JP4491567B2

JP4491567B2 - Novel protein that binds to human-derived sphingosine kinase 1 and polynucleotide encoding the protein

Info

Publication number: JP4491567B2
Application number: JP2003514898A
Authority: JP
Inventors: 俊一中村; 太郎岡田
Original assignee: New Industry Research Organization NIRO
Current assignee: New Industry Research Organization NIRO
Priority date: 2001-07-19
Filing date: 2002-07-19
Publication date: 2010-06-30
Anticipated expiration: 2022-07-19
Also published as: JPWO2003008582A1; WO2003008582A1

Description

技術分野
本発明は、スフィンゴシンをリン酸化し、スフィンゴシン・１リン酸の産生を触媒する酵素であるヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１に結合する新規タンパク質、及び当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
背景技術
スフィンゴシンは、アミノ酸のセリンと脂肪酸との縮合により合成されるアミノアルコールの一種である。一方、スフィンゴシン・キナーゼは、このスフィンゴシンをリン酸化し、細胞増殖、血管新生、アポトーシスの抑制等の多岐にわたる生理現象を引き起こす生理活性物質スフィンゴシン・１リン酸を産生する酵素である。尚、ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１のｃＤＮＡ配列は、１９９８年にスピーゲルらのグループにより同定された（Ｋｏｈａｍａｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３，２３７２２−２３７２８参照）。
上記スフィンゴシン・１リン酸のレセプターであるＥｄｇ（ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＧｅｎｅ）レセプターは、これまでに１から７までの７種類が報告されているが、現在スフィンゴシン・１リン酸のレセプターと考えられているものは、Ｅｄｇ１、Ｅｄｇ３、Ｅｄｇ５（別称：Ｈ２１８又はＡｇｒ１６）、Ｅｄｇ６の４種類である。スフィンゴシン・１リン酸は、これらのＥｄｇレセプターを介して細胞内へシグナル伝達することになるが、このシグナル伝達機構の詳細については、現在世界的に研究されている。
リピッドアクティベーター又はリピッドメディエーターと呼ばれる物質が細胞の種々の機能を調節する重要な働きをすることが最近分かってきた。その中の一つが上記スフィンゴシン・１リン酸であり、上記Ｅｄｇレセプターを介して、細胞増殖能など多彩な細胞調節機能を有する脂質由来の細胞増殖因子と考えられている。
尚、スフィンゴシン・１リン酸の代謝経路及びそのシグナル伝達については、例えば、実験医学Ｖｏｌ．１８Ｎｏ．２（増刊）２０００８０（１８０）−８１（１８１）頁などに記載されており、同文献にも記載されるように、スフィンゴシン・１リン酸は、細胞膜のスフィンゴミエリンが、セラミド、スフィンゴシンと代謝され、スフィンゴシン・キナーゼによってリン酸化されることで生成する。
ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１も、上記のように、スフィンゴシンをリン酸化してスフィンゴシン・１リン酸を生成する重要な酵素であるが、このスフィンゴシン・キナーゼ１の働きがどのように調節されているのか、その活性調節機構については現在のところよく分かっていない。また、このスフィンゴシン・キナーゼ１に結合するタンパク質の存在についてもこれまでに報告がない。
スフィンゴシン・１リン酸は、上記シグナル伝達機構により、細胞増殖、血管新生、アポトーシスの抑制等の多岐にわたる生理機能に関与し、ひいては、これらの生理機能に関わる種々の病気（例えば、動脈硬化や本態性高血圧等）にも深く関与していると考えられている。従って、もし上記スフィンゴシン・キナーゼ１と結合するタンパク質の存在が明らかにされれば、このタンパク質は、上記スフィンゴシン・キナーゼ１の働きを調節する候補タンパク質として、このような病気の病態解析やその治療薬の開発、治療改善に重要な貢献をもたらすものと期待される。
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１に結合する新規タンパク質、及び当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
発明の開示
本願発明者は、スフィンゴシン・キナーゼ１に結合し、その活性を調節する新規タンパク質を探索する目的で、イーストツーハイブリッドスクリーニングを行った。その結果、スフィンゴシン・キナーゼ１と結合する新規タンパク質ＲＰＫ１１８、及び当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを見出し、本発明を完成させるに至った。
第一に、本発明に係るタンパク質は、ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１に結合する性質を持つことを特徴としている。
ここで、上記「結合する性質を持つ」とは、後述の実施例に記載される方法等により、上記スフィンゴシン・キナーゼ１との結合を確認することができることをいい、換言すれば、本発明のタンパク質が、上記スフィンゴシン・キナーゼ１と結合する領域を有することをいう。また、酵素とその基質（即ち、スフィンゴシン・キナーゼ１とその基質スフィンゴシン）との間の結合は、ここにいう「結合」には含まれない。
本発明に係るタンパク質は、スフィンゴシン・キナーゼ１と結合することにより何らかのかたちでその活性を調節していると考えられる。一方、スフィンゴシン・キナーゼ１によりリン酸化されたスフィンゴシン・１リン酸は、上記のように、Ｅｄｇレセプターを介して細胞内にシグナルを伝達し、上述した種々の生理機能に関与していると考えられている。それゆえ、本発明に係るタンパク質は、これらの生理機能ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、これらの生理機能やその調節機構に関わる種々の病気の病態解析やその治療薬の開発、治療改善に有効利用できる可能性がある。
また、後述のように、本発明に係るタンパク質ＲＰＫ１１８が細胞内顆粒輸送に関与している可能性から、目的タンパク質の分解やリサイクルをコントロールすることにより、種々の応用が可能になる。例えば、（１）内分泌疾患の治療：糖尿病患者のインスリン受容体の分解抑制など、（２）感染症の治療：マラリヤ感染における原虫の分解促進など、（３）免疫疾患の治療：Ｃ型肝炎ウィルスのマクロファージによる分解促進効果による抗原提示を介した抗体産生能力の増強など、への利用が考えられる。
本発明に係るタンパク質は、細胞などから単離精製された状態であってもよいし、タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内発現させた状態であってもよい。また、本発明に係るタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。このようなポリペプチドが付加される場合としては、例えば、ＨＡやＭｙｃ、ｆｌａｇ等によって本発明のタンパク質がエピトープ標識されるような場合が挙げられる。
本発明に係るタンパク質は、さらに、下記ａ）〜ｄ）のいずれかの特徴によって特定されるものであってもよい。
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる第１の領域を有する。
ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる第２の領域を有する。
ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と配列番号４に示されるアミノ酸配列とからなる第３の領域を有する。
ｄ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する。
後述のように、本願発明者がヒトから単離した本発明に係るタンパク質ＲＰＫ１１８は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる。このタンパク質ＲＰＫ１１８は、上記第１の領域としてのＰＸｄｏｍａｉｎ、上記第２の領域としてのＥＳＰｄｏｍａｉｎ、上記第３の領域としてのＰ−ｋｉｎａｓｅｄｏｍａｉｎを有している。このうち、第３の領域であるＰ−ｋｉｎａｓｅｄｏｍａｉｎが、上記スフィンゴシン・キナーゼ１との結合領域と考えられる。
第二に、本発明に係るタンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有することを特徴としている。
ここで、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入、及び／又は付加とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により欠失、置換、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されることを意味する。
このように、上記タンパク質は、換言すれば、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる本発明に係る上記タンパク質ＲＰＫ１１８の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。また、この変異タンパク質の性質は特に限定されるものではなく、例えば、スフィンゴシン・キナーゼ１との結合能について、上記タンパク質ＲＰＫ１１８と同様の結合能を持つものであってもよいし、結合領域に変異を生じさせることにより結合能を増強したもの、結合能が弱まったもの、あるいは結合能が失われたものであってもよい。
第三に、本発明に係るポリヌクレオチドは、上述した本発明に係るいずれかのタンパク質をコードすることを特徴としている。
上記「ポリヌクレオチド」とは、少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡを含む意味であり、例えば、配列番号５に示されるアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームを有するｃＤＮＡや、このｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡや、このｍＲＮＡの転写元のゲノムＤＮＡが含まれる。
また、上記「ポリヌクレオチド」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。さらに、上記「ポリヌクレオチド」は、本発明のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。例えば、本発明のタンパク質をコードする配列をベクター配列につないで本発明のポリヌクレオチドを構成し、これを適当な宿主で増幅させることにより、本発明のポリヌクレオチドを所望に増幅させることができる。
本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号６に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドや、配列番号６に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。ここで、１若しくは数個の塩基の欠失、置換、挿入、及び／又は付加とは、公知のＤＮＡ組換え技術、変異導入方法により欠失、置換、挿入、及び／又は付加できる程度の数の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されることを意義する。
本発明に係る組換え発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドを含むものである。例えば、配列番号６に示されるポリヌクレオチドが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
本発明に係る形質転換体は、上記ポリヌクレオチドが導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（線虫、キイロショウジョウバエ、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、マウスやラットは、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、ノックアウトマウス等は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８の更なる機能解析、同タンパク質が関与する病気の診断方法の開発や、その治療方法の開発などに有用である。
本発明の遺伝子検出器具は、上記ポリヌクレオチドにおける少なくとも一部の塩基配列またはその相補配列をプローブとして用いたものである。遺伝子検出器具は、本発明のポリヌクレオチドすなわち本発明の遺伝子の発現解析に利用することができる。本発明の遺伝子検出器具としては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズする上記プローブを基盤（担体）上に固定化したＤＮＡチップ等が挙げられる。
本発明に係る抗体は、本発明のタンパク質、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得られる抗体である。
本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
発明を実施するための最良の形態
本発明の実施の一形態について図面に基づいて説明すれば、以下のとおりである。
（１）本発明に係るタンパク質ＲＰＫ１１８、及びその遺伝子の配列、構造等
本願発明者は、ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１に結合し、その活性を調節する新規タンパク質を探索する目的で、イーストツーハイブリッド（ｙｅａｓｔｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いてラット脳のｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングを行った。そして、得られたｃＤＮＡクローンについて更に解析を進め、ヒト脳のｃＤＮＡライブラリーから上記スフィンゴシン・キナーゼ１と結合する分子量１１８，０００の新規タンパク質ＲＰＫ１１８のアミノ酸配列、及び当該タンパク質をコードする遺伝子の全長ｃＤＮＡ配列を決定することに成功した。尚、上記イーストツーハイブリッド法によるスクリーニング等については、後述の実施例において詳述する。
決定した全長ｃＤＮＡ配列のうち、本発明に係る上記タンパク質ＲＰＫ１１８をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域の塩基配列が、配列番号６に示される（図１〜３にも同配列を示す）。尚、決定した全長ｃＤＮＡ配列は、上記ＯＲＦ領域のほか５’側及び３’側にそれぞれ非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むものであった。
上記タンパク質ＲＰＫ１１８のアミノ酸配列は、配列番号５に示される。図４にも同配列を各アミノ酸１文字表記の形で示す。
図５には、解析の結果明らかになった上記タンパク質ＲＰＫ１１８の模式的構造が示される。上記タンパク質ＲＰＫ１１８は、１０６６個のアミノ酸からなり、同図に示すように、ＰＸｄｏｍａｉｎ（第１の領域）、ＥＳＰｄｏｍａｉｎ（第２の領域）、及びＰ−ｋｉｎａｓｅｄｏｍａｉｎ（第３の領域）の３つのドメインを有している。上記ＰＸｄｏｍａｉｎは、配列番号１、及び図４の灰色で囲まれた領域として示されるように、上記ＲＰＫ１１８の９番目のアミノ酸から１２８番目のアミノ酸までの領域に相当する。上記ＥＳＰｄｏｍａｉｎは、配列番号２、及び図４の実線で囲まれた領域として示されるように、上記ＲＰＫ１１８の２３９番目のアミノ酸から３０７番目のアミノ酸までの領域に相当する。上記Ｐ−ｋｉｎａｓｅｄｏｍａｉｎは、配列番号３に示されるアミノ酸配列と配列番号４に示されるアミノ酸配列との２つの部分からなる。このうち、比較的短い第１の部分（ＰＳＫ１）は、上記ＲＰＫ１１８の３４０番目のアミノ酸から４２６番目のアミノ酸までの領域に相当し、比較的長い第２の部分（ＰＳＫ２）は、上記ＲＰＫ１１８の９０６番目のアミノ酸から１０６６番目のアミノ酸までの領域に相当する（図４の黒帯領域参照）。
上記ＰＸｄｏｍａｉｎ及びＥＳＰｄｏｍａｉｎは、それぞれ既知のソーティングタンパク質が持つＰＸｄｏｍａｉｎ、ＥＳＰｄｏｍａｉｎと呼ばれる領域と相同性が高いことから命名したものである。かかる相同性から、上記ＲＰＫ１１８のＰＸｄｏｍａｉｎ及びＥＳＰｄｏｍａｉｎは、おそらく細胞内小胞輸送におけるソーティング（細胞内の目的の場所に小胞を運ぶ）に関与しており、上記ＲＰＫ１１８は、ＰＸｄｏｍａｉｎ及びＥＳＰｄｏｍａｉｎを介してスフィンゴシン・キナーゼ１を細胞内の特定の場所に輸送・運搬するソーティングタンパク質として機能していると考えられる。
後述の実施例に示されるように、ＲＰＫ１１８の発現は、スフィンゴシン・キナーゼ１の少なくとも一部を初期エンドソームに局在させ、また、初期エンドソームに存在して細胞内顆粒輸送に関わるリン脂質（後述のＰｔｄＩｎｓ（３））とＲＰＫ１１８とが結合することから、ＲＰＫ１１８がアダプター分子としてスフィンゴシン・キナーゼ１を初期エンドソームに運ぶ役割を担っている可能性が高い。
上記Ｐ−ｋｉｎａｓｅｄｏｍａｉｎ（ＰＳＫ）は、タンパク質翻訳の際に重要なｒｉｂｏｓｏｍａｌＳ６ｋｉｎａｓｅ（ＲＳＫ３）と構造類似性を示す新たな領域であり、ＲＳＫ３の相同部位は代謝活性に重要な役割を果たしている。
図６はＲＰＫ１１８のＰ−ｋｉｎａｓｅｄｏｍａｉｎと、ＲＳＫ３のＰ−ｋｉｎａｓｅｄｏｍａｉｎとを比較した図であり、ＰＳＫ１はキナーゼサブドメインＩ〜Ｖに対応し（図６（ａ））、ＰＳＫ２はキナーゼサブドメインＶＩ〜ＸＩに対応している（図６（ｂ））。しかし、ＲＰＫ１１８は、図６（ａ）に示されるように、ＲＳＫ３のキナーゼサブドメインＩにおいて、ＡＴＰの結合に必須であるＧｘＧｘｘＧモチーフが変異している。また、図６（ｂ）に示されるように、ＲＳＫ３のキナーゼサブドメインＶＩＩにおいて、Ｍｇ^２＋の酵素への感受性を付与するＤＦＧモチーフも変異している。つまり、ＲＰＫ１１８は、タンパク質リン酸化に必要な部位が欠如しており、リン酸転移酵素の活性が欠損していると思われる。このドメインの生理機能は不明である。尚、このドメインは、このようにリン酸化に必要な部位を欠如していることから、擬似（ｐｓｅｕｄｏ）キナーゼドメイン、即ちＰ−ｋｉｎａｓｅｄｏｍａｉｎと命名した。また、ＲＳＫ３との構造類似性から、本発明のタンパク質を「ＲＰＫ１１８（ｒｉｂｏｓｏｍａｌＳ６ｋｉｎａｓｅ−ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｔｗｏＰＳＫｄｏｍａｉｎｓ）」と命名した。
さらに解析の結果、上記ＲＰＫ１１８におけるスフィンゴシン・キナーゼ１との結合サイト（結合領域）は、上記Ｐ−ｋｉｎａｓｅｄｏｍａｉｎのうちＣ末端側の上記第２の部分（ＰＳＫ２）に存在することが判明した。
以上のように、本発明に係る上記タンパク質ＲＰＫ１１８は、Ｃ末端側のＰ−ｋｉｎａｓｅｄｏｍａｉｎを介してスフィンゴシン・キナーゼ１と結合し、Ｎ末端側のＰＸｄｏｍａｉｎ及びＥＳＰｄｏｍａｉｎを介してスフィンゴシン・キナーゼ１を細胞内の特定の領域に運搬するソーティングタンパク質として作用していると考えられる。
