JP4502731B2 - デンプン合成関連酵素等の機能解析法 - Google Patents
デンプン合成関連酵素等の機能解析法 Download PDFInfo
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A) 非変性の酵素を含む試料をゲル電気泳動後、ゲル内にて酵素反応させ、得られた反応生成物を含むゲル領域を切り出し、このゲル領域内の反応生成物の構造解析を行うことにより、当該酵素の機能を解析する方法。
B) ゲル電気泳動が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動である、上記A)記載の酵素の機能解析法。
C) ゲル内にて酵素反応後、反応生成物を染色により可視化し、その後、反応生成物を含むゲル領域を切り出すことを特徴とする、上記A)又はB)記載の酵素の機能解析法。
D) 解析対象の酵素が、植物由来の酵素である、上記A)〜C)のいずれかに記載の酵素の機能解析法。
E) 解析対象の酵素が、デンプン合成関連酵素又はデンプン分解酵素である、上記D)記載の酵素の機能解析法。
F) 解析対象の酵素が、デンプン合成関連酵素又はデンプン分解酵素であり、反応生成物の構造解析が、ポリグルカンの鎖長分布解析である、上記E)記載の酵素の機能解析法。
G) キャピラリー電気泳動により鎖長分布解析を行うことを特徴とする、上記F)記載の酵素の機能解析法。
本発明は、前述のように、非変性の酵素を含む試料をゲル電気泳動後、ゲル内にて酵素反応させ、得られた反応生成物を含むゲル領域を切り出し、このゲル領域内の反応生成物の構造解析を行うことにより、当該酵素の機能を解析する方法である。
イネのスターチシンターゼ(SS)を解析対象の酵素とし、ゲルに含ませるプライマーにカキグリコーゲン、ウサギグリコーゲン、ジャガイモアミロペクチンを使用して、以下各実験を行った。
まず、Native−PAGE/SS活性染色法について説明する。Native−PAGE/SS活性染色法は、Nishi et al. (2001) Plant Physiol. 127:459-472記載の方法にしたがって以下のように行った。
Native−PAGE/SS活性染色法で得られたバンド(3レーン分)を切り出し、マイクロチューブに回収した。プラスチック製ホモジナイザーでホモジナイズし、蒸留水を加えて遠心分離し、上清を除去した。全量285μlになるように蒸留水を加え、さらに15μlの5N NaOHを加えて5分間煮沸してポリグルカンを糊化させた。
0.8%のカキグリコーゲン(シグマ,TypeII,G8751)を含むゲルを用いてNative−PAGE/SS活性染色を行うと、図1に示されるバンドが得られた。ゲル上のSSIおよびSSIIIaバンドは、それぞれ変異体から同定されたSSアイソザイムである。
0.8%のウサギ肝臓グリコーゲン(シグマ,TypeIII,G-8876)を含むゲルを用いてNative−PAGE/SS活性染色を行った。その際、反応時間を経時的に停止し(図4)、各反応時間におけるSSIバンドを切り出し、鎖長分布解析を行った(図5・6)。
0.2%のジャガイモアミロペクチン(シグマ,A-8515)を含むゲルを用いてNative−PAGE/SS活性染色を行い(図7)、その後、SSIバンドを切り出して鎖長分布解析を行ったところ、図8のようなパターンが得られた。このパターンは、図9に示されるイネSSI変異体の胚乳アミロペクチンの鎖長分布パターンとDP20以下において、ミラーイメージであった。このことは、グリコーゲンより、実際にイネ胚乳内に存在するものに近いプライマー、ここではジャガイモアミロペクチンを用いることで、インビトロにおいてもそれに近い状況を再現できたと考えることができる。DP20以上に関しては、SSI酵素がデンプン粒と結合し、鎖長を伸長できなくなる可能性が考えられる(Commuri & Keeling (2001) Plant Cell 25: 475-486)ため、インビトロでの実験結果と変異体の結果とが必ずしもミラーイメージになっていないと考えられる。
Claims (7)
- 非変性の酵素を含む試料をゲル電気泳動後、ゲル内にて酵素反応させ、得られた反応生成物を含むゲル領域を切り出し、このゲル領域内の反応生成物の構造解析を行うことにより、当該酵素の機能を解析する方法。
- ゲル電気泳動が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動である、請求項1記載の酵素の機能解析法。
- ゲル内にて酵素反応後、反応生成物を染色により可視化し、その後、反応生成物を含むゲル領域を切り出すことを特徴とする、請求項1又は2記載の酵素の機能解析法。
- 解析対象の酵素が、植物由来の酵素である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の酵素の機能解析法。
- 解析対象の酵素が、デンプン合成関連酵素又はデンプン分解酵素である、請求項4記載の酵素の機能解析法。
- 解析対象の酵素が、デンプン合成関連酵素又はデンプン分解酵素であり、反応生成物の構造解析が、ポリグルカンの鎖長分布解析である、請求項5記載の酵素の機能解析法。
- キャピラリー電気泳動により鎖長分布解析を行うことを特徴とする、請求項6記載の酵素の機能解析法。
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