JP4480199B2 - Method for diagnosing adult-onset type II citrullinemia - Google Patents

Description

【００１２】
イントロンは、SLC25A13中において、表１に示す各エクソンの間に位置する。イントロンの番号は、そのイントロンの直上流にあるエクソンの番号と同じである。すなわち、例えば、第１１イントロンは、表１に示す第１１エクソンと第１２エクソンの間に位置し、第１３イントロンは、第１３エクソンと第１４エクソンの間に位置する。本発明に関連する各イントロンの配列（又は部分配列）を配列番号２〜１３に示す。すなわち、配列番号２には、第７イントロンの３’末端側の塩基配列（配列番号２に示される塩基配列の３’末端のＧの直後に第８エクソンの５’末端のＡが来る。以下同様）を示す。配列番号３には、第８イントロンの塩基配列を示す。配列番号４には、第９イントロンの５’末端側の塩基配列（第９エクソンの３’末端のＧの直後に配列番号４に示される塩基配列の５’末端のＧが来る。以下同様）を示す。配列番号５には、第１０イントロンの３’末端側、配列番号６には、第１１イントロンの５’末端側、配列番号７には第１５イントロンの３’末端側、配列番号８には第１６イントロン、配列番号９には第１７イントロンの５’末端側、配列番号１０には第６イントロンの３’末端側、配列番号１１には第７イントロンの５’末端側、配列番号１２には第１２イントロンの３’末端側、配列番号１３には第１３イントロンの５’末端側の塩基配列をそれぞれ示す。
【００１３】
本願発明者らがCTLN2の病因であることを見出した、SLC25A13中の突然変異は次の５種類である。
(1) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコード領域の851nt〜854ntの領域が欠失する変異（以下、この変異を「[I]851del4」と言うことがある）。
(2) SLC25A13の第１１イントロンの５’末端のGがAに置換する変異（以下、この変異を「[II]IVS11+1G>A」と言うことがある）。
(3) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコード領域の1638nt〜1660ntに相当する23 bpの領域が、該コード領域の1637ntと1638ntの間又は1660ntと1661ntの間のいずれかの部位に挿入される変異（以下、この変異を「[III]1638ins23」と言うことがある）。
(4) 配列表の配列番号１で示されるSLC25A13 cDNAのコード領域の674ntのＣがＡに置換する変異（以下、この変異を「[IV]S225X」と言うことがある）。
(5) SLC25A13の第１３イントロンの５’末端のGがAに置換する変異（以下、この変異を「[V]IVS13+1G>A」と言うことがある）。
【００１４】
下記実施例において記載するように、シトリンは、他のミトコンドリアキャリアファミリーと高いホモロジーを示し、ミトコンドリアの脂質二重膜を６回貫通する構造を有し、ミトコンドリアの膜に存在しているものと考えられる。さらに、シトリンは特徴的なEF-handモチーフを４個有していることから、カルシウム依存性のミトコンドリアキャリア蛋白であると推測される。シトリンの存在状態を図６に模式的に示す。上記(1)〜(5)の突然変異のおよその位置も図６に併せて示されている。
【００１５】
上記(1)の変異により、配列番号１に示す配列の第２８６番目のコドンの位置に停止コドンが導入されるので、該変異遺伝子によりコードされるタンパク質は、途中で切断された不完全なタンパク質となる。上記(2)の変異はイントロン領域内に起きるものであるが、この変異が存在するとｍＲＮＡ形成時のスプライシングが異常となり、ｍＲＮＡの第１１エクソンが欠失し、図６に示す膜貫通領域TM1とTM2の間の親水性ループ内で、配列番号１に示す第３４０〜３９２コドンによりコードされる５３個のアミノ酸残基が欠失する。上記(3)の変異が存在すると、第５５４コドンでフレームシフトが起き、第５７０コドンが停止コドンとなってこの間に１６個の正常とは異なるアミノ酸配列が存在することとなる。従って、この突然変異によれば、シトリンのＣ末端部分が切断された不完全なタンパク質となる。上記(4)の変異が存在すると、第２２５コドンが停止コドンとなり、該変異遺伝子によりコードされるタンパク質は、途中で切断された不完全なタンパク質となる。上記(5)の変異はイントロン領域内に起きるものであるが、この変異が存在するとｍＲＮＡ形成時のスプライシングが異常となり、図６に示すTM2とTM3の間で２７アミノ酸残基（第４１１〜４３７コドン）が欠失する。このように、上記突然変異(1)〜(5)のいずれが存在する場合でも、変異SLC25A13によりコードされるシトリンは、正常なシトリンとは構造が大きく異なったものとなる。
【００１６】
本発明のCTLN2の診断方法では、上記(1)〜(5)の変異の少なくともいずれかを調べる。好ましくは、被検試料中のSLC25A13が上記(1)〜(5)の変異を全く有していないか、また、有しているとすれば(1)〜(5)のどの変異を有しているのかを調べる。これらの変異は、ゲノミックＤＮＡ又はｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡのいずれを調べることによってもその存在の有無を調べることが可能である。上記変異(2)及び(5)は、イントロン領域内の変異であるが、上記のように、該変異によりｍＲＮＡ及びそれに由来するｃＤＮＡの配列が正常のものとは大きく異なるので、(2)及び(5)の変異もｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを調べることによりその存在の有無を調べることができる。なお、CTLN2は肝臓特異的な疾患であるから、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを対象として検査を行うのであれば被検試料としては肝細胞が必要となる。これに対し、ゲノミックＤＮＡを対象として検査を行うのであれば、容易に採取できる末梢血細胞等から抽出されるゲノミックＤＮＡを用いることができるので、肝細胞を採取する必要がなく、簡便で、患者の負担も小さいので好ましい。
【００１７】
本発明により、SLC25A13のｃＤＮＡの配列及びゲノミックＤＮＡ中の、上記突然変異部位近傍のイントロン配列並びに上記各突然変異の位置及び構造が明らかにされたので、上記各突然変異の有無は、種々の常法により容易に調べることができる。例えば、上記(1)又は(3)の変異の有無を調べる場合には、変異を含むゲノミックＤＮＡ又はｃＤＮＡの領域をＰＣＲのような核酸増幅法により増幅し、増幅断片を電気泳動にかけてバンドのサイズを測定することにより行うことができる。変異が存在すると、欠失又は挿入に起因して増幅核酸断片のサイズが正常遺伝子の場合と比較して増減するので、増幅断片のサイズを調べることによりこれらの変異の有無を調べることができる。また、ｃＤＮＡについて調べる場合には、この方法により上記(2)及び(5)の変異の有無も調べることができる。また、ゲノミックＤＮＡについて調べる場合、上記(2)、(4)又は(5)の変異は、塩基の置換なので増幅断片の大きさは正常型も変異型も同じであるが、いわゆる制限断片長多型(RFLP)の手法を用いることにより容易に調べることができる。例えば、上記(4)の変異の有無を調べる場合には、塩基の置換によりAluI部位(AGCT)が導入されるので、(4)の変異を含む断片を核酸増幅法により増幅し、制限酵素AluIで消化し、消化断片を電気泳動にかけてそのサイズを測定することにより該変異の有無を調べることができる。正常型の場合には、増幅断片は切断されず、変異型の場合には増幅断片は、変異が存在する部位でAluIにより切断されるので、正常型の増幅断片よりも小さな断片が２つ現れる。また、変異によって適当な制限酵素部位が導入されない場合には、増幅断片中にこのような制限酵素部位が導入されるように、増幅プライマーの配列を意図的に変えることができる。例えば、上記(2)の変異を検出する場合に、リバース側のプライマーの３’末端を、鋳型ＤＮＡと相補的なＡではなく、Ｇとすることにより、変異部位に正常型ではGGTC、変異型ではGATCの配列が導入される。GATCは、制限酵素Sau3AIにより切断されるので、RFLPにより上記(4)と同様にして変異の有無を調べることができる。また、上記(5)の変異の有無は、リバース側プライマーの３’末端を、鋳型ＤＮＡと相補的なＡではなくＣとすることにより、変異部位に正常型ではCTGCGG、変異型ではCTGCAGの配列が導入されるので、制限酵素PstIを用いたRFLPにより変異(5)の有無を容易に調べることができる。さらに、正常型又は変異型のいずれか一方とはハイブリダイズしない、又はハイブリダイズしても増幅が起きないプライマーを用いて、核酸増幅法を行い、増幅が起きるか否かを指標として変異の有無を調べることも可能である。例えば、ゲノミックＤＮＡについて調べる場合、上記の(1)又は(3)の変異のように、欠失又は挿入が起きる変異の場合には、変異の箇所とハイブリダイズするプライマーを用いることができる。また、変異の部分にハイブリダイズするプローブを用いたサザンブロットやノーザンブロットにより変異の有無を調べることも可能である。また、増幅断片の塩基配列を直接決定することによって変異の有無を調べることも可能である。
【００１８】
なお、核酸増幅のために用いられるプライマーは、配列番号１に示すｃＤＮＡ配列又は配列番号２〜１３のいずれかに示されるイントロン配列と相補的なものであり（イントロンとエクソンにまたがる領域と相補的なものでもよい）、増幅すべき領域の両端にそれぞれハイブリダイズするものである。もっとも、完全な相補性は必ずしも必要ではなく、配列特異的なハイブリダイズが可能であれば非相補的な塩基を含んでいてもよい。プライマーのサイズは、通常１５塩基〜５０塩基程度、好ましくは２０塩基〜４０塩基程度であるがこれらに限定されるものではない。
【００１９】
また、上記のように、変異型のSLC25A13によりコードされるシトリンは、その構造が正常型シトリンと大きく異なるので、シトリンを調べることにより、上記変異の有無を調べることもできる。シトリンが変異型であるか正常型であるかは、例えば免疫測定により簡便かつ正確に調べることができる。変異型のシトリンとのみ特異的に反応し、正常型のシトリンとは反応しないモノクローナル抗体を用いることにより、変異型のシトリンを特異的に検出することができる。このようなモノクローナル抗体は、変異型のシトリンを免疫原として用いて常法によりモノクローナル抗体を作製し、正常型のシトリンとは反応しないが変異型のシトリンとは反応するモノクローナル抗体を選択することにより得ることができる。免疫原として又はモノクローナル抗体のスクリーニングに用いる変異型又は正常型シトリンは、本発明により、そのｃＤＮＡの全塩基配列が明らかになっているので、常法に基づき、遺伝子工学的手法により、大量に作製することが可能である。この具体的な一例が下記実施例３に記載されている。なお、免疫原又はスクリーニング用のシトリンは、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するｃＤＮＡ若しくは上記(1)ないし(5)のいずれかの変異を含むその変異体によりコードされるシトリンのみならず、該シトリンの１若しくは複数のアミノ酸残基が欠失し若しくは置換し、若しくは該タンパク質に１若しくは複数のアミノ酸残基が付加され若しくは挿入された修飾シトリンであって、上記シトリンに対する抗体と免疫反応する修飾シトリンであってもよい。
【００２０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１
１． 方法
(1) 患者
血液試料、外科的又は剖検肝臓標本、及び臨床データは、互いに関連していない血族結婚家族の１８人の成人発症患者（１９〜４８歳）から採集した（図２のa）。なお、シトルリン血症の診断は確立された方法により行った。１２７人の１８〜５５歳の無関係な健常者を対照として用いた。
【００２２】
(2) ホモ接合マッピング(Lander E.S. et al., Science 236, 1567-1570(1987))によるゲノムスクリーニング
Research Genetics, Inc.から市販されているCHLC Human Screening Set/Weber version 6からの３９１種のマイクロサテライトマーカーパネルを用いてスクリーニングを行った。高解像度ジェノタイピングのために、0.2μＭの蛍光標識[R110]-又は[R6G]-dUTPを含む混合物中でＰＣＲを行い、それぞれのＰＣＲ産物のサイズは、サイズ標準としてGeneScan-500[TAMRA]を用い、ABI310 Genetic Analyzer上でGeneScan 672を用いて解像した。PON1-192, PON2-148及びPDK4プロモーター領域は、確立された方法(Humbert, R., et al., Nature Genetics 3, 73-76(1993); Hegele, R.A. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3373-3377(1997); Rowles, J. et al., J. Biol. Chem. 271, 22376-22382(1996))に従い、ＰＣＲと制限酵素消化の組合せにより解析した。関係の統計学的有意差を評価するために、２×２分割表χ²テストを用い、患者におけるホモ接合の百分率を無関係な対照と比較した。Ｐ値はイェーツの修正により調整した。
【００２３】
(3) SLC25A13遺伝子の同定
SLC25A13の３’部分が先ず、ESTクローンyg89b07(GenBank Acc. #R55737)(以下、単にAcc #のみを記載したものは全てBenBankのAccession No.を意味する)を図３に示すYACクローンにマッピングすることにより同定された。続いて常法によりｃＤＮＡライブラリースクリーニング、RT-PCR及び5'-RACE実験を行うことにより、この遺伝子の全長を単離した。遺伝子構造は、BACクローンであるH GS025M02(Acc. #AC002540)及びH GS244B22 (Acc. #AC002450)からｃＤＮＡ配列をゲノム配列と比べること及びゲノミックＤＮＡの逆ＰＣＲにより決定した。これまでにこの遺伝子の１８のエクソンが同定されている。
