JP4491866B2 - Acylsulfonamide derivatives - Google Patents

Description

【０００６】
｛式中、Ｒ¹ は置換基を有していても良いフェニル基、ナフチル基又は水素原子を示し、Ｒ² はハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、カルボキシル基及びニトロ基から選ばれる置換基を有していても良いフェニル基又は水素原子を示す。但し、Ｒ¹ とＲ² が同時に水素原子であることは無い。Ｒ³ は置換基を有していても良いアリール基を示す。Ｘは−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｎ−（ｎは０〜２の整数を表す）又は単結合を示す。｝で示されるアシルスルホンアミド誘導体、その製薬上許容し得る塩、並びにその水和物もしくは溶媒和物及びこれらを有効成分とする医薬組成物並びにキマーゼ阻害剤、各種疾患の治療及び予防薬に存する。
一般式（Ｉ）の化合物には、光学活性体が存在する場合があるが、本発明はラセミ体及び光学活性体の何れをも包含するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の新規なアシルスルホンアミド誘導体は前記一般式（Ｉ）で示される。一般式（Ｉ）において、Ｒ¹ は置換基を有していても良いフェニル基、ナフチル基又は水素原子を示す。
【０００８】
これらの基の置換基としては、ハロゲン原子、Ｃ₁ 〜Ｃ₂₀のアルキル基、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀のアルコキシ基、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀のアルキルチオ基、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀のアルキルスルフィニル基、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀のアルキルスルホニル基、Ｃ₁ 〜Ｃ₄ のハロアルキル基、Ｃ₁ 〜Ｃ₄ のハロアルコキシ基、Ｃ₂ 〜Ｃ₈ のアルコキシカルボニル基、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀のアルキルアミノ基、Ｃ₂ 〜Ｃ₆ のジアルキルアミノ基、Ｃ₆ 〜Ｃ₁₄のアリール基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、アミジノ基、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀のアルキル基またはアルケニル基を有するカルボキシル基、水酸基及び複素環基の中から選ばれる１〜２個の同じ又は異なる基が挙げられる。
【０００９】
上記ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が挙げられ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀のアルキル基、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀のアルコキシ基、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀のアルキルチオ基、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀のアルキルスルフィニル基、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀のアルキルスルホニル基、Ｃ₂ 〜Ｃ₈ のアルコキシカルボニル基、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀のアルキルアミノ基、Ｃ₂ 〜Ｃ₆ のジアルキルアミノ基におけるアルキル鎖部分としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基などが挙げられる。
【００１０】
上記Ｃ₁ 〜Ｃ₄ のハロアルキル基としては、トリフルオロメチル基、ペンタフルオロエチル基、ヘプタフルオロプロピル基、ノナフルオロブチル基、トリクロロメチル基、ペンタクロロエチル基などが挙げられ、上記Ｃ₁ 〜Ｃ₄ のハロアルコキシ基としては、トリフルオロメトキシ基、ジフルオロメトキシ基、２，２，２−トリフルオロエトキシ基、１，１，２，２−テトラフルオロエトキシ基などが挙げられる。
【００１１】
Ｃ₂ 〜Ｃ₆ のアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ペンチルオキシカルボニル基などが挙げられる。
Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀のアルキルアミノ基としては、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基などが挙げられ、Ｃ₂ 〜Ｃ₆ のジアルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基などが挙げられ、上記のＣ₆ 〜Ｃ₁₄の芳香族炭化水素環基としては、例えばフェニル基、ナフチル基などが挙げられる。
【００１２】
また、上記の複素環基としては、２−チエニル基、３−チエニル基、１−チアンスレニル基、２−チアンスレニル基、２−フリル基、３−フリル基、２Ｈ−ピラン−３−イル基、２Ｈ−ピラン−４−イル基、２Ｈ−ピラン−５−イル基、２Ｈ−ピラン−６−イル基、イソベンゾフラニル基、２Ｈ−クロメン−３−イル基、２Ｈ−クロメン−４−イル基、２Ｈ−クロメン−５−イル基、２Ｈ−クロメン−６−イル基、２Ｈ−クロメン−７−イル基、２Ｈ−クロメン−８−イル基、２Ｈ−ピロール−３−イル基、２Ｈ−ピロール−４−イル基、２Ｈ−ピロール−５−イル基、２−ピロリル基、３−ピロリル基、１−イミダゾリル基、２−イミダゾリル基、４−イミダゾリル基、５−イミダゾリル基、１−ピラゾリル基、３−ピラゾリル基、４−ピラゾリル基、５−ピラゾリル基、３−イソチアゾリル基、４−イソチアゾリル基、５−イソチアゾリル基、３−イソキサゾリル基、４−イソキサゾリル基、５−イソキサゾリル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、２−ピラジニル基、２−ピリミジニル基、４−ピリミジニル基、５−ピリミジニル基、３−ピリダジニル基、４−ピリダジニル基、１−インドリジニル基、２−インドリジニル基、３−インドリジニル基、５−インドリジニル基、６−インドリジニル基、７−インドリジニル基、８−インドリジニル基、１−イソインドリル基、４−イソインドリル基、５−イソインドリル基、３Ｈ−インドール−２−イル基、３Ｈ−インドール−４−イル基、３Ｈ−インドール−５−イル基、１−インドリル基、２−インドリル基、３−インドリル基、４−インドリル基、５−インドリル基、６−インドリル基、７−インドリル基、１Ｈ−インダゾール−３−イル基、１Ｈ−インダゾール−４−イル基、１Ｈ−インダゾール−５−イル基、１Ｈ−インダゾール−６−イル基、１Ｈ−インダゾール−７−イル基、２−プリル基、６−プリル基、８−プリル基、４Ｈ−キノリジン−１−イル基、４Ｈ−キノリジン−２−イル基、４Ｈ−キノリジン−３−イル基、４Ｈ−キノリジン−６−イル基、４Ｈ−キノリジン−７−イル基、４Ｈ−キノリジン−８−イル基、４Ｈ−キノリジン−９−イル基、１−イソキノリル基、３−イソキノリル基、４−イソキノリル基、５−イソキノリル基、６−イソキノリル基、７−イソキノリル基、８−イソキノリル基、２−キノリル基、３−キノリル基、４−キノリル基、５−キノリル基、６−キノリル基、７−キノリル基、８−キノリル基、１Ｈ−テトラゾール−５−イル基、３Ｈ−テトラゾール−５−イル基、１−フタラジニル基、５−フタラジニル基、６−フタラジニル基、１，８−ナフチリジン−２−イル基、１，８−ナフチリジン−３−イル基、１，８−ナフチリジン−４−イル基、２−キノキサリニル基、５−キノキサリニル基、６−キノキサリニル基、２−キナゾリニル基、４−キナゾリニル基、５−キナゾリニル基、６−キナゾリニル基、７−キナゾリニル基、８−キナゾリニル基、３−シンノリニル基、４−シンノリニル基、５−シンノリニル基、６−シンノリニル基、７−シンノリニル基、８−シンノリニル基、２−プテリジニル基、４−プテリジニル基、６−プテリジニル基、７−プテリジニル基、４ａＨ−カルバゾール−１−イル基、４ａＨ−カルバゾール−２−イル基、４ａＨ−カルバゾール−３−イル基、４ａＨ−カルバゾール−４−イル基、４ａＨ−カルバゾール−５−イル基、４ａＨ−カルバゾール−６−イル基、４ａＨ−カルバゾール−７−イル基、４ａＨ−カルバゾール−８−イル基、１−カルバゾリル基、２−カルバゾリル基、３−カルバゾリル基、４−カルバゾリル基、β−カルボリン−１−イル基、β−カルボリン−３−イル基、β−カルボリン−４−イル基、β−カルボリン−５−イル基、β−カルボリン−６−イル基、β−カルボリン−７−イル基、β−カルボリン−８−イル基、１−アクリジニル基、２−アクリジニル基、３−アクリジニル基、４−アクリジニル基、９−アクリジニル基、１−フェナジニル基、２−フェナジニル基、１−フェノチアジニル基、２−フェノチアジニル基、３−フェノチアジニル基、４−フェノチアジニル基、３−フラザニル基、１−フェノキサジニル基、２−フェノキサジニル基、３−フェノキサジニル基、４−フェノキサジニル基、１−イソクロマニル基、３−イソクロマニル基、４−イソクロマニル基、５−イソクロマニル基、６−イソクロマニル基、７−イソクロマニル基、８−イソクロマニル基、２−クロマニル基、３−クロマニル基、４−クロマニル基、５−クロマニル基、６−クロマニル基、７−クロマニル基、８−クロマニル基、１−ピロリジニル基、２−ピロリジニル基、３−ピロリジニル基、２−ピロリン−１−イル基、２−ピロリン−２−イル基、２−ピロリン−３−イル基、２−ピロリン−４−イル基、２−ピロリン−５−イル基、１−イミダゾリジニル基、２−イミダゾリジニル基、３−イミダゾリジニル基、２−イミダゾリン−１−イル基、２−イミダゾリン−２−イル基、２−イミダゾリン−４−イル基、２−イミダゾリン−５−イル基、１−ピラゾリジニル基、３−ピラゾリジニル基、４−ピラゾリジニル基、３−ピラゾリン−１−イル基、３−ピラゾリン−２−イル基、３−ピラゾリン−３−イル基、３−ピラゾリン−４−イル基、３−ピラゾリン−５−イル基、１−ピペリジル基、２−ピペリジル基、３−ピペリジル基、４−ピペリジル基、１−ピペラジニル基、２−ピペラジニル基、１−インドリニル基、２−インドリニル基、３−インドリニル基、４−インドリニル基、５−インドリニル基、６−インドリニル基、７−インドリニル基、１−イソインドリニル基、２−イソインドリニル基、４−イソインドリニル基、５−イソインドリニル基、１−キヌクリジニル基、２−キヌクリジニル基、３−キヌクリジニル基、４−キヌクリジニル基、２−モルフォリニル基、３−モルフォリニル基、４−モルフォリニル基、１，２，４−トリアゾール−３−イル基、１，２，３−トリアゾール−４−イル基、１，２，４−オキサジアゾール−３−イル基、１，２，４−オキサジアゾール−５−イル基、１，２，４−チアジアゾール−３−イル基、１，２，４−チアジアゾール−５−イル基、ベンゾチアゾール−２−イル基、ベンズオキサゾール−２−イル基、ベンズイミダゾール−２−イル基、ベンズイソキサゾール−３−イル基、ベンズイソチアゾール−３−イル基、ベンズイソチアゾール−３−イル−１，１−ジオキサイド基、インドール−３−イル基、ｓｙｎ−トリアジニル基、ａｓ−トリアジニル基などが挙げられる。
また、２つの置換基が連結して環状構造を形成しても良く、その環の大きさは、化学的に安定に存在し得る４員環、５員環、６員環、７員環、８員環であり、その環状構造に１つ以上のヘテロ原子（酸素原子、窒素原子、硫黄原子、）を含むものが挙げられる。
【００１３】
一般式（Ｉ）において、Ｒ² は水素原子又はハロゲン原子、アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、カルボキシル基、ニトロ基から選ばれる置換基を有していても良いフェニル基である。上記ハロゲン原子としてはフッ素原子、塩素原子、臭素原子が挙げられる。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｉ−プロポキシ基、ブトキシ基、ｉ−ブトキシ基、ｓ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ペントキシ基、ｉ−ペントキシ基、ネオペントキシ基、ｔ−ペントキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、ノニルオキシ基、デシルオキシ基等のＣ₁ 〜Ｃ₁₀の直鎖もしくは分岐鎖を有するアルコキシ基が挙げられる。
一般式（Ｉ）において、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ₂ 又は単結合を示す。なお、一般式（Ｉ）においてＲ¹ とＲ² が同時に水素原子であることは無い。
【００１４】
一般式（Ｉ）の化合物は、それ自体公知の方法を組み合せて製造することができる。
本発明化合物には光学異性体が存在するが、Ｒ配置、Ｓ配置およびそれらの混合配置いずれもが本発明の範囲内である。
本発明化合物は、例えば以下の様な方法で製造することができる。
【００１５】
【化３】

