 50% or less, preferably 40% or less, more preferably 30% or less under the conditions described in the first purification method (for example, the equivalent amount of CLA glyceride and water) By adding 0.5 to 5.0 U of Candida rugosa lipase per gram of the mixture and stirring for 10 to 48 hours at 30 to 45 ° C.), the purity of the free fatty acid fraction c9, tll-CLA ( The content of c9, t11-CLA relative to the sum of c9, tll-CLA content and t1O, c12-CLA content. Unless otherwise specified, the purity of c9, t11-CLA can be increased to 70% or more. . In this case, the lower limit of the hydrolysis rate is preferably about 5 to 10%. On the other hand, tlO, cl2-CLA can be concentrated to an unreacted glyceride fraction by this selective hydrolysis. When the hydrolysis rate is controlled to 60-80%, the tlO, c12-CLA purity in the undegraded glyceride (the content of tlO, c12-CLA relative to the sum of the c9,11-CLA content and the t10, c12-CLA content, Hereinafter, the purity of tlO and cl2-CLA) can be increased to 70% or more unless otherwise specified. Here, the content of conjugated linoleic acid isomers other than the two isomers is usually about 1% in the conjugated linoleic acid-containing fatty acid.
c9,t11-CLAおよびt10,c12-CLAの分画は反応速度に依存する。すなわち加水分解率を低く抑える程、遊離脂肪酸画分のc9,tll-CLA純度を高めることができる。効率よくc9,t11-CLAをグリセリドから遊離させることができれば、t10,c12-CLAをより高濃度にグリセリド画分に濃縮することができる。すなわち、選択的加水分解を低分解率で繰り返すことにより、未分解グリセリド中のtlO,c12-CLA純度を高めることができる。一例として、まず1回目の加水分解率を30%に制御し、反応液を遊離脂肪酸とグリセリドに分画する。次いで得られたグリセリドを基質として2回目の加水分解を行い、この加水分解率を40〜50%に制御すると、未分解グリセリド中のt10,cl2-CLA純度を80%以上に高めることも可能となる。なお、反応液中に含まれている遊離脂肪酸とグリセリドの分画には、通常の分子蒸留、ヘキサン分画、クロマトグラフィーなどの方法を単独または組合せて採用することができる。 The fractionation of c9, t11-CLA and t10, c12-CLA depends on the reaction rate. That is, the lower the hydrolysis rate, the higher the purity of the free fatty acid fraction c9, tll-CLA. If c9, t11-CLA can be efficiently released from glycerides, t10, c12-CLA can be concentrated in a higher concentration in the glyceride fraction. That is, by repeating selective hydrolysis at a low decomposition rate, the purity of tlO, c12-CLA in undegraded glycerides can be increased. As an example, the first hydrolysis rate is controlled to 30%, and the reaction solution is fractionated into free fatty acids and glycerides. Next, by performing the second hydrolysis using the obtained glyceride as a substrate and controlling the hydrolysis rate to 40-50%, it is possible to increase the purity of t10, cl2-CLA in undegraded glyceride to 80% or more. Become. For fractionation of free fatty acid and glyceride contained in the reaction solution, usual methods such as molecular distillation, hexane fractionation, chromatography and the like can be employed alone or in combination.
＜t10,c12-CLAを高含有する遊離脂肪酸の調製＞
上述した方法で得たt10,c12-CLAを高含有するグリセリドを加水分解することによりt10,c12-CLAを高含有する遊離脂肪酸を製造することができる。加水分解は、エタノールの存在下での通常のケン化分解を採用してもよいし、リパーゼを触媒とした加水分解法を採用してもよい。リパーゼを使用するときには、c9,tll-CLAよりt10,c12-CLAに対して高い活性を示す酵素（例えばPseudomonas属、Burkholderia属など）、あるいはc9,tll-CLAとt1O,c12-CLAに対して選択性を示さない酵素（例えばRhizomucor属、Rhizopus属、Thermomyces属など）の使用が好ましいが、高い加水分解率(80%以上、好ましくは90%以上)が得られる反応系を構築する場合には（例えば大過剰の酵素を使用したり、反応時間を延長する等の条件で反応を行う）、酵素の脂肪酸異性体特異性にこだわる必要はなく非選択的に加水分解を行うことができる。従って、リパーゼは微生物、動物、植物起源のいずれの産業用酵素でもこの反応に使用することができ、遊離型酵素でもよいし、固定化した酵素を使用してもよい。また、この加水分解反応の条件は、基本的に前述した選択的加水分解反応と同様の条件を用いることができる。
<Preparation of free fatty acid with high content of t10, c12-CLA>
A free fatty acid containing a high content of t10, c12-CLA can be produced by hydrolyzing a glyceride containing a high content of t10, c12-CLA obtained by the method described above. For the hydrolysis, normal saponification decomposition in the presence of ethanol may be employed, or a hydrolysis method using lipase as a catalyst may be employed. When using lipase, it is more active against t10, c12-CLA than c9, tll-CLA (eg Pseudomonas genus, Burkholderia genus), or against c9, tll-CLA and t1O, c12-CLA The use of enzymes that do not exhibit selectivity (eg Rhizomucor genus, Rhizopus genus, Thermomyces genus, etc.) is preferable, but when constructing a reaction system that provides a high hydrolysis rate (80% or more, preferably 90% or more). (For example, the reaction is carried out under conditions such as using a large excess of enzyme or extending the reaction time), it is not necessary to stick to the fatty acid isomer specificity of the enzyme, and the hydrolysis can be carried out non-selectively. Therefore, the lipase can be used for this reaction with any industrial enzyme of microbial, animal or plant origin, and may be a free enzyme or an immobilized enzyme. Moreover, the conditions for this hydrolysis reaction can be basically the same as those for the selective hydrolysis reaction described above.
＜c9,t11-CLAを高含有するグリセリドの調製＞
前述した方法で得たc9,t11-CLAを高含有する遊離脂肪酸とグリセリンをエステル化することによりc9,t11-CLA高含有のグリセリドを製造することができる。エステル化は、一般的に採用されているアルカリ触媒を用いた化学法を採用することもできるが、CLAの不安定性を考慮すると、温和な条件下、窒素気流下でも反応が効率よく進行する酵素法が好ましい。このエステル化反応には微生物、動物、植物起源のいずれの産業用酵素も利用することができるが、高いエステル化率が得られ、かつc9,t11-CLAを基質としてよく認識するRhizopus oryzae、Rhizopus niveus、Rhizomucor miehei、Thermomyces 1anuginosa、Candida antarctica、Alcaligenes sp.由来のリパーゼなどが好ましい。また、反応系中の水を除去するとエステル化は効率よく進行するため、窒素の吹き込み、あるいは減圧下（通常0.1〜100mmHg程度）で脱水しながら行う反応が有効である。従って、このエステル化反応には遊離型酵素、固定化酔素のいずれも使用できるが、固定化酵素を用いた方がより好ましい。
<Preparation of glyceride with high content of c9, t11-CLA>
A glyceride with a high content of c9, t11-CLA can be produced by esterifying the free fatty acid with a high content of c9, t11-CLA and glycerin obtained by the method described above. For esterification, a chemical method using a commonly used alkali catalyst can be adopted, but considering the instability of CLA, an enzyme that allows the reaction to proceed efficiently even under a nitrogen stream under mild conditions. The method is preferred. Rhizopus oryzae , Rhizopus , which can use any industrial enzyme of microbial, animal, or plant origin for this esterification reaction, but has a high esterification rate and well recognizes c9, t11-CLA as a substrate Preferred are lipases derived from niveus , Rhizomucor miehei , Thermomyces 1anuginosa , Candida antarctica , Alcaligenes sp . Further, since the esterification proceeds efficiently when water in the reaction system is removed, a reaction carried out while dehydrating under nitrogen blowing or under reduced pressure (usually about 0.1 to 100 mmHg) is effective. Therefore, either a free enzyme or an immobilized dihydrogen can be used for this esterification reaction, but it is more preferable to use an immobilized enzyme.
基質として用いるグリセリン量は遊離脂肪酸量に対して通常1/3〜10モル量、好ましくは1/3〜5モル量である。酵素量は反応液1g当たり1〜10000U、好ましくは10〜5000U添加すればよく、適宜設定することができる。反応温度は5〜70℃（好ましくは25〜60℃）で反応時間は30分〜150時間（好ましくは30分〜72時間）が望ましい。反応形態は攪拌しながら行ってもよいし、固定層型リアクターを用いた連続反応を行ってもよい。上記のような条件下で、エステル化率は90%以上に達成し得る。
なお本発明において、エステル化率は次式によって算出することができる。
エステル化率(%)＝［（Ａ−Ｂ）／Ａ］×１００
（Ａ：反応前の反応混液中に存在する遊離脂肪酸のモル量
Ｂ：反応後の反応混液中に存在する遊離脂肪酸のモル量）
The amount of glycerin used as a substrate is usually 1/3 to 10 mol, preferably 1/3 to 5 mol, relative to the amount of free fatty acid. The amount of the enzyme may be appropriately set by adding 1 to 10000 U, preferably 10 to 5000 U, per 1 g of the reaction solution. The reaction temperature is desirably 5 to 70 ° C. (preferably 25 to 60 ° C.), and the reaction time is desirably 30 minutes to 150 hours (preferably 30 minutes to 72 hours). The reaction form may be carried out with stirring, or a continuous reaction using a fixed bed reactor may be carried out. Under the conditions as described above, the esterification rate can be achieved to 90% or more.
In the present invention, the esterification rate can be calculated by the following formula.
Esterification rate (%) = [(A−B) / A] × 100
(A: molar amount of free fatty acid present in the reaction mixture before reaction
B: molar amount of free fatty acid present in the reaction mixture after the reaction)
反応液からグリセリドを精製するための脱酸は、油脂の精製に一般的に利用されている蒸留法やアルカリ脱酸法、あるいはこれらを組み合わせた方法を利用することができる。上記のような方法により、c9,tll-CLAを70%以上（c9,tll-およびt10,cl2-異性体の全量に対して）含有するグリセリドを得ることができる。 Deoxidation for purifying glyceride from the reaction solution can be performed by a distillation method, an alkaline deoxidation method, or a combination of these methods that are generally used for oil and fat purification. By the method as described above, a glyceride containing 70% or more of c9, tll-CLA (relative to the total amount of c9, tll- and t10, cl2-isomers) can be obtained.
第２の精製方法: 共役リノール酸異性体混合物と食品加工に利用できるアルコールとの選択的エステル化を利用する方法
アルコールは食品に使用可能なものであれば制限されるものではないが、メントール、ステロール、グリセリンなどが好ましい例としてあげられる。
Second purification method: A method using selective esterification of a conjugated linoleic acid isomer mixture and an alcohol that can be used for food processing. Alcohol is not limited as long as it can be used for food, but menthol, Preferred examples include sterol and glycerin.
＜c9,tll-CLAとt10,cl2-CLAの分画＞
エステル合成反応（基質が遊離脂肪酸）またはエステル交換反応（基質がグリセリド）を行うための反応混液中のアルコール（好ましくはL-メントールまたはステロール）と共役リノール酸混合物のモル比は、通常1:10〜10:1、好ましくは1:5〜5:1であるが、原料の種類や反応性の程度に応じて上記以外のモル比も使用し得る。
<Fractionation of c9, tll-CLA and t10, cl2-CLA>
The molar ratio of alcohol (preferably L-menthol or sterol) and conjugated linoleic acid mixture in the reaction mixture for conducting ester synthesis reaction (substrate is free fatty acid) or transesterification reaction (substrate is glyceride) is usually 1:10. -10: 1, preferably 1: 5-5: 1, but other molar ratios may be used depending on the type of raw material and the degree of reactivity.