また、データベース検索によりＲＰＫ１１８のオルソログをキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）および線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ）から同定し、ＲＰＫ１１８が新規の、高度に保存された遺伝子ファミリーに属することを明らかにした（図５）。同図に示すように、キイロショウジョウバエおよび線虫とも、ＲＰＫ１１８と同様に、ＰＸ，ＥＳＰ，ＰＳＫ１，およびＰＳＫ２ドメインを有する。これに対して、ヒト由来のＲＰＫ６０は、ＥＳＰ，ＰＳＫ１，ＰＳＫ２ドメインを有するが、ＰＸドメインを持たない。この遺伝子は、未知のキナーゼとしてアクセッションＮｏ．ＡＡＤ３０１８２に報告されたものであるが機能は未だ不明であり、ＲＰＫ１１８と同様の機能を有している可能性がある。
上記本発明に係るタンパク質ＲＰＫ１１８とスフィンゴシン・キナーゼ１との結合を確認する方法は、特に限定されるものではなく、タンパク質間の相互作用を調べる公知の種々の方法を用いることができ、例えば、ＨＡ等のエピトープ及びその抗体を利用した免疫沈降−ウエスタンブロット法により、両タンパク質の結合の有無を調査することができる。
（２）本発明に係るタンパク質、ポリヌクレオチドの取得方法
以上、本発明に係るタンパク質であるＲＰＫ１１８の配列、構造、機能、及びその遺伝子（ポリヌクレオチド）などの諸特徴について説明したが、以下では、本発明に係るタンパク質、ポリヌクレオチドの取得方法について説明する。
上記タンパク質ＲＰＫ１１８をコードするポリヌクレオチドを取得する方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。例えば、上記ＲＰＫ１１８をコードするｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒトのゲノムＤＮＡライブラリーやヒト脳のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記ＲＰＫ１１８をコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
また、上記プローブの配列を、上記ＲＰＫ１１８の機能上重要と考えられる領域（例えば、上記ＰＸｄｏｍａｉｎ、ＥＳＰｄｏｍａｉｎ又はＰ−ｋｉｎａｓｅｄｏｍａｉｎ）の中から選択し、ヒトやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記ＲＰＫ１１８と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
本発明に係るポリヌクレオチド（遺伝子）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記ＲＰＫ１１８のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒトのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
本発明に係るタンパク質を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得されたポリヌクレオチド（上記ＲＰＫ１１８又はその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れ、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、上記タンパク質ＲＰＫ１１８等の本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。尚、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の組換え領域に宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター及び宿主には様々なものがあるので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたタンパク質を取り出す方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、適切な条件下で目的のタンパク質を精製することが可能である。
また、上記ＲＰＫ１１８のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する変異タンパク質を作製する方法としては、例えば、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法や、部位特異的突然変異誘発法（ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ１５２，２７１−２７５（１９９５）他）等が挙げられる。また、文献「細胞工学別冊新細胞工学実験プロトコール秀潤社２４１−２４８（１９９３）」に記載の方法、さらには、市販のキット（例えば、ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔストラタジーン社製）を利用する方法も可能である。
上記のように作製された変異タンパク質が、野生型と同様の活性・機能を有する例は既に多数知られているが、その活性・機能に異常を来すように変異を導入し変異タンパク質を作製することも既に多く行われている。例えば、上記タンパク質ＲＰＫ１１８の変異タンパク質を作製する場合、結合領域である上記Ｐ−ｋｉｎａｓｅｄｏｍａｉｎに変異を生じさせることにより、スフィンゴシン・キナーゼ１との結合能について、野生型のＲＰＫ１１８に比べて結合能が増強された変異タンパク質、結合能が弱まった変異タンパク質、あるいは結合能が失われた変異タンパク質を作製できる可能性が高い。同様に、スフィンゴシン・キナーゼ１の輸送・運搬に関係すると考えられる上記ＰＸｄｏｍａｉｎ又はＥＳＰｄｏｍａｉｎに変異を導入することにより、野生型のＲＰＫ１１８に比べて運搬能が増強された変異タンパク質、運搬能が弱まった変異タンパク質、あるいは運搬能が失われた変異タンパク質を作製できる可能性が高い。
上記ＲＰＫ１１８をコードするｃＤＮＡの塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を有するポリヌクレオチド（変異遺伝子）についても、例えば、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入する方法や、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異導入方法を用いてＤＮＡを改変し、作製することができる。
（３）本発明に係るタンパク質、ポリヌクレオチドの利用
本発明に係るポリヌクレオチドは、発現ベクターに導入し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れることで、形質転換体を作製することができる。上記ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。
また、本発明に係るポリヌクレオチドがホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るタンパク質とＧＦＰとを融合させた融合タンパク質を発現させてもよい。
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物の培養細胞、あるいは昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
本発明に係るポリヌクレオチドの一部配列またはその相補配列は、遺伝子検出器具のプローブとして利用可能である。遺伝子検出器具としては、例えば、基盤（担体）上にオリゴヌクレオチド（プローブ）を固定化してなるＤＮＡチップが挙げられる。尚、ここで言う「ＤＮＡチップ」とは、主として、合成したオリゴヌクレオチドをプローブに用いる合成型ＤＮＡチップを意味するが、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡをプローブに用いる貼り付け型ＤＮＡマイクロアレイをも包含するものとする。
プローブとして用いるオリゴヌクレオチドの長さは、その特徴的・特異的配列により目的遺伝子の発現を検出できるものであれば特に限定されるものではないが、合成オリゴヌクレオチドの場合は１０以上３０以下が好ましく、１５以上２５以下がより好ましい。
本発明に係るタンパク質に対する抗体の生産方法も特に限定されるものではなく、例えば、ＲＰＫ１１８タンパク質それ自体、又はその部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができる。
（実施例）
〔実施例１：ＲＰＫ１１８の遺伝子配列の決定〕
本願発明者は、以下のように、上記タンパク質ＲＰＫ１１８及びその遺伝子（全長ｃＤＮＡ）を単離し、各配列を決定した。
図７及び配列番号７には、マウス由来のスフィンゴシン・キナーゼ１のｃＤＮＡ配列が示される。このｃＤＮＡ配列をもとに、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法を用いて上記スフィンゴシン・キナーゼ１のｃＤＮＡをクローニングした。
次に、上記スフィンゴシン・キナーゼ１のｃＤＮＡクローンをｂａｉｔ（餌）に用い、市販のラット脳のｃＤＮＡライブラリーからイーストツーハイブリッド（ｙｅａｓｔｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法によるスクリーニングを行った。このイーストツーハイブリッド法は、市販のキット（Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ３Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用い、キットの手順に従って行った。
上記イーストツーハイブリッド法によって得られたポジティブクローンの配列を基に、ヒト脳のｃＤＮＡライブラリーから同一の配列部分を持つｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡは、５’端側が欠けていたので、さらに５’−ＲＡＣＥ法により、欠失していた５’端側を回収し、全長のｃＤＮＡの塩基配列を決定した。尚、５’−ＲＡＣＥ法は市販のキットを用い、キットの手順に従って行った。また、塩基配列の決定には市販のシークエンサーを用いた。
〔実施例２：ＲＰＫ１１８とスフィンゴシン・キナーゼ１との結合を確認する免疫沈降〕
さらに、得られた全長ｃＤＮＡ配列をもとにタンパク質ＲＰＫ１１８を発現させ、スフィンゴシン・キナーゼ１との結合能を調べたところ、当該タンパク質ＲＰＫ１１８はスフィンゴシン・キナーゼ１と結合することが確認された。
図８は、免疫沈降−ウエスタンブロット法により、タンパク質ＲＰＫ１１８とスフィンゴシン・キナーゼ１との結合を確認した実験結果を示す図である。
実験では、哺乳類の発現ベクターｐＣＭＶ５を用い、全長ＲＰＫ１１８、ＰＳＫ２断片、およびＰＳＫを欠くＲＰＫ△ＰＳＫ断片を、各々ベクターｐＣＭＶ５にＦＬＡＧエピトープ標識とともにサブクローン化した。一方、ＣＯＳ７細胞を６０ｍｍ組織培養皿で〜７０％コンフルエントに培養し、各培養皿に対して、上記各ベクター（プラスミドＤＮＡ）３μｇ、および１２μｌのＦｕｇｅｎｅ−６試薬を用いて形質転換した。
上記のように各ベクターをＣＯＳ７細胞に感染させ、ＦＬＡＧ標識したタンパク質ＲＰＫ１１８（ＦＬＡＧ−ＲＰＫ１１８）、ＦＬＡＧ−ＰＳＫ２断片、ＰＳＫ１およびＰＳＫ２ドメインを含む３１４から１０６６残基までの配列を欠くＦＬＡＧ−ＲＰＫΔＰＳＫをそれぞれ発現させた。さらに、上記各タンパク質について、ＨＡ標識したスフィンゴシン・キナーゼ１（ＨＡ−ＳＰＨＫ１）と共発現させたものを用意した。
そして、それぞれのＣＯＳ７細胞を、冷溶解バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１００ｍＭＮａＣｌ，１％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ９７（Ｓｉｇｍａ）およびプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ））で溶解し、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２（Ｓｉｇｍａ）および抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ）を用いて免疫沈降―免疫ブロット分析を行った。
図８にその結果が示される。同図の右側のレーンから順番に、ＦＬＡＧ−ＰＳＫ２断片及びＨＡ−ＳＰＨＫ１の両方を発現させた場合、ＦＬＡＧ−ＰＳＫ２断片のみ発現させた場合、ＦＬＡＧ−ＲＰＫ１１８及びＨＡ−ＳＰＨＫ１の両方を発現させた場合、ＦＬＡＧ−ＲＰＫ１１８のみ発現させた場合、ＦＬＡＧ−ＲＰＫΔＰＳＫ及びＨＡ−ＳＰＨＫ１の両方を発現させた場合、ＦＬＡＧ−ＲＰＫΔＰＳＫのみ発現させた場合、ＨＡ−ＳＰＨＫ１のみ発現させた場合、いずれも発現させなかった場合の試料である。
１〜３段目のパネルは、免疫沈降（ＩＰ）に抗ＦＬＡＧ抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）、免疫ブロット（ＩＢ）に抗ＦＬＡＧ抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）を用いた場合であり、つまり、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて各試料に対し免疫沈降を行った後、各免疫沈降物に対して抗ＦＬＡＧ抗体による免疫ブロット（ウエスタンブロット）を行った結果を示す。４段目のパネルは、上記ＨＡ−ＳＰＨＫ１の発現を確認するため、各試料であるＣＯＳ７細胞の溶解物について、免疫沈降を行わず、直接抗ＨＡ抗体による免疫ブロットを行った結果を示す。５段目のパネルは、免疫沈降（ＩＰ）に抗ＦＬＡＧ抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ）、免疫ブロット（ＩＢ）に抗ＨＡ抗体（ａｎｔｉ−ＨＡ）を用いた場合の結果を示す。
同図に示すように、上記ＦＬＡＧ−ＲＰＫ１１８及び上記ＨＡ−ＳＰＨＫ１の両方をＣＯＳ７細胞に発現させた試料について、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降させ抗ＨＡ抗体で免疫ブロットを行ったところシグナルが得られたことから、タンパク質ＲＰＫ１１８とスフィンゴシン・キナーゼ１との結合が確認された。
同様に、上記ＦＬＡＧ−ＰＳＫ２断片及び上記ＨＡ−ＳＰＨＫ１の両方をＣＯＳ７細胞に発現させた試料について、抗ＦＬＡＧ抗体での免疫沈降後、抗ＨＡ抗体での免疫ブロットによりシグナルが得られたことから、スフィンゴシン・キナーゼ１（ＳＰＨＫ１）との結合部位はＰＳＫ２部位内に存在することが確かめられた。
実施例１で説明したイーストツーハイブリッド法によるスクリーニングの際に、上記タンパク質ＲＰＫ１１８のアミノ酸配列のうち９０１番目から１０６６番目までのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡが陽性クローンとして得られたことから、ＰＳＫ２領域がＳＰＨＫ１との結合サイトと推定されたが、上記の実験結果はそのことを裏付けるものであった。
一方、ＰＳＫ２を含まないＦＬＡＧ−ＲＰＫΔＰＳＫは、上記の実験でＳＰＨＫ１との相互作用を示さなかった。
〔実施例３：ＲＰＫ１１８のリン酸化活性機能を調べるキナーゼアッセイ〕
ＲＰＫ１１８がリン酸化活性機能を有するか確かめるために、以下のキナーゼアッセイを行った。
ＦＬＡＧ−ＲＰＫ１１８またはＦＬＡＧリボソーマルＳ６キナーゼ３（ＲＳＫ３）を発現するＣＯＳ７細胞を、冷溶解バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭＮａＣｌ，１％ＮＰ−４０，０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１ｍＭＮａ_３ＶＯ_４，およびプロテアーゼインヒビター）で溶解した。溶解物中のＦＬＡＧ標識タンパク質は、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２ビーズを用いて免疫沈降され、免疫沈降物にＳ６ペプチド（ＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）２５０μＭを加えた後、または加えずに洗浄し、洗浄後にタンパク質キナーゼ活性を測定した。このときＰ−８１ペーパーに吸収されたＳ６ペプチドへの^３２Ｐの結合は、Ｃｅｒｅｎｋｏｖｃｏｕｎｔｉｎｇによって決定され、免疫沈降物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、ＦｕｊｉｘＢｉｏ−ＩｍａｇｉｎｇＡｎａｌｉｚｅｒ，ＢＡＳ２０００（ＦｕｊｉＰｈｏｔｏＦｉｌｍＣ１．，Ｊａｐａｎ）を用いて定量した。
実験結果を図９に示す。図９（ａ）は自己リン酸化について、（ｂ）は基質Ｓ６ペプチドのリン酸化について調べたものである。免疫沈降されたＲＰＫ１１８は、良好に発現しており、また同条件でＲＳＫ３は自己リン酸化および基質Ｓ６ペプチドのリン酸化について高いキナーゼ活性を示していたにもかかわらず、ＲＰＫ１１８は、自己リン酸化についても基質Ｓ６ペプチドのリン酸化についてもキナーゼ活性を示さなかった。
〔実施例４：ヒト組織におけるＲＰＫ１１８の発現を調べるノーザンブロッティング〕
ヒト各組織におけるＲＰＫ１１８の発現を調べるために、ＲＰＫ１１８ｍＲＮＡのヒト各組織における発現を以下のノーザンブロッティングにより分析した。
まず、ゲルの各レーンごとに１μｇのヒト各組織由来のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ）を電気泳動した後、^３２Ｐ−標識された長さ９００ｂｐのＲＰＫ１１８のＢａｍＨ１断片をプローブとしてハイブリダイズさせた。バンドはＦｕｊｉｘＢｉｏ−ＩｍａｇｉｎｇＡｎａｌｉｚｅｒ，ＢＡＳ２０００により可視化された。
その結果、図１０に示されるように、ＲＰＫ１１８は種々の組織に発現しており、特に骨格筋、脳、心臓、胎盤、腎臓、肝臓で高レベルの発現が検出された。尚、同図において下段のパネルは、βアクチンをコントロール用のプローブとして用いた結果を示すものである。
〔実施例５：ＲＰＫ１１８とスフィンゴシン・キナーゼ１とのＣＯＳ７細胞における局在〕
ＲＰＫ１１８とスフィンゴシン・キナーゼ１（ＳＰＨＫ１）との相互作用をさらに詳しく検討するため、免疫蛍光法を用いてＲＰＫ１１８およびＳＰＨＫ１の細胞内局在等を調べた。
ＲＰＫ１１８をｐＥＧＦＰ−Ｃ１（ＣＬＯＮＥＴＥＣＫ）にクローン化したベクター、および実施例２で使用したＦＬＡＧ−ＲＰＫ１１８、ＨＡ−ＳＰＨＫ１発現ベクターを任意の組み合わせでＣＯＳ７細胞に共発現させて、各標識タンパク質をＣＯＳ７細胞内に発現させた。
形質転換されたＣＯＳ７細胞はカバースリップ（ＮａｌｇｅＮｕｎｃ）に、細胞数１０^６／ｍｌの密度で播種され、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）中の３％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．２％トライトンＸ−１００で１０分間処理した後、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳでブロックした。その後、ＣＯＳ７細胞は１次抗体（ＦＬＡＧ，ＨＡ，初期エンドソームの内在マーカーである初期エンドソーム抗原ＥＥＡ１）とともに２５℃で１時間保温し、３回洗浄した後、蛍光色素と結合した２次抗体とともに２５℃で１時間保温した。なお、ＥＥＡ１抗体はＢＤＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＬａｂ（ＳａｎＪｏｓｅＣＡ）のものを使用した。
その後、ＣＯＳ７細胞を共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−ＲａｄＭＲＣ１０２４）を使用して観察した。顕微鏡観察の結果を図１１に示す。図１１（ａ）〜（ｃ）は、ＧＦＰ−ＲＰＫ１１８とＦＬＡＧ−ＲＰＫ１１８とを共発現するＣＯＳ７細胞において、両タンパク質の共局在を確かめたもので、これによりＧＦＰ−ＲＰＫの有効性が確認された。ＲＰＫ１１８は、細胞質に拡散的に分布し、完全な共局在を示しているところでは小さな点状または輪状の構造で存在していた（図１１（ａ）〜（ｃ）矢印）。対照的に、ＧＦＰベクターのみを発現しているＣＯＳ７細胞では、ＧＦＰが細胞全体に拡散的に分布していた。