【００１６】
（式中、Ｒ¹ 、Ｒ² 及びＸは前記と同義であり、Ｘ′は−ＯＨまたは−ＳＨであり、Ｈａｌはハロゲンであり、Ｒは低級アルキルである。）
本製造方法では化合物（１）と（２）を適当な条件下で縮合させて化合物（３）を得、それを通常の方法で加水分解して化合物（４）を得る。縮合反応は、例えばジメチルホルムアミド、アセトニトリル、アセトン等の溶媒中で炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等の塩基の存在下に室温〜加温下、好ましくは８０℃付近で、数時間〜２４時間、好ましくは０．５〜６時間程度反応させればよい。加水分解はメタノール、エタノール等の低級アルコールに化合物（３）を溶解し、適当な濃度、例えば１Ｎの水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム水溶液等の塩基を加えて冷却下〜加温下、好ましくは室温付近で１時間〜２４時間程度反応させれば化合物（４）が得られる。
【００１７】
【化４】

（式中Ｒ³ は前記と同義である。）
【００１８】
次に、溶媒に溶かした化合物（４）のカルボキシル基を活性化し、塩基存在下で冷却下〜加温下、好ましくは室温付近でスルホンアミド化合物（５）と縮合させて化合物（Ｉ）を得る。
溶媒としては例えばテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジメトキシエタン、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン等を用いればよく、カルボキシル基の活性化には例えば１，１′−カルボニルジイミダゾールが用いられる。塩基としては例えば１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデス−７−エンを好適に用いることができる。
上記合成法に用いる化合物（１）、（２）、（５）は、公知の化合物または公知物から通常の方法で合成した化合物を用いることも可能である。
【００１９】
本発明のアシルスルホンアミド誘導体は、キマーゼに対する選択的な阻害作用を有することから、キマーゼの関与する各種疾患の治療及び予防に有用である。具体的には、高血圧、鬱血性心不全、心筋症、動脈硬化症、冠状動脈疾患、心筋梗塞、血管形成手術又は血栓溶解治療後の血管再狭窄、抹消循環障害、血管炎、糖尿病性又は非糖尿病性腎臓病、肺高血圧症、気管支喘息、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、リウマチ、関節炎、癌等が挙げられる。
【００２０】
本発明化合物を医薬として用いる場合には、その有効成分として、本発明で構造を規定する化合物又はその製薬上許容しうる塩、並びにそれらの水和物及び溶媒和物から選ばれる有効成分である物質と、薬学的に許容され得る固体又は液体の医薬用担体又は希釈剤と共に、即ち賦形剤や安定剤等と共に、製剤とし、ヒトを含む動物に経口又は非経口的に投与可能である。非経口投与としては、例えば、静脈、皮下、筋肉、経皮、直腸、経鼻、点眼内への投与が挙げられる。なお、当該製剤において、前記有効成分の担体成分に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動させることができる。
【００２１】
経口投与剤の剤型としては、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、カプセル剤等が挙げられる。錠剤の成型方法としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤等の製薬学的に許容される担体を用いて通常の方法により成型することができる。丸剤、顆粒剤、散剤も錠剤の場合と同様に賦形剤等を用いて通常の方法により成型することができる。液剤、シロップ剤の成型方法は、グリセリンエステル類、アルコール類、水、植物油等を用いて通常の方法により成型することができる。カプセル剤の成型方法は、顆粒剤、散剤、あるいは液剤等を、ゼラチン等のカプセルに充填することによって成型することができる。
【００２２】
非経口投与剤のうち、静脈、皮下、筋肉内投与の場合には、注射剤として投与することができる。注射剤としては、本発明で構造を規定する化合物又はその製薬上許容しうる塩を生理的食塩水などの水溶性液剤に溶解する場合、あるいは、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油等の有機エステルからなる非水溶性液剤に溶解する場合等が挙げられる。
経皮投与の場合には、例えば軟膏剤、クリーム剤などの剤型として用いることができる。すなわち、本発明で構造を規定する化合物又はその製薬上許容しうる塩を、軟膏剤としては、油脂類又はワセリン等と混合し、クリーム剤としては、乳化剤と混合し、成型することができる。
直腸投与の場合には、ゼラチンソフトカプセルなどを用いて坐剤とすることができる。
【００２３】
経鼻投与の場合には、液状又は粉末状の組成物からなる製剤として用いることができる。液状剤の基剤としては、水、食塩水、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が用いられ、更に、界面活性剤、酸化防止剤、安定剤、保存剤、粘性付与剤を含んでいてもよい。粉末状剤の基剤としては、例えば、水易溶性のポリアクリル酸塩類、セルロース低級アルキルエーテル類、ポリエチレングリコールポリビニルピロリドン、アミロース等の水吸収性のもの、あるいは、例えば、セルロース類、タンパク類、ガム類、架橋ビニル重合体類等の水難溶性のものが挙げられ、これらを混合して用いてもよい。さらに、粉末状剤には、酸化防止剤、着色剤、保存剤、防腐剤、矯腐剤等を添加してもよい。
【００２４】
点眼内投与の場合は、水性あるいは非水性の点眼剤として使用することができる。水性点眼剤としては、溶剤として滅菌精製水、生理的食塩水等を用いることができる。溶剤として滅菌精製水のみを用いた場合、界面活性剤、高分子増粘剤等の懸濁剤を加えて水性懸濁点眼剤として用いることができ、また、非イオン性界面活性剤等の可溶化剤を加えて可溶化点眼液として用いることもできる。非水性点眼剤としては、溶剤に注射用非水性溶剤を用いることができ、非水性懸濁点眼液として用いることができる。
鼻、口等から吸入する場合においては、本発明で構造を規定する化合物又はその製薬上許容しうる塩を、一般的に用いられる製薬賦形剤との溶液または懸濁液として、例えば、吸入用エアゾルスプレー等を用いて投与する。あるいは、本発明で構造を規定する化合物又はその製薬上許容しうる塩を、乾燥粉末状とし、肺と直接接触させる吸入器等を用いて投与することもできる。
【００２５】
これらの種々の製剤には、必要に応じて、等張化剤、保存剤、防腐剤、湿潤剤、緩衝剤、乳化剤、分散剤、安定剤等の製薬学的に許容される担体を添加することができる。また、これらの製剤には、必要に応じて、殺菌剤の配合、バクテリア保留フィルターを用いた濾過、加熱、照射等の処置を行い無菌化することができる。あるいは、無菌の固形製剤を製造し、使用直前に適当な無菌溶液に溶解あるいは懸濁して使用することもできる。
臨床投与量は、疾患の種類、投与経路、患者の症状、年齢、性別、体重等を考慮した上で設定することが望ましいが、成人に対し経口的に投与する場合には、１〜１０００ｍｇ／日を１回〜数回に分けて投与する。非経口投与的に投与する場合には、投与経路により大きく異なるが、通常、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ／日を１回〜数回に分けて投与する。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明化合物の製造例及び薬理試験例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に制約されるものではない。
なお、薬理試験に使用したキマーゼの取得方法を参考例として示す。
また、化合物Ｎｏ．は表−１の化合物Ｎｏ．に対応する。
【００２７】
参考例１
ヒト心臓由来キマーゼｃＤＮＡの取得
ヒト心臓のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）から、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、ヒト心臓キマーゼのｃＤＮＡの取得を行った。反応に用いた合成オリゴヌクレオチドＤＮＡの配列は以下の通りである。
ＭＹ８１：
ＡｇＣＣＴＣＴＣＴｇｇｇＡＡｇＡＴｇＣＴｇＣＴＴ
ＭＹ８２：
ＧｇＡＴＣＣＡｇｇＡＴＴＡＡＴＴＴｇＣＣＴｇＣＡｇ
ＭＹ９７：
ｇＡＴｇＣＴｇＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣＣＴｇＣＴｇ
ＭＹ９９：
ＴＴＡＡＴＴＴｇＣＣＴｇＣＡｇｇＡＴＣＴｇｇＴＴｇＡＴＣＣＡ
なお、このプライマー配列は、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｍ６９１３６を参考にして決定した。
【００２８】
まず始めに、ヒト心臓由来のｃＤＮＡを１ｕｌ、２．５ｍＭ ｄＡＴＰ，２．５ｍＭ ｄＴＴＰ，２．５ｍＭ ｄＧＴＰ，２．５ｍＭ ｄＣＴＰを２ｕｌ、２０ｕＭ ＭＹ８１を５ｕｌ、２０ｕＭ ＭＹ８２を５ｕｌ、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を１ｕｌ、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付されてきた反応バッファー１０ｕｌの混合液に滅菌した水を７６ｕｌ加えて１００ｕｌとし、９４℃、１分間、５５℃、２分間、７２℃、１分間を１サイクルとする反応を２４回繰り返した後、９４℃、１分間、５５℃、２分間、７２℃、５分間の反応を１回行った。更に、この反応産物の溶液１ｕｌ、２．５ｍＭ ｄＡＴＰ，２．５ｍＭ ｄＴＴＰ，２．５ｍＭ ｄＧＴＰ，２．５ｍＭ ｄＣＴＰを２ｕｌ、２０ｕＭ ＭＹ９７を５ｕｌ、２０ｕＭ ＭＹ９９を５ｕｌ、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ を１ｕｌ、反応バッファー１０ｕｌの混合液に滅菌した水を７６ｕｌ加えて１００ｕｌとし、９４℃、１分間、５５℃、２分間、７２℃、１分間を１サイクルとする反応を２４回繰り返した後、９４℃、１分間、５５℃、２分間、７２℃、５分間の反応を１回行った。反応液５ｕｌを１％アガロースゲルで電気泳動を行ったところ、約７４５ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅されていることが確認された。このＤＮＡ断片をｐＣＲIIベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローニングし（このベクターをｐＣＲII−ｈＣｈｙと呼ぶことにする）、ＤＮＡ配列を蛍光ＤＮＡシークエンサー（ｍｏｄｅｌ ３９４：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使って解析した。その結果、増幅されたＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号Ｍ６９１３６として登録されているＤＮＡ配列の１６番から７５９番の間の領域を含み、ヒト心臓キマーゼのタンパク質をコードするＤＮＡであることが確認された。
【００２９】
参考例２
ヒトキマーゼ遺伝子を大腸菌で発現させるためのベクターの構築（１）
ヒトキマーゼ遺伝子を大腸菌に発現させるためのベクターの構築を行った。
まず参考例１において取得されたｐＣＲII−ｈＣｈｙベクターを鋳型とし、Ｓｐ６、ＭＹ１１９をプライマーとしてそれぞれ用いてＰＣＲを行った。合成オリゴヌクレオチドＤＮＡプライマーＳｐ６とＭＹ１１９の配列は以下のとおりである。
Ｓｐ６
ＡＴＴＴＡｇｇＴｇＡＣＡＣＴＡＴＡｇＡＡ
ＭＹ１１９
ＣＡｇＡＡＡＴＡＴＴｇＡＡｇｇｇＡｇｇＡＴＣＡＴＣｇｇｇｇｇＣＡＣＡｇＡＡＴｇＣＡＡ
なお、ＭＹ１１９には、ヒトキマーゼの遺伝子を増幅するために必要な塩基配列に加えて、ＳｓｐＩ制限酵素切断部位、ファクターＸａプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列（ＩＥＧＲ：イソロイシン、グルタミン酸、グリシン、アルギニン）を導入するための塩基配列が付加されている。
【００３０】
ＰＣＲにより増幅された約８００ｂｐのＤＮＡ断片を、制限酵素ＳｓｐＩとＥｃｏＲＩによって処理した後、制限酵素ＥｈｅＩとＥｃｏＲＩ処理によって直鎖状にしたｐＰＲＯＥＸ−１ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）とライゲーション反応を行った。得られたコンストラクションを蛍光ＤＮＡシークエンサーを使ってタンパク質翻訳領域の配列解析を行ったところ、Ｎ末端側にｐＰＲＯＥＸ−１ベクターに由来するペプチド（翻訳開始のメチオニン、６個の連続したヒスチジン残基、ｒＴＥＶプロテアーゼ切断配列を含む）を、Ｃ末端側にファクターＸａプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列と成熟型ヒトキマーゼ（前駆体型ヒトキマーゼの１１番のイソロイシンから２４７番のアスパラギンまで）のアミノ酸配列をもつ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列であることが確認された。そして、このベクターをｐＰＲＯ−ｈＣｈｙと呼ぶことにした。
【００３１】
参考例３
ヒトキマーゼ遺伝子を大腸菌で発現させるためのベクターの構築（２）
ｐＰＲＯ−ｈＣｈｙベクターは、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで処理すると、２つのＤＮＡ断片に切断される。このうち小さい方の約７７０ｂｐの断片をアガロース電気泳動で精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩ処理によって直鎖状にしたｐＥＴ２４Ｄベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）とライゲーション反応を行った。得られたコンストラクションを蛍光ＤＮＡシークエンサーを使ってタンパク質翻訳領域の配列解析を行ったところ、ｐＰＲＯ−ｈＣｈｙと全く同じ融合タンパク質が翻訳されるＤＮＡ配列であることが確認された。このベクターをｐＥＴ−ｈＣｈｙと呼ぶことにした。
ヒト心臓キマーゼのｃＤＮＡ取得から、ｐＥＴ−ｈＣｈｙの構築までの流れを図１として示す。
【００３２】
参考例４
ヒトキマーゼ部分ペプチドに対する抗血清の作製
Ｎ−ＣＶＧＮＰＲＫＴＫＳＡＦＫＧＤＳＧＧ−Ｃの配列を有するペプチドを合成し、ＭＢＳ（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）を介してＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）と結合させる。この複合体をフロインド完全アジュバントまたは、フロインド不完全アジュバントと一緒に雌性日本白色種ウサギに注射する。得られた抗血清をＶ８０と呼ぶことにした。ペプチドの合成及び抗血清取得は、パナファーム・ラボラトリーズ株式会社に依頼した。
【００３３】
参考例５
成熟型ヒトキマーゼ融合タンパク質の大腸菌における発現
大腸菌ＢＬ２１株コンピテントセルに参考例２で示したｐＰＲＯ−ｈＣｈｙベクターを導入し、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地）アガロースプレートで選択培養を行った。また、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株コンピテントセルに参考例３で示したｐＥＴ−ｈＣｈｙベクターを導入し、３０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢアガロースプレートで選択培養を行った。プレート上でクローン化した大腸菌は、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン、もしくは、５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１００ｍｌのＬＢ培地中において、３７℃で振盪培養した。１２時間後、この培養液を１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリン、もしくは、５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含む新しい９００ｍｌのＬＢ培地に入れて、３７℃で振盪培養を続けた。６００ｎｍの吸光度が０．４の細胞密度に到達したところで、１００ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−ｂ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を最終濃度が１ｍＭになるように加えて、更に３時間３７℃で振盪培養を行った。