触媒として用いる酵素は、選択的加水分解に用いた酵素と同様、c9,t11-CLAとt10,cl2-CLAに対する活性に大きな差を有する酵素であれば、微生物、動物、植物いずれの起源であっても良い。好ましくはCandida rugosaのリパーゼ（リパーゼOF,名糖産業;リパーゼAY, 天野エンザイム等）、Geotrichum candidumのリパーゼ、Pseudomonas属やBurkholderia属のリパーゼ、さらに好ましくはc9,t11-CLAをよく認識し、t10,c12-CLAを認識しにくいCandida rugosa、Geotrichum candidum由来のリパーゼなどの使用が望ましい。これらの酵素は遊離型酵素を用いてもよいし、固定化したものを用いてもよい。 The enzyme used as a catalyst is the same as the enzyme used for selective hydrolysis as long as it has a large difference in activity against c9, t11-CLA and t10, cl2-CLA. May be. Preferably, Candida rugosa lipase (lipase OF, famous sugar industry; lipase AY, Amano Enzyme etc.), Geotrichum candidum lipase, Pseudomonas genus and Burkholderia lipase, more preferably c9, t11-CLA are recognized well, t10, It is desirable to use a lipase derived from Candida rugosa or Geotrichum candidum that does not recognize c12-CLA. As these enzymes, free enzymes may be used, or immobilized enzymes may be used.
上記リパーゼを反応液1g当たり1〜10000U、好ましくは10〜5000U、より好ましくは20〜2000U程度用い、基質量に対して好ましくは1〜500重量%の水分量、より好ましくは5〜100重量%の水分量下、5〜70℃（好ましくは25〜50℃）の温度条件で30分〜150時間（好ましくは5〜72時間）、振とうまたは攪拌することによりエステル化またはエステル交換反応を行うことができる。なお、反応系中の水を除去するとエステル化は効率よく進行することもあるため、窒素の吹き込み、あるいは減圧下で脱水しながら行ってもよい。また、固定化酵素による固定層型リアクターを用いた連続反応を行てもよく、固定化酵素を用いる場合には反応系に水分は含まれる必要がない。 The above lipase is used in an amount of 1 to 10000 U, preferably 10 to 5000 U, more preferably about 20 to 2000 U per gram of reaction solution, preferably 1 to 500% by weight of water, more preferably 5 to 100% by weight with respect to the base mass The esterification or transesterification reaction is carried out by shaking or stirring for 30 minutes to 150 hours (preferably 5 to 72 hours) at 5 to 70 ° C. (preferably 25 to 50 ° C.) under a water content of be able to. In addition, since the esterification may proceed efficiently when water in the reaction system is removed, the esterification may be performed while blowing nitrogen or dehydrating under reduced pressure. Moreover, you may perform the continuous reaction using the fixed bed type | mold reactor by an immobilized enzyme, and when using an immobilized enzyme, it is not necessary to contain a water | moisture content in a reaction system.
c9,tll-CLAをよく認識し、t10,c12-CLAを認識しにくいリパーゼ、例えばCandida rugosa、Geotrichum candidum由来のリパーゼを触媒とするCLA異性体混合物の選択的エステル化反応において、一般的に、エステル化率を低く制御するとエステル画分のc9,t11-CLAの含量を高めることができ、未反応の遊離脂肪酸画分に濃縮されるt10,c12-CLA含量は30〜70%のエステル化率のときに最大値に達する。例えば、Candida rugosaリパーゼを触媒としたCLA異性体混合物とL-メントールとの選択的エステル化反応では、エステル化率を35%以下に制御すると、エステル画分におけるc9,tl1-CLAの純度を90%以上に高めることができ、エステル化率を40〜50%に制御すると、未反応の脂肪酸画分のt10,c12-CLA純度は最大値(84%程度)を示す。エステル化率を上記のように制御するためには、例えばL-メントールとCLA異性体混合物（1:1、モル比)、10〜30%水、および反応液1gあたり10〜500Uのリパーゼからなる反応液を25〜40℃で5〜72hr撹拌しながら反応を行えばよい。 In a selective esterification reaction of a mixture of CLA isomers catalyzed by a lipase that recognizes c9, tll-CLA well and does not recognize t10, c12-CLA, for example, Candida rugosa , Geotrichum candidum , By controlling the esterification rate low, the content of c9, t11-CLA in the ester fraction can be increased, and the content of t10, c12-CLA concentrated in the unreacted free fatty acid fraction is 30-70%. When the maximum value is reached. For example, in a selective esterification reaction between a CLA isomer mixture and L-menthol catalyzed by Candida rugosa lipase, the purity of c9, tl1-CLA in the ester fraction is 90% when the esterification rate is controlled to 35% or less. When the esterification rate can be controlled to 40-50%, the t10, c12-CLA purity of the unreacted fatty acid fraction shows the maximum value (about 84%). In order to control the esterification rate as described above, for example, it consists of L-menthol and CLA isomer mixture (1: 1, molar ratio), 10-30% water, and 10-500 U lipase per gram of reaction solution. The reaction may be performed while stirring the reaction solution at 25 to 40 ° C. for 5 to 72 hours.
なお、上記の反応液中に存在するメントール、遊離脂肪酸、メンチルエステルは、通常行われている蒸留、n-ヘキサン抽出（ヘキサン−アルカリ分配法など）、各種のクロマトグラブィー、尿素付加などを単独でまたは組み合わせた方法により分画することができる。 The menthol, free fatty acid, and menthyl ester present in the above reaction solution can be obtained by performing ordinary distillation, n-hexane extraction (hexane-alkali partition method, etc.), various chromatograms, urea addition, etc. alone. Alternatively, fractionation can be performed by a combined method.
＜c9,tll-CLAとtlO,c12-CLAの高純度化＞
遊離脂肪酸画分中のt10,c12-CLA純度をさらに高めたいときには、エステル化の反応液から回収した遊離脂肪酸を原料としてもう一度選択的エステル化反応を繰り返せばよい。
アルコール（L-メントールあるいはステロールなど）に結合した脂肪酸はメタノールあるいはエタノール存在下でのケン化分解、あるいはリパーゼを触媒とした加水分解により遊離脂肪酸に戻すことができる。特に、ステロールに結合した脂肪酸はリパーゼで容易に加水分解される。なお、t10,c12-CLAよりc9,t11-CLAに対して強い加水分解活性を有するリパーゼ（Candida rugosa、Geotrichum candidumのリパーゼなど）を選択すると、加水分解前のエステル（メンチル、ステリルエステルなど）中のc9,t11-CLA含量より高い純度の遊離脂肪酸（c9,tll-CLA）を調製することもできる。この酵素法による加水分解の条件は、基本的に前記第１の方法（加水分解）で述べた条件を採用することができる。
エステル化反応とエステル（メンチルまたはステリルエステルなど)の加水分解によって得られた遊離脂肪酸を原料として、選択的エステル化反応を1回以上繰り返すことにより、c9,tll-CLAの純度をさらに高めることも可能である。
この様にして得られた各CLA異性体を高濃度含有する脂肪酸は食品に応用することができる。
<High purity of c9, tll-CLA and tlO, c12-CLA>
In order to further increase the purity of t10, c12-CLA in the free fatty acid fraction, the selective esterification reaction may be repeated once again using the free fatty acid recovered from the esterification reaction solution as a raw material.
Fatty acids bound to alcohols (such as L-menthol or sterol) can be converted back to free fatty acids by saponification decomposition in the presence of methanol or ethanol, or hydrolysis using lipase as a catalyst. In particular, fatty acids bound to sterols are easily hydrolyzed by lipases. If a lipase (such as Candida rugosa or Geotrichum candidum lipase) that has a stronger hydrolysis activity against c9, t11-CLA than t10, c12-CLA is selected, it will be in the ester (menthyl, steryl ester, etc.) before hydrolysis. It is also possible to prepare free fatty acids (c9, tll-CLA) having a purity higher than that of c9, t11-CLA. Basically, the conditions described in the first method (hydrolysis) can be adopted as the conditions for hydrolysis by the enzymatic method.
It is possible to further increase the purity of c9, tll-CLA by repeating the selective esterification reaction one or more times using the free fatty acid obtained by esterification and hydrolysis of the ester (such as menthyl or steryl ester) as a raw material. Is possible.
The fatty acid containing a high concentration of each CLA isomer thus obtained can be applied to food.
＜c9,tll-CLAとt10,c12-CLAの高純度異性体を含有するグリセリドの製造＞
上述の方法で精製した高純度CLA異性体とグリセリンをエステル化すると、各異性体を高濃度に含有するグリセリド、すなわち、c9,t11-CLAまたはt10,c12-CLAのいずれかの含量が相対的に高い食品用のグリセリドを製造することができる。なお、グリセリドの製造は、基本的に［００２７］、［００３１］〜［００３３］のグリセリドの調製およびエステル化の方法に準じて行うことができる。
<Production of glycerides containing high-purity isomers of c9, tll-CLA and t10, c12-CLA>
When esterifying high purity CLA isomers purified by the above method and glycerin, the content of either glycerides containing high concentrations of each isomer, i.e., c9, t11-CLA or t10, c12-CLA, is relatively High glycerides for food can be produced. In addition, manufacture of a glyceride can be fundamentally performed according to the method of preparation and esterification of the glyceride of [0027] and [0031]-[0033].
以上のように、本発明は共役リノール酸異性体（遊離体およびグリセリドエステル体）の精製方法に関し、代表的な態様において、第１の方法（加水分解反応）および第２の方法（エステル化反応）の単回あるいはくり返しにより、c9,t11-およびt10,c12-の各共役リノール酸異性体を高純度（両異性体全量に対して通常70%以上、例えば70〜95%；脂肪酸混合生成物全量に対して通常30〜95%、好ましくは50〜95%、より好ましくは60〜95%、さらに好ましくは70〜95%程度であり、より実用的には45〜85%程度）で含む遊離脂肪酸およびそれらのグリセリド（グリセリドにおける脂肪酸全量中の両共役リノール酸異性体含量（通常30〜95%、好ましくは50〜95%、より好ましくは60〜95%、さらに好ましくは70〜95%程度であり、実用的には45〜85%程度）および両異性体全量に対する各異性体の割合（通常70%以上、例えば70〜95%程度）は上記遊離脂肪酸の場合とほぼ同じ。グリセリド生成物中の共役リノール酸グリセリド含量は通常30〜95%、好ましくは50〜95%程度であり、より実用的には45〜85%程度であり、残りの成分は遊離脂肪酸等である。）を高収率（一般に35〜60%またはそれ以上）で得ることができる。ここで、収率とは、基質としての共役リノール酸異性体混合物（遊離体またはグリセリドエステル体）の全量に対する目的の生成共役リノール酸各異性体またはその各グリセリド体の割合をいう。なお、本発明で得られた上記共役リノール酸異性体含有脂肪酸およびグリセリドの含量割合に関し、共役リノール酸異性体含有脂肪酸の場合は、共役リノール酸以外の成分は他の脂肪酸（パルミチン酸等）および未転化リノール酸等であり、エステル体の場合は、共役リノール酸エステル以外の成分は上記他の脂肪酸および未転化リノール酸のエステルおよび遊離脂肪酸等である。 As described above, the present invention relates to a method for purifying conjugated linoleic acid isomers (free form and glyceride ester form), and in a typical embodiment, the first method (hydrolysis reaction) and the second method (esterification reaction). C9, t11- and t10, c12- conjugated linoleic acid isomers with high purity (usually 70% or more, for example 70-95%, based on the total amount of both isomers) 30 to 95%, preferably 50 to 95%, more preferably 60 to 95%, still more preferably about 70 to 95%, more practically about 45 to 85% of the total amount Fatty acids and their glycerides (both conjugated linoleic acid isomer content in the total amount of fatty acids in glycerides (usually 30 to 95%, preferably 50 to 95%, more preferably 60 to 95%, more preferably about 70 to 95%) Yes, practically about 45-85%) and the total amount of both isomers The ratio of each isomer to the isomers (usually 70% or more, for example, about 70 to 95%) is almost the same as that of the above free fatty acid.The glyceride content of conjugated linoleic acid in the glyceride product is usually 30 to 95%, preferably 50 to It is about 95%, more practically about 45 to 85%, and the remaining components are free fatty acids and the like.) In a high yield (generally 35 to 60% or more). Here, the yield refers to the ratio of each isomer of the desired conjugated linoleic acid or each glyceride thereof to the total amount of the conjugated linoleic acid isomer mixture (free or glyceride ester) as a substrate. Regarding the content ratio of the conjugated linoleic acid isomer-containing fatty acid and glyceride obtained in the present invention, in the case of the conjugated linoleic acid isomer-containing fatty acid, components other than conjugated linoleic acid include other fatty acids (such as palmitic acid) and Unconverted linoleic acid or the like, and in the case of an ester form, the components other than the conjugated linoleic acid ester are the other fatty acid and the ester of unconverted linoleic acid and free fatty acid.
