JP4468638B2 - Ascofuranone antiprotozoal action-enhancing agent containing alkaloid having indole skeleton and pharmaceutical composition having antiprotozoal action containing them - Google Patents

Description

アスコフラノンの具体的製法は、下記特許文献２に記載されており、その抗腫瘍活性はすでに下記特許文献３に記載されている。また、アスコフラノン誘導体の血糖低下作用、血中脂質低下作用、グリケイション阻害作用、抗酸化作用は、下記特許文献４に記載されている。
【０００８】
トリパノソーマの呼吸系は、ミトコンドリアの呼吸が阻害されると嫌気的条件下と同様にグリセロールキナーゼの関与するグリセロール生成系によって解糖系の進行が維持される。従って、この経路を抑制するために最終生成物であるグリセロールを添加することによってアスコフラノンによる阻害効果が増大することが推測されたので以下の実験を行った。Ｔｒｙｐａｎｏsｏｍａ ｂｒｕｃｅｉｂｒｕｃｅｉのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系でグリセロールを０％、２％、５％、１０％の濃度で添加し、アスコフラノンを０〜２５０，０００ｎＭの１０段階に希釈して増殖阻害効果を検討した。その結果、グリセロール５％または１０％添加によりアスコフラノンは１５ｎＭとグリセリン無添加に比較して１／１７，０００の低濃度で致死作用を示した。アスコフラノンはグリセリンの共存下において、極めて強力な増殖阻害効果を示すことを明らかにした（非特許文献１参照）。
【０００９】
アフリカ睡眠病マウスモデルを用いてアスコフラノンの治療効果を検討した。動物実験は以下の方法で行った。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、６週齢）にＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ｂｒｕｃｅｉ を１０⁴／マウス腹腔内接種し、３日後マウス血中の原虫数が１０⁷／ｍＬ以上であることを確認した後、アスコフラノンの投与による治療を開始した。投与後の治療効果の評価は２４時間毎にマウス尾静脈血をスライドグラスに取り顕微鏡にて４００倍の倍率で検鏡し原虫の有無を確認し判定した。２０視野に原虫０のとき（−）、２０視野に原虫が１〜数匹では（＋１）、１視野に原虫が１〜２０では（＋２）、一視野に原虫が２１〜４０では（＋３）、１視野で原虫が４１以上では（＋４）とした。
【００１０】
トリパノソーマ症マウスにアスコフラノン１００ｍｇ／ｋｇを単回、筋肉内投与して治療効果を検討した。アスコフラノン投与後４日目までは＋４であったが、５日目には＋２に減少し、６、７日目は血液中から原虫は完全に消失した。しかし８日目には＋１、９日目には＋３となり，１０日目には死亡した。アスコフラノン単独投与に対してグリセロールとの併用投与の治療効果を検討した。トリパノソーマ症マウスにアスコフラノン１００ｍｇ／ｋｇとグリセロール３ｇ／ｋｇを同時に単回、筋肉内投与した。併用投与開始４日目までは血中の原虫は＋４であったが５日目以降は消失した。しかし９日目には＋１、１０日目には＋２となり、再び原虫は血中に出現した。すなわちトリパノソーマ治療にアスコフラノンとグリセロールの併用は、アスコフラノンの単独投与に比較してより有効であった（非特許文献２参照）。
【００１１】
以上の成績から、アフリカトリパノソーマ症モデルマウスの治療においては、アスコフラノン単独投与では効果は弱くグリセロールとの併用が必須であった。
グリセロールは吸入または経口摂取すると、吐き気、嘔吐、下痢を起こすおそれがある。グリセロールの急性毒性とし、ヒトで中毒症状を呈する最小投与量は１４２８ｍｇ／ｋｇであり、マウスにおける急性毒性は、腹腔内投与はＬＤ₅₀＝８９９２ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与はＬＤ₅₀＝６１９９ｍｇ／ｋｇである。本試験で使用した３０００ｍｇ／ｋｇはヒトや家畜には大量であることがアスコフラノンをアフリカトリパノソーマ症の治療薬として実用化するための障害となっていた。
【００１２】
【特許文献１】
特開平９−１６５３３２号公報
【特許文献２】
特公昭５６−２５３１０号公報
【特許文献３】
特公昭６３−６１９２９号公報
【特許文献４】
特開平７−２０６８３８号公報
【非特許文献１】
モレキュラー アンド バイオケミカル パラシトロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ）８１：１２７−１３６．１９９６
【非特許文献２】
パラシトロジー インターナショナル（Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ） ４７：１３１−１３７．１９９８
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、アスコフラノンをアフリカトリパノソーマ症等の原虫によって惹起される疾患の治療薬として実用化するために鋭意研究を重ねた結果、インドール骨格を有するアルカロイドをアスコフラノンとともに使用することにより、アスコフラノンの抗原虫作用を大幅に増強することを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成した。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、インドール骨格を有するアルカロイドを含むことを特徴とするアスコフラノンの抗原虫作用増強剤を提供する。
また、本発明は、アスコフラノンおよびインドール骨格を有するアルカロイド、並びに薬剤学的に許容される担体を含む抗原虫作用を有する薬剤組成物を提供する。
さらに、本発明は、アスコフラノンを含む抗原虫剤の製造におけるインドール骨格を有するアルカロイドの使用を提供する。
加えて、本発明は、有効量のアスコフラノンおよびインドール骨格を有するアルカロイドを、投与を必要とするヒトまたはヒト以外の動物に投与することを含む、原虫によって惹起される疾患を予防または治療する方法を提供する。
さらに、本発明は、アスコフラノンおよびインドール骨格を有するアルカロイド、並びに使用説明書を含む、原虫によって惹起される疾患を予防または治療するためのキットを提供する。
本発明において使用されるインドール骨格を有するアルカロイドとしては、例えば、下記の化合物を例示することができる。
【化７】