【００３４】
参考例６
大腸菌からの成熟型ヒトキマーゼ融合タンパク質の抽出
液体培地で大量に培養した大腸菌は、４０００Ｘｇ、２０分、４℃の遠心分離で沈殿させ、１００ｍｌの結合バッファー（５ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．９））で４℃にて再懸濁後、再び４０００Ｘｇ、２０分、４℃の遠心分離で沈殿させた。そして、回収した大腸菌を、１００ｍｌの結合バッファーで再懸濁し、ソニケーター（ＴＡＩＴＥＣ社製、ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を出力レベルを１０、サイクルを４０％に設定して４℃にて粉砕した。このソニケーションをかけたサンプルを１２０００Ｘｇ、２０分、４℃の遠心によって、上清（上清１と呼ぶ）と沈殿（沈殿１と呼ぶ）に分離し、上清１を更に、１２０００Ｘｇ、２０分、４℃で遠心することにより上清（上清２と呼ぶ）と沈殿（沈殿２と呼ぶ）に分離した。沈殿１と沈殿２は、一緒に合わせ、６Ｍ尿素を含む結合バッファーを１００ｍｌ加えて再び同一条件のソニケーションにかけて完全に再懸濁し、１時間、氷上にてインキュベートした。この溶液を１２０００Ｘｇ、２０分、４℃で遠心して上清（上清３と呼ぶ）と沈殿（沈殿３と呼ぶ）に分離した。最終的に得られた画分は次のようになる。
上清２：可溶性画分
上清３：６Ｍ尿素で可溶化された画分
沈殿３：６Ｍ尿素で可溶化されない画分
大腸菌にて発現させた成熟型ヒトキマーゼ融合タンパク質がこの３つの画分のどれに主要に存在するかを、参考例４で取得した抗ヒトキマーゼペプチド抗体（Ｖ８０）を用いたウェスタンプロッティングにより解析した。上清２と上清３にヒトキマーゼ融合タンパク質が１対４に割合で存在することが確認された。
【００３５】
参考例７
大腸菌からの成熟型ヒトキマーゼ融合タンパク質の精製
融合タンパク質を精製するのには、ヒスチジンタグアミノ酸配列へのニッケルイオンキレートカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のアフィニティーを利用した。上清２から精製を行う場合は、通常の結合バッファー、洗浄バッファー、溶出バッファーを用いたが、尿素を含む上清３からの精製を行う場合には、それぞれのバッファーに６Ｍの尿素を加えた。まず、カラム樹脂（上清２０ｍｌにつき、樹脂体積１ｍｌを使用）を、その５倍体積の５０ｍＭ硫酸ニッケル水溶液で前処理し、３倍体積の結合バッファーで平衡化した。上清２および３は、０．４５ｕｍのポアサイズのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過した後、カラムにロードした。サンプルをのせた後のカラムは、１０倍体積の結合バッファー、６倍体積の洗浄バッファー（２０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９））で洗浄し、５倍体積の溶出バッファー（１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．９））で溶出を行った。溶出液は、１．２５ｍｌずつの分画として集めて−２０℃にて保存した。どの分画に融合タンパク質が溶出してきているかは、抗ヒトキマーゼペプチド抗体（Ｖ８０）を用いたウェスタンプロッティングによって解析を行った。
【００３６】
参考例８
成熟型ヒトキマーゼ融合タンパク質の再構成
上清３より精製を行った場合、溶出液には６Ｍの尿素が含まれている。タンパク質の沈殿を極力防ぎかつ精製タンパク質が酵素活性を保持する条件でこの尿素を除去した。まず、溶出液を６Ｍ尿素、０．１％トライトンＸ−１００を含む結合バッファーで１０倍希釈し、以下に示した１）から４）の溶液（希釈したサンプル５０ｍｌ対して２Ｌの透析液を使用）に対して、この番号順で４℃、１２時間ずつ合計４８時間透析を行った。
１）４Ｍ尿素、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％トライトンＸ−１００
２）２Ｍ尿素、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％トライトンＸ−１００
３）トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％トライトンＸ−１００
４）トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％トライトンＸ−１００、１ｍＭ塩化カルシウム
透析後のサンプルは、１２，０００Ｘｇ、４℃、２０分の遠心分離で沈澱物を除き、更に、０．２２ｕｍのフィルターで濾過を行い、アミコンＹＭ１０とセントリコン−１０（Ａｍｉｃｏｎ社製）を使って約１０倍程度に濃縮をした。濃縮液のタンパク質濃度は、プロテインアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ社製）を使って定量した。
【００３７】
参考例９
成熟型ヒトキマーゼ融合タンパク質の活性化
生体では、細胞内で翻訳されたキマーゼタンパク質は、Ｎ末端側に１９アミノ酸残基のシグナルペプチド配列を持っている。この最初に翻訳されたキマーゼタンパク質は細胞外に分泌される過程において、シグナルペプチド領域が切断され、成熟体のＮ末端にグリシンとグルタミン酸の２アミノ酸残基がついたプロ体となる。プロ体にはプロテアーゼの活性はなく、何らかのプロテアーゼによってこの２アミノ酸プロ配列がプロセシングを受け、活性を有する成熟体に変換することがわかっている。
【００３８】
本明細書において大腸菌で発現させた成熟型ヒトキマーゼは、参考例２において示したように、成熟型ヒトキマーゼのＮ末端側に６個の連続したヒスチジン残基、ｒＴＥＶプロテアーゼ切断配列、ファクターＸａプロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列との融合タンパク質である。従って、この融合タンパク質にはキマーゼの活性が無いことが予測される。成熟型ヒトキマーゼのＮ末端側に付加したアミノ酸タグ配列を切り出して、活性を有するヒトキマーゼを取得するために、ファクターＸａ（Ｄａｎｅｘ Ｂｉｏｔｃｋ社製）による処理を行った。
【００３９】
１００ｕｇのヒトキマーゼ融合タンパク質を、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１％トライトンＸ−１００、１ｍＭ塩化カルシウム中で１ｕｇのファクターＸａと３７℃で３時間インキュベートした。ファクターＸａ処理前と処理後のサンプルをＳＤＳ Ｐｏｌｙ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び、ウェスタンプロッティングによって解析すると、処理前に約３０ｋＤａであった分子量が、処理後に約２７ｋＤａへシフトすることがわかった。使用した酵素の特異性と分子量の変化より、成熟型ヒトキマーゼ融合タンパク質のＮ末端側に付加したタグ配列がファクターＸａ認識部位で切断されたものと考察された。
【００４０】
次にファクターＸａ処理したサンプルのキマーゼ活性を測定した。アンジオテンシンＩは、活性化したキマーゼによって、アンジオテンシンIIとヒスチジン−ロイシンのジペプチドに分解されることが知られている。
アンジオテンシンＩ→アンジオテンシンII＋Ｈｉｓ−Ｌｅｕ （イ）
ファクターＸａ処理したキマーゼサンプルを１５０ｍＭホウ酸−四ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中で、０．７７ｍＭアンジオテンシンＩと３７℃で２時間インキュベーションした。このプロテアーゼ反応を逆相クロマトグラフィー（カラム：Ｗｉｄｅ−Ｐｏｒｅ Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ（Ｃ１８）５ ｕｍ ｓｔａｎｄａｒｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ４．６Ｘ ２５０ｍｍ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製）、アセトニトリルの勾配：０％から４０％（０．１％トリフルオロ酢酸、０．０８％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルを使用）、流速：１ｍｌ／分）によって分析したところ、確かに上記（イ）の変換反応が起きていることがわかった。
【００４１】
（イ）の反応を多検体で評価し、反応の効率を定量化するためにマイクロプレートを使った反応と計測を行った。９％のトリクロロ酢酸を加えた後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心を行う。上清を回収し。０．８４Ｎの水酸化ナトリウム、０．７７％のオルトフタルアルデヒドを加えて、室温（２５℃）で５分間反応させる。２．６Ｎの塩酸を加えて、３４０ｎｍで励起し、４９０ｎｍの蛍光強度を測定した。その結果、
（Ａ）ファクターＸａで処理したキマーゼサンプルでは、アンジオテンシンＩの切断を観察することができた。しかし、
（Ｂ）ファクターＸａで処理していないキマーゼサンプル
（Ｃ）ヒトキマーゼ融合タンパク質と同等の精製過程を経た大腸菌（ＩＰＴＧによる誘導前）のタンパク質サンプル
（Ｄ）ファクターＸａのみでは、アンジオテンシンＩの切断は観察されなかった。
以上より、
＜１＞大腸菌によって発現させた成熟型ヒトキマーゼ融合タンパク質は、そのままでは、プロテアーゼ活性を持たないが、ファクターＸａ処理によって活性化しうること。
＜２＞ファクターＸａによって活性化されたヒトキマーゼは、アンジオテンシンＩをアンジオテンシンIIに特異的に変換すること。
＜３＞この変換の活性は、大腸菌が持つ他のプロテアーゼやファクターＸａに起因する物ではなく、活性化させたヒトキマーゼによるものであること。
が確認された。
【００４２】
薬理試験例
組み換えヒトキマーゼの酵素活性阻害測定
参考例で得られた０．１〜０．２単位（なお、１単位は１秒間に１ｐｍｏｌのアンジオテンシンIIをアンジオテンシンＩから生成するキマーゼの酵素活性を示す）の活性型ヒトキマーゼを含むバッファーＡ（２Ｍ ＫＣｌ，２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０）の４０μｌに、バッファーＢ（４０ｍＭトリス塩酸，０．２％トライトンＸ−１００，５％アセトニトリル、ｐＨ８．０）１００μｌと、０．１ｍＭアプロチニン（和光純薬）２０μｌと、適当な濃度となるように調整された本発明において合成された化合物を含むスルホキシド溶液２０μｌを加えた後、基質として、２．５ｍＭスクシニル−アラニル−アラニル−プロリル−フェニルアラニル−パラニトロアニリド（ＳＩＧＭＡ）２０μｌを加え室温で反応させた。４０５ｎｍの吸光度の経時変化を測定し、阻害活性を調べｃｈｙｍａｓｅＩＣ₅₀として示した。
【００４３】
キモトリプシンの酵素活性阻害測定
０．２Ｕ／ｍｌのキモトリプシン（ウシ膵臓由来、和光純薬）４０μｌに、バッファーＣ（５０ｍＭトリス塩酸，０．２％トライトンＸ−１００，５％アセトニトリル、ｐＨ８．３）１００μｌと、適当な濃度となるように調整された本発明において合成された化合物を含むジメチルスルホキシド溶液２０μｌを加えた後、基質として１ｍＭメトキシ−スクシニル−アルギニル−プロリル−チロシル−パラニトロアニリド（ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＸ）４０μｌを加え室温で反応させた。４０５ｎｍの吸光度の経時変化を測定し、阻害活性を調べｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ＩＣ₅₀として示した。
【００４４】
実施例１＜化合物Ｎｏ．１の合成＞
テトラヒドロフラン（以下ＴＨＦと略す）２０ｍｌ中に１．６２ｇ（１０ｍｍｏｌ）の１，１′−カルボニルジイミダゾールを溶解し、２．１２ｇ（１０ｍｍｏｌ）のジフェニル酢酸をＴＨＦ２０ｍｌに溶解したものを滴下した。０．５時間２５℃で撹拌した後０．５時間加熱還流した。反応液を２５℃に冷却し、２．０７ｇ（１０ｍｍｏｌ）の２−ナフタレンスルホンアミド及び１．４９ｍｌ（１０ｍｍｏｌ）の１，８−ジアザビシクロ−［５．４．０］−７−ウンデセンをＴＨＦ１０ｍｌに溶解したものを滴下し、一晩２５℃で撹拌した。反応液を１Ｎ塩酸水溶液２００ｍｌ中にあけ析出した結晶を濾取し、表題化合物を白色固体として３．８１ｇ（収率９５％）を得た。
【００４５】
実施例２＜化合物Ｎｏ．２の合成＞
実施例１と同様の方法で１．４１ｇ（５．０ｍｍｏｌ）のビス（４−クロロフェニル）酢酸と１．０４ｇ（５．０ｍｍｏｌ）の２−ナフタレンスルホンアミドから表題化合物を白色固体として１．５７ｇ（収率６７％）得た。
【００４６】
実施例３＜化合物Ｎｏ．３の合成＞
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦと略す）２０ｍｌ中に１．２９ｇ（１０ｍｍｏｌ）の４−クロロフェノールと２．７８ｇ（１０ｍｍｏｌ）のブロモフェニル酢酸エチルエステルから２−フェニル−２−（４−クロロフェノキシ）酢酸エステルを白色固体として１．７０ｇ（５７％）得た。次いで４．１５ｇ（３０ｍｍｏｌ）の炭酸カリウムを加え、１時間８０℃で撹拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、蒸留水で１回洗浄後有機層を減圧下濃縮した。残渣をエタノール２０ｍｌに溶解し、１５ｍｌ（１５ｍｍｏｌ）の１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え、０．５時間８０℃で撹拌した。氷冷下反応液を希塩酸で酸性とし、析出した固体を濾取し、２−フェニル−２−（４−クロロフェノキシ）酢酸を白色固体として２．３６ｇ（収率９０％）を得た。
この化合物１．３１ｇ（５．０ｍｍｏｌ）と１．０４ｇ（５．０ｍｍｏｌ）の２−ナフタレンスルホンアミドから実施例１と同様にして、表題化合物を白色固体として１．４８ｇ（収率６５％）得た。
【００４７】
実施例４＜化合物Ｎｏ．４の合成＞
実施例３と同様にして０．９４ｇ（１０ｍｍｏｌ）のフェノールと２．４３ｇ（１０ｍｍｏｌ）のブロモフェニル酢酸エチルエステルから２−フェニル−２−フェノキシ酢酸を白色固体として１．６３ｇ（収率７１％）得た。
この化合物１．１４ｇ（５．０ｍｍｏｌ）と１．０４ｇ（５．０ｍｍｏｌ）の２−ナフタレンスルホンアミドから表題化合物を白色固体として１．４４ｇ（収率６９％）得た。
【００４８】
実施例５＜化合物Ｎｏ．５の合成＞
実施例３と同様にして１．２９ｇ（１０ｍｍｏｌ）の４−クロロフェノールと２．７８ｇ（１０ｍｍｏｌ）のブロモ−４−クロロフェニル酢酸エチルエステルから２−（４−クロロフェニル）−２−（４−クロロフェノキシ）酢酸を白色固体として１．７０ｇ（収率５７％）得た。
この化合物１．４９ｇ（５．０ｍｍｏｌ）と１．０４ｇ（５．０ｍｍｏｌ）の２−ナフタレンスルホンアミドから表題化合物を白色固体として２．１０ｇ（収率８６％）得た。
【００４９】
実施例６＜化合物Ｎｏ．１３の合成＞
実施例３と同様の方法で０．７７ｇ（７．０ｍｍｏｌ）のチオフェノールと２．０５ｇ（７．０ｍｍｏｌ）のブロモナフチル酢酸エチルエステルから２−ナフチル−２−フェニルチオ酢酸を白色固体として１．２０ｇ（収率５８％）得た。
この化合物１．１８ｇ（４．０ｍｍｏｌ）と０．８３ｇ（４．０ｍｍｏｌ）の２−ナフタレンスルホンアミドから表題化合物を白色固体として１．３０ｇ（収率６７％）得た。
実施例１〜６と同様にして合成したＮｏ．１〜Ｎｏ．１６の化合物の構造、分析値、薬理データを下記表−１に示した。
【００５０】
【表１】