図１１（ｄ）〜（ｆ）は、ＧＦＰ−ＲＰＫ１１８を発現したＣＯＳ７細胞において、初期エンドソームの内在マーカー（ＥＥＡ１）を免疫染色したものである。これによると、ＥＥＡ１はＧＦＰ−ＲＰＫ１１８と良好な共局在を示しており（図１１（ｄ）〜（ｆ）矢印）、ＲＰＫ１１８が点状または輪状に局在している場所がエンドソームであることを示している。
ＧＦＰ−ＲＰＫ１１８およびＨＡ−ＳＰＨＫ１を同時に発現しているＣＯＳ７細胞では、ＧＦＰ−ＲＰＫ１１８は図１１（ｇ）に示されるように細胞質（核以外）に拡散し、初期エンドソームと見られる位置にも存在した。これはＲＰＫ１１８だけをＣＯＳ７細胞で発現させた場合も同様である。一方、ＨＡ−ＳＰＨＫ１は図１１（ｈ）に示されるように、細胞質に網状に分散し、初期エンドソームにも存在した。また、すべてではないがいくつかの細胞ではエンドソーム構造がＧＦＰ−ＲＰＫ１１８およびＨＡ−ＳＰＨＫ１の両方にラベルされた（図１１（ｉ）矢印）。ＲＰＫ１１８の点状または輪状構造のエンドソーム局在パターンは、比較的低レベルでタンパク質発現させた細胞でも観察されたので、高レベルのタンパク質発現の結果とは考えられない。さらに、ＧＦＰ−ＲＰＫ１１８と共発現させた場合とは異なり、ＨＡ−ＳＰＨＫ１を単独発現させた細胞において、初期エンドソーム構造がＨＡ−ＳＰＨＫ１に染色されたものはほとんど観察されなかった。
ＳＰＨＫ１の初期エンドソームへの輸送にＲＰＫ１１８が直接関与しているのか調べるために、ＰＳＫ２断片をＲＰＫ１１８およびＳＰＨＫ１と共発現させた場合の影響を検討した。ＰＳＫ２断片をＧＦＰ−ＲＰＫ１１８およびＨＡ−ＳＰＨＫ１とともにＣＯＳ７細胞で発現させると、ＧＦＰ−ＲＰＫ１１８の染色パターンはほとんど変わらなかったが（図１１（ｋ））、ＨＡ−ＳＰＨＫ１はエンドソームを標識せずに細胞質および周縁領域に分布していた（図１１（ｌ））。これは、ＰＳＫ２断片がＳＰＨＫ１との結合をＲＰＫ１１８と競合することによりドミナントネガティブに機能する結果と考えられる。以上の結果は、ＲＰＫ１１８がＳＰＨＫ１の初期エンドソームへの輸送（リクルートメント）に重要であることを示すものである。なお、図１１（ｊ）は、細胞の位置を示すために、ＤＩＣ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｃｏｎｔｒａｓｔ）で細胞の概形写真をとったものである。
〔実施例６：ドットブロットオーバーレイアッセイ〕
最近の研究により、ＰＸドメインを含むタンパク質は、特異的に膜表面のホスファチジルイノシトール３リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ）を認識することが分かってきた。そこで、ＲＰＫ１１８もＰＸドメインを介してＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐと結合するか確かめるため、ドットブロットオーバーレイアッセイを行い、ＲＰＫ１１８のホスホイノシチド結合特異性を調べた。
Ｓｆ９細胞発現システムで組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＲＰＫ１１８を生成し、さらにグルタチオン−セファローズ４Ｂ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）により精製した。精製ＧＳＴ−ＲＰＫ１１８をプローブに使用し、種々のリン脂質が付着され、ＢＳＡブロックされたニトロセルロースフィルター（ＥｃｈｅｌｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂ．，ＳａｌｔＬａｋｅＣｉｔｙ，Ｕｔａｈ）と反応させた。その後、フィルターを洗浄し、フィルターに結合したＧＳＴ−ＲＰＫ１１８は、抗ＧＳＴ抗体（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｏｍａｃｉａ）を用いて可視化された。
実験結果を図１２に示す。図１２には、リン脂質として、それぞれ、ＰｔｄＩｎｓ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ；ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰｔｄＩｎｓ（３，４）Ｐ_２，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３，４−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ_２，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ_２，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ_３，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ；ＬｙｓｏＰｔｄＯＨ，ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃａｃｉｄ；ＬｙｓｏＰｔｄＣｈｏ，ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＰｔｄＥｔｎ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ；ＰｔｄＳｅｒ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ；ＰｔｄＣｈｏ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；ＰｔｄＯＨ，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃａｃｉ；ＳＰＰ（ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が付着されたニトロセルロースフィルターが示されており、抗ＧＳＴ抗体により、ＲＰＫ１１８が結合したものが染色されている。
これによれば、ＲＰＫ１１８は、他のホスホイノシチドと比べてＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐに特異的に結合している。また、ＲＰＫ１１８は、ホスファチジルイノシトール５リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（５））と弱く相互作用するが、ホスホチジルイノシトール４，５−２リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ_２）、またはホスファチジルイノシトール３，４，５−３リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（３，４，５））Ｐ_３とは全く相互作用しなかった。さらに、ＲＰＫ１１８のＰＸドメインを欠失させた変異体ＲＰＫ１１８△ＰＸは、フィルターのＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐと結合しなかった。
最近の研究により、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐは、酵母菌や哺乳類において細胞内顆粒輸送に関わることが示唆されており、ＲＰＫ１１８も細胞内顆粒輸送に関与していると考えられる。ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐは、初期エンドソームに存在することから、ＲＰＫ１１８はＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐと結合し、ＳＰＨＫ１を初期エンドソームに運ぶ働きがあると推定される。
尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができる。
産業上の利用の可能性
本発明に係るタンパク質は、以上のように、ヒト由来のスフィンゴシン・キナーゼ１に結合する性質を持ち、好ましくは、上記第１の領域、第２の領域、及び第３の領域の少なくともいずれかの領域を有するもの、あるいは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するものである。また、本発明に係るタンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するものである。さらに、本発明に係るポリヌクレオチドは、上述した本発明に係るいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、好ましくは、配列番号６に示される塩基配列を有するもの、あるいは、配列番号６に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加された塩基配列を有するものである。
それゆえ、本発明に係るタンパク質及びポリヌクレオチドは、スフィンゴシン・キナーゼ１、その酵素活性により産生されるスフィンゴシン・１リン酸、あるいはこのスフィンゴシン・１リン酸によるＥｄｇレセプターを介してのシグナル伝達が関係する種々の生理機能ならびにその調節機構を研究解析するための研究材料として有用であるばかりでなく、こうした研究を通じて、これらの生理機能やその調節機構に関わる種々の病気（例えば、動脈硬化や本態性高血圧等）の病態解析やその治療薬の開発、治療改善に有効利用できる可能性がある、という効果を奏する。
また、ＲＰＫ１１８が細胞内顆粒輸送に関与している可能性から、目的タンパク質の分解やリサイクルを促進または抑制する技術への利用、より具体的には、（１）内分泌疾患の治療：糖尿病患者のインスリン受容体の分解抑制など、（２）感染症の治療：マラリヤ感染における原虫の分解促進など、（３）免疫疾患の治療：Ｃ型肝炎ウィルスのマクロファージによる分解促進効果による抗原提示を介した抗体産生能力の増強など、への利用が考えられる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の実施の一形態に係るタンパク質ＲＰＫ１１８をコードするｃＤＮＡ配列（１〜１２００）を示す図である。
図２は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８をコードするｃＤＮＡ配列（１２０１〜２４００）を示す図である。
図３は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８をコードするｃＤＮＡ配列（２４０１〜３２０１）を示す図である。
図４は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８のアミノ酸配列を示す図である。
図５は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８および他のタンパク質の構造を比較して示した図である。
図６（ａ）および図６（ｂ）は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８と他のタンパク質ＲＳＫ３との間で構造的類似を示す部位のアミノ酸配列を比較して示した図である。
図７は、マウス由来のスフィンゴシン・キナーゼ１のｃＤＮＡ配列を示す図である。
図８は、免疫沈降−ウエスタンブロット法により、上記タンパク質ＲＰＫ１１８とスフィンゴシン・キナーゼ１との結合を確認した実験結果を示す図である。図９（ａ）および図９（ｂ）は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８および他のタンパク質ＲＳＫ３のリン酸化機能を調べた実験結果を示す図である。
図１０は、ヒトの各組織における上記タンパク質ＲＰＫ１１８の発現を調べたノーザンブロッティングの実験結果を示す図である。
図１１（ａ）〜（ｌ）は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８およびスフィンゴシン・キナーゼ１を共発現したＣＯＳ７細胞などで、その共局在および局在箇所を調べた実験結果を示す図である。
図１２は、上記タンパク質ＲＰＫ１１８と種々のリン脂質との結合性を調べた実験結果を示す図である。Technical field
The present invention relates to a novel protein that binds to human-derived sphingosine kinase 1, which is an enzyme that phosphorylates sphingosine and catalyzes the production of sphingosine monophosphate, and a polynucleotide encoding the protein.
Background art
Sphingosine is a kind of amino alcohol synthesized by the condensation of the amino acid serine and a fatty acid. On the other hand, sphingosine kinase is an enzyme that produces a physiologically active substance sphingosine monophosphate that phosphorylates this sphingosine and causes various physiological phenomena such as cell proliferation, angiogenesis, and suppression of apoptosis. The human sphingosine kinase 1 cDNA sequence was identified in 1998 by a group of Spiegel et al. (See Kohama et al. J. Biol. Chem. (1998) 273, 23722-23728).
There are seven types of Edg (Endothelial Cell Differentiation Gene) receptors, which are receptors for the sphingosine monophosphate, from 1 to 7 so far, but are currently considered to be receptors for sphingosine monophosphate. There are four types: Edg1, Edg3, Edg5 (other names: H218 or Agr16), and Edg6. Sphingosine monophosphate signals into cells via these Edg receptors, and details of this signal transduction mechanism are currently being studied worldwide.
It has recently been found that substances called lipid activators or lipid mediators play an important role in regulating various cellular functions. One of them is the sphingosine monophosphate, which is considered to be a lipid-derived cell growth factor having various cell regulatory functions such as cell growth ability through the Edg receptor.
For the metabolic pathway of sphingosine monophosphate and its signal transduction, see, for example, Experimental Medicine Vol. No. 18 2 (extra) 2000 80 (180) -81 (181), etc. As described in the same document, sphingosine monophosphate is produced by the metabolism of sphingomyelin in the cell membrane, ceramide, and sphingosine. It is produced by phosphorylation by sphingosine kinase.
Human-derived sphingosine kinase 1 is also an important enzyme that phosphorylates sphingosine to produce sphingosine monophosphate as described above, but how the action of sphingosine kinase 1 is regulated. However, the activity regulation mechanism is not well understood at present. In addition, there has been no report on the presence of a protein that binds to this sphingosine kinase 1.
Sphingosine monophosphate is involved in a variety of physiological functions such as cell proliferation, angiogenesis, and inhibition of apoptosis by the above signal transduction mechanism. As a result, various diseases related to these physiological functions (for example, arteriosclerosis and It is thought that it is also deeply involved in essential hypertension. Therefore, if the presence of a protein that binds to the sphingosine kinase 1 is clarified, this protein can be used as a candidate protein that regulates the action of the sphingosine kinase 1 as a pathological analysis of such a disease or a therapeutic agent thereof. It is expected to make an important contribution to the development and improvement of treatment.
This invention is made | formed in view of said subject, The objective is to provide the novel protein couple | bonded with human-derived sphingosine kinase 1, and the polynucleotide which codes the said protein.
Disclosure of the invention
