JP4472376B2 - 表面プラズモン共鳴現象測定装置 - Google Patents

Description

本発明は、プラズモン共鳴現象を測定原理に利用して、複数の試料の同時分析を可能とするマルチチャンネル表面プラズモン共鳴測定装置に関する。

表面プラズモン共鳴現象測定装置は食品の安全性や環境モニタリング、また、危険物や麻薬の高感度検出を可能とするものであり、環境保全分野、医療分野、農業、畜産、食品産業分野など、多くの分野への応用が期待されている。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ)測定装置はビアコア株式会社や日本レ−ザ−電子株式会社などからすでに市販されている。そのサイズは760 x 350 x 610 cm(W x D x H)と大きく、また重さは50kg (（ビアコア社:BIAcore 1000））と重いためその使用は実験室に限られている。このため、測定現場に持参し、そこで測定結果を得ることは不可能であった。

そこで、本共同発明者らはＳＰＲ測定装置を小型化してオンサイトで計測できるようにするために、光源から放射される光をシリンドリカルレンズを用いて線焦点を結ばせると共に、プリズムとガラス基板で作成したセンサに入射させ、プリズムから反射された光をリニアＣＣＤ受光素子で計測する携帯型ＳＰＲセンサ(10x170x50cm、770g)（特許文献１〜３）を開発した。

携帯型ＳＰＲセンサの利用の１例として環境や農作物などへの汚染物質の計測があるが、これらを農場等のオンサイトで簡便にリアルタイム計測するためには、一度に多数の試料を分析できる機能（多点同時計測機能、マルチチャンネル化）が求められる。

マルチチャンネル化する方法として２つの提案がある。第１の提案は、光源からの光をビームスプリッターで二光路に分けた後、プリズムで構成されるＳＰＲセンサーの定められた２点にあて、表面プラズモン共鳴現象によって生じた光の減少を二つの独立した光検出器で検出後、検出信号を各々増幅する方式である（特許文献１)。第２の提案は、プリズムの反射光を光分割ミラーで２光路に分けて光検出器で検出する方法である（特許文献４）。

しかし乍ら，これら方式でマルチチャンネル化する場合は、必要とするチャンネル数と同数のビームスプリッターまたは光分割ミラーが必要になり、更にこれらのスプリッターとミラーのサイズに対応した光路を備えることが必要になる。その結果、必然的に装置が大型化し、小型の携帯型を指向するには限界がある。即ち、パームサイズでマルチャンネルＳＰＲセンサを実施するには、従来上記の解決するべき困難な問題がある。
特許第3462179号 特許第335621号 特許第3356212号 特願2003-118565号

本発明者らは、上記問題を解決するために種々検討した結果、従来の携帯型ＳＰＲセンサにおけるリニアＣＣＤライン受光素子の光学配置を90度回転させる構成を採用することに想到した。即ち、予めサンプルによるＳＰＲの起こる一定の角度に入射角度を固定し、光源から放射される光をプリズム上に配置したマルチセンサに線焦点を結ぶように照射すると共に、マルチセンサの反射光の延長線上に配置したリニアＣＣＤライン受光素子で測定対象の濃度に対応したＳＰＲ信号を検出することにより、パームサイズで携帯型マルチチャンネルＳＰＲセンサが実現できる。

更に、後述する第２光学系に、ハーフミラー、及びアイピ−スを備えることにより、視覚的に観測して、ＳＰＲが起きていることの確認、及びＳＰＲシグナルの最低光強度に対応する位置に受光素子を位置決めできることを知得した。

本発明は上記検討に基づき完成されるに至ったもので、その目的とするところは、表面プラズモン共鳴現象（ＳＰＲ）法によるリアルタイム・マルチチャンネル多点計測を携帯型で実現する表面プラズモン共鳴現象測定装置を提供することにある。

〔１〕 （１）プリズム表面の金属膜上に複数の測定セルを一列に形成したセンサーと、
（２）光源と、
（３）光源の照射光を前記センサーに形成した複数の測定セルに線焦点を結ばせてプラズモン共鳴角を含む入射角で照射する第１光学系と、
（４）センサーの放出する反射光を平行反射光に変換する第２光学系と、
（５）線焦点の焦点軸方向とリニアＣＣＤの受光素子の配列方向とを平行にして配設すると共に、平行反射光の光軸方向垂直面内を移動する手段を有するステージに取りつけられたリニアＣＣＤと、
を有する表面プラズモン共鳴現象測定装置。

〔２〕 （１）プリズム表面の金属膜上に複数の測定セルを一列に形成したセンサーと、
（２）光源と、
（３）光源の照射光を前記センサーに形成した複数の測定セルに線焦点を結ばせてプラズモン共鳴角を含む入射角で照射する第１光学系と、
（４）センサーの放出する反射光を平行反射光に変換すると共に、前記平行反射光中に設けたハーフミラーと、平行反射光が入射するリニアＣＣＤの前面に設けた反射板であってリニアＣＣＤの受光部の前面に沿ってスリットを有する反射板と、ハーフミラーの反射光を観測するアイピースとを備えてなる第２光学系と、
（５）線焦点の焦点軸方向とリニアＣＣＤの受光素子の配列方向とを平行にして配設すると共に、平行反射光の光軸方向垂直面内を移動する手段を有するステージに取りつけられたリニアＣＣＤと、
を有する表面プラズモン共鳴現象測定装置。

〔３〕 ステージが、平行反射光の光軸の回りを９０℃回動させる手段を有する〔１〕又は〔２〕に記載の表面プラズモン共鳴現象測定装置。

〔４〕 第２光学系が、平行光線を発散させる凹レンズを組込んでなる〔１〕又は〔２〕に記載の表面プラズモン共鳴現象測定装置。

本発明に於いては、ハーフミラーの反射光を直接アイピースで観測して、SPI共鳴角を決定できる。また、本発明に於いては、リニアＣＣＤをセンサーに結ばれる線焦点の焦点軸方向と平行に配置し、SPI共鳴角度を予め固定してセンサーの複数の測定セルで生じるＳＰＲ共鳴シグナルをそのまま同時に測定するようにしているので、多数の試料の同時測定ができる。

以下、図面を参照して本発明を詳細に説明する。

図１は、本発明の携帯型マルチチャンネル表面プラズモン共鳴現象測定装置の光学配置の一例を示す正面図である。図１中、１００はセンサーで、プリズム１１２に不図示の整合板を介して載置したガラス板１１４上面に蒸着した金属薄膜１１６の上に複数の後述する試料測定セル１１８が形成されている。

図２は、センサー１００の平面図で、金属薄膜１１６上に一列に測定セル１１８ａ、１１８ｂ、・・・１１８ｘが形成されている。

図１に於いて、２００は第１光学系で、LED等の一定波長を持つ光源４の照射する光線をレンズ１で平行光線にした後、平行光線をシリンドリカルレンズ２を用いて収束し、センサ１００に線焦点を結ばせる。線焦点の線幅は一列に並んだ測定セル１０７ａ・・・１０７ｘの全てを覆う長さである。センサーへの入射光線の入射角度はプラズモン共鳴角を含む入射角である。線焦点上の各測定セルに対応する各点で起る表面プラズモン共鳴現象に基づき各鳴角が変化した角測定セルに対応する反射光の光強度を、後述するリニアＣＣＤ受光素子３１６で測定する。

図１中、３００は第２光学系である。センサー１００の放出するＳＰＲ共鳴角の変化した反射光は、シリンドリカルレンズ３で平行な反射光（平行反射光３０８）に変換され、偏光子３１０、次いでハーフミラー３１２、反射板３１４に形成されたスリット３１６を順次通過し、リニアＣＣＤ３１８の一列に配列された受光素子３１９を照射する。

ここで、前記線焦点の焦点軸と前記受光素子の配列方向は平行である。即ち、図１に於いて焦点軸は、本図に於いては紙面に垂直であり、また受光素子の配列方向も紙面に対して垂直になっている。

この状態に於いては、受光素子３１９は、センサー１００の各測定セル１１８ａ〜１１８ｘ・・・に基づく各ＳＰＲシグナル像に対応する互いに分離した光の点を検出することになる。図２中に、リニアＣＣＤ３１８と、測定セルとの位置関係をしめす。

一方、スリット３１６を透過した反射光以外の反射光は、反射板３１４で反射され、更にハーフミラー３１２で反射された後、第２光学系の側方に配置されたアイピース３２０に入る。従って、観測者は、アイピース３２０を透して、反射光の光軸方向と平行な直線状のＳＰＲシグナル像に対応する光の濃淡像を観測できる。

３２２はステージで、前記リニアＣＣＤ３１８が取りつけられている。このステージ３２２は、前記平行反射光３０８に垂直な面内を移動する手段、及び平行反射光３０８の光軸の回りを９０度回動できる手段を備えている。

図３は、前記光軸回りを９０度回動できる手段（ステージ３２２）を用いて、図１に示す状態からリニアＣＣＤ３１８を９０度回動させた状態を示す。この状態に於いては、受光素子は、線焦点と直交する関係にある。即ち、図３に於いては、線焦点は紙面に垂直方向にあり、リニアＣＣＤ３１８の受光素子は紙面に平行に配列されている。

この状態においては、リニアＣＣＤ３１８は、センサー１００に形成した何れか１の測定セルに由来するＳＰＲシグナル像４００を観測している。ステージ３２２を光焦点の焦点軸方向に移動させることにより、順次異なる測定セルに由来
するＳＰＲシグナル像４００を観察できる。

本測定装置の測定原理はプラズモン共鳴現象を光強度で測定するものである。図４にプラズモン共鳴現象により観測されるＳＰＲシグナルを示す。共鳴の起きているＳＰＲ角度でリニアＣＣＤ出力信号強度は大きい吸収ピークを示す。測定においては、特定のＳＰＲ角度をモニタする様にＳＰＲ角度ｉの位置にリニアＣＣＤを設置して、ＳＰＲシグナルを測定する。測定セル１１８ａ〜１１８ｘ内の試料に応じてＳＰＲ角度が変化し、このためＳＰＲシグナルがi〜iiiの方向に変化する。この場合、リニアＣＣＤの設置位置は特定角度に対応する位置に固定されているため、リニアＣＣＤを照射する光強度は変化しその結果リニアＣＣＤの出力信号はa〜ｃのように変化する。このように、リニアＣＣＤ信号強度と測定試料との関連づけができる。

本装置はリニアＣＣＤの共鳴角度に対応する方向へのスライド動作および９０度回転動作を可能とするステージ３２２を備えている。図１の状態で、リニアＣＣＤを紙面に垂直な面内において９０度回転させることにより、図３に示すような従来のＳＰＲ光学配置を実現することができる。 更に、この状態（リニアＣＣＤ３１８の受光素子の配列方向が紙面に平行）でステージを紙面に垂直方向に移動させることにより、特定試料セルに対応するＳＰＲシグナルの全体を観察することが出来る。

図５は、本装置の異なる形態を示すものである。この場合は、凹レンズ３２４をリニアＣＣＤ３１８の前面の光路に配置し、反射光を発散させることにより、ＳＰＲシグナルの角度分解能を向上させている。

次に、上記測定装置を用いて任意の試料を測定する場合につき説明する。

本装置を用いる測定に於いては、リファレンス用測定セルと各試料用測定セルとの差信号を計測することが好ましい。この場合は、先ず、多点同時測定を開始するにあたって、リファレンス用測定セルを例えば図２に示す１１８ａとし、図１に示すようにリニアＣＣＤ３１８を線焦点と直交する方向（矢印Ｘ方向）にその位置を微調整してリファレンスＳＰＲシグナルの最深部を探す。

この最深部のＳＰＲシグナル強度と、他の試料測定セルからのＳＰＲシグナル強度との差信号を出力することにより、Ｓ／Ｎ日の高い信号を得ることができる。

最深部の決定は、図１に示すように、ＳＰＲシグナルの状態をアイピース３２０により観察することにより可能となる。

図６はアイピースにより測定開始前のリファレンスのＳＰＲシグナルの最深部にリニアＣＣＤの位置を調整する状態を示している。図６中の四角印はＳＰＲシグナルの各セルの最深部を示している。レファレンスとなる試料のＳＰＲシグナルの最深部ＤをリニアＣＣＤ３１８の受光素子に一致させるようにステージを移動させる。図６（ａ）は最深部Ｄが受光素子の左側に偏っている状態、（ｂ）は最深部Ｄが受光素子に一致している状態、（Ｃ）は最深部Ｄが受光素子の右側に偏っている状態を示している。この調整後、レファレンスと各試料セルとの差信号を測定する。

実施例１ ５チャンネルマルチセンサーの製造
マルチセンサーを次に述べる順序に従って製造した。

１）光学顕微鏡用の16mm角、厚さ0.1mmのカバーガラスに5nmのCrを蒸着した後、更にこの上にAuを45nmの厚さで蒸着して金基板を作成した。

２）次に，16mm角，厚さ1mmのサカセ化学製粘着製シリコンシートの中心12 x 12 mmの領域の中心線上に直径が1mmの孔をその中心間の距離を2.5mmとして貫通させて、5ケの孔を持つセンサーセル支持体を作成した。

３）金基板上に２）で作成したセンサーセル支持体を光学的に密着させた後、その1mmφの溝に、マイクロ試料サンプリング用として吸湿性マイクロ微粒子（ダイヤポリマー株式会社製 商品名 アクアパール）を一定量充満させて、前記孔で構成する５個の測定セルを持つ5チャンネルマルチセンサーセルを構築した。その概略を図７に示した。

図１に示す表面プラズモン共鳴現象測定装置に上記作成した5チャンネルマルチセンサーを取りつけ、純水と濃度の異なるスクロース水溶液とをセンサーの各測定セルに加えた。

先ず、純水の測定セルのＳＰＲシグナルを用いて、図３に示すように、第２光学系の受光素子の配列方向を線焦点の軸方向と直交する（従来の角度情報をとる事の出来る光学配置）方向にしてＳＰＲが起きていることを確認した後、その最深部の角度に受光素子を固定した。

次に、ステージを回転することによりリニアＣＣＤ受光素子を90度回転させ、マルチチャンネルセンサのＳＰＲシグナルに基づく反射光を2048pixelのリニアＣＣＤ受光素子で測定した。プリズムとマルチチャンネルセンサとの光整合は，PVC光インターフェイス膜を用いて行った。

5個の測定セルには、ブランク，2, 4, 6, 8 % のスクロース溶液をマイクロピペットを用いて加えた。

得られたＳＰＲ強度と濃度のグラフを図８に示した。図から明らかな様に、濃度の異なるスクロースによって各チャンネルで起ったＳＰＲに基づく反射光をリニアＣＣＤ受光素子が重相関係数0.995の確かさで正しく検出していること分かる。この結果から、従来基本的に単成分測定であったＳＰＲ計測のリアルタイム・マルチチャンネル同時計測ができることが明らかである。

本発明プラズモン共鳴現象測定装置の一例を示す概略構成図である。 リニアＣＣＤと、測定セルとの位置関係を示す説明図である。 図１に於いて、ステージを９０度回転させた状態を示す説明図である。 本測定装置の検出原理を示すグラフである。 本発明プラズモン共鳴現象測定装置の他の例を示す概略構成図である 本発明プラズモン共鳴現象測定装置のレファランス位置を合わせる状態の説明図で、（ａ）は位置が左より、（ｂ）は位置が良好な状態、（ｃ）配置が右よりの状態を示す。 実施例１に於いて用いたセンサーの形状を示す（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図である。 実施例１において本発明プラズモン共鳴現象測定装置で得られたリニアＣＣＤの受光素子信号強度と、スクロースの濃度の関係を示すグラフである。

符号の説明

１００ センサー
１１２ プリズム
１１４ ガラス板
１１６ 金属薄膜
１１８ 試料測定セル
１１８ａ、１１８ｂ、・・・１１８ｘ 測定セル
２００ 第１光学系
１ レンズ
２、３ シリンドリカルレンズ
４ 光源
３１６ リニアＣＣＤ受光素子
３００ 第２光学系
３０８ 平行反射光
３１０ 偏光子
３１２ ハーフミラー
３１４ 反射板
３１６ スリット
３１８ リニアＣＣＤ
３１９ 受光素子
３２０ アイピース
３２２ ステージ
４００ ＳＰＲシグナル像

Claims (3)

1. （１）プリズム表面の金属膜上に複数の測定セルを一列に形成したセンサーと、
   （２）光源と、
   （３）光源の照射光を前記センサーに形成した複数の測定セルに線焦点を結ばせてプラズモン共鳴角を含む入射角で照射する第１光学系と、
   （４）センサーの放出する反射光を平行反射光に変換する第２光学系と、
   （５）線焦点の焦点軸方向とリニアＣＣＤの受光素子の配列方向とを平行にして配設すると共に、平行反射光の光軸方向垂直面内を移動する手段及び平行反射光の光軸回りを９０度回動する手段を有するステージに取りつけられたリニアＣＣＤと、
   を有する表面プラズモン共鳴現象測定装置。
2. （１）プリズム表面の金属膜上に複数の測定セルを一列に形成したセンサーと、
   （２）光源と、
   （３）光源の照射光を前記センサーに形成した複数の測定セルに線焦点を結ばせてプラズモン共鳴角を含む入射角で照射する第１光学系と、
   （４）センサーの放出する反射光を平行反射光に変換すると共に、前記平行反射光中に設けたハーフミラーと、平行反射光が入射するリニアＣＣＤの前面に設けた反射板であってリニアＣＣＤの受光部の前面に沿ってスリットを有する反射板と、ハーフミラーの反射光を観測するアイピースとを備えてなる第２光学系と、
   （５）線焦点の焦点軸方向とリニアＣＣＤの受光素子の配列方向とを平行にして配設すると共に、平行反射光の光軸方向垂直面内を移動する手段及び平行反射光の光軸回りを９０度回動する手段を有するステージに取りつけられたリニアＣＣＤと、
   を有する表面プラズモン共鳴現象測定装置。
3. 第２光学系が、平行光線を発散させる凹レンズを組込んでなる請求項１又は２に記載の表面プラズモン共鳴現象測定装置。

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