【００５１】
【表２】

【００５２】
【表３】

【００５３】
【表４】

【００５４】
【表５】

【００５５】
【表６】

【００５６】
【表７】

【００５７】
【表８】

【００５８】
【発明の効果】
実施例から明らかな様に、本発明で得られる前記一般式（Ｉ）で示される新規なアシルスルホンアミド誘導体は、優れたキマーゼ阻害活性を有し、キマーゼの関与する各種疾患の治療及び予防のための医薬として期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト心臓キマーゼのｃＤＮＡ取得から、ｐＥＴ−ｈＣｈｙの構築までの流れを示す図。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel acylsulfonamide derivative having chymase inhibitory action.
[0002]
[Prior art]
Chymase is a serine protease that is present in mast cell granules and shows specificity for chymotrypsin-like substrates, but is secreted by degranulation of mast cells and binds to extracellular matrices such as heparan sulfate proteoglycans, It is known that the enzyme activity is exerted in the heart, blood vessels, skin, etc. for a long time and is deeply involved in various biological reactions. Recently, it has been reported that chymase is involved in the production of angiotensin II, an extremely potent vasoconstrictor, in the heart and blood vessels (Circ. Res. 66 , 883, 1990). Accordingly, compounds having chymase inhibitory action are expected as new therapeutic agents for cardiovascular diseases involving angiotensin II (for example, hypertension, heart failure, coronary artery disease, diabetic and non-diabetic nephropathy, etc.). In addition to producing angiotensin II, chymase has various actions such as promoting degranulation of mast cells, activation of interleukin-1-β, activation of matrix metalloprotease, release of transforming growth factor β. Therefore, the inhibitor is attracting attention as it can be a new type of anti-inflammatory agent or anti-allergic agent.
To date, compounds having chymase inhibitory activity have been disclosed in, for example, International Patent Application Publication No. 93/25574, International Patent Application Publication No. 96/04248, International Patent Application Publication No. 98/09949, and the like. However, it cannot be said that practically satisfactory results have been obtained as a pharmaceutical product, and there has been no clinical application.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel acylsulfonamide derivative capable of preventing and treating various diseases by selectively inhibiting human chymase and a pharmaceutical comprising the same as an active ingredient.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have found a novel acylsulfonamide derivative having an excellent chymase inhibitory action. That is, the gist of the present invention is the following general formula (I)
[0005]
[Chemical formula 2]

