JP4490661B2

JP4490661B2 - Apoptosis inhibitor

Info

Publication number: JP4490661B2
Application number: JP2003299253A
Authority: JP
Inventors: 彰宏佐藤; 進一ノ瀬; 義則西澤; 比呂志楠奥; 祐輔渋谷
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2003-08-22
Filing date: 2003-08-22
Publication date: 2010-06-30
Anticipated expiration: 2023-08-22
Also published as: JP2005068061A

Description

本発明は、ラノスタン型トリテルペノイド誘導体を有効成分とするアポトーシス抑制剤に関する。 The present invention relates to an apoptosis inhibitor comprising a lanostane-type triterpenoid derivative as an active ingredient.

近年、アポトーシスは発生・分化、細胞のターンオーバー等の生理的機構に加え、老化や癌等の様々な病態や疾患にも関与することが明らかにされ、これを制御する物質の開発が進められている。
ヒトの老化現象の一つである白髪は、メラニン産生細胞であるメラノサイトが大きく関わっているが、近年、メラノサイトのアポトーシスによってメラノサイトが欠如することが、その発症要因の一つとして考えられている（例えば特許文献１参照）。 In recent years, it has been clarified that apoptosis is involved in various pathologies and diseases such as aging and cancer in addition to physiological mechanisms such as development / differentiation and cell turnover, and the development of substances that control this has been promoted. ing.
The gray hair, which is one of the aging phenomena in humans, is greatly related to melanocytes, which are melanin-producing cells. Recently, the lack of melanocytes due to apoptosis of melanocytes is considered as one of the onset factors ( For example, see Patent Document 1).

従来、抗白髪剤としては、メラノサイトのｃＡＭＰ産性能を向上させてメラノサイトの機能低下を抑えるもの（例えば、特許文献２参照）、メラノサイトのメラニン生成の活性化を図るもの（例えば、特許文献３、特許文献４、特許文献５参照）、そして、メラノサイトのアポトーシスを抑制するもの（例えば、特許文献６参照）等、多種多様な成分が見出されている。しかしながら、実用上十分に満足できるものは未だ得られていない。 Conventionally, as an anti-hair whitening agent, what improves the cAMP production performance of melanocytes and suppresses the functional deterioration of melanocytes (for example, refer to Patent Document 2), and activates melanin production of melanocytes (for example, Patent Document 3, A wide variety of components such as those that inhibit apoptosis of melanocytes (see, for example, Patent Document 6) have been found. However, a product that is sufficiently satisfactory for practical use has not yet been obtained.

一方、ラノスタン型トリテルペノイド誘導体は、マンネンタケ属（Ganoderma）植物に含まれるトリテルペノイドであり、これまでにガノデリック酸α、β、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｔ、Ｍｆ、ガノデリオールＡ、Ｂ、Ｆなど１１９種類の化合物の化学構造が決定されている。斯かるトリテルペノイドには、抗ＨＩＶ作用、抗高血圧作用、細胞毒性作用、酵素阻害作用（FPT、PLA-2、DNA pol.β）、肝保護作用、ヒスタミン遊離阻害作用、低コレステロール化作用、血小板凝集阻害作用等があることが報告されているが（非特許文献１）、アポトーシス抑制作用があることは全く知られていない。 On the other hand, lanostane-type triterpenoid derivatives are triterpenoids contained in plants of the genus Ganoderma (Ganoderma), and 119 kinds of ganoderic acids α, β, A, B, C, T, Mf, ganoderiol A, B, F, etc. The chemical structure of the compound has been determined. Such triterpenoids have anti-HIV, antihypertensive, cytotoxic, enzyme inhibitory (FPT, PLA-2, DNA pol. Β), hepatoprotective, histamine release inhibitory, hypocholesterolemic, platelet aggregation Although it has been reported that there is an inhibitory action (Non-patent Document 1), it is not known at all that it has an apoptosis-suppressing action.

