JP4480125B2 - siRNAを用いたヒト血管内皮増殖因子の発現の強い抑制。 - Google Patents
siRNAを用いたヒト血管内皮増殖因子の発現の強い抑制。 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4480125B2 JP4480125B2 JP2003141179A JP2003141179A JP4480125B2 JP 4480125 B2 JP4480125 B2 JP 4480125B2 JP 2003141179 A JP2003141179 A JP 2003141179A JP 2003141179 A JP2003141179 A JP 2003141179A JP 4480125 B2 JP4480125 B2 JP 4480125B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vegf
- sirna
- double
- base sequence
- vascular endothelial
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト血管内皮増殖因子の発現を抑制するsiRNA配列に関する。
【0002】
【従来の技術】
血管内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor:VEGF)は、血管内皮細胞に強い特異性を有し、強力な血管新生を促すヘパリン結合性増殖因子として、1989年に、Ferraraらによって下垂体濾胞星状細胞の培養上清から見出された(Ferrara,N.et al.:Endocr.Rev.,13,18−32,1992;Leung,D.W.et al.:Science,246,1306−1309,1989)。その後、VEGFのcDNAクローニングが行われると、VEGFは、1983年にすでに、Sengerらによって見出されていた血管透過性因子(vascular permeability factor:VPF)と同一物質であることが明らかとなった(Pamera,J.K.et al.:Science,246,1309−1312,1989)。Sengerらは、腫瘍に関連した血管における蛋白質の透過性を亢進する活性を指標にVPFを単離した(Senger,D.R.et al.:Science,219,983−985,1983)。これらの研究背景から、血管内皮増殖因子はVEGF/VPFまたは単にVEGFと表記するのが通例となった。VEGFは分子量約22,000のサブユニットが二量体を形成する構造を持ち、血管内皮細胞の増殖・遊走・管腔形成を促進し、個体レベルでの血管新生・血管透過性の亢進を起こす。また、組織因子やプラスミノーゲンアクチベーター(plasminogen activator:PA)などの凝固系・線溶系因子の産生亢進、マトリックス・メタロプロテイナーゼやPA受容体の発現などの亢進を誘導し、血管基底膜を分解する(Ferrara,N.:J.Mol.Med.,77,527−543,1999)。また、VEGFはVPFという別名が示す如く、血管透過性を亢進する。
VEGFはalternative splicingにより、5個のサイズの異なるアイソフォーム(すなわちVEGF121,VEGF145,VEGF165,VEGF189,VEGF206:下付の数字は構成アミノ酸数を示す)として存在することが知られている(Tischer,E.et al.:J.Biol.Chem.,266:11947−11954,1991)。これら5種のVEGFサブタイプの性質上の相違点はヘパリンまたはヘパラン硫酸プロテオグリカンに対する結合能の有無や結合力の違いにある。ヘパリン結合ドメインを包含するエクソン6およびエクソン7を有しないVEGF121のみヘパリン結合能がなく、また、VEGF189とVEGF206はより強いヘパリン結合能を持つ。VEGF121,VEGF145,VEGF165は強力な血管内皮細胞増殖能を有し、in vivoにおける血管新生を誘導する。いずれのサブタイプもシグナルペプチドを持ち、糖鎖修飾を受けて分泌される。VEGFを産生している細胞は、何種類かのサブタイプを同時に産生している。通常、VEGF121とVEGF165が優位であるが、VEGF189も多くの細胞で発現が観察されている。VEGF145の発現は組織限定的で、これまで女性生殖器官に由来する細胞でのみの発現とされてきたが、最近口腔悪性腫瘍からVEGF145が同定された(Michi,Y.et al.:Oral Oncol.,36:81−88,2000)。このようなalternativesplicingによって生合成される5種のVEGFサブタイプの遺伝子構造を詳細に把握することは、本発明のヒト血管内皮増殖因子の発現を抑えるsiRNA配列を設計するために、非常に重要であると考えられる。
VEGFは強力な血管新生作用を持つことから、癌治療の分子標的として非常に有用であると推測される。従って、VEGFの生産を抑えるか作用を阻害することによって、癌の治療に寄与することが可能と考えられる。また、癌以外のVEGF過剰発現をその主病因とする疾患、例えば眼内血管新生病(糖尿病網膜症や網膜静脈閉塞症など)、動脈硬化症などの治療にも寄与することが可能と考えられる。
【0003】
VEGFの活性を抑えるためには抗VEGF抗体が考えられ、実際、ヒト型VEGF中和抗体の投与によりヒト胃癌細胞株や大腸癌株の腫瘍成育抑制効果を認めている。(Kanai,T.et al.:Int.J.Cancer,77:933−936,1998)。しかし、抗体が、すべてのVEGF分子に接触し得るわけではないので、効率的なVEGF抑制にはVEGFの生合成そのものをおさえる必要がある。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトVEGFタンパク質の生合成を特異的に強く抑制する物質を提供することを課題とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】