The inventor of the present application performed yeast-to-hybrid screening for the purpose of searching for a novel protein that binds to sphingosine kinase 1 and regulates its activity. As a result, a novel protein RPK118 that binds to sphingosine kinase 1 and a polynucleotide encoding the protein were found, and the present invention was completed.
First, the protein according to the present invention is characterized in that it has a property of binding to human-derived sphingosine kinase 1.
Here, the term “having the property of binding” means that the binding to the sphingosine kinase 1 can be confirmed by the method described in the below-described examples, in other words, It means that the protein has a region that binds to the sphingosine kinase 1. In addition, the binding between the enzyme and its substrate (ie, sphingosine kinase 1 and its substrate sphingosine) is not included in the “binding” here.
The protein according to the present invention is considered to regulate its activity in some way by binding to sphingosine kinase 1. On the other hand, sphingosine monophosphate phosphorylated by sphingosine kinase 1 is considered to be involved in the various physiological functions described above by transmitting signals into cells via the Edg receptor as described above. ing. Therefore, the protein according to the present invention is not only useful as a research material for research and analysis of these physiological functions and their regulatory mechanisms, but also through these studies, various proteins related to these physiological functions and their regulatory mechanisms are used. There is a possibility that it can be effectively used for disease state analysis, development of therapeutic agents, and improvement of treatment.
In addition, as described later, since the protein RPK118 according to the present invention may be involved in intracellular granule transport, various applications can be achieved by controlling the degradation and recycling of the target protein. For example, (1) treatment of endocrine diseases: inhibition of insulin receptor degradation in diabetic patients, etc. (2) treatment of infectious diseases: acceleration of protozoa degradation in malaria infection, etc. (3) treatment of immune diseases: hepatitis C virus It can be used for enhancement of antibody production ability through antigen presentation due to the effect of promoting degradation by macrophages.
The protein according to the present invention may be in a state isolated and purified from cells or the like, or may be in a state in which a gene encoding the protein is introduced into a host cell and the protein is expressed in the cell. . The protein according to the present invention may contain an additional polypeptide. Examples of the case where such a polypeptide is added include a case where the protein of the present invention is epitope-tagged by HA, Myc, flag or the like.
The protein according to the present invention may be further specified by any of the following characteristics a) to d).
a) It has a first region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
b) It has a second region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
c) It has a third region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
d) It has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
As will be described later, the protein RPK118 according to the present invention isolated from humans by the present inventor consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. The protein RPK118 has PX domain as the first region, ESP domain as the second region, and P-kinase domain as the third region. Of these, the third region, P-kinase domain, is considered to be a binding region to sphingosine kinase 1.
Second, the protein according to the present invention is characterized by having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. .
Here, the deletion, substitution, insertion and / or addition of one or several amino acids means deletion, substitution, insertion and / or by known mutant protein production methods such as site-directed mutagenesis. It means that as many amino acids as can be added (preferably 10 or less, more preferably 7 or less, and even more preferably 5 or less) are deleted, substituted, inserted, and / or added.
Thus, in other words, the protein is a mutant protein of the protein RPK118 according to the present invention consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the “mutation” here is mainly a known mutant protein production method Is an artificially introduced mutation, but a naturally occurring mutant protein may be isolated and purified. In addition, the properties of the mutant protein are not particularly limited. For example, the binding ability to sphingosine kinase 1 may be the same as that of the protein RPK118, and the binding region may be mutated. The binding ability may be enhanced by causing the binding, the binding ability may be weakened, or the binding ability may be lost.
Thirdly, the polynucleotide according to the present invention is characterized by encoding any of the proteins according to the present invention described above.
The above-mentioned “polynucleotide” is meant to include at least genomic DNA, cDNA, and mRNA. For example, it corresponds to a cDNA having an open reading frame encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and the base sequence of this cDNA. It includes mRNA having a base sequence and genomic DNA from which this mRNA is transcribed.
The “polynucleotide” includes not only double-stranded DNA but also single-stranded DNA and RNA such as sense strand and antisense strand constituting the DNA. Furthermore, the “polynucleotide” may include sequences such as a sequence of an untranslated region (UTR) and a vector sequence (including an expression vector sequence) in addition to the sequence encoding the protein of the present invention. For example, the polynucleotide of the present invention can be amplified as desired by constructing the polynucleotide of the present invention by connecting the sequence encoding the protein of the present invention to a vector sequence and amplifying it in a suitable host.
Examples of the polynucleotide of the present invention include, for example, a polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, and one or several bases deleted, substituted, inserted, and / or deleted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 6. Or the polynucleotide which has the added base sequence is mentioned. Here, the deletion, substitution, insertion and / or addition of one or several bases is a number which can be deleted, substituted, inserted and / or added by a known DNA recombination technique or mutation introduction method. Is deleted, substituted, inserted, and / or added.
The recombinant expression vector according to the present invention comprises the above polynucleotide. For example, a recombinant expression vector into which the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 6 has been inserted can be mentioned. For the production of a recombinant expression vector, a plasmid, phage, cosmid or the like can be used, but is not particularly limited.
The transformant according to the present invention is a transformant into which the polynucleotide is introduced. Here, “gene introduced” means that the gene is introduced into a target cell (host cell) so as to be expressed by a known genetic engineering technique (gene manipulation technique). The above-mentioned “transformant” means not only cells / tissues / organs but also animals (transformed animals such as nematodes, Drosophila melanogaster, mice, rats, rabbits, pigs, monkeys). In particular, mice and rats are widely used as experimental animals and pathological model animals, and knockout mice and the like are used for further functional analysis of the protein RPK118, development of diagnostic methods for diseases involving the protein, and treatment methods thereof. It is useful for the development of
The gene detection instrument of the present invention uses at least a part of the nucleotide sequence in the above polynucleotide or a complementary sequence thereof as a probe. The gene detection instrument can be used for expression analysis of the polynucleotide of the present invention, that is, the gene of the present invention. Examples of the gene detection instrument of the present invention include a DNA chip in which the probe that specifically hybridizes with the gene of the present invention is immobilized on a substrate (carrier).
The antibody according to the present invention is an antibody obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody by a known method using the protein of the present invention or a partial peptide thereof as an antigen.
Other objects, features, and advantages of the present invention will be fully understood from the following description. The benefits of the present invention will become apparent from the following description with reference to the accompanying drawings.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
