JP4491090B2

JP4491090B2 - Apoptosis inducer

Info

Publication number: JP4491090B2
Application number: JP28849099A
Authority: JP
Inventors: 万木夫古林; 洋子平野; めぐみ森下; 角夫野牧; 修丸林
Original assignee: ヒガシマル醤油株式会社
Priority date: 1999-10-08
Filing date: 1999-10-08
Publication date: 2010-06-30
Anticipated expiration: 2019-10-08
Also published as: JP2001114673A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なアポトーシス誘導剤に関するもので、アスタキサンチンモノエステルを有効成分とするものである。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシスは、細胞に本来備わっている死の機構を発動させて起きる自殺型の細胞死であって、細胞の小体化やその核の断片化を伴うものである。そして、アポトーシスは多細胞生物の生命を維持する上で不可欠の機構であるから、その制御が狂い、アポトーシスが起きすぎたり、逆に少なすぎたりすると、さまざまな病気になることも知られている。
【０００３】
癌は、細胞が死ぬ機構をなくしたために起きるものであることから、アポトーシスの減少もその発生原因の一つであると言われている。また、その他にアポトーシスの減少に起因する疾患として自己免疫性疾患、あるいはウイルス感染などが挙げられている（Thompson,C.B.,Science,267,1456,1995）。したがって、アポトーシスを増加させる物質、すなわちアポトーシス誘導活性を有する物質を提供することは、癌のみでなくその他の疾患の治療あるいは予防にも役立つものである。
【０００４】
癌細胞に対するアポトーシス誘導活性を有する物質として、いくつかの化合物が研究されているが、アポトーシス誘導活性があり、かつ副作用が少ない有効成分の提供は未だに困難な状況にある。
【０００５】
一方、本発明者らは、エビ、カニなどの甲殻類に含まれるカロテノイドとして知られるアスタキサンチン類について、種々の研究を行ってきたが、この度、アスタキサンチンのエステルがアポトーシス誘導活性を有することを見出した。
アスタキサンチンは、エビ、カニなどの甲殻類のみでなく、赤色酵母やヘマトコッカスなどの藻類にも含有されていることが知られている。天然物から抽出することができるので、その利用は安全性の点から好ましいものである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アポトーシス誘導活性を有する、安全性の高い新規な医薬を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、アスタキサンチンモノエステルを有効成分として含有させることによって上記の課題を解決した。すなわち、本発明は、アスタキサンチンモノエステルを有効成分とするアポトーシス誘導剤に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において、アスタキサンチンは、遊離の化合物としてではなく、エステルとして用いる。実施例で示すように、本発明者らは、アスタキサンチンは、遊離の化合物ではアポトーシス誘導活性を有さないが、エステルにすると特異的にアポトーシス誘導活性を有することを発見した。
【０００９】
