JP4482692B2 - Caco−2細胞を用いたエステル含有化合物の消化管吸収性の予測方法 - Google Patents
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Description
好ましくは、カルボキシルエステラーゼの阻害剤は、ビス(p−ニトロフェニル)ホスフェートである。
本発明によるエステル含有化合物の消化管吸収性の予測方法は、カルボキシルエステラーゼの阻害剤でCaco−2細胞を前処理することを特徴とする。本発明の一例においては、Caco−2細胞を通常のように培養し、透過実験の前に、カルボキシルエステラーゼの不可逆的阻害薬であるビス(ニトロフェニル)ホスフェートを約40分間作用させ、その後、細胞を洗浄、短時間の培養をした後、通常の透過実験に供することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
(1)試料
Butyryl-propranolol(BT-PL)は本研究室で合成したもの、Temocapril、Temocaprilatは三共株式会社から寄与されたものを用いた。Bis (p-nitrophenyl)phosphate(BNPP)、p-Nitrophenylacetate(PNPA)はナカライテスクより、ダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM)、0.25%Trypsin-EDTA、Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)、Hank's balanced salt (HBS)、Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)はSIGMA CHEMICAL Co.(USA)より購入した。D(+)-glucoseはWakoより、HEPESはDOJINDOより購入した。また、非必須アミノ酸(Non-essential amino acid:NEAA)、Penicillin-Streptomycin、L-glutamineはGIBCO製を、牛胎児血清(Fetal Bovine Serum:FBS)はCell Culture Technologies(CCT)より購入した。
その他、試薬はすべて市販特級品を、水はミリQ精製水を用いた。
Caco-2細胞は、カルチャーフラスコ(75cm2, TPP社製)を用いて37℃、5%CO2の条件で培養し、5〜7日毎に継代した。培地は、1%(v/v)非必須アミノ酸、10%(v/v)牛胎児血清、ベンジルペニシリンG(50Units/mL)及びストレプトマイシン(50μg/mL)、2mM L-グルタミンを含有するDulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)を用いた。0.01%EDTAを含むDulbecco's phosphate buffered saline(PBS)を37℃、5分間処理後、適量の0.25%トリプシン/0.53mM EDTA溶液を添加し、細胞をフラスコの底からはぎ取り、DMEMに再懸濁した。血球計数盤にて懸濁液中の細胞数を計測したあと、透過実験に使用するTranswellポリカーボネートフィルター(3μm孔、Costar社製)の上部にDMEMで2.5×105cell/mLに希釈した細胞溶液1.5mLを播種し、フィルター下部にはDMEM 2.6mLを満たした。実験には28〜40継代のCaco-2細胞を使用した。
Transwellで3週間培養したCaco-2細胞をDulbecco's phosphate buffered saline(PBS(Ca, Mg free))で洗浄後、細胞をミクロスパーテルではぎ取り、SET buffer(0.29M sucrose, 1mM EDTA, 50mM Tris(hydroxymethyl) aminomethane)により再懸濁し、ポリトロン処理後(目盛:30000、5sec×1+3sec×1)、テフロン(登録商標)ガラスホモジナイザーを用いて粗ホモジネートを調製した。以上の操作はすべて氷冷下で行い、得られた粗ホモジネートを9000g、4℃、20min遠心分離後の上清(S9)を分取した。
(i)Temocapril の酵素溶液中における加水分解実験
上記の方法で作成したCaco-2細胞S9を50mM HEPES緩衝液で適当な蛋白含量になるように希釈し、その酵素溶液175μLを37℃、5minプレインキュベーション後、DMSOに溶解し、HEPES緩衝液で希釈したTemocapril(0.4〜4mM)を25μL添加し、初濃度50〜500μMで反応を開始した。一定時間後、冷アセトニトリル200μLを添加し、反応を停止した。これを3000rpm、10min遠心し、上清100μLに2%リン酸を50μL添加したものをHPLCサンプルとし、Temocaprilatを定量した。
同様のCaco-2細胞S9を50mM HEPES緩衝液で適当な蛋白含量になるように希釈した酵素溶液1mLを37℃、5minプレインキュベーション後、DMSOに溶解したPNPA(5〜100mM)を5μM添加し、初濃度25〜500μMで反応を開始した。p-Nitrophenolの生成量から、酵素溶液の活性を求めた。生成したp-Nitrophenolを分光光度計(JASCO, V-530)を用いて経時的に波長405nmの吸光度を測定し、定量した。
まず、基質として選択したButyryl-propranolol(BT-PL)の安定性について、EBSS(pH=6.0)、EBSS(pH=6.5)、HBSS(pH=7.0)+3%BSA、HBSS(pH=7.4) +3%BSA中で1時間インキュベーション後に存在するBT-PL及びPLを定量し、加水分解率を算出した。その結果より、透過実験に用いるAP及びBL側のbufferを決定した。
↓ TEER(1)
(2)BNNP処理:37℃、40分
↓
(3)DMEM洗浄×2
DMEM:37℃、40min
↓ TEER(2)
(4)AP:EBSS
BL:HBSS+BSA 37℃、10分
↓ TEER(3)
(5)透過実験
↓ TEER(4)
(6)0.1%トリパンブルー処理
見かけの透過係数(Papp)は時間(sec)に対する単位面積当たりの累積透過量(μmol/cm2)をプロットし、その初期直線の傾きより次式に従って求めた。
Q:透過量(μmol)
A:細胞表面積(cm2)
C0:初濃度(μM)
Papp:見かけの透過係数(cm/sec)
(i)Butyryl-propranolol及びPropranolol
蛍光検出器(JASCO、820-FP)、ポンプ(JASCO、PU-980)、データ処理装置(SHIMADZU、C-R4A)を装備したHPLC装置を用いて、以下の条件で同時に定量した。BT-PL及びPLの保持時間はそれぞれ11min及び5.5minであった。
カラム;RP-Select B(関東化学、Cat No.16355-1B、250-4φmm、7μm)
移動相;20mM KH2PO4:アセトニトリル=1:1
流速;1.0mL/min
波長; Ex :285nm、Em:340nm
注入量;100μL
UV検出器(JASCO、875-UV)、ポンプ(JASCO、880-PU)、データ処理装置(SHIMADZU、CHROMATOPAC、CR7A plus)を装備したHPLC装置を用いて、以下の条件で同時に定量した。Temocapril及びTemocaprilatの保持時間は、それぞれ17.6min及び6.4minであった。
移動相;A液 ミリQ:アセトニトリル=3:7(10mMリン酸含有)
B液 ミリQ(10mMリン酸含有)
プログラム;0〜10min A:B=45:55
10〜20min 直線グラジエントでA液を100%にする
20〜25min A:B=100:0
25〜26min 直線的にA:B=45:55に戻す
流速;0.8mL/min
波長;258nm
注入量;120μL
Bradford法に準じ、ウシ血清アルブミン(BSA)を標準タンパク質として定量した。
ポリアクリルアミド電気泳動後のゲルに、α-Naphthylacetateを基質として添加し、加水分解生成したα-Naphtholをfast red TRで染色した。
(1)Caco-2細胞の加水分解パラメータに及ぼす培養条件の影響
Transwellで3週間及びFlaskで1週間培養したCaco-2細胞S9間のTemocapril及びp-Nitrophenylacetate(PNPA)に対する加水分解パラメータを比較したところ、図3に示すように、どちらの基質に対してもTranswellとFlaskという培養条件の違いによる影響は見られなかった。
Transwellで培養したCaco-2細胞の培養日数(7, 14, 21, 28days)における CES発現量の変動を検討した結果を図4に示す。
CES発現量の変動の影響を考えずに薬物の透過性のみを評価するため、阻害剤前処理によるエステル含有医薬品のための評価系構築に関する検討を行った。
(i)Butyryl-propranolol(BT-PL)の安定性
受動拡散され、透過時に酵素以外の影響を受けにくいBT-PLを基質として選択し、まずその各buffer中におけるBT-PLの1hr後の安定性を検討した。
今回用いたBNPP濃度範囲によるCaco-2細胞への影響について、細胞上下間抵抗(TEER)及びトリパンブルー処理の結果をそれぞれ図6と図7に示す。
Caco-2細胞への影響を確認したBNPP濃度範囲で、Butytyl-propranolol (BT-PL)を基質としてCaco-2細胞単層膜のapical(AP)側に添加し、経時的にサンプリングを行ってその代謝物であるPropranolol(PL)と共に定量し、見かけの透過係数及び透過実験終了時である35分後の加水分解率を算出した。図8及び図9にその結果を示す。
BNPP;0〜500μM
Caco-2 cell;p.32(24days, 26days), p.33(23days, 24days, 26days)
今回決定したCESの特異的阻害剤であるBNPP処理濃度において、他の輸送系へ影響を与える事がないことを確認するため、排出トランスポータであるP-gp(Taxol)及びジペプチドトランスポータであるPepT-1(Gly-Sar)を介した薬物輸送や、細胞間隙輸送(D-Mannitol)及び受動輸送(Propranolol:PL)に関して、Taxol及びPLはAP→BL・BL→AP両方向への透過性について、またプロトン共輸送されるGly-SarはpH勾配差による透過性について検討した。
Caco-2 cell;Taxol・・・AP→BL/p.29(26days)
BL→AP/p.30(24days)
Gly-Sar・・・pH=6.0/p.39(23days)
pH=7.4/p.39(24days)
D-Mannitol・・・p.37(24days), p.38(25days)
Propranolol・・・p.32(25days), p.33(23days)
今回決定したCES阻害剤(BNPP)濃度におけるTemocaprilの透過性について、吸収(AP→BL)過程及び分泌(BL→AP)過程の両方向で検討を行った。
Temocapril;100μM
BNPP;0μM/p.34(24days)
200μM/p.37(24days)
Sampling time;0〜120min
Claims (4)
- ビス(p−ニトロフェニル)ホスフェートで前処理したCaco−2細胞を用いることを特徴とする、エステル含有化合物の消化管吸収性の予測方法。
- エステル含有化合物がエステル含有薬物である、請求項1に記載の方法。
- ビス(p−ニトロフェニル)ホスフェートで前処理したCaco−2細胞から構成される、エステル含有化合物の消化管吸収性を予測するための吸収性評価システム。
- エステル含有化合物がエステル含有薬物である、請求項3に記載の消化管吸収性評価システム。
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