[0006]
{Where R is ¹ Represents a phenyl group, a naphthyl group or a hydrogen atom which may have a substituent, and R ² Represents a phenyl group or a hydrogen atom which may have a substituent selected from a halogen atom, an alkoxy group, an amino group, a cyano group, a carboxyl group and a nitro group. However, R ¹ And R ² Are not hydrogen atoms at the same time. R ^Three Represents an aryl group which may have a substituent. X represents -O-, -S (O) n- (n represents an integer of 0 to 2) or a single bond. }, Pharmaceutically acceptable salts thereof, hydrates or solvates thereof, pharmaceutical compositions containing these as active ingredients, chymase inhibitors, and therapeutic and prophylactic agents for various diseases .
The compound of the general formula (I) may have an optically active form, but the present invention includes both a racemic form and an optically active form.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The novel acylsulfonamide derivative of the present invention is represented by the general formula (I). In general formula (I), R ¹ Represents a phenyl group, a naphthyl group or a hydrogen atom which may have a substituent.
[0008]
As substituents of these groups, a halogen atom, C ₁ ~ C ₂₀ Alkyl group of ₁ ~ C _Ten An alkoxy group of ₁ ~ C _Ten Alkylthio group of ₁ ~ C _Ten An alkylsulfinyl group of C ₁ ~ C _Ten An alkylsulfonyl group of C ₁ ~ C _Four A haloalkyl group of C ₁ ~ C _Four A haloalkoxy group of C ₂ ~ C ₈ An alkoxycarbonyl group of C ₁ ~ C _Ten An alkylamino group of C ₂ ~ C ₆ Dialkylamino group of C ₆ ~ C ₁₄ Aryl group, cyano group, nitro group, amino group, amidino group, C ₁ ~ C _Ten 1 to 2 identical or different groups selected from among a carboxyl group, a hydroxyl group and a heterocyclic group having an alkyl group or an alkenyl group.
[0009]
Examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, and a bromine atom, and C ₁ ~ C _Ten Alkyl group of ₁ ~ C _Ten An alkoxy group of ₁ ~ C _Ten Alkylthio group of ₁ ~ C _Ten An alkylsulfinyl group of C ₁ ~ C _Ten An alkylsulfonyl group of C ₂ ~ C ₈ An alkoxycarbonyl group of C ₁ ~ C _Ten An alkylamino group of C ₂ ~ C ₆ As the alkyl chain moiety in the dialkylamino group, methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, isopentyl group, neopentyl group, tert- Examples include a pentyl group, a hexyl group, an isohexyl group, a heptyl group, an octyl group, a nonyl group, and a decyl group.
[0010]
C above ₁ ~ C _Four Examples of the haloalkyl group include trifluoromethyl group, pentafluoroethyl group, heptafluoropropyl group, nonafluorobutyl group, trichloromethyl group, pentachloroethyl group, and the like. ₁ ~ C _Four Examples of the haloalkoxy group include a trifluoromethoxy group, a difluoromethoxy group, a 2,2,2-trifluoroethoxy group, and a 1,1,2,2-tetrafluoroethoxy group.
[0011]
C ₂ ~ C ₆ Examples of the alkoxycarbonyl group include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a propoxycarbonyl group, an isopropoxycarbonyl group, a butoxycarbonyl group, and a pentyloxycarbonyl group.
C ₁ ~ C _Ten Examples of the alkylamino group include a methylamino group, an ethylamino group, a propylamino group, and an isopropylamino group. ₂ ~ C ₆ Examples of the dialkylamino group include dimethylamino group, diethylamino group, dipropylamino group, and the like. ₆ ~ C ₁₄ Examples of the aromatic hydrocarbon ring group include a phenyl group and a naphthyl group.
[0012]
Examples of the heterocyclic group include 2-thienyl group, 3-thienyl group, 1-thianthrenyl group, 2-thianthrenyl group, 2-furyl group, 3-furyl group, 2H-pyran-3-yl group, and 2H. -Pyran-4-yl group, 2H-pyran-5-yl group, 2H-pyran-6-yl group, isobenzofuranyl group, 2H-chromen-3-yl group, 2H-chromen-4-yl group, 2H-chromen-5-yl group, 2H-chromen-6-yl group, 2H-chromen-7-yl group, 2H-chromen-8-yl group, 2H-pyrrol-3-yl group, 2H-pyrrole-4 -Yl group, 2H-pyrrol-5-yl group, 2-pyrrolyl group, 3-pyrrolyl group, 1-imidazolyl group, 2-imidazolyl group, 4-imidazolyl group, 5-imidazolyl group, 1-pyrazolyl group, 3- Pyrazolyl group, 4-pi Zolyl group, 5-pyrazolyl group, 3-isothiazolyl group, 4-isothiazolyl group, 5-isothiazolyl group, 3-isoxazolyl group, 4-isoxazolyl group, 5-isoxazolyl group, 2-pyridyl group, 3-pyridyl group, 4- Pyridyl group, 2-pyrazinyl group, 2-pyrimidinyl group, 4-pyrimidinyl group, 5-pyrimidinyl group, 3-pyridazinyl group, 4-pyridazinyl group, 1-indolidinyl group, 2-indolidinyl group, 3-indolidinyl group, 5- Indolizinyl group, 6-indolidinyl group, 7-indolidinyl group, 8-indolidinyl group, 1-isoindolyl group, 4-isoindolyl group, 5-isoindolyl group, 3H-indol-2-yl group, 3H-indol-4-yl group 3H-indol-5-yl group, 1-indolyl group, 2-India Group, 3-indolyl group, 4-indolyl group, 5-indolyl group, 6-indolyl group, 7-indolyl group, 1H-indazol-3-yl group, 1H-indazol-4-yl group, 1H-indazole- 5-yl group, 1H-indazol-6-yl group, 1H-indazol-7-yl group, 2-prill group, 6-prill group, 8-prill group, 4H-quinolizin-1-yl group, 4H-quinolidine 2-yl group, 4H-quinolizin-3-yl group, 4H-quinolizin-6-yl group, 4H-quinolizin-7-yl group, 4H-quinolizin-8-yl group, 4H-quinolizin-9-yl group 1-isoquinolyl group, 3-isoquinolyl group, 4-isoquinolyl group, 5-isoquinolyl group, 6-isoquinolyl group, 7-isoquinolyl group, 8-isoquinolyl group, 2-quinolyl group, 3 -Quinolyl group, 4-quinolyl group, 5-quinolyl group, 6-quinolyl group, 7-quinolyl group, 8-quinolyl group, 1H-tetrazol-5-yl group, 3H-tetrazol-5-yl group, 1-phthalazinyl Group, 5-phthalazinyl group, 6-phthalazinyl group, 1,8-naphthyridin-2-yl group, 1,8-naphthyridin-3-yl group, 1,8-naphthyridin-4-yl group, 2-quinoxalinyl group, 5-quinoxalinyl group, 6-quinoxalinyl group, 2-quinazolinyl group, 4-quinazolinyl group, 5-quinazolinyl group, 6-quinazolinyl group, 7-quinazolinyl group, 8-quinazolinyl group, 3-cinnolinyl group, 4-cinnolinyl group, 5-cinnolinyl group, 6-cinnolinyl group, 7-cinnolinyl group, 8-cinnolinyl group, 2-pteridinyl group, 4-pteridinyl group, -Pteridinyl group, 7-Pteridinyl group, 4aH-carbazol-1-yl group, 4aH-carbazol-2-yl group, 4aH-carbazol-3-yl group, 4aH-carbazol-4-yl group, 4aH-carbazole-5 -Yl group, 4aH-carbazol-6-yl group, 4aH-carbazol-7-yl group, 4aH-carbazol-8-yl group, 1-carbazolyl group, 2-carbazolyl group, 3-carbazolyl group, 4-carbazolyl group Β-carbolin-1-yl group, β-carbolin-3-yl group, β-carbolin-4-yl group, β-carbolin-5-yl group, β-carbolin-6-yl group, β-carboline- 7-yl group, β-carbolin-8-yl group, 1-acridinyl group, 2-acridinyl group, 3-acridinyl group, 4-acridinyl group, 9- Acridinyl group, 1-phenazinyl group, 2-phenazinyl group, 1-phenothiazinyl group, 2-phenothiazinyl group, 3-phenothiazinyl group, 4-phenothiazinyl group, 3-furazanyl group, 1-phenoxazinyl group, 2-phenoxazinyl group Group, 3-phenoxazinyl group, 4-phenoxazinyl group, 1-isochromanyl group, 3-isochromanyl group, 4-isochromanyl group, 5-isochromanyl group, 6-isochromanyl group, 7-isochromanyl group, 8-isochromanyl group, 2-chromanyl group Group, 3-chromanyl group, 4-chromanyl group, 5-chromanyl group, 6-chromanyl group, 7-chromanyl group, 8-chromanyl group, 1-pyrrolidinyl group, 2-pyrrolidinyl group, 3-pyrrolidinyl group, 2-pyrroline -1-yl group, 2-pyrrolin-2-yl group, 2-pyro N-3-yl group, 2-pyrrolin-4-yl group, 2-pyrrolin-5-yl group, 1-imidazolidinyl group, 2-imidazolidinyl group, 3-imidazolidinyl group, 2-imidazolin-1-yl group, 2 -Imidazolin-2-yl group, 2-imidazolin-4-yl group, 2-imidazolin-5-yl group, 1-pyrazolidinyl group, 3-pyrazolidinyl group, 4-pyrazolidinyl group, 3-pyrazolin-1-yl group, 3-pyrazolin-2-yl group, 3-pyrazolin-3-yl group, 3-pyrazolin-4-yl group, 3-pyrazolin-5-yl group, 1-piperidyl group, 2-piperidyl group, 3-piperidyl group 4-piperidyl group, 1-piperazinyl group, 2-piperazinyl group, 1-indolinyl group, 2-indolinyl group, 3-indolinyl group, 4-indolinyl group, 5-i Dorynyl group, 6-indolinyl group, 7-indolinyl group, 1-isoindolinyl group, 2-isoindolinyl group, 4-isoindolinyl group, 5-isoindolinyl group, 1-quinuclidinyl group, 2-quinuclidinyl group, 3-quinuclidinyl group, 4- Quinuclidinyl group, 2-morpholinyl group, 3-morpholinyl group, 4-morpholinyl group, 1,2,4-triazol-3-yl group, 1,2,3-triazol-4-yl group, 1,2,4- Oxadiazol-3-yl group, 1,2,4-oxadiazol-5-yl group, 1,2,4-thiadiazol-3-yl group, 1,2,4-thiadiazol-5-yl group, Benzothiazol-2-yl group, benzoxazol-2-yl group, benzimidazol-2-yl group, benzisoxazol-3-yl Group, benzisothiazol-3-yl group, benzisothiazol-3-yl-1,1-dioxide group, indol-3-yl group, syn-triazinyl group, as-triazinyl group and the like.
In addition, two substituents may be linked to form a cyclic structure, and the size of the ring is a 4-membered ring, a 5-membered ring, a 6-membered ring, a 7-membered ring that can exist chemically stably, An 8-membered ring containing one or more heteroatoms (oxygen atom, nitrogen atom, sulfur atom) in the cyclic structure is exemplified.
[0013]
In general formula (I), R ² Is a phenyl group which may have a substituent selected from a hydrogen atom or a halogen atom, an alkoxy group, an amino group, a cyano group, a carboxyl group and a nitro group. Examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, and a bromine atom. As the alkoxy group, methoxy group, ethoxy group, propoxy group, i-propoxy group, butoxy group, i-butoxy group, s-butoxy group, t-butoxy group, pentoxy group, i-pentoxy group, neopentoxy group, t- C such as pentoxy group, hexyloxy group, heptyloxy group, octyloxy group, nonyloxy group, decyloxy group, etc. ₁ ~ C _Ten And an alkoxy group having a straight chain or a branched chain.
In the general formula (I), X is O, S, SO, SO ₂ Or a single bond is shown. In general formula (I), R ¹ And R ² Are not hydrogen atoms at the same time.
[0014]
The compound of the general formula (I) can be produced by a combination of methods known per se.
The compound of the present invention has optical isomers, and any of R configuration, S configuration and mixed configuration thereof is within the scope of the present invention.
The compound of the present invention can be produced, for example, by the following method.
[0015]
[Chemical 3]