本発明において、エステルを構成する酸成分としては、パルミチン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸等の飽和脂肪酸、オレイン酸、リノール酸などの不飽和脂肪酸のいずれもが用いられる。
【００１０】
アスタキサンチンは、合成であっても、また、アスタキサンチン及び／又はそのエステルを含有する赤色酵母、エビ、カニ、オキアミ等の甲殻類の殻、緑藻類、微細藻類等よりの抽出物であっても、いずれでも使用できる。
例えば、本発明者らによる特開平１１−５６３４６号公報には、ヘマトコッカス藻体からアスタキサンチンを抽出する方法が記載されているが、該方法は好ましい抽出方法の一つである。
【００１１】
以下に、特開平１１−５６３４６号公報に記載される抽出法の概略を説明する。
緑藻類としては、ヘマトコッカス属に属し、アスタキサンチンを生産する藻体であれば、いかなる緑藻類でも使用しうる。例えば、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）、ヘマトコッカス・ラキュウストリス（Haematococcus lacustris）、ヘマトコッカス・カペンシス（Haematococcus capensis）などが挙げられるが、ヘマトコッカス・プルビアリスが好適である。ヘマトコッカス・プルビアリス藻体の栄養細胞は、暗所で酢酸などの有機物を炭素源として従属栄養的に、または、明所で酢酸などの有機物と炭酸ガスの両方を炭素源として混合栄養的に培養することによって得られる。培養したヘマトコッカス藻体の栄養細胞はアスタキサンチン合成能が低いため、アスタキサンチン合成能を高めるために、様々なストレスによりアスタキサンチン合成の誘導・活性化を行う必要がある。すなわち、栄養源枯渇、強光、活性酸素、高温、乾燥等の環境ストレスを単独又は組み合わせて付加することにより、栄養細胞を休眠状態であるシスト細胞に速やかに形態変化させることができる。この形態変化に伴いアスタキサンチン合成系が誘導され、アスタキサンチンが多量蓄積される。このように培養したヘマトコッカス藻体のシスト細胞は、遠心分離等により容易に回収され、アスタキサンチンの抽出工程が行われる。
【００１２】
本発明のアスタキサンチンモノエステルを有効成分とする製剤の投与形態は、経口投与または非経口投与のいずれでも良く、注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤などを挙げることができる。
【００１３】
本発明のアスタキサンチンモノエステルがアポトーシス誘導活性を有することは、制癌剤のスクリーニング法として通常使われている実施例で示す方法によって確認した（平成１０年版「制がん剤の分子標的スクリーニング−その概要と利用法−」文部省がん特定総合がん・制がん剤スクリーニング委員会）。
【００１４】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明する。
【実施例】
アスタキサンチンモノエステルの製造例
表１に示す培養基100mlを200ml容のフラスコに入れ、121℃で15分間滅菌した。同じ組成を有する維持用の培養基に別に培養したヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）NIES 144のシードを接種し、1500ルクスの光照射下、生育温度20℃で４日間、液体培養した。上記液体培養で得られた栄養細胞に、炭素源として酢酸濃度が45mM、鉄イオン濃度（FeSO₄・7H₂O）が450μMとなるように添加し、9000ルクスの光照射下、20℃でさらに４日間培養した。栄養細胞は速やかにシスト細胞へ形態変化し、細胞内に著量のアスタキサンチンを蓄積した。
【表１】