An embodiment of the present invention will be described below with reference to the drawings.
(1) Protein RPK118 according to the present invention and the sequence and structure of the gene thereof
The present inventor screened from a rat brain cDNA library using the yeast two-hybrid method for the purpose of searching for a novel protein that binds to human-derived sphingosine kinase 1 and regulates its activity. Went. The obtained cDNA clone is further analyzed, and from the human brain cDNA library, the amino acid sequence of the novel protein RPK118 having a molecular weight of 118,000 that binds to the sphingosine kinase 1, and the full-length cDNA of the gene encoding the protein The sequence was successfully determined. In addition, about the screening by the said yeast two hybrid method, etc. are explained in full detail in the below-mentioned Example.
Among the determined full-length cDNA sequences, the base sequence of the open reading frame (ORF) region encoding the protein RPK118 according to the present invention is shown in SEQ ID NO: 6 (the same sequence is also shown in FIGS. 1 to 3). The determined full-length cDNA sequence contained an untranslated region (UTR) on the 5 ′ side and 3 ′ side in addition to the ORF region.
The amino acid sequence of the protein RPK118 is shown in SEQ ID NO: 5. FIG. 4 also shows the same sequence in the form of one letter for each amino acid.
FIG. 5 shows a schematic structure of the protein RPK118 that has been clarified as a result of the analysis. The protein RPK118 consists of 1066 amino acids, and as shown in the figure, PX domain (first region), ESP domain (second region), and P-kinase domain (third region) 3 Has two domains. The PX domain corresponds to the region from the 9th amino acid to the 128th amino acid of the RPK118, as shown in SEQ ID NO: 1 and the region surrounded by gray in FIG. The ESP domain corresponds to the region from the 239th amino acid to the 307th amino acid of the RPK118, as shown in SEQ ID NO: 2 and the region surrounded by the solid line in FIG. The P-kinase domain consists of two parts, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. Among these, the relatively short first part (PSK1) corresponds to the region from the 340th amino acid to the 426th amino acid of the RPK118, and the relatively long second part (PSK2) is the 906 of the RPK118. The region corresponds to the region from the 10th amino acid to the 1066th amino acid (see the black belt region in FIG. 4).
The above PX domain and ESP domain are named because they have high homology with the regions called PX domain and ESP domain possessed by known sorting proteins, respectively. Because of this homology, the RPK118 PX domain and ESP domain are probably involved in sorting in the intracellular vesicle transport (carrying vesicles to the desired location in the cell), and the RPK118 is PXdomain and ESP. It is thought that it functions as a sorting protein that transports and transports sphingosine kinase 1 to a specific place in the cell via domain.
As shown in the examples described below, RPK118 expression is such that at least a part of sphingosine kinase 1 is localized in early endosomes, and is also present in phospholipids (described later) involved in intracellular granule transport. Since PtdIns (3)) binds to RPK118, it is highly likely that RPK118 plays a role of transporting sphingosine kinase 1 to the early endosome as an adapter molecule.
The P-kinase domain (PSK) is a new region showing structural similarity with ribosomal S6 kinase (RSK3), which is important for protein translation, and the homologous site of RSK3 plays an important role in metabolic activity.
FIG. 6 is a diagram comparing the P-kinase domain of RPK118 and the P-kinase domain of RSK3, PSK1 corresponds to kinase subdomains I to V (FIG. 6 (a)), and PSK2 is kinase subdomain VI. To XI (FIG. 6B). However, RPK118 has a GxGxxG motif that is essential for ATP binding in the kinase subdomain I of RSK3, as shown in FIG. 6 (a). In addition, as shown in FIG. 6B, in the kinase subdomain VII of RSK3, Mg ²⁺ The DFG motif that confers sensitivity to enzymes is also mutated. In other words, RPK118 lacks a site necessary for protein phosphorylation and appears to lack phosphotransferase activity. The physiological function of this domain is unknown. Since this domain lacks a site necessary for phosphorylation in this way, it was named pseudo kinase domain, that is, P-kinase domain. Moreover, the protein of the present invention was named “RPK118 (ribosomal S6 kinase-like protein with two PSK domains)” from the structural similarity with RSK3.
As a result of analysis, it was found that the binding site (binding region) to sphingosine kinase 1 in RPK118 is present in the second portion (PSK2) on the C-terminal side of the P-kinase domain.
As described above, the protein RPK118 according to the present invention binds to sphingosine kinase 1 via the C-terminal P-kinase domain, and binds sphingosine kinase 1 via the N-terminal PX domain and ESP domain. It is thought that it acts as a sorting protein that is transported to a specific area in the cell.
In addition, database search identified orthologs of RPK118 from Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans, revealing that RPK118 belongs to a new, highly conserved gene family (FIG. 5). As shown in the figure, both Drosophila melanogaster and nematode have PX, ESP, PSK1, and PSK2 domains, similar to RPK118. In contrast, human-derived RPK60 has ESP, PSK1, and PSK2 domains, but does not have a PX domain. This gene is known as Accession No. as an unknown kinase. Although it was reported to AAD30182, the function is still unknown, and it may have the same function as RPK118.
The method for confirming the binding between the protein RPK118 and sphingosine kinase 1 according to the present invention is not particularly limited, and various known methods for examining the interaction between proteins can be used. For example, HA The presence or absence of the binding of both proteins can be investigated by immunoprecipitation-Western blotting using such epitopes and their antibodies.
(2) Protein and polynucleotide acquisition method according to the present invention
Although the sequence, structure, function, and various features of the gene (polynucleotide) of RPK118, which is the protein according to the present invention, have been described above, the method for obtaining the protein and polynucleotide according to the present invention will be described below. .
A method for obtaining a polynucleotide encoding the protein RPK118 is not particularly limited, and DNA fragments containing the polynucleotide are isolated and cloned by various methods based on the sequence information disclosed above. can do. For example, a probe that specifically hybridizes with a partial sequence of cDNA encoding the RPK118 may be prepared, and a human genomic DNA library or a human brain cDNA library may be screened. As such a probe, any probe of any sequence and length may be used as long as it specifically hybridizes to at least part of the base sequence of cDNA encoding RPK118 or its complementary sequence. Moreover, what is necessary is just to perform about each step in the said screening on the conditions used normally.
The clone obtained by the above screening can be analyzed in more detail by preparing a restriction enzyme map and determining its nucleotide sequence (sequencing). By these analyses, it can be easily confirmed whether or not a DNA fragment containing the polynucleotide according to the present invention has been obtained.
Further, the sequence of the probe is selected from regions considered to be important for the function of the RPK118 (for example, the PX domain, ESP domain, or P-kinase domain), and genomic DNA (or cDNA) of humans or other organisms. ) If a library is screened, it is highly possible to isolate and clone a gene encoding a homologous molecule or a similar molecule having the same function as RPK118.
As a method for obtaining a polynucleotide (gene) according to the present invention, there is a method using an amplification means such as PCR in addition to the above screening method. For example, among the above RPK118 cDNA sequences, primers are prepared from sequences of 5 ′ and 3 ′ untranslated regions (or their complementary sequences), and human genomic DNA (or cDNA) is prepared using these primers. ) And the like as a template, and amplifying a DNA region sandwiched between both primers, a large amount of DNA fragments containing the polynucleotide of the present invention can be obtained.