[0016]
(Wherein R ¹ , R ² And X is as defined above, X ′ is —OH or —SH, Hal is halogen, and R is lower alkyl. )
In this production method, compounds (1) and (2) are condensed under appropriate conditions to obtain compound (3), which is hydrolyzed by a conventional method to obtain compound (4). The condensation reaction is carried out in the presence of a base such as potassium carbonate, sodium carbonate or sodium hydroxide in a solvent such as dimethylformamide, acetonitrile or acetone, preferably at room temperature to warming, preferably at around 80 ° C. for several hours to 24 hours. The reaction is preferably performed for about 0.5 to 6 hours. In the hydrolysis, the compound (3) is dissolved in a lower alcohol such as methanol or ethanol, and a base such as 1N sodium hydroxide or potassium hydroxide aqueous solution is added at an appropriate concentration, for example, cooling to warming, preferably room temperature. Compound (4) can be obtained by reacting for about 1 to 24 hours in the vicinity.
[0017]
[Formula 4]

(Where R ^Three Is as defined above. )
[0018]
Next, the carboxyl group of the compound (4) dissolved in the solvent is activated and condensed with the sulfonamide compound (5) in the presence of a base under cooling to warming, preferably near room temperature, to obtain the compound (I). .
As the solvent, for example, tetrahydrofuran, diethyl ether, dimethoxyethane, methylene chloride, 1,2-dichloroethane or the like may be used, and for example, 1,1′-carbonyldiimidazole is used for activating the carboxyl group. As the base, for example, 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undes-7-ene can be preferably used.
As the compounds (1), (2) and (5) used in the above synthesis method, a known compound or a compound synthesized from a known product by a usual method can be used.
[0019]
Since the acylsulfonamide derivative of the present invention has a selective inhibitory action on chymase, it is useful for the treatment and prevention of various diseases involving chymase. Specifically, hypertension, congestive heart failure, cardiomyopathy, arteriosclerosis, coronary artery disease, myocardial infarction, vascular restenosis after angioplasty or thrombolytic treatment, peripheral circulatory disturbance, vasculitis, diabetic or non-diabetic Include kidney disease, pulmonary hypertension, bronchial asthma, chronic obstructive pulmonary disease, chronic bronchitis, emphysema, allergic rhinitis, atopic dermatitis, rheumatism, arthritis, cancer and the like.
[0020]
When the compound of the present invention is used as a medicine, the active ingredient is an active ingredient selected from the compound that defines the structure in the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and hydrates and solvates thereof. The substance and a pharmaceutically acceptable solid or liquid pharmaceutical carrier or diluent, that is, together with excipients, stabilizers and the like, can be formulated and administered to animals including humans orally or parenterally. Examples of parenteral administration include intravenous, subcutaneous, intramuscular, transdermal, rectal, nasal, and intraocular administration. In the preparation, the ratio of the active ingredient to the carrier component can be varied between 1 to 90% by weight.
[0021]
Examples of the dosage form for oral administration include tablets, pills, granules, powders, solutions, syrups, capsules and the like. The tablet can be molded by a conventional method using a pharmaceutically acceptable carrier such as an excipient, a binder, and a disintegrant. Pills, granules, and powders can be molded by an ordinary method using excipients as in the case of tablets. Liquids and syrups can be molded by conventional methods using glycerin esters, alcohols, water, vegetable oils and the like. The capsule can be molded by filling a capsule such as gelatin with a granule, powder, or liquid.
[0022]
In the case of intravenous, subcutaneous and intramuscular administration among parenteral administration agents, it can be administered as an injection. As an injection, when the compound defining the structure in the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof is dissolved in an aqueous solution such as physiological saline, or from an organic ester such as propylene glycol, polyethylene glycol or vegetable oil. The case where it melt | dissolves in the water-insoluble liquid agent which becomes.
In the case of transdermal administration, it can be used as a dosage form such as an ointment or cream. That is, the compound which defines the structure in the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be mixed with oils or fats or petroleum jelly as an ointment, and mixed with an emulsifier as a cream to be molded.
In the case of rectal administration, a suppository can be prepared using a gelatin soft capsule or the like.
[0023]
In the case of nasal administration, it can be used as a preparation comprising a liquid or powder composition. As the base of the liquid agent, water, saline solution, phosphate buffer solution, acetate buffer solution and the like are used, and it may further contain a surfactant, an antioxidant, a stabilizer, a preservative, and a viscosity imparting agent. Good. As the base of the powdery agent, for example, water-soluble polyacrylates, cellulose lower alkyl ethers, polyethylene glycol polyvinylpyrrolidone, amylose and other water-absorbing ones, for example, celluloses, proteins, Examples include poorly water-soluble materials such as gums and cross-linked vinyl polymers, and these may be used as a mixture. Furthermore, you may add antioxidant, a coloring agent, a preservative, an antiseptic | preservative, a corrigent etc. to a powdery agent.
[0024]
In the case of intraocular administration, it can be used as an aqueous or non-aqueous eye drop. As an aqueous eye drop, sterilized purified water, physiological saline, or the like can be used as a solvent. When only sterilized purified water is used as a solvent, it can be used as an aqueous suspension eye drop by adding a suspension agent such as a surfactant or a polymer thickener, and a nonionic surfactant or the like can be used. It can also be used as a solubilized eye drop by adding a solubilizer. As a non-aqueous eye drop, a non-aqueous solvent for injection can be used as a solvent, and it can be used as a non-aqueous suspension eye drop.
In the case of inhalation through the nose, mouth, etc., the compound having the structure defined in the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof is used as a solution or suspension with a commonly used pharmaceutical excipient, for example, inhalation. Administer using aerosol spray. Alternatively, the compound having a structure defined in the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof can be administered in an inhaler or the like in a dry powder form and brought into direct contact with the lung.
[0025]
To these various preparations, pharmaceutically acceptable carriers such as isotonic agents, preservatives, preservatives, wetting agents, buffering agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers and the like are added as necessary. be able to. In addition, these preparations can be sterilized by treatment with a bactericide, filtration using a bacteria retention filter, heating, irradiation, or the like, if necessary. Alternatively, a sterile solid preparation can be produced and dissolved or suspended in a suitable sterile solution immediately before use.
The clinical dose is preferably set in consideration of the type of disease, administration route, patient symptom, age, sex, body weight, etc., but in the case of oral administration to an adult, 1 to 1000 mg / The day is divided into 1 to several times. In the case of parenteral administration, although it varies greatly depending on the administration route, 0.1 mg to 100 mg / day is usually administered once to several times.
[0026]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although the manufacture example and pharmacological test example of this invention compound are shown and this invention is demonstrated further more concretely, this invention is not restrict | limited to a following example, unless the summary is exceeded.
In addition, the acquisition method of chymase used for the pharmacological test is shown as a reference example.
In addition, Compound No. Is the compound No. of Table-1. Corresponding to
[0027]
Reference example 1
Acquisition of chymase cDNA from human heart
Human heart chymase cDNA was obtained from a human heart cDNA library (Clontech) by the PCR (polymerase chain reaction) method. The sequence of the synthetic oligonucleotide DNA used for the reaction is as follows.
MY81:
AgCCTCTCTgggAAAgATgCTgCTT
MY82:
GgATCCAggATTAATTTTgCCTgCAg
MY97:
gATgCTgCTCTCTCTCCTCCCCCTgCTg
MY99:
TTAATTTTgCCTgCAggATCTggTTgATCCA
This primer sequence was determined with reference to GenBank accession number M69136.
[0028]
First, 1 ul of cDNA derived from human heart, 2 ul of 2.5 mM dATP, 2.5 mM dTTP, 2.5 mM dGTP, 2.5 mM dCTP, 5 ul of 20 uM MY81, 5 ul of 20 uM MY82, Taq polymerase (Perkin-Elmer) 1 ul, 76 ul of sterilized water is added to a mixture of 10 ul of reaction buffer attached to Taq polymerase to make 100 ul, and 1 cycle of 94 ° C, 1 min, 55 ° C, 2 min, 72 ° C, 1 min The reaction was repeated 24 times, and then the reaction at 94 ° C., 1 minute, 55 ° C., 2 minutes, 72 ° C., 5 minutes was performed once. Furthermore, 1 ul of this reaction product solution, 2 ul of 2.5 mM dATP, 2.5 mM dTTP, 2.5 mM dGTP, 2.5 mM dCTP, 5 ul of 20 uM MY97, 5 ul of 20 uM MY99, 1 ul of Taq polymerase, 10 ul of reaction buffer 76 ul of sterilized water was added to the mixed solution to make 100 ul, and the reaction was repeated 24 times at 94 ° C., 1 minute, 55 ° C., 2 minutes, 72 ° C., 1 minute, then 94 ° C., 1 minute, 55 The reaction was carried out once at 5 ° C. for 2 minutes at 72 ° C. When 5 ul of the reaction solution was electrophoresed on a 1% agarose gel, it was confirmed that a DNA fragment of about 745 bp was specifically amplified. This DNA fragment was subcloned into a pCRII vector (Invitrogen) (this vector will be referred to as pCRII-hChy), and the DNA sequence was analyzed using a fluorescent DNA sequencer (model 394: Applied Biosystems). As a result, it was confirmed that the amplified DNA was a DNA encoding the protein of human heart chymase, including the region between the 16th and 759th DNA sequences registered as GenBank accession number M69136. It was.
[0029]
Reference example 2
Construction of vector for expressing human chymase gene in E. coli (1)
A vector for expressing the human chymase gene in E. coli was constructed.
First, PCR was performed using the pCRII-hChy vector obtained in Reference Example 1 as a template and Sp6 and MY119 as primers. The sequences of the synthetic oligonucleotide DNA primers Sp6 and MY119 are as follows.
Sp6
ATTTAGgTgACACTATAgAA
MY119
CAgAATAATTgAAAGggAggATCATTCggggCACAgAATgCAA
In MY119, in addition to the nucleotide sequence necessary for amplifying the human chymase gene, an SspI restriction enzyme cleavage site and an amino acid sequence cleaved by factor Xa protease (IEGR: isoleucine, glutamic acid, glycine, arginine) were introduced. A base sequence is added.
[0030]
An about 800 bp DNA fragment amplified by PCR was treated with restriction enzymes SspI and EcoRI, and then ligated with pPROEX-1 vector (manufactured by Life Technologies) linearized by restriction enzymes EheI and EcoRI. . When the obtained construction was subjected to sequence analysis of the protein translation region using a fluorescent DNA sequencer, the peptide derived from the pPROEX-1 vector (translation-initiating methionine, 6 consecutive histidine residues, rTEV) Coding for a fusion protein having an amino acid sequence cleaved by factor Xa protease and an amino acid sequence of mature human chymase (from precursor human chymase 11 isoleucine to 247 asparagine) on the C-terminal side It was confirmed that this was a DNA sequence. This vector was called pPRO-hChy.
[0031]
Reference example 3
Construction of vector for expressing human chymase gene in E. coli (2)
The pPRO-hChy vector is cleaved into two DNA fragments when treated with restriction enzymes NcoI and EcoRI. The smaller fragment of about 770 bp was purified by agarose electrophoresis, and ligated with a pET24D vector (manufactured by Novagen) that was linearized by treatment with restriction enzymes NcoI and EcoRI. When the obtained construction was subjected to sequence analysis of the protein translation region using a fluorescent DNA sequencer, it was confirmed that it was a DNA sequence in which the same fusion protein as pPRO-hChy was translated. This vector was called pET-hChy.
FIG. 1 shows the flow from the acquisition of human heart chymase cDNA to the construction of pET-hChy.
[0032]
Reference example 4
Preparation of antiserum against human chymase partial peptide
A peptide having a sequence of N-CVGNPRKTKSAKGDSGG-C is synthesized and combined with KLH (keyhole limpet hemocyanin) via MBS (m-maleidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester). This complex is injected into female Japanese white rabbits with Freund's complete or incomplete Freund's adjuvant. The resulting antiserum was called V80. Panafarm Laboratories was requested to synthesize peptides and obtain antisera.
[0033]
Reference Example 5
Expression of mature human chymase fusion protein in E. coli
The pPRO-hChy vector shown in Reference Example 2 was introduced into E. coli BL21 strain competent cells, and selective culture was performed on LB (Luria-Bertani medium) agarose plates containing 100 ug / ml ampicillin. Further, the pET-hChy vector shown in Reference Example 3 was introduced into E. coli BL21 (DE3) strain competent cells, and selective culture was performed on LB agarose plates containing 30 ug / ml kanamycin. The E. coli cloned on the plate was cultured with shaking at 37 ° C. in 100 ml LB medium containing 100 ug / ml ampicillin or 50 ug / ml kanamycin. After 12 hours, the culture was placed in fresh 900 ml LB medium containing 100 ug / ml ampicillin or 50 ug / ml kanamycin, and shaking culture was continued at 37 ° C. When the absorbance at 600 nm reached a cell density of 0.4, 100 mM IPTG (isopropyl-1-thio-b-D-galactopyranoside) was added to a final concentration of 1 mM, and the mixture was further shaken at 37 ° C. for 3 hours. Culture was performed.
