JP4451514B2 - Blood coagulation factor vii variant - Google Patents

Blood coagulation factor vii variant Download PDF

Info

Publication number
JP4451514B2
JP4451514B2 JP23761099A JP23761099A JP4451514B2 JP 4451514 B2 JP4451514 B2 JP 4451514B2 JP 23761099 A JP23761099 A JP 23761099A JP 23761099 A JP23761099 A JP 23761099A JP 4451514 B2 JP4451514 B2 JP 4451514B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
fvii
amino acid
variant
activity
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP23761099A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP2001061479A (en
Inventor
智弘 中垣
見事 副島
貞昭 岩永
純 水口
正人 湯口
Original Assignee
財団法人化学及血清療法研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 財団法人化学及血清療法研究所 filed Critical 財団法人化学及血清療法研究所
Priority to JP23761099A priority Critical patent/JP4451514B2/en
Publication of JP2001061479A publication Critical patent/JP2001061479A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP4451514B2 publication Critical patent/JP4451514B2/en
Application status is Expired - Fee Related legal-status Critical
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Description

【0001】 [0001]
【発明の属する技術分野】 BACKGROUND OF THE INVENTION
本願発明は、酵素活性を増強させた血液凝固第VII因子(以下、FVIIと称することがある)及び/または活性化血液凝固第VII因子(以下、FVIIaと称することがある)の改変体に関するものである。 The present invention, blood coagulation factor VII that enhanced the enzyme activity (hereinafter sometimes referred to as FVII) and / or activated blood coagulation factor VII relate variants (hereinafter, sometimes referred to as FVIIa) it is. 詳細には、本願発明は、FVIIに特有なアミノ酸配列を、置換・欠損することにより、活性が増強されたFVII/FVIIa改変体、当該改変体を有効成分として含有する医薬品組成物、及び当該医薬品組成物からなる血友病インヒビター患者の治療に有効な薬剤に関するものである。 In particular, the present invention provides an amino acid sequence specific to FVII, by substituting & deficient, FVII / FVIIa variant activity is enhanced, pharmaceutical compositions containing the variants as the active ingredient, and said medicament it relates an agent effective in the treatment of hemophilia inhibitor patients comprising the composition.
【0002】 [0002]
【従来の技術および解決すべき課題】 [Problem to be conventional techniques and solve]
FVIIはビタミンK依存性の血液凝固因子であり、外因系血液凝固の開始因子であることは広く知られている。 FVII is a blood clotting factor vitamin K dependent, it is well known that the initiation factor of the extrinsic blood coagulation. 他のビタミンK依存性凝固因子と同様にN末端から35残基までのアミノ酸配列に10個のγカルボキシグルタミン酸(以下、Glaと称することがある)からなるGla領域を有している(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.83,p.2412−2416,1986)。 Other vitamin K dependent coagulation factors 10 to the amino acid sequence from N-terminal to the 35 residue as with the γ-carboxyglutamic acid has a Gla domain consisting of (hereinafter, it is referred to as Gla) (Proc. Natl.Acad.Sci.USA, vol.83, p.2412-2416,1986). FVIIは、in vitroにおいて、活性化血液凝固第X因子(以下、FXaと称することがある)、活性化血液凝固第IX因子(以下、FIXaと称することがある)またはトロンビン(以下、FIIaと称することがある)によって、152Arg−153Ileが加水分解され、一個のS−S結合で架橋されたH鎖とL鎖から構成される活性型FVIIすなわちFVIIaに変換されることは知られている(J.Biol.Chem.,vol.251,p.4797−4802,1976)。 FVII, in in vitro, activated blood coagulation factor X (hereinafter, sometimes referred to as FXa), activated blood coagulation factor IX (hereinafter sometimes referred to as FIXa) or thrombin (hereinafter, referred to as FIIa by there), 152Arg-153Ile is hydrolyzed, one of S-S bonds by being converted into formed activated FVII i.e. FVIIa by a crosslinked H and L chains are known (J .Biol.Chem., vol.251, p.4797-4802,1976).
【0003】 [0003]
FVIIa自体の酵素活性は極めて弱く、補酵素である組織因子(TF)と結合すると劇的に上昇する(Komiyama et al., Biochemistry, 29(40), pp.9418-25(1990))。 FVIIa enzymatic activity of themselves very weak, dramatically increases when bound to tissue factor is a cofactor (TF) (Komiyama et al., Biochemistry, 29 (40), pp.9418-25 (1990)). FVIIaとTFの1次構造、その複合体の結晶構造、さらに両分子間の結合部位もアミノ酸残基レベルで判明しているが、その触媒活性増幅機構の詳細(TF結合に伴う立体構造変化)は依然として不明である(Banner et al., , et al., Nature 380(6569): pp.41-6(1996))。 Primary structure of the FVIIa and TF, the crystal structure of the complex, but has been found further binding site is also the amino acid residue level between both molecules, (conformational change associated with TF binding) Details of its catalytic activity amplification mechanism it is still unknown (Banner et al,, et al, Nature 380 (6569):.. pp.41-6 (1996)).
【0004】 [0004]
血友病A及び血友病B患者に対する補充療法として、血液凝固第VIII因子(以下、FVIIIと称することがある)及び血液凝固第IX因子(以下、FIXと称することがある)製剤の投与が行なわれている。 As replacement therapy for hemophilia A and hemophilia B patients, factor VIII (hereinafter sometimes referred to as FVIII) and blood coagulation factor IX (hereinafter sometimes referred to as FIX) administration of the formulation It has been carried out. しかし、当該治療法に伴いFVIII及びFIXに対する中和抗体(インヒビターと呼ばれることもある)の出現が問題視されている。 However, the emergence of neutralizing antibodies against FVIII and FIX with the relevant therapy (sometimes referred to as the inhibitor) is seen as a problem.
【0005】 [0005]
このようなインヒビターを生じた血友病患者の対処療法として、(1)FVIII因子の過剰投与、(2)ブタFVIII因子の投与、(3)FII、FVII、FIX及びFXからなる複合体製剤の投与、(4)FVIIa製剤の投与などがある。 As symptomatic treatment of hemophilia patients produced such inhibitors, (1) an overdose of FVIII factor, (2) administration of porcine FVIII factor, (3) FII, FVII, complex formulation consisting FIX and FX administration, and the like administration of (4) FVIIa preparations. しかしながらこれらの方法は、それぞれ (1)については、より高力価なインヒビターの誘導による症状悪化、(2)については、抗原性によるショック、(3)については、血栓・DICの誘発、(4)については、治療効果が不十分であることや大量・頻回投与によりコストが高いなどの問題を抱えている。 These methods, however, for each (1), worsening of symptoms due to higher induction of high titers inhibitors, for (2), the shock antigenicity, (3), the thrombus · DIC induction, (4 for), it has a problem, such as a high cost by a large amount, frequent administration and that the treatment effect is insufficient. これらの中で、効果と危険性のバランスを考慮した場合、最も効率的なものは(4)のFVIIa製剤の投与である。 Among these, in consideration of balance of effects and risks, the most efficient ones is the administration of FVIIa preparations (4). しかしながら、FVIIa製剤はその活性の弱さのため、止血効果を発揮するには、前述したように大量投与と頻回投与を必要とし、治療コストを大きく高めている。 However, since FVIIa preparations weakness of its activity, to exert a hemostatic effect, requires large doses and frequent administration as described above, it has greatly increased the cost of treatment. また、その治療効果も血友病患者に対して行われている従来の補充療法に比べれば充分とはいえない。 Moreover, it can not be said that sufficient compared to conventional replacement therapy for its therapeutic effect is also made to hemophiliacs.
【0006】 [0006]
この問題を解決するための手段として、酵素活性を上昇させたFVIIの改変体を作製することが挙げられるが、これは一般的に困難であることが知られている(タンパク質の構造入門、勝部幸輝ら監修、教育社発行、1992年)。 As means for solving this problem, but can be given to produce the variants of FVII which increased the enzyme activity, which is known to be generally difficult (Introduction to Protein Structures, KATSUBE Kouki et al., eds., education, published, 1992). 特に、血液凝固因子について、以下の理由により改変による活性増強は困難と考えられている。 In particular, the blood clotting factors, activity enhancer is considered difficult by modifying the following reasons.
【0007】 [0007]
血友病は血液凝固因子の異常であるが、量的欠損に伴う活性低下と質的異常による活性低下の2つに分類される。 Hemophilia is an abnormality of the blood coagulation factors are divided into two reduced activity and activity reduction due qualitative abnormalities associated with quantitative deficiency. このうち質的異常の多くは(ポイント)ミューテーションであることが知られており、FIXの異常である血友病Bの患者の解析が行われた結果、FIXの構造全域にわたって分子異常が存在することが明らかとなり、中にはたった1個のアミノ酸が置換されただけで、活性が1%以下になる例が多数ある。 Among many qualitative abnormalities are known to be (point) mutation, results analysis of patients with hemophilia B is abnormal for FIX is performed, there is a molecular abnormality over structure entire region of FIX it becomes clear that, some only just one amino acid is substituted, an example in which the activity is 1% or less numerous. 従って、血液凝固因子についてむやみに改変を行っても、活性低下を招くのは明らかである。 Therefore, even if the excessively modified for blood coagulation factors, it is clear causing a reduction in activity.
【0008】 [0008]
また、Alanine Scannningで得られた情報(Dickinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(25), pp.14379-84(1996))によれば、FVIIの112個のAlanine置換体ついて、その中で酵素活性が上がったものは唯一1つであり、しかもその規則性は見いだされていない。 Further, information obtained by Alanine Scannning (Dickinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (25), pp.14379-84 (1996)) according to, 112 pieces of Alanine substitution of FVII for the body, it is among only 1 thing that went up the enzymatic activity in the, yet its regularity has not been found.
【0009】 [0009]
その他の試みとして、Hopfnerらは、FIXを構成する一部のドメインの数アミノ酸残基から構成される構造単位を欠損・置換する方法を用い、合成基質活性を上昇させたFIXフラグメント改変体を作製した(EMBO J, 16(22), pp.6626-35(1997))。 Other attempts, Hopfner et al., Produce FIX fragment variants which several amino acid residues using the method deficient or replaced the structural unit formed to raise the synthetic substrate activity of some domains that constitute the FIX the (EMBO J, 16 (22), pp.6626-35 (1997)). しかしながら、これはインタクトなFIXではなく、FIXの部分フラグメントを大腸菌で発現させたもので合成基質活性を見ているに過ぎないため、血液凝固活性を増強しうるどころか血液凝固活性すら有さないものである。 However, this is the intact FIX without for the partial fragment of FIX merely watching synthetic substrate activity which was expressed in E. coli, which does not have even the blood coagulation activity, let alone can enhance blood clotting activity it is. さらに、これはFIXに関するものであり、構造も特異性も全く異なる別物質であるFVIIに対して何ら示唆するものではなく、FVIIの酵素活性を増強させた改変体についても、これまで何ら報告はない。 Moreover, this is related to FIX, and not to suggest any relative structures is another substance which also quite different specificities FVII, for also variants in which enhanced the enzyme activity of FVII, is no report so far Absent.
【0010】 [0010]
このように、強い酵素活性を有する改変体の作製は、特に血液凝固因子においては困難と考えられていた。 Thus, the production of variants with strong enzyme activity was especially considered difficult in the blood clotting factor. FIXにおいて、その部分フラグメントについて合成基質活性を上げる試みはなされたものの、インタクトな分子として高い酵素活性を有する血液凝固因子の改変体についてはこれまでも報告例はない。 In FIX, although made attempts to raise its partial fragment synthetic substrate activity, also reported examples are not far for a variant of a blood coagulation factor having a high enzymatic activity as intact molecules.
【0011】 [0011]
従って、本発明の解決すべき課題は、一般に血液凝固因子の改変は困難と考えられている状況において、血友病インヒビター患者の治療に有効な強い活性を有するFVII及び/またはFVIIaを作製・提供することである。 Therefore, the problem to be solved of the present invention are generally in situations where modification of the blood clotting factors are considered difficult, making and providing FVII and / or FVIIa has effective strong activity in the treatment of hemophilia inhibitor patients It is to be.
【0012】 [0012]
【課題を解決するための手段】 In order to solve the problems]
上記のような状況において、本発明者らは、それ自身高い酵素活性を有するFVIIを作製すべく鋭意研究を重ね種々の検討を行った結果、本願発明を完成するに至った。 In the above situation, the present inventors have made various studies overlapped to intensive research to produce FVII having its own high enzyme activity, thereby completing the present invention. 本願発明は、FVIIと各種セリンプロテアーゼとアミノ酸配列構造を比較し、FVIIに特有のアミノ酸配列部位を明確にし、その特有な部位を、欠損・置換することにより、活性が増強されたFVII及び/またはFVIIa改変体を作製することに成功したものである。 The present invention compares the FVII and various serine proteases and amino acid sequence structure, to clarify the sequence of amino acids characteristic of site FVII, its unique site, by deficient or replaced, activity was enhanced FVII and / or it is those that have succeeded in making a FVIIa variants.
【0013】 [0013]
【発明の構成】 SUMMARY OF THE INVENTION
トリプシン族に類する一群のセリンプロテアーゼの基本構造は、約250残基からなり、アミノ酸配列上でおよそ、その前半と後半の2つのドメインに分けられる(図1)。 The basic structure of the group of serine proteases like trypsin family consists of about 250 residues, approximately on amino acid sequence is divided into the first half and the second half of the two domains (Figure 1). 各ドメイン内にはそれぞれ6本のβストランドがあり、プロテアーゼとして計12本のβストランドを有する構造で形成されている(図2)。 Within each domain there are six β strands, respectively, are formed in a structure having a total of 12 of the β-strand as a protease (Fig. 2). これら12本のβストランドはいわばセリンプロテアーゼの骨格構造となっており、各ストランド間をつなぐループないし、ヘリックス領域が、その基質特異性やコファクターとの反応性などのプロテアーゼ活性を担っていると考えられている。 These twelve β strands are so to speak a skeletal structure of serine proteases, to no loop connecting between each strand helix region and is responsible for the protease activity, such as reactivity with their substrate specificity and cofactors It is considered. セリンプロテアーゼの例としては、FII、FVII、FVIII、FIX、FX等の各種血液凝固因子、プラスミン等の血栓溶解酵素、またはトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼなどの消化酵素がある。 Examples of serine proteases are FII, FVII, FVIII, FIX, various blood coagulation factors, such as FX, thrombolytic enzymes plasmin like or trypsin, chymotrypsin, and digestive enzymes, such as elastase.
そこで、FVIIをはじめとする各種セリンプロテアーゼのアミノ酸配列構造の比較を行い、FVIIに特徴的な領域を特定した(図3)。 Therefore, to compare the amino acid sequence structure of the various serine proteases, including FVII, identified characteristic region in FVII (Figure 3). そして、これらの部位を改変のターゲットとし、他のセリンプロテアーゼの構造を参考に、FVIIのアミノ酸配列を欠損・置換することによって、高い酵素活性を有するFVII改変体を作製した。 Then, these sites and modification of the target, with reference to the structure of other serine proteases, by deficient or replaced amino acid sequence of FVII, to produce a FVII variants with high enzymatic activity. これらの改変体について詳細に説明する。 These variants will be described in detail.
【0014】 [0014]
(a)159Cys−164Cys結合が切断された改変体(a−▲1▼)159Cysと164CysをCys以外のアミノ酸残基によって置換することにより、当該159Cys−164Cysが切断された改変体(VII−5)。 (A) 159Cys-164Cys bond is cleaved variant (a- ▲ 1 ▼) by replacing the 159Cys and 164Cys with an amino acid residue other than Cys, variant (VII-5 to the 159Cys-164Cys is disconnected ).
この改変体の具体例として、Cysをそれぞれアラニン(Ala)に置換したものを配列表配列番号3または4に記載した。 Specific examples of this variant was described that replacing Cys with alanine respectively (Ala) in SEQ ID NO: 3 or 4. ここで、置換に用いるCys以外のアミノ酸残基の一例として、Alaを選択したが、置換によって、Cys−Cys結合を切断すること以外に酵素活性を失活させるなどの大きな障害を与えない限り、任意のアミノ酸が選択可能である。 Here, as an example of the amino acid residue other than Cys to be used for replacement, was chosen Ala, substitution, as long as it does not have a significant failure, such as to inactivate the enzyme activity other than to cut the Cys-Cys bond, any of the amino acid can be selected.
【0015】 [0015]
(a−▲2▼)164CysをCys以外のアミノ酸残基によって置換し、かつ、299番目のヴァリン(299Val)をCysに置換することにより、159Cys−164Cysが切断され、かつ159Cysと299Cys間においてジスルフィド結合(159Cys−299Cys)が形成された改変体(VII−6)。 (A- ▲ 2 ▼) was replaced by an amino acid residue other than Cys to 164Cys, and disulfide by substituting 299 th Varin the (299Val) to Cys, 159Cys-164Cys is cut, and between 159Cys and 299Cys binding (159Cys-299Cys) is formed variant (VII-6).
この改変体の具体例として、Cys以外のアミノ酸残基としてAlaを用いて置換したものを配列表配列番号5または6に記載した。 Specific examples of this variant, as described in SEQ ID NO: 5 or 6 which was replaced with Ala as amino acid residue other than Cys. ここで、置換に用いるCys以外のアミノ酸残基については上述の通り、置換によって159Cys−164Cys結合を切断すること以外に酵素活性を失活させるなどの大きな障害を与えない限り、Ala以外の他のアミノ酸が選択可能である。 Here, as described above for the amino acid residue except Cys used for substitution, substituted by do not confer a significant failure, such as to inactivate the enzyme activity other than to cleave 159Cys-164Cys bonds, other than Ala amino acid can be selected.
【0016】 [0016]
(b)FVII内の、233番目のスレオニン(233Thr)から240番目のアスパラギン(240Asn)のアミノ酸配列からなるループ構造(以下、99−loopと称することもある)を構成するアミノ酸配列またはその一部が、置換、追加または削除された改変体。 (B) in FVII, 233 th threonine (233Thr) from 240 th loop structure comprising the amino acid sequence of asparagine (240Asn) (hereinafter, 99-loop and may be referred to) an amino acid sequence or a portion thereof constituting the There, substituted, added or deleted variants.
この領域は、図3に示すようにセリンプロテアーゼに共通に存在するβストランド5とβストランド6の間に介在するアミノ酸配列を含むものである。 This area includes the amino acid sequence interposed between the β strands 5 and β strands 6 present in common to serine proteases, as shown in FIG. この領域を他のトリプシン族セリンプロテアーゼの構造上対応するアミノ酸配列で置換することが好ましい。 It is preferred to replace this region structurally corresponding amino acid sequences of other trypsin family serine proteases. トリプシン族セリンプロテアーゼの好適な一例として、ヒトトリプシンが挙げられる。 Preferable examples of the trypsin family serine proteases, human trypsin. さらに、具体的な例として、FVIIの99−loop内の235番目のバリン(235Val)から239番目のスレオニン(239Thr)までのアミノ酸配列が、トリプシンのループ構造内にあるAsp−Arg−Lys−Thr−Leuで置換された改変体(VII−30)が挙げられる。 Further, as a specific example, the amino acid sequence from 235th valine in 99-loop of FVII (235Val) to 239th threonine (239Thr) is, Asp-Arg-Lys-Thr in the loop structure of trypsin are variants substituted at -Leu (VII-30) can be mentioned. この改変体を配列表配列番号7または8に記載した。 It described this variant in SEQ ID NO: 7 or 8.
【0017】 [0017]
(c)FVII内の、304番目のアルギニン(304Arg)から329番目のシステイン(329Cys)の介在アミノ酸配列を構成するアミノ酸配列またはその一部が、置換、追加または削除された改変体。 (C) in FVII, 304 arginine (304Arg) 329 th cysteine ​​(329Cys) intervening amino acids constituting the sequence amino acid sequence or a portion thereof from is substituted, added or deleted variants.
特にこの領域は、図3に示すように、セリンプロテアーゼに共通に存在するβストランド8とβストランド9の間に介在するアミノ酸配列において、FVIIは他のセリンプロテアーゼと比較して数アミノ酸残基長いという特徴を有することから、FVII改変における好適なターゲットとなりうるものと推測される。 In particular, this region, as shown in FIG. 3, in the amino acid sequence interposed between the β strands 8 and β strands 9 present in common to serine proteases, FVII long number amino acid residues as compared to other serine proteases since it has a feature that, it is presumed that may be suitable targets in FVII modified.
この領域を、他のトリプシン族セリンプロテアーゼの構造上対応するアミノ酸配列で置換することが好ましい。 This region is preferably replaced by structurally corresponding amino acid sequences of other trypsin family serine proteases. トリプシン族セリンプロテアーゼの好適な一例として、ヒトトリプシンが挙げられる。 Preferable examples of the trypsin family serine proteases, human trypsin. また、FVII内の置換、追加、削除しうる好ましい領域は、310番目のシステイン(310Cys)から329番目のシステイン(329Cys)のアミノ酸配列からなるループ構造(170−loopと称することもある)を構成するアミノ酸配列またはその一部である。 Further, substitution in FVII, additional, preferred regions which can be deleted, configuration 310 th cysteine ​​(sometimes referred to as a 170-loop) the loop structure consisting of the amino acid sequence of (310Cys) from 329 th cysteine ​​(329Cys) an amino acid sequence or a portion thereof. さらに、具体的な例として、FVIIの170−loop内の311番目のロイシン(311Leu)から322番目のアスパラギン(322Asn)までのアミノ酸配列が、ヒトトリプシンのループ構造内にあるGlu−Ala−Ser−Tyr−Pro−Gly−Lysで置換された改変体(VII−31)が挙げられる。 Further, as a specific example, the amino acid sequence from 311 th leucine in 170-loop of the FVII (311Leu) to 322 th asparagine (322Asn) is, Glu-Ala-Ser- within the loop structure of human trypsin are variants substituted with tyr-Pro-Gly-Lys (VII-31) can be mentioned. この改変体を配列表配列番号9または10に記載した。 Described in this variant SEQ ID NO: 9 or 10.
【0018】 [0018]
さらに、上記(a)から(c)の改変を適宜組み合わせることも可能である。 Furthermore, it is also possible to combine appropriately the adaptation of said (a) from (c). その具体例として、例えば、(b)と(c)の組み合わせ、すなわち、FVIIの99−loop内の235番目のバリン(235Val)から239番目のスレオニン(239Thr)までのアミノ酸配列が、ヒトトリプシンのループ構造内にあるAsp−Arg−Lys−Thr−Leuで置換され、かつ、170−loop内の311番目のロイシン(311Leu)から322番目のアスパラギン(322Asn)までのアミノ酸配列が、トリプシンのループ構造内にあるGlu−Ala−Ser−Tyr−Pro−Gly−Lysで置換された改変体(VII−39)が挙げられる。 As specific examples, for example, a combination, i.e., the amino acid sequence from 235th valine in 99-loop of FVII (235Val) to 239th threonine (239Thr) is, the human trypsin (b) and (c) It is substituted with Asp-Arg-Lys-Thr-Leu in the loop structure, and the amino acid sequence from 311 th leucine in the 170-loop (311Leu) to 322 th asparagine (322Asn) is, loop structures trypsin are variants substituted with Glu-Ala-Ser-Tyr-Pro-Gly-Lys located within (VII-39) can be mentioned. この改変体を配列表配列番号11または12に記載した。 Described in this variant SEQ ID NO: 11 or 12.