【００１５】
このようにして得られたシスト細胞100ｇ（総アスタキサンチン５％、クロロフィル２％含有）を、80℃に加温した40％アセトン溶液１Ｌに浸漬し、80℃で２分間保持した後、急冷し、４℃、24時間、暗所で静置した。遠心分離により溶媒を除去し、熱アセトン処理したシスト細胞を回収し、定法どおり凍結乾燥して乾燥細胞を得た。この乾燥細胞にアセトン−メタノール（７：３）溶液１Ｌを加え、室温で24時間浸漬した後、遠心分離によって細胞を除去して抽出液を得た。この抽出液を窒素雰囲気下、エバポレーターにより濃縮し、アスタキサンチン粗抽出乾固物を得た。この乾固物を少量のアセトンに溶解し、ＴＬＣ（Kieselgel 60、0.2mm、メルク社製）によりアスタキサンチンエステルの分画を暗所で行った。展開溶媒はアセトン−ヘキサン（３：７）を使用した。アスタキサンチンジエステルのRf値は約0.6、モノエステルのRf値は約0.75〜0.85であった。スパチュラによりエステル画分を回収し、アセトンに溶解して、各アスタキサンチンエステル標品を得た。アスタキサンチンエステルは、エバポレーターによりアセトンを除去し、適当な溶媒に溶解して試験に使用した。
【００１６】
アポトーシス誘導試験に供したアスタキサンチンエステルのエステル成分を次の方法で分析した。
上記製造例で製造したアスタキサンチンエステル混合物を、石油エーテル100mlに溶解してから、10％KOH含有メタノール100mlと混合し、50℃で攪拌しながら24時間けん化処理を行った。遊離アスタキサンチンを石油エーテル層に分配し、除去した後、水溶性画分のpHを３に下げて石油エーテルにより遊離脂肪酸を抽出した。遊離脂肪酸を定法どおりメチル化し、ガスクトマトグラフィにより組成分析を行った。
組成分析の結果は、次のとおりであった。
Ｃ_14:0、0.62%; Ｃ_16:0、22.37%; Ｃ_17:0、1.10%; Ｃ_18:0、4.11%; Ｃ_18:1、19.73%; Ｃ_18:2、24.68%; Ｃ_18:3、10.74%; Ｃ_18:4、2.07%; Ｃ_20:1、0.11%;Ｃ_20:4、0.15%; Ｃ_20:5、0.37%; その他13.95%
なお、ここで、例えば、Ｃ_14:0は、炭素数１４、二重結合数０の脂肪酸を表す。
【００１７】
アポトーシス誘導試験例
上記製造例で得られたアスタキサンチンモノエステルのアポトーシス誘導活性は、ヒト単球系白血病Ｕ937細胞を用いて次のような形態変化観察により測定した。
Ｕ937細胞の培養は、10％FBSを含むRPMI中、37℃、5％CO₂濃度下で行う。サンプルは溶媒による10倍希釈系列を４段階用意した。
前培養を行い、対数増殖期に入った細胞を３×10⁵cells/mlになるように培地で調整し、24穴培養プレートに１mlずつ分注し、サンプル溶液を10μl（最終濃度が10、1、0.1、0.01にμg/mlなるよう）添加し、混和する。0、4、8、24時間培養した後、各ウェルの細胞について顕微鏡像の写真撮影を行った。
【００１８】
顕微鏡写真による形態変化観察の評価は、形態変化の無いもの（−）、多くの細胞に形態変化が認められるもの（＋）、及び細胞が死滅していると思われるもの（＋＋）として表２に示した。
また、対照例として遊離型アスタキサンチンについて同様のアポトーシス誘導活性試験を行い、その結果得られた評価を表３に示した。
いずれかの段階で＋が認められたものは、総合的にアポトーシス誘導活性を有するものであると評価される。
【００１９】
【表２】

【００２０】
【表３】

【００２１】
以上の結果から、アスタキサンチンモノエステルが、ヒト単球系白血病細胞に対してアポトーシス誘導活性を示すのに対して、遊離型アスタキサンチンではアポトーシス誘導活性を示さないということが分かる。
【００２２】
【発明の効果】
本発明のアスタキサンチンモノエステルは、アポトーシス誘導活性を示し、制癌剤などアポトーシスが関連する疾病の予防及び治療剤としての効果を有する。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel apoptosis inducer, and uses astaxanthin monoester as an active ingredient.
[0002]
[Prior art]
Apoptosis is a suicide type cell death caused by activating the intrinsic death mechanism in the cell, and involves cell miniaturization and fragmentation of the nucleus. And since apoptosis is an indispensable mechanism for maintaining the life of multicellular organisms, it is also known that if it is out of control, and if apoptosis occurs too much or too little, it will cause various diseases. .
[0003]
Since cancer occurs because the mechanism by which cells die is lost, it is said that a decrease in apoptosis is one of the causes. In addition, autoimmune diseases or viral infections are listed as diseases caused by a decrease in apoptosis (Thompson, CB, Science, 267, 1456, 1995). Therefore, providing a substance that increases apoptosis, that is, a substance having apoptosis-inducing activity is useful not only for cancer but also for the treatment or prevention of other diseases.
[0004]
Several compounds have been studied as substances having apoptosis-inducing activity against cancer cells, but it is still difficult to provide an active ingredient having apoptosis-inducing activity and few side effects.
[0005]
On the other hand, the present inventors have conducted various studies on astaxanthins known as carotenoids contained in crustaceans such as shrimps and crabs, but this time, they found that esters of astaxanthin have apoptosis-inducing activity. .
Astaxanthin is known to be contained not only in crustaceans such as shrimps and crabs, but also in algae such as red yeast and hematococcus. Since it can be extracted from natural products, its use is preferable from the viewpoint of safety.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a highly safe novel drug having apoptosis-inducing activity.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have solved the above-mentioned problems by including astaxanthin monoester as an active ingredient. That is, the present invention relates to an apoptosis inducer containing astaxanthin monoester as an active ingredient.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, astaxanthin is used as an ester, not as a free compound. As shown in the Examples, the present inventors have discovered that astaxanthin has no apoptosis-inducing activity with a free compound, but has an apoptosis-inducing activity specifically when an ester is used.
[0009]
In the present invention, as the acid component constituting the ester, any of saturated fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and nonadecanoic acid, and unsaturated fatty acids such as oleic acid and linoleic acid are used.
[0010]
Astaxanthin may be synthetic or extracted from red yeast, shrimp, crab, krill and other crustacean shells, green algae, microalgae, etc. containing astaxanthin and / or esters thereof. But you can use it.
For example, Japanese Patent Laid-Open No. 11-56346 by the present inventors describes a method for extracting astaxanthin from Haematococcus alga bodies, and this method is one of preferred extraction methods.
[0011]
The outline of the extraction method described in JP-A-11-56346 will be described below.
Any green algae can be used as long as it belongs to the genus Haematococcus and produces astaxanthin. Examples include Haematococcus pluvialis , Haematococcus lacustris , Haematococcus capensis , and Hematococcus prubialis is preferred. Vegetative cells of Haematococcus plubialis algal cells are cultured heterotrophically using organic substances such as acetic acid as a carbon source in the dark, or mixed nutritionally using both organic substances such as acetic acid and carbon dioxide as a carbon source in the dark. It is obtained by doing. Since the vegetative cells of the cultured Haematococcus alga have low astaxanthin synthesis ability, it is necessary to induce and activate astaxanthin synthesis by various stresses in order to enhance astaxanthin synthesis ability. That is, vegetative cells can be rapidly transformed into dormant cyst cells by adding environmental stress such as nutrient depletion, strong light, active oxygen, high temperature, and drying alone or in combination. Astaxanthin synthesis system is induced with this morphological change, and a large amount of astaxanthin is accumulated. The cyst cells of the Haematococcus alga body thus cultured are easily recovered by centrifugation or the like, and an astaxanthin extraction step is performed.
[0012]
The dosage form of the preparation comprising the astaxanthin monoester of the present invention as an active ingredient may be either oral administration or parenteral administration, and examples thereof include injection solutions, infusion solutions, powders, granules, tablets and the like.
[0013]
It has been confirmed that the astaxanthin monoester of the present invention has an apoptosis-inducing activity by the method shown in Examples that are usually used as screening methods for anticancer agents (1998 molecular target screening for anticancer agents-overview and Usage-“Ministry of Education Cancer Specific Comprehensive Cancer and Anticancer Drug Screening Committee).
[0014]
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
【Example】
Production example of astaxanthin monoester 100 ml of the culture medium shown in Table 1 was placed in a 200 ml flask and sterilized at 121C for 15 minutes. A maintenance culture medium having the same composition was inoculated with seeds of Haematococcus pluvialis NIES 144 separately cultured, and subjected to liquid culture at a growth temperature of 20 ° C. for 4 days under 1500 lux light irradiation. To the vegetative cells obtained in the above liquid culture, the acetic acid concentration as a carbon source is 45 mM and the iron ion concentration (FeSO ₄ · 7H ₂ O) is 450 μM, and further, at 20 ° C. under light irradiation of 9000 lux. Cultured for 4 days. Vegetative cells rapidly changed to cyst cells and accumulated significant amounts of astaxanthin in the cells.
[Table 1]