The method for obtaining the protein according to the present invention is not particularly limited. For example, the polynucleotide obtained as described above (such as cDNA encoding RPK118 or a homologous molecule thereof) is well known. The protein according to the present invention such as the above-mentioned protein RPK118 can be easily obtained by incorporating into a microorganism such as Escherichia coli or yeast or animal cells by the method, and expressing and purifying the protein encoded by the cDNA. When introducing a foreign gene into the host in this way, there are various expression vectors and hosts that incorporate a promoter that functions in the host in the recombination region of the foreign gene. do it. The method for extracting the produced protein varies depending on the host used and the nature of the protein, but it is possible to purify the target protein under appropriate conditions.
In addition, as a method for producing a mutant protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added in the amino acid sequence of RPK118, for example, a PCR method is used. Examples thereof include a method for producing a mutated protein by introducing a point mutation into a base sequence, a site-directed mutagenesis method (hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275 (1995), etc.), and the like. In addition, a method described in the document “Cell Engineering Separate Volume: New Cell Engineering Experiment Protocol Shujunsha 241-248 (1993)” and a commercially available kit (for example, Quikchange Site-Directed Mutagenesis Kit, manufactured by Stratagene) are used. A method is also possible.
Many examples of mutant proteins produced as described above having the same activity and function as wild type are already known, but mutations are introduced to produce abnormalities in the activity and function of the mutant protein. Many things have already been done. For example, when a mutant protein of the protein RPK118 is prepared, the binding ability of the P-kinase domain, which is a binding region, is changed so that the binding ability to sphingosine kinase 1 is higher than that of wild-type RPK118. There is a high possibility that an enhanced mutant protein, a mutant protein with a weak binding ability, or a mutant protein with a loss of binding ability can be produced. Similarly, by introducing a mutation into the above-mentioned PX domain or ESP domain considered to be related to the transport / transport of sphingosine kinase 1, a mutant protein whose transport ability is enhanced compared to wild-type RPK118, and the transport ability is weakened. There is a high possibility that a mutant protein with a lost transport ability or a mutant protein with lost transport ability can be produced.
For a polynucleotide (mutant gene) having a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted, and / or added in the base sequence of the cDNA encoding RPK118, for example, the PCR method is used. Thus, DNA can be modified and prepared using a known mutation introduction method such as a method for introducing a point mutation into a base sequence or a site-directed mutagenesis method.
(3) Use of protein and polynucleotide according to the present invention
The polynucleotide according to the present invention can be prepared by introducing it into an expression vector and incorporating it into a microorganism such as Escherichia coli or yeast or animal cells by a known method. The specific type of the vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in the host cell may be appropriately selected. That is, according to the type of the host cell, a promoter sequence may be appropriately selected in order to reliably express the gene, and those obtained by incorporating this and the polynucleotide of the present invention into various plasmids may be used as the expression vector.
In addition, various markers may be used in order to confirm whether or not the polynucleotide according to the present invention has been introduced into the host cell, and whether or not it is reliably expressed in the host cell. For example, a green fluorescent protein GFP (Green Fluorescent Protein) derived from Aequorea jellyfish may be used as a marker to express a fusion protein obtained by fusing the protein according to the present invention and GFP.
The host cell is not particularly limited, and various conventionally known cells can be suitably used. Specifically, for example, bacteria such as Escherichia coli, yeast (budding yeast Saccharomyces cerevisiae and fission yeast Schizosaccharomyces pombe), Xenopus laevis oocytes, various mammalian cultured cells, mammalian cells of various insects, Although cultured cells etc. can be mentioned, it is not specifically limited.
A method for introducing the expression vector into a host cell, that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be suitably used. .
A partial sequence of the polynucleotide according to the present invention or a complementary sequence thereof can be used as a probe for a gene detection instrument. Examples of the gene detection instrument include a DNA chip formed by immobilizing an oligonucleotide (probe) on a substrate (carrier). The “DNA chip” as used herein mainly means a synthetic DNA chip that uses a synthesized oligonucleotide as a probe, but also includes an affixed DNA microarray that uses a cDNA such as a PCR product as a probe. And
The length of the oligonucleotide used as the probe is not particularly limited as long as the expression of the target gene can be detected by its characteristic / specific sequence, but in the case of a synthetic oligonucleotide, it is preferably 10 or more and 30 or less. 15 to 25 is more preferable.
The method for producing an antibody against the protein according to the present invention is not particularly limited, and for example, it can be obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody by a conventionally known method using the RPK118 protein itself or a partial peptide thereof as an antigen.
(Example)
[Example 1: Determination of gene sequence of RPK118]
The inventor of the present application isolated the protein RPK118 and its gene (full-length cDNA) as follows and determined each sequence.
7 and SEQ ID NO: 7 show the cDNA sequence of sphingosine kinase 1 derived from mouse. Based on this cDNA sequence, the cDNA of sphingosine kinase 1 was cloned using a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method.
Next, the sphingosine kinase 1 cDNA clone was used as a bait, and screening was performed by a yeast two-hybrid method from a commercially available rat brain cDNA library. This yeast two-hybrid method was performed using a commercially available kit (Matchmaker two-hybrid system 3 Clontech) according to the procedure of the kit.
Based on the sequence of the positive clone obtained by the yeast two-hybrid method, cDNA having the same sequence portion was obtained from a human brain cDNA library. Since this cDNA lacked the 5 ′ end side, the 5 ′ end side that had been deleted was further recovered by 5′-RACE method, and the base sequence of the full-length cDNA was determined. The 5′-RACE method was carried out using a commercially available kit according to the procedure of the kit. A commercially available sequencer was used to determine the base sequence.
[Example 2: Immunoprecipitation confirming binding of RPK118 and sphingosine kinase 1]
Furthermore, protein RPK118 was expressed based on the obtained full-length cDNA sequence, and the binding ability to sphingosine kinase 1 was examined. As a result, it was confirmed that the protein RPK118 bound to sphingosine kinase 1.
FIG. 8 is a diagram showing the experimental results of confirming the binding between protein RPK118 and sphingosine kinase 1 by immunoprecipitation-Western blotting.
In the experiment, the mammalian expression vector pCMV5 was used and the full length RPK118, PSK2 fragment, and the RPKΔPSK fragment lacking PSK were each subcloned into the vector pCMV5 with the FLAG epitope tag. On the other hand, COS7 cells were cultured in a 60 mm tissue culture dish to ˜70% confluent, and each culture dish was transformed with 3 μg of each vector (plasmid DNA) and 12 μl of Fugene-6 reagent.
As described above, each vector was infected with COS7 cells, and FLAG-RPKΔPSK lacking the sequence from 314 to 1066 residues including FLAG-labeled protein RPK118 (FLAG-RPK118), FLAG-PSK2 fragment, PSK1 and PSK2 domains, respectively. Expressed. Furthermore, about each said protein, what co-expressed with the HA-labeled sphingosine kinase 1 (HA-SPHK1) was prepared.
Each COS7 cell was then lysed with cold lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% (w / v) Brij 97 (Sigma) and protease inhibitor (Roche)) and anti-FLAG. Immunoprecipitation-immunoblot analysis was performed using antibody M2 (Sigma) and anti-HA antibody (Roche).
The result is shown in FIG. When both FLAG-PSK2 fragment and HA-SPHK1 are expressed in order from the right lane in the figure, when only FLAG-PSK2 fragment is expressed, when both FLAG-RPK118 and HA-SPHK1 are expressed When only FLAG-RPK118 is expressed, when both FLAG-RPKΔPSK and HA-SPHK1 are expressed, when only FLAG-RPKΔPSK is expressed, when only HA-SPHK1 is expressed, when neither is expressed This is a sample.
The 1st to 3rd panel is the case where anti-FLAG antibody (anti-FLAG) is used for immunoprecipitation (IP) and anti-FLAG antibody (anti-FLAG) is used for immunoblotting (IB), that is, anti-FLAG antibody The results of performing immunoprecipitation (Western blotting) with anti-FLAG antibody on each immunoprecipitate after performing immunoprecipitation on each sample using the above. The fourth panel shows the results of direct immunoblotting with anti-HA antibody without performing immunoprecipitation of the lysates of COS7 cells, which are each sample, in order to confirm the expression of the HA-SPHK1. The fifth panel shows the results of using anti-FLAG antibody (anti-FLAG) for immunoprecipitation (IP) and anti-HA antibody (anti-HA) for immunoblotting (IB).
As shown in the figure, when a sample in which both FLAG-RPK118 and HA-SPHK1 were expressed in COS7 cells was immunoprecipitated with anti-FLAG antibody and immunoblotted with anti-HA antibody, a signal was obtained. From this, the binding between protein RPK118 and sphingosine kinase 1 was confirmed.
Similarly, for a sample in which both the FLAG-PSK2 fragment and the HA-SPHK1 were expressed in COS7 cells, after immunoprecipitation with an anti-FLAG antibody, a signal was obtained by immunoblotting with an anti-HA antibody. It was confirmed that the binding site to sphingosine kinase 1 (SPHK1) exists within the PSK2 site.
During the screening by the yeast two-hybrid method described in Example 1, cDNA encoding the amino acid sequence from the 901st to the 1066th amino acid sequence of the protein RPK118 was obtained as a positive clone. It was presumed to be a binding site with SPHK1, but the above experimental results confirmed this.
On the other hand, FLAG-RPKΔPSK containing no PSK2 did not show any interaction with SPHK1 in the above experiment.
[Example 3: Kinase assay for examining phosphorylation activity function of RPK118]
In order to confirm whether RPK118 has a phosphorylation activity function, the following kinase assay was performed.
COS7 cells expressing FLAG-RPK118 or FLAG ribosomal S6 kinase 3 (RSK3) were treated with cold lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% Triton X-100). , 1 mM Na ₃ VO ₄ , And protease inhibitors). The FLAG-labeled protein in the lysate was immunoprecipitated using anti-FLAG antibody M2 beads, washed with or without adding 250 μM S6 peptide (Upstate Biotechnology) to the immunoprecipitate, and protein kinase activity after washing. It was measured. At this time, to the S6 peptide absorbed in P-81 paper ³² P binding was determined by Cerenkov counting, and immunoprecipitates were quantified using SDS-PAGE followed by Fuji Bio-Imaging Analyzer, BAS2000 (Fuji Photo Film C1, Japan).
The experimental results are shown in FIG. FIG. 9A shows the autophosphorylation, and FIG. 9B shows the phosphorylation of the substrate S6 peptide. Although immunoprecipitated RPK118 was well expressed and under the same conditions RSK3 showed high kinase activity for autophosphorylation and phosphorylation of the substrate S6 peptide, RPK118 was responsible for autophosphorylation. Neither showed kinase activity for phosphorylation of the substrate S6 peptide.
[Example 4: Northern blotting for examining RPK118 expression in human tissues]
In order to examine the expression of RPK118 in each human tissue, the expression of RPK118 mRNA in each human tissue was analyzed by the following Northern blotting.
First, 1 μg of poly (A) derived from each human tissue for each lane of the gel ⁺ After electrophoresis of RNA (CLONETECH), ³² A P-labeled 900 bp long BamH1 fragment of RPK118 was hybridized as a probe. Bands were visualized by Fujix Bio-Imaging Analyzer, BAS2000.
As a result, as shown in FIG. 10, RPK118 was expressed in various tissues, and in particular, high level expression was detected in skeletal muscle, brain, heart, placenta, kidney, and liver. In the figure, the lower panel shows the results of using β-actin as a control probe.
[Example 5: Localization of RPK118 and sphingosine kinase 1 in COS7 cells]
In order to further examine the interaction between RPK118 and sphingosine kinase 1 (SPHK1), the intracellular localization of RPK118 and SPHK1 was examined using immunofluorescence.
A vector obtained by cloning RPK118 into pEGFP-C1 (CLONETECK) and the FLAG-RPK118 and HA-SPHK1 expression vectors used in Example 2 were coexpressed in COS7 cells in any combination, and each labeled protein was expressed in COS7 cells. Expressed in
Transformed COS7 cells were transferred to a coverslip (Nalge Nunc) with a cell number of 10 ⁶ 1% bovine serum albumin (BSA) seeded at a density of / ml, fixed with 3% paraformaldehyde in phosphate-buffered saline (PBS) for 15 minutes, treated with 0.2% Triton X-100 for 10 minutes Blocked with PBS containing Thereafter, COS7 cells were incubated with a primary antibody (FLAG, HA, early endosomal antigen EEA1 which is an endogenous endosomal marker) at 25 ° C. for 1 hour, washed 3 times, and then washed with a secondary antibody conjugated with a fluorescent dye. It was kept at 1 ° C. for 1 hour. The EEA1 antibody used was BD Transaction Lab (San Jose CA).
COS7 cells were then observed using a confocal microscope (Bio-Rad MRC1024). The result of microscopic observation is shown in FIG. FIGS. 11 (a) to 11 (c) show the co-localization of both proteins in COS7 cells co-expressing GFP-RPK118 and FLAG-RPK118, confirming the effectiveness of GFP-RPK. It was. RPK118 was diffusively distributed in the cytoplasm and existed in a small punctate or ring-like structure where complete colocalization was shown (FIGS. 11 (a) to (c) arrows). In contrast, in COS7 cells expressing only the GFP vector, GFP was diffusely distributed throughout the cell.
FIGS. 11 (d) to 11 (f) are immunostains of an endogenous endosomal marker (EEA1) in COS7 cells expressing GFP-RPK118. According to this, EEA1 shows a good co-localization with GFP-RPK118 (arrows in FIGS. 11 (d) to (f)), and the location where RPK118 is localized in a dot or ring shape is an endosome. Is shown.
In COS7 cells that simultaneously express GFP-RPK118 and HA-SPHK1, GFP-RPK118 diffused into the cytoplasm (other than the nucleus) as shown in FIG. . This is the same when only RPK118 is expressed in COS7 cells. On the other hand, as shown in FIG. 11 (h), HA-SPHK1 was dispersed in a reticulated manner in the cytoplasm and was also present in the early endosome. In some but not all cells, the endosomal structure was labeled on both GFP-RPK118 and HA-SPHK1 (arrows in FIG. 11 (i)). The RPK118 punctate or ring-shaped endosomal localization pattern was also observed in cells expressed at relatively low levels of protein, and is not considered a result of high levels of protein expression. Furthermore, unlike the case of co-expression with GFP-RPK118, in the cells in which HA-SPHK1 was expressed alone, the initial endosome structure stained with HA-SPHK1 was hardly observed.
In order to investigate whether RPK118 is directly involved in the transport of SPHK1 to the early endosome, the effect of co-expression of the PSK2 fragment with RPK118 and SPHK1 was examined. When the PSK2 fragment was expressed in COS7 cells together with GFP-RPK118 and HA-SPHK1, the staining pattern of GFP-RPK118 was almost unchanged (FIG. 11 (k)), but HA-SPHK1 did not label endosomes and It was distributed in the peripheral area (FIG. 11 (l)). This is thought to be a result of the PSK2 fragment functioning dominant negative by competing with RPK118 for binding to SPHK1. The above results indicate that RPK118 is important for the transport (recruitment) of SPHK1 to the early endosome. FIG. 11 (j) is a schematic photograph of the cells by DIC (Differential Interference contrast) in order to show the position of the cells.
[Example 6: Dot blot overlay assay]
Recent studies have shown that proteins containing the PX domain specifically recognize phosphatidylinositol triphosphate (PtdIns (3) P) on the membrane surface. Therefore, in order to confirm whether RPK118 also binds to PtdIns (3) P via the PX domain, a dot blot overlay assay was performed to examine the phosphoinositide binding specificity of RPK118.
Recombinant glutathione-S-transferase (GST) -RPK118 was produced with the Sf9 cell expression system and further purified with glutathione-Sepharose 4B (Amersham Pharmacia). Purified GST-RPK118 was used as a probe and reacted with various phospholipid-attached and BSA-blocked nitrocellulose filters (Echelon Research Lab., Salt Lake City, Utah). Thereafter, the filter was washed, and GST-RPK118 bound to the filter was visualized using an anti-GST antibody (Amersham Pharmacia).
The experimental results are shown in FIG. In FIG. 12, PtdIns, phosphatidylinositol; PtdIns (3) P, phosphatidylinositol 3-phosphate, PtdIns (4) P, phosphatidylinositol 4-phosphate; PtdIns (5) P, phosphoid 3,4) P ₂ , Phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate; PtdIns (4,5) P ₂ , Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; PtdIns (3,5) P ₂ , Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate; PtdIns (3,4,5) P ₃ ,

