JP4446486B2 - 微小物体の固定方法 - Google Patents

Description

この発明は、多数の微小物体の中から特定の微小物体を固定、回収又は観察する方法に関し、より詳細には、ＤＮＡ分子や細胞や微生物等の特定の微小物体をその他の微小物体と混在する中から固定、回収又は観察する方法に関する。

従来、ＤＮＡ分子や細胞や微生物等の特定の微小物体をその他の微小物体と混在する中から回収する方法として、マイクロピペットを用いてシャーレ等に入ったターゲットを光学顕微鏡下で観察しながら取り出したり、セルソーターを用いる方法などがとられていた（非特許文献１）。しかし、マイクロピペットを用いる方法では、顕微鏡下で微小な試料を高純度で選別し回収するためにはその作業に熟練した技術を要し、その実施に膨大な時間と費用を要している。また、セルソーターによる方法では、大きさが数十μｍ前後の対象物には有効性が示されているものの、数μｍ程度の微生物等の対象物への適用は難しく、サンプルを一列に整列させてシーケンシャルな分離作業を行うため、ランダムに分散したサンプルから任意に選ばれたターゲットを高速に取り出すことは不可能であった。

また、発明者らはマイクロ流体回路内でレーザートラップ、誘電泳動、マイクロキャピラリーフローを複合的に利用して分離を行う非接触式マニピレーション手法を用いた高速分離システムを考案した（特許文献１〜３）。しかし、直接レーザートラップで微生物を搬送するため、微生物に損傷を与える危惧があり、これを避けるために、マイクロツールをレーザートラップして、微生物を押したり引いたりすることで、間接的に搬送する方法も考案したが、実際は操作が難しい等の問題があった。
このような問題を解決するために、出願人らはゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす相転移温度等を有する媒体を用いて、これを局所的にゲル化して微小物体をこのゲル化した媒体に固定し、所望の微小物体を回収する方法を提案した（特願2002-131656）。

特開平11-346756 特開2001-095558 特開2001-145478 日本機会学会論文集 67巻635号C編146-153(平成13年1月)、Electrophoresis 2001, 22, 283-288

出願人らが提案した方法（特願2002-131656）では、温度変化でゾルゲル相転移をする熱ゲル水溶液等を用いて目標細胞を固定することで、細胞等の微小物体の分離を試みた。しかし、加熱によりゲル化する材料を用いた場合には温度が下がると微小物体を保持できなくなることや、いくつかのゲル化材料（メチルセルロースやポリNイソプロピルアクリルアミドなど）を用いると、付着力が弱いためマイクロ流路内で大きな外乱が作用するとしっかり固定ができない等の問題点があった。

そこで、光硬化樹脂を用いて微小物体を固定したり、更に、これに温度変化でゾルゲル相転移をする熱ゲル水溶液等を組み合わせることにより、微小物体の固定や回収が容易に行えることを見出し、本発明を完成させるに至った。
ここで固定とは、対象となる微小物体を空間的に移動できない状態にすることをいい、必ずしも微小物体を支持体等に接着、固着することに限定されない。このように固定した後に、適宜、固定された微小物体を回収したり観察することができる。

即ち、本発明は、ゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体、支持体、及び微小物体から成る系で固定しようとする微小物体の周辺の媒体を局所的にゲル化して該微小物体をこのゲル化した媒体と共に該支持体に固定する段階（Ａ段階）、この系に光硬化樹脂を加える段階（Ｂ段階）、及びゲル化した媒体周辺に該光硬化樹脂の硬化に有効な光を照射する段階から成る微小物体の固定方法である。
又更に、本発明は、この方法により微小物体を固定した後、硬化した光硬化樹脂の中から微小物体を含むゲル化した媒体又は硬化した光硬化樹脂の中の該媒体をゾル化して光硬化樹脂の中から微小物体を回収する段階から成る微小物体の回収方法である。
なお更に、本発明は、上記Ａ段階の後に、支持体上に固定されていない媒体及び微小物体を除去する段階を行い、上記Ｂ段階として、光硬化樹脂を含む媒体を系に注入する段階を行う上記の方法である。

また、本発明は、光硬化樹脂、支持体、及び微小物体から成る系において固定しようとする微小物体
を光硬化樹脂で囲み、微小物体が出入りできる開口部を開けるように、該光硬化樹脂の硬化に有効な光を照射して該微小物体を該支持体に固定する段階（Ｃ段階）、この系にゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体を加える段階（Ｄ段階）、及び該開口部の周辺の媒体を局所的にゲル化する段階から成る微小物体の固定方法である。
更に、本発明は、上記方法により微小物体を固定した後、前記開口部をゲルの温度制御によって開けて、微小物体を取り出す方法である。

従来微生物など細胞の特性調査は、個々の細胞を直接観察しながら活性生体分子を観察することが困難であったため、集団細胞実験を用いて行われてきた。提案手法では分散した微小物体の中から目標物をランダムに選択して生きたまま固定化すること可能であり、個々の細胞を直接観察しながらの特性調査を行うことができる。また、固定位置の情報は保存されるので電動ステージを制御することで複数の細胞の観察を自動化することができる。

本発明の方法で用いる光硬化樹脂として、光重合系（不飽和ポリエステル系、アクリレート、ナイロン系（光重合オリゴマー＋ポリマー）、Ｅｎｅ付加反応系、カチオン重合系等）、光架橋型（金属イオン重クロム酸型感光性樹脂（重クロム酸塩＋ポリマー）、光二量化型感光性樹脂（シンナメート系ポリマー）等）及び光分解型（光分解架橋型（アジド系化合物＋ポリマー）、光分解不溶型（ジアゾ系化合物＋ポリマー）等）等が挙げられるが、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールを含んだプレポリマー（例えば、ENTG-3800（関西ペイント））が好ましい。
このような樹脂を硬化させる光の波長は樹脂にもよるが好ましくは290nm〜800nm、より好ましくは320nm〜800nmであり、特に320nm〜400nmの光はＤＮＡの損傷がほとんどなく、加えて可視光で固まらないものを選択すれば可視光による観察が可能であるため好ましい。
この光の照射手段としては、水銀ランプ、ケミカルランプ（波長300〜400nm）、He-Cdレーザー（325nm）、Nd:YAG レーザーの 3 倍波（355nm）等が挙げられる。これらに適宜波長制御のためのフィルターや集光するためのレンズ等をかませてもよい。
また、この場合、媒体は光硬化樹脂のみでもよいし、これを適当な溶媒等に溶解させたものでもよい。

支持体は目標物を固定し、不要物を除去する際に目標物を固定しておくためのものであるので、このような目的にかなうのもであれば特に制限はない。通常は微小物体と媒体を入れておく容器であるが、容器とは別に、棒状、板状、網状あるいは格子状などの形状をした支持体を用いてもよい。支持体の材質には特に制限はない。但し、支持体が透明であると、その支持体を通して光を当てたり、目標物を観察したりすることが可能となり、更に、透過照明法により観察するタイプの顕微鏡を利用することができるため、好ましい。
媒体は、温度によりゾルとゲルの相転移を起こすものであり、この媒体が加熱出来るものであれば好都合である。例えば、支持体が透明電極（ＩＴＯ）であれば、これに赤外レーザー光を照射して局部加熱することも出来るし、通電により全体又は部分を加熱することも出来るため特に好ましい。
本発明の方法の対象である微小物体として、ゲル化した媒体に取り込まれるものであればいかなるものでも対象とできるが、特にサイズが数ｎｍ〜約２００μｍ、好ましくは数ｎｍ〜約３０μｍのものが適している。本発明の方法は、特に、ＤＮＡ分子、細胞又は微生物等の微小物体を分離回収することに適している。このような微小物体は、通常、試料の形、大きさ、色、蛍光反応などを目視又は顕微鏡を通して目視で識別することができるが、この微小物体が何らかのマーカーを有することにより、これにより識別してもよい。本発明においては、このような選択は必ずしも目視で行われることを必要とせず、ＣＣＤカメラなどを用いた自動識別装置や蛍光反応を自動的に感知する装置などを用いて自動化してもよい。

ゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体は、ゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こすものであれば如何なるものでもよい。その中で特に温度によりこのような相転移を起こすものを用いるのが簡便である。即ち、この媒体は、ゾルとゲルの相転移温度を有し、該相転移温度以上に加熱されることによりゲル化し、該相転移温度以下に冷却されることによりゾル化することが好ましい。この相転移温度は、本発明の対象である微小物体の性質にもよるが、好ましくは室温〜９０℃、より好ましくは２０〜８５℃、更に好ましくは３０〜６０℃、である。特に微生物を分離回収するためにはこの相転移温度は３０〜５０℃が好ましい。またこの場合、媒体は、水溶性のセルロース誘導体又はその溶液であることが好ましく、このセルロース誘導体としてはメチルセルロースがより好ましく、例えば、信越化学工業社製メトローズＳＭ、ＳＨ、ＳＥ等が挙げられる。更に、媒体として、ポリＮイソプロピルアクリルアミドとポリエチレングリコール誘導体の重合物等を用いてもよい。この重合物は、例えば、メビオールジェル（登録商標、株式会社池田理化、転移温度２２℃）として市販されているが、分子設計により転換温度を３０〜３２℃に設定することも可能である。
例えば、メチルセルロース（メトローズＳＭ）は、通常２％溶液で約５５℃に加熱すると、白濁してゲル化し、冷却することで再びゾル化する。この変化は温度変化に対して可逆性があり、メチルセルロースは繊維であるため生体、人体に無害である。さらに、ＮａＣｌやＮａＯＨなどを混入することでゲル化温度が低下する。例えば、この２％溶液にＮａＣｌ ５％を加えるとゲル化温度が約４０℃に低下する。

本発明において、ゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす手段は、ゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす物質の性質によって適宜選択すればよいが、温度によりゲルとゾルの相転移を可逆的に引き起こす物質を用いるのが簡便である。
局所加熱の方法としては特に制限はないが、微小電極を微細加工により形成し、抵抗線加熱を行ったり、赤外線照射装置により局所的に加熱してもよい。
加熱電極等の抵抗線加熱を行う場合であって、対象物が微生物等の場合には、抵抗線を絶縁体で被覆して、これらが通電により死滅しないような配慮をすることが好ましい。絶縁体としては、酸化シリコン、窒化シリコン、ポリイミド樹脂等が挙げられる。
この局所加熱方法としては、特に、赤外線の照射により媒体を相転移温度以上に加熱し、この照射を止めることにより媒体を相転移温度以下に冷却することが好ましい。赤外線照射装置は公知のものを用いることできるが、赤外レーザーを用いることがよい。レーザーは対象物にそのまま照射してもよいし、レンズ等を用いて対象物に集光するように照射してもよい。赤外レーザーとしては、ＹＡＧレーザー（Ｎｄ−ＹＡＧレーザー）、Ｎｄ：ＹＶＯ_４レーザー、ＣＯ_２レーザー、ルビーレーザーなどいかなるものを用いてもよいが、ＹＡＧレーザー又はＮｄ：ＹＶＯ_４レーザーを用いるのが簡便である。
また、加熱方法として、注入ポートから湯を注いでもよい。

以下、本発明の実施形態等を示すが本発明を限定することを意図するものではない。
まず、目標物を光硬化樹脂と共に固定して、目標物を分離、回収又は観察する方法を示す。
図１に示すような微細な流路をもったマイクロチップを製作し、顕微鏡ステージ上にセットする。マイクロチップとしては、この他に様々な形のものが考えられるが、図２に示すようなものも実際使い易い。
微小流路は微細加工により型を製作する。例えばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）により型取りすることでマイクロ流体チップを製作してもよいし、ガラスを用いて製作してもよい。また、バルブの開閉はマイクロ流体チップに接続しているチューブを変形させることや、マイクロチップ内にマイクロ小形バルブを作ってそれを制御することで行ってもよい。
サンプル投入ポートからサンプル細胞、微生物などを含む液体を注入する。分離部では光ピンセットあるいは熱ゲルの加熱冷却に基づいて選別したい目標細胞を補足する。光硬化樹脂投入ポートから光硬化樹脂を含む水溶液を投入する。このとき、試薬投入ポートのバルブは閉めておく。
2本の微小流路の合流点以降を倒立顕微鏡で観察し、試料の形、大きさ、色、蛍光反応などに基づいて目標物を選択する。目標物周辺に硬化する波長の光を局所的に照射して光硬化性樹脂を硬化させて目標物を固定する。
図３に光硬化性樹脂内に目標物を固定する例を示す。この例では目標物の位置が正確に固定できるメリットがあるが、包括的に固定しているため目標物の運動や試薬を流した際の基質の移動を阻害する可能性がある。

次に、目標物の周囲の光硬化樹脂を硬化して目標物を分離、回収又は観察する方法を示す。
上記と同じ装置と手順で行う。硬化手順を図４〜６に示す。
この例では、硬化する波長の光を目標物には照射せずに、その周辺を囲むように照射し、ポケットあるいは環状に光硬化性樹脂を硬化させ形成した空間内に目標物を固定する。
図４は目標物の周囲を半分だけ硬化させる例を示すが、空間内への固定であるため目標物の位置を精密に固定できないが、目標物の運動や基質の移動を阻害しにくいメリットがある。
以上の手順を繰り返し必要数の目標物を固定した後、試薬投入ポートから培養液や蛍光試薬等の試薬を流して、同時に不純物を除去する。試薬投入後は例えばバルブを全て閉じて閉環境にして反応を観察したり試薬を定期的あるいは連続的に循環させながら観察したりすることができる。
図５は更に目標物の周囲を筒状に全部硬化させる例を示す。この例では、目標物が固着していないので、上部から目標物を容易に取り出すことができる。
更に目標物を光硬化樹脂で囲み、細胞が出入りできる穴を開けておくこともできる。その例を図６に示す。図６では円筒の光硬化樹脂で目標物を取り囲み、上部の開口部を熱ゲルの温度制御によって開けたり閉めたりする。熱ゲルは温度制御によりゾルゲル相転移を起すため、入り口の開閉制御が可能となる。

本発明の実施形態として、一旦目標物を温度感受性ゲルで固定し、その周囲の光硬化樹脂を硬化することにより目標物を分離、回収又は観察する方法を示す。
この例では光硬化性樹脂と温度感受性ゾル/ゲルを併用する。その例を図７に示す。
まず、投入ポートから温度感受性ゲルを溶かした溶液に微小物体を分散した溶液を微小流路に投入する。このとき光硬化性樹脂投入ポートおよび試薬投入ポートのバルブは閉じておく。光硬化性樹脂との合流点以降の領域で倒立顕微鏡により観察し、試料の形、大きさ、色、蛍光反応などに基づいて目標物を選択する。選択した目標周辺に溶液が吸収する波長のレーザを照射し局所的に加熱しゲル化させる（ａ）。
次に光硬化性樹脂を微小流路内に投入する（ｂ）。このとき投入ポートおよび試薬投入ポートのバルブは閉じておく。ゲル化して目標物を固定した場所に光硬化性樹脂が硬化する波長の光を局所的に照射しゲル化部分を覆うように硬化させる（ｃ）。硬化後ゲル化を解除することで硬化した光硬化性樹脂により形成したドーム上の空間内に目標物が固定される（ｄ）。
この手順を繰り返して必要数の目標物を固定した後試薬投入ポートから試薬を微小流路に投入し反応を観察する。
上記図４の例では固定した空間内に光硬化性樹脂が残り、特に疎水性の光硬化性樹脂を使用する場合、水中では液滴が生じ観察を疎外する可能性がある。しかし、この例では温度感受性ゲルで予め空間を固定しておいてその周りを光硬化性樹脂で覆っているため、疎水性の光硬化性樹脂でも液滴が空間内には生じず観察を疎外しないメリットがある。尚、他の例と同様にバルブの開閉はマイクロ流体チップに接続しているチューブを変形させることや、マイクロチップ内にマイクロ小形バルブを作ってそれを制御することで行ってもよい。

流路をもったマイクロチップの一例を示す図（平面図）である。 マイクロチップの別の一例を示す図である。 光硬化性樹脂内に目標物を固定する例を示す図（断面図）である。 目標物の周囲（半分）の光硬化樹脂を硬化する手順を示す図である。上図は平面図、下図は断面図である。 目標物の周囲（残り半分）の光硬化樹脂を硬化する手順を示す図である。上図は平面図、下図は断面図である。 目標物の周囲を筒状に全部硬化させる例を示す図である。上図は平面図、下図は断面図である。 光硬化性樹脂と温度感受性ゾル/ゲルを併用した例を示す図である。すベて断面図である。

Claims (5)

1. ゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体、支持体、及び微小物体から成る系において固定しようとする微小物体の周辺の媒体を局所的にゲル化して該微小物体をこのゲル化した媒体と共に該支持体に固定する段階（Ａ段階）、この系に光硬化樹脂を加える段階（Ｂ段階）、及びゲル化した媒体周辺に該光硬化樹脂の硬化に有効な光を照射する段階から成る微小物体の固定方法。
2. 請求項１に記載の方法により微小物体を固定した後、硬化した光硬化樹脂の中から微小物体を含むゲル化した媒体を回収するか又は硬化した光硬化樹脂の中の該媒体をゾル化して光硬化樹脂の中から微小物体を回収する段階から成る微小物体の回収方法。
3. 前記Ａ段階の後に、支持体上に固定されていない媒体及び微小物体を除去する段階を行い、前記Ｂ段階として、光硬化樹脂を含む媒体を系に注入する段階を行う請求項１又は２に記載の方法。
4. 光硬化樹脂、支持体、及び微小物体から成る系において固定しようとする微小物体
   を光硬化樹脂で囲み、微小物体が出入りできる開口部を開けるように、該光硬化樹脂の硬化に有効な光を照射して該微小物体を該支持体に固定する段階（Ｃ段階）、この系にゾルとゲルの相転移を可逆的に引き起こす媒体を加える段階（Ｄ段階）、及び該開口部の周辺の媒体を局所的にゲル化する段階から成る微小物体の固定方法。
5. 請求項４に記載の方法により微小物体を固定した後、前記開口部をゲルの温度制御によって開けて、微小物体を取り出す方法。