上記各化合物の化合物名を以下に記す。
ＴＯＡ−１：1,2-dimethyl-3-ethyl-12H-pyrido[2,1-a] β-carbolin-5-ium
ＴＯＡ−２：1-ethyl-2,3-dimethyl-12H-pyrido[2,1-a] β-carbolin-5-ium
ＴＯＡ−５：1,2-dimethyl-11H-pyrrolo[2,1-a] β-carbolin-5-ium
ＴＯＡ−６：11H-[1,2,4]-triazole[3,4-b]β-carboline
ＴＯＡ−７：picrasiden G
ＴＯＡ−１０：1,2-dimethyl-3-propyl-12H-pyrido[2,1-a] β-carbolin-5-ium
ＴＯＡ−１１：1,3-dimethyl-2-propyl-12H-pyrido[2,1-a] β-carbolin-5-ium
ＴＯＡ−１２：1,2,3-trimethyl-3-ethyl-12H-pyrido[2,1-a] β-carbolin-5-ium
ＴＯＡ−１３：2,3-diethyl-12H-pyrido[2,1-a] β-carbolin-5-ium
ＴＯＢ−３：1-formyl-β-carboline
ＴＯＢ−７：benzalharman
ＴＯＢ−８：n-propyl harman-3-carboxylate
ＴＯＢ−９：methyl 1-(4-bromophenyl)-β-caroline-3-carboxylate
ＴＯＢ−１０：4-methoxy-1-vinyl-β-carboline
ＴＯＢ−１２：1-(3-hydroxyethyl)-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline
ＴＯＢ−２０：methyl 1-(4-chlorophenyl)-β-caroline-3-carboxylate
ＴＯＢ−２１：n-propyl-β-carboline-3-carboxylate
あるいは1-(4-bromophenyl)-β-caroline-3-carboxylic acid methyl ester
ＴＯＢ−２２：isopropyl-β-caroline-3-carboxylate
上記化合物は高い融点を有しており、例えば、ＴＯＡ−１，２，６，１０，１１，１２，１３の融点 は、３００度Ｃ以上、ＴＯＢ−２１の融点は１８７−１８８度Ｃ、ＴＯＢ−２２の融点は２１１−２１２度Ｃである。
上記化合物はいずれも公知であり、例えば、ＴＯＢ−３，ＴＯＢ−５，ＴＯＢ−７，ＴＯＢ−１０については下記の文献に記載されている。
ＴＯＢ−３：K. Koike and T. Ohmoto, Chem.Pharm.Bull., 32(9), 3579-3583 (1984).
ＴＯＡ−５：H.Yoshino、K.Koike,T.Nikaido,Heterocycles,51(2),281-293(1999)
ＴＯＢ−７：最初の合成報告はH.R.Synder et al., JACS, 70, 219 (1948).
ＴＯＢ−７の原報：K. Koike and T. Ohmoto, Chem.Pharm.Bull., 35(8), 3305-3308, (1987).
ＴＯＢ−１０：T. Ohmoto and K. Koike, Chem.Pharm.Bull., 31(9), 3198-3204 (1983).
なお、本発明で使用されるインドール骨格を有するアルカロイドは、天然物由来のものであっても、合成物であってもよい。
【００１５】
【発明の実施の形態】
アスコフラノンの実用化を考えたとき、少量の投与でアスコフラノンと併用効果を示すグリセロールに代わる薬剤を見いだすことが必須であることが明らかになった。そこで、発明者等はグリセロールの標的であるグリセロールキナーゼの阻害剤を探索するためのスクリーニング系を確立した。確立した探索系は、グリセロール−３リン酸とＡＤＰからグリセロールキナーゼによってグリセロールが生成する時に生ずるＡＴＰをルシフェリン−ルシフェラーゼの系で測定し、ＡＴＰアナライザーとマイクロプレートを用いて迅速にスクリーニングを行うことが可能である。
【００１６】
次に本発明者等は、開発した系を用いてグリセロールキナーゼ阻害剤を探索した。対照としたのはニガキ科植物に属し化学構造が明らかになっている天然物である。ニガキ科植物に含まれる主な成分は、β−ｃａｒｂｏｌｉｎｅあるいはｃａｎｔｈｉｎ−６−ｏｎｅ骨格を有するアルカロイドと苦味の本体である変形トリテルペノイドのクアシノイドである。ニガキ科植物は、世界各地の伝承医学あるいは民間伝承の中で悪性腫瘍、マラリアをはじめとする感染症、発熱、胃腸疾患の治療に使われている。
【００１７】
ニガキ科植物に存在することが明らかにされているアルカロイド７３化合物のうち、インドール骨格を有する化合物単独のグリセロールキナーゼ阻害効果を段落番号［００１１］に記載したスクリーニング系に各々終濃度２５μＭ添加して残存活性を測定して検索した。またアスコフラノンとの併用効果は段落番号［０００７］に記載したＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ｂｒｕｃｅｉの培養系にアスコフラノン４ｎＭに１８化合物を５００−０．２４μＭまでの２倍希釈系列を作成し２４時間培養した後、原虫数を測定することで５０％有効濃度ＥＤ₅₀を求めた。その結果インドール骨格を有するアルカロイド、ＴＯＢ−７、ＴＯＢ−８、ＴＯＢ−１２、ＴＯＢ−２１、ＴＯＡ−６、ＴＯＡ−７を選択し、動物実験において効果が得られるかを検討した。
【００１８】