特定のタンパク質の生合成を阻害するためには、そのタンパク質の合成を指令するメッセンジャーRNA(mRNA)を標的とすることが考えられる。すなわち、標的遺伝子のmRNAの働きを抑制し、かつそのmRNA自体を分解に導く戦略、つまりRNAinterferenceを基本原理とする遺伝子発現制御システムを選択した。RNAinterferenceの現象は、1998年、Fireらによって報告された、C.elegansに2本鎖RNAを導入し、in vivoで特定遺伝子のノックダウンに成功したという発表(Fire,A.et al.:Nature:391,806−811,1998)により広く知られるようになった。使用された2本鎖RNAのターゲット遺伝子に対する特異性は、非常に高くターゲット配列に相補しない2本鎖RNAでは一切の発現制御効果を示さなかった。次いで、この実験系を哺乳動物に応用する試みがなされたが、2本鎖RNAの導入に伴う、インターフェロン作用が働くため、哺乳動物細胞の遺伝子をターゲットとした2本鎖RNAは使用できない事が大きな問題となった。その後、Tuschlの研究グループがもっとも効率よく遺伝子をノックダウンする2本鎖RNAの研究をすすめ、3’末端に2塩基のオーバーハングを持った21−merという短い2本鎖を用いると、哺乳類細胞で問題となっていたインターフェロン作用を引き起こさずにRNAiを機能させることができると報告した。このような短い2本鎖RNAをshort interfering RNA(siRNA)と呼ぶ(Elbashir,S.M.et al.:Nature,411:494−498,2001,Bass,B.L.et al:Nature,411,428−429,2001)。申請者らは、ヒトVEGF mRNAに作用し、VEGFタンパク質の発現を阻害可能なsiRNAの塩基配列を見出した。
【0006】
すなわち、本発明は、(1)ヒトVEGFの生合成を強く抑制するsiRNA配列の決定からなる。
【0007】
【発明の実施の形態】
以下添付の図面に従ってこの発明を詳細に説明する。図1は検討した4種のVEGF siRNAと陰性コントロールとして使用した1種のsiRNAの構造を示す。図2Aは4種のVEGF siRNAをヒト前立腺癌細胞(PC−3)に投与し、回収した上清中のVEGF発現の抑制を調べるための酵素免疫測定法(Enzyme−linkedimmunosorbent assay,ELISA)の測定結果である。図2Bは、VEGF合成阻害に最も有効であることが判明したVEGF siRNA#2とそのスクランブル配列VEGF siRNA#2−SCRをPC−3に投与し、回収した上清中のVEGF発現の抑制を図2Aと同様に検討した結果を示す。
【0008】
1.siRNAの分子設計について説明する。ヒトVEGFのmRNA(Leung,D.W.et al.:Science,246,1306−1309,1989;Keck,P.J.et al.:Science,246,1309−1312)は既に報告されている。その翻訳領域の中で工夫をこらして選択を行った。まず、AAおよびCAから始まるターゲット配列よりGC含有量が45〜55%の21塩基の候補配列14種を選択し、「GCの偏り」が比較的少ない配列7種に候補を絞った。続いて、この7種について、BLASTサーチによる類似配列の検索を行い、類似配列の少ないターゲットを選択し、かつその近傍二次構造解析結果を参考に、比較的立体障害の影響の少ないと想定できる4種を最終的に選択した。なお、この配列から出発して、ターゲット配列との相補性に影響の少ない置換、付加を行った配列は請求に含まれる。また、siRNAの3’末端に付加するオーバーハングの選択において、dTdT以外の2塩基についても請求に含まれる。
【0009】
2.siRNAによるVEGFの合成抑制の効果判定について説明する。siRNAをVEGFを合成分泌している細胞に投与し、培養液中に分泌されるVEGF量をQuantikine human VEGF ELISAキット(R&D Systems社)を用いて測定した。
【0010】
【実施例】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0011】
(実施例1)siRNAの作成を行った。ヒトVEGFのmRNA(GenBank Accession No.NM_003376)において、alternative splicingにより生合成される5種のVEGFサブタイプ(VEGF121,VEGF145,VEGF165,VEGF189,VEGF206)がすべて共有する第1エクソンから第5エクソンまでの翻訳領域内から前述の配列選定法に基づいて設計したsiRNA4種をDharmacon社に依託し合成した。合成したsiRNA duplexは図1に示す如くであり、各siRNAのmRNAの標的部位は下記の如くである。
VEGF siRNA#1(mRNA標的部位:塩基配列149番目から167番目;GCUACUGCCAUCCAAUCGA;GC含有量47%)、
VEGF siRNA#2(mRNA標的部位:塩基配列189番目から207番目;GGAGUACCCUGAUGAGAUC;GC含有量47%)、
VEGF siRNA#3(mRNA標的部位:塩基配列290番目から308番目;CUGAGGAGUCCAACAUCAC;GC含有量47%)、
VEGF siRNA#4(mRNA標的部位:塩基配列336番目から354番目;CCAAGGCCAGCACAUAGGA;GC含有量52%)
【0012】
配列番号1 5’−(CA)GCUACUGCCAUCCAAUCGA−3’
配列番号2 5’−(CA)GGAGUACCCUGAUGAGAUC−3’
配列番号3 5’−(CA)CUGAGGAGUCCAACAUCAC−3’
配列番号4 5’−(CA)CCAAGGCCAGCACAUAGGA−3’
【0013】
(実施例2)siRNAによるVEGF産生の抑制を行った。VEGFを分泌しているヒト前立腺癌細胞(PC−3,American Type Culture Collection;ATCCNumber CRL−1435)を35mmディッシュ(FALCON,3001)に2×105個/ディッシュ[ウシ胎仔血清(FBS)10%/F12K培地(F12K)]の細胞密度で正確にまき、37℃、5%CO2存在下で1晩前培養した。あらかじめ、20μMに濃度調整したVEGF siRNA#1,#2,#3,#4の各々をそれぞれ5μlとり、Opti−MEM105μlと混合し、プラス試薬(インビトロジェン社)10μlを加え、よく混合し、室温で15分反応させた。さらに、リポフェクトアミン試薬(インビトロジェン社)4μlを加え、室温で15分反応させ、siRNA・リポソーム処理液の調製を完了した。なお、上記調製量は35mmディッシュで1枚に投与可能な量である。続いてPC−3細胞に新鮮なF12K0.8mlを満たし、前述のsiRNA・リポソーム処理液を0.2mlを加えた後、37℃、4時間トランスフェクションを行った。このとき、siRNAの投与濃度は100nMとなる。10%FBS/F12K 1mlを加え、6時間培養した。細胞をF12Kで洗浄し、20μg/mlのヘパリンを含むF12K 1mlを加え、さらに16時間培養を続け、上清を回収した。回収した培養上清についてR&D Systems社から販売されているQuantikine human VEGF ELISAキットを用いてVEGF濃度を測定した。その結果を図2Aに示す。図2Aに示す如く、VEGF siRNAを投与することにより、培養上清中に分泌されるVEGF濃度の低下を認めた。各培養上清中のVEGF濃度を比較するため、無処理細胞の濃度を100%と定義すると、VEGF siRNA#1では3.6%、VEGF siRNA#2では1.6%、VEGF siRNA#3では22.3%、VEGF siRNA#4では53.5%の濃度であることが明らかとなった(図2A)。