Phosphatidylinositol

3,4,5-trisphosphate; LysoPtdOH, lysophosphatidic acid; LysoPtdCho, lysophosphatidylcholine; PtdEtn, phosphatidylethanolamine; PtdSer, phosphatidylserine; PtdCho, phosphatidylcholine; PtdOH, phosphatidic aci; SPP nitrocellulose filters (sphingosine 1-phosphate) is attached The RPK118 binding is stained with the anti-GST antibody.
According to this, RPK118 specifically binds to PtdIns (3) P compared to other phosphoinositides. RPK118 interacts weakly with phosphatidylinositol pentaphosphate (PtdIns (5)), but phosphotidylinositol 4,5-2 phosphate (PtdIns (4,5) P ₂ ), Or

phosphatidylinositol

3,4,5-3 phosphate (PtdIns (3,4,5)) P ₃ Did not interact at all. Furthermore, the mutant RPK118ΔPX lacking the PXK118 PX domain did not bind to the filter PtdIns (3) P.
Recent studies suggest that PtdIns (3) P is involved in intracellular granule transport in yeast and mammals, and RPK118 is also considered to be involved in intracellular granule transport. Since PtdIns (3) P is present in the early endosome, it is presumed that RPK118 binds to PtdIns (3) P and carries SPHK1 to the early endosome.
It should be noted that the specific embodiments or examples made in the best mode for carrying out the invention are merely to clarify the technical contents of the present invention, and are limited to such specific examples. The present invention should not be interpreted in a narrow sense, and various modifications can be made within the spirit of the present invention and the scope of the following claims.
Industrial applicability
As described above, the protein according to the present invention has a property of binding to human-derived sphingosine kinase 1, and preferably, at least one of the first region, the second region, and the third region. One having a region or one having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. The protein according to the present invention has an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. Furthermore, the polynucleotide according to the present invention is a polynucleotide encoding any one of the above-described proteins according to the present invention, and preferably has the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, or shown in SEQ ID NO: 6. The base sequence has a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added.
Therefore, the protein and the polynucleotide according to the present invention are related to sphingosine kinase 1, sphingosine monophosphate produced by its enzymatic activity, or signal transduction through the Edg receptor by this sphingosine monophosphate. Not only is it useful as a research material for research and analysis of various physiological functions and their regulatory mechanisms, but also through these studies, various diseases related to these physiological functions and their regulatory mechanisms (eg, arteriosclerosis and essential hypertension). Etc.), there is a possibility that it can be effectively used for pathological analysis, development of therapeutic agents, and improvement of treatment.
In addition, because of the possibility that RPK118 is involved in intracellular granule transport, it can be used for technology for promoting or suppressing degradation and recycling of the target protein. More specifically, (1) Treatment of endocrine diseases: Inhibition of insulin receptor degradation, etc. (2) Treatment of infectious diseases: acceleration of protozoan degradation in malaria infection, etc. (3) Treatment of immune diseases: antibodies through antigen presentation due to degradation of hepatitis C virus macrophages It can be used for enhancement of production capacity.
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing a cDNA sequence (1-1200) encoding protein RPK118 according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a view showing a cDNA sequence (1201 to 2400) encoding the protein RPK118.
FIG. 3 is a view showing a cDNA sequence (2401-3201) encoding the protein RPK118.
FIG. 4 shows the amino acid sequence of the protein RPK118.
FIG. 5 is a diagram comparing the structures of the protein RPK118 and other proteins.
FIG. 6A and FIG. 6B are diagrams comparing the amino acid sequences of the sites showing structural similarity between the protein RPK118 and the other protein RSK3.
FIG. 7 shows the cDNA sequence of mouse-derived sphingosine kinase 1.
FIG. 8 is a diagram showing experimental results in which the binding between the protein RPK118 and sphingosine kinase 1 was confirmed by immunoprecipitation-Western blotting. FIG. 9 (a) and FIG. 9 (b) are diagrams showing the experimental results of examining the phosphorylation function of the protein RPK118 and the other protein RSK3.
FIG. 10 is a diagram showing the northern blotting experimental results of examining the expression of the protein RPK118 in each human tissue.
FIGS. 11 (a) to (l) are diagrams showing experimental results obtained by examining the co-localization and location of COS7 cells co-expressing the above protein RPK118 and sphingosine kinase 1. FIG.
FIG. 12 is a diagram showing experimental results of examining the binding properties of the protein RPK118 and various phospholipids.

Claims

A protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.

The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and has the property of binding to human-derived sphingosine kinase 1. And a protein having a function of transporting the kinase to early endosomes .

A protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.

The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added, and has the property of binding to human-derived sphingosine kinase 1. protein.

A polynucleotide encoding the protein according to any one of claims 1 to 4 .

Na Ru polynucleotide of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6.

The base sequence shown in SEQ ID NO: 6 consists of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, inserted and / or added, and has the property of binding to human-derived sphingosine kinase 1. And a polynucleotide encoding a protein having a function of transporting the kinase to early endosomes .

A recombinant expression vector comprising the polynucleotide according to any one of claims 5 to 7 .

A transformant into which the polynucleotide according to any one of claims 5 to 7 has been introduced .

The polynucleotide according to any one of claims 5 to 7, wherein the polynucleotide according to any one of claims 5 to 7 , wherein at least a part of the nucleotide sequence or a complementary sequence thereof is used as a probe, is detected. Gene detection instrument for .

Antibodies against the protein of any one of claims 1 to 4.