[0015]
100 g of cyst cells thus obtained (containing 5% total astaxanthin and 2% chlorophyll) were immersed in 1 L of 40% acetone solution heated to 80 ° C., held at 80 ° C. for 2 minutes, then rapidly cooled, It was allowed to stand in the dark at 4 ° C for 24 hours. The solvent was removed by centrifugation, and cyst cells treated with hot acetone were collected and lyophilized as usual to obtain dried cells. 1 L of acetone-methanol (7: 3) solution was added to the dried cells and immersed for 24 hours at room temperature, and then the cells were removed by centrifugation to obtain an extract. This extract was concentrated by an evaporator in a nitrogen atmosphere to obtain a crude astaxanthin extract dried product. This dried product was dissolved in a small amount of acetone, and fractionation of astaxanthin ester was performed in the dark by TLC (Kieselgel 60, 0.2 mm, manufactured by Merck). As a developing solvent, acetone-hexane (3: 7) was used. The Rf value of astaxanthin diester was about 0.6, and the Rf value of monoester was about 0.75 to 0.85. The ester fraction was collected with a spatula and dissolved in acetone to obtain each astaxanthin ester preparation. Astaxanthin ester was used for the test after removing acetone with an evaporator and dissolving in an appropriate solvent.
[0016]
The ester component of the astaxanthin ester subjected to the apoptosis induction test was analyzed by the following method.
The astaxanthin ester mixture produced in the above production example was dissolved in 100 ml of petroleum ether, mixed with 100 ml of methanol containing 10% KOH, and saponified for 24 hours while stirring at 50 ° C. After free astaxanthin was distributed to the petroleum ether layer and removed, the pH of the water-soluble fraction was lowered to 3 and free fatty acid was extracted with petroleum ether. Free fatty acids were methylated as usual and composition analysis was performed by gas chromatography.
The results of the composition analysis were as follows.
C _{14: 0} , 0.62%; C _{16: 0} , 22.37%; C _{17: 0} , 1.10%; C _{18: 0} , 4.11%; C _{18: 1} , 19.73%; C _{18: 2} , 24.68%; C _{18 : 3} , 10.74%; C _{18: 4} , 2.07%; C _{20: 1} , 0.11%; C _{20: 4} , 0.15%; C _{20: 5} , 0.37%; Other 13.95%
Here, for example, C _{14: 0} represents a fatty acid having 14 carbon atoms and 0 double bonds.
[0017]
Apoptosis induction test example The apoptosis induction activity of the astaxanthin monoester obtained in the above production example was measured by observing the following morphological changes using human monocytic leukemia U937 cells.
U937 cells are cultured in RPMI containing 10% FBS at 37 ° C. and 5% CO ₂ concentration. Samples were prepared in four stages in a 10-fold dilution series with a solvent.
Pre-culture, adjust cells in logarithmic growth phase to 3 × 10 ⁵ cells / ml with medium, dispense 1 ml each into a 24-well culture plate, and add 10 μl sample solution (final concentration is 10, Add to 1, 0.1, 0.01 μg / ml) and mix. After culturing for 0, 4, 8, and 24 hours, microscopic images of the cells in each well were taken.
[0018]
The evaluation of morphological changes observed by micrographs is shown in Table 2 as those having no morphological changes (−), those in which morphological changes are observed in many cells (+), and those in which cells are considered dead (++). It was shown to.
Further, as a control example, a similar apoptosis-inducing activity test was performed for free astaxanthin, and the evaluation obtained as a result is shown in Table 3.
Those in which + is recognized at any stage are evaluated as having comprehensive apoptosis-inducing activity.
[0019]
[Table 2]

[0020]
[Table 3]

[0021]
From the above results, it can be seen that astaxanthin monoester exhibits apoptosis-inducing activity against human monocytic leukemia cells, whereas free astaxanthin does not exhibit apoptosis-inducing activity.
[0022]
【The invention's effect】
The astaxanthin monoester of the present invention exhibits apoptosis-inducing activity and has an effect as a preventive and therapeutic agent for diseases associated with apoptosis such as anticancer agents.

Claims

An apoptosis inducer comprising, as an active ingredient, a monoester of a fatty acid mixture having astaxanthin having 14 to 20 carbon atoms and 0 to 5 double bonds .