[0034]
Reference Example 6
Extraction of mature human chymase fusion protein from Escherichia coli
Escherichia coli cultured in a large amount in a liquid medium is precipitated by centrifugation at 4000 × g for 20 minutes at 4 ° C., and 4 times with 100 ml of a binding buffer (5 mM imidazole, 0.5 M sodium chloride, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9)). After resuspension at 0 ° C., the precipitate was again precipitated by centrifugation at 4000 × g for 20 minutes at 4 ° C. Then, the recovered E. coli was resuspended in 100 ml of a binding buffer, and pulverized at 4 ° C. with a sonicator (manufactured by TAITEC, ultrasonicator) at an output level of 10 and a cycle of 40%. The sample subjected to this sonication was separated into a supernatant (referred to as Supernatant 1) and a precipitate (referred to as Precipitate 1) by centrifugation at 12000 × g for 20 minutes at 4 ° C., and the supernatant 1 was further separated at 12000 × g for 20 minutes. Centrifugation at 4 ° C. separated the supernatant (referred to as supernatant 2) and the precipitate (referred to as precipitate 2). Precipitate 1 and Precipitate 2 were combined together, 100 ml of binding buffer containing 6M urea was added and completely resuspended by sonication under the same conditions, and incubated on ice for 1 hour. This solution was centrifuged at 12,000 × g for 20 minutes at 4 ° C. to separate into a supernatant (referred to as supernatant 3) and a precipitate (referred to as precipitate 3). The final fraction obtained is as follows.
Supernatant 2: soluble fraction
Supernatant 3: fraction solubilized with 6M urea
Precipitation 3: fraction not solubilized with 6M urea
In which of these three fractions the mature human chymase fusion protein expressed in E. coli is mainly present was analyzed by Western plotting using the anti-human chymase peptide antibody (V80) obtained in Reference Example 4. . It was confirmed that human chymase fusion protein was present at a ratio of 1: 4 in supernatant 2 and supernatant 3.
[0035]
Reference Example 7
Purification of mature human chymase fusion protein from E. coli
To purify the fusion protein, the affinity of a nickel ion chelate column (Novagen) to the histidine tag amino acid sequence was used. When purifying from the supernatant 2, normal binding buffer, washing buffer and elution buffer were used. However, when purifying from the supernatant 3 containing urea, 6 M urea was added to each buffer. . First, a column resin (using 1 ml of resin volume per 20 ml of supernatant) was pretreated with 5 volumes of 50 mM nickel sulfate aqueous solution and equilibrated with 3 volumes of binding buffer. Supernatants 2 and 3 were filtered through a 0.45 um pore size filter (Millipore) and then loaded onto the column. After loading the sample, the column was washed with 10 volumes of binding buffer and 6 volumes of wash buffer (20 mM imidazole, 0.5 M sodium chloride, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9)) and 5 volumes. The elution buffer (1 M imidazole, 0.5 M sodium chloride, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9)) was used for elution. The eluate was collected as 1.25 ml fractions and stored at -20 ° C. To which fraction the fusion protein was eluted was analyzed by Western plotting using an anti-human chymase peptide antibody (V80).
[0036]
Reference Example 8
Reconstitution of mature human chymase fusion protein
When purification is performed from the supernatant 3, the eluate contains 6M urea. This urea was removed under conditions that prevent protein precipitation as much as possible and that the purified protein retains enzyme activity. First, the eluate was diluted 10-fold with a binding buffer containing 6 M urea and 0.1% Triton X-100, and the following solutions 1) to 4) were used (2 L dialysate was used for 50 ml of diluted sample). ) Was dialyzed in this order of numbers at 4 ° C. for 12 hours for a total of 48 hours.
1) 4 M urea, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8), 0.5 M sodium chloride, 0.1% Triton X-100
2) 2M urea, 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8), 0.5M sodium chloride, 0.1% Triton X-100
3) Tris-HCl buffer (pH 8), 0.5M sodium chloride, 0.1% Triton X-100
4) Tris-HCl buffer (pH 8), 0.5 M sodium chloride, 0.1% Triton X-100, 1 mM calcium chloride
The dialyzed sample was centrifuged at 12,000 × g and 4 ° C. for 20 minutes to remove precipitates, and further filtered through a 0.22 μm filter, using Amicon YM10 and Centricon-10 (Amicon). Concentrated to about 10 times. The protein concentration of the concentrate was quantified using a protein assay (Biorad).
[0037]
Reference Example 9
Activation of mature human chymase fusion protein
In living bodies, chymase protein translated in cells has a signal peptide sequence of 19 amino acid residues on the N-terminal side. In the process of secreting this first translated chymase protein extracellularly, the signal peptide region is cleaved, and the mature form becomes a pro form with two amino acid residues of glycine and glutamic acid at the N-terminus. It is known that the pro form has no protease activity, and that this two amino acid pro sequence is processed by some protease and converted into an active mature form.
[0038]
In this specification, mature human chymase expressed in E. coli is cleaved by 6 consecutive histidine residues, rTEV protease cleavage sequence, and factor Xa protease on the N-terminal side of mature human chymase as shown in Reference Example 2. It is a fusion protein with an amino acid sequence. Therefore, this fusion protein is predicted to have no chymase activity. In order to obtain an active human chymase by excising the amino acid tag sequence added to the N-terminal side of mature human chymase, treatment with Factor Xa (manufactured by Danex Biotck) was performed.
[0039]
100 ug of human chymase fusion protein was incubated with 1 ug of Factor Xa for 3 hours at 37 ° C. in Tris-HCl buffer (pH 8), 0.5 M sodium chloride, 0.1% Triton X-100, 1 mM calcium chloride. Analysis of samples before and after Factor Xa analysis by SDS Polyacrylamide gelphoresis (SDS-PAGE) and Western plotting showed that the molecular weight, which was about 30 kDa before processing, was shifted to about 27 kDa after processing. . From the changes in the specificity and molecular weight of the enzyme used, it was considered that the tag sequence added to the N-terminal side of the mature human chymase fusion protein was cleaved at the factor Xa recognition site.
[0040]
Next, the chymase activity of the sample treated with Factor Xa was measured. Angiotensin I is known to be broken down into angiotensin II and histidine-leucine dipeptides by activated chymase.
Angiotensin I → Angiotensin II + His-Leu (I)
Factor Xa-treated chymase samples were incubated with 0.77 mM angiotensin I at 37 ° C. for 2 hours in 150 mM boric acid-sodium tetraborate buffer (pH 8.5). This protease reaction was subjected to reverse phase chromatography (column: Wide-Pore Octadecyl (C18) 5 um standard analytical 4.6X 250 mm (manufactured by JT Baker), acetonitrile gradient: 0% to 40% (0.1% Analysis using trifluoroacetic acid and acetonitrile containing 0.08% trifluoroacetic acid), flow rate: 1 ml / min) showed that the above conversion reaction (a) had occurred.
[0041]
The reaction (a) was evaluated with multiple samples, and the reaction and measurement using a microplate were performed to quantify the efficiency of the reaction. After adding 9% trichloroacetic acid, centrifuge at 10,000 rpm for 5 minutes. Collect the supernatant. 0.84N sodium hydroxide and 0.77% orthophthalaldehyde are added and reacted at room temperature (25 ° C.) for 5 minutes. 2.6N hydrochloric acid was added and excited at 340 nm, and the fluorescence intensity at 490 nm was measured. as a result,
(A) In the chymase sample treated with Factor Xa, cleavage of angiotensin I could be observed. But,
(B) Chymase sample not treated with Factor Xa
(C) Protein sample of E. coli (before induction with IPTG) that has undergone the same purification process as human chymase fusion protein
(D) No cleavage of angiotensin I was observed with factor Xa alone.
From the above,
<1> The mature human chymase fusion protein expressed by E. coli does not have protease activity as it is, but can be activated by treatment with factor Xa.
<2> Human chymase activated by factor Xa specifically converts angiotensin I to angiotensin II.
<3> This conversion activity is not caused by other proteases or factor Xa possessed by Escherichia coli but by activated human chymase.
Was confirmed.
[0042]
Pharmacological test example
Measurement of enzyme activity inhibition of recombinant human chymase
Buffer A (2M) containing 0.1 to 0.2 units of active human chymase obtained in the Reference Example (where 1 unit represents the enzymatic activity of chymase that produces 1 pmol of angiotensin II from angiotensin I per second) 40 μl of KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0), 100 μl of buffer B (40 mM Tris-HCl, 0.2% Triton X-100, 5% acetonitrile, pH 8.0) and 0.1 mM aprotinin (Wako Pure Chemicals) After adding 20 μl and 20 μl of a sulfoxide solution containing a compound synthesized in the present invention adjusted to an appropriate concentration, 2.5 mM succinyl-alanyl-alanyl-prolyl-phenylalanyl-paranitro as a substrate 20 μl of anilide (SIGMA) was added and allowed to react at room temperature. Measure the time course of absorbance at 405 nm and check the inhibitory activity. ₅₀ As shown.
[0043]
Measurement of enzyme activity inhibition of chymotrypsin
0.2 μm of chymotrypsin (derived from bovine pancreas, Wako Pure Chemical Industries) 40 μl, buffer C (50 mM Tris-HCl, 0.2% Triton X-100, 5% acetonitrile, pH 8.3) 100 μl, and appropriate concentration After adding 20 μl of a dimethyl sulfoxide solution containing the compound synthesized in the present invention prepared as described above, 40 μl of 1 mM methoxy-succinyl-arginyl-prolyl-tyrosyl-paranitroanilide (CHROMOGENIX) as a substrate was added and reacted at room temperature. It was. Measure the time course of absorbance at 405 nm, and check the inhibitory activity chymtrypsin IC ₅₀ As shown.
[0044]
Example 1 <Compound No. 1 Synthesis of 1>
1.62 g (10 mmol) of 1,1′-carbonyldiimidazole was dissolved in 20 ml of tetrahydrofuran (hereinafter abbreviated as THF), and 2.12 g (10 mmol) of diphenylacetic acid dissolved in 20 ml of THF was added dropwise. After stirring at 25 ° C. for 0.5 hour, the mixture was heated to reflux for 0.5 hour. The reaction solution was cooled to 25 ° C., and 2.07 g (10 mmol) of 2-naphthalenesulfonamide and 1.49 ml (10 mmol) of 1,8-diazabicyclo- [5.4.0] -7-undecene were dissolved in 10 ml of THF. Was added dropwise and stirred overnight at 25 ° C. The reaction solution was poured into 200 ml of 1N aqueous hydrochloric acid, and the precipitated crystals were collected by filtration to obtain 3.81 g (yield 95%) of the title compound as a white solid.
[0045]
Example 2 <Compound No. Synthesis of 2>
In the same manner as in Example 1, 1.57 g (1.57 g) of the title compound as a white solid was obtained from 1.41 g (5.0 mmol) of bis (4-chlorophenyl) acetic acid and 1.04 g (5.0 mmol) of 2-naphthalenesulfonamide. Yield 67%).
[0046]
Example 3 <Compound No. Synthesis of 3>
From 1.29 g (10 mmol) of 4-chlorophenol and 2.78 g (10 mmol) of bromophenylacetic acid ethyl ester in 20 ml of N, N-dimethylformamide (hereinafter abbreviated as DMF), 2-phenyl-2- (4-chloro 1.70 g (57%) of phenoxy) acetate was obtained as a white solid. Subsequently, 4.15 g (30 mmol) of potassium carbonate was added and stirred at 80 ° C. for 1 hour. The reaction solution was extracted with ethyl acetate, washed once with distilled water, and the organic layer was concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in 20 ml of ethanol, 15 ml (15 mmol) of 1N aqueous sodium hydroxide solution was added, and the mixture was stirred at 80 ° C. for 0.5 hour. The reaction solution was acidified with dilute hydrochloric acid under ice cooling, and the precipitated solid was collected by filtration to obtain 2.36 g (yield 90%) of 2-phenyl-2- (4-chlorophenoxy) acetic acid as a white solid.
1.48 g (yield 65%) of the title compound as a white solid was obtained in the same manner as in Example 1 from 1.31 g (5.0 mmol) of this compound and 1.04 g (5.0 mmol) of 2-naphthalenesulfonamide. It was.
[0047]
Example 4 <Compound No. Synthesis of 4>
In the same manner as in Example 3, 1.63 g (yield 71%) of 2-phenyl-2-phenoxyacetic acid as a white solid from 0.94 g (10 mmol) of phenol and 2.43 g (10 mmol) of bromophenylacetic acid ethyl ester Obtained.
From 1.14 g (5.0 mmol) of this compound and 1.04 g (5.0 mmol) of 2-naphthalenesulfonamide, 1.44 g (yield 69%) of the title compound was obtained as a white solid.
[0048]
Example 5 <Compound No. Synthesis of 5>
Analogously to Example 3, from 1.29 g (10 mmol) of 4-chlorophenol and 2.78 g (10 mmol) of bromo-4-chlorophenylacetic acid ethyl ester to 2- (4-chlorophenyl) -2- (4-chlorophenoxy) ) Acetic acid was obtained as a white solid (1.70 g, yield 57%).
2.10 g (yield 86%) of the title compound was obtained as a white solid from 1.49 g (5.0 mmol) of this compound and 1.04 g (5.0 mmol) of 2-naphthalenesulfonamide.
[0049]
Example 6 <Compound No. Synthesis of 13>
1.20 g of 2-naphthyl-2-phenylthioacetic acid as a white solid from 0.77 g (7.0 mmol) of thiophenol and 2.05 g (7.0 mmol) of bromonaphthylacetic acid ethyl ester in the same manner as in Example 3. (Yield 58%).
From 1.18 g (4.0 mmol) of this compound and 0.83 g (4.0 mmol) of 2-naphthalenesulfonamide, 1.30 g (yield 67%) of the title compound was obtained as a white solid.
No. 1 synthesized in the same manner as in Examples 1-6. 1-No. The structure, analytical values, and pharmacological data of 16 compounds are shown in Table 1 below.
[0050]
[Table 1]

[0051]
[Table 2]

[0052]
[Table 3]

[0053]
[Table 4]

[0054]
[Table 5]

[0055]
[Table 6]

[0056]
[Table 7]

[0057]
[Table 8]

[0058]
【The invention's effect】
As is clear from the examples, the novel acylsulfonamide derivative represented by the general formula (I) obtained in the present invention has excellent chymase inhibitory activity and can be used for the treatment and prevention of various diseases involving chymase. It is expected as a medicine for
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the flow from the acquisition of human heart chymase cDNA to the construction of pET-hChy.

Claims (4)

General formula:

{Wherein R ¹ and R ² are as defined in (1) or (2) below.
(1) ^{R 1} is a halogen _atom, an alkyl group of C 1 _{-C 20,} alkoxy group of C 1 _{-C 10,} an alkylthio group of C 1 _{-C 10,} an alkylsulfinyl group having _C 1 ~C _10, C 1 ~ an alkylsulfonyl group having C _10, C 1 _{~C 4} haloalkyl _group, a haloalkoxy group C 1 ~C _4, C 2 alkoxycarbonyl group -C _8, alkyl amino group of _C 1 _{~C 10,} C 2 _~C 1-2 selected from ₆ dialkylamino groups, C ₆ -C ₁₄ aryl groups, cyano groups, nitro groups, amino groups, amidino groups, C ₁ -C ₁₀ alkyl groups or alkenyl group carboxyl groups and hydroxyl groups A phenyl group or a naphthyl group, which may have the same or different substituents,
R ² represents a phenyl group which may have one or two same or different substituents selected from a halogen atom, a C _{1 to} C ₁₀ alkoxy group, an amino group, a cyano group, a carboxyl group and a nitro group. Show.
(2) R ¹ represents a hydrogen atom,
R ² represents a phenyl group having 1 to 2 identical or different substituents selected from a halogen atom, a C _{1 to} C ₁₀ alkoxy group, an amino group, a cyano group, a carboxyl group and a nitro group.
X represents —O—, —S (O) _n — (n represents an integer of 0 to 2) or a single bond. }
Or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate or solvate thereof. General formula:

{In the formula, R ¹ represents a halogen atom, a C _{1 to} C ₂₀ alkyl group, a C _{1 to} C ₁₀ alkoxy group, a C _{1 to} C ₁₀ alkylthio group, a C _{1 to} C ₁₀ alkylsulfinyl group, C _1. alkylsulfonyl group ~C _10, C 1 ~C ₄ haloalkyl _group, a haloalkoxy group C 1 ~C _4, C 2 alkoxycarbonyl group -C _8, alkyl amino group of _C 1 _{~C 10,} C 2 ~ 1 to _{6 selected} from C ₆ dialkylamino group, C _{6 to} C ₁₄ aryl group, cyano group, nitro group, amino group, amidino group, C _{1 to} C ₁₀ alkyl group or alkenyl group carboxyl group and hydroxyl group Two phenyl groups or naphthyl groups which may have the same or different substituents, or a hydrogen atom are shown.
R ² represents a phenyl group which may have one or two identical or different substituents selected from a halogen atom, a C _{1 to} C ₁₀ alkoxy group, an amino group, a cyano group, a carboxyl group and a nitro group. Show.
R ³ represents a phenyl group or a naphthyl group.
X represents —O—, —S (O) _n — (n represents an integer of 0 to 2) or a single bond. }
And a pharmaceutically acceptable salt, hydrate or solvate thereof as an active ingredient.   The pharmaceutical composition according to claim 2, which is a chymase inhibitor.   Hypertension, congestive heart failure, cardiomyopathy, arteriosclerosis, coronary artery disease, myocardial infarction, vascular restenosis after angioplasty or thrombolysis, peripheral circulatory disturbance, vasculitis, diabetic or non-diabetic kidney disease, lung The pharmaceutical composition according to claim 2 for the treatment and / or prevention of hypertension, bronchial asthma, chronic obstructive pulmonary disease, chronic bronchitis, emphysema, allergic rhinitis, atopic dermatitis, rheumatism, arthritis or cancer.

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