【0019】 [0019]
上述した改変体は、遺伝子組換え法を用いて得ることができる。 Above variants can be obtained using a genetic recombination. 発現宿主としては、動物細胞等の真核細胞が好ましい。 The expression host, eukaryotic animal cells and the like are preferable. 本発明の改変体は、上記各改変体のアミノ酸配列をコードするcDNAを適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞にトランスフェクトし、目的の遺伝子を発現している細胞をクローニングし、得られた安定発現株を培養後、精製することにより得られる。 Variants of the present invention incorporates a cDNA encoding the amino acid sequence of each variant in a suitable expression vector, transfect the host cells, cloning the cells expressing the gene of interest, the resulting stable after the expression strain culture obtained by purification.
【0020】 [0020]
本願発明のFVII改変体は各種化学処理等を行い、活性化型FVII(FVIIa)改変体として使用することができる。 FVII variants of the present invention performs various chemical processes, etc., it can be used as activated FVII (FVIIa) variant.
【0021】 [0021]
本願発明のFVII/FVIIa改変体は、治療、診断または他の用途のために製薬学的調合剤に処方することができる。 FVII / FVIIa variants of the present invention, the therapeutic may be formulated into pharmaceutical formulations for diagnostic or other purposes. 静脈内投与のための調合剤に対しては、組成物を、通常、生理学的に適合しうる物質、例えば塩化ナトリウム、グリシン等を含み、かつ生理学的条件に適合しうる緩衝されたpHを有する水溶液中に溶解する。 For preparation for intravenous administration, the compositions typically have a substance physiologically compatible, such as sodium chloride, include glycine, and the buffered pH be adapted to physiological conditions It is dissolved in an aqueous solution. また、長期安定性の確保の観点から、最終的剤型として凍結乾燥製剤の形態をとることも考慮されうる。 From the viewpoint of ensuring long-term stability, it may also be considered to take the form of a lyophilized formulation as the final dosage form. なお、静脈内に投与される組成物のガイドラインは政府の規則、例えば「生物学的製剤基準」によって確立されている。 Incidentally, the guidelines of the composition administered intravenously has been established governmental regulations, for example, by "Biological Products".
本願発明のFVII/FVIIa改変体からなる医薬品組成物の具体的な用途としては、FVIIIまたはFIXの補充療法により当該血液凝固因子に対してインヒビターを生じた血友病インヒビター患者の治療が挙げられる。 Specific applications of the pharmaceutical composition comprising FVII / FVIIa variants of the invention, treatment of hemophilia inhibitor patients resulted in inhibitor with respect to the blood coagulation factor and the like by replacement therapy of FVIII or FIX.
【0022】 [0022]
【実施例】 【Example】
本願発明を実施例により例示するが、これら実施例は本願発明を限定するものではない。 Illustrated by examples present invention, but these examples are not intended to limit the present invention. 本願発明について添付図面を参照して特定な実施例にて例示する。 With reference to the accompanying drawings the present invention is illustrated by specific examples. 実施例は改変体を動物細胞(CHO-K1)の培養上清中に発現させたものである。 Examples are those expressing the variant in the culture supernatant of animal cells (CHO-K1). 以下特に断りが無い限り、遺伝子組換えに関わる試薬等は、宝酒造、東洋紡、パーキンエルマーアプライドNew England Biolabs 社の製品を用いた。 Unless otherwise stated below, reagents and the like related to the gene recombination, Takara Shuzo, Toyobo, using a product of Perkin-Elmer Applied by New England Biolabs.
【0023】 [0023]
《実施例1. "Example 1. FVIIcDNAのクローニング》 Cloning of FVIIcDNA "
ヒト肝臓cDNAライブラリー(宝酒造)を購入し、文献等(Molecular Basis of Thrombosia and Hemostasis)で公知のcDNA配列(配列表配列番号1に記載)を基にSalIサイトを付加したFVII合成DNAセンスプライマー(VII-PWN;GGGGTCGACATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTG)及び、BamHIサイトを付加したアンチセンスプライマー(VII-PWC;CCCGGATCCCTAGGGAAATGGGGCTCGCAGGAGGACTCCTGGGCG)を用いてPCRを行い、市販のクローニングベクターpCRII(Invitrogen社)にクローニングした。 Human liver cDNA purchased library (Takara Shuzo), literature (Molecular Basis of Thrombosia and Hemostasis) was added SalI site known cDNA sequence (described in SEQ ID NO: 1) based on at the FVII synthetic DNA sense primer ( VII-PWN; GGGGTCGACATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTG) and an antisense primer by adding a BamHI site (VII-PWC; PCR was carried out using ShishishijijieitishishishitieijijijieieieitijiGGGCTCGCAGGAGGACTCCTGGGCG), was cloned into a commercially available cloning vector pCRII (Invitrogen Corp.). この際、常法によりDNAシークエンスを行い、文献等で公知の配列(Hagen FS et al , PNAS 1986; 83; 2412-6)を有することを確認した。 At this time, perform DNA sequencing by a conventional method, known sequences in the literature such as (Hagen FS et al, PNAS 1986; 2412-6; 83) was confirmed to have.
【0024】 [0024]
《実施例2. "Example 2. FVII発現ベクターの調製》 Preparation of FVII expression vector "
発現ベクターpCAGn(特許第2824434号公報)をSalI、BamHIで消化し、そこにFVIIをコードした配列を含む上記実施例1で調製したDNAフラグメントをSalI、BamHIでカットしたものをライゲーションし、大腸菌JM105に形質転換し、アンピシリン含有のLB寒天培地上で培養し、形質転換大腸菌を選択した。 Expression vectors pCAGn the (Japanese Patent No. 2,824,434) was digested SalI, with BamHI, and a DNA fragment prepared in Example 1 comprising the sequence thereto encoding a FVII ligated those cut SalI, with BamHI, E. coli JM105 was transformed into, and cultured on LB agar medium containing ampicillin, were selected transformed Escherichia coli. 出現したコロニーを市販の培地で一晩培養し、目的の発現プラスミドを抽出精製し「pVII-W」を調製した。 The appeared colonies were cultured overnight in a commercial medium was prepared by extracting and purifying the expression plasmid of interest "pVII-W". この発現ベクターのDNAシークエンスを行い、目的の遺伝子配列を有することを確認した。 Perform DNA sequence of the expression vector, it was confirmed to have the gene sequence of interest.
【0025】 [0025]
《実施例3. "Example 3. 改変体発現ベクターの調製》 Preparation of variant expression vector "
図4に示すアミノ酸配列を有する各FVII改変体を、以下の方法で作成した。 Each FVII variants having an amino acid sequence shown in Figure 4, were prepared in the following manner. なお図4は、FVIIの153番目のイソロイシンよりC末側のアミノ酸配列のみ示したもので、152番目のアルギニンよりN末側のアミノ酸については、いずれも改変は行っておらず野生型と同じである。 Note FIG. 4 shows only 153 th C-terminal amino acid sequence from isoleucine FVII, about 152-th of the N-terminal side of the arginine amino acid, any modifications are the same as the wild-type does not perform is there. 図5に示す合成DNAプライマーを用いてFVII遺伝子を鋳型としてPCRを行いそれぞれの増幅断片を得る。 Obtaining respective amplified fragment PCR was subjected to FVII gene as a template using a synthetic DNA primer shown in FIG. 各増幅断片と、発現ベクターpCAGnをSalI及びBamHIでカットしたものをライゲーションし、大腸菌JM105に形質転換し、アンピシリン含有のLB寒天培地上で培養し、形質転換大腸菌を選択した。 Each amplified fragment, an expression vector pCAGn were ligated which was cut with SalI and BamHI, and transformed into E. coli JM105, cultured on LB agar medium containing ampicillin, were selected transformed Escherichia coli. 出現したコロニーを市販の培地で一晩培養し、目的の発現プラスミドを抽出精製し「pVII-5」、「pVII-30」、及び「pVII-31」を調製した(図6)。 The appeared colonies were cultured overnight in a commercial culture medium, was extracted and purified the expression plasmid of interest "pVII-5", "pVII-30", and to prepare the "pVII-31" (FIG. 6). また、「pVII-6」については、図5に記載のプライマー▲5▼及び▲6▼を用いて得られた遺伝子を鋳型にし、さらにプライマー▲7▼及び▲8▼を用いてPCRを行うことにより得られた。 Further, the "pVII-6" is possible to perform PCR using primers ▲ 5 ▼ and ▲ 6 ▼ a gene obtained by using a template, further primers ▲ 7 ▼ and ▲ 8 ▼ description in FIG. 5 obtained by. また、「pVII-39」については、プライマー▲9▼及び(10)を用いて得られた遺伝子を鋳型にし、さらにプライマー(11)及び(12)を用いてPCRを行うことにより得られた。 Further, the "pVII-39" is a gene obtained by using primers ▲ 9 ▼ and (10) as a template, was obtained by performing PCR further using primers (11) and (12). さらにDNAシークエンスを行い、これらのプラスミドが目的の配列を有することを確認した。 Further subjected to DNA sequencing, these plasmids were confirmed to have the sequence of interest.
【0026】 [0026]
《実施例4. "Example 4. 各改変体の培養上清への発現及び精製》 Expression of the culture supernatant of each variant and purification "
上記発現ベクターを、市販のリポフェクチン試薬でCHO細胞に対して形質導入を行い、G418(1mg/ml)で選択し、目的の遺伝子を発現している細胞を限外希釈法によりクローニングした。 The expression vector, performs transduce CHO cells with a commercially available Lipofectin reagents, selected with G418 (1mg / ml), and the cells expressing the gene of interest were cloned by limiting dilution method. FVII改変体の発現の確認は、市販のFVIIに対するELISAキット(アセラクロムFVII;Diagnostica Strago社)で行った。 Confirmation of the expression of FVII variants, ELISA kit for the commercially available FVII; was carried out in (Acela chromium FVII Diagnostica Strago Co., Ltd.). 得られた安定発現株を無血清培地(ASF104、味の素、ペニシリン、ストレプトマイシン、20μg/mlビタミンK、1mM酪酸)で培養し、抗ヒトFVIIモノクローナル抗体カラムで精製した(特許第2824430号公報)。 The resulting stable cell lines serum-free medium (ASF104, Ajinomoto, penicillin, streptomycin, 20 [mu] g / ml vitamin K, 1 mM butyrate) were cultured in, and purified by anti-human FVII monoclonal antibody column (Patent No. 2824430 discloses). 平衡化・洗浄及び溶出は、平衡化・洗浄バッファー(50mM Tris, pH 7.2, 0.1M NaCl, 50mM Benzamidine-HCl, 2mM Ca 2+ )、溶出バッファー(50mM Tris, pH 7.2, 0.1M NaCl, 50mM Benzamidine-HCl, 10mM EDTA)を用いて行った。 Equilibration, washing and elution, equilibration and washing buffers (50mM Tris, pH 7.2, 0.1M NaCl, 50mM Benzamidine-HCl, 2mM Ca 2+), elution buffer (50mM Tris, pH 7.2, 0.1M NaCl, 50mM Benzamidine -HCl, it was carried out using a 10mM EDTA). 純化された改変体をSDS−PAGE、または市販のFVIIに対する抗体を用いて、ウエスタンブロットを行い、FVII改変体であることを確認した。 The Purified variants with antibodies against SDS-PAGE or commercially available FVII,, subjected to Western blotting, it was confirmed that a FVII variant.
【0027】 [0027]
《実施例5. "Example 5. 各改変体の凝固活性の測定》 Measurement of coagulation activity of each variant "
各改変体の凝固活性は常法に従い、FVII欠乏血漿を用いた凝固法で測定した。 Clotting activity of each variant according to a conventional method, was measured by clotting method using the FVII-deficient plasma. 精製した各改変体を50〜5ng/mlになるようにTris-BSAで希釈し、FVII欠乏血症と等量混ぜ、37℃で3分加温後、再脂質化TF(トロンボプラスチン;Dade社)を等量添加し、凝固反応を開始させた。 Each variant was purified by diluting with Tris-BSA so as to 50~5ng / ml, mix equal amounts and FVII deficiency hypertriglyceridemia, after 3 minutes heating at 37 ° C., re-lipidated TF (thromboplastin; Dade Co.) It was added in equal amounts, to initiate the clotting reaction. 凝固時間を測定し、標準曲線と希釈率より凝固活性を求めた。 The coagulation time was measured to determine a more clotting activity to a standard curve dilution. 凝固活性を蛋白濃度(Bradford法で測定)当たりに換算し比活性を求めた結果を表1に記す。 The clotting activity protein concentration (measured by Bradford method) result of obtaining converted to specific activity per shown in Table 1. その結果、本発明のFVII改変体は、血漿由来FVII及び野生型組換えFVIIと比較して、2〜6倍高い凝固活性を有することが明らかとなった。 As a result, FVII variants of the present invention, as compared to the plasma derived FVII and wild type recombinant FVII, it was found to have 2-6 fold higher clotting activity.
【0028】 [0028]
【表1】 [Table 1]
【0029】 [0029]
《実施例6. "Example 6. 活性化された各改変体の調製》 Preparation of the variants activated "
精製した各改変体を、50mM Tris, pH 7.45, 0.1M NaClに透析し、FXaを1/100(モル比)加え、50mM Tris, pH 7.45, 0.1M NaCl, 0.1% PEG 8000, 100μg/mLリン脂質(Platerin(登録商標) Organotecnica社)、 10mM Ca 2+ 、 37℃の条件下、1〜60分でインキュベーションし活性化した。 Each variant purified, 50mM Tris, pH 7.45, and dialyzed against 0.1 M NaCl, FXa 1/100 added (molar ratio), 50mM Tris, pH 7.45, 0.1M NaCl, 0.1% PEG 8000, 100μg / mL phosphorus lipids (Platerin (TM) Organotecnica Co.), 10mM Ca 2+, under conditions of 37 ° C., incubated and activated with 1 to 60 minutes. 活性化後、50mM Benzamidine-HClを加えて反応を停止し、抗ヒトFVIIモノクローナル抗体カラムで精製した(実施例4と同じ方法)。 After activation, the reaction was stopped by adding 50 mM Benzamidine-HCl, and purified by anti-human FVII monoclonal antibody column (the same method as in Example 4). 精製済みの各活性化改変体はTBS pH 8.0(0.1% PEG 8000含有)に透析し、-80℃に凍結保存した。 Purified each activation variants dialysed TBS pH 8.0 (0.1% PEG 8000 containing) and stored frozen in -80 ° C.. 活性化の程度は、SDS−PAGEで確認した。 The degree of activation was confirmed by SDS-PAGE.
【0030】 [0030]
《実施例7. "Example 7. 活性化された各改変体の合成基質に対する水解活性測定》 Hydrolyzate activity measured against synthetic substrate of each variant activated "
実施例6に従い活性化された改変体VIIa−31を0.1μMになるまで50mM Tris-HCl, 100mM NaCl,10mM Ca 2+ , 0.1% PEG 8000, pH 8.0で希釈し、そこに種々の合成基質を最終濃度1.0mMになるように加え、最終容量を200μlとし、30℃で反応させ、1分間当たりの基質の水解量を見た。 50 mM Tris-HCl variant VIIa-31 activated according to Example 6 until 0.1μM, 100mM NaCl, 10mM Ca 2+ , diluted with 0.1% PEG 8000, pH 8.0, various synthetic substrates therein added to a final concentration 1.0 mM, the final volume of 200 [mu] l, reacted at 30 ° C., viewed hydrolyzate amount of substrate per minute. 温度制御が可能な microplate reader Spectra max plus (Molecular device社)でpNAの遊離を405nmによる発色度として測定した。 Was measured free pNA as coloring degree of 405nm at a temperature control is possible microplate reader Spectra max plus (Molecular device, Inc.). この結果を表2に示す。 The results are shown in Table 2. 本発明の改変体の一つであるVIIa−31は、何れの合成基質を対しても野生型(VIIa−W)より高い水解活性を示し、その範囲は2〜23倍であった。 VIIa-31 variant which is one of the present invention, even for any synthetic substrates shows high water-decomposable activity than the wild type (VIIa-W), the range was 2 to 23 times.
【0031】 [0031]
【表2】 [Table 2]
【0032】 [0032]
【発明の効果】 【Effect of the invention】
このように本願発明により得られたFVII及び/またはFVIIaの改変体は、野生型のFVIIに比べて明らかに高い酵素活性を有するものである。 Thus FVII obtained by the present invention and / or FVIIa variants are those with significantly higher enzymatic activity than FVII wild-type. 従って、本願発明の改変体は、血友病インヒビター患者への補充療法として極めて有効な薬剤となりうるものである。 Thus, variants of the present invention are those which can be a very effective drug as replacement therapy for hemophilia inhibitor patients.
【配列表】 [Sequence Listing]

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
【図1】 FVIIの一次構造及び改変部位(星印)を示す図。 FIG. 1 is a diagram showing a primary structure and modification site (asterisk) of FVII.
【図2】 FVIIのプロテアーゼドメインアミノ酸配列を基にしたセリンプロテアーゼの基本構造を示す図。 2 is a diagram showing the basic structure of serine proteases that are based on the protease domain amino acid sequence of the FVII.
【図3】 X線立体構造既知の各種トリプシン族セリンプロテアーゼ間の3Dマルチアライメントを示す図。 FIG. 3 shows a 3D multi-alignment between the X-ray three-dimensional structure known various trypsin family serine proteases.
【図4】 野生型FVII(FVII−Wild)及び各種FVII改変体のアミノ酸配列の一部を示す図。 FIG. 4 shows a portion of a wild-type FVII (FVII-Wild) and various FVII variant amino acid sequence. 本図はFVIIの153番目のイソロイシンよりC末側のアミノ酸配列のみ示したもので、152番目のアルギニンよりN末側のアミノ酸配列についてはいずれも改変は行っておらず野生型と同じである。 This figure an illustration only 153 th C-terminal amino acid sequence from isoleucine FVII, both for 152 amino acid sequence of the N-terminal side of arginine modification is the same as the wild type did not go.
【図5】 FVII改変体作製用プライマー配列を示す図。 FIG. 5 shows a FVII variant fabrication primer sequence.
【図6】 FVII改変体発現ベクターの構築方法を示す図。 6 shows a construction process of FVII variant expression vector.

Claims (6)

  1. 血液凝固第VII因子(以下、FVII)または活性化型血液凝固第VII因子(以下、FVIIa)の170−loop内の311番目のロイシン(311Leu)から322番目のアスパラギン(322Asn)までのアミノ酸配列が、Glu−Ala−Ser−Tyr−Pro−Gly−Lysで置換されることを特徴とするFVIIまたはFVIIaの改変体。 Blood coagulation factor VII (hereinafter, FVII) or activated blood coagulation factor VII (hereinafter, FVIIa) amino acid sequence from 311 th leucine in 170-loop of the (311Leu) to 322 th asparagine (322Asn) is , FVII or FVIIa variants of which characterized in that it is substituted with Glu-Ala-Ser-Tyr- Pro-Gly-Lys.
  2. 配列表配列番号9または10記載のアミノ酸配列からなる請求項1に記載の改変体。 Variant according to claim 1 consisting of SEQ ID NO: 9 or 10 amino acid sequence described.
  3. 付加的に FVIIの99−loop内の235番目のバリン(235Val)から239番目のスレオニン(239Thr)までのアミノ酸配列が、Asp−Arg−Lys−Thr−Leuで置換されることを特徴とする請求項1 または2に記載の改変体。 The amino acid sequence of additionally from 235th valine in 99-loop of FVII (235Val) to 239th threonine (239Thr) is characterized in that it is substituted with Asp-Arg-Lys-Thr- Leu claims variant according to claim 1 or 2.
  4. 配列表配列番号11または12記載のアミノ酸配列からなる請求項に記載の改変体。 Variant according to claim 3 consisting of SEQ ID NO: 11 or 12 amino acid sequence described.
  5. 請求項1からのいずれかに記載の改変体を有効成分として含有する医薬品組成物。 Pharmaceutical composition containing as an active ingredient a variant according to any one of claims 1 to 4.
  6. 請求項の医薬品組成物からなる血友病インヒビター患者の治療に有効な薬剤。 Agents effective in the treatment of hemophilia inhibitor patients consisting of pharmaceutical composition of claim 5.
JP23761099A 1999-08-24 1999-08-24 Blood coagulation factor vii variant Expired - Fee Related JP4451514B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP23761099A JP4451514B2 (en) 1999-08-24 1999-08-24 Blood coagulation factor vii variant

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP23761099A JP4451514B2 (en) 1999-08-24 1999-08-24 Blood coagulation factor vii variant

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2001061479A JP2001061479A (en) 2001-03-13
JP4451514B2 true JP4451514B2 (en) 2010-04-14

Family

ID=17017876

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP23761099A Expired - Fee Related JP4451514B2 (en) 1999-08-24 1999-08-24 Blood coagulation factor vii variant

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP4451514B2 (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012001087A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Novo Nordisk A/S Antibodies that are capable of specifically binding tissue factor pathway inhibitor
WO2012117091A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Novo Nordisk A/S Coagulation factor-targeting to tlt-1 on activated platelets
WO2014057068A1 (en) 2012-10-10 2014-04-17 Novo Nordisk Health Care Ag Liquid pharmaceutical composition of factor vii polypeptide

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6905683B2 (en) 2000-05-03 2005-06-14 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII variants
CZ2003611A3 (en) 2000-09-13 2003-08-13 Novo Nordisk A/S Variants of human coagulation factor VII
WO2002038162A1 (en) 2000-11-09 2002-05-16 The Scripps Research Institute MODIFIED FACTOR VIIa
WO2002077218A1 (en) * 2001-03-22 2002-10-03 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii derivatives
JP2003284570A (en) 2001-04-25 2003-10-07 Chemo Sero Therapeut Res Inst VON WILLEBRAND FACTOR (vWF) BREAKING ENZYME
KR20040039444A (en) * 2001-09-27 2004-05-10 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 Human coagulation factor ⅶ polypeptides
US7052868B2 (en) 2001-09-27 2006-05-30 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US6960657B2 (en) 2001-11-02 2005-11-01 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
WO2003037932A2 (en) * 2001-11-02 2003-05-08 Novo Nordisk Health Care Ag Human coagulation factor vii polypeptides
KR101212025B1 (en) 2002-06-21 2013-01-09 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 Stabilised solid compositions of factor ⅶ polypeptides
DE60330923D1 (en) * 2002-09-25 2010-02-25 Novo Nordisk Healthcare Ag Human coagulation factor VII polypeptides
US6911323B2 (en) 2002-09-25 2005-06-28 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
CN1761747A (en) 2003-03-18 2006-04-19 诺和诺德医疗保健公司 Method for the production of GLA-residue containing serine proteases
EP2392655A3 (en) 2003-09-09 2012-02-29 Novo Nordisk Health Care AG Coagulation factor VII polypeptides
CN102351953B (en) 2003-12-01 2017-05-10 诺和诺德医疗保健公司 Virus filtration factor vii liquid composition
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
PL2298287T3 (en) 2003-12-19 2019-02-28 Novo Nordisk Health Care Ag Stabilised compositions of factor VII polypeptides
EP2368579A1 (en) 2004-01-21 2011-09-28 Novo Nordisk Health Care AG Transglutaminase mediated conjugation of peptides
KR20070043051A (en) 2004-08-17 2007-04-24 쳇엘베 베링 게엠베하 Modified vitamin k dependent polypeptides
KR101364001B1 (en) 2004-12-23 2014-02-17 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 Reduction of the content of protein contaminants in compositions comprising a vitamin k-dependent protein of interest
JP5216580B2 (en) 2005-05-25 2013-06-19 ノヴォ ノルディスク アー/エス Glycopegylated first ix factor
EP1893632B1 (en) 2005-06-17 2015-08-12 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine
WO2007006808A1 (en) 2005-07-13 2007-01-18 Novo Nordisk Health Care Ag Host cell protein knock-out cells for production of therapeutic proteins
EP1924689B1 (en) 2005-09-01 2014-08-13 Novo Nordisk Health Care AG Hydrophobic interaction chromatography purification of factor vii polypeptides
EP1926817A2 (en) 2005-09-14 2008-06-04 Novo Nordisk Health Care AG Human coagulation factor vii polypeptides
ES2531934T3 (en) 2006-09-01 2015-03-20 Novo Nordisk Health Care Ag Glycoproteins modified
ES2551123T3 (en) 2007-06-12 2015-11-16 Ratiopharm Gmbh Improved process for the production of nucleotide sugars
KR101798813B1 (en) 2007-12-27 2017-11-16 박스알타 인코퍼레이티드 Cell culture processes

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012001087A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Novo Nordisk A/S Antibodies that are capable of specifically binding tissue factor pathway inhibitor
WO2012117091A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Novo Nordisk A/S Coagulation factor-targeting to tlt-1 on activated platelets
WO2014057068A1 (en) 2012-10-10 2014-04-17 Novo Nordisk Health Care Ag Liquid pharmaceutical composition of factor vii polypeptide

Also Published As

Publication number Publication date
JP2001061479A (en) 2001-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100861470B1 (en) Factor ? glycoforms
US8765915B2 (en) Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
JP3459416B2 (en) The modified factor ▲ vii ▼
JP3122127B2 (en) Anticoagulant protein
KR101121593B1 (en) FACTOR VII OR VIIa POLYPEPTIDE VARIANTS
JP4509846B2 (en) Factor VII or Factor VIIa-like molecules
Dahl et al. Human recombinant pro-dipeptidyl peptidase I (cathepsin C) can be activated by cathepsins L and S but not by autocatalytic processing
JP3330932B2 (en) Anticoagulant protein
EP0502968B1 (en) Activatable fibrinolytic and anti-thrombotic proteins
JP4472526B2 (en) Factor VII or Factor VIIa variant clotting activity is increased
JP5917334B2 (en) Human coagulation vii factor polypeptide
RU2396347C2 (en) Modified vitamin k dependent polypeptides
EP2085471B1 (en) Modified factor VIIA polypeptides
EP1745141B1 (en) O-linked glycoforms of faktor vii and method to manufacture them
JP4276379B2 (en) Modified vitamin k-dependent polypeptides
JP4597678B2 (en) Human coagulation factor vii polypeptide
JP4317976B2 (en) x factor analogs having modified protease cleavage site
EP0370036B1 (en) Modified factor vii/viia
JP2610783B2 (en) Genes and vectors containing the same encoding Porikuri ing le plasminogen activator
JP4361786B2 (en) Stabilizing proteins with engineered disulfide bonds
Weimer et al. Prolonged in-vivo half-life of factor VIIa by fusion to albumin
Andolfo et al. Metalloproteases cleave the urokinase-type plasminogen activator receptor in the D1-D2 linker region and expose epitopes not present in the intact soluble receptor
AU2006254311B2 (en) Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties
US5550213A (en) Inhibitors of urokinase plasminogen activator
US5580560A (en) Modified factor VII/VIIa

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060713

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090512

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090710

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20090710

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090915

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20091116

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20091116

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20100126

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20100128

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130205

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130205

Year of fee payment: 3

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130205

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130205

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140205

Year of fee payment: 4

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313532

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees