JP2004231601A

JP2004231601A - Agent for enhancing antiprotozoal action of ascofuranone containing alkaloid having indole skeleton and agent composition having antiprotozoal action containing the same

Info

Publication number: JP2004231601A
Application number: JP2003024643A
Authority: JP
Inventors: Kiyoshi Kita; 潔北; Yoshisada Yabu; 義貞籔; Kazuo Nagai; 和夫永井; Nobuko Minagawa; 信子皆川; Tomoyoshi Hosokawa; 知良細川
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-01-31
Filing date: 2003-01-31
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2023-01-31
Also published as: JP4468638B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an agent for enhancing antiprotozoal action of ascofuranone and a new agent composition having antiprotozoal action containing the agent. <P>SOLUTION: An alkaloid having an indole skeleton which exists in a plant of the family Simaroubaceae is used as the agent for enhancing antiprotozoal action of ascofuranone. The agent composition comprising an ascofuranone and the alkaloid having the indole skeleton and a pharmaceutically acceptable carrier is used in order to prevent and treat diseases for human or animals other than human caused by protozoans. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インドール骨格を有するアルカロイドを含むことを特徴とするアスコフラノンの抗原虫作用増強剤、アスコフラノンおよびインドール骨格を有するアルカロイドを含む薬剤組成物、アスコフラノンを含む抗原虫剤の製造におけるインドール骨格を有するアルカロイドの使用、およびアスコフラノンおよびインドール骨格を有するアルカロイドを必要とするヒトまたはヒト以外の動物に投与することを含む、原虫によって惹起される疾患を予防または治療する方法、並びにアスコフラノンおよびインドール骨格を有するアルカロイドを含む、原虫によって惹起される疾患を予防または治療するためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
アフリカトリパノソーマ症はヒトではアフリカ睡眠病、家畜ではナガナ病と呼ばれ、サハラ砂漠以南の北緯１４度から南緯２９度に分布し、ツエツエバエによって媒介される。アフリカ睡眠病はトリパノソーマ科原虫感染によって発症し、毎年２０−３０万人の新たな患者が発症しているといわれている。しかしアフリカ睡眠病の患者数は調査データの信頼性が低く確定できないのが現状である。少なくともＷＨＯによれば１９９６年には１５万人が死亡し、１０万人以上に後遺症が残ったと言われている。さらに、ナガナ病と呼ばれる家畜類の被害はそれ以上に甚大であり、人々のタンパク源となるべきウシが年間数１０万頭も死んでいる。また、アメリカ合衆国に匹敵する面積の約１０００万平方キロのサバンナでトリパノソーマのために牧畜が不可能になっている。この様にアフリカ睡眠病はアフリカの人々の健康及び経済的発展を著しく妨げており、ＷＨＯは制圧すべき感染症の一つに掲げている。
【０００３】
アフリカ睡眠病はツエツエバエによって媒介されるトリパノソーマによる原虫感染症であり、感染から１０日前後で原虫が血流中に出現する。感染初期には原虫は血流中で増殖し、発熱、倦怠感、頭痛、筋肉や関節の痛み、掻痒感を与え進行する。慢性期に入ると中枢神経が侵されて、精神錯乱や全身の痙攣などの症状を呈し、最終的には嗜眠状態に陥って死に至る。
【０００４】
アフリカ睡眠病の治療にはペンタミジン、メラルソプロールやエフロルニチン等が用いられ１９６０年代にはその撲滅も可能との感もあった。しかし、これらの薬剤は古く、有効性は徐々に低下している。特にヒ素剤であるメラルソプロールに対する耐性は大きな問題となっており、効果のみられない患者は死を待つのみと言う悲惨な状況となっている。
【０００５】
トリパノソーマはヒト体内では主に血流中に生息している。この血流型のエネルギー代謝はグリコソームと呼ばれる原虫特有なオルガネラで行われる解糖系に依存しており、いわゆるミトコンドリアにおける酸化的リン酸化は機能していない。しかしこの解糖系を効率よく駆動するためには生成したＮＡＤＨの再酸化が必要であり、これにはミトコンドリアのグリセロール−３リン酸酸化系が重要な役割を果たしている。この酸化系の末端酸化酵素は還元型のユビキノンを電子供与体とするキノール酸化酵素として機能し、宿主の持つ好気的な呼吸系のシトクロム酸化酵素とは大きく異なった性質を有している。特に注目すべき点は、この末端酸化酵素が宿主のシトクロム酸化酵素を速やかに阻害するシアンに非感受性という点である。そこで、これまでも欧米を中心に多くの研究者がこのシアン耐性酸化酵素を標的とした薬剤の開発を試みてきたが、選択毒性の高い有効なものは得られていなかった。
【０００６】
このような状況の中で、本発明者等はイソプレノイド系生理活性物質アスコクロリン、アスコフラノン並びにそれらの誘導体、特にアスコフラノンがトリパノソーマのグリセロール−３リン酸酸化系をｎＭオーダーという極めて低い濃度で特異的に阻害する事を発見し、特許を出願した（特許文献１参照）。
【０００７】
すなわち、ラット血流中で増殖させたＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉｂｒｕｃｅｉ虫体をグラスビーズで機械的に破砕し、遠心分画法によって調製したミトコンドリア標品におけるグリセロール−３リン酸依存性の呼吸に対するアスコクロリン、アスコフラノン及びそれらの誘導体に対する阻害効果を検討した。５０％阻害の絶対量はＱサイクルの阻害剤として知られるアンチマイシンＡ３の４８，６００ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白、ミキソチアゾールの２１，５００ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白、スチグマテリン１８，６００ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白に対して、アスコフラノンは２５ｐｍｏｌ／ｍｇ蛋白と極めて低濃度で阻害効果を示した。なお、アスコフラノンは下記式で表されるイソプレノイド系抗生物質である。
【化６】

アスコフラノンの具体的製法は、下記特許文献２に記載されており、その抗腫瘍活性はすでに下記特許文献３に記載されている。また、アスコフラノン誘導体の血糖低下作用、血中脂質低下作用、グリケイション阻害作用、抗酸化作用は、下記特許文献４に記載されている。
【０００８】
トリパノソーマの呼吸系は、ミトコンドリアの呼吸が阻害されると嫌気的条件下と同様にグリセロールキナーゼの関与するグリセロール生成系によって解糖系の進行が維持される。従って、この経路を抑制するために最終生成物であるグリセロールを添加することによってアスコフラノンによる阻害効果が増大することが推測されたので以下の実験を行った。Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉｂｒｕｃｅｉのｉｎｖｉｔｒｏ培養系でグリセロールを０％、２％、５％、１０％の濃度で添加し、アスコフラノンを０〜２５０，０００ｎＭの１０段階に希釈して増殖阻害効果を検討した。その結果、グリセロール５％または１０％添加によりアスコフラノンは１５ｎＭとグリセリン無添加に比較して１／１７，０００の低濃度で致死作用を示した。アスコフラノンはグリセリンの共存下において、極めて強力な増殖阻害効果を示すことを明らかにした（非特許文献１参照）。
【０００９】
アフリカ睡眠病マウスモデルを用いてアスコフラノンの治療効果を検討した。動物実験は以下の方法で行った。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、６週齢）にＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉｂｒｕｃｅｉを１０^４／マウス腹腔内接種し、３日後マウス血中の原虫数が１０^７／ｍＬ以上であることを確認した後、アスコフラノンの投与による治療を開始した。投与後の治療効果の評価は２４時間毎にマウス尾静脈血をスライドグラスに取り顕微鏡にて４００倍の倍率で検鏡し原虫の有無を確認し判定した。２０視野に原虫０のとき（−）、２０視野に原虫が１〜数匹では（＋１）、１視野に原虫が１〜２０では（＋２）、一視野に原虫が２１〜４０では（＋３）、１視野で原虫が４１以上では（＋４）とした。
【００１０】
トリパノソーマ症マウスにアスコフラノン１００ｍｇ／ｋｇを単回、筋肉内投与して治療効果を検討した。アスコフラノン投与後４日目までは＋４であったが、５日目には＋２に減少し、６、７日目は血液中から原虫は完全に消失した。しかし８日目には＋１、９日目には＋３となり，１０日目には死亡した。アスコフラノン単独投与に対してグリセロールとの併用投与の治療効果を検討した。トリパノソーマ症マウスにアスコフラノン１００ｍｇ／ｋｇとグリセロール３ｇ／ｋｇを同時に単回、筋肉内投与した。併用投与開始４日目までは血中の原虫は＋４であったが５日目以降は消失した。しかし９日目には＋１、１０日目には＋２となり、再び原虫は血中に出現した。すなわちトリパノソーマ治療にアスコフラノンとグリセロールの併用は、アスコフラノンの単独投与に比較してより有効であった（非特許文献２参照）。
【００１１】
以上の成績から、アフリカトリパノソーマ症モデルマウスの治療においては、アスコフラノン単独投与では効果は弱くグリセロールとの併用が必須であった。
グリセロールは吸入または経口摂取すると、吐き気、嘔吐、下痢を起こすおそれがある。グリセロールの急性毒性とし、ヒトで中毒症状を呈する最小投与量は１４２８ｍｇ／ｋｇであり、マウスにおける急性毒性は、腹腔内投与はＬＤ_５０＝８９９２ｍｇ／ｋｇ、静脈内投与はＬＤ_５０＝６１９９ｍｇ／ｋｇである。本試験で使用した３０００ｍｇ／ｋｇはヒトや家畜には大量であることがアスコフラノンをアフリカトリパノソーマ症の治療薬として実用化するための障害となっていた。
【００１２】
【特許文献１】
特開平９−１６５３３２号公報
【特許文献２】
特公昭５６−２５３１０号公報
【特許文献３】
特公昭６３−６１９２９号公報
【特許文献４】
特開平７−２０６８３８号公報
【非特許文献１】
モレキュラーアンドバイオケミカルパラシトロジー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ）８１：１２７−１３６．１９９６
【非特許文献２】
パラシトロジーインターナショナル（ＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）４７：１３１−１３７．１９９８
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、アスコフラノンをアフリカトリパノソーマ症等の原虫によって惹起される疾患の治療薬として実用化するために鋭意研究を重ねた結果、インドール骨格を有するアルカロイドをアスコフラノンとともに使用することにより、アスコフラノンの抗原虫作用を大幅に増強することを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成した。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、インドール骨格を有するアルカロイドを含むことを特徴とするアスコフラノンの抗原虫作用増強剤を提供する。
また、本発明は、アスコフラノンおよびインドール骨格を有するアルカロイド、並びに薬剤学的に許容される担体を含む抗原虫作用を有する薬剤組成物を提供する。
さらに、本発明は、アスコフラノンを含む抗原虫剤の製造におけるインドール骨格を有するアルカロイドの使用を提供する。
加えて、本発明は、有効量のアスコフラノンおよびインドール骨格を有するアルカロイドを、投与を必要とするヒトまたはヒト以外の動物に投与することを含む、原虫によって惹起される疾患を予防または治療する方法を提供する。
さらに、本発明は、アスコフラノンおよびインドール骨格を有するアルカロイド、並びに使用説明書を含む、原虫によって惹起される疾患を予防または治療するためのキットを提供する。
本発明において使用されるインドール骨格を有するアルカロイドとしては、例えば、下記の化合物を例示することができる。
【化７】

上記各化合物の化合物名を以下に記す。
ＴＯＡ−１：１，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−ｅｔｈｙｌ−１２Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ［２，１−ａ］ β−ｃａｒｂｏｌｉｎ−５−ｉｕｍ
ＴＯＡ−２：１−ｅｔｈｙｌ−２，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１２Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ［２，１−ａ］ β−ｃａｒｂｏｌｉｎ−５−ｉｕｍ
ＴＯＡ−５：１，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｏ［２，１−ａ］ β−ｃａｒｂｏｌｉｎ−５−ｉｕｍ
ＴＯＡ−６：１１Ｈ−［１，２，４］−ｔｒｉａｚｏｌｅ［３，４−ｂ］β−ｃａｒｂｏｌｉｎｅ
ＴＯＡ−７：ｐｉｃｒａｓｉｄｅｎＧ
ＴＯＡ−１０：１，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３−ｐｒｏｐｙｌ−１２Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ［２，１−ａ］ β−ｃａｒｂｏｌｉｎ−５−ｉｕｍ
ＴＯＡ−１１：１，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｒｏｐｙｌ−１２Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ［２，１−ａ］ β−ｃａｒｂｏｌｉｎ−５−ｉｕｍ
ＴＯＡ−１２：１，２，３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−３−ｅｔｈｙｌ−１２Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ［２，１−ａ］ β−ｃａｒｂｏｌｉｎ−５−ｉｕｍ
ＴＯＡ−１３：２，３−ｄｉｅｔｈｙｌ−１２Ｈ−ｐｙｒｉｄｏ［２，１−ａ］ β−ｃａｒｂｏｌｉｎ−５−ｉｕｍ
ＴＯＢ−３：１−ｆｏｒｍｙｌ−β−ｃａｒｂｏｌｉｎｅ
ＴＯＢ−７：ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ
ＴＯＢ−８：ｎ−ｐｒｏｐｙｌｈａｒｍａｎ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ
ＴＯＢ−９：ｍｅｔｈｙｌ１−（４−ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｙｌ）−β−ｃａｒｏｌｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ
ＴＯＢ−１０：４−ｍｅｔｈｏｘｙ−１−ｖｉｎｙｌ−β−ｃａｒｂｏｌｉｎｅ
ＴＯＢ−１２：１−（３−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１，２，３，４−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−β−ｃａｒｂｏｌｉｎｅ
ＴＯＢ−２０：ｍｅｔｈｙｌ１−（４−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−β−ｃａｒｏｌｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ
ＴＯＢ−２１：ｎ−ｐｒｏｐｙｌ−β−ｃａｒｂｏｌｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ
あるいは１−（４−ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｙｌ）−β−ｃａｒｏｌｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ
ＴＯＢ−２２：ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−ｃａｒｏｌｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ
上記化合物は高い融点を有しており、例えば、ＴＯＡ−１，２，６，１０，１１，１２，１３の融点は、３００度Ｃ以上、ＴＯＢ−２１の融点は１８７−１８８度Ｃ、ＴＯＢ−２２の融点は２１１−２１２度Ｃである。
上記化合物はいずれも公知であり、例えば、ＴＯＢ−３，ＴＯＢ−５，ＴＯＢ−７，ＴＯＢ−１０については下記の文献に記載されている。
ＴＯＢ−３：Ｋ．ＫｏｉｋｅａｎｄＴ．Ｏｈｍｏｔｏ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３２（９），３５７９−３５８３（１９８４）．
ＴＯＡ−５：Ｈ．Ｙｏｓｈｉｎｏ、Ｋ．Ｋｏｉｋｅ，Ｔ．Ｎｉｋａｉｄｏ，Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，５１（２），２８１−２９３（１９９９）
ＴＯＢ−７：最初の合成報告はＨ．Ｒ．Ｓｙｎｄｅｒｅｔａｌ．，ＪＡＣＳ，７０，２１９（１９４８）．
ＴＯＢ−７の原報：Ｋ．ＫｏｉｋｅａｎｄＴ．Ｏｈｍｏｔｏ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３５（８），３３０５−３３０８，（１９８７）．
ＴＯＢ−１０：Ｔ．ＯｈｍｏｔｏａｎｄＫ．Ｋｏｉｋｅ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３１（９），３１９８−３２０４（１９８３）．
なお、本発明で使用されるインドール骨格を有するアルカロイドは、天然物由来のものであっても、合成物であってもよい。
【００１５】
【発明の実施の形態】
アスコフラノンの実用化を考えたとき、少量の投与でアスコフラノンと併用効果を示すグリセロールに代わる薬剤を見いだすことが必須であることが明らかになった。そこで、発明者等はグリセロールの標的であるグリセロールキナーゼの阻害剤を探索するためのスクリーニング系を確立した。確立した探索系は、グリセロール−３リン酸とＡＤＰからグリセロールキナーゼによってグリセロールが生成する時に生ずるＡＴＰをルシフェリン−ルシフェラーゼの系で測定し、ＡＴＰアナライザーとマイクロプレートを用いて迅速にスクリーニングを行うことが可能である。
【００１６】
次に本発明者等は、開発した系を用いてグリセロールキナーゼ阻害剤を探索した。対照としたのはニガキ科植物に属し化学構造が明らかになっている天然物である。ニガキ科植物に含まれる主な成分は、β−ｃａｒｂｏｌｉｎｅあるいはｃａｎｔｈｉｎ−６−ｏｎｅ骨格を有するアルカロイドと苦味の本体である変形トリテルペノイドのクアシノイドである。ニガキ科植物は、世界各地の伝承医学あるいは民間伝承の中で悪性腫瘍、マラリアをはじめとする感染症、発熱、胃腸疾患の治療に使われている。
【００１７】
ニガキ科植物に存在することが明らかにされているアルカロイド７３化合物のうち、インドール骨格を有する化合物単独のグリセロールキナーゼ阻害効果を段落番号［００１１］に記載したスクリーニング系に各々終濃度２５μＭ添加して残存活性を測定して検索した。またアスコフラノンとの併用効果は段落番号［０００７］に記載したＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉｂｒｕｃｅｉの培養系にアスコフラノン４ｎＭに１８化合物を５００−０．２４μＭまでの２倍希釈系列を作成し２４時間培養した後、原虫数を測定することで５０％有効濃度ＥＤ_５０を求めた。その結果インドール骨格を有するアルカロイド、ＴＯＢ−７、ＴＯＢ−８、ＴＯＢ−１２、ＴＯＢ−２１、ＴＯＡ−６、ＴＯＡ−７を選択し、動物実験において効果が得られるかを検討した。
【００１８】
トリパノソーマ症マウスモデル（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉｂｒｕｃｅｉ接種ＢＡＬＢ／ｃマウス）にアスコフラノン１００ｍｇ／ｋｇと、段落番号［００１２］で選択したの６化合物を３投与量（１００ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ）にて、単回筋肉内に併用投与してマウスにおける治療効果を検討した。その結果、６化合物にはＴＯＢ−２１を除いて血液中の原虫の減少または消失がみられた。以上の成績から、インドール骨格を持つアルカロイドはアスコフラノンとの併用によって、アフリカ睡眠病において延命または治療効果を奏することが明らかになった。
【００１９】
本発明において使用されるアスコフラノンには、光学異性体が存在するが、それぞれの光学異性体、およびそれらの混合物は全て本発明に含まれる。本発明の薬剤組成物としてはいずれを用いてもよい。アスコフラノンは遊離の形で用いてもよいが、塩基と塩を形成するので塩の形で用いることもできる。塩を形成する塩基としては、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、アンモニア、トリエチルアミンなどが挙げられる。インドール骨格を持つアルカロイドとしては特に限定されないが、例えば、上に挙げた１８種類のアルカロイドから１種若しくは２種以上を用いることができる。また、インドール骨格を持つアルカロイドは天然物でも合成品でもよく天然物の場合、その由来はニガキ科植物に限定されない。これらのアルカロイドは遊離の形で用いてもよいが、酸との塩の形で用いることもできる。塩を形成する酸としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、燐酸などの無機酸、および酢酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トロフルオロ酢酸などの有機酸が挙げられる。かかる塩としては、例えば、上記インドールアルカロイドのブロマイドが挙げられる。
【００２０】
インドール骨格を持つアルカロイドおよびアスコフラノンを含む本発明の薬剤組成物は、１種もしくはそれ以上の薬剤学的に許容し得る担体を含む薬剤組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。
本発明で使用する担体としては、医薬品製造の技術分野で周知である任意の添加剤を使用することができる。そのような担体として、賦形剤、希釈剤、湿潤剤、懸濁剤、乳化剤、分散剤、補助剤、甘味剤、着色剤、風味剤、緩衝剤、防腐剤、保存剤、緩衝剤、結合剤、安定化剤等が例示され、目的とする剤形に応じて周知慣用の担体から必要なものを選択することができる。例えば、インドール骨格を持つアルカロイドの酸との塩およびアスコフラノンの塩基との塩を水に溶解したり、懸濁剤、賦形剤および・またはその他の担体と混合して経口投与に適する剤形として製剤化することができる。なお、賦形剤または補助剤としては、例えば、乳糖、種々のデンプン（例えば、トウモロコシデンプン）、ブドウ糖、スクロース、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸塩、タルク、植物油（例えば、大豆油、ラッカセイ油。オリーブ油）、レシチン等が挙げられる。
なお、本発明の薬剤組成物は、グリセロールを含有してもよい。添加するグリセロールの量は、必要に応じて適宜調節することができる。
【００２１】
本発明の薬剤組成物は、一般的に、経口で、例えば、錠剤、カプセル剤、液剤の形態で投与することができる。しかし、投与は直腸から、例えば、座薬として投与して投与してもよい。さらに、非経口で、例えば、注射剤として投与してもよい。インドール骨格を持つアルカロイドおよびアスコフラノンの投与は、これらの活性物質を、錠剤やカプセル剤などの単一の投与剤形中に混在して含有する製剤の形態または各成分が異なる層に存在する多層状の製剤の形態で行うことができる。あるいは、これらの活性物質を別々に、単位投与形態の組合せ製剤として、同時にまたは時間差をおいて投与することも可能である。
本発明化合物の投与量は、対象となる患者（ヒト）またはヒト以外の動物の体型、年齢、体調、疾患の度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができる。例えば、ヒトに対する経口投与の場合の体重１ｋｇ当りの１日量は、アスコフラノンについては１００〜５００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、インドール骨格を持つアルカロイドについては、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙである（食後３回投与）。また、非経口投与（静注、筋注、皮下注）の場合には、アスコフラノンについては２５〜１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、インドール骨格を持つアルカロイドについては、２５〜１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で使用される。さらに、座薬の場合には、アスコフラノンについては１．０〜２．０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、インドール骨格を持つアルカロイドについては、０．０５〜１．０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの用量で使用される。
【００２２】
【実施例】
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、これは本発明を何ら限定するものではない。
【００２３】
【実施例１】
ＡＤＰとグリセロール−３リン酸に組み換えグリセロールキナーゼを加えて反応を開始し、生成したＡＴＰをルシフェラーゼ法で測定する系に、上記１８種のインドール骨格を有するアルカロイド２５μＭを添加してグリセロールキナーゼ阻害作用を検討した。結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】

【００２５】
実施例１において用いた天然物の構造式は以下のとおりである。
【００２６】
【化８】

【００２７】
表１に示すようにＴＯＢ−７、ＴＯＢ−８、ＴＯＢ−１２、ＴＯＢ−２１、ＴＯＡ−６、ＴＯＡ−７に特に強いグリセロールキナーゼ阻害効果が認められた。
【００２８】
【実施例２】
Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉｂｒｕｃｅｉの培養系にアスコフラノン４ｎＭと５００〜０．２４μＭの濃度の１８種類のアルカロイドとを併用添加した際における増殖阻害作用を検討した。結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】

【００３０】
ＴＯＢ−９、ＴＯＢ−２１、ＴＯＡ−２、ＴＯＡ−５、ＴＯＡ−１１を除いていずれの化合物もＥＤ_５０は１０μＭ以下であったが、細胞毒性（マウス白血病細胞株Ｐ−３８８における５０％生育阻害濃度）の成績を考慮して、ＴＯＢ−７、ＴＯＢ−８、ＴＯＢ−１２、ＴＯＢ−２１、ＴＯＡ−６、ＴＯＡ−７の６化合物を選択して動物実験を行った。
【００３１】
【実施例３】
トリパノソーマ症マウスに１００ｍｇ／ｋｇのアスコフラノンと５０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇのＴＯＢ−１２、ＴＯＢ−７、ＴＯＢ−２１、ＴＯＢ−８、ＴＯＢ−６、ＴＯＢ−７を各２匹に単回、筋肉内投与し１０日間観察した。この間、毎日、尾静脈血をスライドグラスに取り光学顕微鏡４００倍にて鏡検し、原虫の数が２０視野で０の場合（−）、２０視野に原虫１匹〜数匹場合（＋１）、１視野に原虫が１〜２０匹の場合（＋２）、１視野に原虫２１〜４０匹の場合（＋３）、１視野に原虫４１以上の場合（＋４）とした。結果を表３に示す。
【００３２】
【表３】

【００３３】
トリパノソーマ症マウスにおけるアスコフラノン１００ｍｇ／ｋｇとグリセロール３０００ｍｇ／ｋｇの併用投与により、原虫は５日目から８日目までは血中から消失したが、９日目には＋１，１０日目には＋２と再び出現した。ＴＯＢ−７投与では６日目から原虫は消失し、１０日目まで出現しなかった。ＴＯＡ−７投与では５日目または６日目から９日目までは原虫は消失したが１０日目には＋１と再び出現した。すなわちアスコフラノンにＴＯＢ−７（ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ）、またはＴＯＡ−７（ｐｉｃｒａｓｉｄｉｎｅ−Ｇ）併用投与によってグリセロールの１／３０または１／６０の投与量で同等またはそれ以上の効果が認められた。
【００３４】
【実施例４】
トリパノソーマ症マウスに治療開始後１日と６日目にアスコフラノン単独並びにＴＯＢ−７（ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ）またはＴＯＡ−７（ｐｉｃｒａｓｉｄｉｎｅ−Ｇ）と併用、筋肉内投与し、薬物の複数回投与の効果を検討した。結果を表４に示す。
【００３５】
【表４】

【００３６】
表４に示すようにアスコフラノン単独、２回投与では５日目までは＋４であったが６−８日目まで原虫は血中から消失した。しかし９日目は＋１、１１日目は＋４であった。ＴＯＢ−７との併用では６日目以降１１日目まで原虫は血中から消失した。またＴＯＡ−７でも６日目から９日目まで消失し、１１日目でも＋１であった。すなわちＴＯＢ−７、またはＴＯＡ−７との併用は複数回投与でより効果的であることが明らかになった．
【００３７】
【実施例５】
トリパノソーマ症マウスにアスコフラノン単独またはアスコフラノンとＴＯＡ−７（ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ）、ＴＯＢ−７（ｐｉｃｒａｓｉｄｉｎｅ−Ｇ）との併用、２日間、３日間連続筋肉内投与し薬物の連続投与の効果を検討した。結果を表５に示す。
【００３８】
【表５】

【００３９】
アスコフラノン１００ｍｇ／ｋｇとＴＯＢ−７（ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ）１５０ｍｇ／ｋｇを、３日間連続投与することによって、治療開始５日目以降は原虫が長期にわたって血中から消失し治癒した。
【００４０】
アスコフラノンは新規抗トリパノソーマ薬として研究してきたが、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉｂｒｕｃｅｉにおいてアスコフラノン１回の投与で感染マウスを治癒するには多量のグリセロールを併用する必要があった。今回、グリセロールの標的となる酵素であり、アスコフラノン投与時のエネルギー代謝において重要な役割を果たすグリセロールキナーゼ（ＧＫ）に注目した。より高い薬効と実用性を得るため、グリセロールに代わるＧＫの阻害剤の探索を行った結果、インドールアルカロイドであるＴＯＢ−７（ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ）、ＴＯＡ−７（ｐｉｃｒａｓｉｄｉｎｅ−Ｇ）等を得た。ＧＫ阻害剤と併用することでアスコフラノンの効果が高まることが証明され、ＴＯＢ−７（ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ）を三日間、アスコフラノンと併用投与することによって、１００％治癒するという結果が得られた。これは、アスコフラノン単独で三日間投与した場合の３３％の治癒率に比較して目覚ましい進歩である。
上述のように、インドール骨格を持つアルカロイドおよびアスコフラノンを含む本発明の薬剤組成物は、１種もしくはそれ以上の薬剤学的に許容し得る担体を含む薬剤組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。例えば、錠剤として使用する場合には、次のような処方例が挙げられる。
錠剤の処方例
アスコフラノン１０ｍｇ
ＴＯＢ−７（ｂｅｎｚａｌｈａｒｍａｎ）１０ｍｇ
無水ラクトース３４ｍｇ
微結晶セルロース２５ｍｇ
ポリビニルピロリドン２０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム１ｍｇ
アスコフラノン、ＴＯＢ−７、無水ラクトース、微結晶セルロースおよびポリビニルピロリドンを混合し、篩にかけた。混合物を湿潤粒状化し、乾燥し、篩にかけた。篩にかけた顆粒をステアリン酸マグネシウムと混合し、プレスして卵形の錠剤核にした。
【００４１】
【発明の効果】
上述のように、本発明によれば、これまで治癒率が低かったアフリカトリパノソーマ症等の原虫によって惹起される疾患をほぼ完全に予防または治療する薬剤を提供することが可能となった。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention provides an antiprotozoal action enhancer of ascofuranone, which comprises an alkaloid having an indole skeleton, a pharmaceutical composition containing ascofuranone and an alkaloid having an indole skeleton, and an indole in the production of an antiprotozoal agent containing ascofuranone. Use of alkaloids having a skeleton, and methods of preventing or treating diseases caused by protozoa, including administering to humans or non-human animals in need of alkaloids having an ascofuranone and indole skeleton, and ascofuranone and The present invention relates to a kit for preventing or treating a disease caused by a protozoan, comprising an alkaloid having an indole skeleton.
[0002]
[Prior art]
African trypanosomiasis is referred to as African sleeping sickness in humans and Nagana disease in livestock, and is distributed from 14 ° N to 29 ° S south of the Sahara Desert and is transmitted by the house fly. African sleeping sickness is caused by trypanosomiasis infection and is said to affect 200,000 to 300,000 new patients every year. However, at present, the number of patients with African sleeping sickness cannot be determined due to low reliability of the survey data. According to the WHO, at least 150,000 people died in 1996 and more than 100,000 had sequelae. In addition, the damage to livestock, called nagana's disease, is even more severe, with hundreds of thousands of cattle dying of protein each year. Trypanosoma has made it impossible to livestock in an approximately 10 million square kilometer savannah area comparable to the United States. Thus, African sleeping sickness has severely hindered the health and economic development of African people, and the WHO has listed it as one of the infectious diseases to be controlled.
[0003]
African sleeping sickness is a protozoan infection caused by Trypanosoma mediated by the house fly, with the protozoa appearing in the bloodstream about 10 days after infection. In the early stages of infection, the parasite proliferates in the bloodstream and develops with fever, malaise, headache, muscle and joint pain, and pruritus. During the chronic phase, the central nervous system is affected, causing symptoms such as mental confusion and generalized convulsions, eventually leading to lethargy and death.
[0004]
Pentamidine, melarsoprol, eflornithine and the like are used for the treatment of African sleeping sickness, and there was a feeling that the eradication was possible in the 1960s. However, these drugs are old and their effectiveness is gradually decreasing. In particular, resistance to the arsenic drug melarsoprol has become a major problem, and patients who have failed to respond only have to wait for death.
[0005]
Trypanosoma lives in the human body mainly in the bloodstream. This blood-stream type energy metabolism depends on the glycolysis system performed in protozoan organelles called glycosomes, and so-called oxidative phosphorylation in mitochondria does not function. However, in order to efficiently drive this glycolysis system, it is necessary to re-oxidize the generated NADH, and the mitochondrial glycerol-3-phosphate oxidation system plays an important role. This oxidative terminal oxidase functions as a quinol oxidase using reduced ubiquinone as an electron donor, and has properties significantly different from those of the aerobic respiratory cytochrome oxidase of the host. Of particular note is that this terminal oxidase is insensitive to cyanide, which rapidly inhibits host cytochrome oxidase. Thus, many researchers, mainly in Europe and the United States, have attempted to develop a drug targeting this cyan-resistant oxidase, but no effective drug having high selective toxicity has been obtained.
[0006]
Under these circumstances, the present inventors have found that the isoprenoid-based physiologically active substances ascochlorin, ascofuranone, and their derivatives, particularly ascofuranone, specifically oxidize the glycerol-3-phosphate oxidation system of trypanosomes at an extremely low concentration of the order of nM. And applied for a patent (see Patent Document 1).
[0007]
That is, Ascochlorin and Ascofuranone for glycerol-3-phosphate-dependent respiration in a mitochondrial preparation prepared by centrifuging fractionated Trypanosoma bruceibrucei insects grown in the bloodstream of rats and mechanically crushing with glass beads. And their inhibitory effects on their derivatives. The absolute amount of 50% inhibition is ascofuranone based on 48,600 pmol / mg protein of antimycin A3, 21,500 pmol / mg protein of myxothiazole, and 18,600 pmol / mg protein of stigmatelin, which are known as Q cycle inhibitors. Showed an inhibitory effect at a very low concentration of 25 pmol / mg protein. Ascofuranone is an isoprenoid antibiotic represented by the following formula.
Embedded image

The specific production method of ascofuranone is described in Patent Document 2 below, and its antitumor activity is already described in Patent Document 3 below. In addition, the blood sugar lowering action, blood lipid lowering action, glycation inhibitory action, and antioxidant action of the ascofuranone derivative are described in Patent Document 4 below.
[0008]
When mitochondrial respiration is inhibited, the progress of the glycolytic pathway of trypanosome is maintained by a glycerol-producing system involving glycerol kinase, as in anaerobic conditions. Therefore, it was presumed that the addition of glycerol, which is the final product, to suppress this pathway would increase the inhibitory effect of ascofuranone. Therefore, the following experiment was performed. Glycerol was added at a concentration of 0%, 2%, 5%, and 10% in an in vitro culture system of Trypanosoma bruceibrucei, and ascofuranone was diluted to 10 steps from 0 to 250,000 nM to examine the growth inhibitory effect. As a result, by adding 5% or 10% of glycerol, ascofuranone showed a lethal effect at a concentration of 15 nM, which was 1/17000, lower than that without glycerin. Ascofuranone was shown to exhibit a very strong growth inhibitory effect in the presence of glycerin (see Non-Patent Document 1).
[0009]
The therapeutic effect of ascofuranone was studied using an African sleeping sickness mouse model. Animal experiments were performed in the following manner. Mice (C57BL / 6, 6 weeks old) were treated with 10 trypanosoma brucei brucei.⁴/ 3 days after inoculation of the mouse intraperitoneally, the number of parasites in the mouse blood was 10⁷After confirming that the concentration was not less than / mL, treatment by administration of ascofuranone was started. For evaluation of the therapeutic effect after administration, blood was collected from the tail vein of a mouse on a slide glass every 24 hours and examined under a microscope at 400 × magnification to confirm the presence or absence of protozoa. When the parasite is 0 in 20 visual fields (-), 1 to several parasites in 20 visual fields (+1), 1 to 20 parasites in 1 visual field (+2), and 21 to 40 parasites in one visual field (+3) (+4) when the number of protozoa was 41 or more in one visual field.
[0010]
A single dose of ascofuranone 100 mg / kg was intramuscularly administered to trypanosomiasis mice to examine the therapeutic effect. The value was +4 on the 4th day after ascofuranone administration, but decreased to +2 on the 5th day, and the protozoa disappeared completely from the blood on the 6th and 7th days. However, she was +1 on day 8, +3 on day 9, and died on day 10. The therapeutic effect of combined administration of glycerol with ascofuranone alone was investigated. Aspofuranone 100 mg / kg and glycerol 3 g / kg were simultaneously and intramuscularly administered once to trypanosomiasis mice. The protozoa in the blood were +4 until the 4th day from the start of the combined administration, but disappeared after the 5th day. However, on day 9 it was +1 and on day 10 it was +2, and again the protozoa appeared in the blood. That is, the combined use of ascofuranone and glycerol for the treatment of trypanosoma was more effective than the single administration of ascofuranone (see Non-Patent Document 2).
[0011]
From the above results, in the treatment of African trypanosomiasis model mice, ascofuranone alone had a weak effect and was required to be used in combination with glycerol.
Glycerol may cause nausea, vomiting and diarrhea when inhaled or ingested. The acute dose of glycerol is 1428 mg / kg, which is toxic in humans. The acute toxicity in mice is LD intraperitoneally.₅₀= 8992 mg / kg, intravenous administration is LD₅₀= 6199 mg / kg. The large amount of 3000 mg / kg used in this test in humans and livestock was an obstacle to practically using ascofuranone as a therapeutic agent for African trypanosomiasis.
[0012]
[Patent Document 1]
JP-A-9-165332
[Patent Document 2]
JP-B-56-25310
[Patent Document 3]
JP-B-63-61929
[Patent Document 4]
JP-A-7-206838
[Non-patent document 1]
Molecular and Biochemical Parasitology 81: 127-136.1996
[Non-patent document 2]
Parasitology International 47: 131-137.1998
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventors have conducted intensive studies to commercialize ascofuranone as a therapeutic agent for diseases caused by protozoa such as African trypanosomiasis, and as a result, by using an alkaloid having an indole skeleton together with ascofuranone, The present inventors have found that ascofuranone greatly enhances the antiprotozoal action, and based on this finding, completed the present invention.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention provides an ascofuranone antiprotozoal action enhancer comprising an alkaloid having an indole skeleton.
The present invention also provides a pharmaceutical composition having an antiprotozoal effect, comprising an alkaloid having an ascofuranone and an indole skeleton, and a pharmaceutically acceptable carrier.
Further, the present invention provides the use of an alkaloid having an indole skeleton in the production of an antiprotozoal agent containing ascofuranone.
In addition, the present invention provides a method for preventing or treating a disease caused by a protozoan comprising administering an effective amount of an alkaloid having an ascofuranone and an indole skeleton to a human or non-human animal in need thereof. I will provide a.
Furthermore, the present invention provides a kit for preventing or treating a disease caused by a protozoan, comprising an ascofuranone and an alkaloid having an indole skeleton, and instructions for use.
Examples of the alkaloid having an indole skeleton used in the present invention include the following compounds.
Embedded image

The compound names of the above compounds are described below.
TOA-1: 1,2-dimethyl-3-ethyl-12H-pyrido [2,1-a] β-carbolin-5-ium
TOA-2: 1-ethyl-2,3-dimethyl-12H-pyrido [2,1-a] β-carbolin-5-ium
TOA-5: 1,2-dimethyl-11H-pyrrolo [2,1-a] β-carbolin-5-ium
TOA-6: 11H- [1,2,4] -triazole [3,4-b] β-carboline
TOA-7: picrasiden G
TOA-10: 1,2-dimethyl-3-propyl-12H-pyrido [2,1-a] β-carbolin-5-ium
TOA-11: 1,3-dimethyl-2-propyl-12H-pyrido [2,1-a] β-carbolin-5-ium
TOA-12: 1,2,3-trimethyl-3-ethyl-12H-pyrido [2,1-a] β-carbolin-5-ium
TOA-13: 2,3-diethyl-12H-pyrido [2,1-a] β-carbolin-5-ium
TOB-3: 1-formyl-β-carboline
TOB-7: benzalharman
TOB-8: n-propyl harman-3-carboxylate
TOB-9: methyl 1- (4-bromophenyl) -β-carolin-3-carboxylate
TOB-10: 4-methythyl-1-vinyl-β-carboline
TOB-12: 1- (3-hydroxyethyl) -1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline
TOB-20: methyl 1- (4-chlorophenyl) -β-carolin-3-carboxylate
TOB-21: n-propyl-β-carboline-3-carboxylate
Or 1- (4-bromophenyl) -β-carolin-3-carboxylic methyl ester
TOB-22: isopropyl-β-carolin-3-carboxylate
The above compound has a high melting point. For example, the melting point of TOA-1,2,6,10,11,12,13 is 300 ° C. or higher, and the melting point of TOB-21 is 187-188 ° C., TOB The melting point of −22 is 211-212 ° C.
All of the above compounds are known. For example, TOB-3, TOB-5, TOB-7 and TOB-10 are described in the following documents.
TOB-3: K.I. Koike and T.K. Ohmoto, Chem. Pharm. Bull. ,32(9), 3579-3583 (1984).
TOA-5: H. Yoshino, K .; Koike, T .; Nikaido, Heterocycles, 51 (2), 281-293 (1999).
TOB-7: The first synthetic report was published by H.E. R. Synder et al. , JACS, 70, 219 (1948).
Original report of TOB-7: Koike and T.K. Ohmoto, Chem. Pharm. Bull. ,35(8), 3305-3308, (1987).
TOB-10: T.I. Ohmoto and K. See Koike, Chem. Pharm. Bull. ,31(9), 3198-3204 (1983).
The alkaloid having an indole skeleton used in the present invention may be derived from a natural product or a synthetic product.
[0015]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
When considering the practical use of ascofuranone, it became evident that it was essential to find a drug alternative to glycerol that showed a combined effect with ascofuranone in small doses. Thus, the inventors have established a screening system for searching for an inhibitor of glycerol kinase, which is a target of glycerol. The established search system measures the ATP generated when glycerol is generated from glycerol-3 phosphate and ADP by glycerol kinase using the luciferin-luciferase system, and enables rapid screening using an ATP analyzer and microplate. It is.
[0016]
Next, the present inventors searched for a glycerol kinase inhibitor using the developed system. The control is a natural product belonging to the family of the family Oysteraceae, the chemical structure of which is known. The main components contained in the plant of the family Oysteraceae are alkaloids having a β-carboline or canthin-6-one skeleton and quassinoids, modified triterpenoids that are the main body of bitterness. Background of the artemisia is used in the treatment of malignant tumors, malaria and other infectious diseases, fever, and gastrointestinal diseases in traditional medicine and folklore around the world.
[0017]
Among the 73 alkaloid compounds that have been shown to be present in the plants of the family Nigkiaceae, the glycerol kinase inhibitory effect of the compound having an indole skeleton alone was added to the screening system described in paragraph [0011] by adding a final concentration of 25 μM to each of the screening systems described in paragraph [0011]. The activity was measured and searched. Ascofuranone was used in combination with Trypanosoma brucei brucei in the culture system of Trypanosoma brucei brucei described in paragraph [0007]. 50% effective concentration ED by measuring the number of protozoa₅₀I asked. As a result, alkaloids having an indole skeleton, TOB-7, TOB-8, TOB-12, TOB-21, TOA-6, and TOA-7 were selected to examine whether or not an effect could be obtained in animal experiments.
[0018]
Trypanosome disease mouse model (Trypanosoma brucei brucei inoculated BALB / c mouse), 100 mg / kg of ascofuranone and 3 doses of 6 compounds selected in paragraph [0012] (100 mg / kg, 50 mg / kg, 25 mg / kg) The therapeutic effect in mice was examined by administering the compound once intramuscularly. As a result, the six compounds showed a decrease or disappearance of protozoa in blood except for TOB-21. From the above results, it was revealed that alkaloids having an indole skeleton can prolong life or treat curative effects in African sleeping sickness when used in combination with ascofuranone.
[0019]
Ascofuranone used in the present invention has optical isomers, and each optical isomer and a mixture thereof are all included in the present invention. Any may be used as the pharmaceutical composition of the present invention. Ascofuranone may be used in a free form, but can also be used in a salt form since it forms a salt with a base. Examples of the salt-forming base include sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, ammonia, and triethylamine. The alkaloid having an indole skeleton is not particularly limited, and for example, one or more of the 18 alkaloids listed above can be used. The alkaloid having an indole skeleton may be a natural product or a synthetic product. These alkaloids may be used in a free form or in the form of a salt with an acid. Examples of the acid that forms a salt include inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, and phosphoric acid, and acetic acid, oxalic acid, maleic acid, fumaric acid, citric acid, tartaric acid, and methanesulfonic acid. And organic acids such as trifluoroacetic acid. Such salts include, for example, bromides of the above-mentioned indole alkaloids.
[0020]
The pharmaceutical composition of the present invention containing an alkaloid having an indole skeleton and ascofuranone can be used as a pharmaceutical composition containing one or more pharmaceutically acceptable carriers depending on the intended route of administration. And can be administered. The route of administration may be parenteral or oral.
As the carrier used in the present invention, any additive known in the technical field of pharmaceutical production can be used. Such carriers include excipients, diluents, wetting agents, suspending agents, emulsifying agents, dispersing agents, adjuvants, sweetening agents, coloring agents, flavoring agents, buffers, preservatives, preservatives, buffers, binders. Agents, stabilizers and the like are exemplified, and necessary ones can be selected from known and commonly used carriers according to the intended dosage form. For example, a salt suitable for oral administration by dissolving a salt with an acid of an alkaloid having an indole skeleton and a salt with a base of ascofuranone in water, or mixing with a suspension, an excipient and / or other carriers. Can be formulated as In addition, as an excipient or an auxiliary, for example, lactose, various starches (for example, corn starch), glucose, sucrose, cellulose, methylcellulose, carboxymethylcellulose, magnesium stearate, lauryl sulfate, talc, vegetable oil (for example, Soybean oil, peanut oil, olive oil), lecithin and the like.
In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may contain glycerol. The amount of glycerol to be added can be appropriately adjusted as needed.
[0021]
The pharmaceutical compositions of the present invention can generally be administered orally, for example, in the form of tablets, capsules, liquids. However, it may be administered rectally, for example, as a suppository. Further, they may be administered parenterally, for example, as an injection. The administration of alkaloids having an indole skeleton and ascofuranone may be carried out in the form of a preparation containing these active substances in a single dosage form such as a tablet or capsule, or in a case where each ingredient is present in a different layer. It can be performed in the form of a layered preparation. Alternatively, these active substances can be administered separately, simultaneously or at staggered times, as a combined preparation in a unit dosage form.
The dose of the compound of the present invention can be appropriately selected according to the body type, age, physical condition, degree of disease, elapsed time after onset, and the like of the target patient (human) or non-human animal. For example, in the case of oral administration to humans, the daily dose per kg of body weight is 100 to 500 mg / kg / day for ascofuranone and 100 to 500 mg / kg / day for alkaloids having an indole skeleton (3 after meal). Dose). In the case of parenteral administration (intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection), dose of ascofuranone is 25 to 100 mg / kg / day, and alkaloid having indole skeleton is 25 to 100 mg / kg / day. used. Further, in the case of suppositories, ascofuranone is used at a dose of 1.0 to 2.0 mg / kg / day, and alkaloid having an indole skeleton is used at a dose of 0.05 to 1.0 mg / kg / day.
[0022]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0023]
Embodiment 1
The reaction was initiated by adding recombinant glycerol kinase to ADP and glycerol-3 phosphate, and 25 μM of the above 18 alkaloids having an indole skeleton were added to a system for measuring the generated ATP by the luciferase method to inhibit the glycerol kinase inhibitory action. investigated. Table 1 shows the results.
[0024]
[Table 1]

[0025]
The structural formula of the natural product used in Example 1 is as follows.
[0026]
Embedded image

[0027]
As shown in Table 1, TOB-7, TOB-8, TOB-12, TOB-21, TOA-6, and TOA-7 showed particularly strong glycerol kinase inhibitory effects.
[0028]
Embodiment 2
The growth inhibitory effect was examined when 4 nM of ascofuranone and 18 alkaloids at a concentration of 500 to 0.24 μM were added in combination to a culture system of Trypanosoma brucei brucei. Table 2 shows the results.
[0029]
[Table 2]

[0030]
Except for TOB-9, TOB-21, TOA-2, TOA-5, and TOA-11, all compounds had EDs.₅₀Was 10 μM or less, but considering the results of cytotoxicity (50% growth inhibitory concentration in mouse leukemia cell line P-388), TOB-7, TOB-8, TOB-12, TOB-21, TOA- An animal experiment was conducted by selecting 6 and 6 compounds of TOA-7.
[0031]
Embodiment 3
Trypanosomiasis mice were given 100 mg / kg of ascofuranone and 50 mg / kg, 25 mg / kg of TOB-12, TOB-7, TOB-21, TOB-8, TOB-6, TOB-7 once for each two mice, It was administered intramuscularly and observed for 10 days. During this period, the tail vein blood is taken every day on a slide glass and microscopically examined with a light microscope (× 400). When the number of protozoa is 0 in 20 visual fields (−), when one to several parasites are present in 20 visual fields (+1), In one visual field, 1 to 20 parasites (+2), in one visual field, 21 to 40 parasites (+3), and in one visual field, 41 or more parasites (+4). Table 3 shows the results.
[0032]
[Table 3]

[0033]
By co-administration of ascofuranone 100 mg / kg and glycerol 3000 mg / kg in trypanosomiasis mice, the protozoa disappeared from the blood from day 5 to day 8, but +2 on day 9 and +2 on day 10. And appeared again. With TOB-7 administration, the protozoa disappeared from day 6 and did not appear until day 10. With TOA-7 administration, the protozoa disappeared from day 5 or 6 to day 9 but reappeared as +1 on day 10. That is, ascofuranone showed a similar or better effect at 1/30 or 1/60 dose of glycerol by combined administration of TOB-7 (benzalharman) or TOA-7 (picrasidine-G).
[0034]
Embodiment 4
Intramuscular administration of ascofuranone alone or in combination with TOB-7 (benzalharman) or TOA-7 (picrasidine-G) to trypanosomiasis mice on the 1st and 6th day after the start of treatment, and the effect of multiple administrations of the drug was examined did. Table 4 shows the results.
[0035]
[Table 4]

[0036]
As shown in Table 4, when ascofuranone alone was administered twice, the value was +4 until the fifth day, but the protozoa disappeared from the blood until the sixth to eighth days. However, day 9 was +1, day 11 was +4. In combination with TOB-7, the protozoa disappeared from the blood from day 6 to day 11. In addition, TOA-7 disappeared from the 6th day to the 9th day, and was +1 on the 11th day. That is, it became clear that TOB-7 or the combination with TOA-7 was more effective in multiple administrations.
[0037]
Embodiment 5
Ascofuranone alone or in combination with ascofuranone and TOA-7 (benzalharman) or TOB-7 (picrasidine-G) was administered intramuscularly to trypanosomiasis mice for 2 days and 3 days, and the effect of continuous administration of the drug was examined. Table 5 shows the results.
[0038]
[Table 5]

[0039]
By continuously administering 100 mg / kg of ascofuranone and 150 mg / kg of TOB-7 (benzalharman) for 3 days, the protozoa disappeared from the blood for a long time after day 5 of the treatment and healed.
[0040]
Although ascofuranone has been studied as a novel antitrypanosome drug, it was necessary to use a large amount of glycerol in combination with Trypanosoma brucei brucei to cure infected mice with a single administration of ascofuranone. Here, we focused on glycerol kinase (GK), which is a target enzyme of glycerol and plays an important role in energy metabolism during ascofuranone administration. As a result of searching for a GK inhibitor instead of glycerol in order to obtain higher drug efficacy and practicality, TOB-7 (benzalharman), TOA-7 (picrasidine-G) and the like, which were indole alkaloids, were obtained. It has been proved that the effect of ascofuranone is enhanced when used in combination with a GK inhibitor, and 100% healing was obtained by co-administering TOB-7 (benzalharman) with ascofuranone for 3 days. This is a remarkable improvement compared to a 33% cure rate when administered ascofuranone alone for 3 days.
As described above, the pharmaceutical composition of the present invention comprising an alkaloid having an indole skeleton and ascofuranone can be used as a pharmaceutical composition containing one or more pharmaceutically acceptable carriers in a desired route of administration. Accordingly, it can be administered in any suitable form. The route of administration may be parenteral or oral. For example, when used as tablets, the following formulation examples are given.
Example of tablet formulation
Ascofuranone 10mg
TOB-7 (benzalharman) 10mg
34mg anhydrous lactose
25mg microcrystalline cellulose
Polyvinylpyrrolidone 20mg
Magnesium stearate 1mg
Ascofuranone, TOB-7, anhydrous lactose, microcrystalline cellulose and polyvinylpyrrolidone were mixed and sieved. The mixture was wet granulated, dried and sieved. The sieved granules were mixed with magnesium stearate and pressed into oval tablet cores.
[0041]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, it has become possible to provide a drug that almost completely prevents or treats diseases caused by protozoa such as African trypanosomiasis, which had a low cure rate until now.

Claims

An ascofuranone antiprotozoal action enhancer comprising an alkaloid having an indole skeleton.

Alkaloid having an indole skeleton is represented by the following formula

The ascofuranone antiprotozoal activity enhancer according to claim 1, which is one or more of a compound selected from the group consisting of: and a pharmaceutically acceptable salt thereof.

A pharmaceutical composition having an antiprotozoal effect, comprising an ascofuranone and an alkaloid having an indole skeleton, and a pharmaceutically acceptable carrier.

Alkaloid having an indole skeleton is represented by the following formula

4. The pharmaceutical composition according to claim 3, which is one or more of a compound selected from the group consisting of: and a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Use of an alkaloid having an indole skeleton in the production of an antiprotozoal agent containing ascofuranone.

Alkaloid having an indole skeleton is represented by the following formula

The use according to claim 5, which is one or more of a compound selected from the group consisting of: and a pharmaceutically acceptable salt thereof.

A method for preventing or treating a disease caused by a protozoan, which comprises administering an effective amount of an alkaloid having an ascofuranone and an indole skeleton to a human or a non-human animal in need thereof.

Alkaloid having an indole skeleton is represented by the following formula

The method according to claim 7, which is one or more compounds selected from the group consisting of: and a pharmaceutically acceptable salt thereof.

9. The method according to claim 7 or 8, wherein the disease is African trypanosomiasis.

A kit for preventing or treating a disease caused by a protozoan, comprising an ascofuranone and an alkaloid having an indole skeleton, and instructions for use.

Alkaloid having an indole skeleton is represented by the following formula

The kit according to claim 10, which is one or more compounds selected from the group consisting of: and a pharmaceutically acceptable salt thereof.