【００２４】
(4) ノーザンブロット分析
プライマー5'-F (5'-acgccagccagccagtcagt-3', -53nt〜-34nt（SLC25A13 mRNAのヌクレオチドは、開始コドンのＡを+1として示す）)とプライマー10B(5'-tctgggcctcagccaagtta-3', 928nt〜909nt)を用いてＰＣＲにより増幅された981 bpの断片（ｃＤＮＡの５’側）をプローブとして、ヒト多組織ノーザンブロット(Clontech #7760-1)とハイブリダイズさせることによりSLC25A13 mRNAを調べた。さらに、プライマー3'-F (5'-taggaagatcagccctggga-3')とプライマーEnd-B (5'-gcgcctctgaccattatgca-3')を用いたＰＣＲにより増幅された９３４ｂｐの断片（SLC25A13の3'-非翻訳領域、2026nt〜2959nt）をプローブとして用いて同じブロットにハイブリダイズさせた。aralar mRNA(del Arco, A. et al., J. Biol. Chem. 273, 23327-23334(1998))を検出するために、プライマー5'F (5'-gagcacagcatggcggtca-3')とプライマー5'B (5'-ctggagccagataggcctg-3')を用いて９７５ｂｐの断片（ｃＤＮＡの５’側、15nt〜989nt）を増幅し、クローニング及び配列決定の後、これをプローブとして用いた。
【００２５】
(5) 突然変異検出
各ｍＲＮＡのコード領域を増幅するためのＲＴ−ＰＣＲに際して、オリゴ(dT)_12-18及びM-MuLV逆転写酵素を用いて肝臓ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを合成した。増幅されたｃＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分離し、抽出し、TA-vector (Invitrogen社)を用いてクローニングし、塩基配列を決定した。SLC25A13 mRNAのためには、オリゴヌクレオチドプライマー5'-F、10B及びMF (5'-gaacggattgctcctctgga-3', 871nt〜890nt)及び3'-B (5'-gacagcactatcccagggct-3', 2055nt〜2036nt)を用いた。TFPI-2 (Acc. #L27624), PON1 (Acc. #M63012), PON2 (Acc. #AF001601), PDK4 (Rowles, J. et al., J. biol. Chem. 271, 22376-22382(1996))及びDNCI1 mRNAの全コード領域は、それぞれ適当なプライマーセットを用いて増幅した。用いたプライマーセットは、それぞれ、5'-ggacgccttgcccagcgggc-3'と5'-ccaatgatttgtttcctcatgctg-3'、5'-cccccgaccatggcgaagct-3'と5'-tggcatgggtgcaaatcggt-3'、5'-cggagcgaggcagcgcgccc-3'と5'-agggccgttccttactggaa-3'、5'-atgaaggcggcccgcttcgt-3'と5'-agacccactttgatcccgtaaa-3'、及び5'-gagagaggaagtgatcgctc-3'と5'-acgctgagctctaggacaca-3'であった。
【００２６】
SLC25A13の突然変異検出のためには、各エクソンに隣接するイントロンの配列に基づき、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。IVS-6F (5'-ggagagtacaagttctggtc-3'), IVS-7B (5'-actagttgccttcttcaccc-3'), IVS-7F (5'-tcactcattccagtgccttg-3'), IVS-9B (5'-caatgccgcaaaggcaactg-3'), IVS-10F (5'-ttgggctgtagcaatgtgcc-3'), IVS-11B (5'-ctagatgcctccagcctact-3'), IVS-12F (5'-ctcctgaaacatcagtgatgc-3'), IVS-13B (5'-cctagtagactctgcccttg-3'), IVS-15F (5'-ggagcagacatcttgcacac-3')及びIVS-17B (5'-ggagttgatacattctcatca-3')。それぞれの増幅されたゲノミックＤＮＡ断片の塩基配列を直接決定し、又はTA-vectorにクローニング後、塩基配列を決定した。
【００２７】
２． 結果
上記のように、血族結婚家族の患者からのＤＮＡについて、ホモ接合マッピングアプローチ(Lander, E.S., et al.,上掲)を用いてCTLN2座をゲノム全体に渡って検索した。先ず、常染色体に沿って分散された合計３３２個の遺伝マーカーを１５人のCTLN2患者と１５人の対照に対して分析した（図１）。染色体7q21-q22上の２つのマーカー(D7S821とD7S1799)が、それぞれ、１５人の患者のうち１２人（８０％）及び９人（６０％）においてホモ接合であり、これらのχ²値（Ｐ値）は、それぞれ13.4(0.0004)及び12.2(0.0007)であった。
【００２８】
常染色体を縦断する３３２個のマーカーのホモ接合マッピングの結果を図１に示す。それぞれの多型ＤＮＡマーカーについてのホモ接合の頻度のχ²解析は、血族結婚家族（図２参照）からの１８人のCTLN2患者のうち、AP-9、AP-69及びAP-80を除いた１５人と、１５人の無関係な対照との間で行った。対照と比較して高い患者のホモ接合百分率は、各染色体を示す線の右側にχ²値をプロットした。用いたマーカーの相対位置は、センチモルガン(cM)単位で各遺伝的距離を示した。染色体7q21-q22上の２つのマーカー(D7S821及びD7S1799)は、１５人の患者のうち、それぞれ１２人（８０％）及び９人（６０％）がホモ接合であり、それらのχ²値（Ｐ値）は、それぞれ13.4 (0.0004)及び12.2 (0.0007)であった。患者と対照との間の観察された差異により、CTLN2遺伝子は、D7S2212 (χ²=2.78, P=0.039)の先端部領域及びD7S22847(χ²=1.29, P=0.45)の忌憚部領域内に存在するかもしれないことが示唆された。１８人のCTLN2患者と１１８人の対照とを調べると、他の常染色体上では、D19S586もまた非常に有意であった(χ²=11.8, P=0.0017)。しかしながら、D19S586に１cM以内の距離で隣接する３つのさらなるマーカー、すなわち、D19S413(χ²=0.50, P=0.57)、D19S204(χ²=1.65, P=0.26)及びD19S583(χ²=4.04, P=0.062)では、有意な結果は検出されなかった。
【００２９】
この観察の有意性を確認し、染色体７ｑ上のCTLN2遺伝子座をより正確に特定するために、１６個のマイクロサテライトマーカー及び３個の遺伝子(PON1, PON2及びPDK4)(Humbert et al., 上掲；Hegele,R.A. et al.,上掲；Rowles J. et al.,上掲)中の多型を用いて、１８人の患者及び１２０人の対照全部を解析した。３つのマーカー(D7S527, D7S1812及びD7S821)のホモ接合の割合がχ²及びＰ値の両者とも、有意に高かった（図２）。さらに、D7S1812は、１８人の全てのCTLN2患者においてホモ接合であった。これらの１８人のCTLN2患者のうち、１３人（７２％）において２９０ｂｐのD7S1812対立遺伝子のホモ接合が観察され、これは１１６人の対照のうちの２４人（２１％）と比較して有意に高かった(χ²=20.7, P<0.0001)。２８１ｂｐのD7S1812対立遺伝子のホモ接合は、１８人の患者のうち５人（２８％）、１１６人の対照のうち１１人（9.5%）で観察され、これの有意性はより低かった(χ²=4.96、P=0.042)。全てのCTLN2患者のハプロタイプを比較すること及び対照と比較した対立遺伝子頻度に基づき、CTLN2遺伝子座の最も可能性の高い部位は、D7S527とD7S821の間でD7S1812に近い、7q21.3であると推定した（各マーカーの位置については図３参照）。さらに、ハプロタイプの解析により、５種類の異なる疾患遺伝子担持染色体が存在する可能性が示された（図２のb）。
【００３０】
図２は血族結婚両親(a)からの１８人のCTLN2患者及び対応するハプロタイプ(b)のリストを示す。図２のaにおいて、「いとこ」は、両親の血縁の程度を示す。「Cit」及び「Arg」は、それぞれ血清中のシトルリン及びアルギニン濃度を示し、Thr/Serは血清中のスレオニン／セリンの比率を示す。sPSTI及びhPSTIは、それぞれ血清中及び肝臓中のPSTI濃度を示す。肝臓ASS(hASS)は、対照に対する％で示されている。括弧内の各数字は「平均±標準偏差」を示す(Kobayashi, K., et al., Hepatology 25, 1160-1165(1997))。「n.t.」は測定しなかったことを意味する。図２のbにおいて、D7S2212ないしD7S1799からの各マーカーが、図の左側に、染色体7q21-q22領域を含むジェノミックインターバルの動原体側末端（上）からテロメア側末端（下）に向かう物理マッピングの順に示されている。括弧内の数字は、対照のホモ接合(ホモ接合／測定した人数)を示す。各患者がホモ接合であったマーカーのストレッチを淡灰色のシェーディングで示す。また、図２のｂにおいて、PON1の行のＲとＱ、PON2の行のＡとＧは、それぞれにPON1の１９２番目、PON2の１４８番目のアミノ酸であり、PDK4の行のCC, CTやTTは、それぞれにPDK4遺伝子の５’上流の-154番目（Ｃ又はＴ）と-209番目（Ｃ又はＴ）の塩基に相当するものである。患者では、３つのマーカーが、χ²及びＰ値の両者ともにおいて、ホモ接合の割合が有意に高かった。すなわち、χ²及びＰ値がそれぞれ42.1及び8.7 x 10^-11であるD7S527、25.8及び3.9x10^-7であるD7S1812、並びに25.7及び3.9x10^-7であるD7S821である。共通のハプロタイプに基づき５つの異なるグループ(I/I, II/II, III/III, I/IV及びI/V)に分けることが可能であり、このことは、図６に示すように５つの異なる疾患遺伝子担持染色体の存在を示している。
【００３１】
染色体７ｑの完全な遺伝子地図を構築しようとする努力において、7q21.3領域から少なくとも１７個の遺伝子が同定された（図３）。PDK4、TFPI-2及びPON遺伝子がCTLN2の位置的（及び機能的）候補であったが、これらのコード領域の塩基配列を決定したところ、突然変異は見つからなかった。D7S1812を包含する直近領域における遺伝子同定実験により、中間鎖ダイニン遺伝子(DNCI1) 及びこれまでに特徴づけられていない遺伝子の存在が示された。ＤＮＡ配列決定及び解析、ESTマッピング、並びにｃＤＮＡライブラリースクリーニング及び特徴付けを組み合わせることにより、後者の遺伝子（SLC25A13と命名）が１８個のエクソンを有し、約200 kbのＤＮＡから成ることを決定した。この遺伝子はまた、D7S1812マーカーを包含し（図３）、突然変異スクリーニングにより究極的にこれがCTLN2遺伝子であることが同定された。
【００３２】
図３に7q21.3におけるCTLN2遺伝子座の物理的地図を示す。7q21.3をカバーするYACコンティグ及びこの染色体バンド内の公知の遺伝子が示されている。既知の場合には、５’から３’への遺伝子の転写方向が矢印で示されている。この研究に用いた遺伝マーカーを、YACコンティグ内での位置により決定された順に、黒丸を付して示す。３つのさらなる遺伝マーカー(D7S1513, D7S2430及びD7S1849)も白丸を付して示す。CTLN2の責任遺伝子をSLC25A13として示す。分析した全ての患者においてホモ接合であったD7S1812は、SLC25A13のエクソン１５及び１６の間に位置する。YACクローンは、公知の染色体７−特異的YACライブラリーからのものである。
【００３３】
塩基配列解析により、SLC25A13 cDNAの全長は３１３５ｂｐであり、予想されるオープンリーディングフレーム(ORF)は２０２５ｂｐであることがわかった。推定的ATG翻訳開始部位の近傍のＤＮＡ(ggcgaatcatgcg)は、Kozakコンセンサス配列(Kozak, M., Mamm. Genome 7, 563-574(1996))にとって必須的な-3プリンと+4グアニン残基を有する。
【００３４】
SLC25A13によりコードされる、「シトリン」と命名した推定タンパク質は、６７５個のアミノ酸残基から成り、約74 kDaの分子量を有する（図４）。Ｃ末端領域は、ミトコンドリア溶質キャリアファミリー(Kuan, J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28, 209-233(1993))と相同性（２０〜３０％のアミノ酸が一致）を有する。Ｎ末端領域は、カルシウム結合タンパク質において保存されている４つの推定的EF-hand領域(Kawasaki, H. et al., Protein Profile 1, 343-517(1994))を有する。シトリンの全体的な構造は、カルシウムに結合するミトコンドリアキャリアスーパーファミリー(del Arco, A. et al.,上掲)のメンバーであるアララー、及びC. elegansタンパク質(Q21153)とそれぞれ77.8%及び53.7%の相同性を有する。シトリンをアララー及びQ21153タンパク質と整列させることにより、Ｎ末端及びＣ末端の各末端近傍の領域を除き、配列が高度に保存されていることが明らかになった（図４）。これらの配列特徴は、アララーと同様、シトリンもまたミトコンドリアの膜中に位置し、カルシウム依存性ミトコンドリア溶質キャリア(del Arco, A. et al.,上掲)として機能しているかもしれないことを示唆している。
【００３５】
図４にシトリンと関連タンパク質の整列比較を示す。シトリン(SLC25A13タンパク質)と、アララー(SLC25A12タンパク質)と、C. elegans Q21153タンパク質の推定アミノ酸配列を比較を示す。アミノ酸の同一及び保存を、それぞれ黒又は斑点で強調してある。シトリンは、４つの推定的EF-hand領域を有し（第２８〜３９、６６〜７７、１００〜１１１、１７１〜１８２残基）、これらはカルシウム−結合タンパク質において保存されている(Kawasaki, H. et al., Protein Profile 1, 343-517(1994))。典型的なミトコンドリアキャリアシグネチャーであるGX₃GX₈PX(D/E)X(I/L/V)(K/R)X(R/K)XQX_20-30GX₄(Y/W)(R/K)GX₉PがシトリンのＣ末端側半分の領域中に観察され（第３３５〜４０３、４３５〜４９５及び５２７〜５９１残基）、米印で記す。他のミトコンドリア溶質キャリアファミリーの他のメンバーと同様に、シトリンは、約１００残基の長さの繰り返し配列を含む。それぞれの繰り返し領域は、２つの膜貫通領域(TM)を含む。第１の領域は、より疎水性で、保存されたグリシン及びプロリン残基を有し、第２の領域は、より親水性で、非常に保存された親水性残基を規定された位置(Kuan, J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28, 209-233(1993))に有する。機能領域は、EF-hand及びTMらせんをそれぞれ示す、黒塗り及び白抜きの箱で示す。Ｃ末端側の３領域構造のそれぞれの３つの繰り返し領域内のTMらせんのそれぞれの対は、それらを結ぶ線で示す。
【００３６】
ヒト組織からのpoly(A)⁺RNAのノーザンブロット解析により、SLC25A13 cDNAの異なる領域からのプローブが、調べたほとんどの組織において約3.4 kbの主なハイブリダイゼーションバンドを検出することが示された（図５のa）。肝臓内での発現レベルが最も高いという観察は、この遺伝子が肝臓特異的CTLN2に関係していることと一貫している。比較的普遍的なSLC25A13の発現とは対照的に、3.3 kbと2.8 kbに２つの主なバンドを有し、6.6 kbに弱いバンドを有するアララーのｍＲＮＡは、心臓、脳及び骨格筋においてよく発現されるが、肝臓においては発現されない（図５のｂ）。
【００３７】
図５にSLC25A13の発現プロフィールを示す。図５に示すヒト組織からのpoly(A)⁺RNA(２μｇ)を含むノーザンブロットを、SLC25A13-特異的プローブ（コード領域の５’側）(a)、アララー−特異的プローブ（コード領域の５’側）(b)、及びβ−アクチン−特異的プローブ(c)と連続的にハイブリダイズさせた。Ｈは心臓、Ｂは脳、Ｐｌは胎盤、Ｌｕは肺、Ｌｉは肝臓、Ｓｋは骨格筋、Ｋは腎臓、Ｐａは膵臓を意味する。β−アクチンｍＲＮＡは、内部対照として検出した。SLC25A13 mRNA(3.4 kb)とは対照的に、アララー(SLC25A12)の発現は肝臓では観察されず、心臓、脳及び骨格筋において、3.3 kbと2.8 kbのサイズの２つの主なバンドが観察された。これらより弱いが、明らかに特異的なハイブリダイズを示す、約6.6 kbのサイズのバンドも観察された。
【００３８】
図６に示されるように、１８人の全ての血族結婚CTLN2患者のSLC25A13中に、５つの異なる突然変異（最初に図２のｂに示すハプロタイプによって定義された[I]〜[V]と命名）が同定され、これらがCTLN2の病因であることが確認された。このように、個々の突然変異は、上記CTLN2患者からのゲノミックＤＮＡ中に検出された。発見された突然変異は、[I]フレームシフト及び停止コドンの導入をもたらす４ｂｐの欠失、[II]TM1及びTM2領域の間のループを欠失させる置換、[III]停止突然変異をもたらす２３ｂｐの挿入、[IV]ナンセンス変異をもたらす置換、[V]エクソン１３の欠失を引き起こす置換を包含する（図６）。
【００３９】
図６にCTLN2患者におけるヒトシトリン及び突然変異の推定トポロジカルモデルを示す。これはアミノ酸配列（図４）に基づいて推定される、ヒトシトリンの模式図であり、SLC25A13の突然変異[I-V]により引き起こされる変異のおよその位置が示されている。
【００４０】
7q21.3における個々の観察されたハプロタイプ（図２のｂ）を説明する独立した突然変異の同定により、CTLN2が単一の遺伝子により引き起こされることが強く示唆される。血族結婚の両親から生まれた１８人の患者のうち、１５人までがそれぞれの突然変異についてホモ接合であった。驚くべきことに、３人の患者は、血族結婚の両親から生まれたにも関わらず、複合ヘテロ接合であった。このことは、日本人の間でこの疾患の発生率が高いこと及び／又は表現率が低いことを示唆している。非血族結婚の患者１０人全員にも、上記したのと同じ突然変異が観察された。さらに、１２７人の無関係な対照の中では、ただ一人のみがS225X配列変異を有しており、このヒトはおそらくこの疾患のキャリアである（この観察は、日本人の中でCTLN2のキャリアの頻度が1/150ないし1/200であるとの予想と一致する）。
【００４１】
実施例２ ＰＣＲ又はＰＣＲ−ＲＦＬＰを用いた突然変異の検出
健常人又はCTLN2患者の末梢血リンパ球より、常法によりゲノミックＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、以下の各変異検出用のプライマーセットを用い、常法に基づきＰＣＲにより核酸断片を増幅した。
【００４２】
(1)の変異検出用プライマーセット
フォワード側：IVS-8F2 (5'-ggtatatttgttgcttgtgtttg-3')(配列番号３の５’末端から166番目〜188番目の塩基配列)
リバース側：Ex-9B (5'-tcttccagaggagcaatccg-3')(配列番号１のコード領域の874nt〜893ntとハイブリダイズ)
【００４３】
(2)の変異検出用プライマーセット
フォワード側：Ex-11F2 (5'-gaaagtgctacgctatgaagg-3')（配列番号１のコード領域の1137nt〜1157nt）
リバース側：IVS-11Bm2 (5'-aggtattgagcatgtggcactg-3')(配列番号６の５’末端から３番目〜２４番目の塩基配列とハイブリダイズ（ただし、該プライマーの３’末端は非相補的）)
【００４４】
(3)の変異検出用プライマーセット
フォワード側：IVS-15F2 (5'-tgttgtgtctctcctgcagg-3')(配列番号７の５’末端から160番目〜配列番号１のｃＤＮＡのコード領域の1592ntの塩基配列)
リバース側：Ex-16B (5'-gcagtctatcactccgctgt-3')（配列番号１のｃＤＮＡのコード領域の1676nt〜1695ntとハイブリダイズ）
【００４５】
(4)の変異検出用プライマーセット
フォワード側：ISV-6F (5'-ggagagtacaagttctggtc-3')(配列番号１０の５’末端から７２番目〜９１番目の塩基配列)
リバース側：ISV-7B (5'-actagttgccttcttcaccc-3')（配列番号１１の５’末端から５７番目〜７６番目の塩基配列とハイブリダイズ）
【００４６】
(5)の変異検出用プライマーセット
フォワード側：Ex-13F(5'-gtgaacgattttgtgagggata-3')(配列番号１のコード領域の1231nt〜1250ntの塩基配列)
リバース側：IVS-13Bm (5'-gaagagagcttcaaaaggtacttc-3')（配列番号１３の５’末端から２番目〜２６番目の塩基配列とハイブリダイズ（ただし、該プライマーの３’末端は非相補的）
【００４７】
(1)の変異を調べる場合には、上記プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、増幅産物を直接アガロースゲル電気泳動にかけた。その結果、正常型遺伝子の場合には、８２ｂｐの増幅断片が検出され、(1)の変異を有する変異型遺伝子の場合には、７８ｂｐの増幅断片が検出された。
【００４８】
(2)の変異を調べる場合には、上記プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、Sau3AIで消化し、消化産物をアガロースゲル電気泳動にかけた。その結果、正常型遺伝子の場合には、６５ｂｐの増幅断片が検出され、(2)の変異を有する変異型遺伝子の場合には、４２ｂｐと２３ｂｐの２つの増幅断片が検出された。
【００４９】
(3)の変異を調べる場合には、上記プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、増幅産物を直接アガロースゲル電気泳動にかけた。その結果、正常型遺伝子の場合には、１２３ｂｐの増幅断片が検出され、(3)の変異を有する変異型遺伝子の場合には、１４６ｂｐの増幅断片が検出された。
【００５０】
(4)の変異を調べる場合には、上記プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、AluIで消化し、消化産物をアガロースゲル電気泳動にかけた。その結果、正常型遺伝子の場合には、５７ｂｐと３６９ｂｐの２つの増幅断片が検出され、(4)の変異を有する変異型遺伝子の場合には、５７ｂｐ、２１４ｂｐと１５５ｂｐの３つの増幅断片が検出された。
【００５１】
(5)の変異を調べる場合には、上記プライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅後、PstIで消化し、消化産物をアガロースゲル電気泳動にかけた。その結果、正常型遺伝子の場合には、１０６ｂｐの増幅断片が検出され、(2)の変異を有する変異型遺伝子の場合には、８０ｂｐと２６ｂｐの２つの増幅断片が検出された。
【００５２】
実施例３
リコンビナントシトリン蛋白の作成
シトリンのリコンビナント蛋白として、N-half（883 bp）、C-half（1188 bp）、Full-length（2044 bp）、C末端膜外部（201 bp）の４種類を作成した。ヒト肝細胞より抽出したmRNAを用いて、First Strand cDNA Synthesis Kit（Pharmacia Biotech社）により、cDNAを合成した。そのcDNAを鋳型にして、以下のprimerを用いて RT-PCRを行なった。プライマーの組み合わせは、N-half：ORF-1FN (5'-taggatccgatggcggccgccaaggtg-3')とORF-1B (5'-tcggatccaatgtctgctaaggtcgtc-3')、C-half：ORF-2F (5'-tgcatatgaccttagcagacattgaa-3')とORF-2B (5'-tcggatcctatgggcctccaccaa-3') 、Full-length：ORF-1FNとORF-2B、C末端膜外部：Ex17F (5'-caagcttcatatgggatcagagccagttcc-3')とORF-2Bであり、下線部分はCitrin cDNAの塩基配列を示す。PCRの条件 は、すべて１cycle（94℃、５分）、30 cycle（94℃、１分； 58℃、１分； 72℃、 ４分）、１cycle（72℃、20分）で行なった。PCR-productは１％agarose S gel（ニッポンジーン社）を用いて電気泳動を行ない、目的のバンドを切りだし、QIAEX II（QIAGEN社）によりDNAをゲルから抽出した。目的DNAはTA vector（Invitrogen社）に組み込み、クローニングした。Positive cloneの選別後、それぞれのプラスミドを適切な制限酵素で切断した。得られたインサートDNAをそれぞれ対応する制限酵素で切断したpET-15b vector（Novagen社）に組み込んで、クローン化した。N-halfおよびFull-lengthにはBamHI、C-halfならびにC末端膜外部にはNdeIとBamHIが用いられた。目的DNAをpET-15bに挿入したplasmidをBL21(DE3)細胞にtransformし、培養菌液のOD600nmが0.5-0.6付近になった時点で、終濃度0.4 mM のIPTGを添加後、さらに４時間培養することにより蛋白発現を行なった。得られた菌体を5,000g、20分、4℃の遠心で集めた。その沈殿を20 mM Tris-HCl（pH8.0）、1 mM DTT、1% Triton X-100溶液に懸濁し、凍結融解を３回行ない、5,000g、20分、4℃で遠心した。その沈殿を8M Urea存在下0.1 M Tris-HCl（pH8.0）に溶解し、His-Tag SystemのNi-columnにアプライ後、8 M Urea存在下0.1 M Imidazole、0.5 M NaCl、20 mM Tris-HCl（pH8.0）溶液を用いて目的蛋白を溶出し、精製を行なった。目的蛋白を含む画分は終濃度10%のトリクロロ酢酸により濃縮し、その最終沈殿は100%エタノールで２回洗浄した後、-20℃で保存した。
【００５３】
実施例４
抗シトリン抗体の作成
上記の方法で精製したリコンビナント蛋白400μｇを250μｌの8M Urea存在下20mM Tris-HCl（pH8.0）で溶解し、同量のTiterMax Gold（CytRx社）を加えて超音波処理により混合し、その混液をウサギに注射した。１回目の免疫から３週間後、同様の方法で２回目の免疫を行ない、ELISA法により抗体の力価を測定した。最初の免疫から４週間後に３回目の免疫を実施し、その１週間後に全採血を行ない、抗血清を得た。
【００５４】
【発明の効果】
本発明により、初めてCTLN2を遺伝子検査又は免疫測定により、簡便、かつ確実に診断できるようになった。
【００５５】
【配列表】

【００５６】

【００５７】

【００５８】

【００５９】

【００６０】

【００６１】

【００６２】

【００６３】

【００６４】

【００６５】

【００６６】

【００６７】

【００６８】

【図面の簡単な説明】
【図１】第７染色体上のCTLN2の遺伝マッピングを示す図である。
【図２】血族結婚両親からの１８人のCTLN2患者(a)及び対応するハプロタイプ(b)のリストを示す図である。
【図３】染色体7q21.3におけるCTLN2遺伝子座の物理的地図を示す図である。
【図４】シトリンと関連タンパク質の整列比較を示す図である。
【図５】 SLC25A13 mRNAの発現プロフィールを示す図である。
【図６】 CTLN2患者におけるヒトシトリン及び突然変異の推定トポロジカルモデルを示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention relates to adult-onset type II citrullinemiaDetection of pathogenic mutationMethodas well asUsed for itRutaRelated to protein.
[0002]
[Prior art]
Citrullinemia (CTLN) is a disease in which the concentration of citrulline and ammonia in blood and urine increases, causing vomiting, disturbance of consciousness, convulsions, etc. Argininosuccinic acid synthase (a urea cycle enzyme) ASS) is a disease based on abnormality. The inventors of the present application have so far analyzed more than 170 cases of CTNL and classified them into 3 types based on enzyme abnormality and 2 types based on differences in etiology. Of these, type I and type III are neonatal infantile classic citrullinemia (CTLN1) caused by an abnormality in the ASS gene located on chromosome 9q34.
[0003]
On the other hand, adult-onset type II citrullinemia (CTLN2), which is seen in the majority of adult-onset, is characterized by liver-specific deficiency in ASS, but there is no abnormality in the ASS gene, and it is also found in ASS mRNA in hepatocytes It is a disease caused by a specific etiology that there is no abnormality. CTLN2 causes disturbances of consciousness and coma, and many deaths occur in 2-3 years. The incidence of CTNL2 in Japan is about 1 in 100,000, which is higher than CTRN1. The fact that CTLN2 is a liver-specific disease is supported by the fact that liver transplantation performed in 9 cases so far has shown good therapeutic effects. The inventors of the present application have so far experienced 118 families of CTNL2, and have reported that CTRN2 is an autosomal recessive hereditary disease because 23 families are derived from bloodline marriage. However, the responsible gene was completely unknown.
[0004]
Currently, CTNL2 is diagnosed by examining amino acid analysis in blood, biochemical markers such as increased pancreatic secretory trypsin inhibitor (PSTI) concentration, and measuring ASS activity and protein decrease in liver tissue. ing. However, biochemical tests and enzymological analyzes are cumbersome and time consuming, so they are not necessarily suitable for clinical tests that require a large number of specimens to be tested in a short time. Is difficult. If the responsible gene of CTNL2 can be clarified, and the mutation in the responsible gene that causes CTNL2 can be clarified, it can be diagnosed simply and reliably by genetic testing, It is advantageous. In addition, not only CTNL2 diagnosis but also the carrier of the gene can be diagnosed. In addition, if this responsible gene is a structural gene encoding a protein and CTRN2 is caused by an abnormality of the protein, CTNL2 can be easily and reliably obtained by immunoassay or the like for the protein. Diagnosis becomes possible.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
  Therefore, the object of the present invention is to clarify the responsible gene of CTNL2 and the mutation in the responsible gene that causes CTNL2, thereby enabling easy and reliable diagnosis of CTRN2 by genetic testing or the like.WhoIs to provide the law.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors consider that CTNL2 is an autosomal recessive genetic disease, and using the homologous mapping method, the gene locus of CTNL2 is determined to be number 7 using the genomic DNA of CTRN2 patients and healthy individuals derived from clan marriage. A novel gene located on chromosome 7q21.3, which is thought to be a responsible gene for CTNL2, was identified by performing genomic cloning based on the genomic DNA found on the chromosome. Furthermore, by determining the base sequence of the gene of CTNL2 patients and healthy individuals, CTRN2 patients are included in homozygous or complex heterozygotes, but healthy individuals are not included in homozygotes. A mutation was found and the conclusion was reached that the gene is responsible for CTNL2. A method was developed to detect these five mutations by genetic testing. Furthermore, a protein encoded by the responsible gene was expressed to produce an antibody using the protein as an antigen.
[0007]
  That is, the present invention comprises examining at least one of the following (1) to (5) for genomic DNA or mRNA or cDNA synthesized from the mRNA in a test sample isolated from a living body, A method for detecting a pathogenic variant of type II citrullinemia is provided.
(1) Whether a mutation that deletes the 851-nt to 854-nt region of the SLC25A13 cDNA coding region shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is present in cDNA or mRNA, or corresponds to the mutation in genomic DNA Whether there is a mutation.
(2) of the sequence listingShown in SEQ ID NO: 65 'end of the 11th intron of SLC25A13 gene1nt of side areaWhether there is a mutation that replaces G with A.
(3) A 23 bp region corresponding to 1638 nt to 1660 nt of the coding region of SLC25A13 cDNA shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is any site between 1637 nt and 1638 nt or between 1660 nt and 1661 nt of the coding region. Whether or not a mutation to be inserted into cDNA or mRNA exists, or whether or not a mutation corresponding to the mutation exists in genomic DNA.
(4) Whether or not a mutation in which 674 nt C of the coding region of SLC25A13 cDNA represented by SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing substitutes A exists in cDNA or mRNA, or a mutation corresponding to the mutation in genomic DNA Whether or not exists.
(5) Sequence listingShown in SEQ ID NO: 135 'end of the 13th intron of SLC25A13 gene1nt of side areaWhether there is a mutation that replaces G with A.
[0008]
  Furthermore, the present invention relates to SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 13Including the mutation of any of (1) to (5) above in the base sequence shown inSLC25A13 geneThe protein encoded byIt consists of a genomic DNA sequence, mRNA sequence or cDNA sequence of SLC25A13 gene containing any of the mutations (1) to (5) above in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 13Nucleic acids are provided.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Based on the fact that CTNL2 is an autosomal recessive genetic disease, the inventors of the present application, as detailed in the Examples below, use homozygosity using genomic DNA of CTNL2 patients and healthy individuals derived from clan marriage. -By identifying the CTNL2 gene locus on chromosome 7 by mapping method and performing positional cloning of genomic DNA based on this, a novel gene located at chromosome 7q21.3, which is considered to be a responsible gene for CTRN2, is identified. The cDNA sequence was determined. Furthermore, the base sequence of genomic DNA (including intron region) corresponding to the cDNA was determined. The CTRN2 patient was found to have 5 types of mutations that were homozygous or compound heterozygous, but not healthy individuals. This revealed that the gene is a responsible gene for CTNL2, and the five types of mutations are the cause of CTNL2. The responsible gene was named “SLC25A13”, and the protein encoded by the gene was named “citrin”.
[0010]
The nucleotide sequence of cDNA derived from SLC25A13 of a healthy person is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing together with the deduced amino acid sequence of the protein (citrin) encoded by this. Hereinafter, in the present specification, unless otherwise specified, the position of the base is what number base of the coding region shown in SEQ ID NO: 1 (starting from the 138th A of the sequence shown in SEQ ID NO: 1) It is expressed by whether or not. For example, the position of A which is the first base of the coding region is represented as “1nt”, and the position of the 1000th C is represented as “1000nt”. The base sequence of SLC25A13, which is a gene in the genomic DNA from which the cDNA was derived, was analyzed and compared with the cDNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 to determine the exon-exon boundary in the cDNA sequence. As a result, it was revealed that SLC25A13 has 18 exon regions. The position of each exon region in the cDNA is shown in Table 1 below.
[0011]
[Table 1]

[0012]
Introns are located in SLC25A13 between each exon shown in Table 1. The number of the intron is the same as the number of the exon immediately upstream of that intron. That is, for example, the 11th intron is located between the 11th and 12th exons shown in Table 1, and the 13th intron is located between the 13th and 14th exons. The sequences (or partial sequences) of each intron relevant to the present invention are shown in SEQ ID NOs: 2 to 13. That is, in SEQ ID NO: 2, the base sequence on the 3 ′ end side of the seventh intron (A at the 5 ′ end of the eighth exon comes immediately after the G at the 3 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. The same). SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of the eighth intron. SEQ ID NO: 4 is the base sequence on the 5 ′ end side of the 9th intron (G at the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 follows immediately after the 3 ′ end G of the 9th exon, and so on) Indicates. SEQ ID NO: 5 includes the 3 ′ terminal side of the 10th intron, SEQ ID NO: 6 includes the 5 ′ terminal side of the 11th intron, SEQ ID NO: 7 includes the 3 ′ terminal side of the 15th intron, and SEQ ID NO: 8 includes the 16 intron, SEQ ID NO: 9 is 5 'end of 17th intron, SEQ ID NO: 10 is 3' end of 6th intron, SEQ ID NO: 11 is 5 'end of 7th intron, SEQ ID NO: 12 is The nucleotide sequence at the 3 ′ end side of the 12th intron and SEQ ID NO: 13 show the nucleotide sequence at the 5 ′ end side of the 13th intron, respectively.
[0013]
The inventors of the present application have found that it is the etiology of CTNL2, and there are the following five types of mutations in SLC25A13.
(1) Mutation in which the 851nt to 854nt region of the coding region of SLC25A13 cDNA represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is deleted (hereinafter, this mutation may be referred to as “[I] 851del4”).
(2) A mutation in which G at the 5 ′ end of the 11th intron of SLC25A13 is replaced with A (hereinafter, this mutation may be referred to as “[II] IVS11 + 1G> A”).
(3) A 23 bp region corresponding to 1638 nt to 1660 nt of the coding region of SLC25A13 cDNA shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is any site between 1637 nt and 1638 nt or between 1660 nt and 1661 nt of the coding region. (Hereinafter, this mutation may be referred to as “[III] 1638ins23”).
(4) A mutation in which 674 nt C in the coding region of SLC25A13 cDNA represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is replaced with A (hereinafter, this mutation may be referred to as “[IV] S225X”).
(5) A mutation in which G at the 5 'end of the 13th intron of SLC25A13 is replaced with A (hereinafter, this mutation may be referred to as “[V] IVS13 + 1G> A”).
[0014]
As described in the Examples below, citrine is highly homologous to other mitochondrial carrier families, has a structure that penetrates the mitochondrial lipid bilayer six times, and is thought to exist in the mitochondrial membrane. It is done. Furthermore, since citrine has four characteristic EF-hand motifs, it is presumed to be a calcium-dependent mitochondrial carrier protein. The presence state of citrine is schematically shown in FIG. The approximate positions of the mutations (1) to (5) are also shown in FIG.
[0015]
Since the mutation of (1) above introduces a stop codon at the position of the 286th codon of the sequence shown in SEQ ID NO: 1, the protein encoded by the mutant gene is an incomplete protein cleaved halfway It becomes. The mutation of (2) above occurs in the intron region. However, if this mutation is present, splicing during mRNA formation becomes abnormal, the 11th exon of mRNA is deleted, and the transmembrane region TM1 shown in FIG. Within the hydrophilic loop between TM2, the 53 amino acid residues encoded by the 340-392 codon shown in SEQ ID NO: 1 are deleted. When the mutation (3) is present, a frame shift occurs at the 554 codon, the 570 codon becomes a stop codon, and 16 amino acid sequences different from normal are present. Thus, this mutation results in an incomplete protein with the C-terminal portion of citrine truncated. When the mutation (4) is present, the 225 codon becomes a stop codon, and the protein encoded by the mutant gene becomes an incomplete protein cleaved halfway. The mutation of (5) above occurs in the intron region. If this mutation is present, splicing during mRNA formation becomes abnormal, and 27 amino acid residues (411 to 437) between TM2 and TM3 shown in FIG. Codon) is deleted. Thus, even when any of the above mutations (1) to (5) is present, the structure of citrin encoded by the mutation SLC25A13 is significantly different from that of normal citrine.
[0016]
In the method for diagnosing CTNL2 of the present invention, at least one of the mutations (1) to (5) is examined. Preferably, SLC25A13 in the test sample does not have any of the above mutations (1) to (5), and if so, which of (1) to (5) Find out if it is. The presence or absence of these mutations can be examined by examining either genomic DNA or cDNA or mRNA. Although the mutations (2) and (5) are mutations in the intron region, as described above, the mutations cause the mRNA and the cDNA sequence derived therefrom to differ greatly from normal ones. The presence or absence of the mutation (5) can also be examined by examining cDNA or mRNA. Since CTNL2 is a liver-specific disease, hepatocytes are required as a test sample if testing is performed on cDNA or mRNA. On the other hand, if the test is performed on genomic DNA, genomic DNA extracted from peripheral blood cells and the like that can be easily collected can be used. This is preferable because the burden is small.
[0017]
According to the present invention, the intron sequence in the vicinity of the mutation site in the SLC25A13 cDNA sequence and genomic DNA and the position and structure of each mutation have been clarified. It can be easily examined by the law. For example, when examining the presence or absence of the mutation (1) or (3) above, a region of genomic DNA or cDNA containing the mutation is amplified by a nucleic acid amplification method such as PCR, and the amplified fragment is subjected to electrophoresis to obtain the size of the band. Can be measured. If there is a mutation, the size of the amplified nucleic acid fragment increases or decreases compared to the normal gene due to deletion or insertion. Therefore, the presence or absence of these mutations can be examined by examining the size of the amplified fragment. In addition, when examining cDNA, the presence or absence of the mutations (2) and (5) can be examined by this method. When examining genomic DNA, the mutations in (2), (4) or (5) above are base substitutions, so the size of the amplified fragment is the same for both normal and mutant types. It can be easily examined by using the type (RFLP) method. For example, when examining the presence or absence of the mutation of (4) above, since the AluI site (AGCT) is introduced by base substitution, the fragment containing the mutation of (4) is amplified by the nucleic acid amplification method, and the restriction enzyme AluI The presence or absence of the mutation can be examined by digesting with digestion and measuring the size of the digested fragment by electrophoresis. In the normal type, the amplified fragment is not cleaved. In the mutant type, the amplified fragment is cleaved by AluI at the site where the mutation is present, so two fragments appear smaller than the normal type amplified fragment. . When an appropriate restriction enzyme site is not introduced due to mutation, the sequence of the amplification primer can be intentionally changed so that such a restriction enzyme site is introduced into the amplified fragment. For example, when detecting the mutation of (2) above, the 3 ′ end of the reverse primer is set to G instead of A which is complementary to the template DNA, so that the normal site is GGTC or mutant type. Now we introduce the GATC sequence. Since GATC is cleaved by the restriction enzyme Sau3AI, the presence or absence of mutation can be examined by RFLP in the same manner as in the above (4). In addition, the presence or absence of the mutation in (5) above is determined by setting the 3 ′ end of the reverse primer to C instead of A complementary to the template DNA, so that the CTGCGG in the normal type and the CTGCAG sequence in the mutant type at the mutation site. Therefore, the presence or absence of mutation (5) can be easily examined by RFLP using restriction enzyme PstI. Furthermore, the presence or absence of mutations using a nucleic acid amplification method using primers that do not hybridize with either normal type or mutant type, or that do not cause amplification even when hybridized, and whether or not amplification occurs. It is also possible to check. For example, when examining genomic DNA, in the case of a mutation that causes deletion or insertion, such as the mutation of (1) or (3) above, a primer that hybridizes with the mutation site can be used. It is also possible to examine the presence or absence of mutation by Southern blot or Northern blot using a probe that hybridizes to the mutation portion. It is also possible to examine the presence or absence of mutation by directly determining the base sequence of the amplified fragment.
[0018]
The primer used for nucleic acid amplification is complementary to the cDNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the intron sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 13 (complementary to the region spanning the intron and exon). May be hybridized to both ends of the region to be amplified. However, complete complementarity is not always necessary, and non-complementary bases may be included as long as sequence-specific hybridization is possible. The size of the primer is usually about 15 to 50 bases, preferably about 20 to 40 bases, but is not limited thereto.
[0019]
Further, as described above, since the structure of citrin encoded by the mutant SLC25A13 is greatly different from that of normal citrine, the presence or absence of the mutation can also be examined by examining citrin. Whether citrine is a mutant type or a normal type can be easily and accurately examined by, for example, immunoassay. By using a monoclonal antibody that specifically reacts only with mutant citrin and does not react with normal citrin, mutant citrin can be specifically detected. Such a monoclonal antibody is prepared by a conventional method using a mutant citrin as an immunogen and selecting a monoclonal antibody that does not react with normal citrin but reacts with mutant citrin. Obtainable. Mutant or normal citrine used as an immunogen or for screening monoclonal antibodies has been prepared in large quantities by genetic engineering techniques based on conventional methods since the entire nucleotide sequence of the cDNA has been clarified by the present invention. Is possible. A specific example of this is described in Example 3 below. The citrin for immunogen or screening is only citrin encoded by the cDNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or the mutant containing any of the mutations (1) to (5) above. A modified citrin in which one or more amino acid residues of the citrin are deleted or substituted, or one or more amino acid residues are added to or inserted into the protein, the antibody against the citrin, It may be a modified citrine that immunoreacts.
[0020]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
[0021]
Example 1
1. Method
(1) Patient
Blood samples, surgical or autopsy liver specimens, and clinical data were collected from 18 adult-onset patients (19-48 years old) from a family of unmarried family members (19-48 years old) (a in FIG. 2). Citrullinemia was diagnosed by an established method. 127 unrelated healthy individuals aged 18-55 years were used as controls.
[0022]
(2) Genome screening by homozygous mapping (Lander E.S. et al., Science 236, 1567-1570 (1987))
Screening was performed using 391 microsatellite marker panels from CHLC Human Screening Set / Weber version 6 commercially available from Research Genetics, Inc. For high resolution genotyping, PCR is performed in a mixture containing 0.2 μM fluorescently labeled [R110]-or [R6G] -dUTP, and the size of each PCR product is GeneScan-500 [TAMRA] as the size standard. And resolved using GeneScan 672 on the ABI310 Genetic Analyzer. PON1-192, PON2-148, and PDK4 promoter regions were established by established methods (Humbert, R., et al., Nature Genetics 3, 73-76 (1993); Hegele, RA et al., J. Clin. Endocrinol Metab. 82, 3373-3377 (1997); Rowles, J. et al., J. Biol. Chem. 271, 22376-22382 (1996)), and analyzed by a combination of PCR and restriction enzyme digestion. 2 × 2 contingency table χ to assess the statistical significance of the relationship²The test was used to compare the percentage of homozygotes in patients with irrelevant controls. The P value was adjusted by correcting Yates.
[0023]
(3) Identification of SLC25A13 gene
First, the 3 ′ portion of SLC25A13 maps the EST clone yg89b07 (GenBank Acc. # R55737) (hereinafter, only Acc # only means BenBank Accession No.) to the YAC clone shown in FIG. Was identified. Subsequently, the full length of this gene was isolated by conducting cDNA library screening, RT-PCR and 5′-RACE experiments by conventional methods. The gene structure was determined by comparing the cDNA sequence from the BAC clones H GS025M02 (Acc. # AC002540) and H GS244B22 (Acc. # AC002450) with the genomic sequence and by inverse PCR of genomic DNA. So far, 18 exons of this gene have been identified.
[0024]
(4) Northern blot analysis
Primer 5'-F (5'-acgccagccagccagtcagt-3 ', -53nt to -34nt (the nucleotide of SLC25A13 mRNA indicates the start codon A as +1)) and primer 10B (5'-tctgggcctcagccaagtta-3', 928nt SLC25A13 mRNA was examined by hybridizing with a human multiple tissue northern blot (Clontech # 7760-1) using a 981 bp fragment (5 ′ side of cDNA) amplified by PCR using ˜909 nt) as a probe. Furthermore, a 934 bp fragment (3′-untranslated region of SLC25A13) amplified by PCR using primer 3′-F (5′-taggaagatcagccctggga-3 ′) and primer End-B (5′-gcgcctctgaccattatgca-3 ′) , 2026nt-2959nt) as a probe and hybridized to the same blot. In order to detect aralar mRNA (del Arco, A. et al., J. Biol. Chem. 273, 23327-23334 (1998)), primer 5'F (5'-gagcacagcatggcggtca-3 ') and primer 5' A 975 bp fragment (5 ′ side of cDNA, 15 nt to 989 nt) was amplified using B (5′-ctggagccagataggcctg-3 ′) and used as a probe after cloning and sequencing.
[0025]
(5) Mutation detection
In RT-PCR to amplify the coding region of each mRNA, oligo (dT)_12-18And single-stranded cDNA was synthesized from liver RNA using M-MuLV reverse transcriptase. The amplified cDNA fragment was separated on an agarose gel, extracted, cloned using TA-vector (Invitrogen), and the nucleotide sequence was determined. For SLC25A13 mRNA, oligonucleotide primers 5'-F, 10B and MF (5'-gaacggattgctcctctgga-3 ', 871nt-890nt) and 3'-B (5'-gacagcactatcccagggct-3', 2055nt-2036nt) Using. TFPI-2 (Acc. # L27624), PON1 (Acc. # M63012), PON2 (Acc. # AF001601), PDK4 (Rowles, J. et al., J. biol. Chem. 271, 22376-22382 (1996) ) And DNCI1 mRNA all coding regions were amplified using appropriate primer sets, respectively. The primer sets used were 5'-ggacgccttgcccagcgggc-3 'and 5'-ccaatgatttgtttcctcatgctg-3', 5'-cccccgaccatggcgaagct-3 ', 5'-tggcatgggtgcaaatcggt-3', 5'-cggagcgaggccc'cg -agggccgttccttactggaa-3 ', 5'-atgaaggcggcccgcttcgt-3' and 5'-agacccactttgatcccgtaaa-3 ', and 5'-gagagaggaagtgatcgctc-3' and 5'-acgctgagctctaggacaca-3 '.
[0026]
For detecting the mutation of SLC25A13, the following oligonucleotides were synthesized based on the sequence of the intron adjacent to each exon. IVS-6F (5'-ggagagtacaagttctggtc-3 '), IVS-7B (5'-actagttgccttcttcaccc-3'), IVS-7F (5'-tcactcattccagtgccttg-3 '), IVS-9B (5'-caatgccgcaaaggcaactg-3' ), IVS-10F (5'-ttgggctgtagcaatgtgcc-3 '), IVS-11B (5'-ctagatgcctccagcctact-3'), IVS-12F (5'-ctcctgaaacatcagtgatgc-3 '), IVS-13B (5'-cctagtagactctgcccttg- 3 '), IVS-15F (5'-ggagcagacatcttgcacac-3') and IVS-17B (5'-ggagttgatacattctcatca-3 '). The base sequence of each amplified genomic DNA fragment was directly determined, or after cloning into a TA-vector, the base sequence was determined.
[0027]
2. result
As described above, the CTNL2 locus was searched across the genome for homologous mapping approaches (Lander, E.S., et al., Supra) for DNA from patients of family members of the family. First, a total of 332 genetic markers distributed along the autosome were analyzed against 15 CTNL2 patients and 15 controls (FIG. 1). Two markers on chromosome 7q21-q22 (D7S821 and D7S1799) are homozygous in 12 (80%) and 9 (60%) of 15 patients, respectively.²The values (P values) were 13.4 (0.0004) and 12.2 (0.0007), respectively.
[0028]
The results of homozygous mapping of 332 markers that longitudinally cut the autosome are shown in FIG. Homozygous frequency χ for each polymorphic DNA marker²Analysis was performed among 15 CTRN2 patients from 18 family members (see Figure 2), excluding AP-9, AP-69 and AP-80, and 15 unrelated controls. It was. The percentage of patients who were homozygous compared to the control was χ to the right of the line representing each chromosome.²Values were plotted. The relative positions of the markers used indicated each genetic distance in centmorgan (cM) units. The two markers (D7S821 and D7S1799) on chromosome 7q21-q22 are homozygous in 12 (80%) and 9 (60%) of 15 patients, respectively.²The values (P values) were 13.4 (0.0004) and 12.2 (0.0007), respectively. Due to the observed differences between patients and controls, the CTRN2 gene is expressed in D7S2212 (χ²= 2.78, P = 0.039) and D7S22847 (χ²= 1.29, P = 0.45). Examining 18 CTNL2 patients and 118 controls, D19S586 was also very significant on other autosomes (χ²= 11.8, P = 0.0017). However, three additional markers that are adjacent to D19S586 within a distance of 1 cM, namely D19S413 (χ²= 0.50, P = 0.57), D19S204 (χ²= 1.65, P = 0.26) and D19S583 (χ²= 4.04, P = 0.062), no significant results were detected.
[0029]
To confirm the significance of this observation and to more accurately identify the CTRN2 locus on chromosome 7q, 16 microsatellite markers and 3 genes (PON1, PON2 and PDK4) (Humbert et al., Above Hepatele, RA et al., Supra; Rowles J. et al., Supra) were used to analyze 18 patients and all 120 controls. The homozygous ratio of three markers (D7S527, D7S1812 and D7S821) is χ²Both P and P values were significantly higher (Figure 2). Furthermore, D7S1812 was homozygous in all 18 CTNL2 patients. Of these 18 CTNL2 patients, a homozygous 290 bp D7S1812 allele was observed in 13 (72%), which was significantly higher than 24 (116%) of 116 controls. High (χ²= 20.7, P <0.0001). A homozygous 281 bp D7S1812 allele was observed in 5 of 18 patients (28%) and 11 of 116 controls (9.5%), which was less significant (χ²= 4.96, P = 0.042). Based on comparing haplotypes of all CTNL2 patients and allelic frequency compared to controls, the most likely site of the CTNL2 locus is estimated to be 7q21.3, close to D7S1812 between D7S527 and D7S821 (See FIG. 3 for the position of each marker). Furthermore, the analysis of haplotypes indicated the possibility of the presence of five different disease gene-carrying chromosomes (b in FIG. 2).
[0030]
FIG. 2 shows a list of 18 CTNL2 patients and their corresponding haplotypes (b) from their clan-married parents (a). In FIG. 2a, “cousins” indicate the degree of relatives of the parents. “Cit” and “Arg” indicate the concentrations of citrulline and arginine in the serum, respectively, and Thr / Ser indicates the ratio of threonine / serine in the serum. sPSTI and hPSTI indicate serum and liver PSTI concentrations, respectively. Liver ASS (hASS) is shown as a percentage of the control. Each number in parentheses indicates “mean ± standard deviation” (Kobayashi, K., et al., Hepatology 25, 1160-1165 (1997)). “N.t.” means not measured. In FIG. 2b, the markers from D7S2212 to D7S1799 are shown on the left side of the diagram in the physical mapping from the centromeric end (upper) to the telomere end (lower) of the genomic interval containing the chromosome 7q21-q22 region. They are shown in order. Numbers in parentheses indicate control homozygotes (homozygotes / number of people measured). Marker stretches where each patient was homozygous are shown in light gray shading. In FIG. 2b, R and Q in the PON1 row, and A and G in the PON2 row are the 192nd amino acid of the PON1 and the 148th amino acid of the PON2, respectively, and CC, CT and TT in the PDK4 row. These correspond to the −154th (C or T) and −209th (C or T) bases 5 ′ upstream of the PDK4 gene, respectively. In patients, three markers are χ²And in both the P values, the proportion of homozygotes was significantly higher. That is, χ²And P values of 42.1 and 8.7 x 10 respectively^-11D7S527, 25.8 and 3.9x10^-7D7S1812, and 25.7 and 3.9x10^-7It is D7S821. Based on the common haplotypes, it can be divided into five different groups (I / I, II / II, III / III, I / IV and I / V), as shown in FIG. It shows the presence of chromosomes carrying different disease genes.
[0031]
In an effort to construct a complete genetic map of chromosome 7q, at least 17 genes from the 7q21.3 region were identified (Figure 3). The PDK4, TFPI-2 and PON genes were positional (and functional) candidates for CTNL2, but when the nucleotide sequences of these coding regions were determined, no mutation was found. Gene identification experiments in the immediate region including D7S1812 showed the presence of the mid-chain dynein gene (DNCI1) and a gene not previously characterized. By combining DNA sequencing and analysis, EST mapping, and cDNA library screening and characterization, it was determined that the latter gene (named SLC25A13) has 18 exons and consists of approximately 200 kb of DNA. . This gene also included the D7S1812 marker (FIG. 3), and mutation screening identified it ultimately as the CTRN2 gene.
[0032]
FIG. 3 shows a physical map of the CTNL2 locus at 7q21.3. YAC contigs covering 7q21.3 and known genes within this chromosomal band are shown. Where known, the transcription direction of the gene from 5 'to 3' is indicated by an arrow. The genetic markers used in this study are shown with black circles in the order determined by their position in the YAC contig. Three additional genetic markers (D7S1513, D7S2430 and D7S1849) are also shown with open circles. The responsible gene for CTLN2 is shown as SLC25A13. D7S1812, which was homozygous in all patients analyzed, is located between exons 15 and 16 of SLC25A13. YAC clones are from known chromosome 7-specific YAC libraries.
[0033]
From the nucleotide sequence analysis, it was found that the total length of SLC25A13 cDNA was 3135 bp and the expected open reading frame (ORF) was 2025 bp. DNA near the putative ATG translation start site (ggcgaatcatgcg) has the -3 purine and +4 guanine residues essential for the Kozak consensus sequence (Kozak, M., Mamm. Genome 7, 563-574 (1996)).
[0034]
The putative protein named “citrin” encoded by SLC25A13 consists of 675 amino acid residues and has a molecular weight of approximately 74 kDa (FIG. 4). The C-terminal region has homology (20-30% amino acid match) with the mitochondrial solute carrier family (Kuan, J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28, 209-233 (1993)). The N-terminal region has four putative EF-hand regions (Kawasaki, H. et al., Protein Profile 1, 343-517 (1994)) that are conserved in calcium binding proteins. The overall structure of citrine is 77.8% and 53.7% with Arara, a member of the mitochondrial carrier superfamily that binds calcium (del Arco, A. et al., Supra) and C. elegans protein (Q21153), respectively. Have homology. By aligning citrine with allara and Q21153 proteins, it was revealed that the sequence was highly conserved, except for the regions near the N-terminal and C-terminal ends (FIG. 4). These sequence features indicate that, like Ararar, citrine is also located in the mitochondrial membrane and may function as a calcium-dependent mitochondrial solute carrier (del Arco, A. et al., Supra). Suggests.
[0035]
FIG. 4 shows an alignment comparison between citrine and related proteins. A comparison of the deduced amino acid sequences of citrine (SLC25A13 protein), allara (SLC25A12 protein), and C. elegans Q21153 protein is shown. Amino acid identity and conservation are highlighted with black or spots, respectively. Citrine has four putative EF-hand regions (residues 28-39, 66-77, 100-111, 171-182), which are conserved in calcium-binding proteins (Kawasaki, H et al., Protein Profile 1, 343-517 (1994)). GX, a typical mitochondrial carrier signature_ThreeGX₈PX (D / E) X (I / L / V) (K / R) X (R / K) XQX_20-30GX_Four(Y / W) (R / K) GX₉P is observed in the C-terminal half region of citrine (residues 335 to 403, 435 to 495, and 527 to 591) and is marked with an asterisk. Like other members of the other mitochondrial solute carrier family, citrine contains a repetitive sequence approximately 100 residues long. Each repeating region includes two transmembrane regions (TM). The first region is more hydrophobic and has conserved glycine and proline residues, and the second region is more hydrophilic and contains highly conserved hydrophilic residues (Kuan , J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28, 209-233 (1993)). The functional area is indicated by black and white boxes indicating EF-hand and TM helix, respectively. Each pair of TM helices in each of the three repeating regions of the C-terminal triregion structure is indicated by a line connecting them.
[0036]
Poly (A) from human tissue⁺Northern blot analysis of RNA showed that probes from different regions of the SLC25A13 cDNA detected a major hybridization band of approximately 3.4 kb in most tissues examined (Fig. 5a). The observation that the expression level in the liver is highest is consistent with this gene being related to liver-specific CTNL2. In contrast to the relatively universal expression of SLC25A13, allar mRNA with two major bands at 3.3 kb and 2.8 kb and a weak band at 6.6 kb is well expressed in heart, brain and skeletal muscle However, it is not expressed in the liver (Fig. 5b).
[0037]
FIG. 5 shows the expression profile of SLC25A13. Poly (A) from human tissue shown in FIG.⁺Northern blots containing RNA (2 μg) were analyzed using SLC25A13-specific probe (5 ′ side of the coding region) (a), allerer-specific probe (5 ′ side of the coding region) (b), and β-actin-specific. Hybridized continuously with the target probe (c). H is the heart, B is the brain, Pl is the placenta, Lu is the lung, Li is the liver, Sk is the skeletal muscle, K is the kidney, and Pa is the pancreas. β-actin mRNA was detected as an internal control. In contrast to SLC25A13 mRNA (3.4 kb), expression of allara (SLC25A12) was not observed in the liver, and two major bands of size 3.3 kb and 2.8 kb were observed in the heart, brain and skeletal muscle. . A band about 6.6 kb in size was also observed which was weaker than these but clearly showed specific hybridization.
[0038]
As shown in FIG. 6, five different mutations (initially named [I]-[V] defined by the haplotypes shown in FIG. 2b) in SLC25A13 of all 18 clan-married CTNL2 patients ) Were identified and confirmed to be the etiology of CTNL2. Thus, individual mutations were detected in genomic DNA from the CTNL2 patient. The mutations found are [I] a 4 bp deletion resulting in a frameshift and introduction of a stop codon, a substitution that deletes the loop between the [II] TM1 and TM2 regions, and a [III] 23 bp resulting in a stop mutation. Insertions, substitutions leading to [IV] nonsense mutations, substitutions causing deletion of [V] exon 13 (FIG. 6).
[0039]
FIG. 6 shows an estimated topological model of human citrine and mutation in CTNL2 patients. This is a schematic diagram of human citrine deduced based on the amino acid sequence (FIG. 4), showing the approximate location of the mutation caused by the SLC25A13 mutation [I-V].
[0040]
Identification of independent mutations that account for individual observed haplotypes in 7q21.3 (FIG. 2b) strongly suggests that CTRN2 is caused by a single gene. Of the 18 patients born from clan-married parents, up to 15 were homozygous for each mutation. Surprisingly, the three patients were compound heterozygotes despite being born from a clan marriage parents. This suggests that the incidence of this disease is high and / or the expression rate is low among Japanese. The same mutations described above were observed in all 10 non-blood marriage patients. In addition, of 127 unrelated controls, only one has the S225X sequence mutation, and this person is probably the carrier of this disease (this observation is the frequency of carriers of CTNL2 among Japanese) Agrees with the expectation of 1/150 to 1/200).
[0041]
Example 2  Mutation detection using PCR or PCR-RFLP
Genomic DNA was extracted from the peripheral blood lymphocytes of healthy individuals or CTNL2 patients by a conventional method. Using this as a template, nucleic acid fragments were amplified by PCR based on conventional methods using the following primer sets for mutation detection.
[0042]
(1) Primer set for mutation detection
Forward side: IVS-8F2 (5'-ggtatatttgttgcttgtgtttg-3 ') (the 166th to 188th base sequence from the 5' end of SEQ ID NO: 3)
Reverse side: Ex-9B (5'-tcttccagaggagcaatccg-3 ') (hybridizes with 874nt to 893nt of the coding region of SEQ ID NO: 1)
[0043]
(2) Primer set for mutation detection
Forward side: Ex-11F2 (5'-gaaagtgctacgctatgaagg-3 ') (1137nt to 1157nt in the coding region of SEQ ID NO: 1)
Reverse side: IVS-11Bm2 (5'-aggtattgagcatgtggcactg-3 ′) (hybridizes with the 3rd to 24th nucleotide sequence from the 5 ′ end of SEQ ID NO: 6 (however, the 3 ′ end of the primer is non-complementary))
[0044]
(3) Primer set for mutation detection
Forward side: IVS-15F2 (5′-tgttgtgtctctcctgcagg-3 ′) (the nucleotide sequence of 1592 nt of the coding region of the cDNA of SEQ ID NO: 160 from 5 ′ end to SEQ ID NO: 1)
Reverse side: Ex-16B (5'-gcagtctatcactccgctgt-3 ') (hybridizes with 1676nt to 1695nt of the coding region of cDNA of SEQ ID NO: 1)
[0045]
(4) Primer set for mutation detection
Forward side: ISV-6F (5'-ggagagtacaagttctggtc-3 ') (72nd to 91st nucleotide sequence from 5' end of SEQ ID NO: 10)
Reverse side: ISV-7B (5'-actagttgccttcttcaccc-3 ') (hybridizes with the 57th to 76th nucleotide sequence from the 5' end of SEQ ID NO: 11)
[0046]
(5) Primer set for mutation detection
Forward side: Ex-13F (5'-gtgaacgattttgtgagggata-3 ') (1231nt to 1250nt base sequence of the coding region of SEQ ID NO: 1)
Reverse side: IVS-13Bm (5'-gaagagagcttcaaaaggtacttc-3 ') (hybridizes with the 2nd to 26th nucleotide sequence from the 5' end of SEQ ID NO: 13 (however, the 3 'end of the primer is non-complementary)
[0047]
When examining the mutation of (1), after amplification by PCR using the above primer set, the amplified product was directly subjected to agarose gel electrophoresis. As a result, an amplified fragment of 82 bp was detected in the case of the normal type gene, and an amplified fragment of 78 bp was detected in the case of the mutant type gene having the mutation (1).
[0048]
When examining the mutation of (2), after amplification by PCR using the above primer set, digestion was performed with Sau3AI, and the digested product was subjected to agarose gel electrophoresis. As a result, in the case of the normal gene, an amplified fragment of 65 bp was detected, and in the case of the mutant gene having the mutation (2), two amplified fragments of 42 bp and 23 bp were detected.
[0049]
When examining the mutation of (3), after amplification by PCR using the above primer set, the amplified product was directly subjected to agarose gel electrophoresis. As a result, an amplified fragment of 123 bp was detected in the case of the normal type gene, and an amplified fragment of 146 bp was detected in the case of the mutant type gene having the mutation (3).
[0050]
When examining the mutation in (4), amplification was performed by PCR using the above primer set, followed by digestion with AluI, and the digested product was subjected to agarose gel electrophoresis. As a result, in the case of the normal gene, two amplified fragments of 57 bp and 369 bp are detected, and in the case of the mutant gene having the mutation of (4), three amplified fragments of 57 bp, 214 bp and 155 bp are detected. It was done.
[0051]
When examining the mutation in (5), amplification was performed by PCR using the above primer set, followed by digestion with PstI, and the digested product was subjected to agarose gel electrophoresis. As a result, an amplified fragment of 106 bp was detected in the case of the normal gene, and two amplified fragments of 80 bp and 26 bp were detected in the case of the mutant gene having the mutation (2).
[0052]
Example 3
Production of recombinant citrin protein
Four types of recombinant proteins for citrine were prepared: N-half (883 bp), C-half (1188 bp), Full-length (2044 bp), and C-terminal membrane exterior (201 bp). Using mRNA extracted from human hepatocytes, cDNA was synthesized by First Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia Biotech). RT-PCR was performed using the cDNA as a template and the following primers. Primer combination is N-half: ORF-1FN (5'-taggatccgatggcggccgccaaggtg-3 ') and ORF-1B (5'-tcggatccaatgtctgctaaggtcgtc-3 '), C-half: ORF-2F (5'-tgcatatgaccttagcagacattgaa-3 ') and ORF-2B (5'-tcggatcctatgggcctccaccaa-3 '), Full-length: ORF-1FN and ORF-2B, C-terminal membrane exterior: Ex17F (5'-caagcttcatatgggatcagagccagttcc-3 ′) and ORF-2B, and the underlined portion indicates the base sequence of Citrin cDNA. PCR conditions were 1 cycle (94 ° C., 5 minutes), 30 cycles (94 ° C., 1 minute; 58 ° C., 1 minute; 72 ° C., 4 minutes), 1 cycle (72 ° C., 20 minutes). PCR-product was electrophoresed using 1% agarose S gel (Nippon Gene), the target band was cut out, and DNA was extracted from the gel by QIAEX II (QIAGEN). The target DNA was incorporated into TA vector (Invitrogen) and cloned. After selection of positive clones, each plasmid was cleaved with an appropriate restriction enzyme. The obtained insert DNA was incorporated into pET-15b vector (Novagen) cleaved with the corresponding restriction enzyme and cloned. BamHI was used for the N-half and Full-length, and NdeI and BamHI were used outside the C-terminal and C-terminal membranes. When the target DNA is inserted into pET-15b, the plasmid is transformed into BL21 (DE3) cells, and when the OD600nm of the culture solution is around 0.5-0.6, the final concentration of 0.4 mM IPTG is added, followed by further incubation for 4 hours. By doing so, protein expression was performed. The obtained cells were collected by centrifugation at 5,000 g for 20 minutes at 4 ° C. The precipitate was suspended in 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM DTT, 1% Triton X-100 solution, freeze-thawed three times, and centrifuged at 5,000 g for 20 minutes at 4 ° C. The precipitate was dissolved in 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) in the presence of 8 M Urea, applied to Ni-column of His-Tag System, and then 0.1 M Imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris- in the presence of 8 M Urea. The target protein was eluted using an HCl (pH 8.0) solution and purified. The fraction containing the target protein was concentrated with trichloroacetic acid having a final concentration of 10%, and the final precipitate was washed twice with 100% ethanol and stored at -20 ° C.
[0053]
Example 4
Production of anti-citrin antibody
400 μg of the recombinant protein purified by the above method was dissolved in 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) in the presence of 250 μl of 8 M Urea, added with the same amount of TiterMax Gold (CytRx), and mixed by sonication. Were injected into rabbits. Three weeks after the first immunization, the second immunization was performed in the same manner, and the antibody titer was measured by ELISA. A third immunization was carried out 4 weeks after the first immunization, and after 1 week, whole blood was collected to obtain an antiserum.
[0054]
【The invention's effect】
According to the present invention, CTNL2 can be easily and reliably diagnosed by genetic testing or immunoassay for the first time.
[0055]
[Sequence Listing]

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[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing genetic mapping of CTRN2 on chromosome 7.
FIG. 2 shows a list of 18 CTNL2 patients (a) and corresponding haplotypes (b) from clan-married parents.
FIG. 3 shows a physical map of the CTNL2 locus on chromosome 7q21.3.
FIG. 4 shows an alignment comparison between citrine and related proteins.
FIG. 5 is a view showing an expression profile of SLC25A13 mRNA.
FIG. 6 shows a putative topological model of human citrine and mutations in CTLN2 patients.

Claims (9)

A study of adult-onset type II citrullinemia, comprising examining at least one of the following (1) to (5) for genomic DNA or mRNA in a test sample isolated from a living body or cDNA synthesized from the mRNA: Methods for detecting pathogenic mutations.
(1) Whether or not a mutation that deletes the 851nt to 854nt region of the SLC25A13 cDNA coding region shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing exists in cDNA or mRNA, or corresponds to the mutation in genomic DNA Whether there is a mutation.
(2) Whether or not there is a mutation in which 1 nt G in the 5 ′ end region of the 11th intron of the SLC25A13 gene represented by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing is replaced with A.
(3) The 23 bp region corresponding to 1638 nt to 1660 nt of the coding region of SLC25A13 cDNA shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is any site between 1637 nt and 1638 nt or between 1660 nt and 1661 nt of the coding region. Whether or not a mutation to be inserted into cDNA or mRNA exists, or whether or not a mutation corresponding to the mutation exists in genomic DNA.
(4) Whether or not there is a mutation in cDNA or mRNA that replaces 674 nt C in the coding region of SLC25A13 cDNA shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a mutation corresponding to the mutation in genomic DNA Whether or not exists.
(5) Is there a mutation in which 1 nt G in the 5 'terminal region of the thirteenth intron of the SLC25A13 gene represented by SEQ ID NO: 13 in the sequence listing is substituted with A?   The presence or absence of the mutation described in the above (1) or (3) is performed by amplifying a nucleic acid region containing any of these mutations and examining the presence or absence of the mutation from the size of the amplified nucleic acid fragment. The method according to 1.   The presence or absence of the mutation described in the above (2), (4) or (5) is obtained by amplifying a nucleic acid region containing any of these mutations and digesting the amplified nucleic acid fragment having a different size depending on the presence or absence of the mutation. The method according to claim 1 or 2, wherein the method is carried out by digesting with a restriction enzyme that generates a nucleic acid fragment and examining the presence or absence of the mutation from the size of the digested nucleic acid fragment generated by digestion.   The method according to any one of claims 1 to 3, wherein it is examined whether or not the mutation described in (1) to (5) above is present in genomic DNA. The presence or absence of the mutation described in (1) to (5) above is carried out by examining the following proteins (i) to (v) encoded by the SLC25A13 gene : The method described.
(i) A protein cleaved halfway resulting from the introduction of a stop codon at the position of the 286th codon in the sequence shown in SEQ ID NO: 1 due to the mutation of (1) above.
(ii) A protein in which 53 amino acid residues encoded by codons 340 to 392 in the sequence shown in SEQ ID NO: 1 have been deleted due to the mutation of (2) above.
(iii) Due to the mutation of (3) above, a frameshift occurred at the 554 codon in the sequence shown in SEQ ID NO: 1, and this caused the C-terminal part of citrine to be cleaved at the 570th codon as a stop codon. Protein.
(iv) A protein cleaved in the middle, caused by the mutation of (4) above, resulting in the 225 codon in the sequence shown in SEQ ID NO: 1 serving as a stop codon.
(v) A protein in which 27 amino acid residues encoded by codons 411 to 437 in the sequence shown in SEQ ID NO: 1 have been deleted due to the mutation of (5) above.   The method according to claim 5, which is carried out by an immunoassay.   The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the presence or absence of all mutations according to the above (1) to (5) is examined. The above (i) to (v) encoded by the SLC25A13 gene containing any one of the mutations (1) to (5) above in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 13 in the sequence listing Any of the proteins. A nucleic acid comprising a genomic DNA sequence, mRNA sequence or cDNA sequence of the SLC25A13 gene containing any of the mutations (1) to (5) above in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 13 in the sequence listing .

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