JP4463198B2 - Method for producing heterologous protein in Escherichia coli - Google Patents
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Abstract
Description
本願発明は、大腸菌を宿主とする異種蛋白質の工業生産スケールにおける製造方法に関する。より詳細には、温度シフトにより発現誘導を行うことができるプロモーターの下流に異種蛋白質をコードする核酸断片が組み込まれた発現ベクターで大腸菌を形質転換し、得られた組換え大腸菌（異種蛋白質産生大腸菌）を任意に低温で培養して工業生産レベルにまで増殖させた後、これを発現誘導剤の非存在下に高温で培養することにより当該異種蛋白質の発現誘導を行うことを特徴とする異種蛋白質の製造方法、及び当該製造方法により得られる、発現誘導剤を全く含有しない異種蛋白質に関する。 The present invention relates to a method for producing a heterologous protein using Escherichia coli as a host on an industrial production scale. More specifically, E. coli was transformed with an expression vector incorporating a nucleic acid fragment encoding a heterologous protein downstream of a promoter capable of inducing expression by temperature shift, and the resulting recombinant E. coli (heterologous protein-producing E. coli ) Is arbitrarily cultured at a low temperature and grown to an industrial production level, and then is cultured at a high temperature in the absence of an expression inducer to induce expression of the heterologous protein. And a heterologous protein obtained by the production method and containing no expression inducer.
大腸菌は組換え蛋白質を製造するのに欠くことのできない宿主である。大腸菌における異種蛋白質の発現に用いられるプロモーターとして、例えば、イソプロピル−ベーターチオガラクトシドピラノシド（ＩＰＴＧ）を始めとする発現誘導剤の存在下で機能するプロモーター、ｐＨの変動により発現誘導を行うプロモーター、特定のアミノ酸や糖の除去または低減により宿主を飢餓状態にすることにより発現誘導を行うプロモーター及び培養温度をシフトさせることにより発現誘導を行うプロモーターなどが開発されている（例えば、ＳＡＶＶＡＳ Ｃ．ＭＡＫＲＩＤＥＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｒｓ，Ｖｏｌ．６０，Ｎｏ．３，ｐ．５１２−５３８，Ｓｅｐｔ．１９９６；参照のため本明細書に引用する）。
発現誘導剤を使用する方法は、目的とする異種蛋白質の工業的生産には好ましくない。すなわち、発現誘導剤の多くは代謝阻害剤であり、その残留物の生体への影響が懸念される。また、培養の途中で菌体の増殖に合わせて発現誘導剤を無菌的に添加するという煩雑な操作を行わなければならない。更に、非常に高価な発現誘導剤の使用は製造コストの上昇に繋がるなどの問題がある。したがって、発現誘導剤などの高価な薬品を使用せずに、安全、簡便且つ低コストで異種蛋白質を製造する方法の開発が望まれる。
温度シフトにより発現誘導を行う発現系は、発現誘導剤を使用しないので、このような製造目的に適した方法の一つといえる。温度シフトにより発現誘導を行うことができるプロモーターとして、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔａｃ、ＰＬ、Ｔ７、λＰＬ、ＰＬ−９Ｇ−５０及びｃｓｐＡなどが報告されている。
しかしながら、工業生産における大腸菌の培養には、大型の発酵槽（ファーメンタ）を用いた通気培養が一般的である。目的産物の発現量を増大させるためには、菌体の増殖を抑え、目的産物の蓄積を優先させるために低温下で発現誘導をかける方法が用いられてきた。例えば、ＰＬ−９Ｇ−５０またはｃｓｐＡプロモーターの制御下にβ−ガラクトシダーゼ蛋白質が発現するように構築された組換え大腸菌が挙げられる（例えば、Ｈｉｌｌａ Ｇｉｌａｄｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９２，ｐｐ．２１８４−２１８８，Ｍａｒｃｈ １９９５；参照のため本明細書に引用する）。この場合、低温シフトで発現量は上がるが、ほとんど菌体の増殖は見られない。このように、低温下での培養は菌体自体の代謝速度が低下することから、培養時間が延びる傾向があり、作業性が良くなかった。また、培養時間が延びることは、その期間だけ更に無菌性を確保し続ける必要があり、生産上のリスクも大きくなる。このように、工業生産においては、解決すべき問題が多い。例えば、大腸菌を用いて組換えダニ主要アレルゲンを発現させることに成功したことが記載された結城らの報告がある（例えば、特許第２６５７８６１号公報；参照のため本明細書に引用する）。しかしながら、彼らの方法は、ダニ主要アレルゲンを発現させる際に、発現誘導剤としてＩＰＴＧを使用する方法であり、前述のような解決されるべき問題が存在する。
ヒョウヒダニは、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性皮膚炎及びアレルギー性結膜炎などのアレルギー性疾患を引き起こす主要な因子として知られている。アレルギー性疾患の治療には抗アレルギー剤や抗ヒスタミン剤が用いられることが多いが、対症療法である当該治療法では、アレルギー性疾患を根治することはできない。アレルギー性疾患の原因抗原を注射する減感作療法が唯一の根治療法であると考えられている。減感作療法とはアレルギー性疾患患者にその原因となっているアレルゲンを少量ずつ注射し生体のアレルギー反応をなくす治療法であり、その有効率は７０％以上といわれている。
現在使用されている治療用アレルゲンは、天然物から抽出したものである。たとえば、ダニアレルギー疾患の治療に用いられるアレルゲン製剤は、室内塵（ハウスダスト）の抽出液から製造される。ハウスダスト抽出液には、ダニ由来アレルゲンだけでなく、極めて多種類の不純物が含まれるので、この抽出液から安定した力価の製剤を製造することは極めて困難である。このため、ハウスダスト抽出液を原材料として製造されたアレルゲン製剤を使用した場合、常にアナフィラキシーショックの危険性が付きまとうことになる。臨床現場では、アレルゲン製剤の製造ロットが変わる毎に、投与量が調節されており、これは、医師、患者双方の大きな負担となっている。また、当該アレルゲン製剤は、天然物を出発材料とするため、その製造量が限られるという問題がある。
近年、ダニアレルゲンの研究が進み、すでにいくつかのダニ主要アレルゲン（Ｄｅｒ ｆ １，Ｄｅｒ ｆ ２，Ｄｅｒ ｐ １，Ｄｅｒ ｐ ２など）が同定されており（例えば、ｐｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８０，７５５−７７５，１９８７）；参照のため本明細書に引用する）、また、アナフィラキシーショックの惹起を低減することなどを目的とした、組換え技術による改変型ダニ主要アレルゲンの開発も進められている。
例えば、ダニ主要アレルゲンＤｅｒ ｆ ２のシステイン残基をセリン残基に置換した改変Ｄｅｒ ｆ ２をコードする遺伝子を含む発現ベクターで原核生物または真核生物を形質転換し、この形質転換体を培養して得られる培養物から改変型のダニ主要アレルゲンを製造する方法が報告されている（例えば、特開平６−２５３８５１号公報；参照のため本明細書に引用する）。しかしながら、この報告においても、ダニ主要アレルゲンを発現させる際にＩＰＴＧが使用されており、生体への影響の問題が残る。E. coli is an indispensable host for producing recombinant proteins. As a promoter used for expression of heterologous proteins in E. coli, for example, a promoter that functions in the presence of an expression inducer such as isopropyl-beta-thiogalactoside pyranoside (IPTG), a promoter that induces expression by fluctuation in pH, Promoters that induce expression by starving the host by removing or reducing specific amino acids and sugars, promoters that induce expression by shifting the culture temperature, and the like have been developed (eg, SAVVAS C. MAKRIDES Microbiological) Reviews, Vol. 60, No. 3, p. 512-538, Sept. 1996; cited herein for reference).
A method using an expression inducer is not preferable for industrial production of the desired heterologous protein. That is, many expression inducers are metabolic inhibitors, and there is a concern about the influence of the residue on the living body. In addition, a complicated operation of aseptically adding an expression inducer in accordance with the growth of bacterial cells during the culture must be performed. Furthermore, the use of a very expensive expression inducer has problems such as an increase in production cost. Therefore, it is desired to develop a method for producing a heterologous protein safely, simply and at low cost without using expensive chemicals such as expression inducers.
Since an expression system that induces expression by temperature shift does not use an expression inducer, it can be said to be one of the methods suitable for such production purpose. As a promoter capable of inducing expression by temperature shift, lac, trc, tac, PL, T7, λPL, PL-9G-50, cspA and the like have been reported.
However, aerobic culture using a large fermenter is generally used for culturing Escherichia coli in industrial production. In order to increase the expression level of the target product, a method of inducing expression at low temperatures has been used in order to suppress the growth of bacterial cells and give priority to the accumulation of the target product. For example, recombinant E. coli constructed to express a β-galactosidase protein under the control of the PL-9G-50 or cspA promoter (see, for example, Hilla Giladi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 92, pp. 2184-2188, March 1995; cited herein for reference). In this case, the expression level is increased by a low temperature shift, but the growth of the cells is hardly observed. Thus, culture at low temperatures has a tendency to extend the culture time because the metabolic rate of the cells itself decreases, and the workability is not good. In addition, if the culture time is extended, it is necessary to further ensure sterility during that period, which increases production risk. Thus, there are many problems to be solved in industrial production. For example, there is a report of Yuki et al. Which described successful expression of a major recombinant mite allergen using E. coli (for example, Japanese Patent No. 2567861; cited herein for reference). However, their method is a method of using IPTG as an expression inducer when expressing a major mite allergen, and there are problems to be solved as described above.
Leopard mite is known as a major factor causing allergic diseases such as allergic asthma, allergic rhinitis, allergic dermatitis and allergic conjunctivitis. Antiallergic agents and antihistamines are often used for the treatment of allergic diseases, but the allergic diseases cannot be cured by the treatment method which is symptomatic treatment. Desensitization therapy, injecting the causative antigen of allergic disease, is considered the only radical treatment. Desensitization therapy is a treatment that eliminates allergic reactions in the body by injecting allergens that cause it all at once into patients with allergic diseases, and the effective rate is said to be 70% or more.
Currently used therapeutic allergens are extracted from natural products. For example, allergen preparations used for the treatment of tick allergic diseases are produced from an extract of house dust. Since the house dust extract contains not only mite-derived allergens but also a very wide variety of impurities, it is extremely difficult to produce a preparation having a stable titer from this extract. For this reason, when an allergen preparation produced using house dust extract as a raw material is used, there is always a risk of anaphylactic shock. In clinical settings, the dosage is adjusted every time the production lot of an allergen preparation is changed, which is a great burden on both doctors and patients. Moreover, since the said allergen formulation uses a natural product as a starting material, there exists a problem that the production amount is limited.
In recent years, research on mite allergens has progressed and several major mite allergens (Der
For example, a prokaryotic or eukaryotic organism is transformed with an expression vector containing a gene encoding a modified
（発明が解決しようとする技術的課題）
本願発明の目的は、天然物の抽出によらず遺伝子組換え技術により異種蛋白質を製造するに際して、高価な発現誘導剤を使用することなく、種々の異種蛋白質を大量に、しかも安全、簡便且つ低コストで製造する方法を提供することにある。
また、本願発明の他の目的は、当該製造方法により得られる、発現誘導剤を全く含有しない異種蛋白質、とりわけダニ主要アレルゲン、ブタ胸膜肺炎菌由来分泌性マクロファージ毒素及びブタ丹毒感染防御抗原を提供することにある。
（その解決方法）
そこで、本願発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、所定のプロモーターを用いて遺伝子組換え技術により得られた異種蛋白質産生大腸菌を発現誘導剤を使用することなく高温培養するだけで異種蛋白質を発現できること、また、高温培養する前に低温培養することにより工業生産レベルにまで増殖させた後、発現誘導剤の非存在下に高温培養することにより、細胞の増殖をコントロールしながら異種蛋白質を高レベルで発現できることを見出した。
すなわち、本願発明は、異種蛋白質の発現が温度シフトにより発現誘導を行うことができるプロモーターの制御下におかれた発現ベクターで大腸菌を形質転換し、ついで得られる形質転換体を任意に２０〜３４℃、好ましくは２５〜３２℃で低温培養することにより増殖させた後、発現誘導剤の非存在下に３５〜４０℃、好ましくは３７〜３８℃で培養することにより当該異種蛋白質を発現させることを含む、異種蛋白質の製造方法に関する。
本願発明はまた、上記方法によって得られた、発現誘導剤を含有しない異種蛋白質、とりわけダニ主要アレルゲン、ブタ胸膜肺炎菌由来分泌性マクロファージ毒素及びブタ丹毒感染防御抗原に関する。
なお、本願発明の方法に使用するｔｒｐプロモーター等の温度シフトにより発現誘導を行うことができるプロモーターが、発現誘導剤を使用することなく高温培養（３５〜４０℃、好ましくは３７〜３８℃）するだけで異種蛋白質を発現することはこれまでに報告されていない。
（従来技術より有効な効果）
本願発明の方法に従えば、高価な発現誘導剤を使用することなく、種々の異種蛋白質を大量、且つ安価に供給できる。また、本願発明の方法によれば、培養温度を高温にシフトするだけで発現誘導を行うことができるので、発現誘導剤を使用する方法とは異なり、培養の途中で発現誘導剤を菌体の増殖に合わせて無菌的に添加するような煩雑な操作をする必要はなく、無菌性の確保が容易である。更に、本願発明の方法において形質転換体を低温培養で増殖させた後に高温培養にシフトする態様によれば、工業生産において種々の仕事（細胞の回収、培養中の種々のアッセイなど）ができるように細胞の増殖をコントロールすることができる。
また、本願発明の方法に従って得られた異種蛋白質は、生体への影響が懸念される発現誘導剤を全く含まない安全性の高いものである。かかる異種蛋白質の例示として挙げた組換えダニ主要アレルゲンは、アレルギー性疾患の治療あるいは診断に利用される。また、マクロファージ毒素（ＡｐｘＩＩＩ）は、ブタの胸膜肺炎に対するワクチン、ブタ丹毒感染防御抗原（ΔＳｐａＡ）は、ブタ丹毒感染症のワクチンとして利用することができる。(Technical problem to be solved by the invention)
The object of the present invention is to produce various kinds of heterologous proteins in large quantities, safely, simply and at low cost without using expensive expression inducers when producing heterologous proteins by genetic recombination techniques without extracting natural products. It is to provide a method of manufacturing at a cost.
Another object of the present invention is to provide a heterologous protein containing no expression inducer, particularly a tick major allergen, a secreted macrophage toxin derived from porcine pleural pneumococcus and a porcine erysipelas protective antigen obtained by the production method. There is.
(Solution)
Therefore, as a result of intensive studies to achieve the above object, the inventors of the present application have used a heterologous protein-producing Escherichia coli obtained by gene recombination technology using a predetermined promoter without using an expression inducer. Heterogeneous proteins can be expressed only by high-temperature culture. Also, cell growth can be achieved by high-temperature culture in the absence of an expression inducer after growing to industrial production level by low-temperature culture before high-temperature culture. We found that heterologous proteins can be expressed at high levels while controlling
That is, in the present invention, Escherichia coli is transformed with an expression vector placed under the control of a promoter capable of inducing the expression of a heterologous protein by a temperature shift, and then the resulting transformant is optionally transformed into 20 to 34. To express the heterologous protein by culturing at a low temperature of 35 to 40 ° C., preferably 37 to 38 ° C. in the absence of an expression inducer And a method for producing a heterologous protein.
The present invention also relates to a heterologous protein containing no expression inducer obtained by the above method, particularly a major mite allergen, a secreted macrophage toxin derived from porcine pneumococcus pneumoniae, and a porcine erysipelas protective antigen.
A promoter capable of inducing expression by a temperature shift such as a trp promoter used in the method of the present invention is cultured at a high temperature (35 to 40 ° C., preferably 37 to 38 ° C.) without using an expression inducer. It has not been reported so far to express heterologous proteins alone.
(Effective effect than conventional technology)
According to the method of the present invention, various heterologous proteins can be supplied in large quantities and at low cost without using an expensive expression inducer. In addition, according to the method of the present invention, expression induction can be performed only by shifting the culture temperature to a high temperature. Therefore, unlike the method using an expression inducer, the expression inducer is removed during the cultivation. It is not necessary to perform a complicated operation of adding aseptically according to the growth, and it is easy to ensure sterility. Furthermore, in the method of the present invention, according to the aspect in which the transformant is grown in low-temperature culture and then shifted to high-temperature culture, various works (recovery of cells, various assays during culture, etc.) can be performed in industrial production In addition, cell growth can be controlled.
In addition, the heterologous protein obtained according to the method of the present invention is highly safe and does not contain any expression inducer that may be affected by the living body. Recombinant tick major allergens listed as examples of such heterologous proteins are used for the treatment or diagnosis of allergic diseases. In addition, macrophage toxin (ApxIII) can be used as a vaccine against porcine pleurisy pneumonia, and porcine erysipelas infection protective antigen (ΔSpaA) can be used as a vaccine against swine erysipelas infection.
図１は、発現ベクターｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓの構築方法を示す。
図２は、発現ベクターｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓの構築方法を示す。
図３は、発現誘導剤の存在下、３２℃で培養して増殖させた組換え大腸菌の超音波破砕液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示す。
レーン１：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９、レーン２：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９、レーン３：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１、レーン４：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１、レーン５：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＬＥ３９２、レーン６：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＬＥ３９２、レーン７：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１、レーン８：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１。
図４は、発現誘導剤の存在下、３７℃で培養して増殖させた組換え大腸菌の超音波破砕液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示す。
レーン１：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９、レーン２：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１、レーン３：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＬＥ３９２、レーン４：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１、レーン５：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９、レーン６：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１、レーン７：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＬＥ３９２、レーン８：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１。
図５は、発現誘導剤の非存在下、３２℃で培養して増殖させた組換え大腸菌の超音波破砕液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示す。
レーン１：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９、レーン２：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１、レーン３：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＬＥ３９２、レーン４：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１、レーン５：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９、レーン６：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１、レーン７：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＬＥ３９２、レーン８：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１。
図６は、発現誘導剤の非存在下、３７℃で培養して増殖させた組換え大腸菌の超音波破砕液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示す。
レーン１：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９、レーン２：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１、レーン３：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＬＥ３９２、レーン４：ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１、レーン５：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９、レーン６：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１、レーン７：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＬＥ３９２、レーン８：ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１。
図７は、ファーメンタ培養時の菌体の増殖曲線を示す。
図８は、ファーメンタ培養して増殖させた組換え大腸菌を経時的にサンプリングし、超音波破砕処理し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示す。
レーン１：３７℃温度シフト前、レーン２：３７℃温度シフト１時間後、レーン３：温度シフト３時間後、レーン４：温度シフト５時間後、レーン５：温度シフト７時間後、レーン６：温度シフト９時間後、レーン７：温度シフト１２時間後。
図９は、プラスミドｐＵＣ−Ｔｒｐ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓの構築方法を示す。
図１０は、発現ベクターｐＴｒｐ−ＡｐｘＩＩＩΔ２の構築方法を示す。
図１１は、発現誘導剤の非存在下、３７℃で培養して増殖させたＡｐｘＩＩＩΔ２産生大腸菌の超音波破砕液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示す。
図１２は、発現誘導剤の非存在下、３７℃で培養して増殖させたＡｐｘＩＩＩΔ２産生大腸菌の超音波破砕液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、ＰＶＤＦ膜に転写し、ペルオキシダーゼ標識抗Ｈｉｓタグ抗体で染色した結果を示す。
図１３は、発現ベクターｐＵＣ−Ｔｒｐ ΔｓｐａＡの構築方法を示す。
図１４は、３０℃で培養・増殖させたΔＳｐａＡ産生大腸菌及びその後、発現誘導剤の非存在下に３７℃で培養して発現誘導を行ったΔＳｐａＡ産生大腸菌の超音波破砕液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示す。
レーン１：ＨＢ１０１ ３０℃ １５時間培養、レーン２：ｐＵＣ−ＴｒｐΔｓｐａＡ／ＨＢ１０１ ３０℃ １５時間培養、レーン３：ＨＢ１０１ ３０℃ １５時間培養後、更に３７℃シフト ８時間培養、レーン４：ｐＵＣ−ＴｒｐΔｓｐａＡ／ＨＢ１０１ ３０℃ １５時間培養後、更に３７℃ ８時間培養、レーン５：ＨＢ１０１ ３０℃ １５時間培養後、更に３７℃シフト １２時間培養、レーン６：ｐＵＣ−ＴｒｐΔｓｐａＡ／ＨＢ１０１ ３０℃ １５時間培養後、更に３７℃ １２時間培養、レーン７：：ＨＢ１０１ ３０℃ １５時間培養後、更に３７℃シフト ２５時間培養、レーン８：ｐＵＣ−ＴｒｐΔｓｐａＡ／ＨＢ１０１ ３０℃ １５時間培養後、更に３７℃ ２５時間培養。FIG. 1 shows a method for constructing the expression vector pWU11-C8 / 119S.
FIG. 2 shows a method for constructing the expression vector pFLU11-C8 / 119S.
FIG. 3 shows the result of subjecting an ultrasonic disruption solution of recombinant E. coli grown by culturing at 32 ° C. in the presence of an expression inducer to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
Lane 1: pFLU11-C8 / 119S / JM109, Lane 2: pWU11-C8 / 119S / JM109, Lane 3: pFLU11-C8 / 119S / HB101, Lane 4: pWU11-C8 / 119S / HB101, Lane 5: pFLU11-C8 / 119S / LE392, Lane 6: pWU11-C8 / 119S / LE392, Lane 7: pFLU11-C8 / 119S / TB1, Lane 8: pWU11-C8 / 119S / TB1.
FIG. 4 shows the result of subjecting an ultrasonic disruption solution of recombinant E. coli grown in culture at 37 ° C. in the presence of an expression inducer to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
Lane 1: pFLU11-C8 / 119S / JM109, Lane 2: pFLU11-C8 / 119S / HB101, Lane 3: pFLU11-C8 / 119S / LE392, Lane 4: pFLU11-C8 / 119S / TB1, Lane 5: pWU11-C8 / 119S / JM109, Lane 6: pWU11-C8 / 119S / HB101, Lane 7: pWU11-C8 / 119S / LE392, Lane 8: pWU11-C8 / 119S / TB1.
FIG. 5 shows the result of subjecting an ultrasonic disruption solution of recombinant Escherichia coli grown by culturing at 32 ° C. in the absence of an expression inducer to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
Lane 1: pFLU11-C8 / 119S / JM109, Lane 2: pFLU11-C8 / 119S / HB101, Lane 3: pFLU11-C8 / 119S / LE392, Lane 4: pFLU11-C8 / 119S / TB1, Lane 5: pWU11-C8 / 119S / JM109, Lane 6: pWU11-C8 / 119S / HB101, Lane 7: pWU11-C8 / 119S / LE392, Lane 8: pWU11-C8 / 119S / TB1.
FIG. 6 shows the result of subjecting an ultrasonic disruption solution of recombinant Escherichia coli grown by culturing at 37 ° C. in the absence of an expression inducer to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
Lane 1: pFLU11-C8 / 119S / JM109, Lane 2: pFLU11-C8 / 119S / HB101, Lane 3: pFLU11-C8 / 119S / LE392, Lane 4: pFLU11-C8 / 119S / TB1, Lane 5: pWU11-C8 / 119S / JM109, Lane 6: pWU11-C8 / 119S / HB101, Lane 7: pWU11-C8 / 119S / LE392, Lane 8: pWU11-C8 / 119S / TB1.
FIG. 7 shows a growth curve of bacterial cells during fermenter culture.
FIG. 8 shows the results of sampling recombinant Escherichia coli grown by fermenter culture over time, sonicating and subjecting it to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
Lane 1: Before 37 ° C. temperature shift, Lane 2: 37 ° C. temperature shift after 1 hour, Lane 3: Temperature shift after 3 hours, Lane 4: Temperature shift after 5 hours, Lane 5: Temperature shift after 7 hours, Lane 6: 9 hours after temperature shift, Lane 7: 12 hours after temperature shift.
FIG. 9 shows the construction method of plasmid pUC-Trp / Myc-His.
FIG. 10 shows a method for constructing the expression vector pTrp-ApxIIIΔ2.
FIG. 11 shows the results of subjecting an ultrasonic disruption solution of ApxIIIΔ2-producing Escherichia coli grown at 37 ° C. in the absence of an expression inducer to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
FIG. 12 shows the ApxIIIΔ2-producing Escherichia coli sonication solution grown at 37 ° C. in the absence of an expression inducer, subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, transferred to a PVDF membrane, and labeled with peroxidase. The result of staining with an anti-His tag antibody is shown.
FIG. 13 shows a method for constructing the expression vector pUC-Trp ΔspaA.
FIG. 14 shows an ultrasonic disruption solution of ΔSpaA-producing Escherichia coli cultured and grown at 30 ° C. and ΔSpaA-producing Escherichia coli that was cultured at 37 ° C. in the absence of an expression inducer and induced for expression. The result of applying to acrylamide gel electrophoresis is shown.
Lane 1:
本願発明者らは、ベクターｐＵＣの複製開始点、ｔｒｐプロモーター及び異種蛋白質をコードする遺伝子としてダニ主要アレルゲン遺伝子を含む発現ベクターで大腸菌を形質転換し、得られた組換え大腸菌を発現誘導剤の非存在下、３２℃及び３７℃で培養したところ、３２℃ではダニ主要アレルゲンはほとんど発現せず、３７℃に温度シフトして培養を続けることにより、大量且つ効果的にダニ主要アレルゲンを生産できることを見出した。また、他の異種蛋白をコードする遺伝子としてブタ胸膜肺炎菌由来分泌性マクロファージ毒素（ＡｐｘＩＩＩ）遺伝子及びブタ丹毒感染防御抗原遺伝子を含む発現ベクターを用いることにより、同様に、発現誘導剤を使用することなく、これらの蛋白質を生産できることを見出し、本願発明を完成するに至った。
したがって、本願発明は、ｐＵＣの複製開始点、ｔｒｐプロモーター及びダニ主要アレルゲン遺伝子を含む発現ベクターにより形質転換された組換え大腸菌を、発現誘導剤の非存在下、３２℃で培養した後、更に３７℃で培養することからなるダニ主要アレルゲンの製造方法及び当該製造方法によって得られた、発現誘導剤を全く含有しないダニ主要アレルゲンを包含する。同様に、ダニ主要アレルゲン遺伝子の代わりにマクロファージ毒素の遺伝子またはブタ丹毒感染防御抗原の遺伝子を用いた同様の製造方法及び当該製造方法によって得られた、発現誘導剤を全く含有しないマクロファージ毒素及びブタ丹毒感染防御抗原を包含する。
本願発明の方法は、温度シフトにより発現誘導を行うことができるプロモーター、好ましくはｔｒｐプロモーターの下流に異種蛋白質遺伝子が組み込まれた発現ベクターで大腸菌を形質転換する工程、得られる組換え大腸菌（異種蛋白質産生大腸菌）を任意に低温で培養して工業生産レベルにまで増殖させる工程、及び発現誘導剤の非存在下に高温で培養して異種蛋白質の発現誘導を行う工程を含む異種蛋白質の製造方法によって特徴付けられる。本願発明の方法を用いることにより、発現誘導剤を全く含有しない組換え異種蛋白質を大量に取得することができる。
本発明の方法によって発現できる異種蛋白質としては、上記ダニ主要アレルゲン、ブタ胸膜肺炎菌由来分泌性マクロファージ毒素及びブタ丹毒感染防御抗原以外にも、例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）やヒト成長ホルモンなどの生理活性物質は、組換え医薬品として使用されているが、発現誘導剤などの不純物が混入していない方が望ましく、これらの蛋白質の生産にも使用できる。
以下、ダニ主要アレルゲンを中心に本願発明について詳述する。
これまでに同定されたＤｅｒ ｆ １、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２など何れのダニ主要アレルゲン遺伝子も本願発明に使用することができる。これらのダニ主要アレルゲン遺伝子を含む核酸断片は、ダニから抽出したｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを出発材料として、Ｓａｍｂｒｏｏｋらが述べている一般的な遺伝子組換え技術（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）に従って調製することができる。
実際には、市販のキットが使用される。例えば、ＲＮＡの抽出には、ＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン社）、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（東洋紡）などの試薬、ｍＲＮＡの精製には、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社）、Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｑｕｉｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（東洋紡）、ｍＲＮＡ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｋｉｔ（クロンテック社）などのキット、ｃＤＮＡへの変換には、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社）、ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（宝酒造）、ＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＆ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（クロンテック社）、Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｒｙ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ（ノバジェン社）などが使用される。
塩基配列の一部を置換したダニ主要アレルゲン遺伝子を用いれば、改変型のダニ主要アレルゲンを得ることができる。このようなダニ主要アレルゲン遺伝子を含む核酸断片は、特許第２６５７８６１号公報に記載の方法に従って、改変型ダニ主要アレルゲンのｃＤＮＡを保持しているプラスミドを作製し、これを鋳型としてＰＣＲ法を実施することにより取得することができる。本願発明では、改変型ダニ主要アレルゲン遺伝子を含む核酸断片が使用される。
より具体的には、かかる改変型ダニ主要アレルゲン遺伝子は、改変型ダニ主要アレルゲンのｃＤＮＡを保持しているプラスミドｐＦＬＴ１１−Ｃ８／１１９Ｓを鋳型として５’末端に制限酵素切断部位ＮｓｐＶを含むプライマー（配列表の配列番号１）及び３’末端に制限酵素切断部位ＮｒｕＩを含むプライマー（配列表の配列番号２）を用いてＰＣＲ法により取得される。こうして得られた改変型ダニ主要アレルゲンをコードする核酸断片（以下、「Ｃ８／１１９Ｓ」と称することもある）が発現ベクターに組込まれる。
本願発明に用いられる発現ベクターは、上記のＣ８／１１９Ｓ断片を、温度シフト（高温）により発現誘導を行うことができるプロモーターの下流に接続し、これを複製開始点を含有するＤＮＡ断片に結合させることによって構築される。このようなプロモーターとして、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター及びλＰＬプロモーターが挙げられる。好ましくは、数種の大腸菌株に対して使用することができるｔｒｐプロモーターである。
複製開始点として、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐＡＣＹＣ、ｐＳＣ１０１、ＣｏｌＥ１などのプラスミド由来の複製開始点を使用することができるが、好ましくは、宿主内におけるコピー数の多いことが知られているｐＵＣ由来の複製開始点が用いられる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。
上記の発現ベクターを用いて形質転換する大腸菌として、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＬＥ３９２、ＴＢ１など一般的に市販されている株が使用できる。後述の実施例（図６）から明らかなように、ダニ主要アレルゲンの発現量は、プロモーターと大腸菌株との組合せによって異なる。したがって、ダニ主要アレルゲンを大量に発現させるには、両者の組合せが重要である。例えば、ｔｒｐプロモーターが使用される場合には、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、またはＴＢ１のいずれかの株が選択され、ｔｒｃプロモーターが使用される場合は、ＪＭ１０９株が選択される。最も大量且つ効果的なダニ主要アレルゲンの発現は、ｔｒｐプロモーター、ダニ主要アレルゲン遺伝子（Ｃ８／１１９Ｓ）及びｐＵＣ由来の複製開始点を含む発現ベクターで大腸菌ＨＢ１０１またはＴＢ１を形質転換したときに達成される。
大腸菌の形質転換は、市販のコンピテントセル（Ｔａｋａｒａ社）を用い、添付の方法に従って行うことができる。あるいは、バイオ実験イラストレイテッド（秀潤社）に記載の方法に従って行うことができる。大腸菌の培養に使用される培地（例えば、ＬＢ、ＳＯＣ、ＳＯＢなどが使用できる）及び形質転換体の選択に用いられる試薬（例えば、アンピシリンなど）は、一般に市販されているものを使用すればよい。また、培地のｐＨは、大腸菌の増殖に適した範囲（ｐＨ６〜８）で用いられる。
ダニ主要アレルゲンを発現している組換え大腸菌のスクリーニングは、以下のように行われる。発現誘導剤の存在下あるいは非存在下に、培養・増殖した菌体を遠心分離により回収し、これに一定の生理食塩水を加え懸濁した後、超音波処理により菌体を破砕し、高速遠心（１４０００ｒｐｍ、３０分間）により封入体を回収する。再度、適当量の生理食塩水に懸濁した後、一定量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、クマシーブリリアントブルーで染色した後、分子サイズ（約１５ｋＤ）及び染色像からダニ主要アレルゲンの発現を確認する。また、回収した封入体の湿重量を測定することにより、発現量を確認する。こうして得られたダニ主要アレルゲン産生大腸菌は、大量培養に供するための生産株としてグリセリンストックにされる。
ダニ主要アレルゲンの発現の確認（またはダニ主要アレルゲンの検出）には、上記の分子サイズに基づく方法以外に、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法、ドットブロット法などの抗原抗体反応に基づく方法がとられることもある。いずれも大腸菌で発現させた異種蛋白を検出する際の一般的な方法であり、目的に応じて適宜選択すればよい。
本願発明の特徴の一つは、上記のダニ主要アレルゲン産生大腸菌を、ダニ主要アレルゲンが発現しない条件で工業生産レベルにまで培養増殖した後、発現誘導剤を使用することなく培養温度を高温にシフトさせて効率よく当該蛋白質を生産することにある。より具体的には、前記のグリセリンストックをＬ液体培地に接種し低温培養する。この培養により菌体は増殖するがダニ主要アレルゲンはほとんど発現しない。菌体数が適当に増加した時点で、発現誘導剤を添加することなく、培養温度を高温にシフトし、培養を続ける。この温度シフトにより初めてダニ主要アレルゲンの発現が加速される。このような培養方法をとることより、菌体は、栄養源の少ない培地中で効率よく増殖し、且つダニ主要アレルゲンの大量発現が達成される。
大腸菌を増殖させるときの培養温度として、２０〜３４℃を使用できるが、好ましくは２５〜３２℃である。ダニ主要アレルゲンを効果的に発現させるときの温度は、使用される発現ベクターの種類によって異なるが、３５〜４０℃の範囲で使用される。好ましくは、３７〜３８℃である。本願発明は、低温培養で細胞を増殖させた後に、高温培養で異種蛋白質を発現させることを特徴とするが、目的によっては、最初から高温培養を行い、菌体の増殖及び異種蛋白質の発現を同時に行うことによって異種蛋白質を産生させることもできる。
培養期間は、培養温度及びダニ主要アレルゲンの製造スケールに依存するが、低温培養は、組換え大腸菌が対数増殖期の中期に達するまで行うのが好ましい。また、高温培養は、ダニ主要アレルゲンの量がピークに達するまで行うのが好ましい。より具体的には、組換え大腸菌（ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１）のグリセリンストック１０ｍｌを約１Ｌの培地に接種し、３２℃で６〜１０時間培養した後、これを２００〜３００Ｌの培地に接種し、２５℃で１２〜１７時間培養する。その後、３７℃で８〜１６時間培養することにより、湿重量で約７〜１０ｇ／Ｌのダニ主要アレルゲンを含む封入体が生産できる。
かかるダニ主要アレルゲン産生大腸菌からダニ主要アレルゲンを精製する際には、一般的に、蛋白質化学において使用される精製方法、例えば、塩析法、限外ろ過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマト法、ゲルろ過クロマト法、アフィニティークロマト法、疎水クロマト法、ハイドロキシアパタイトクロマト法などの方法が用いられる。実際には、細胞由来の多種類の夾雑物が混在するため、ダニ主要アレルゲンの精製は、上記方法の複雑な組み合わせにより行われる。
上述したダニ主要アレルゲンの製造方法は、大腸菌における異種蛋白質の製造方法の一例である。ダニ主要アレルゲン遺伝子の代わりに他の蛋白質をコードする遺伝子またはその一部の遺伝子断片を用いることによって、発現誘導剤を含有しない当該蛋白質またはその一部のオリゴペプチド若しくはポリペプチドを効率よく取得することができる。このような他の蛋白質遺伝子の例として、ブタ胸膜肺炎菌由来分泌性マクロファージ毒素（ＡｐｘＩＩＩ）をコードする遺伝子、ブタ丹毒感染防御抗原をコードする遺伝子などが挙げられる。
以下に、実施例を挙げて本願発明を具体的に説明するが、本願発明はこれら実施例に何等限定されるものではない。
実施例１：ダニ主要アレルゲン産生大腸菌の作製
（１）トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターを有する発現ベクターｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓの構築
先ず、ｔｒｐプロモーターの下流に改変ダニ主要アレルゲン（Ｃ８／１１９Ｓ）遺伝子断片を結合した遺伝子断片を以下のように構築した。
ｔｒｐプロモーターを含む０．５キロ塩基対の遺伝子断片は、大腸菌プラスミドｐｔｒｐＥＤ ５−１（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、Ｇｅｎｅ ９，２７−４７，１９８０）をＨｉｎｆ Ｉで完全消化して得た。得られたトリプトファンプロモーター遺伝子断片の粘着末端を埋め、５’及び３’末端にＥｃｏＲＩリンカー（ＴａＫａＲａ社製）を結合した後、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、組換えベクターｐＷを作製した。
次に、改変ダニ主要アレルゲン遺伝子（Ｃ８／１１９Ｓ）を含む核酸断片を、当該改変ダニ主要アレルゲン遺伝子を保持しているプラスミドｐＦＬＴ１１−Ｃ８／１１９Ｓ（特許第２６５７８６１号公報参照）を鋳型として、５’末端に制限酵素切断部位ＮｓｐＶを含む合成プライマー（配列表の配列番号１）及び３’末端に制限酵素切断部位ＮｒｕＩを含む合成プライマー（配列表の配列番号２）を用いて、ＰＣＲ法を実施することにより取得した。
この核酸断片を制限酵素ＮｓｐＶ及びＮｒｕＩで完全消化して得られる断片と制限酵素ＣｌａＩ及びＮｒｕＩで完全消化した組換えベクターｐＷとをＴ４リガーゼ（ＴａＫａＲａ社製）で連結して、発現ベクターｐＷ１１−Ｃ８／１１９Ｓを作製した。
次に、発現量を増加させる目的で、ｐＷ１１−Ｃ８／１１９Ｓに含まれるｐＢＲ３２２由来の複製開始点をｐＵＣ１８由来の複製開始点に置換した。プラスミドｐＵＣ１８を、制限酵素ＰｖｕＩ及びＰｖｕＩＩで完全消化して、複製開始点を含む遺伝子断片を得た。一方で、プラスミドｐＷ１１−Ｃ８／１１９ＳをＮｒｕＩ及びＰｖｕＩで完全消化して、改変ダニ主要アレルゲン遺伝子（Ｃ８／１１９Ｓ）を含む核酸断片を得た。調製した二つの核酸断片をＴ４リガーゼで連結して、発現プラスミドｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓを得た（図１）。
（２）ｔｒｐ・ｌａｃ融合プロモーター（ｔｒｃ）を有する発現ベクターｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓの構築
ｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターであるｔｒｃプロモーターは、発現プラスミドｐＫＫ２３３−２（アマシャム社製）から調製した。ｐＫＫ２３３−２を制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで完全消化して４．６キロ塩基対の遺伝子断片を得た。改変ダニ主要アレルゲン遺伝子（Ｃ８／１１９Ｓ）を含む核酸断片は、５’末端に制限酵素切断部位ＮｃｏＩを含む合成プライマー（配列表の配列番号３）及び３’末端に制限酵素切断部位ＨｉｎｄＩＩＩを含む合成プライマー（配列表の配列番号４）を用いる以外は、（１）と同様にＰＣＲ法を実施することにより取得した。この核酸断片を制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで完全消化して得られる断片と、ｔｒｃプロモーターを含む４．６キロ塩基対の遺伝子断片とをＴ４リガーゼで連結して発現ベクターｐＦＬＫ１１−Ｃ８／１１９Ｓを作製した。（１）と同じ方法により、ｐＦＬＫ１１−Ｃ８／１１９Ｓに含まれるｐＢＲ３２２由来の複製開始点をｐＵＣ１８由来の複製開始点に置換した発現プラスミドｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓを作製した（図２）。
（３）組換え大腸菌の作製
上記（１）及び（２）で得られた発現プラスミドｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ及びｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓを用いて、大腸菌株ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＴＢ１及びＬＥ３９２をそれぞれ形質転換し、組換え大腸菌株ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１、ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９、ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１及びｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＬＥ３９２、並びにｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１、ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９、ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１及びｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＬＥ３９２を得た。
実施例２：ダニ主要アレルゲンを発現している組換え大腸菌のスクリーニング
（１）発現誘導剤の存在下におけるダニ主要アレルゲンの発現
発現誘導剤の存在下において、ダニ主要アレルゲンを大量に発現している組換え大腸菌のスクリーニングを以下の方法により実施した。Ｌ型試験管に分注された５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ液体培地（１０ｍｌ）に、組換え体ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１、ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９、ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１、ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＬＥ３９２、ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１、ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９、ｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１及びｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＬＥ３９２をそれぞれ接種し、３２℃で約２〜３時間振盪培養した。菌体の濁度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．４以上になったところで、ｔｒｐプロモーターを使用した発現系には、終濃度で５０μｇ／ｍｌのインドール酢酸（シグマ社製）を添加した。またｔｒｃプロモーターを使用した発現系には、終濃度で１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（和光純薬社製）を添加した。その後更に６時間培養することにより発現誘導を行った。
培養後の菌体は、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿として回収した。この菌体に適当量の生理食塩水を添加して再懸濁して、菌体濁度（ＯＤ６００ｎｍ）が２０になるように調製した。各１ｍｌの菌体懸濁液をサンプルチューブ（アシスト社製）に取り、超音波処理して菌体を破砕した。１４０００ｒｐｍで３０分間遠心して、封入体を沈殿として回収した。回収した封入体は再度１ｍｌの生理食塩水に懸濁した。封入体懸濁液と等量のＳＤＳサンプルバッファーを混合し、１００℃で２分間の加熱処理を行った後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、クマシーブリリアントブルー（ナカライテスク社製）で染色した。１５ｋＤ付近のバンドの染色像を比較した結果、ダニ主要アレルゲンは、組換え体ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１で最も発現量が多く、次いでｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９及びｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１の系で発現していることが判明した（図３）。
次に、３７℃で培養した場合のダニ主要アレルゲンの発現量を確認した。培養温度を３７℃で行うこと以外は、上記と同じ方法に従って行った。その結果、ダニ主要アレルゲンは、組換え体ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１及びｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１の系でより多く発現し、次いでｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９の系で発現していることが判明した（図４）。
（２）発現誘導剤の非存在下におけるダニ主要アレルゲンの発現
発現誘導剤の非存在下において、ダニ主要アレルゲンを大量発現している組換え大腸菌のスクリーニングを（１）と同じ方法により実施した。その結果、３２℃での振盪培養した場合には、何れの組換え体においても、ダニ主要アレルゲンの発現はほとんど確認できなかったが（図５）、３７℃で振盪培養した場合には、組換え体ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１及びｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＴＢ１は、ダニ主要アレルゲンを産生していた（図６）。また、ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９及びｐＦＬＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＪＭ１０９も前記の組換え体よりも発現量は少ないが、ダニ主要アレルゲンの発現を確認することができた（図６）。菌体当りのダニ主要アレルゲンの発現量は発現誘導剤を用いた場合と同等であった。しかしながら、発現誘導剤を添加しなかった場合の菌体の増殖（菌体密度）は、発現誘導剤を添加した場合よりも２〜４割程度高かった（表１）。したがって、ダニ主要アレルゲンの培養容量当りの生産量は、発現誘導剤を使用した場合よりも多くなることが判明した。
組換え体ｐＷＵ１１−Ｃ８／１１９Ｓ／ＨＢ１０１をダニ主要アレルゲンの生産株として、グリセリンストックを作製した。グリセリンストックは、以下の方法で調製した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ液体培地１Ｌに組換え体を接種し、３２℃で一晩振盪培養した。この培養液に、等量の滅菌したグリセリン（和光純薬社製）を添加して充分混和した。アシストチューブ（アシスト社製）に１０ｍｌずつ２００本分注し、超低温冷凍庫に凍結保存した。
グリセリンストックの１本を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ液体培地（１．５Ｌ）に接種し、３２℃で８時間振盪培養した。この培養菌液を２５０ＬのＬ液体培地に接種し、２５℃で一晩通気培養した後、３７℃に培養温度を上げて更に１２時間通気培養した（図７）。この期間、菌体の増殖に合わせてアミノ酸等の添加を適時実施した。
３７℃で培養している間は、培養液の一部を経時的にサンプリングした。サンプリングした培養液中の菌体は、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿として回収した。この菌体に適当量の生理食塩水を添加して再懸濁して、菌体濁度（ＯＤ６００ｎｍ）が２０になるように調製した。各菌体懸濁液の１ｍｌをサンプルチューブ（アシスト社製）に取り、超音波処理して菌体を破砕した。１４０００ｒｐｍで３０分間遠心して封入体を沈殿として回収した。回収した封入体は再度１ｍｌの生理食塩水に懸濁した。封入体懸濁液と等量のＳＤＳサンプルバッファーを混合し、１００℃で２分間の過熱処理を行った後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、クマシーブリリアントブルー（ナカライテスク社製）で染色し、発現を確認した。その結果、培養温度を３７℃に昇温して３時間後にはダニ主要アレルゲンが封入体として蓄積されていることが判明した。菌体は培養終了まで増殖し続け（図７）、その間ダニ主要アレルゲンの単位菌体当りの発現量も漸増した（図８）。
実施例４：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のマクロファージ毒素蛋白質 （ＡｐｘＩＩＩΔ２）を生産する組換え大腸菌の作製
（１）プラスミドｐＵＣ−Ｔｒｐ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓの構築
ｔｒｐプロモーターの制御下にマクロファージ毒素蛋白質（ＡｐｘＩＩＩΔ２）を発現させるための発現カセットＴｒｐ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを有するプラスミドｐＵＣ−Ｔｒｐ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを以下のように構築した（図９）。
▲１▼市販プラスミドｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｂ（インビトロジェン）を制限酵素ＭｌｕＩ、ＮｃｏＩで消化し、約３．９Ｋｂｐの断片を精製した。
▲２▼センス鎖、アンチセンス鎖のｔｒｐプロモーター領域の合成Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ（配列表の配列番号５及び６）（シグマゲノシス社に合成委託）を等モルで混合し、９４℃で１分、７５℃で１０分加熱し、室温まで徐々に温度を下げることで、アニーリングさせた。プロモーターの上流側にはＭｌｕＩ、下流側にはＮｃｏＩの突出末端の相補鎖を付加した。
▲３▼アニーリングさせたｔｒｐプロモーターＤＮＡフラグメント（▲２▼）を、先に調製した３．９ＫｂｐのｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（▲１▼）に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｌ（宝酒造）を用いてライゲーションした（１０℃、一昼夜）。これを市販の大腸菌ＴＯＰ１０（インビトロジェン社）に導入した。得られたプラスミドをｐＢＲ−Ｔｒｐ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓとした。
▲４▼ｐＢＲ−Ｔｒｐ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを制限酵素ＭｌｕＩとＢｓｒＢＩで処理し、約０．５Ｋｂｐのフラグメントを精製した。このフラグメントには、ｔｒｐプロモーターとｐＢＡＤ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ由来のマルチクローニングサイト、Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ＨｅｘａｍｅｒのＤＮＡ配列及び大腸菌由来ｒｒｎＢ Ｔ１及びＴ２の転写終結配列からなる発現カセットＴｒｐ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを含む。この約０．５ＫｂｐフラグメントをＢｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈキット（東洋紡）を用いて平滑末端処理した。
▲５▼プラスミドｐＵＣ１８（宝酒造）を制限酵素ＰｖｕＩＩ、ＮｄｅＩで処理し、２．２Ｋｂｐの断片を精製し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈキット（東洋紡）を用いて平滑末端処理した。
▲６▼ｔｒｐプロモーターを含む平滑末端処理した約０．５Ｋｂｐフラグメント（▲４▼）を制限酵素処理・平滑末端処理したｐＵＣ１８ ＤＮＡに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒｌ（宝酒造）を用いてライゲーションし（１０℃、一昼夜）、これを大腸菌（ＪＭ１０９）に導入し、得られた形質転換体からＴｒｐ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを有するプラスミドｐＵＣ−Ｔｒｐ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを精製した（図９）。
（２）発現ベクターｐＴｒｐ−ＡｐｘＩＩＩΔ２の構築
ＡｐｘＩＩＩのＮ末端側疎水性領域以外の部分（ＡｐｘＩＩＩΔ２）をコードする遺伝子断片をプラスミドｐＵＣ−Ｔｒｐ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓに挿入した発現ベクターｐＴｒｐ−ＡｐｘＩＩＩΔ２を以下のように構築した（図１０）。ＤＮＡ抽出キットＩＳＯＰＬＡＮＴ（和光純薬）を用いてＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＮＧ−２２株（血清型２型）のＤＮＡを抽出し、これを鋳型にＡｐｘＩＩＩΔ２をコードする領域をＰＣＲキット（宝酒造ＬＡ Ｔａｑ）を用いて増幅した。ＰＣＲには、Ｃｈａｎｇら（ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９３；１２：３５１−６２）が報告したａｐｘＩＩＩＡの塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｌ１２１４５）に基づき選定された塩基配列に、ＦｓｐＩサイトが付加された上流側プライマー（配列表の配列番号７）及びＮｏｔＩサイトが付加された下流側プライマー（配列表の配列番号８）を用いた。
ＰＣＲにより得られた断片を市販のベクターｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ（インビトロジェン社）にクローニングし、ｐＣＲ−ＡｐｘＩＩＩΔ２を得た。得られたプラスミドを制限酵素ＦｓｐＩ、ＮｏｔＩで処理し、約１．８ＫｂｐのＤＮＡ断片を精製し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈキット（東洋紡）を用いて平滑末端処理した。一方、（１）で得たｐＵＣ−Ｔｒｐ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを制限酵素ＮｃｏＩ、ＸｂａＩで処理し、同キットで平滑末端処理した後、エビ由来アルカリ性フォスファターゼ（プロメガ社）で処理した。このＤＮＡと先に調製したＡｐｘＩＩＩΔ２をコードしている１．８Ｋｂｐ ＤＮＡ断片をライゲーションし、発現ベクターｐＴｒｐ−ＡｐｘＩＩＩΔ２を構築した（図１０）。
（３）発現誘導剤の非存在下におけるＡｐｘＩＩＩΔ２の発現
上記の発現ベクターｐＴｒｐ−ＡｐｘＩＩＩΔ２を大腸菌ＨＢ１０１（宝酒造）に導入し、ｐＴｒｐ−ＡｐｘＩＩＩΔ２を有するＨＢ１０１形質転換体を得た。これをサークルグロー培地（ＢＩＯ１０１）に接種し、３７℃で約１６時間培養した。培養菌液１ｍｌを１００００回転／分、１分間遠心し、菌体を回収した。これに４００μｌのＳＤＳサンプルバッファーを混合し、１００℃で２分間の加熱処理を行った後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーで染色した（図１１）。また、電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、ペルオキシダーゼ標識抗Ｈｉｓタグ抗体（インビトロジェン社）と４℃一夜反応後、コニカイムノステイン（生化学工業）を用いて発現蛋白を染色した（図１２）。約６９ ｋＤａのＡｐｘＩＩＩΔ２の発現が認められた。
実施例５：ブタ丹毒菌の感染防御抗原蛋白質（ΔＳｐａＡ）を生産する組換え大腸菌 の作製
（１）発現ベクターｐＵＣ−Ｔｒｐ ΔｓｐａＡの構築
ブタ丹毒菌の感染防御抗原蛋白質遺伝子（ｓｐａＡ）の第８８〜１２９３番目に相当する１２０６ｂｐの塩基配列によってコードされる当該蛋白質（以下、「ΔＳｐａＡ」と称する）をコードする遺伝子断片（以下、「ΔｓｐａＡ」と称する）がプラスミドｐＵＣ−Ｔｒｐ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓに挿入された発現ベクターｐＵＣ−Ｔｒｐ ΔｓｐａＡを以下のように構築した（図１３）。
ブタ丹毒菌ＳＥ−９株の培養菌体よりＩＳＯＰＬＡＮＴ（ニッポンジーン社）を用いて抽出したＤＮＡをテンプレートとし、公表された塩基配列情報（Ｉｍａｄａ，Ｙ．，Ｇｏｊｉ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．，Ｋｉｓｈｉｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｓｅｋｉｚａｋｉ，Ｔ．Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＳｐａＡ）ｏｆ Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ ｓｅｒｏｔｙｐｅ １ａ ｅｌｉｃｉｔｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １ａ ａｎｄ ２ｂ ｉｎ ｐｉｇｓ．：Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７（９），４３７６−４３８２（１９９９））／ ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０１９１２４）に基づき合成した２種類のプライマー、ＮｃｏＩサイトが付加された上流プライマー（配列表の配列番号９）及びＢａｍＨＩサイトが付加された下流プライマー（配列表の配列番号１０）を用いてＰＣＲを行った。増幅したΔｓｐａＡを含む断片を制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで２重消化した後、これを同様の酵素処理を行ったプラスミドｐＥＴ１１ｄ（ノバジェン社）にＴ４ ＤＮＡリガーゼ処理して連結した。連結ＤＮＡで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有ＬＢ寒天培地に塗布して、アンピシリン耐性を持つ株を選択した。選択株よりプラスミドを抽出して、ΔｓｐａＡを保持するプラスミドｐＥＴ１１ｄ ΔｓｐａＡを得た（図１３）。
次に、実施例４の（１）で得たプラスミドｐＵＣ−Ｔｒｐ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで２重消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動により、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７ｋｂの核酸断片を回収した。一方、ｐＥＴ１１ｄ ΔｓｐａＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで２重消化した後、０．８％アガロースゲル電気泳動により、約１．５ｋｂのΔｓｐａＡを含む核酸断片を回収し、これを先に得た約２．７ｋｂの核酸断片にＴ４ＤＮＡリガーゼ処理して連結した。連結ＤＮＡで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有ＬＢ寒天培地に塗布して、アンピシリン耐性を持つ株を選択し、発現ベクターｐＵＣ−Ｔｒｐ ΔｓｐａＡを保持する組換え大腸菌を得た（図１３）。
（２）発現誘導剤の非存在下におけるΔＳｐａＡの発現
上記の発現ベクターｐＵＣ−Ｔｒｐ ΔｓｐａＡを保持する組換え大腸菌をサークルグロー培地（ＢＩＯ１０１）に接種し、３０℃で約１５時間培養した後、３７℃で約２５時間培養した。コントロールとして非形質転換大腸菌（ＨＢ１０１）を用いた。経時的にサンプリングした培養菌液に等量のＳＤＳサンプルバッファーを等量混合し、１００℃で２分間の加熱処理を行った後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーで染色した。その結果、培養温度を３０℃から３７℃にシフトすることによって、約５０ｋＤａのΔＳｐａＡの発現が認められた（図１４）。 The present inventors transformed Escherichia coli with an expression vector containing the major allergen gene of mite as a gene encoding the replication origin of vector pUC, trp promoter and heterologous protein, and the resulting recombinant Escherichia coli was used as a non-expression inducer. When cultured at 32 ° C. and 37 ° C. in the presence, most of the major mite allergens were not expressed at 32 ° C., and the mite major allergens can be produced in large quantities and effectively by continuing the culture by shifting the temperature to 37 ° C. I found it. Similarly, an expression inducer should be used by using an expression vector containing a secreted macrophage toxin (ApxIII) gene derived from porcine pneumococcus pneumoniae and a porcine erysipelas infection antigen gene as genes encoding other heterologous proteins. The inventors have found that these proteins can be produced, and have completed the present invention.
Therefore, the present invention relates to a recombinant Escherichia coli transformed with an expression vector containing the pUC origin of replication, trp promoter and tick major allergen gene, after culturing at 32 ° C. in the absence of an expression inducer. A method for producing a major mite allergen comprising culturing at 0 ° C. and a major mite allergen that is obtained by the production method and does not contain any expression inducer. Similarly, a similar production method using a macrophage toxin gene or a porcine erysipelas infection-protecting antigen gene instead of a tick major allergen gene, and a macrophage toxin and swine erysipelas containing no expression inducer obtained by the production method. Includes protective antigens.
The method of the present invention comprises a step of transforming Escherichia coli with an expression vector in which a heterologous protein gene is incorporated downstream of a promoter capable of inducing expression by a temperature shift, preferably the trp promoter, and the resulting recombinant Escherichia coli (heterologous protein A method for producing a heterologous protein, comprising a step of optionally cultivating E. coli) at a low temperature to grow it to an industrial production level, and a step of culturing at a high temperature in the absence of an expression inducer to induce expression of the heterologous protein. Characterized. By using the method of the present invention, a large amount of recombinant heterologous protein containing no expression inducer can be obtained.
The heterologous protein that can be expressed by the method of the present invention includes, for example, tissue plasminogen activator (tPA) and human growth other than the above-mentioned major mite allergen, secreted macrophage toxin derived from porcine pleural pneumococcus, and swine erysipelas infection protective antigen. Physiologically active substances such as hormones are used as recombinant pharmaceuticals, but it is desirable that impurities such as expression inducers are not mixed, and these proteins can also be used for the production of these proteins.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with a focus on major allergens of mites.
Any tick major allergen gene such as
In practice, commercially available kits are used. For example, for extraction of RNA, reagents such as TRIzol reagent (Invitrogen), ISOGEN (Nippon Gene), StrataPrep Total RNA Purification Kit (Toyobo), for purification of mRNA, mRNA Purification Kit (Amersham Bioscience), Poly (A) Kits such as Quick mRNA Isolation Kit (Toyobo), mRNA Separator Kit (Clontech) for conversion to cDNA, SuperScript plasmid system, cDNA synthesis and plasmid Genki (Sc) SMART PCR cD NA Synthesis & Library Construction Kits (Clontech), Directional cDNA Library Construction systems (Novagen), etc. are used.
If a tick major allergen gene in which a part of the base sequence is replaced is used, a modified tick major allergen can be obtained. For such a nucleic acid fragment containing a major mite allergen gene, a plasmid carrying a modified tick major allergen cDNA is prepared according to the method described in Japanese Patent No. 2567861, and PCR is carried out using this plasmid as a template. Can be obtained. In the present invention, a nucleic acid fragment containing a modified tick major allergen gene is used.
More specifically, such a modified tick major allergen gene is a primer containing a restriction enzyme cleavage site NspV at the 5 ′ end using the plasmid pFLT11-C8 / 119S carrying the modified tick major allergen cDNA as a template. It is obtained by the PCR method using SEQ ID NO: 1) in the sequence listing and a primer (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) containing a restriction enzyme cleavage site NruI at the 3 ′ end. The thus obtained nucleic acid fragment encoding the modified major mite major allergen (hereinafter also referred to as “C8 / 119S”) is incorporated into an expression vector.
In the expression vector used in the present invention, the above C8 / 119S fragment is connected downstream of a promoter capable of inducing expression by temperature shift (high temperature), and this is linked to a DNA fragment containing the replication origin. Built by that. Examples of such a promoter include trp promoter, trc promoter, PL promoter, T7 promoter, lac promoter, tac promoter, and λPL promoter. Preferably, the trp promoter can be used for several types of E. coli strains.
As an origin of replication, for example, an origin of replication derived from a plasmid such as pBR322, pUC, pACYC, pSC101, ColE1 can be used, but preferably derived from pUC known to have a large number of copies in the host (Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989).
As E. coli transformed with the above expression vector, generally commercially available strains such as HB101, JM109, LE392, TB1 can be used. As will be apparent from the examples (FIG. 6) described later, the expression level of the major mite allergen varies depending on the combination of the promoter and the E. coli strain. Therefore, in order to express a large amount of major mite allergens, a combination of both is important. For example, when the trp promoter is used, any strain of HB101, JM109, or TB1 is selected, and when the trc promoter is used, the JM109 strain is selected. The most abundant and effective expression of major mite allergens is achieved when E. coli HB101 or TB1 is transformed with an expression vector containing the trp promoter, tick major allergen gene (C8 / 119S) and the pUC origin of replication. .
Transformation of E. coli can be performed using a commercially available competent cell (Takara) according to the attached method. Or it can carry out according to the method as described in Bio-Experiment Illustrated (Shyujunsha). As a medium used for culturing Escherichia coli (for example, LB, SOC, SOB, etc. can be used) and a reagent used for selection of a transformant (for example, ampicillin, etc.), commercially available ones may be used. . Further, the pH of the medium is used in a range (
Screening of recombinant Escherichia coli expressing a tick major allergen is performed as follows. The cultured and proliferated cells are collected by centrifugation in the presence or absence of an expression inducer, suspended in a certain amount of physiological saline, and then sonicated to disrupt the cells. The inclusion bodies are collected by centrifugation (14000 rpm, 30 minutes). After suspending in an appropriate amount of physiological saline again, a certain amount was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, stained with Coomassie Brilliant Blue, and then the expression of major mite allergens from the molecular size (about 15 kD) and stained images. Check. In addition, the expression level is confirmed by measuring the wet weight of the collected inclusion bodies. The mite major allergen-producing Escherichia coli thus obtained is made into a glycerin stock as a production strain for use in mass culture.
To confirm the expression of major mite allergens (or detection of major mite allergens), methods based on antigen-antibody reactions such as ELISA, Western blot, and dot blot can be used in addition to the methods based on the above molecular sizes. There is also. Both are general methods for detecting heterologous proteins expressed in E. coli, and may be appropriately selected according to the purpose.
One of the features of the present invention is that the above-mentioned major mite allergen-producing Escherichia coli is cultured and proliferated to the industrial production level under conditions where the major mite allergen is not expressed, and then the culture temperature is shifted to a high temperature without using an expression inducer. And producing the protein efficiently. More specifically, the glycerin stock is inoculated into an L liquid medium and cultured at a low temperature. By this culture, the cells grow, but the major mite allergen is hardly expressed. When the number of cells increases appropriately, the culture temperature is shifted to a high temperature without adding an expression inducer, and the culture is continued. This temperature shift accelerates the expression of major mite allergens for the first time. By adopting such a culture method, the microbial cells are efficiently proliferated in a medium having few nutrient sources, and a large amount of major mite allergen is achieved.
Although 20-34 degreeC can be used as culture | cultivation temperature when growing E. coli, Preferably it is 25-32 degreeC. The temperature at which the major mite allergen is effectively expressed varies depending on the type of expression vector used, but is used in the range of 35 to 40 ° C. Preferably, it is 37-38 degreeC. The invention of the present application is characterized in that a heterologous protein is expressed in a high-temperature culture after the cells are grown in a low-temperature culture, but depending on the purpose, high-temperature culture is performed from the beginning to increase the cell growth and the expression of the heterologous protein. A heterologous protein can also be produced by carrying out simultaneously.
The culture period depends on the culture temperature and the production scale of the major mite allergen, but the low temperature culture is preferably performed until the recombinant Escherichia coli reaches the middle stage of the logarithmic growth phase. The high temperature culture is preferably performed until the amount of the major mite allergen reaches a peak. More specifically, 10 ml of a glycerin stock of recombinant E. coli (pWU11-C8 / 119S / HB101) is inoculated into about 1 L of medium and cultured at 32 ° C. for 6 to 10 hours, and then this is added to 200 to 300 L of medium. Inoculate and incubate at 25 ° C. for 12-17 hours. Thereafter, by culturing at 37 ° C. for 8 to 16 hours, inclusion bodies containing about 7 to 10 g / L of a major mite allergen by wet weight can be produced.
When purifying mite major allergens from such mite major allergen-producing Escherichia coli, purification methods generally used in protein chemistry, such as salting out, ultrafiltration, isoelectric precipitation, electrophoresis, etc. Methods such as ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, and hydroxyapatite chromatography are used. Actually, since many kinds of cell-derived contaminants coexist, purification of the major mite allergen is performed by a complicated combination of the above methods.
The above-described method for producing a major tick allergen is an example of a method for producing a heterologous protein in Escherichia coli. By efficiently using a gene encoding another protein or a partial gene fragment thereof instead of the tick major allergen gene, the protein or a partial oligopeptide or polypeptide thereof that does not contain an expression inducer is obtained. Can do. Examples of such other protein genes include a gene encoding a secreted macrophage toxin (ApxIII) derived from porcine pleural pneumococci, a gene encoding a porcine erysipelas infection protective antigen, and the like.
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1: Production of major mite allergen-producing Escherichia coli
(1) Construction of expression vector pWU11-C8 / 119S having a tryptophan (trp) promoter
First, a gene fragment in which a modified tick major allergen (C8 / 119S) gene fragment was linked downstream of the trp promoter was constructed as follows.
A 0.5 kilobase pair gene fragment containing the trp promoter was obtained by complete digestion of E. coli plasmid ptrpED 5-1 (Hallewell et al.,
Next, a nucleic acid fragment containing the modified tick major allergen gene (C8 / 119S) is used as a template using plasmid pFLT11-C8 / 119S (see Japanese Patent No. 25677861) carrying the modified tick major allergen gene as a template. PCR is carried out using a synthetic primer containing a restriction enzyme cleavage site NspV at the end (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) and a synthetic primer containing a restriction enzyme cleavage site NruI at the 3 ′ end (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing). Was obtained by
A fragment obtained by completely digesting this nucleic acid fragment with restriction enzymes NspV and NruI and a recombinant vector pW completely digested with restriction enzymes ClaI and NruI were ligated with T4 ligase (manufactured by TaKaRa) and expression vector pW11-C8. / 119S was produced.
Next, for the purpose of increasing the expression level, the replication start point derived from pBR322 contained in pW11-C8 / 119S was replaced with the replication start point derived from pUC18. Plasmid pUC18 was completely digested with restriction enzymes PvuI and PvuII to obtain a gene fragment containing the origin of replication. On the other hand, plasmid pW11-C8 / 119S was completely digested with NruI and PvuI to obtain a nucleic acid fragment containing the modified major mite allergen gene (C8 / 119S). The prepared two nucleic acid fragments were ligated with T4 ligase to obtain an expression plasmid pWU11-C8 / 119S (FIG. 1).
(2) Construction of expression vector pFLU11-C8 / 119S having trp / lac fusion promoter (trc)
The trc promoter which is a trp-lac fusion promoter was prepared from the expression plasmid pKK233-2 (manufactured by Amersham). pKK233-2 was completely digested with restriction enzymes NcoI and HindIII to obtain a gene fragment of 4.6 kilobase pairs. A nucleic acid fragment containing the modified tick major allergen gene (C8 / 119S) is synthesized with a synthetic primer (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing) containing a restriction enzyme cleavage site NcoI at the 5 ′ end and a restriction enzyme cleavage site HindIII at the 3 ′ end. It was obtained by carrying out the PCR method in the same manner as (1) except that the primer (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing) was used. A fragment obtained by completely digesting this nucleic acid fragment with restriction enzymes NcoI and HindIII and a gene fragment of 4.6 kilobase pairs including the trc promoter were ligated with T4 ligase to prepare an expression vector pFLK11-C8 / 119S. . By the same method as (1), an expression plasmid pFLU11-C8 / 119S was prepared by replacing the replication origin derived from pBR322 contained in pFLK11-C8 / 119S with the replication origin derived from pUC18 (FIG. 2).
(3) Production of recombinant E. coli
Using the expression plasmids pWU11-C8 / 119S and pFLU11-C8 / 119S obtained in (1) and (2) above, E. coli strains HB101, JM109, TB1 and LE392 were transformed, respectively, and recombinant E. coli strain pWU11- C8 / 119S / HB101, pWU11-C8 / 119S / JM109, pWU11-C8 / 119S / TB1 and pWU11-C8 / 119S / LE392, and pFLU11-C8 / 119S / HB101, pFLU11-C8 / 119S / JM109, pFLU11 / 119S / TB1 and pFLU11-C8 / 119S / LE392 were obtained.
Example 2: Screening of recombinant E. coli expressing major mite allergens
(1) Expression of major mite allergens in the presence of expression inducers
In the presence of an expression inducer, screening of recombinant Escherichia coli expressing a large amount of major mite allergens was performed by the following method. Recombinant pWU11-C8 / 119S / HB101, pWU11-C8 / 119S / JM109, pWU11-C8 / 119S / TB1 were added to L liquid medium (10 ml) containing 50 μg / ml ampicillin dispensed into L-shaped test tubes. PWU11-C8 / 119S / LE392, pFLU11-C8 / 119S / HB101, pFLU11-C8 / 119S / JM109, pFLU11-C8 / 119S / TB1 and pFLU11-C8 / 119S / LE392, respectively, and about 2 at 32 ° C. Shake culture for ~ 3 hours. When the turbidity (OD600 nm) of the bacterial cells reached 0.4 or more, 50 μg / ml indoleacetic acid (manufactured by Sigma) was added to the expression system using the trp promoter. In addition, 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a final concentration was added to the expression system using the trc promoter. Thereafter, expression was induced by further culturing for 6 hours.
The cultured cells were collected as a precipitate by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes. An appropriate amount of physiological saline was added to the cells and resuspended so that the cell turbidity (OD600 nm) was 20. Each 1 ml of the bacterial cell suspension was taken in a sample tube (manufactured by Assist) and sonicated to disrupt the bacterial cells. The inclusion body was collected as a precipitate by centrifugation at 14,000 rpm for 30 minutes. The collected inclusion bodies were suspended again in 1 ml of physiological saline. The inclusion body suspension and an equal volume of SDS sample buffer were mixed, heat-treated at 100 ° C. for 2 minutes, then subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie Brilliant Blue (manufactured by Nacalai Tesque). . As a result of comparing stained images of bands around 15 kD, the major mite allergen was most expressed in the recombinant pWU11-C8 / 119S / HB101, followed by pWU11-C8 / 119S / JM109 and pWU11-C8 / 119S / TB1. (Fig. 3).
Next, the expression level of the major mite allergen when cultured at 37 ° C. was confirmed. The procedure was the same as above except that the culture temperature was 37 ° C. As a result, the major mite allergen is expressed more in the recombinant pWU11-C8 / 119S / HB101 and pWU11-C8 / 119S / TB1 systems, and then in the pWU11-C8 / 119S / JM109 system. Was found (FIG. 4).
(2) Expression of major mite allergens in the absence of expression inducers
In the absence of an expression inducer, screening for recombinant Escherichia coli expressing a large amount of major mite allergens was performed by the same method as in (1). As a result, in the case of shaking culture at 32 ° C., almost no expression of major mite allergens could be confirmed in any of the recombinants (FIG. 5). The recombinants pWU11-C8 / 119S / HB101 and pWU11-C8 / 119S / TB1 produced major mite allergens (FIG. 6). Moreover, although expression levels of pWU11-C8 / 119S / JM109 and pFLU11-C8 / 119S / JM109 were also lower than those of the recombinants, expression of major mite allergens could be confirmed (FIG. 6). The expression level of the major mite allergen per cell was the same as when the expression inducer was used. However, the growth (cell density) of the cells when the expression inducer was not added was about 20 to 40% higher than when the expression inducer was added (Table 1). Therefore, it was found that the production amount of the mite major allergen per culture volume was higher than that when the expression inducer was used.
A glycerin stock was prepared using recombinant pWU11-C8 / 119S / HB101 as a production strain for major mite allergens. The glycerin stock was prepared by the following method. The recombinant was inoculated into 1 L of L liquid medium containing 50 μg / ml ampicillin and cultured overnight at 32 ° C. with shaking. To this culture solution, an equal amount of sterilized glycerin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and mixed well. 200 bottles of 10 ml were dispensed into an assist tube (manufactured by Assist) and stored frozen in an ultra-low temperature freezer.
One glycerin stock was inoculated into L liquid medium (1.5 L) containing 50 μg / ml ampicillin and cultured with shaking at 32 ° C. for 8 hours. This cultured bacterial solution was inoculated into 250 L of L liquid medium and aerated at 25 ° C. overnight, then the culture temperature was raised to 37 ° C. and further aerated for 12 hours (FIG. 7). During this period, addition of amino acids and the like was performed in a timely manner according to the growth of the cells.
While culturing at 37 ° C., a part of the culture solution was sampled over time. The cells in the sampled culture broth were collected as a precipitate by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes. An appropriate amount of physiological saline was added to the cells and resuspended so that the cell turbidity (OD600 nm) was 20. 1 ml of each cell suspension was taken in a sample tube (manufactured by Assist) and sonicated to disrupt the cells. The inclusion body was collected as a precipitate by centrifugation at 14,000 rpm for 30 minutes. The collected inclusion bodies were suspended again in 1 ml of physiological saline. The inclusion body suspension and an equal volume of SDS sample buffer are mixed, and after heat treatment at 100 ° C. for 2 minutes, it is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie Brilliant Blue (manufactured by Nacalai Tesque). The expression was confirmed. As a result, it was found that the main mite allergen was accumulated as
Example 4: Macrophage toxin protein from Actinobacillus pleuropneumoniae Production of recombinant E. coli producing (ApxIIIΔ2)
(1) Construction of plasmid pUC-Trp / Myc-His
Plasmid pUC-Trp / Myc-His having an expression cassette Trp / Myc-His for expressing macrophage toxin protein (ApxIIIΔ2) under the control of trp promoter was constructed as follows (FIG. 9).
(1) A commercially available plasmid pBAD / Myc-His B (Invitrogen) was digested with restriction enzymes MluI and NcoI, and a fragment of about 3.9 Kbp was purified.
(2) Synthesis of trp promoter region of sense strand and antisense strand Oligo DNA (SEQ ID NOS: 5 and 6 in the sequence listing) (synthesized by Sigmagenosis Co., Ltd.) is mixed in equimolar amounts, at 94 ° C. for 1 minute, at 75 ° C. Annealing was performed by heating for 10 minutes and gradually lowering the temperature to room temperature. The complementary strand at the protruding end of MluI was added upstream of the promoter and NcoI was added downstream.
(3) The annealed trp promoter DNA fragment (2) was ligated to the 3.9 Kbp pBAD / Myc-HisB (1) prepared previously using Ligation Kit Ver (Takara Shuzo) (10 ℃, day and night). This was introduced into commercially available E. coli TOP10 (Invitrogen). The obtained plasmid was designated as pBR-Trp / Myc-His.
(4) pBR-Trp / Myc-His was treated with restriction enzymes MluI and BsrBI, and a fragment of about 0.5 Kbp was purified. This fragment contains an expression cassette Trp / Myc-His consisting of a trp promoter and a multicloning site derived from pBAD / Myc-His, a DNA sequence of Histidene Hexamer, and transcription termination sequences of E. coli-derived rrnB T1 and T2. This about 0.5 Kbp fragment was blunt-ended using a Blunting High kit (Toyobo).
(5) Plasmid pUC18 (Takara Shuzo) was treated with restriction enzymes PvuII and NdeI, a 2.2 Kbp fragment was purified, and blunt-ended using a Blunting High kit (Toyobo).
{Circle around (6)} About 0.5 Kbp fragment (4) treated with blunt ends containing trp promoter was ligated to pUC18 DNA treated with restriction enzymes and blunt ends using Ligation Kit Ver (Takara Shuzo) (10 ° C., all day and night) This was introduced into Escherichia coli (JM109), and a plasmid pUC-Trp / Myc-His having Trp / Myc-His was purified from the resulting transformant (FIG. 9).
(2) Construction of expression vector pTrp-ApxIIIΔ2
An expression vector pTrp-ApxIIIΔ2 in which a gene fragment encoding a portion other than the N-terminal hydrophobic region of ApxIII (ApxIIIΔ2) was inserted into a plasmid pUC-Trp / Myc-His was constructed as follows (FIG. 10). DNA of Actinobacillus pleuropneumoniae NG-22 strain (serotype 2) was extracted using DNA extraction kit ISOPLANT (Wako Pure Chemical Industries), and the region encoding ApxIIIΔ2 was extracted using this as a template using PCR kit (Takara Shuzo LA Taq). Amplified. For PCR, an upstream primer in which an FspI site is added to a base sequence selected based on the base sequence of ApxIIIA (GeneBank Accession No. L12145) reported by Chang et al. (DNA Cell Biol 1993; 12: 351-62). (SEQ ID NO: 7 in the sequence listing) and a downstream primer (SEQ ID NO: 8 in the sequence listing) to which the NotI site was added were used.
The fragment obtained by PCR was cloned into a commercially available vector pCR2.1 TOPO (Invitrogen) to obtain pCR-ApxIIIΔ2. The obtained plasmid was treated with restriction enzymes FspI and NotI, a DNA fragment of about 1.8 Kbp was purified, and blunt-ended using a Blunting High kit (Toyobo). On the other hand, pUC-Trp / Myc-His obtained in (1) was treated with restriction enzymes NcoI and XbaI, blunt-ended with the same kit, and then treated with shrimp-derived alkaline phosphatase (Promega). This DNA was ligated with the 1.8 Kbp DNA fragment encoding ApxIIIΔ2 prepared previously to construct an expression vector pTrp-ApxIIIΔ2 (FIG. 10).
(3) Expression of ApxIIIΔ2 in the absence of an expression inducer
The expression vector pTrp-ApxIIIΔ2 was introduced into Escherichia coli HB101 (Takara Shuzo) to obtain an HB101 transformant having pTrp-ApxIIIΔ2. This was inoculated into a circle glow medium (BIO101) and cultured at 37 ° C. for about 16 hours. 1 ml of the cultured bacterial solution was centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute, and the cells were collected. This was mixed with 400 μl of SDS sample buffer, heated at 100 ° C. for 2 minutes, then subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie brilliant blue (FIG. 11). Moreover, after electrophoresis, it transferred to a PVDF membrane, reacted with peroxidase-labeled anti-His tag antibody (Invitrogen) at 4 ° C. overnight, and then stained the expressed protein using Konica Immunostain (Seikagaku Corporation) (FIG. 12). About 69 kDa ApxIIIΔ2 expression was observed.
Example 5: Recombinant Escherichia coli producing an infection protective antigen protein (ΔSpaA) of swine erysipelas Making
(1) Construction of expression vector pUC-Trp ΔspaA
A gene fragment (hereinafter referred to as “ΔspaA”) encoding the protein (hereinafter referred to as “ΔSpaA”) encoded by a 1206 bp base sequence corresponding to the 88th to 1293th positions of the infection protective antigen protein gene (spaA) of swine erysipelas. The expression vector pUC-Trp ΔspaA inserted in the plasmid pUC-Trp / Myc-His was constructed as follows (FIG. 13).
DNA extracted from cultured cells of S. cerevisiae SE-9 strain using ISOPLANT (Nippon Gene) as a template, and published base sequence information (Imada, Y., Goji, N., Ishikawa, H., Kishima) , M.and Sekizaki, T.Truncated surface protective antigen (SpaA) of Erysipelothrix rhusiopathiae serotype 1a elicits protection against challenge with serotypes 1a and 2b in pigs.:Infect.Immun.67(9),4376-4382(1999))/ GeneBank Accession No. PCR was performed using two types of primers synthesized based on AB019124), an upstream primer to which an NcoI site was added (SEQ ID NO: 9 in the sequence listing), and a downstream primer to which a BamHI site was added (SEQ ID NO: 10 in the sequence listing). It was. The amplified fragment containing ΔspaA was double-digested with restriction enzymes NcoI and BamHI, and then ligated to the plasmid pET11d (Novagen) treated with the same enzyme by T4 DNA ligase treatment. Escherichia coli BL21 (DE3) strain was transformed with the ligated DNA and applied to an LB agar medium containing 50 μg / ml of ampicillin to select a strain having ampicillin resistance. Plasmid was extracted from the selected strain to obtain plasmid pET11d ΔspaA carrying ΔspaA (FIG. 13).
Next, the plasmid pUC-Trp / Myc-His obtained in (1) of Example 4 was subjected to double digestion with restriction enzymes NcoI and HindIII, followed by 0.8% agarose gel electrophoresis to obtain about 2 containing the trp promoter. A .7 kb nucleic acid fragment was recovered. On the other hand, pET11d ΔspaA was double-digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, and then a nucleic acid fragment containing about 1.5 kb of ΔspaA was recovered by 0.8% agarose gel electrophoresis. The 7 kb nucleic acid fragment was ligated by T4 DNA ligase treatment. The Escherichia coli HB101 strain was transformed with the ligated DNA, applied to an LB agar medium containing 50 μg / ml of ampicillin, a strain having ampicillin resistance was selected, and a recombinant Escherichia coli carrying the expression vector pUC-Trp ΔspaA was obtained (FIG. 13).
(2) ΔSpaA expression in the absence of an expression inducer
Recombinant Escherichia coli carrying the expression vector pUC-Trp ΔspaA was inoculated into Circle Glow medium (BIO101), cultured at 30 ° C. for about 15 hours, and then cultured at 37 ° C. for about 25 hours. Non-transformed E. coli (HB101) was used as a control. An equal volume of SDS sample buffer was mixed with the culture solution sampled over time, heat-treated at 100 ° C. for 2 minutes, then subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and stained with Coomassie Brilliant Blue. . As a result, expression of ΔSpaA of about 50 kDa was observed by shifting the culture temperature from 30 ° C. to 37 ° C. (FIG. 14).
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