トリパノソーマ症マウスモデル（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ｂｒｕｃｅｉ 接種 ＢＡＬＢ／ｃマウス）にアスコフラノン１００ｍｇ／ｋｇと、段落番号［００１２］で選択したの６化合物を３投与量（１００ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ）にて、単回筋肉内に併用投与してマウスにおける治療効果を検討した。その結果、６化合物にはＴＯＢ−２１を除いて血液中の原虫の減少または消失がみられた。以上の成績から、インドール骨格を持つアルカロイドはアスコフラノンとの併用によって、アフリカ睡眠病において延命または治療効果を奏することが明らかになった。
【００１９】
本発明において使用されるアスコフラノンには、光学異性体が存在するが、それぞれの光学異性体、およびそれらの混合物は全て本発明に含まれる。本発明の薬剤組成物としてはいずれを用いてもよい。 アスコフラノンは遊離の形で用いてもよいが、塩基と塩を形成するので塩の形で用いることもできる。塩を形成する塩基としては、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、アンモニア、トリエチルアミンなどが挙げられる。
インドール骨格を持つアルカロイドとしては特に限定されないが、例えば、上に挙げた１８種類のアルカロイドから１種若しくは２種以上を用いることができる。また、インドール骨格を持つアルカロイドは天然物でも合成品でもよく天然物の場合、その由来はニガキ科植物に限定されない。これらのアルカロイドは遊離の形で用いてもよいが、酸との塩の形で用いることもできる。塩を形成する酸としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、燐酸などの無機酸、および酢酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トロフルオロ酢酸などの有機酸が挙げられる。かかる塩としては、例えば、上記インドールアルカロイドのブロマイドが挙げられる。
【００２０】
インドール骨格を持つアルカロイドおよびアスコフラノンを含む本発明の薬剤組成物は、１種もしくはそれ以上の薬剤学的に許容し得る担体を含む薬剤組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。
本発明で使用する担体としては、医薬品製造の技術分野で周知である任意の添加剤を使用することができる。そのような担体として、賦形剤、希釈剤、湿潤剤、懸濁剤、乳化剤、分散剤、補助剤、甘味剤、着色剤、風味剤、緩衝剤、防腐剤、保存剤、緩衝剤、結合剤、安定化剤等が例示され、目的とする剤形に応じて周知慣用の担体から必要なものを選択することができる。例えば、インドール骨格を持つアルカロイドの酸との塩およびアスコフラノンの塩基との塩を水に溶解したり、懸濁剤、賦形剤および・またはその他の担体と混合して経口投与に適する剤形として製剤化することができる。なお、賦形剤または補助剤としては、例えば、乳糖、種々のデンプン（例えば、トウモロコシデンプン）、ブドウ糖、スクロース、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸塩、タルク、植物油（例えば、大豆油、ラッカセイ油。オリーブ油）、レシチン等が挙げられる。
なお、本発明の薬剤組成物は、グリセロールを含有してもよい。添加するグリセロールの量は、必要に応じて適宜調節することができる。
【００２１】
本発明の薬剤組成物は、一般的に、経口で、例えば、錠剤、カプセル剤、液剤の形態で投与することができる。しかし、投与は直腸から、例えば、座薬として投与して投与してもよい。さらに、非経口で、例えば、注射剤として投与してもよい。インドール骨格を持つアルカロイドおよびアスコフラノンの投与は、これらの活性物質を、錠剤やカプセル剤などの単一の投与剤形中に混在して含有する製剤の形態または各成分が異なる層に存在する多層状の製剤の形態で行うことができる。あるいは、これらの活性物質を別々に、単位投与形態の組合せ製剤として、同時にまたは時間差をおいて投与することも可能である。
本発明化合物の投与量は、対象となる患者（ヒト）またはヒト以外の動物の体型、年齢、体調、疾患の度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができる。例えば、ヒトに対する経口投与の場合の体重１ｋｇ当りの１日量は、アスコフラノンについては１００〜５００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、インドール骨格を持つアルカロイドについては、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである（食後３回投与）。また、非経口投与（静注、筋注、皮下注）の場合には、アスコフラノンについては２５〜１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、インドール骨格を持つアルカロイドについては、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で使用される。さらに、座薬の場合には、アスコフラノンについては１．０〜２．０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、インドール骨格を持つアルカロイドについては、０．０５〜１．０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で使用される。
【００２２】
【実施例】
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、これは本発明を何ら限定するものではない。
【００２３】
【実施例１】
ＡＤＰとグリセロール−３リン酸に組み換えグリセロールキナーゼを加えて反応を開始し、生成したＡＴＰをルシフェラーゼ法で測定する系に、上記１８種のインドール骨格を有するアルカロイド２５μＭを添加してグリセロールキナーゼ阻害作用を検討した。結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】

【００２５】
実施例１において用いた天然物の構造式は以下のとおりである。
【００２６】
【化８】

【００２７】
表１に示すようにＴＯＢ−７、ＴＯＢ−８、ＴＯＢ−１２、ＴＯＢ−２１、ＴＯＡ−６、ＴＯＡ−７に特に強いグリセロールキナーゼ阻害効果が認められた。
【００２８】
【実施例２】
Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ｂｒｕｃｅｉの培養系にアスコフラノン４ｎＭ と５００〜０．２４μＭの濃度の１８種類のアルカロイドとを併用添加した際における増殖阻害作用を検討した。結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】

【００３０】
ＴＯＢ−９、ＴＯＢ−２１、ＴＯＡ−２、ＴＯＡ−５、ＴＯＡ−１１を除いていずれの化合物もＥＤ₅₀は１０μＭ以下であったが、細胞毒性（マウス白血病細胞株Ｐ−３８８における５０％生育阻害濃度）の成績を考慮して、ＴＯＢ−７、ＴＯＢ−８、ＴＯＢ−１２、ＴＯＢ−２１、ＴＯＡ−６、ＴＯＡ−７の６化合物を選択して動物実験を行った。
【００３１】
【実施例３】
トリパノソーマ症マウスに１００ｍｇ／ｋｇのアスコフラノンと５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇのＴＯＢ−１２、ＴＯＢ−７、ＴＯＢ−２１、ＴＯＢ−８、ＴＯＢ−６、ＴＯＢ−７を各２匹に単回、筋肉内投与し１０日間観察した。この間、毎日、尾静脈血をスライドグラスに取り光学顕微鏡４００倍にて鏡検し、原虫の数が２０視野で０の場合（−）、２０視野に原虫１匹〜数匹場合（＋１）、１視野に原虫が１〜２０匹の場合（＋２）、１視野に原虫２１ 〜４０匹の場合（＋３）、１視野に原虫４１以上の場合（＋４）とした。結果を表３に示す。
【００３２】
【表３】

【００３３】
トリパノソーマ症マウスにおけるアスコフラノン１００ｍｇ／ｋｇとグリセロール３０００ｍｇ／ｋｇの併用投与により、原虫は５日目から８日目までは血中から消失したが、９日目には＋１，１０日目には＋２と再び出現した。ＴＯＢ−７投与では６日目から原虫は消失し、１０日目まで出現しなかった。ＴＯＡ−７投与では５日目または６日目から９日目までは原虫は消失したが１０日目には＋１と再び出現した。すなわちアスコフラノンにＴＯＢ−７（ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ）、またはＴＯＡ−７（ｐｉｃｒａｓｉｄｉｎｅ−Ｇ）併用投与によってグリセロールの１／３０または１／６０の投与量で同等またはそれ以上の効果が認められた。
【００３４】
【実施例４】
トリパノソーマ症マウスに治療開始後１日と６日目にアスコフラノン単独並びにＴＯＢ−７（ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ）またはＴＯＡ−７（ｐｉｃｒａｓｉｄｉｎｅ−Ｇ）と併用、筋肉内投与し、薬物の複数回投与の効果を検討した。結果を表４に示す。
【００３５】
【表４】

【００３６】
表４に示すようにアスコフラノン単独、２回投与では５日目までは＋４であったが６−８日目まで原虫は血中から消失した。しかし９日目は＋１、１１日目は＋４であった。ＴＯＢ−７との併用では６日目以降１１日目まで原虫は血中から消失した。またＴＯＡ−７でも６日目から９日目まで消失し、１１日目でも＋１であった。すなわちＴＯＢ−７、またはＴＯＡ−７との併用は複数回投与でより効果的であることが明らかになった．
【００３７】
【実施例５】
トリパノソーマ症マウスにアスコフラノン単独またはアスコフラノンとＴＯＡ−７（ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ）、ＴＯＢ−７（ｐｉｃｒａｓｉｄｉｎｅ−Ｇ）との併用、２日間、３日間連続筋肉内投与し薬物の連続投与の効果を検討した。結果を表５に示す。
【００３８】
【表５】

【００３９】
アスコフラノン１００ ｍｇ／ｋｇとＴＯＢ−７（ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ）１５０ｍｇ／ｋｇを、３日間連続投与することによって、治療開始５日目以降は原虫が長期にわたって血中から消失し治癒した。
【００４０】
アスコフラノンは新規抗トリパノソーマ薬として研究してきたが、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ｂｒｕｃｅｉにおいてアスコフラノン１回の投与で感染マウスを治癒するには多量のグリセロールを併用する必要があった。今回、グリセロールの標的となる酵素であり、アスコフラノン投与時のエネルギー代謝において重要な役割を果たすグリセロールキナーゼ（ＧＫ）に注目した。より高い薬効と実用性を得るため、グリセロールに代わるＧＫの阻害剤の探索を行った結果、インドールアルカロイドであるＴＯＢ−７（ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ）、ＴＯＡ−７（ｐｉｃｒａｓｉｄｉｎｅ−Ｇ）等を得た。ＧＫ阻害剤と併用することでアスコフラノンの効果が高まることが証明され、ＴＯＢ−７（ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ）を三日間、アスコフラノンと併用投与することによって、１００％治癒するという結果が得られた。これは、アスコフラノン単独で三日間投与した場合の３３％の治癒率に比較して目覚ましい進歩である。
上述のように、インドール骨格を持つアルカロイドおよびアスコフラノンを含む本発明の薬剤組成物は、１種もしくはそれ以上の薬剤学的に許容し得る担体を含む薬剤組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。例えば、錠剤として使用する場合には、次のような処方例が挙げられる。
錠剤の処方例
アスコフラノン １０ｍｇ
ＴＯＢ−７（ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ） １０ｍｇ
無水ラクトース ３４ｍｇ
微結晶セルロース ２５ｍｇ
ポリビニルピロリドン ２０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １ｍｇ
アスコフラノン、ＴＯＢ−７、無水ラクトース、微結晶セルロースおよびポリビニルピロリドンを混合し、篩にかけた。混合物を湿潤粒状化し、乾燥し、篩にかけた。篩にかけた顆粒をステアリン酸マグネシウムと混合し、プレスして卵形の錠剤核にした。
【００４１】
【発明の効果】
上述のように、本発明によれば、これまで治癒率が低かったアフリカトリパノソーマ症等の原虫によって惹起される疾患をほぼ完全に予防または治療する薬剤を提供することが可能となった。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an ascofuranone antiprotozoal action-enhancing agent characterized by comprising an alkaloid having an indole skeleton, a pharmaceutical composition comprising an ascofuranone and an alkaloid having an indole skeleton, and an indole in the production of an antiprotozoal agent comprising ascofuranone Use of alkaloids having a skeleton, and methods for preventing or treating protozoan-induced diseases, comprising administering to humans or non-human animals in need of ascofuranone and indole skeleton alkaloids, and ascofuranone and The present invention relates to a kit for preventing or treating a disease caused by a protozoan, comprising an alkaloid having an indole skeleton.
[0002]
[Prior art]
African trypanosomiasis is called African sleeping sickness in humans and Nagana disease in domestic animals. It is distributed from 14 degrees north latitude to 29 degrees south latitude in the sub-Saharan Desert and is mediated by the fly fly. African sleeping sickness is caused by infection with Trypanosoma protozoa, and it is said that 200,000 to 300,000 new patients develop each year. However, the number of patients with African sleeping sickness is currently uncertain due to the low reliability of the survey data. According to WHO, at least 150,000 people died in 1996, and more than 100,000 people are said to have sequelae. Furthermore, the damage to livestock called Nagana disease is even greater, with hundreds of thousands of cows dying every year that should serve as a protein source for people. In addition, the savanna of about 10 million square kilometres, which is comparable to the United States, has been unable to livestock for trypanosomes. As such, African sleeping sickness has significantly hampered the health and economic development of African people, and WHO is listed as one of the infectious diseases to be controlled.
[0003]
African sleeping sickness is a protozoal infection caused by trypanosomes mediated by the fly fly, and the protozoa appear in the bloodstream around 10 days after infection. In the early stages of infection, protozoa grow in the bloodstream and progress with fever, fatigue, headache, muscle and joint pain, and pruritus. At the beginning of the chronic phase, the central nervous system is invaded and symptoms such as mental confusion and generalized convulsions occur, eventually falling into lethargy and dying.
[0004]
For treatment of African sleeping sickness, pentamidine, meralsoprole, eflornithine and the like were used, and in the 1960s, there was a feeling that it could be eradicated. However, these drugs are old and their effectiveness is gradually declining. In particular, resistance to the arsenic agent melalsoprol has become a major problem, and the ineffective patients are only waiting for death.
[0005]
Trypanosoma lives mainly in the bloodstream in the human body. This blood flow type energy metabolism depends on a glycolysis system performed in a protozoan-specific organelle called a glycosome, and so-called oxidative phosphorylation in mitochondria does not function. However, in order to efficiently drive this glycolysis system, re-oxidation of the produced NADH is necessary, and the mitochondrial glycerol-3-phosphate oxidation system plays an important role in this. This terminal oxidase of the oxidation system functions as a quinol oxidase using reduced ubiquinone as an electron donor, and has properties that are significantly different from the aerobic respiratory cytochrome oxidase of the host. Of particular note is that this terminal oxidase is insensitive to cyanide, which rapidly inhibits the host cytochrome oxidase. So far, many researchers, mainly in Europe and the United States, have tried to develop drugs targeting this cyanide-resistant oxidase, but no effective drugs with high selective toxicity have been obtained.
[0006]
Under such circumstances, the present inventors have identified isoprenoid physiologically active substances ascochlorin, ascofuranone and derivatives thereof, in particular, ascofuranone is specific to trypanosoma glycerol-3-phosphate oxidation system at an extremely low concentration of nM order. Have been found to be obstructive, and applied for a patent (see Patent Document 1).
[0007]
Specifically, Trypanosoma bruceibrusi parasites grown in the bloodstream of rats were mechanically disrupted with glass beads, and ascochlorin and ascofuranone against glycerol-3-phosphate-dependent respiration in mitochondrial preparations prepared by centrifugal fractionation And the inhibitory effect on their derivatives. The absolute amount of 50% inhibition is ascofuranone relative to 48,600 pmol / mg protein of antimycin A3 known as an inhibitor of Q cycle, 21,500 pmol / mg protein of myxothiazole, and 18,600 pmol / mg protein of stigmateline Showed an inhibitory effect at a very low concentration of 25 pmol / mg protein. Ascofuranone is an isoprenoid antibiotic represented by the following formula.
[Chemical 6]

A specific production method of ascofuranone is described in Patent Document 2 below, and its antitumor activity has already been described in Patent Document 3 below. Further, the blood glucose lowering action, blood lipid lowering action, glycation inhibiting action, and antioxidant action of ascofuranone derivatives are described in Patent Document 4 below.
[0008]
In the trypanosome respiratory system, when mitochondrial respiration is inhibited, the progress of glycolysis is maintained by the glycerol production system involving glycerol kinase, as in anaerobic conditions. Therefore, it was presumed that the inhibitory effect by ascofuranone was increased by adding glycerol which is the final product in order to suppress this pathway, so the following experiment was conducted. Glycerol was added at a concentration of 0%, 2%, 5%, and 10% in an in vitro culture system of Trypanosoma bruceibrucei, and ascofuranone was diluted in 10 stages from 0 to 250,000 nM to examine the growth inhibitory effect. As a result, when 5% or 10% glycerol was added, Ascofuranone exhibited a lethal action at a concentration of 15 nM and 1 / 17,000 lower than that without glycerol. It has been clarified that ascofuranone exhibits a very strong growth inhibitory effect in the presence of glycerin (see Non-Patent Document 1).
[0009]
The therapeutic effect of ascofuranone was examined using an African sleep disease mouse model. The animal experiment was performed by the following method. Mice (C57BL / 6, 6 weeks old) with 10 Trypanosoma brucei brucei^Four/ Inoculate mouse intraperitoneally, and after 3 days, the number of protozoa in mouse blood is 10⁷After confirming that the amount was not less than / mL, treatment with ascofuranone was started. Evaluation of the therapeutic effect after administration was made by taking mouse tail vein blood every 24 hours on a slide glass and examining it with a microscope at a magnification of 400 times to confirm the presence or absence of protozoa. When protozoa is 0 in 20 fields (−), 1 to several protozoa in 20 fields (+1), 1 to 20 protozoa in field 1 (+2), 21 to 40 protozoa in field 1 (+3) When the number of protozoa was 41 or more in one visual field, it was set as (+4).
[0010]
Ascofuranone 100 mg / kg was administered intramuscularly to trypanosomiasis mice and the therapeutic effect was examined. Although it was +4 until the 4th day after the administration of ascofuranone, it decreased to +2 on the 5th day, and the protozoa completely disappeared from the blood on the 6th and 7th days. However, it was +1 on the 8th day, +3 on the 9th day, and died on the 10th day. The therapeutic effect of combined administration with glycerol was examined against ascofuranone alone. Ascofuranone 100 mg / kg and glycerol 3 g / kg were simultaneously administered intramuscularly to trypanosomiasis mice. The protozoa in the blood was +4 until day 4 after the start of combined administration, but disappeared after day 5. However, it was +1 on the 9th day and +2 on the 10th day, and the protozoa appeared again in the blood. That is, the combined use of ascofuranone and glycerol for trypanosoma treatment was more effective than single administration of ascofuranone (see Non-Patent Document 2).
[0011]
From the above results, in the treatment of African trypanosomiasis model mice, the effect of ascofuranone alone was weak and the combined use with glycerol was essential.
Glycerol may cause nausea, vomiting, and diarrhea if inhaled or taken orally. The minimum dose that causes acute toxicity of glycerol and causes toxic symptoms in humans is 1428 mg / kg, and acute toxicity in mice is₅₀= 8992 mg / kg, intravenous administration is LD₅₀= 6199 mg / kg. The amount of 3000 mg / kg used in this study was large for humans and livestock, which was an obstacle to the practical use of ascofuranone as a therapeutic drug for African trypanosomiasis.
[0012]
[Patent Document 1]
JP-A-9-165332
[Patent Document 2]
Japanese Patent Publication No.56-25310
[Patent Document 3]
Japanese Patent Publication No. 63-61929
[Patent Document 4]
JP 7-206838 A
[Non-Patent Document 1]
Molecular and Biochemical Parasitology 81: 127-136.1996
[Non-Patent Document 2]
Parasitology International 47: 131-137.1998
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
As a result of intensive research for practical application of ascofuranone as a therapeutic agent for diseases caused by protozoa such as African trypanosomiasis, the use of alkaloids having an indole skeleton together with ascofuranone It was found that the antiprotozoal action of ascofuranone was greatly enhanced, and the present invention was completed based on this finding.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention provides an ascofuranone antiprotozoal action enhancer comprising an alkaloid having an indole skeleton.
The present invention also provides a pharmaceutical composition having an antiprotozoal action comprising an alkaloid having an ascofuranone and an indole skeleton, and a pharmaceutically acceptable carrier.
Furthermore, the present invention provides the use of an alkaloid having an indole skeleton in the manufacture of an antiprotozoal agent comprising ascofuranone.
In addition, the present invention provides a method for preventing or treating a disease caused by a protozoa, comprising administering an effective amount of an alcoloid having an ascofuranone and an indole skeleton to a human or non-human animal in need thereof. I will provide a.
Furthermore, the present invention provides a kit for preventing or treating a disease caused by protozoa, comprising an alkaloid having an ascofuranone and an indole skeleton, and instructions for use.
Examples of the alkaloid having an indole skeleton used in the present invention include the following compounds.
[Chemical 7]

The compound name of each said compound is described below.
TOA-1: 1,2-dimethyl-3-ethyl-12H-pyrido [2,1-a] β-carbolin-5-ium
TOA-2: 1-ethyl-2,3-dimethyl-12H-pyrido [2,1-a] β-carbolin-5-ium
TOA-5: 1,2-dimethyl-11H-pyrrolo [2,1-a] β-carbolin-5-ium
TOA-6: 11H- [1,2,4] -triazole [3,4-b] β-carboline
TOA-7: picrasiden G
TOA-10: 1,2-dimethyl-3-propyl-12H-pyrido [2,1-a] β-carbolin-5-ium
TOA-11: 1,3-dimethyl-2-propyl-12H-pyrido [2,1-a] β-carbolin-5-ium
TOA-12: 1,2,3-trimethyl-3-ethyl-12H-pyrido [2,1-a] β-carbolin-5-ium
TOA-13: 2,3-diethyl-12H-pyrido [2,1-a] β-carbolin-5-ium
TOB-3: 1-formyl-β-carboline
TOB-7: benzalharman
TOB-8: n-propyl harman-3-carboxylate
TOB-9: methyl 1- (4-bromophenyl) -β-caroline-3-carboxylate
TOB-10: 4-methoxy-1-vinyl-β-carboline
TOB-12: 1- (3-hydroxyethyl) -1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline
TOB-20: methyl 1- (4-chlorophenyl) -β-caroline-3-carboxylate
TOB-21: n-propyl-β-carboline-3-carboxylate
1- (4-bromophenyl) -β-caroline-3-carboxylic acid methyl ester
TOB-22: isopropyl-β-caroline-3-carboxylate
The above compound has a high melting point. For example, the melting point of TOA-1,2,6,10,11,12,13 is 300 degrees C or higher, the melting point of TOB-21 is 187-188 degrees C, TOB The melting point of -22 is 211-212 degrees C.
All of the above compounds are known, and for example, TOB-3, TOB-5, TOB-7, and TOB-10 are described in the following documents.
TOB-3: K. Koike and T. Ohmoto, Chem. Pharm. Bull.,32(9), 3579-3583 (1984).
TOA-5: H. Yoshino, K. Koike, T. Nikaido, Heterocycles, 51 (2), 281-293 (1999)
TOB-7: The first synthesis report is H.R. Synder et al., JACS, 70, 219 (1948).
Original report of TOB-7: K. Koike and T. Ohmoto, Chem. Pharm. Bull.,35(8), 3305-3308, (1987).
TOB-10: T. Ohmoto and K. Koike, Chem. Pharm. Bull.,31(9), 3198-3204 (1983).
The alkaloid having an indole skeleton used in the present invention may be derived from a natural product or a synthetic product.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
When considering the practical application of ascofuranone, it became clear that it was essential to find an alternative to glycerol that showed the effect of concomitant use with ascofuranone in small doses. Accordingly, the inventors established a screening system for searching for an inhibitor of glycerol kinase, which is a target of glycerol. The established search system can measure ATP generated when glycerol is produced from glycerol-3-phosphate and ADP by glycerol kinase using a luciferin-luciferase system, and can be rapidly screened using an ATP analyzer and a microplate. It is.
[0016]
Next, the present inventors searched for a glycerol kinase inhibitor using the developed system. The control was a natural product belonging to the family Nigellaceae and whose chemical structure has been clarified. The main components contained in the oyster family are alkaloids having a β-carboline or canthin-6-one skeleton and quasinoids of modified triterpenoids, which are bitter bodies. Oxidaceae plants are used to treat malignant tumors, malaria and other infectious diseases, fever, and gastrointestinal diseases in traditional medicine and folklore around the world.
[0017]
Of the alkaloid 73 compounds that have been clarified to be present in the oyster family plants, the glycerol kinase inhibitory effect of the compound having an indole skeleton alone is added to the screening system described in paragraph [0011] to a final concentration of 25 μM, respectively. The activity was measured and searched. Further, the effect of combined use with ascofuranone was obtained by cultivating a 2-fold dilution series of 18 compounds in ascofuranone 4nM to 500-0.24 μM in the culture system of Trypanosoma brucei brucei described in paragraph [0007], and culturing for 24 hours. 50% effective concentration ED by measuring the number of protozoa₅₀Asked. As a result, alkaloids having an indole skeleton, TOB-7, TOB-8, TOB-12, TOB-21, TOA-6, and TOA-7 were selected to examine whether an effect could be obtained in animal experiments.
[0018]
Trypanosomiasis mouse model (Trypanosoma brucei brucei inoculated BALB / c mice) 3 doses (100 mg / kg, 50 mg / kg, 25 mg / kg) of Ascofuranone 100 mg / kg and 6 compounds selected in paragraph [0012] Then, a single intramuscular administration was conducted to examine the therapeutic effect in mice. As a result, 6 compounds showed a decrease or disappearance of protozoa in blood except for TOB-21. From the above results, it has been clarified that alkaloids with indole skeleton prolong life or have therapeutic effects in African sleeping sickness when combined with ascofuranone.
[0019]
The ascofuranone used in the present invention has optical isomers, and each optical isomer and a mixture thereof are all included in the present invention. Any of the pharmaceutical compositions of the present invention may be used. Ascofuranone may be used in a free form, but can also be used in the form of a salt because it forms a salt with a base. Examples of the base that forms a salt include sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, ammonia, triethylamine, and the like.
Although it does not specifically limit as alkaloid which has an indole skeleton, For example, 1 type (s) or 2 or more types can be used from 18 types of alkaloid mentioned above. In addition, the alkaloid having an indole skeleton may be a natural product or a synthetic product, and in the case of a natural product, its origin is not limited to the family Nigakiaceae. These alkaloids may be used in a free form or in the form of a salt with an acid. Examples of the acid that forms a salt include inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, and phosphoric acid, and acetic acid, oxalic acid, maleic acid, fumaric acid, citric acid, tartaric acid, and methanesulfonic acid. And organic acids such as trifluoroacetic acid. Examples of such salts include the indole alkaloid bromide.
[0020]
The pharmaceutical composition of the present invention comprising an alkaloid having an indole skeleton and ascofuranone is suitable as a pharmaceutical composition comprising one or more pharmaceutically acceptable carriers depending on the intended route of administration. It can be administered in the form of The route of administration may be a parenteral route or an oral route.
As the carrier used in the present invention, any additive known in the technical field of pharmaceutical production can be used. Such carriers include excipients, diluents, wetting agents, suspending agents, emulsifying agents, dispersing agents, adjuvants, sweeteners, coloring agents, flavoring agents, buffering agents, preservatives, preservatives, buffering agents, binding agents. Agents, stabilizers and the like are exemplified, and necessary ones can be selected from well-known and commonly used carriers according to the intended dosage form. For example, a dosage form suitable for oral administration by dissolving a salt of an alkaloid acid having an indole skeleton and a salt of an ascofuranone base in water, or mixing with a suspension, excipient and / or other carrier Can be formulated as Examples of the excipient or adjuvant include lactose, various starches (for example, corn starch), glucose, sucrose, cellulose, methylcellulose, carboxymethylcellulose, magnesium stearate, lauryl sulfate, talc, vegetable oil (for example, Soybean oil, peanut oil, olive oil) and lecithin.
The pharmaceutical composition of the present invention may contain glycerol. The amount of glycerol to be added can be appropriately adjusted as necessary.
[0021]
The pharmaceutical composition of the present invention can generally be administered orally, for example, in the form of a tablet, capsule or liquid. However, administration may be administered rectally, for example as a suppository. Further, it may be administered parenterally, for example, as an injection. Administration of alkaloids with an indole skeleton and ascofuranone involves the administration of these active substances in a single dosage form such as a tablet or capsule, or in the presence of multiple components in different layers. It can be carried out in the form of a layered preparation. Alternatively, these active substances can be administered separately, as a combined preparation of unit dosage forms, simultaneously or at a time difference.
The dose of the compound of the present invention can be appropriately selected according to the body type, age, physical condition, degree of disease, elapsed time after onset, etc. of the subject patient (human) or non-human animal. For example, the daily dose per kg body weight in the case of oral administration to humans is 100 to 500 mg / kg / day for ascofuranone and 100 to 500 mg / kg / day for alkaloids having an indole skeleton (after meal 3 Multiple doses). In the case of parenteral administration (intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection), the dose of 25-100 mg / kg / day for ascofuranone and 25-100 mg / kg / day for alkaloids having an indole skeleton. used. Furthermore, in the case of suppositories, it is used at a dose of 1.0 to 2.0 mg / kg / day for ascofuranone and 0.05 to 1.0 mg / kg / day for alkaloids having an indole skeleton.
[0022]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples, but this does not limit the present invention in any way.
[0023]
[Example 1]
The reaction is initiated by adding recombinant glycerol kinase to ADP and glycerol-3-phosphate, and adding 25 μM alkaloids having 18 indole skeletons to the system that measures the generated ATP by the luciferase method. investigated. The results are shown in Table 1.
[0024]
[Table 1]

[0025]
The structural formula of the natural product used in Example 1 is as follows.
[0026]
[Chemical 8]

[0027]
As shown in Table 1, particularly strong glycerol kinase inhibitory effects were observed in TOB-7, TOB-8, TOB-12, TOB-21, TOA-6, and TOA-7.
[0028]
[Example 2]
The growth inhibitory action when Ascofuranone 4 nM and 18 kinds of alkaloids having a concentration of 500 to 0.24 μM were added to the culture system of Trypanosoma brucei brucei was examined. The results are shown in Table 2.
[0029]
[Table 2]

[0030]
Except for TOB-9, TOB-21, TOA-2, TOA-5, and TOA-11, all compounds are ED.₅₀Was 10 μM or less, but considering the results of cytotoxicity (50% growth inhibitory concentration in mouse leukemia cell line P-388), TOB-7, TOB-8, TOB-12, TOB-21, TOA- 6. Six compounds of TOA-7 were selected to conduct animal experiments.
[0031]
[Example 3]
Trypanosomiasis mice were given 100 mg / kg ascofuranone and 50 mg / kg, 25 mg / kg of TOB-12, TOB-7, TOB-21, TOB-8, TOB-6, TOB-7 once for each two mice, It was administered intramuscularly and observed for 10 days. During this time, every day, tail vein blood is taken on a slide glass and microscopically examined with an optical microscope 400 times. When the number of protozoa is 0 in 20 fields (-), 1 to several protozoa in 20 fields (+1), The case of 1 to 20 protozoa per field (+2), the case of 21 to 40 protozoa per field (+3), and the case of 41 or more protozoa per field (+4). The results are shown in Table 3.
[0032]
[Table 3]

[0033]
Ascofuranone 100 mg / kg and glycerol 3000 mg / kg were administered in combination in trypanosomiasis mice, the protozoa disappeared from the blood from the 5th day to the 8th day, but +2 on the 9th day and +1, 10th day. And appeared again. In TOB-7 administration, the protozoa disappeared from the 6th day and did not appear until the 10th day. With TOA-7 administration, the protozoa disappeared from the 5th day or from the 6th day to the 9th day, but appeared again as +1 on the 10th day. That is, ascofuranone was administered with TOB-7 (benzalharman) or TOA-7 (picrasidine-G) in combination, and the same or higher effect was observed at a dose of 1/30 or 1/60 of glycerol.
[0034]
[Example 4]
Consider the effect of multiple doses of drugs administered to trypanosomiasis mice on the first and sixth days after the start of treatment, with ascofuranone alone and in combination with TOB-7 (benzalharman) or TOA-7 (picrasidine-G) did. The results are shown in Table 4.
[0035]
[Table 4]

[0036]
As shown in Table 4, ascofuranone alone was +4 until the 5th day in the second administration, but the parasite disappeared from the blood until the 6th to 8th day. However, it was +1 on the 9th day and +4 on the 11th day. In combination with TOB-7, the protozoa disappeared from the blood from the 6th day to the 11th day. In TOA-7, it disappeared from the 6th day to the 9th day, and it was +1 even on the 11th day. That is, it became clear that combined use with TOB-7 or TOA-7 is more effective with multiple administrations.
[0037]
[Example 5]
To trypanosomiasis mice, ascofuranone alone or a combination of ascofuranone and TOA-7 (benzalharman) or TOB-7 (picrasineline-G) was intramuscularly administered for 2 days for 3 days, and the effect of continuous drug administration was examined. The results are shown in Table 5.
[0038]
[Table 5]

[0039]
Ascofuranone 100 mg / kg and TOB-7 (benzalharman) 150 mg / kg were continuously administered for 3 days, and the protozoa disappeared from the blood over a long period of time and cured after the 5th day.
[0040]
Ascofuranone has been studied as a novel antitrypanosoma drug, but it was necessary to use a large amount of glycerol in combination with Trypanosoma brucei brucei to cure infected mice with a single administration of ascofuranone. In this study, we focused on glycerol kinase (GK), which is a target enzyme of glycerol, and plays an important role in energy metabolism during administration of ascofuranone. As a result of searching for an inhibitor of GK instead of glycerol in order to obtain higher drug efficacy and practicality, TOB-7 (benzalharman), TOA-7 (picrasidine-G), etc., which are indole alkaloids, were obtained. It was proved that the effect of ascofuranone was enhanced by the combined use with a GK inhibitor, and the result of 100% cure was obtained by administering TOB-7 (benzalharman) together with ascofuranone for 3 days. This is a remarkable advance compared to the 33% cure rate when administered ascofuranone alone for 3 days.
As described above, a pharmaceutical composition of the present invention comprising an alkaloid having an indole skeleton and an ascofuranone is suitable for a desired route of administration as a pharmaceutical composition comprising one or more pharmaceutically acceptable carriers. Depending, it can be administered in any suitable form. The route of administration may be a parenteral route or an oral route. For example, when used as a tablet, the following prescription examples are given.
Example of tablet formulation
Ascofuranone 10mg
TOB-7 (benzharman) 10mg
Anhydrous lactose 34mg
Microcrystalline cellulose 25mg
Polyvinylpyrrolidone 20mg
Magnesium stearate 1mg
Ascofuranone, TOB-7, anhydrous lactose, microcrystalline cellulose and polyvinylpyrrolidone were mixed and sieved. The mixture was wet granulated, dried and sieved. The sieved granules were mixed with magnesium stearate and pressed into egg-shaped tablet cores.
[0041]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, it has become possible to provide a drug that almost completely prevents or treats a disease caused by a protozoan such as African trypanosomiasis, which has so far had a low cure rate.

Claims (7)

Alkaloids having an indole skeleton represented by the following formula

An ascofuranone antiprotozoal action-enhancing agent , comprising one or more of a compound selected from pharmaceutically acceptable salts thereof and a pharmaceutically acceptable salt thereof. Ascofuranone and alkaloid having an indole skeleton represented by the following formula

A pharmaceutical composition for preventing or treating a disease caused by a protozoan, comprising one or more of a compound selected from the group consisting of a pharmaceutically acceptable salt thereof and a pharmaceutically acceptable salt thereof. The pharmaceutical composition according to claim 2, wherein the disease is African trypanosomiasis. Alkaloid having an indole skeleton represented by the following formula in the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease caused by protozoa, including ascofuranone

Use of one or more of a compound selected from: and a pharmaceutically acceptable salt thereof. Use according to claim 4, wherein the disease is African trypanosomiasis. Ascofuranone and alkaloid having an indole skeleton represented by the following formula

A kit for preventing or treating a disease caused by a protozoan, comprising one or more of a compound selected from pharmaceutically acceptable salts thereof and instructions for use thereof, and instructions for use . The kit according to claim 6, wherein the disease is African trypanosomiasis.