本発明は、メラノサイトのアポトーシスを抑制し、白髪や皮膚白斑症の発症予防又はその改善に有効な医薬、化粧料等を提供することを目的とする。
米国特許第６１０３６８９号明細書特開平４−１２４１２２号公報特開平５−７８２２２号公報特開平７−２８５８７４号公報特開平７−３１６０２６号公報特開２００２−８０３８２号公報 H. W. Kimら, International Journal of Medicinal Mushrooms, 121, 1999 An object of the present invention is to provide a pharmaceutical, a cosmetic, and the like that suppress apoptosis of melanocytes and are effective for preventing or improving the onset of gray hair and skin vitiligo.
US Pat. No. 6,103,689 JP-A-4-124122 JP-A-5-78222 JP-A-7-285874 Japanese Patent Laid-Open No. 7-316026 JP 2002-80382 A HW Kim et al., International Journal of Medicinal Mushrooms, 121, 1999

本発明者は、メラノサイトのアポトーシスを抑制する天然成分について検討したところ、下記の一般式（１）で表されるラノスタン型トリテルペノイド誘導体（以下、「ラノスタン型トリテルペノイド誘導体（１）」という）に、優れたアポトーシス抑制作用があり、白髪や皮膚白斑症の予防・改善に有効であることを見出した。 The present inventor examined natural components that suppress apoptosis of melanocytes. As a result, the present inventor was superior to a lanostane-type triterpenoid derivative represented by the following general formula (1) (hereinafter referred to as “lanostane-type triterpenoid derivative (1)”). It has been found that it has an inhibitory effect on apoptosis and is effective in preventing and improving gray hair and skin vitiligo.

また、このうち下記のラノスタン型トリテルペノイド化合物（２）が新規化合物であることを見出した。 Of these, the following lanostane type triterpenoid compound (2) was found to be a novel compound.

すなわち本発明は、下記一般式（１）：

That is, the present invention provides the following general formula (1):

〔式中、ＡはＣ＝Ｏ又はＣＨ−ＯＨを示し、Ｒ¹は−ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＨ₂ＯＡｃ又は−ＣＯＯＨを示し、Ｒ²は−ＣＨ₂ＯＨ、−ＣＨ₂ＯＡｃ又は−ＣＨ₃を示し、Ｒ³は−Ｈ又は−ＯＨを示す。〕
で表されるラノスタン型トリテルペノイド誘導体を有効成分とするアポトーシス抑制剤、白髪予防・改善剤及び皮膚白斑症の予防・改善剤を提供するものである。 [In the formula, A represents C═O or CH—OH, R ¹ represents —CH ₂ OH, —CH ₂ OAc, or —COOH, and R ² represents —CH ₂ OH, —CH ₂ OAc, or —CH _3. R ³ represents —H or —OH. ]
The present invention provides an apoptosis inhibitor, a gray hair prevention / amelioration agent, and a skin leukoplasia prevention / amelioration agent comprising a lanostane type triterpenoid derivative represented by the formula:

また本発明は、下記式（２）： The present invention also provides the following formula (2):

で表されるラノスタン型トリテルペノイド化合物を提供するものである。 A lanostane-type triterpenoid compound represented by the formula:

本発明によれば、優れたメラノサイトのアポトーシス抑制作用を有し、白髪や皮膚白斑症の発症予防又は改善に有効な医薬、化粧料等を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it has the outstanding apoptosis inhibitory effect of a melanocyte, and can provide the medicine, cosmetics, etc. which are effective in the onset prevention or improvement of gray hair and skin vitiligo.

本発明のラノスタン型トリテルペノイド誘導体（１）のうち、ＡがＣ＝Ｏ、Ｒ¹が−ＣＯＯＨ、Ｒ²が−ＣＨ₃、Ｒ³が−ＯＨである化合物（２）は新規化合物であり、それ以外はいずれも既知化合物である。尚、Ｒ³が−ＯＨである化合物においては、１５位の炭素原子は不斉炭素となり立体異性体（Ｒ体、Ｓ体）が存在する。本発明はそれらの立体異性体のいずれをも包含するものであり、光学活性体であってもラセミ体であってもよいが、好ましくはＳ体である。 Of the lanostane-type triterpenoid derivatives (1) of the present invention, the compound (2) in which A is C═O, R ¹ is —COOH, R ² is —CH ₃ , and R ³ is —OH is a novel compound, All of these are known compounds. In the compound in which R ³ is —OH, the carbon atom at the 15-position becomes an asymmetric carbon and a stereoisomer (R-form, S-form) exists. The present invention includes any of these stereoisomers and may be an optically active form or a racemic form, but is preferably an S form.

本発明のラノスタン型トリテルペノイド誘導体（１）は、化合物（２）を含め、マンネンタケ属（Ganoderma）菌類から抽出することにより、或いは抽出された誘導体を常法によりアセチル化又は還元処理することにより得ることができる。 The lanostane-type triterpenoid derivative (1) of the present invention can be obtained by extracting from the genus Ganoderma, including the compound (2), or by subjecting the extracted derivative to acetylation or reduction treatment by a conventional method. Can do.

マンネンタケ属菌類からの抽出は、例えば霊芝（Ganoderma lucidum (Fr.) Karst.、サルノコシカケ科（Polyporaceae）マンネンタケ属（Ganoderma））の菌体の任意の部分、好ましくは子実体を、そのまま又は紛砕した後、更に必要に応じて予め水蒸気蒸留や低極性溶媒処理により精油成分を除去した後、常温下又は加温下で溶剤を加えることにより行えばよい。 Extraction from the fungus, for example, any part of the fungus body of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. Thereafter, if necessary, the essential oil component may be removed in advance by steam distillation or low-polar solvent treatment, and then the solvent may be added at room temperature or under heating.

抽出溶剤には、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、１，３−ブタンジオール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、水等の極性溶剤が好適に用いられ、これらは単独又は混合して用いてもよい。 As the extraction solvent, polar solvents such as methanol, ethanol, propanol, 1,3-butanediol, acetone, tetrahydrofuran, dioxane, water and the like are suitably used, and these may be used alone or in combination.

本発明のラノスタン型トリテルペノイド誘導体（１）の取得は、抽出過程において、濃縮、希釈、濾過等の処理をして得ることでもよく、また得られた抽出物を更にカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を用いて分離精製することでもよい。
クロマトグラフィーの充填剤としては、シリカゲル、アルミナ、セルロース、デキストラン等を用いることができ、展開溶媒としては、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、メタノール、酢酸、アセトニトリル等を単独又は混合して用いることができる。斯かる抽出によれば、ラノスタン型トリテルペノイド誘導体（１）が、単独のみならず、数種の混合物として取得される場合があるが、本発明のアポトーシス抑制剤、白髪又は皮膚白斑症の予防・改善剤においては、これらの何れをも用いることができる。 The lanostane-type triterpenoid derivative (1) of the present invention may be obtained by subjecting it to a treatment such as concentration, dilution or filtration in the extraction process, and the obtained extract is further subjected to column chromatography or ion exchange chromatography. Alternatively, separation and purification may be performed using an appropriate separation and purification means such as high performance liquid chromatography.
Silica gel, alumina, cellulose, dextran and the like can be used as the chromatography filler, and n-hexane, chloroform, methanol, acetic acid, acetonitrile and the like can be used alone or in combination as the developing solvent. According to such extraction, the lanostane-type triterpenoid derivative (1) may be obtained not only as a single substance but also as a mixture of several kinds. The apoptosis inhibitor of the present invention, prevention or improvement of gray hair or skin leukoplakia Any of these can be used in the agent.

ラノスタン型トリテルペノイド誘導体（１）のうち、Ｒ¹及び／又はＲ²が−ＣＨ₂ＯＡｃであるものは、対応する−ＯＨ体を例えばＡｃ₂Ｏ／Ｐｙ等によりアセチル化すればよく、またＡがＣＨ−ＯＨであるものは、対応するカルボニル体をＮａＢＨ₄等により還元することにより得ることができる。 Of the lanostane-type triterpenoid derivatives (1), those in which R ¹ and / or R ² are —CH ₂ OAc may be obtained by acetylating the corresponding —OH form with, for example, Ac ₂ O / Py. What is CH—OH can be obtained by reducing the corresponding carbonyl compound with NaBH ₄ or the like.

かくして得られるラノスタン型トリテルペノイド誘導体（１）は、後記実施例に示すように、メラノサイトにおいて、アポトーシス抑制作用を有する。そして、メラノサイトのアポトーシスが抑制されれば、メラノサイトの欠如が抑えられ、白髪や皮膚白斑症の発症を予防し又はそれらを改善できる。
従って、上記ラノスタン型トリテルペノイド誘導体（１）を有効量含有する製剤は、アポトーシスの抑制、白髪や皮膚白斑症の予防・改善のための医薬品、医薬部外品、化粧料等として有用である。 The lanostane-type triterpenoid derivative (1) thus obtained has an apoptosis-inhibiting action in melanocytes, as shown in Examples below. If the apoptosis of melanocytes is suppressed, the lack of melanocytes can be suppressed, and the onset of gray hair and skin vitiligo can be prevented or improved.
Therefore, a preparation containing an effective amount of the lanostane-type triterpenoid derivative (1) is useful as a pharmaceutical, a quasi-drug, a cosmetic and the like for suppressing apoptosis and preventing / ameliorating gray hair and skin vitiligo.

斯かる医薬品、医薬部外品、化粧料等は、種々の剤形、例えば注射剤、吸入剤、坐剤、経口剤、軟膏、クリーム、ローション、乳剤、ゲル等の製剤とすることができる。特に、毛髪、頭皮又は皮膚に効果的に塗布できる剤形が好ましく、例えば、ヘアトニック、ヘアリキッド、リニメント、ヘアーリンス、ヘアーシャンプー、ヘアートリートメント、ヘアーコンディショナー、軟膏、クリーム、ローリョン、化粧水、油性化粧料、パック剤、ファンデーション等が好適なものとして挙げられる。 Such pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics and the like can be made into various dosage forms such as injections, inhalants, suppositories, oral preparations, ointments, creams, lotions, emulsions, gels and the like. In particular, dosage forms that can be effectively applied to the hair, scalp or skin are preferred, for example, hair tonics, hair liquids, liniments, hair rinses, hair shampoos, hair treatments, hair conditioners, ointments, creams, lollons, lotions, oily Cosmetics, pack agents, foundations and the like are preferable.

また、当該製剤には、白髪又は皮膚白斑症の予防・改善効果の増強を図る点から、ラノスタン型トリテルペノイド誘導体（１）の他に、例えば、クロモン誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤、スギナエキス、スイカズラエキス、ヒキオコシエキス、ブドウエキス、ヘチマエキス、セイヨウニワトコエキス、ブッチャーブルームエキス、タイソウエキス、イタヤカエデエキス、ソテツエキス、アマチャエキス、ベニバナエキス、オタネニンジンエキス、パセリエキス、レイシエキス、オノニスエキス、ウイキョウエキス、ボウイエキス、ｃＡＭＰ誘導体、ＰＫＣ阻害剤、テオフィリン、ビタミンＤ３、サンショウエキス、サフランエキス、パラメリア属エキス、ワタ属エキス、デイゴ属エキス、メントゼリア属エキス、タカサブロウ属エキス、インドジャボク属エキス、アキノタムラソウ属エキス、ハナスゲ属エキス、サツマイモ属エキス、ミカニア属エキス、ウワウルシ属エキス、アカザ属エキス、ポテリウム属エキス、シラタマノキ属エキス、キサンチン、ニコチン酸アミド、コパイバエキス、ぺチコペタルム属エキス、不飽和脂肪酸、チオール化合物、オウレンエキス、酵母培養液、basicＦＧＦ等の薬効成分を配合することもできる。 In addition to the lanostane-type triterpenoid derivative (1), the preparation includes, for example, a chromone derivative, a phosphodiesterase inhibitor, a horsetail extract, a honeysuckle extract, from the viewpoint of enhancing the effect of preventing or improving white hair or skin vitiligo. Butterberry extract, grape extract, loofah extract, elderberry extract, butcher bloom extract, sea bream extract, itaya maple extract, cycad extract, amacha extract, safflower extract, ginseng extract, parsley extract, litchi extract, onion extract, fennel extract, bowie extract, cAMP Derivatives, PKC inhibitors, theophylline, vitamin D3, salamander extract, saffron extract, parameria extract, cotton genus extract, deigo genus extract, mentzeria genus extract, Takasaburo genus extract Indian jaboku genus extract, Acynotamus spp., Hanus spp. Medicinal components such as genus extract, unsaturated fatty acid, thiol compound, auren extract, yeast culture fluid, basic FGF and the like can also be blended.

また、上記製剤には、通常、化粧料、医薬部外品、医薬品等に用いられる各種成分を配合することができる。例えば、毛髪化粧料とする場合には、一般的な基材成分として、油性基材、ポリマー、ゲル化剤、活性剤、香料、着色剤等を添加配合することができる。 Moreover, the said formulation can be normally mix | blended with the various components used for cosmetics, a quasi drug, a pharmaceutical, etc. For example, when it is used as a hair cosmetic, an oily base material, a polymer, a gelling agent, an activator, a fragrance, a colorant and the like can be added and blended as a general base material component.

本発明のアポトーシス抑制剤、白髪又は皮膚白斑症の予防・改善剤におけるラノスタン型トリテルペノイド誘導体（1）の含有量は、通常全組成の０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜５重量％、より好ましくは０．０１〜２重量％、特に、０．１〜１重量％であるのが好ましい。 The content of the lanostane-type triterpenoid derivative (1) in the apoptosis inhibitor of the present invention, the preventive / ameliorating agent for gray hair or cutaneous vitiligo is usually 0.0001 to 10% by weight, preferably 0.001 to 5% by weight of the total composition. %, More preferably 0.01 to 2% by weight, and particularly preferably 0.1 to 1% by weight.

以下、実施例により本発明を具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described specifically by way of examples.

製造例１
霊芝（Ganoderma lucidum (Fr.) Karst.）の子実体の刻み６ｋｇに、エタノールと水の混液（７５：２５）６０Ｌを加え、室温下１２日間浸漬の後、濾過し、濃縮物２３９ｇを得た。得られた濃縮物２３９ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、クロロホルム−メタノール（２０：１）混液にて溶出したところ、混合物８．９ｇが得られた。得られた混合物８．９ｇをＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供し、メタノールにて溶出したところ、混合物２．１ｇが得られた。得られた混合物２．１ｇをゲルろ過クロマトグラフィー（セファデックスＬＨ−２０）に供し、メタノールにて溶出したところ、トリテルペノイド誘導体を含有する混合物０．３ｇが得られた。得られた混合物を高速液体クロマトグラフィー（ＯＤＳ、メタノール水混液、アセトニトリル水混液）で繰り返し精製し、下記の化合物（２）及び化合物（３）（Ganoderiol F）を得た。ここで、化合物（２）は、文献未記載の新規化合物であり、以下の物性を有する。 Production Example 1
To 6 kg of fruit body of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst., Add 60 L of ethanol / water mixture (75:25), soak at room temperature for 12 days, and filter to obtain 239 g of concentrate. It was. When 239 g of the obtained concentrate was subjected to silica gel column chromatography and eluted with a chloroform-methanol (20: 1) mixed solution, 8.9 g of a mixture was obtained. When 8.9 g of the obtained mixture was subjected to ODS column chromatography and eluted with methanol, 2.1 g of the mixture was obtained. When 2.1 g of the obtained mixture was subjected to gel filtration chromatography (Sephadex LH-20) and eluted with methanol, 0.3 g of a mixture containing a triterpenoid derivative was obtained. The obtained mixture was repeatedly purified by high performance liquid chromatography (ODS, methanol water mixture, acetonitrile water mixture) to obtain the following compound (2) and compound (3) (Ganoderiol F). Here, the compound (2) is a novel compound not described in the literature and has the following physical properties.

性状：淡黄色油状
¹H-NMR(CDCl₃)δ：6.883(t-br, 1H), 5.903(d, 1H, J=6.7Hz), 5.387(d, 1H, J=6.4Hz) , 4.201(dd, 1H, J=9.8, 5.8Hz), 2.36(m, 1H),2.770（ddd, 1H, J=14.7, 14.7, 5.8）, 2.10(m, 1H),2.32(m, 1H) , 2.08(m, 1H),2.28(m, 1H), 2.07(m, 1H),2.20(m, 1H), 1.841(s, 3H) , 1.77(m, 1H),2.26(m, 1H), 1.74(m, 1H),1.97(m, 1H), 1.67(m, 1H) , 1.546(dd, 1H, J=11.6, 4.0Hz), 1.39(br, 1H), 1.197(s, 3H), 1.18(m, 1H),1.51(m, 1H), 1.128(s, 3H), 1.087(s, 3H), 0.941(s, 3H), 0.919(d, 3H, J=6.4Hz), 0.641(s, 3H). Properties: pale yellow oil
¹ H-NMR (CDCl ₃ ) δ: 6.883 (t-br, 1H), 5.903 (d, 1H, J = 6.7 Hz), 5.387 (d, 1H, J = 6.4 Hz), 4.201 (dd, 1H, J = 9.8, 5.8Hz), 2.36 (m, 1H), 2.770 (ddd, 1H, J = 14.7, 14.7, 5.8), 2.10 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.08 (m, 1H), 2.28 (m, 1H), 2.07 (m, 1H), 2.20 (m, 1H), 1.841 (s, 3H), 1.77 (m, 1H), 2.26 (m, 1H), 1.74 (m, 1H), 1.97 (m, 1H), 1.67 (m, 1H), 1.546 (dd, 1H, J = 11.6, 4.0Hz), 1.39 (br, 1H), 1.197 (s, 3H), 1.18 (m, 1H), 1.51 ( m, 1H), 1.128 (s, 3H), 1.087 (s, 3H), 0.941 (s, 3H), 0.919 (d, 3H, J = 6.4Hz), 0.641 (s, 3H).

¹³C-NMR(CDCl₃)δ：216.63(s), 172.61(s), 145.05(s), 144.78(d), 140.95(s), 126.95(s), 121.16(d), 116.94(d), 74.55(d), 51.96(s), 50.54(d), 48.34(d), 47.43(s), 44.36(s), 40.03(t), 38.50(t), 37.27(s), 36.63(t), 35.91(d), 34.80(t), 34.73(t), 25.83(t), 25.44(q), 23.62(t), 22.45(q), 22.17(q), 18.29(q), 17.03(q), 16.02(q), 12.06(q). ¹³ C-NMR (CDCl ₃ ) δ: 216.63 (s), 172.61 (s), 145.05 (s), 144.78 (d), 140.95 (s), 126.95 (s), 121.16 (d), 116.94 (d), 74.55 (d), 51.96 (s), 50.54 (d), 48.34 (d), 47.43 (s), 44.36 (s), 40.03 (t), 38.50 (t), 37.27 (s), 36.63 (t), 35.91 (d), 34.80 (t), 34.73 (t), 25.83 (t), 25.44 (q), 23.62 (t), 22.45 (q), 22.17 (q), 18.29 (q), 17.03 (q), 16.02 (q), 12.06 (q).

製造例２
１０ｍＬフラスコ中、上記の化合物（３）１．７ｍｇに、無水酢酸０．５ｍＬとピリジン０．５ｍＬを加え、室温下一夜攪拌した。減圧濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製することで、下記の化合物（４）を1.5ｍｇ得た。 Production Example 2
In a 10 mL flask, 0.5 mL of acetic anhydride and 0.5 mL of pyridine were added to 1.7 mg of the above compound (3), and the mixture was stirred overnight at room temperature. After concentration under reduced pressure, purification by silica gel chromatography gave 1.5 mg of the following compound (4).

製造例３
１０ｍＬフラスコ中、上記の化合物（３）２．４ｍｇにメタノール１ｍＬと水素化ホウ素ナトリウム０．５ｍｇを加え、室温下３時間攪拌した。塩酸で酸性化した後、クロロホルム抽出した。減圧濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製することで、下記の化合物（５）を1.９ｍｇ得た。 Production Example 3
In a 10 mL flask, 1 mL of methanol and 0.5 mg of sodium borohydride were added to 2.4 mg of the above compound (3), and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. After acidification with hydrochloric acid, chloroform extraction was performed. After concentration under reduced pressure, 1.9 mg of the following compound (5) was obtained by purification by silica gel chromatography.

試験例１メラノサイトのアポトーシスに対する効果
96ウェルのプレートに、ウェル当り５×１０⁴cellsずつヒト表皮正常メラノサイト（クラボウ）を播種し、Medium 154S培地（クラボウ）にて３７℃、５％CO₂の条件下２４時間培養した。サプリメントを添加していないDefined ケラチノサイト−SFM培地（ギブコBRL）１００μｌに培地交換後、化合物（２）〜（５）を終濃度1.4μＭになるように添加し、３７℃、５％CO₂の条件下３日間培養を続けた。その後、0.1ｍＭ過酸化水素を１０μｌ添加しアポトーシスを誘導した。アポトーシス誘導後１２時間後に、TaKaRa社より市販されているLDH detection kitを用いて、アポトーシス細胞を定量化した。実験は、kitの説明書に従い行った。また、コントロールとして、被験物質非存在下で培養したヒト表皮正常メラノサイトに過酸化水素を加えたもの（コントロール-アポトーシスあり）と加えないもの（コントロール−アポトーシスなし）を用意した。生細胞数（％）は、コントロール-アポトーシスありを０％とし、コントロール-アポトーシスなしを１００％として定義し、被験物質存在下での生細胞数の割合を算出した。被験物質存在下での生細胞数の割合が高いほどアポトーシス抑制活性が高いことを示す。結果を図１に示す。 Test Example 1 Effects of melanocytes on apoptosis
A 96-well plate was inoculated with 5 × 10 ⁴ cells per well of normal human epidermis melanocytes (Kurabo), and cultured in Medium 154S medium (Kurabo) for 24 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO ₂ . After changing the medium to 100 μl of Defined Keratinocyte-SFM medium (Gibco BRL) to which no supplement was added, compounds (2) to (5) were added to a final concentration of 1.4 μM, and the conditions were 37 ° C. and 5% CO ₂ . The culture was continued for 3 days. Thereafter, 10 μl of 0.1 mM hydrogen peroxide was added to induce apoptosis. Twelve hours after induction of apoptosis, apoptotic cells were quantified using an LDH detection kit commercially available from TaKaRa. The experiment was performed according to the kit instructions. As controls, human epidermal normal melanocytes cultured in the absence of the test substance were added with hydrogen peroxide (control-with apoptosis) and without (control-without apoptosis). The number of viable cells (%) was defined as 0% with control-apoptosis and 100% without control-apoptosis, and the ratio of the number of viable cells in the presence of the test substance was calculated. The higher the ratio of the number of living cells in the presence of the test substance, the higher the apoptosis-inhibiting activity. The results are shown in FIG.

図１は、メラノサイトのアポトーシス抑制効果を示した図である。FIG. 1 is a diagram showing the apoptosis-inhibiting effect of melanocytes.

Claims

The following general formula (1):

[In the formula, A represents C═O or C—OH, R ¹ represents —CH ₂ OH, —CH ₂ OAc, or —COOH, and R ² represents —CH ₂ OH, —CH ₂ OAc, or —CH _3. R ³ represents —H or —OH. ]
An apoptosis inhibitor for normal melanocytes of human epidermis comprising a lanostane-type triterpenoid derivative represented by the formula:

The following general formula (1):
The following general formula (1):

[In the formula, A represents C═O or C—OH, R ¹ represents —CH ₂ OH, —CH ₂ OAc, or —COOH, and R ² represents —CH ₂ OH, —CH ₂ OAc, or —CH _3. R ³ represents —H or —OH. ]
An agent for preventing and / or improving gray hair comprising a lanostane-type triterpenoid derivative represented by the formula:

The following general formula (1):

[In the formula, A represents C═O or C—OH, R ¹ represents —CH ₂ OH, —CH ₂ OAc, or —COOH, and R ² represents —CH ₂ OH, —CH ₂ OAc, or —CH _3. R ³ represents —H or —OH. ]
A prophylactic / ameliorating agent for skin vitiligo comprising a lanostane-type triterpenoid derivative represented by the formula: