JP4438865B2 - 妊娠可能性検査方法及び検査キット - Google Patents

Description

本発明は、妊娠可能性を早期に検査することができる方法及び検査キットに関する。より詳しくは、卵胞液内のＭＭＰ活性を測定することにより妊娠可能性を検査する方法に関する。

１９７９年に最初の試験管ベビーが生まれた以後、不妊患者を治療する多様な生殖補助施術法（ａｓｓｉｓｔｅｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ;ＡＲＴ）が開発され応用に至っている。ＡＲＴの例としては、試験管内受精−胚芽移植（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ−ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ;ＩＶＦ−ＥＴ）、細胞質内精子注入（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ;ＩＣＳＩ）、睾丸内の精子抽出法（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｓｐｅｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ;ＴＥＳＥ）、精子細胞注入（ｒｏｕｎｄ ｓｐｅｒｍａｔｉｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ;ＲＯＳＩ）及び胚芽冷凍（ｅｍｂｒｙｏ ｆｒｅｅｚｉｎｇ）法等がある。現在、生殖補助施術法は種々の原因による不妊治療において重要であり、一般的ともなっているが、高費用、複雑な過程及び低い成功率といった問題が残っている。

ＡＲＴは増加傾向にあり、特にＩＶＦにおける妊娠率は増加しているが、期待を上回るものではなく、実際の出産率（ｔａｋｅ ｈｏｍｅ ｂａｂｙ ｒａｔｅ）は１５−３０％程度である。米国の統計によると、１９８５年のＩＶＦによる妊娠率は周期当り２３.８％、分晩率は周期当り１９.３％であった。１９９７年統計によると、妊娠率は周期当り２９．３％、分晩率２４.０％に高くなった。しかしながら、１９９６年と１９９７年の統計で差異がなかった。

生殖補助施術（ＡＲＴ）周期において、成功的な人間の妊娠は、卵胞発達、回収された卵母細胞数、受精、受精卵の発達及び着床に依存する（Ｓａｋｋａｓ Ｄ, ｅｔ ａｌ．，２００１）。それらうち、子宮内膜に胚盤胞の着床は、子宮内膜と受精卵の発達から構造的な変化に依存する複雑な過程である。組織再形成には、子宮の準備、子宮内膜の受精卵破裂及び連続的な子宮内膜基質の出現が要求される。説得力のある証拠により、ＭＭＰｓ類がこの過程におけるＥＣＭ成分の破壊のために必須であるという仮説を裏付けている。このような観点から、ＭＭＰｓ類は発生過程において細胞の減数分裂、浸透及び組織の再現性と関連があるものと推測される。即ち、ＭＭＰはＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）の変化を誘発して生理周期に伴う内膜組織の変成（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）に関与すると知られており、更に、ＭＭＰ分子等は生理周期に伴って多様な発現様相を見せ、排卵及び着床過程に関与する。

ＭＭＰｓ類の中でも、９２ｋＤａ タイプ ＩＶ コラゲナーゼ／ゼラチナーゼ Ｂ（ｔｙｐｅ ＩＶ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ／ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ Ｂ）として知られたＭＭＰ−９（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９）は、多くの種類のコラーゲン（ＩＶ, Ｖ ａｎｄ ＸＩ）、エラスチン、プロテオグリカン及びゼラチンを分解する（Ｈｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５: Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。更に、従来の研究は、人間の頸部フイブロブラスト（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｆｉｂｒｏｌａｓｔｓ）（Ｓａｔｏ, Ｈ. ａｎｄ Ｓｅｉｋｉ, Ｍ．，１９９３）、栄養細胞（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｓ）（Ｓｈｉｍｏｎｏｖｉｔｚ, Ｓ. ａｔ ａｌ．，１９９６）及び子宮内膜基質細胞（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ）（Ｈｕａｎｇ, Ｈ.Ａ．， ｅｔ ａｌ．，１９９８）から分泌されるＭＭＰ−９がホルモンとサイトカインによって刺激されることを立証している。ＭＭＰ−９は、生理周期、排卵、着床、分晩及び授乳後の乳腺の退縮といった、女性の生殖に関する周期的な変化の異なる段階に介在すると提案されている（Ｊｅｚｉｏｒｓｋａ, Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，１９９６; Ｌｉｂｒａｃｈ, Ｃ. Ｌ. ｅｔ ａｌ．，１９９１; Ｖａｄｉｌｌｏ−Ｏｒｔｅｇａ, Ｆ, ｅｔ ａｌ．，１９９５）。排卵は脳下垂体からＬＨが排卵前に上昇して生ずる過程であり、その結果、卵巣の卵胞から成熟された卵子が排出される。このような過程は、多くの組織形成が要求され、ＭＭＰ−９は排卵時に必要な蛋白分解活性を惹起するのに重要であるが、人間の卵胞液とＭＭＰ−９との間の関係については明らかにされていない。

本発明の目的は、試験管受精といった生殖補助施術の方法において、妊娠可能性を検査することができる方法及び検査キットを提供することである。

この目的を達成するため、試験管受精プログラムに参加する女性から回収した卵胞液及びＭＭＰ活性が測定された。その結果、ＭＭＰ−９活性が低いグループからは全く妊娠がされず、ＭＭＰ−９活性の高いグループにおいては妊娠率が５０−６０％であることが示された。従って、本発明の方法及びキットを用いて、卵胞液でＭＭＰ−９の発現程度を測定することにより、ＡＲＴにおける妊娠可能性を予測することができ、ＡＲＴの効率性を向上することができる。本発明の発明者らは、卵胞液からのＭＭＰ−９の発現が、試験管受精周期において妊娠と関係しているかを試験した。本発明の結果は、排卵液からのＭＭＰ−９の発現が高い着床率及び高い妊娠率に関係があることが示した。

すなわち、本発明は成熟した卵母細胞を有する卵胞の卵胞液に含まれたＭＭＰ−９の活性を測定し、前記ＭＭＰ−９の活性をゼラチン基質ザイモグラフィ技術において密度測定機器を使用して数値化した値が５０,０００ユニット以上であることを確認することにより妊娠可能性を検査する方法を提供することを特徴とする。

更に詳しくは、本発明は粒径１７ｍｍ以上の卵胞を選んでＭＭＰ−９活性を測定することにより妊娠可能性を検査する方法であることを特徴とする。

また、本発明はＭＭＰ−９によって分解される蛋白質基質を含むポリアクリルアミドゲルを使用して、卵胞液内のＭＭＰ−９活性を測定し、前記ＭＭＰ−９の活性をゼラチン基質ザイモグラフィ技術において密度測定機器を使用して数値化した値が５０,０００ユニット以上であることを確認することができる妊娠可能性検査キットを提供することを特徴とする。

更に詳しくは、本発明は、妊娠可能性を検査する検査キットにおいて、前記蛋白質基質は、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＸＩ、エラスチン、プロテオグリカン及びゼラチンの中から選択されることを特徴とする。

生殖周期及び妊娠期間における女性の内分泌状態の変化は、子宮における多くの組織再形成の結果である（Ｗｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６; Ａｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。例えば、子宮にあるｔｙｐｅ ＩＶ コラーゲン、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、フイブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）及びプロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）といった様々な基底膜成分は、月経周期と妊娠を通じて変化を伴うようになる（Ａｐｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。同様に、ネズミの子宮内基質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）も、この過程中に細胞外液マトリクス成分のリモデリング（Ｗｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６）が行われ、ＭＭＰｓ類とＴＩＭＰｓ類が排卵、着床及び脱落膜過程にマトリクスを分解する核心媒介要因であると考えられる（Ｂｅｈｒｅｎｄｔｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２: Ｃｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４; Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９５４; Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５; Ｌｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６; Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

本発明では、排卵中ヒトの卵胞液（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）に存在するＭＭＰ−９活性をゼラチン基質ザイモグラフィ（ｇｅｌａｔｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）技術により証明するものであり、ＭＭＰ−９活性は、非妊娠グループに比べて妊娠グループにおいて顕著に増加する（Ｐ＜０.０１）。しかしながら、細胞のリモデリングに関与するものと知られた更に一つの酵素であるＭＭＰ−２活性は妊娠グループと非妊娠グループの全ての卵胞液において高く発現され差異は存在しなかった。各グループから測定したＭＭＰ−９活性を、密度測定（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）機器を使用して数値化して比較した結果、妊娠グループの平均ＭＭＰ−９活性は６１,７５９ｕｎｉｔであった。これらの結果は、ＭＭＰ−９活性が妊娠のための前提条件であることを明確に示唆するものである。

多くの研究は、ＭＭＰ−９の役割が組織形成と多くの生物学的組織治療、排卵、炎症、関節炎、傷治療、腫瘍浸透、形態形成のような病理学的状態において重要であると提案する（Ｂｅｈｒｅｎｄｔｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２； Ｃｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４; Ｌｅｆｅｂｖｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５; Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５; Ｌｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６; Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。しかしながら、生理学的に要求されるＭＭＰと体内で発生された蛋白質基質に関してはほとんど知られていない。膜成分のコラーゲン ＩＶを含む基質特異性を有する卵胞液において、ＭＭＰ−９の存在は、卵胞成長と発達する間、組織再現性を要求するであろうと考えられる。排卵は、調節された酵素的な分解と卵胞壁でコラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ）の損失による結果として起こる（Ｅｓｐｅｙ,１９９４；Ｌｕｃｋ ａｎｄ Ｚｈａｏ,１９９５）。

コラーゲン分解酵素は、ヒトでない他の種の排卵においても重要であると考えられ、卵巣基質に対して外皮構造を付与する繊維状コラーゲンの形成を破壊するＭＭＰ−１といった繊維状コラゲナーゼ（ｆｉｂｒｉｌｌａｒ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）を含む。ＭＭＰ−９の発現は、マウスと人間のｐｒｅ−ｉｍｐｌａｔａｔｉｏｎｅｍｂｒｙｏ、ＥＣ細胞及び漂白生成物（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）からザイモグラフィ、免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）及びＲＣＲによって検出された。フイブロブラスト成長因子−４（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔａｒ−４）の存在下において、胞胚培養はＭＭＰ−Ｐの分泌を増加させた。ＭＭＰ−９は、受精卵着床の間マウスの胞胚と栄養胚葉細胞層（ｃｙｔｏｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ）において漸進的に増加することが示された。本発明において、ＭＭＰ−９の発現グループと非発現グループとの間で、受精から８−細胞期まで卵割率は、ＭＭＰ−９の発現は細胞分裂による重大な差異はないが、その後、着床期間の間、ＭＭＰ−９は必要であることが示された。

一方、成功的な妊娠は着床の時に脱落膜（ｄｅｃｉｄｕａ）において栄養胚葉（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）の浸透に依存し、その結果、子宮壁に細胞の栄養胚葉（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｏｕｓ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）が更に浸透する（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５;Ｌｉｂｒａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８５; Ｌｉｂｒａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１ ; Ｃｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。これらの出来事は、細胞外液マトリクスの破壊と細胞の移動が要求される。ＭＭＰｓは細胞外マトリクスの破壊を可能とする基質特異性が広い亜鉛依存性酵素の重要なファミリーである（Ｈｕｌｂｏｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ラットと人間の胎膜において、ＭＭＰ−９の総量は、陣痛とともに増加した（Ｂｒｙａｎｔ−Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ,１９９５; Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５; Ｌｅｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。

本研究は、卵胞液におけるＭＭＰ−９発現の欠乏は、不妊となることを立証した。すなわち、着床と妊娠状態においてＭＭＰ−９発現が必須であり、また、この発現が、排卵期におけるＭＭＰ−９発現と親密に関連していることを示唆する。結論として、ＭＭＰ−９は、卵胞の成長及び発達期の細胞外マトリクスの破壊、卵胞の移動、胚卵及び他の細胞の作用を調節するのに重要な役割を果たす。

下記に実施例を通じて、本発明を説明する。その実施例は、説明を目的としてものであって、本発明における特定の形態を限定するものではない。

＜材料及び方法＞
研究対象
東国大学校（Ｄｏｎｇｇｕｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の病院女性人工授精（ＩＶＦ）プログラムに従って、多様な不妊の問題を有する５４名の患者が本研究に動員された。不妊の原因別に卵管要因（ｎ＝１５）、子宮内膜症（ｎ＝１１）、排卵停止（ｎ＝９）そして、原因不明の不妊（ｎ＝１９）である。患者らの年は２１〜３３歳であった（平均３１.３歳）。一方、男性不妊要因、即ち、無精子症、稀少精子症等が同伴された場合は本研究対象から除外された。

＜生殖補助施術過程＞
１．卵母細胞の準備
排卵誘導は、ゴナドトロピン分泌ホルモン作用薬（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ａｇｏｎｉｓｔ）（ＧｎＲＨ−ａ）によって実施された。黄体期中期から、９００ブゼレリン（ｂｕｓｅｒｅｌｉｎ）（Ｈｏｅｃｈｓｔ, Ｇｅｒｍａｎｙ）を鼻腔噴霧投与して脳下垂体を抑制させ、卵胞期３〜５日目から、ヒト更年期ゴナドトロピン（ｈｕｍａｎ ｍｅｎｏｐａｕｓａｌ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）（ｈＭＧ,Ｐｅｒｇｏｎａｌ,Ｓｅｒｏｎｏ又はＩＶＦ―Ｍ,ＬＧ.韓国）を投与した。窒息超音波を使用した卵胞の反応に従って、ｈＭＧの投与量を調節して、卵胞の粒径が１７ｍｍ以上であるものが２個以上である時、１０,０００ＩＵのヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｒｔｏｐｉｎ）（ｈＣＧ,ＩＶＦ−Ｃ,ＬＧ,韓国）を投与して胚卵を誘導した。ｈＣＧ注射の３６時間後に窒息超音波を使用して卵胞を吸入、卵母細胞を採取した。採取した卵母細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２条件に調節された操作機（ＩＶＦ ｃｈａｍｂｅｒ,米国）内で解剖顕微鏡（ＳＭＺ−１０,ニコン,日本）を使用して卵球細胞の特徴と細胞質内のＧＶの有無を基準に卵母細胞の成熟程度を確認した。その後、１０％ＳＳＳを添加したＰ１培地が入っている培養皿（３０３７,Ｆａｌｃｏｎ,米国）に移して受精時期までＣＯ_２培養器で培養した。受精に使用する卵母細胞は培養皿当り、５個以下になるように調節した。

２．体外受精
卵母細胞を採取後、マスターベーションにより試料容器（ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）（Ｂａｘｔｅｒ,米国）に精液を回収した。精子の濃度と運動性は、ＷＨＯの基準に従って測定した。精液は、液状化を誘導するため、室温で１０〜２０分間放置された。液状化された精液は１５ｍｌコニカルチューブ（ｃｏｒｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）（２０９９,Ｆａｌｃｏｎ,米国）に移した後、１０％ＳＳＳが添付されたＨａｍ’ｓ Ｆ−１０にて１,５００ｒｐｍで、２回（５分、３分）遠心分離された。遠心分離後、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を除いた上層液は除去され、ペレットが散らないように１ｍｌの１０％ＳＳＳが添加されたＨａｍ'ｓ Ｆ−１０を注意して添加して、３０分間培養器内で精子を浮遊した。浮遊された精子は５ｍｌ容チューブ（２００３，ｆａｌｃｏｎ,米国）に保管しながら受精に使用した。受精に使用する精子は１×１０^５／ｍｌ匹になるように受精時期の卵母細胞が入っている培養液内に注入した。翌日の朝、３７℃、５％ＣＯ_２条件に調節された操作機内にある解剖顕微鏡下で注射針（ｓｙｒｉｎｇｅ ｎｅｅｄｌｅ）（３２０３１０,ＢＤ,米国）を用いて卵球細胞を除去し、受精したかどうかを調べた。雌性前核と雄性前核が形成されており、２個の極体があるのを受精がなったものと確認した。

３．胚芽移植
正常的に受精が行われた胚だけを選別してＰ１培養液で４８時間を培養した後、８−細胞期以上の胚を２−５個選別して移植した。移植には、殆どの場合、Ｔｏｍｃａｔ ｃａｔｈｅｔｅｒ（８８９０−７９３０２１,Ｓｈｅｒｗｏｏ,米国）を使用した。

４．黄体ホルモンの投与及び妊娠の確認
胚芽移植後、毎日、１００ｍｇの黄体ホルモン（ｐｒｏｇｅｔｅｒｏｎｅ ｉｎ ｏｉｌ, Ｐｒｏｇｅｓｔ,Ｓａｍｉｌ,韓国）が患者に対して筋肉注射された。移植後の１０日頃に、血中β−ｈＣＧの濃度が１０ｍＩＵ／ｍｌ以上であることをもって生化学的妊娠として定義した。また、少なくとも妊娠期間中に窒息超音波検査で胎児の心臓活性が確認されることをもって臨床的妊娠として定義した。

＜卵胞液の準備＞
卵胞液は、ＩＶＦ体外受精施術を行って周期が高揚している女性の粒径１７ｍｍ以上の卵胞から超音波吸入（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−ｇｕｉｄｅｄ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）方法で回収した。回収した卵母細胞及び卵胞液は、超音波吸入に供され、卵胞液については血液が殆ど混じっていないものだけを回収して使用した。回収された卵胞液は遠心分離（３,５００ｒｐｍ）を３０分間実施して血球細胞と顆粒球細胞等を除去した後、上層液だけを回収した。上層液は、０.２μｍの濾過器で除菌し、−２０℃の冷蔵庫で保管した。卵胞液は使用に際して溶解された。

＜ザイモグラフイ（ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）法を用いたＭＭＰ−９活性の測定＞
卵胞液におけるＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の発現は、Ｒａｗｄａｎｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ.（１９９４）の記載に、Ｒｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ. （１９９９）の内容を修正したザイモグラフイを使用して検出した。卵胞液は１ｍｇ／ｍｌのゼラチンが含まれたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７.５％（ｗ／ｖ ｇｅｌｓ; Ｍｉｎｉｇｅｌ ａｐｐａｒａｔｕｓ; Ｂｉｏ−Ｒｅｄ, Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｅａｄ）を用いて分離した。ゲルは、２.５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で２回洗浄され、消化緩衝液（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ; ２００ｍＭ ＮａＣｌ, ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ, ２.５ ｍＭ ＣａＣｌ_２, １ｍＭ ＺｎＣｌ_２, ｐＨ７.６; ａｌｌ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｆｒｏｍ Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ, Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ）に入れて３７℃、１８時間保管した。ゲルは、染色溶液（０.５％（ｗ／ｖ） Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ Ｒ２５０ （Ｂｉｏ Ｒｅｄ, Ｒｉｃｈｍｏｎｄ, ＣＡ） ｉｎ ３０％（ｖ／ｖ） ｍｅｔｈａｎｏｌ １０％（ｖ／ｖ）ｇｌａｃｉａｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Ｈ_２Ｏ）で室温で染色した。

＜ザイモグラフイ後、ＭＭＰ−９活性の数値化＞
ゼラチナーゼ（Ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ）活性は、ゲルをスキャニングした後、帯（ｂａｎｄ）層の強さと表面を測定するＧｅｌ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｅｍｉ−ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｃｏｒｅ−Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ, Ｓｅｏｕｌ,韓国）を使用して定量された。

＜統計＞
結果は、少なくとも３反復の平均により行われた。平均に対する有意性はＳｔｕｄｅｎｔｓ ｔ−ｔｅｓｔで評価した。Ｐ＜０.０５である場合、統計学的に有意性のあるものと判定した。

＜結果＞
卵胞液において、９２ｋＤａに表れるゼラチナーゼ活性は、ザイモグラフイによって立証されたように、ＭＭＰ−９活性と一致した（図１）。妊娠群のＭＭＰ−９活性の総量は、非妊娠群に比べて有意的に高かった（Ｐ＜０.０１）。

また、しかし、７２ｋＤａサイズに現れるゼラチナーゼ活性は、全ての女性の卵胞液に多くあるＭＭＰ−２活性と一致する。しかしながら、ＭＭＰ−２活性は妊娠群と非妊娠群間の差異がなかった（図２）。

本試験対象女性らの平均年齢は３１歳（±３.３）であった。全ての試験対象群（ｎ＝５４）から一度処理周期後、卵母細胞を成功的に回収した。卵母細胞の回収はｈＣＧを注射後、３６−３７時間に行った。妊娠群の平均受精率は７１.８２％（±１１.７）であった。妊娠ができない非妊娠群は６９.１％（±１３.１）であった。その結果、全ての女性は２〜７個の受精卵を移植した。１６名が化学的妊娠に確認され、その中、１名は流産になり１５名は継続進行され分晩した。歳による妊娠群と非妊娠群との間の差異はなかった。平均の年は夫々２９（±３.３）と３１（±３.２）であった（表１）。

卵胞液に存在するＭＭＰ−９活性を測定した結果、妊娠群の平均ＭＭＰ−９活性は６１,７５９デンシメトリーユニット（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ ｕｎｉｔ）であった。全体５４名の女性が本試験対象群に含まれたが、各グループの分類を見ると卵管要因（Ｔｕｂａｌ ｆａｃｔｏｒ）（ｎ＝１５）、子宮内膜症（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ; ｎ＝１１）, 原因不明（ｎ＝１９）及び排卵停止（ａｎｏｖｕｌａｔｉｏｎ; ｎ＝９）であり、各グループの平均ＭＭＰ−９活性の程度を比較した（図３）。すなわち、無排卵群におけるＭＭＰ−９活性は他の３グループに比べて有意に低かった（ｐ＜０.００１）。

一方、最終的な全着床率（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）及び全妊娠率（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｒａｔｅ）は、夫々１８.６％と２９.６％であった。表２ではＭＭＰ−９活性の程度に基づいて、任意的に４種の群に分類して妊娠率と着床率とを区分した。第１群のＭＭＰ−Ｐ活性度は３０,０００〜４０,０００ｕｎｉｔ、第２群は４０,０００〜５０,０００ｕｎｉｔ、第３群は５０,０００〜６０,０００ｕｎｉｔ、そして、第４群は６０,０００ｕｎｉｔ以上に区分した。

興味があることに、ＭＭＰ−９活性水準が５０,０００ｕｎｉｔ以下である時、着床率と妊娠率は全て０％であった。対照的に、ＭＭＰ−Ｐ活性水準が５０,０００ｕｎｉｔ以上である時、着床率と妊娠率は夫々３２.１５と４７.３％であったし、ＭＭＰ−９活性が高い時にだけ着床と妊娠が成功的であった。ＭＭＰ−９活性５０,０００ｕｎｉｔ以下では着床と妊娠は全て行われなかった。従って、本発明者らはＭＭＰ−９活性が存在しなければ着床と妊娠が行われない事実を提示した（表２）。

本発明によれば、生殖補助施術法において、実際の出産まで繋がる確率が低い問題点を解決し、妊娠可能性有無を初期に検査することができる。

更に、本発明によれば、ＭＭＰ−９が発現されない群を分類して従来の生殖補助施術法に前以て妊娠率を高めることができる新しい治療法を見出すことができるようになった。

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図１は人間卵胞液におけるＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２の活性をザイモグラフイ分析で測定した写真。試料等は０.１％ゼラチンが含まれた７.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気移動させて洗浄し、ザイモグラフイインキュベーション緩衝液からオーバーナイトしてゼラチンが切断（ｄｉｇｅｓｔ）されるようにした。図１ＡはＭＭＰ−９活性に対するザイモグラフイであり、図１ＢはＭＭＰ−２活性に対するザイモグラフイ。レーンＣはＭＭＰ−９対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）、レーン１−５は妊娠群（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）、レーン６−１０は非妊娠群（ｎｏｎｐｒｅｇｎａｎｃｙ）。 図２は試験管受精の卵胞液からｐｒｏＭＭＰ−９の発現と妊娠率（ｐｒｅｇｎａｎｃｙｒａｔｅ）との関係を表したグラフ。 図３は本研究対象患者らの不妊原因とＭＭＰ−９発現との間における関係を表したグラフ。

Claims (4)

1. 成熟な卵母細胞を有する卵胞の卵胞液に含まれたＭＭＰ−９の活性を測定し、前記ＭＭＰ−９の活性をゼラチン基質ザイモグラフィ技術において密度測定機器を使用して数値化した値が５０,０００ユニット以上であることを確認することにより妊娠可能性を検査することを特徴とする妊娠可能性検査方法。
2. 前記卵胞は、粒径１７ｍｍ以上のものが選択されることを特徴とする請求項１に記載の妊娠可能性検査方法。
3. ＭＭＰ−９によって分解される蛋白質基質を含むポリアクリルアミドゲルを使用して卵胞液内に含まれるＭＭＰ−９の活性を測定し、前記ＭＭＰ−９の活性をゼラチン基質ザイモグラフィ技術において密度測定機器を使用して数値化した値が５０,０００ユニット以上であることを確認することを特徴とする妊娠可能性検査キット。
4. 前記蛋白質基質は、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＸＩ、エラスチン、プロテオグリカン及びゼラチンの中から選択されたものであることを特徴とする請求項３に記載の妊娠可能性検査キット。

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