【0014】
(実施例3)VEGF siRNAによるVEGF産生の抑制の特異性を検討した。すなわち、実施例2において、VEGF産生抑制が最も強かったVEGF siRNA#2のアンチセンス鎖をスクランブルにし、それに相補的な2本鎖RNA(VEGF siRNA#2−SCR)を新たに合成し、陰性コントロールとして用いた。
実施例2で示した方法と全く同様の方法を用いて、上記のVEGF siRNA#2とVEGF siRNA#2−SCRをヒト前立腺癌細胞(PC−3)にトランスフェクションした。回収した培養上清について実施例2で示した如く、Quantikine human VEGF ELISAキットを用いてVEGF濃度を測定した。その結果を図2Bに示す。各培養上清中のVEGF濃度を比較するため、無処理細胞の濃度を100%と定義すると、VEGF siRNA#2では1.3%、VEGF siRNA#2−SCRでは94.9%の濃度であることが明らかとなった(図2B)。以上のように、VEGF siRNA#2の配列特異的に、PC−3細胞の分泌するVEGFが減少していることが明らかとなった。
【0015】
【発明の効果】
以上図示し説明したように本発明のsiRNAによってヒトVEGFの発現を強く抑制することが出来る。
【0016】
【配列表】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【図面の簡単な説明】
【図1】この発明における、4種のVEGF siRNA duplexと1種のコントロールsiRNA duplexの構造である。
【図2】この発明の一実施例に関わる、siRNAなどを投与したPC−3細胞の培養上清中のヒトVEGF濃度をELISA法により測定し、各測定値をグラフ化したものである。各投与群について、平均値±標準偏差(n=4)をグラフに示した。図2Aおよび図2Bにおいて、各VEGF siRNAを投与したときのVEGF産生低下量を無投与時のVEGF濃度を100%と定義したときの濃度比として、グラフ内に示した。
Claims (3)
- ヒトVEGF遺伝子の発現を抑制する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、
以下(a)及び(b);
(a)配列番号1で表される塩基配列における第3番目〜第21番目の塩基からなる塩基配列を含むRNA鎖(センス鎖)と前記塩基配列に相補的な塩基配列を含むRNA鎖(アンチセンス鎖)とからなる二重鎖RNA部分
(b)配列番号2で表される塩基配列における第3番目〜第21番目の塩基からなる塩基配列を含むRNA鎖(センス鎖)と前記塩基配列に相補的な塩基配列を含むRNA鎖(アンチセンス鎖)とからなる二重鎖RNA部分
から選択されるいずれかの二重鎖RNA部分を有する二本鎖オリゴヌクレオチド。 - 前記二重鎖RNA部分のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ3’末端に2塩基のオーバーハングを有する、請求項1に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
- 前記オーバーハングは、dTdTである、請求項2に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003141179A JP4480125B2 (ja) | 2003-04-11 | 2003-04-11 | siRNAを用いたヒト血管内皮増殖因子の発現の強い抑制。 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003141179A JP4480125B2 (ja) | 2003-04-11 | 2003-04-11 | siRNAを用いたヒト血管内皮増殖因子の発現の強い抑制。 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004313141A JP2004313141A (ja) | 2004-11-11 |
JP4480125B2 true JP4480125B2 (ja) | 2010-06-16 |
Family
ID=33475012
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003141179A Expired - Fee Related JP4480125B2 (ja) | 2003-04-11 | 2003-04-11 | siRNAを用いたヒト血管内皮増殖因子の発現の強い抑制。 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4480125B2 (ja) |
-
2003
- 2003-04-11 JP JP2003141179A patent/JP4480125B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2004313141A (ja) | 2004-11-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
USRE46873E1 (en) | Multi-targeted RNAi therapeutics for scarless wound healing of skin | |
Zhou et al. | miR-30a negatively regulates TGF-β1–induced epithelial-mesenchymal transition and peritoneal fibrosis by targeting Snai1 | |
CN101160138B (zh) | RNAi抑制CTGF用于治疗眼科疾病 | |
US8283331B2 (en) | Methods to regulate miRNA processing by targeting Lin-28 | |
US9642873B2 (en) | Combinations of TGFβ and COX-2 inhibitors and methods for their therapeutic application | |