上記のようにして得られる共役リノール酸異性体（遊離脂肪酸またはグリセリド）は食品に応用することができる。従って、本発明は、脂肪および健康成分を含む食品であって、健康成分が上記の共役リノール酸異性体から選択される１種以上である食品にも関する。脂肪を含む食品は、脂肪が配合された食品であれば特に限定されないが、例えばスプレッド、マーガリン、クリーム、ドレッシング、マヨネーズ、チーズ、アイスクリーム、べ一カリー食品、乳幼児食、育児粉乳、チョコレート、菓子、ソース、コーティング、スープ等があげられる。本発明において、上記のような食品中に配合される共役リノール酸異性体（遊離脂肪酸またはグリセリド）の配合量は通常、食品全体に対して好ましくは、共役リノール酸異性体含有脂肪酸またはグリセリド（他の脂肪酸を含む）として0.1〜50重量%、好ましくは0.5〜20重量%、共役リノール酸として0.1〜50重量%、好ましくは0.1〜20重量%程度である。 The conjugated linoleic acid isomer (free fatty acid or glyceride) obtained as described above can be applied to food. Therefore, the present invention also relates to a food containing fat and a health ingredient, wherein the health ingredient is one or more selected from the above conjugated linoleic acid isomers. The food containing fat is not particularly limited as long as it is a food containing fat. For example, spread, margarine, cream, dressing, mayonnaise, cheese, ice cream, basic food, infant food, infant formula, chocolate, confectionery , Sauces, coatings, soups. In the present invention, the amount of the conjugated linoleic acid isomer (free fatty acid or glyceride) to be blended in the food as described above is usually preferably the conjugated linoleic acid isomer-containing fatty acid or glyceride (others). 0.1 to 50% by weight, preferably 0.5 to 20% by weight, and conjugated linoleic acid is about 0.1 to 50% by weight, preferably about 0.1 to 20% by weight.
以下は、本発明を実施例により更に具体的に説明するものであり、本発明を限定するものではない。
以下の実施例において、グリセリド組成の分析・測定は、n-ヘキサン:酢酸エチル:酢酸(=90:10:1,容量比)で展開した後、イヤトロスキャンMK-5（ヤトロン）で分析した。脂肪酸組成はDB-23キャピラリーカラム(0.25mm×30m;J&W Scientific)を用いたガスクロマトグラフィーにより分析した。
In the following, the present invention will be described more specifically by way of examples, but the present invention is not limited thereto.
In the following examples, the analysis and measurement of the glyceride composition was developed with n-hexane: ethyl acetate: acetic acid (= 90: 10: 1, volume ratio) and then analyzed with the Eartroscan MK-5 (Yatron). . The fatty acid composition was analyzed by gas chromatography using a DB-23 capillary column (0.25 mm × 30 m; J & W Scientific).
[1] 共役リノール酸トリグリセリドを選択的加水分解して異性体を分画する方法
[調製例１] 共役リノール酸の異性体を構成成分とするトリグリセリドの調製
c9,t11-およびt10,c12-共役リノール酸の混合物(c9,t11-CLA含量,33.1%;t10,cl2-CLA含量,33.9%;（残りは他の脂肪酸（パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸）、未転化リノール酸）等）CLA-80;リノール油脂)1352g、グリセリン148g、および固定化Rhizomucor mieheiリパーゼ（Novozyme 435;ノボザイムズ）75gを3L容量の4つロフラスコに入れ、5mmHgの減圧下、50℃で48時間撹伴しながらインキュベートした(エステル化率,92.3%)。得られた反応液を200℃、0.02mmHgで分子蒸留(Wiprene Type 2-03;神鋼パンテック)し未反応脂肪酸を留分として除去した。残渣画分になお残存していた脂肪酸を除去するために、この残渣を250℃、0.001mmHgで再度分子蒸留して1209gの蒸留残渣を得た。この残渣画分中には86.8 wt%のトリグリセリドと13.2wt%のジグリセリドが含まれ、モノグリセリドと遊離脂肪酸の含量は検出できなかった(O.2wt%以下)。得られたグリセリド標品(以下Gly-CLAと略す)は33.5 wt%のc9,t11-CLAと34.4wt%のt10,c12-CLAを含んでいた。
[1] Method for fractionating isomers by selective hydrolysis of conjugated linoleic acid triglycerides
[Preparation Example 1] Preparation of triglyceride containing isomer of conjugated linoleic acid as a constituent
Mixture of c9, t11- and t10, c12-conjugated linoleic acid (c9, t11-CLA content, 33.1%; t10, cl2-CLA content, 33.9%; (the rest are other fatty acids (palmitic acid, stearic acid, oleic acid ), Unconverted linoleic acid, etc.) CLA-80; linole oil and fat) 1352g, glycerin 148g, and immobilized Rhizomucor miehei lipase (Novozyme 435; Novozymes) 75g were placed in a 4L flask with 3L capacity, 50mmHg under reduced pressure, 50 Incubation was performed for 48 hours at 0 ° C. (esterification rate, 92.3%). The obtained reaction solution was subjected to molecular distillation (Wiprene Type 2-03; Shinko Pantech) at 200 ° C. and 0.02 mmHg to remove unreacted fatty acids as fractions. In order to remove the fatty acid still remaining in the residue fraction, the residue was molecularly distilled again at 250 ° C. and 0.001 mmHg to obtain 1209 g of distillation residue. This residue fraction contained 86.8 wt% triglyceride and 13.2 wt% diglyceride, and the content of monoglyceride and free fatty acid could not be detected (O.2 wt% or less). The obtained glyceride preparation (hereinafter abbreviated as Gly-CLA) contained 33.5 wt% c9, t11-CLA and 34.4 wt% t10, c12-CLA.
[実施例１] Candida rugosaリパーゼによるGly-CLAの加水分解
Gly-CLA3g、水3g、および種々の量のCandida rugosaリパーゼ(リパーゼOF;名糖産業)からなる反応液を30℃で16時間攪拌しながらインキュベートした。反応後、アルカリ条件下でヘキサン抽出し、未分解グリセリドをヘキサン層に回収した。また水層画分に存在した脂肪酸石鹸は塩酸で酸性に戻して遊離体とし、これをヘキサンで抽出した。グリセリドおよび遊離脂肪酸画分の脂肪酸組成を表１に示す。Gly-CLAの加水分解率が低いほど、遊離脂肪酸画分中のc9,t11-CLAの純度は高くなり、また加水分解率が約60%に達したときにグリセリド画分のt10,cl2-CLAの純度は最大値を示した。
[Example 1] Hydrolysis of Gly-CLA by Candida rugosa lipase
A reaction solution composed of 3 g of Gly-CLA, 3 g of water, and various amounts of Candida rugosa lipase (Lipase OF; Meisho Sangyo) was incubated at 30 ° C. with stirring for 16 hours. After the reaction, hexane was extracted under alkaline conditions, and undegraded glycerides were collected in the hexane layer. The fatty acid soap present in the aqueous layer fraction was returned to acidity with hydrochloric acid to give a free product, which was extracted with hexane. Table 1 shows the fatty acid composition of glycerides and free fatty acid fractions. The lower the hydrolysis rate of Gly-CLA, the higher the purity of c9, t11-CLA in the free fatty acid fraction, and t10, cl2-CLA in the glyceride fraction when the hydrolysis rate reaches about 60%. The purity of was the maximum.
表１
酵素量a 加水分解率 画分 CLA含量(wt%) 異性体純度 b (%)
(U/g) (%) c9,tll tlO,c12 c9,tll tlO,c12
0.8 10.1 遊離脂肪酸 51.8 14.2 75.7
グリセリド 30.9 36.7 54.3
1.5 31.5 遊離脂肪酸 50.5 17.2 74.6
グリセリド 24.3 43.6 64.2
3 41.0 遊離脂肪酸 45.3 21.2 68.1
グリセリド 23.8 44.9 65.3
6 61.5 遊離脂肪酸 40.6 24.1 62.7
グリセリド 19.2 52.5 73.2
10 67.7 遊離脂肪酸 36.5 28.2 56.4
グリセリド 19.6 52.6 72.9
30 82.5 遊離脂肪酸 34.0 32.1 51.5
グリセリド 26.1 44.5 63.1
a: リパーゼ1単位(U)とはオリーブ油を基質として用いた30℃での加水分解反応において1分間に1μmolの脂肪酸を遊離する活性である。
b: c9,t11-CLAとtlO,c12-CLAの合計含量に対するc9,t11-CLAあるいはtlO,cl2-CLAの含量をパーセントで表示した。
Table 1
Enzyme amount a hydrolysis rate Fraction CLA content (wt%) isomer purity b (%)
(U / g) (%) c9, tll tlO, c12 c9, tll tlO, c12
0.8 10.1 Free fatty acids 51.8 14.2 75.7
Glycerides 30.9 36.7 54.3
1.5 31.5 Free fatty acids 50.5 17.2 74.6
Glycerides 24.3 43.6 64.2
3 41.0 Free fatty acids 45.3 21.2 68.1
Glyceride 23.8 44.9 65.3
6 61.5 Free fatty acids 40.6 24.1 62.7
Glycerides 19.2 52.5 73.2
10 67.7 Free fatty acids 36.5 28.2 56.4
Glyceride 19.6 52.6 72.9
30 82.5 Free fatty acids 34.0 32.1 51.5
Glycerides 26.1 44.5 63.1
a: One unit of lipase (U) is an activity that liberates 1 μmol of fatty acid per minute in a hydrolysis reaction at 30 ° C. using olive oil as a substrate.
b: The content of c9, t11-CLA or tlO, cl2-CLA was expressed as a percentage of the total content of c9, t11-CLA and tlO, c12-CLA.
[実施例２] CLA異性体の大量分画
Candida rugosaリパーゼを触媒とし、酵素量を制限した反応系を用いた選択的加水分解反応および過剰量の酵素を用いた非選択的加水分解を利用したCLA異性体分画の概略を図1に示し、操作の各段階における物質収支を表2に示す。
調製例1に記載した反応を繰り返して調製したGly-CLAを原料として使用した。第1工程の選択的加水分解はc9,t11-CLA含量の高い遊離脂肪酸を調製する工程である。Gly-CLAを2000g、水を2000g、およびCandida rugosaリパーゼ1.5U/gをリアクター(MDL1OO1;丸菱バイオエンジ)に入れ、30℃、200rpmで16時間攪拌しながらインキュベートした(加水分解率,31.9%)。反応後、静置して得た油層を160℃、0.2mmHgで分子蒸留(Wiprene Type 2-03;神鋼パンテック)し、原料由来のパルミチン酸を多く含む留分1-1(83g)を除去した。次いで残渣画分を190℃、0.05mmHgで分子蒸留し、炭素数18の脂肪酸を多く含む留分1-2(423g)を回収した。留分2-1の酸価は200mgKOH/gでグリセリドの混在は検出できなかった。また、この画分中のc9,tll-CLAおよびt10,c12-CLAの含量はそれぞれ49.3%と18.3%であった(c9,tl1-CLAの純度,73.0%)。
[Example 2] Mass fractionation of CLA isomers
Figure 1 shows an outline of CLA isomer fraction using selective hydrolysis using Candida rugosa lipase as a catalyst and a non-selective hydrolysis using an enzyme with a limited amount of enzyme. Table 2 shows the material balance at each stage of the operation.
Gly-CLA prepared by repeating the reaction described in Preparation Example 1 was used as a raw material. The selective hydrolysis in the first step is a step of preparing a free fatty acid having a high c9, t11-CLA content. Gly-CLA (2000 g), water (2000 g), and Candida rugosa lipase (1.5 U / g) were placed in a reactor (MDL1OO1; Marubishi Bioengineering) and incubated at 30 ° C. and 200 rpm for 16 hours with agitation (hydrolysis rate, 31.9% ). After the reaction, the oil layer obtained by standing was subjected to molecular distillation at 160 ° C and 0.2 mmHg (Wiprene Type 2-03; Shinko Pantech) to remove fraction 1-1 (83 g) rich in raw material-derived palmitic acid did. Next, the residue fraction was subjected to molecular distillation at 190 ° C. and 0.05 mmHg to recover a fraction 1-2 (423 g) containing a large amount of fatty acids having 18 carbon atoms. The acid value of fraction 2-1 was 200 mgKOH / g, and no glyceride was detected. The contents of c9, tll-CLA and t10, c12-CLA in this fraction were 49.3% and 18.3%, respectively (purity of c9, tl1-CLA, 73.0%).
上記の蒸留によって得られた残渣画分には、10.5%の遊離脂肪酸が含まれていたため、これを除去するために210℃、0.01mmHgで再度分子蒸留して1145gの残渣1-3を得た。第2工程はこの残渣を原料として選択的加水分解を行い、t10,c12-CLAをグリセリド画分に濃縮する工程である。残渣1-3に等量の水と反応混液1g当たり15UのCandida rugosaのリパーゼを加え、30℃で24時間加水分解を行った（加水分解率,62.0%）。反応後、油層を190℃、0.02mmHgの分子蒸留で遊離脂肪酸を留分2-1として回収した。得られた残渣中には、まだ12.2%の遊離脂肪酸が含まれていたので、210℃、0.01mmHgでもう一度分子蒸留し52gの留分2-2と343gの残渣2-2に分画した。選択的加水分解を2回繰り返して得られたグリセリド画分(残渣2-2)には14.0%のc9,tll-CLAと57.3%のtl0,cl2-CLAが含まれていた(tl0,c12-CLAの純度,80.4%;トリグリセリド:ジグリセリド:モノグリセリド:遊離脂肪酸=83.0:15.0:1.l:0.9,重量比)。 The residue fraction obtained by the above distillation contained 10.5% of free fatty acid, and in order to remove this, molecular distillation was again performed at 210 ° C. and 0.01 mmHg to obtain 1145 g of residue 1-3. . The second step is a step of performing selective hydrolysis using this residue as a raw material to concentrate t10, c12-CLA into a glyceride fraction. The residue 1-3 was added lipase Candida rugosa in an equal volume of water and the reaction mixture 1g per 15U, was hydrolyzed for 24 hours at 30 ° C. (degree of hydrolysis 62.0%). After the reaction, the oil layer was recovered as a fraction 2-1 by subjecting the oil layer to molecular distillation at 190 ° C. and 0.02 mmHg. Since the obtained residue still contained 12.2% free fatty acid, it was molecularly distilled again at 210 ° C. and 0.01 mmHg, and fractionated into 52 g of fraction 2-2 and 343 g of residue 2-2. The glyceride fraction (residue 2-2) obtained by repeated selective hydrolysis twice contained 14.0% c9, tll-CLA and 57.3% tl0, cl2-CLA (tl0, c12- CLA purity, 80.4%; triglyceride: diglyceride: monoglyceride: free fatty acid = 83.0: 15.0: 1.l: 0.9, weight ratio).
第3工程はグリセリド画分に濃縮されたt10,c12-CLAを加水分解により遊離させる工程である。残渣2-2に等量の水と反応混液1g当たり200UのCandida rugosaのリパーゼを加え、30℃で24時間加水分解を行った(加水分解率,88.8%)。反応後、油層に大豆油200gを加え、200℃、0.02mmHgの分子蒸留で遊離脂肪酸を留分3-1として回収した。この留分の酸価は199.3mg KOH/gで遊離脂肪酸の含量は99.6%であり、13.2%のc9,tll-CLAと58.3%のt10,cl2-CLAを含んでいた(t10,cl2-CLAの純度,81.5%)。 The third step is a step of releasing t10, c12-CLA concentrated in the glyceride fraction by hydrolysis. An equivalent amount of water and 200 U of Candida rugosa lipase per gram of the reaction mixture were added to residue 2-2, and hydrolysis was performed at 30 ° C. for 24 hours (hydrolysis rate, 88.8%). After the reaction, 200 g of soybean oil was added to the oil layer, and free fatty acid was recovered as fraction 3-1 by molecular distillation at 200 ° C. and 0.02 mmHg. The acid value of this fraction was 199.3 mg KOH / g with a free fatty acid content of 99.6%, containing 13.2% c9, tll-CLA and 58.3% t10, cl2-CLA (t10, cl2-CLA Purity, 81.5%).
以上の3工程によりc9,tl1-CLAとt10,c12-CLAを多く含む遊離脂肪酸を効率よく製造することができた。なお、調製例1に示した方法に準ずると、第1工程のc9,t11-CLA高含有遊離脂肪酸をグリセリンでエステル化することができ、c9,t11-CLA高含有グリセリドを製造することもできる。第2工程の産物はt10,c12-CLA高含有グリセリドであることから、両異性体をグリセリド体として製造することも可能である。 Through the above three steps, free fatty acids containing a large amount of c9, tl1-CLA and t10, c12-CLA could be produced efficiently. According to the method shown in Preparation Example 1, the free fatty acid containing c9, t11-CLA in the first step can be esterified with glycerin, and a glyceride containing c9, t11-CLA can be produced. . Since the product of the second step is a glyceride containing a high content of t10, c12-CLA, both isomers can be produced as glycerides.
表２
工程 重量 CLA含量(wt%) 異性体純度(%)
(g) c9,tll tlO,c12 c9,tll tlO,c12
原料(Gly-CLA) 2000 33.7 34.5 49.5 50.6
留分1-1 83 39.7 14.5 73.2 −
留分1-2 423 49.3 18.3 73.0 −
留分1-3 141 − − − −
残渣1-3 1145 23.4 43.5 35.0 65.0
留分2-1 544 28.2 34.4 45.1 54.9
留分2-2 52 − − − −
残渣2-2 343 14.0 57.3 − 80.4
留分3-1 220 13.2 58.3 − 81.5
留分3-2 40 − − − −
残渣3-2 221 − − − −
Table 2
Process Weight CLA content (wt%) Isomeric purity (%)
(g) c9, tll tlO, c12 c9, tll tlO, c12
Raw material (Gly-CLA) 2000 33.7 34.5 49.5 50.6
Fraction 1-1 83 39.7 14.5 73.2 −
Fraction 1-2 423 49.3 18.3 73.0 −
Fraction 1-3 141 − − − −
Residue 1-3 1145 23.4 43.5 35.0 65.0
Fraction 2-1 544 28.2 34.4 45.1 54.9
Fraction 2-2 52 − − − −
Residue 2-2 343 14.0 57.3 − 80.4
Fraction 3-1 220 13.2 58.3 − 81.5
Fraction 3-2 40 − − − −
Residue 3-2 221 − − − −
[2] 共役リノール酸の異性体混合物をメントールでエステル化して異性体を分画する方法
[実施例3] Candida rugosaリパーゼによるCLA異性体混合物のエステル化
CLA異性体混合物とL-メントールを等モルになるように調製した基質4g、水1mL、および種々の量のCandida rugosaリパーゼからなる反応混液を30℃で、16、40、70時間攪拌しながら反応させた。反応後、アルカリ条件下でヘキサン抽出し、メントールとメンチルエステルをヘキサン層に回収した。また水層画分に存在した脂肪酸石鹸は塩酸で酸性に戻して遊離体とし、これをヘキサンで抽出した。エステルを含む画分と遊離脂肪酸画分の脂肪酸組成を表3に示す。Candida rugosaのリパーゼはt10,cl2-CLAよりc9,t11-CLAをよく認識し、c9,t11-CLAはエステル化率が低いほどエステル画分に効率よく濃縮された。一方、t10,c12-CLAは、約45%のエステル化率で最も効率よく未反応遊離脂肪酸画分に濃縮することができた。
この濃縮効果は、既に報告されている同じ酵素を触媒としラウリルアルコールを基質とした選択的エステル化反応(２文献（McNailら（J.Am.Oil Chem.Soc.,76,1265-1268(1999)）および本発明者らの論文（J.Am.Oil Chem.Soc.,79,303-308(2002)）とほぼ同じであった。L-メントールは食品として利用されていることを考慮すると、食品として利用できるCLA異性体を分画する目的にL-メントールを活用することは非常に有効であることが分かった。
[2] Method of esterifying isomer mixture of conjugated linoleic acid with menthol to fractionate isomers
[Example 3] Esterification of CLA isomer mixture with Candida rugosa lipase
Reaction mixture of CLA isomer mixture and L-menthol prepared in equimolar amounts of 4 g of substrate, 1 mL of water, and various amounts of Candida rugosa lipase at 30 ° C with stirring for 16, 40, and 70 hours I let you. After the reaction, hexane was extracted under alkaline conditions, and menthol and menthyl ester were recovered in the hexane layer. The fatty acid soap present in the aqueous layer fraction was returned to acidity with hydrochloric acid to give a free product, which was extracted with hexane. Table 3 shows the fatty acid composition of the ester-containing fraction and the free fatty acid fraction. Candida rugosa lipase recognized c9, t11-CLA better than t10, cl2-CLA, and c9, t11-CLA was more efficiently concentrated in the ester fraction as the esterification rate decreased. On the other hand, t10, c12-CLA was most efficiently concentrated to the unreacted free fatty acid fraction at an esterification rate of about 45%.
This enrichment effect is a selective esterification reaction using the same enzyme that has been reported as a catalyst and lauryl alcohol as a substrate (McNail et al. (J. Am. Oil Chem. Soc., 76 , 1265-1268 (1999 )) And our paper (J. Am. Oil Chem. Soc., 79 , 303-308 (2002)), considering that L-menthol is used as a food. It was found that using L-menthol for the purpose of fractionating CLA isomers that can be used as food is very effective.
表３
酵素量 反応時間 エステル化率 画分 CLA含量(wt%) 異性体純度(%)
(U/g) (h) (%) c9,tll tlO,c12 c9,tll tlO,c12
25 16 8.3 遊離脂肪酸 26.4 37.6 58.8
エステル 75.5 5.9 92.8
40 19.1 遊離脂肪酸 19.4 42.3 68.5
エステル 74.7 6.1 92.5
70 28.7 遊離脂肪酸 14.2 48.3 77.3
エステル 71.9 6.4 91.9
50 16 18.1 遊離脂肪酸 22.9 40.8 64.0
エステル 74.9 6.1 92.5
40 32.8 遊離脂肪酸 12.3 49.5 80.1
エステル 69.8 6.2 91.8
70 38.3 遊離脂肪酸 11.0 52.9 82.8
エステル 63.7 7.1 90.0
100 40 40.2 遊離脂肪酸 10.9 54.2 83.3
エステル 62.0 7.4 89.4
70 45.6 遊離脂肪酸 11.1 58.3 84.0
エステル 55.9 9.7 85.2
200 40 46.0 遊離脂肪酸 11.2 58.6 84.0
エステル 55.0 10.4 84.1
70 53.0 遊離脂肪酸 13.5 60.2 81.7
エステル 49.2 13.8 78.1
Table 3
Enzyme amount Reaction time Esterification rate Fraction CLA content (wt%) Isomeric purity (%)
(U / g) (h) (%) c9, tll tlO, c12 c9, tll tlO, c12
25 16 8.3 Free fatty acids 26.4 37.6 58.8
Ester 75.5 5.9 92.8
40 19.1 Free fatty acids 19.4 42.3 68.5
Esters 74.7 6.1 92.5
70 28.7 Free fatty acids 14.2 48.3 77.3
Esters 71.9 6.4 91.9
50 16 18.1 Free fatty acids 22.9 40.8 64.0
Esters 74.9 6.1 92.5
40 32.8 Free fatty acids 12.3 49.5 80.1
Esters 69.8 6.2 91.8
70 38.3 Free fatty acids 11.0 52.9 82.8
Esters 63.7 7.1 90.0
100 40 40.2 Free fatty acid 10.9 54.2 83.3
Esters 62.0 7.4 89.4
70 45.6 Free fatty acids 11.1 58.3 84.0
Esters 55.9 9.7 85.2
200 40 46.0 Free fatty acid 11.2 58.6 84.0
Ester 55.0 10.4 84.1
70 53.0 Free fatty acids 13.5 60.2 81.7
Esters 49.2 13.8 78.1
[実施例4] Candida rugosaリパーゼによるCLA異性体混合物のエステル化の工程と、合成されたメンチルエステルから脂肪酸を遊離させる工程を組み合わせた方法による異性体の分画方法の概略を図2に示し、操作の各段階における物質収支を表4に示す。 [Example 4] FIG. 2 shows an outline of a method for fractionating an isomer by a method combining a step of esterifying a CLA isomer mixture with Candida rugosa lipase and a step of liberating a fatty acid from the synthesized menthyl ester. Table 4 shows the material balance at each stage of the operation.
第1工程は、c9,tl1-およびt10,cl2-共役リノール酸の混合物をL-メントールで選択的エステル化しtlO,cl2-CLAが濃縮された遊離脂肪酸とc9,tll-CLAが濃縮されたメンチルエステルの調製である。c9,tll-およびt10,c12-共役リノール酸の混合物514g、L-メントール286g(脂肪酸量に対して等モル量)、および反応液lg当たり200UのCandida rugosaリパーゼを2L容量のリアクター(MDS-U;丸菱バイオエンジ)に入れ、30℃、200rpmで48時間攪拌しながらインキュベートした(エステル化率,45.1%)。反応後、静置して得た油層を120℃、3mmHgの単蒸留によりメントールを留出除去し、538gの蒸留残渣を回収した。得られた蒸留残渣に5Lのn-ヘキサンと2Lの0.5N KOH(20%エタノール溶液)を加え、10分間攪拌した後ヘキサン層(エステル画分)と水層を回収した。水層画分には150mLの濃塩酸と5Lのn-ヘキサンを加えて攪拌した後ヘキサン層(遊離脂肪酸画分)を回収した。エステルおよび遊離脂肪酸を含んだへキサン溶液からヘキサンをエバポレーターで除去し、296gのメンチルエステルと224gの遊離脂肪酸を得た。メンチルエステルの構成脂肪酸中には59.4%のc9,t11-CLAと9.6%のt10,c12-CLA(c9,tll-CLAの純度,86.1%)が含まれており、遊離脂肪酸画分には60.0%のt1O,cl2-CLAと11.8%のc9,t11-CLA(t10,cl2-CLAの純度,83,6%)が含まれていた。 The first step is the selective esterification of a mixture of c9, tl1- and t10, cl2-conjugated linoleic acid with L-menthol and free fatty acid enriched in tlO, cl2-CLA and menthyl enriched in c9, tll-CLA. Preparation of the ester. 514 g of a mixture of c9, tll- and t10, c12-conjugated linoleic acid, 286 g of L-menthol (equal molar amount to the amount of fatty acid), and 200 U of Candida rugosa lipase per lg of reaction solution (MDS-U And then incubated with stirring at 30 ° C. and 200 rpm for 48 hours (esterification rate, 45.1%). After the reaction, the oil layer obtained by standing was removed by distilling off menthol by simple distillation at 120 ° C. and 3 mmHg, and 538 g of distillation residue was recovered. To the obtained distillation residue, 5 L of n-hexane and 2 L of 0.5N KOH (20% ethanol solution) were added and stirred for 10 minutes, and then the hexane layer (ester fraction) and the aqueous layer were recovered. To the aqueous layer fraction, 150 mL of concentrated hydrochloric acid and 5 L of n-hexane were added and stirred, and then the hexane layer (free fatty acid fraction) was recovered. Hexane was removed from the hexane solution containing the ester and free fatty acid with an evaporator to obtain 296 g of menthyl ester and 224 g of free fatty acid. The constituent fatty acids of menthyl ester contain 59.4% c9, t11-CLA and 9.6% t10, c12-CLA (c9, tll-CLA purity, 86.1%), and the free fatty acid fraction contains 60.0%. % T10, cl2-CLA and 11.8% c9, t11-CLA (purity of t10, cl2-CLA, 83,6%).
第2工程はメンチルエステル画分からc9,t11-CLAを遊離させる工程である。合成したメンチルエステル(224g)に、水を86mL、NaOHを57g、およぴエタノールを1L加え、沸騰させながら30分間ケン化分解した。反応液に3Lの水とlLのヘキサンを加え、10分間攪拌した後水層を回収した。得られた水層に220mLの濃塩酸を加えて酸性に戻し、さらに3Lのヘキサンを加えて攪拌した後ヘキサン層を回収した(遊離脂肪酸画分)。このヘキサン溶液からヘキサンをエバポレーターで除去し、178gの遊離脂肪酸を得た。遊離脂肪酸中には58.9%のc9,t11-CLAと9.6%のtlO,c12-CLA(c9,tll-CLAの純度,86.0%)が含まれていた(酸価196mg KOH/g)。 The second step is a step of releasing c9, t11-CLA from the menthyl ester fraction. To the synthesized menthyl ester (224 g), 86 mL of water, 57 g of NaOH, and 1 L of ethanol were added and saponified and decomposed for 30 minutes while boiling. 3 L of water and 1 L of hexane were added to the reaction solution and stirred for 10 minutes, and then the aqueous layer was recovered. To the obtained aqueous layer, 220 mL of concentrated hydrochloric acid was added to return to acidity, 3 L of hexane was further added and stirred, and then the hexane layer was recovered (free fatty acid fraction). Hexane was removed from the hexane solution with an evaporator to obtain 178 g of free fatty acid. The free fatty acid contained 58.9% c9, t11-CLA and 9.6% tlO, c12-CLA (purity of c9, tll-CLA, 86.0%) (acid value 196 mg KOH / g).
表４
工程 重量 CLA含量(wt%) 異性体純度(%)
(g) c9,tll tlO,c12 c9,tll tlO,c12
原料(Gly-CLA) 800 33.7 34.5 49.5 50.6
第１工程のエステル
化反応液の分画
蒸留留分 66 39.7 14.5 73.2 −
へキサン抽出
遊離脂肪酸画分 224 11.8 60.0 − 83.6
エステル画分 296 59.4 9.6 86.1 −
第２工程のケン化
分解物の分画
へキサン抽出
遊離脂肪酸画分 178 58.9 9.6 86.1 − Table 4
Process Weight CLA content (wt%) Isomeric purity (%)
(g) c9, tll tlO, c12 c9, tll tlO, c12
Raw material (Gly-CLA) 800 33.7 34.5 49.5 50.6
Fractionation of esterification reaction solution in the first step Distillation fraction 66 39.7 14.5 73.2 −
Hexane extraction Free fatty acid fraction 224 11.8 60.0 − 83.6
Ester fraction 296 59.4 9.6 86.1 −
Fractionation of saponification degradation product in the second step Hexane extraction
Free fatty acid fraction 178 58.9 9.6 86.1 −
［実施例5］c9,t11-CLA含量の高いメンチルエステルの加水分解物を再度選択的エステル化することにより、c9,t11-CLAの純度を高める方法
実施例４の第２工程で得られた遊離脂肪酸画分(メンチルエステルの加水分解により得られたc9,t11-CLA含量の高い画分)とメントールを合わせて2.4 g(脂肪酸とメントールのモル比=1:1)、水0.6 g、および反応混液1 gに対して100 U のCandida rugosaリパーゼからなる反応混液を30℃で攪拌しながら40時間反応させた。反応後の油層の酸価から、エステル化率は61.2%であった。また油層のヘキサン抽出によりメンチルエステル画分を回収し、その脂肪酸組成を調べたところ、c9,t11-CLA含量は76.7%、t10,c12-CLA含量は2.3%であり、c9,t11-CLAの純度は97%であった。このようにCandida rugosaリパーゼによる選択的エステル化を２回繰り返すことにより、c9,t11-CLAの純度を上げることができる。
[Example 5] Method for increasing the purity of c9, t11-CLA by re-selectively esterifying a hydrolyzate of a menthyl ester having a high content of c9, t11-CLA, obtained in the second step of Example 4 Free fatty acid fraction (the fraction with high c9, t11-CLA content obtained by hydrolysis of menthyl ester) and menthol combined 2.4 g (fatty acid to menthol molar ratio = 1: 1), water 0.6 g, and A reaction mixture consisting of 100 U of Candida rugosa lipase was reacted for 40 hours with stirring at 30 ° C. per 1 g of the reaction mixture. From the acid value of the oil layer after the reaction, the esterification rate was 61.2%. The menthyl ester fraction was recovered by hexane extraction of the oil layer, and its fatty acid composition was examined. The c9, t11-CLA content was 76.7%, the t10, c12-CLA content was 2.3%, and the c9, t11-CLA content was The purity was 97%. Thus, the purity of c9, t11-CLA can be increased by repeating selective esterification with Candida rugosa lipase twice.
［実施例6］t10,c12-CLA含量の高い遊離脂肪酸画分を再度選択的エステル化することにより、t10,c12-CLAの純度を高める方法
実施例４の第１工程で得られた遊離脂肪酸画分(t10,c12-CLA含量の高い画分)とメントールを合わせて2.4 g(脂肪酸とメントールのモル比=1:1)、水0.6 g、および反応混液1 gに対して100 U のCandida rugosaリパーゼからなる反応混液を30℃で攪拌しながら40時間反応させた。反応後の油層の酸価から、エステル化率は18.6%であった。また油層のヘキサン抽出により未反応の遊離脂肪酸画分を回収し、その脂肪酸組成を調べたところ、c9,t11-CLA含量は7.9%、t10,c12-CLA含量は68.3%であり、t10,c12-CLAの純度は90%であった。このようにCandida rugosaリパーゼによる選択的エステル化を２回繰り返すことにより、t10,c12-CLAの純度を上げることができる。
[Example 6] Method for increasing the purity of t10, c12-CLA by re-selectively esterifying a free fatty acid fraction having a high t10, c12-CLA content again Free fatty acid obtained in the first step of Example 4 fractions (t10, c12-CLA high content of fraction) and the combined menthol 2.4 g (fatty acid and menthol molar ratio = 1: 1), water 0.6 g, and 100 U of Candida to the reaction mixture 1 g The reaction mixture composed of rugosa lipase was reacted at 30 ° C. with stirring for 40 hours. From the acid value of the oil layer after the reaction, the esterification rate was 18.6%. Further, the unreacted free fatty acid fraction was recovered by hexane extraction of the oil layer, and its fatty acid composition was examined.The c9, t11-CLA content was 7.9%, the t10, c12-CLA content was 68.3%, and the t10, c12 The purity of -CLA was 90%. Thus, the purity of t10, c12-CLA can be increased by repeating the selective esterification with Candida rugosa lipase twice.
[3] 共役リノール酸の異性体混合物をステロールでエステル化して異性体を分画する方法
[実施例7]
ステロールを基質とした選択的エステル化と合成されたステリルエステルの選択的加水分解を組み合わせたCLA異性体分画プロセスの概略を図3に示し、操作の各段階における物質収支とCLA異性体の組成を表5に示す。
[3] Method of fractionating isomers by esterifying isomer mixture of conjugated linoleic acid with sterol
[Example 7]
Figure 3 outlines the CLA isomer fractionation process, which combines selective esterification with sterol as a substrate and selective hydrolysis of the synthesized steryl ester, and shows mass balance and composition of CLA isomers at each stage of operation. Is shown in Table 5.
＜1回目のエステル化反応＞
ステロール16.2gと共役リノール酸の異性体混合物55.8gを混合し(ステロールに対して5倍モル量の遊離脂肪酸)、さらに水48mLと反応液lg当たり500UのCandida rugosaリパーゼを加えて40℃で24時間攪拌しながらインキュベートした(ステロールに対するエステル化率,70.3%;脂肪酸に対するエステル化率,14.1%)。反応後、ヘキサン分画によりFFAとステリルエステルをそれぞれ43.2gと20.3g回収した。エステル画分には61.3%のc9,tll-CLAと9.4%のt10,cl2-CLAが含まれており、c9,t11-CLAの純度は1回のエステル化反応で49.5%から86.7%まで上昇した。一方遊離脂肪酸画分には27.0%のc9,t11-CLAと37.2%のt10,c12-CLAが含まれており、tlO,c12-CLAの純度は57.9%まで高めることができた。
<First esterification reaction>
Mix 16.2 g of sterol and 55.8 g of isomer mixture of conjugated linoleic acid (5 times the molar amount of free fatty acid with respect to sterol), add 48 mL of water and 500 U of Candida rugosa lipase per lg of reaction solution at 40 ° C. Incubated with stirring for a period of time (esterification rate to sterol, 70.3%; esterification rate to fatty acid, 14.1%). After the reaction, 43.2 g and 20.3 g of FFA and steryl ester were recovered by hexane fraction, respectively. The ester fraction contains 61.3% c9, tll-CLA and 9.4% t10, cl2-CLA, and the purity of c9, t11-CLA increases from 49.5% to 86.7% in a single esterification reaction. did. On the other hand, the free fatty acid fraction contained 27.0% c9, t11-CLA and 37.2% t10, c12-CLA, and the purity of tlO, c12-CLA could be increased to 57.9%.
＜繰り返しエステル化反応によるt10,cl2-CLAの濃縮＞
遊離脂肪酸画分のtlO,cl2-CLAの純度を高めるために1回反応によって得られた遊離脂肪酸(43.2g)に等モル量のステロール(63.3g)を加え、さらに11.8 mlの水(10%)と反応液1g当たりIOOOUのCandida rugosaリパーゼを含む反応液を調製し、40℃で12時間攪拌しながらインキュベートした(エステル化率,17.5%)。エステル化率を高めるために5mm Hgで脱水しながらさらに24時間反応を続けた結果、エステル化率は46.3%まで上昇した。反応後、ヘキサン分画によりFFAとステリルエステルをそれぞれ14.3gと29.5g回収した。遊離脂肪酸画分は11.2%のc9,t11-CLAと58.3%のtl0,c12-CLAを含んでいた(tl0,c12-CLAの純度,83.9%)。
<Concentration of t10, cl2-CLA by repeated esterification>
To increase the purity of tlO, cl2-CLA in the free fatty acid fraction, add an equimolar amount of sterol (63.3 g) to the free fatty acid (43.2 g) obtained by a single reaction, and then add 11.8 ml of water (10% ) And IOOOU Candida rugosa lipase per gram of the reaction solution was prepared and incubated at 40 ° C. with stirring for 12 hours (esterification rate, 17.5%). As a result of continuing the reaction for another 24 hours while dehydrating at 5 mm Hg to increase the esterification rate, the esterification rate increased to 46.3%. After the reaction, 14.3 g and 29.5 g of FFA and steryl ester were recovered by hexane fraction, respectively. The free fatty acid fraction contained 11.2% c9, t11-CLA and 58.3% tl0, c12-CLA (purity of tl0, c12-CLA, 83.9%).
＜ステリルエステルから遊離脂肪酸の回収＞
1回目のエステル化反応によって得られたステリルエステル(20.3g)に等量の水と反応液lgに対して200UのCandida rugosaリパーゼを加え、30℃で40時間攪拌しながらインキュベートした(加水分解率,65.6%)。反応後、ヘキサン分画により4.39gの遊離脂肪酸が回収でき、c9,t11-CLAとtlO,cl2-CLAの含量はそれぞれ71.2%と5.9%であった(c9,tll-CLAの純度,92.3%)。Candida rugosaリパーゼはt10,cl2-CLAよりc9,t11-CLAを基質として認識しやすい性質を持っている。この加水分解においても脂肪酸に対する選択性を引き出すことができc9,t11-CLAの純度を86.7%から92.3%まで高めることができた。
<Recovering free fatty acids from steryl esters>
To the steryl ester (20.3 g) obtained by the first esterification reaction, add 200 U of Candida rugosa lipase to an equal amount of water and reaction solution lg, and incubate with stirring at 30 ° C. for 40 hours (hydrolysis rate , 65.6%). After the reaction, 4.39 g of free fatty acid was recovered by hexane fractionation, and the contents of c9, t11-CLA and tlO, cl2-CLA were 71.2% and 5.9%, respectively (purity of c9, tll-CLA, 92.3% ). Candida rugosa lipase has a property that it is easier to recognize c9, t11-CLA as a substrate than t10, cl2-CLA. In this hydrolysis, the selectivity for fatty acids could be derived and the purity of c9, t11-CLA could be increased from 86.7% to 92.3%.
表５
操作 画分 重量 CLA含量(wt%) 異性体純度(%)
(g) c9,tll tlO,c12 c9,tll tlO,c12
原料CLA − 55.8 33.7 34.5 49.5 50.6
エステル化 FFA 43.2 27.0 37.2 57.9
（１回目） エステル 20.3 61.3 9.4 86.7
エステル化
（２回目） FFA 14.3 11.2 58.3 83.9
１回目のエステル
化で得たステリル
エステルの加水分解 FFA 5.0 71.2 5.9 92.3
Table 5
Operation Fraction Weight CLA content (wt% ) Isomeric purity (%)
(g) c9, tll tlO, c12 c9, tll tlO, c12
Raw material CLA − 55.8 33.7 34.5 49.5 50.6
Esterification FFA 43.2 27.0 37.2 57.9
(First) Ester 20.3 61.3 9.4 86.7
Esterification (second time) FFA 14.3 11.2 58.3 83.9
Steryl obtained from the first esterification
Ester hydrolysis FFA 5.0 71.2 5.9 92.3
［実施例8］Candida rugosaリパーゼを用いたCLA異性体混合物とステロールのエステル化に及ぼす減圧の影響
(1) CLA異性体混合物(CLA-80)とステロール(純度97%、タマセ生化学株式会社)の混合物3.0 g(CLAとステロールのモル比=2:1)、水0.2 ml、および反応混液1 gに対して150 または1000 UのCandida rugosaリパーゼからなる反応混液を40℃、20 mm Hgで攪拌しながら20時間反応させた。(2) CLA異性体混合物(CLA-80)とステロール、水を合計3.0 g(CLAとステロールのモル比=2:1、水分1, 10, 30, 50 wt%)、および反応混液1 gに対して150 または1000 UのC. rugosaリパーゼからなる反応混液を40℃、760 mm Hgで攪拌しながら20時間反応させた。反応後、油層の酸価およびガスクロマトグラフィー分析によりエステル化率を求めた(表６)。
表６
ステロールに対するエステル化率（％）
反応系 150U/g 1000U/g
20mmHgで反応 74.2 96.3
760mmHgで反応,水分量 1wt% 16.5 30.7
760mmHgで反応,水分量10wt% 23.9 35.2
760mmHgで反応,水分量30wt% 37.9 51.1
760mmHgで反応,水分量50wt% 35.7 52.4
常圧下(760 mm Hg)ではステロールに対するエステル化率は最大で50%程度であったが、減圧下で反応させることによりエステル化率を96%にまで高めることができた。エステル化反応の初期には水が必要であるが、エステル化の進行と共に初めから存在していた水、およびエステル化に伴って生成する水を取り除くことによってエステル化率が向上する。
[Example 8] Effect of reduced pressure on esterification of CLA isomer mixture and sterol using Candida rugosa lipase
(1) 3.0 g of CLA isomer mixture (CLA-80) and sterol (purity 97%, Tamase Biochemical Co., Ltd.) mixture (CLA to sterol molar ratio = 2: 1), water 0.2 ml, and reaction mixture 1 A reaction mixture composed of 150 or 1000 U of Candida rugosa lipase was reacted for 20 hours at 40 ° C. with stirring at 20 mm Hg. (2) CLA isomer mixture (CLA-80), sterol and water total 3.0 g (CLA to sterol molar ratio = 2: 1, moisture 1, 10, 30, 50 wt%), and 1 g of reaction mixture On the other hand, a reaction mixture composed of 150 or 1000 U of C. rugosa lipase was reacted for 20 hours while stirring at 40 ° C. and 760 mm Hg. After the reaction, the esterification rate was determined by acid value and gas chromatography analysis of the oil layer (Table 6).
Table 6
Esterification rate to sterol (%)
Reaction system 150U / g 1000U / g
Reaction at 20 mmHg 74.2 96.3
Reaction at 760mmHg, water content 1wt% 16.5 30.7
Reaction at 760mmHg, water content 10wt% 23.9 35.2
Reaction at 760mmHg, moisture content 30wt% 37.9 51.1
Reaction at 760mmHg, moisture content 50wt% 35.7 52.4
Under normal pressure (760 mm Hg), the esterification rate with respect to sterol was about 50% at maximum, but the esterification rate could be increased to 96% by reacting under reduced pressure. Although water is required at the beginning of the esterification reaction, the esterification rate is improved by removing the water that has been present from the beginning as the esterification proceeds and the water produced by the esterification.
［実施例９］Candida rugosaリパーゼを用いた減圧下でのCLA異性体混合物とステロールのエステル化――モル比の影響
CLA異性体混合物(CLA-80)とステロールの混合物3.0 g(CLAとステロールのモル比=5:1, 3:1, 2:1, 1.5:1, 1:1)、水0.2 ml、および反応混液1 gに対して1000 UのCandida rugosaリパーゼからなる反応混液を40℃、20 mm Hgで攪拌しながら20時間反応させた。反応後、油層の酸価およびガスクロマトグラフィー分析によりエステル化率を求めた(表７)。
表７
モル比(CLA:ステロール) ステロールに対するエステル化率(%)
5 : 1 96.4
3 : 1 96.8
2 : 1 96.3
1.5 : 1 90.9
1 : 1 37.9
ステロールに対して２倍モル以上のCLAを加えることにより、ステロールに対するエステル化率が96%以上になった。
[Example 9] Esterification of CLA isomer mixture and sterol under reduced pressure using Candida rugosa lipase-Effect of molar ratio
CLA isomer mixture (CLA-80) and sterol mixture 3.0 g (CLA to sterol molar ratio = 5: 1, 3: 1, 2: 1, 1.5: 1, 1: 1), water 0.2 ml, and reaction A reaction mixture composed of 1000 U of Candida rugosa lipase was reacted with 1 g of the mixture for 20 hours while stirring at 40 ° C. and 20 mm Hg. After the reaction, the esterification rate was determined by acid value and gas chromatography analysis of the oil layer (Table 7).
Table 7
Molar ratio (CLA: sterol) Esterification rate to sterol (%)
5: 1 96.4
3: 1 96.8
2: 1 96.3
1.5: 1 90.9
1: 1 37.9
By adding 2 times mole or more of CLA to sterol, the esterification rate to sterol became 96% or more.
［実施例１０］Candida rugosaリパーゼを用いた減圧下でのCLA異性体混合物とステロールのエステル化――酵素量の影響
CLA異性体混合物(CLA-80)とステロールの混合物3.0 g(CLAとステロールのモル比=2:1)、水0.2 ml、および反応混液1 gに対して50〜400 UのCandida rugosaリパーゼからなる反応混液を40℃、20 mm Hgで攪拌しながら20時間反応させた。反応後、油層の酸価およびガスクロマトグラフィー分析によりエステル化率を求めた。また反応液をアルカリ条件下でヘキサン抽出し、ステロールとステリルエステルをヘキサン層に回収した。水層画分に存在した脂肪酸石鹸は塩酸で酸性に戻して遊離脂肪酸とし、これをヘキサンで抽出した。反応後のエステル化率、エステルを含む画分と遊離脂肪酸画分の脂肪酸組成を表８に示す。
表８
酵素量 脂肪酸に ステロール 画分 CLA含量(wt%) 異性体純度(%)
対するエス に対する
テル化率 エステル化率
(U/g) (%) (%) c9,t11 t10,c12 c9,t11 t10,c12
50 14.7 29.4 遊離脂肪酸 28.7 39.4 57.8
エステル 64.7 14.9 81.2
100 21.4 42.8 遊離脂肪酸 25.4 42.4 62.6
エステル 62.5 15.4 80.2
150 32.1 64.1 遊離脂肪酸 20.7 46.3 69.1
エステル 59.7 17.0 77.9
200 43.3 86.6 遊離脂肪酸 16.8 50.6 75.0
エステル 55.5 19.1 74.4
300 45.5 91.0 遊離脂肪酸 16.3 51.8 76.0
エステル 55.1 19.8 73.6
400 48.3 96.5 遊離脂肪酸 17.5 51.3 74.5
エステル 51.9 22.0 74.4
c9,t11-CLAはエステル化率が低いほどエステル画分に効率よく濃縮された。一方、t10,c12-CLAは脂肪酸に対するエステル化率45.5%の時に最も効率よく未反応遊離脂肪酸画分に濃縮することができた。
エステル画分におけるc9,t11-CLAの純度は本発明の実施例７（１回目のエステル化反応）に比べて低かったが、未反応の遊離脂肪酸画分のt10,c12-CLAの純度は高かった。実施例７では常圧下で水を含む反応であり、エステル化が進行しにくいので脂肪酸を過剰量添加している。そのため、脂肪酸に対するエステル化率が非常に低いところで反応を停止させなければならないので、c9,t11-CLAの純度が高く、t10,c12-CLAの純度が低くなるのである。一方、本実施例のように減圧下で反応させるとエステル化が進行しやすくなるため、反応系に添加する脂肪酸量を実施例７よりも減らすことができる。その結果、脂肪酸に対するエステル化率が上昇し、t10,c12-CLAの純度を高めることができた。
ステロールの選択的エステル化反応を利用したときのCLA異性体の分画効率は、ラウリルアルコールを基質とした選択的エステル化反応（J. Am. Oil Chem. Soc., 79, 303-308(2002)）およびメントールを基質とした選択的エステル化反応（本発明の実施例３）よりも悪いが、CLAトリグリセリドを基質とした選択的加水分解反応（本発明の実施例１，２）よりも良い。
Example 10 Esterification of CLA isomer mixture and sterol under reduced pressure using Candida rugosa lipase-effect of enzyme amount
Consists of CLA isomer mixture (CLA-80) and sterol mixture 3.0 g (CLA to sterol molar ratio = 2: 1), water 0.2 ml, and 50-400 U Candida rugosa lipase for 1 g reaction mixture The reaction mixture was reacted for 20 hours at 40 ° C. with stirring at 20 mm Hg. After the reaction, the esterification rate was determined by acid value and gas chromatography analysis of the oil layer. The reaction solution was extracted with hexane under alkaline conditions, and sterol and steryl ester were recovered in the hexane layer. The fatty acid soap present in the aqueous layer fraction was acidified with hydrochloric acid to obtain free fatty acid, which was extracted with hexane. Table 8 shows the esterification rate after the reaction, the fatty acid composition of the fraction containing the ester and the free fatty acid fraction.
Table 8
Enzyme content Fatty acid Sterol fraction CLA content (wt%) Isomeric purity (%)
Vs. esterification rate for S
(U / g) (%) (%) c9, t11 t10, c12 c9, t11 t10, c12
50 14.7 29.4 Free fatty acids 28.7 39.4 57.8
Esters 64.7 14.9 81.2
100 21.4 42.8 Free fatty acids 25.4 42.4 62.6
Ester 62.5 15.4 80.2
150 32.1 64.1 Free fatty acids 20.7 46.3 69.1
Esters 59.7 17.0 77.9
200 43.3 86.6 Free fatty acids 16.8 50.6 75.0
Ester 55.5 19.1 74.4
300 45.5 91.0 Free fatty acid 16.3 51.8 76.0
Ester 55.1 19.8 73.6
400 48.3 96.5 Free fatty acids 17.5 51.3 74.5
Ester 51.9 22.0 74.4
c9, t11-CLA was more efficiently concentrated in the ester fraction as the esterification rate was lower. On the other hand, t10, c12-CLA was most efficiently concentrated in the unreacted free fatty acid fraction when the esterification rate to fatty acid was 45.5%.
The purity of c9, t11-CLA in the ester fraction was lower than that in Example 7 (first esterification reaction) of the present invention, but the purity of t10, c12-CLA in the unreacted free fatty acid fraction was high. It was. In Example 7, the reaction includes water under normal pressure, and the esterification hardly proceeds, so that an excessive amount of fatty acid is added. Therefore, since the reaction must be stopped at a very low esterification rate with respect to fatty acids, the purity of c9, t11-CLA is high and the purity of t10, c12-CLA is low. On the other hand, when the reaction is carried out under reduced pressure as in this example, esterification tends to proceed, so that the amount of fatty acid added to the reaction system can be reduced as compared with Example 7. As a result, the esterification rate with respect to the fatty acid increased, and the purity of t10, c12-CLA could be increased.
Fractionation efficiency of CLA isomers using the selective esterification reaction of sterol is determined by selective esterification reaction using lauryl alcohol as a substrate (J. Am. Oil Chem. Soc., 79 , 303-308 (2002 )) And a selective esterification reaction using menthol as a substrate (Example 3 of the present invention), but better than a selective hydrolysis reaction using CLA triglyceride as a substrate (Examples 1 and 2 of the present invention). .
［実施例１１］Candida rugosaリパーゼを用いた減圧下でのCLA異性体混合物とステロールのエステル化――大量分画
CLA異性体混合物(CLA-HG)とステロールの混合物2000 g(CLAとステロールのモル比=2:1)、水50 ml、および反応混液1 gに対して300 U/gのCandida rugosaリパーゼからなる反応混液を40℃、20 mm Hgで攪拌しながら26時間反応させた。このときの脂肪酸に対するエステル化率は40.3%であった。反応後の油層のセライト濾過と脱水を行った後、190℃, 0.2 mm Hgで分子蒸留し、脂肪酸を含む留分１を除去した。次いで残渣を230℃, 0.03 mm Hgで分子蒸留し、留分２と残渣２を得た。これらの工程における物質収支を表９に、脂肪酸組成を表１０に示す。
表９
酸価 全重量 遊離脂肪酸 ステロール エステル
(mgKOH/g) (g) (g) (g) (g)
反応前 115.4 2100 1212 888 0
反応後 65.5 2004 690 155 1159
脱水後 65.7 1919 654 145 1120
蒸留
留分１ 202.1 346 342 4 0
留分２ 144.0 368 276 88 4
残渣２ 1.5 1147 9 50 1088
表１０
CLA含量(wt%) 異性体純度(%)
c9,t11 t10,c12 c9,t11 t10,c12
反応前 37.0 38.7 48.9 51.1
反応後 遊離脂肪酸画分 21.5 52.2 70.8
エステル画分 61.0 21.9 73.6
蒸留
留分１ 21.1 49.4 70.8
留分２ 21.8 53.5 71.0
残渣２ 60.9 23.5 72.1
選択的エステル化反応と蒸留を組み合わせることにより、c9,t11-CLA含量の高いステリルエステル（残渣２）、およびt10,c12-CLA含量の高い遊離脂肪酸（留分１と２）が得られた。なお、未反応のステロールは留分２と残渣２の両方に移行した。
Example 11 Esterification of CLA isomer mixture and sterol under reduced pressure using Candida rugosa lipase-mass fractionation
Consisting of 2000 g of CLA isomer mixture (CLA-HG) and sterol mixture (CLA to sterol molar ratio = 2: 1), 50 ml water, and 300 U / g Candida rugosa lipase per 1 g reaction mixture The reaction mixture was reacted for 26 hours at 40 ° C. with stirring at 20 mm Hg. The esterification rate with respect to the fatty acid at this time was 40.3%. After the reaction, the oil layer was subjected to Celite filtration and dehydration, followed by molecular distillation at 190 ° C. and 0.2 mm Hg to remove fraction 1 containing fatty acid. Next, the residue was subjected to molecular distillation at 230 ° C. and 0.03 mm Hg to obtain fraction 2 and residue 2. Table 9 shows the material balance in these steps, and Table 10 shows the fatty acid composition.
Table 9
Acid value Total weight Free fatty acid Sterol ester
(mgKOH / g) (g) (g) (g) (g)
Before reaction 115.4 2100 1212 888 0
After reaction 65.5 2004 690 155 1159
After dehydration 65.7 1919 654 145 1120
Distillation fraction 1 202.1 346 342 4 0
Fraction 2 144.0 368 276 88 4
Residue 2 1.5 1147 9 50 1088
Table 10
CLA content (wt%) Isomeric purity (%)
c9, t11 t10, c12 c9, t11 t10, c12
Before reaction 37.0 38.7 48.9 51.1
After reaction Free fatty acid fraction 21.5 52.2 70.8
Ester fraction 61.0 21.9 73.6
Distillation fraction 1 21.1 49.4 70.8
Fraction 2 21.8 53.5 71.0
Residue 2 60.9 23.5 72.1
By combining the selective esterification reaction and distillation, a steryl ester having a high c9, t11-CLA content (residue 2) and a free fatty acid having a high t10, c12-CLA content (fractions 1 and 2) were obtained. The unreacted sterol was transferred to both fraction 2 and residue 2.
［実施例１２］c9,t11-CLA含量の高いエステル画分のCandida rugosaリパーゼによる加水分解
実施例１１で得た残渣２(c9,t11-CLA含量の高いエステル画分) 2.4 g、水0.6 g、および反応混液1 gに対して25から1600U のCandida rugosaリパーゼからなる反応混液を760 mm Hg、40℃で攪拌しながら20時間反応させた。反応後、油層の酸価およびガスクロマトグラフィー分析により加水分解率を推定した。また油層のヘキサン抽出により遊離脂肪酸画分を回収した。表１１に結果を示す。
表１１
遊離脂肪酸画分における
酵素量 加水分解率 c9,t11含量 t10,c12含量 c9,t11純度 c9,t11収率
(U/g) (%) (wt%) (wt%) (%) (%)
反応前(残渣２) − 60.9 23.5 72.1 −
25 8.1 82.5 6.5 92.7 11.0
50 17.8 82.8 6.5 92.7 24.3
75 29.0 80.8 6.2 92.9 38.5
100 39.6 75.7 7.4 91.1 49.2
150 44.4 73.0 8.7 89.4 53.3
200 46.6 70.5 9.8 87.8 54.0
400 50.9 66.5 12.3 84.4 55.6
800 54.6 63.8 16.3 79.7 57.2
1600 56.6 62.2 16.8 78.8 57.8
c9,t11-CLAに作用性の高いCandida rugosaリパーゼ(Lipase-OF)を用いて、c9,t11-CLA含量の高いステリルエステルを加水分解すれば、ステリルエステルに結合しているCLAよりもさらにc9,t11-CLA含量の高い遊離脂肪酸を得ることができる。この時、加水分解率が低いほどc9,t11-CLAの純度は高い。
従来技術であるc9,t11-CLA含量の高いラウリルエステル、c9,t11-CLA含量の高いメントールエステル（本発明の実施例３，４）をそれぞれ遊離脂肪酸に変換するとき、効率の良い加水分解には化学法を採用しなければならい。化学法では反応容器が大きくなりCLAの変性の危険がある。またCLA異性体の選択性がないため、加水分解によりc9,t11-CLAの純度を上げることができない。しかし本方法では、穏和な条件下での酵素を用いたステリルエステルの選択的加水分解が可能であり、かつc9,t11-CLAの純度を上げることができる。
なお反応混液からの遊離脂肪酸の回収には、蒸留、溶媒分画（ヘキサン、メタノール、エタノールなど）、クロマトグラフィーなどの方法が使用できる。
[Example 12] Hydrolysis of ester fraction with high c9, t11-CLA content by Candida rugosa lipase Residue 2 obtained in Example 11 (ester fraction with high c9, t11-CLA content) 2.4 g, water 0.6 g The reaction mixture consisting of 25 to 1600 U of Candida rugosa lipase was reacted for 20 hours with stirring at 760 mm Hg and 40 ° C. per 1 g of the reaction mixture. After the reaction, the hydrolysis rate was estimated by acid value and gas chromatography analysis of the oil layer. The free fatty acid fraction was recovered by hexane extraction of the oil layer. Table 11 shows the results.
Table 11
In the free fatty acid fraction
Enzyme hydrolysis rate c9, t11 content t10, c12 content c9, t11 purity c9, t11 yield
(U / g) (%) (wt%) (wt%) (%) (%)
Before reaction (residue 2) − 60.9 23.5 72.1 −
25 8.1 82.5 6.5 92.7 11.0
50 17.8 82.8 6.5 92.7 24.3
75 29.0 80.8 6.2 92.9 38.5
100 39.6 75.7 7.4 91.1 49.2
150 44.4 73.0 8.7 89.4 53.3
200 46.6 70.5 9.8 87.8 54.0
400 50.9 66.5 12.3 84.4 55.6
800 54.6 63.8 16.3 79.7 57.2
1600 56.6 62.2 16.8 78.8 57.8
If Candida rugosa lipase (Lipase-OF), which has a high activity on c9, t11-CLA, is used to hydrolyze steryl esters with a high content of c9, t11-CLA, it will be more c9 than CLA bound to steryl esters. Therefore, free fatty acids with high t11-CLA content can be obtained. At this time, the lower the hydrolysis rate, the higher the purity of c9, t11-CLA.
When converting the lauryl ester having a high content of c9, t11-CLA and the menthol ester having a high content of c9, t11-CLA (Examples 3 and 4 of the present invention) into free fatty acids, respectively, efficient hydrolysis can be achieved. Must adopt chemical methods. In chemical methods, the reaction vessel becomes large and there is a risk of denaturation of CLA. Moreover, since there is no selectivity of a CLA isomer, the purity of c9, t11-CLA cannot be increased by hydrolysis. However, in this method, selective hydrolysis of steryl esters using an enzyme under mild conditions is possible, and the purity of c9, t11-CLA can be increased.
For recovery of free fatty acid from the reaction mixture, methods such as distillation, solvent fractionation (hexane, methanol, ethanol, etc.), chromatography, etc. can be used.
［実施例１３］t10,c12-CLA含量の高い遊離脂肪酸（留分１と２）のCandida rugosaリパーゼによる選択的エステル化
実施例１１で得た留分１と２の混合物(t10,c12-CLA含量の高い遊離脂肪酸画分)とステロールをあわせて3.0 g（CLAとステロールのモル比=2:1）、水0.2 g、および反応混液1 gに対して25から1000U のCandida rugosaリパーゼからなる反応混液を20 mm Hg、40℃で攪拌しながら20時間反応させた。反応後、油層の酸価およびガスクロマトグラフィー分析によりエステル化率を推定した。また油層のヘキサン抽出により未反応の遊離脂肪酸画分を回収した。表１２に結果を示す。
表１２
脂肪酸に対する 遊離脂肪酸画分における
酵素量 エステル化率 c9,t11含量 t10,c12含量 t10,c12純度 t10,c12収率
(U/g) (%) (wt%) (wt%) (%) (%)
反応前(残渣２) − 21.5 51.4 70.5 −
50 12.3 17.7 54.6 75.5 13.1
100 28.9 10.7 62.7 85.4 35.3
200 34.6 10.0 63.9 86.5 43.0
300 43.3 8.6 65.3 88.4 55.0
400 47.1 6.9 65.2 90.4 59.8
500 48.3 11.1 65.8 85.6 61.8
1000 49.3 18.2 57.9 76.1 55.5
Candida rugosaリパーゼを用いてt10,c12-CLA含量の高い遊離脂肪酸画分（留分１と２の混合物）をステロールでエステル化し、反応混液から未反応の遊離脂肪酸を回収すれば、t10,c12-CLA含量をより高めた遊離脂肪酸画分を得ることができる。この時、脂肪酸に対するエステル化率が47%の時、t10,c12-CLAの純度が最大になった。
なお反応混液からの遊離脂肪酸の回収には、蒸留、溶媒分画（ヘキサン、メタノール、エタノールなど）、クロマトグラフィーなどの方法が使用できる。
[Example 13] Selective esterification of free fatty acids having high t10, c12-CLA content (fractions 1 and 2) with Candida rugosa lipase A mixture of fractions 1 and 2 obtained in Example 11 (t10, c12-CLA Highly free fatty acid fraction) and sterol combined with 3.0 g (CLA to sterol molar ratio = 2: 1), water 0.2 g, and reaction mixture consisting of 25 to 1000 U of Candida rugosa lipase The mixture was reacted at 20 mm Hg and 40 ° C. with stirring for 20 hours. After the reaction, the esterification rate was estimated by the acid value of the oil layer and gas chromatography analysis. Moreover, the unreacted free fatty acid fraction was recovered by hexane extraction of the oil layer. Table 12 shows the results.
Table 12
In the free fatty acid fraction for fatty
Enzyme content Esterification rate c9, t11 content t10, c12 content t10, c12 purity t10, c12 yield
(U / g) (%) (wt%) (wt%) (%) (%)
Before reaction (residue 2) − 21.5 51.4 70.5 −
50 12.3 17.7 54.6 75.5 13.1
100 28.9 10.7 62.7 85.4 35.3
200 34.6 10.0 63.9 86.5 43.0
300 43.3 8.6 65.3 88.4 55.0
400 47.1 6.9 65.2 90.4 59.8
500 48.3 11.1 65.8 85.6 61.8
1000 49.3 18.2 57.9 76.1 55.5
If Candida rugosa lipase is used to esterify the free fatty acid fraction with a high content of t10, c12-CLA (mixture of fractions 1 and 2) with sterol and recover unreacted free fatty acid from the reaction mixture, t10, c12- A free fatty acid fraction having a higher CLA content can be obtained. At this time, when the esterification rate with respect to the fatty acid was 47%, the purity of t10, c12-CLA was maximized.
For recovery of free fatty acid from the reaction mixture, methods such as distillation, solvent fractionation (hexane, methanol, ethanol, etc.), chromatography, etc. can be used.
［食品の配合例］
例１ （重量％）
脂肪食品（スプレッド） １００ｇ
脂肪相
CLAグリセリド １０
サフラワー油 ３０
ハイモノ7804 ０．３
着色料 ０．０２
水相
水 ５６．４４
スキムミルクパウダー １．５
ゼラチン １．５
ソルビン酸カリウム ０．１５％
クエン酸粉末 ０．０７％
例２ （重量％）
脂肪食品（ドレッシング） １００ｇ
CLAグリセリド １５．０
サフラワー油 １０．０
マルトデキストリン ２０．０
乾燥卵黄 ０．８
キサンタンガム ０．４
ビネガー ５．０
水 ４８．８
例３ （重量％）
脂肪食品（アイスクリーム） １００ｇ
CLAグリセリド １０．０
脂肪粉乳 １０．０
結晶砂糖 １２．０
透明シロップ ４．０
無水デキストロース ２．０
水 ６２．０
例４ （重量％）
脂肪食品（マヨネーズ） １００ｇ
CLAグリセリド ２０
サフラワー油 ６０
卵黄 ８．０
食酢 ３．０
砂糖 １．５
食塩 １．０
香辛料 ２．０
水 ４．５
[Food formulation examples]
Example 1 (% by weight)
Fat food (spread) 100g
Fat phase
CLA glyceride 10
Safflower oil 30
High Mono 7804 0.3
Coloring agent 0.02
Water phase Water 56.44
Skim milk powder 1.5
Gelatin 1.5
Potassium sorbate 0.15%
Citric acid powder 0.07%
Example 2 (% by weight)
Fat food (dressing) 100g
CLA glyceride 15.0
Safflower oil 10.0
Maltodextrin 20.0
Dried egg yolk 0.8
Xanthan gum 0.4
Vinegar 5.0
Water 48.8
Example 3 (% by weight)
Fat food (ice cream) 100g
CLA glyceride 10.0
Fat milk powder 10.0
Crystal sugar 12.0
Transparent syrup 4.0
Anhydrous dextrose 2.0
Water 62.0
Example 4 (% by weight)
Fat food (mayonnaise) 100g
CLA glyceride 20
Safflower oil 60
Egg yolk 8.0
Vinegar 3.0
Sugar 1.5
Salt 1.0
Spice 2.0
Water 4.5
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