WO2009151539A1 (en) | COMPOSITIONS AND METHODS USING siRNA MOLECULES FOR TREATMENT OF GLIOMAS | |
EP3679138B1 (en) | Hnf4a sarna compositions and methods of use | |
US20130023578A1 (en) | siRNA for inhibition of c-Met expression and anticancer composition containing the same | |
US20170035851A1 (en) | Compositions And Methods For Treating Glioma | |
US9284557B2 (en) | Double-stranded nucleic acid molecule, cancer cell proliferation inhibitor and pharmaceutical agent suitable for prevention or treatment of cancer | |
JP4480125B2 (ja) | siRNAを用いたヒト血管内皮増殖因子の発現の強い抑制。 | |
EP2243828A1 (en) | Use of mixed lineage like kinase polypeptides (MLKL polypeptides) in cancer therapy | |
AU2011248566B2 (en) | Compositions and methods for reduced scarring and for treatment of fibrosis | |
JP5697010B2 (ja) | 腫瘍新生血管血管内皮細胞の新しいバイオマーカーとそれを標的とした癌治療薬 | |
WO2011074652A1 (ja) | HIF-2αの発現を抑制する核酸 | |
JP2004275169A (ja) | siRNAを用いたヒトミッドカインの発現の強い抑制。 | |
US10036015B2 (en) | Composition and methods for reduced scarring and treatment of fibrosis | |
WO2024076781A1 (en) | Polynucleotides for silencing transcript variant 1 of assembly factor for spindle microtubules and applications thereof | |
JPWO2005063984A1 (ja) | 遺伝子発現を抑制する二本鎖rna | |
CN118272377A (zh) | Dcaf13抑制剂在制备治疗肺腺癌的药物中的应用 | |
JP2019508379A (ja) | 悪性腫瘍に対する治療方法及び治療用組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060407 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20060407 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060407 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060621 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060621 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060804 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20061127 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20061206 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070106 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090303 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090507 |
|
RD12 | Notification of acceptance of power of sub attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7432 Effective date: 20090507 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20090507 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090616 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090615 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090825 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091026 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091222 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
R155 | Notification before disposition of declining of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R155 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100315 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130326 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140326 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |