JP4434360B2

JP4434360B2 - Protease-containing liquid

Info

Publication number: JP4434360B2
Application number: JP16212799A
Authority: JP
Inventors: 政博関口; 幸司牛澤
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 1999-06-09
Filing date: 1999-06-09
Publication date: 2010-03-17
Anticipated expiration: 2019-06-09
Also published as: JP2000342252A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロテアーゼ含有液に関し、さらに詳しくは、長期間溶液中でプロテアーゼ活性の低下が少なく、操作性、経済性に優れたプロテアーゼ含有液に関する。
【０００２】
【従来の技術】
グリコシル化蛋白質は、グルコース等の還元糖類と、血清アルブミン等の蛋白質とが非酵素的に縮合したものであり、その主なグリコシル化部位は、リジン残基のε−アミノ基及びＮ末端アミノ酸のα−アミノ基である。かかるグリコシル化蛋白質は、糖尿病における血糖制御を監視する上で有用な手段である。例えば、フルクトサミンは、アルブミンを主とする血漿蛋白質がグルコースと結合し、アマドリ転移により安定化したものであり、血液中の過去１〜３週間のグルコースレベルを反映する。また、ＨｂＡ１ｃは、グルコースがヘモグロビンβ鎖のＮ末端バリンと結合し、アマドリ転移により安定化したものであり、血液中の過去３〜４週間のグルコースレベルを反映する。
【０００３】
上記フルクトサミン等のグリコシル化蛋白質を測定する手段としては、例えば試料をプロテアーゼで処理し、そのプロテアーゼ処理試料をケトアミンオキシダーゼで処理し、その反応生成物を測定することを特徴とする、試料中の非酵素的グリコシル化蛋白質の測定法（特開平５−１９２１９３号公報）が知られている。これは、ケトアミンオキシダーゼの反応によって、プロテアーゼ処理蛋白質から糖オソン及び過酸化水素を生成させ、そのいずれかを測定することにより、グリコシル化蛋白質を測定する方法である。この方法は、測定精度が高く、自動化に適しているという優れた利点を有している。しかしながら、この方法において、プロテアーゼは、蛋白質を分解してケトアミンオキシダーゼの基質を遊離するという性質を有するものであるため、プロテアーゼの活性が低下すると、測定感度が低下するという問題を有している。このためこれまでは、プロテアーゼを含む試薬を凍結乾燥して、保存中のプロテアーゼ活性の低下を防止し、使用する際にその都度必要量を水に溶解していた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、使用の際にその都度必要量を溶解することは、操作性、迅速性の点で問題があった。また、余った溶液は、そのまま保存するとプロテアーゼ活性が低下するため、廃棄せざるを得ず、経済的にも不利であった。
【０００５】
したがって、本発明は、プロテアーゼが溶液中で長期間安定であり、液状化試薬としてそのまま用いることができ、操作性、経済性に優れたプロテアーゼ含有液を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、プロテアーゼとともに、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｈｉｓ−Ｌｅｕ及びαアミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基で修飾したアミノ酸からなる群より選ばれる１種以上を配合したプロテアーゼ含有液であれば、長期間保存してもプロテアーゼ活性の低下が少なく安定であり、測定時にそのまま使用することができ、操作性、迅速性、経済性に優れていることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、グリコシル化蛋白質を測定する際に使用するプロテアーゼ含有液であって、これが、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｈｉｓ−Ｌｅｕ及びαアミノ基をｔ−ブトキシカルボニル基で修飾したアミノ酸からなる群より選ばれる１種以上を含有することを特徴とするプロテアーゼ含有液を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明に用いるプロテアーゼは、グリコシル化蛋白質の測定に用いるものであれば特に制限はなく、例えばプロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、アナナイン、サーモリジン、ズブチリシン、ウシ膵臓プロテアーゼ等が挙げられ、これらを１種以上用いることができる。このうち、プロテイナーゼＫが好ましい。かかるプロテアーゼは、本発明のプロテアーゼ含有液中、活性として０．５〜１００００ｕ／ｍＬ、特に１０〜２０００ｕ／ｍＬの範囲で用いることが好ましい。
【０００９】
本発明においては、αアミノ基をｔ−ブトキシカルボニル（以下、「Ｂｏｃ」という）基で修飾したアミノ酸（以下、「Ｂｏｃアミノ酸」という）の絶対配置に特に制限はなく、Ｄ型、Ｌ型のいずれでもよいが、このうちＬ型が特に好ましい。
【００１０】
Ｂｏｃアミノ酸は、少なくともαアミノ基がＢｏｃ基で修飾されていれば、残余のアミノ基やカルボキシル基等が、Ｂｏｃ基や、あるいはベンゾキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシ基等のＢｏｃ基以外の基で修飾されていてもよい。例えば、α位とε位の２個所にアミノ基を有するリジンの場合、両者がＢｏｃ基で修飾されていてもよく、またαアミノ基がＢｏｃ基で修飾され、εアミノ基がＢｏｃ基以外の基で修飾されていてもよい。かかるＢｏｃアミノ酸としては、例えばＢｏｃ−Ａｌａ位とε位の２個所にアミノ基を有するリジンの場合、両者がＢｏｃ基で修飾されていてもよく、またαアミノ基がＢｏｃ基で修飾され、εアミノ基がＢｏｃ基以外の基で修飾されていてもよい。かかるＢｏｃアミノ酸としては、例えばＢｏｃ−Ａｌａ、Ｎ（α）−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ、Ｎ（α）−Ｂｏｃ−Ｎ（ε）−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ、Ｎ（α）−Ｂｏｃ−Ｎ（ε）−ベンゾキシカルボニル−Ｌｙｓ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ、Ｎ（α）−Ｂｏｃ−Ａｓｐ−β−シクロヘキシルエステル、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ及びＢｏｃ−Ｖａｌ等が好ましい。このうちＢｏｃ−Ｌ−α−アミノ酸であるＢｏｃ−Ｌ−α−Ａｌａ、Ｎ（α）−Ｂｏｃ−Ｎ（ε）−ベンゾキシカルボニル−Ｌ−α−Ｌｙｓ、Ｎ（α）−Ｂｏｃ−Ｌ−α−Ａｓｐ−β−シクロヘキシルエステル、Ｂｏｃ−Ｌ−α−Ｇｌｙ及びＢｏｃ−Ｌ−α−Ｖａｌが特に好ましい。かかるＢｏｃアミノ酸の、本発明のプロテアーゼ含有液中の含有量は、０．１〜５００ｍＭ、特に１〜１００ｍＭが好ましい。０．１〜５００ｍＭ含有することにより、プロテアーゼ含有液中のプロテアーゼ安定化効果が顕著になる。なお、ここでＮ（α）またはＮ（ε）とは、α位のＮまたはε位のＮを意味する。
【００１１】
また、本発明においては、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｈｉｓ−Ｌｅｕを用いることもでき、このうち、Ｇｌｙ−Ｐｈｅが好ましい。また、本発明においては、ペプチドをプロテアーゼ含有液に添加し、該プロテアーゼで該ペプチドを加水分解させ、上記ジペプチドを該プロテアーゼ含有液中で生成させてもよい。上記ジペプチドの、本発明のプロテアーゼ含有液中の含有量は、０．１〜５００ｍＭ、特に１〜１００ｍＭが好ましい。０．１〜５００ｍＭ含有することにより、プロテアーゼ含有液中のプロテアーゼ安定化効果が顕著になる。また本発明においては、Ｂｏｃアミノ酸と上記ジペプチドとを併用してもよい。
【００１２】
本発明においては、Ｂｏｃアミノ酸や上記ジペプチドの、プロテアーゼ含有液への溶解を容易にするため、ラウリル硫酸ナトリウム、ツイーン２０、ブリジ３５等の界面活性剤をプロテアーゼ含有液に配合してもよい。さらに、本発明においては、プロテアーゼ含有液中のプロテアーゼを安定化させるために、既知のプロテアーゼ安定化剤、例えばプロテイナーゼＫに対しはてカルシウムイオン等を配合してもよい。
【００１３】
本発明のプロテアーゼ含有液は、プロテアーゼ、Ｂｏｃアミノ酸、上記ジペプチド、必要に応じてその他の化合物を水に混合し、適宜撹拌することにより調製することができる。水の温度、上記成分の添加順序に特に制限はない。本発明のプロテアーゼ含有液の保存条件に特に制限はないが、５０℃以下、特に４０℃以下で保存することが好ましい。
【００１４】
本発明のプロテアーゼ含有液は、グリコシル化蛋白質測定のための予備処理に用いることができる。すなわち、糖と蛋白質が反応し、さらにアマドリ転移して生じたケトアミン体に対して、本発明のプロテアーゼ含有液を作用させ、蛋白質部分を加水分解する。次いで該加水分解物にケトアミンオキシダーゼ等を作用させ、生成した糖オソン又は過酸化水素を定量することにより、グリコシル化蛋白質を定量することができる。かかるグリコシル化蛋白質の測定は、用いるプロテアーゼの活性により、測定感度が大きく変化するが、本発明のプロテアーゼ含有液は、長期間活性が変化せず安定であり、上記測定方法の予備処理液として優れたものである。本発明のプロテアーゼ含有液は、特に糖化アルブミン、糖化ヘモグロビンの測定に有用である。
【００１５】
【実施例】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１６】
実施例１〜６及び比較例１〜３
プロテアーゼ含有液の調製
糖化タンパク測定用試薬「ＧｌｙＰｒｏ」（ジェンザイムダイアグノスティク社製）の試薬▲１▼（プロテイナーゼＫ、パーオキシダーゼ、グッド緩衝液を含む凍結乾燥試薬）に２５ｍＬの蒸留水を添加し、室温で１０分間適宜撹拌して溶解させた。これに、Ｂｏｃ−Ｌ−α−Ａｌａを、濃度が１０ｍＭとなるように溶解して、プロテアーゼ含有液を調製した（実施例１）。実施例２〜６及び比較例１、２は、実施例１において、Ｂｏｃ−Ｌ−α−Ａｌａの代わりに表１に示す化合物を用いた以外は実施例１と同様にしてプロテアーゼ含有液を調製した。比較例３は、実施例１において、Ｂｏｃ−Ｌ−α−Ａｌａを配合せずにプロテアーゼ含有液を調製した。各実施例及び比較例に配合した修飾アミノ酸等及びその濃度を表１に示す。
【００１７】
【表１】

【００１８】
試験例１
プロテアーゼ含有液の活性の測定
上記で得られた各プロテアーゼ含有液中の、プロテイナーゼＫ活性を測定した。次いで、該含有液を３７℃で１５日間保存した後、再度プロテイナーゼＫ活性を測定した。次いで、活性残存率（％）を、１００×（保存後のプロテイナーゼＫ活性）／（保存前のプロテイナーゼＫ活性）により算出した。また、比較例３の活性残存率に対する各実施例、比較例の活性残存率を、活性残存率対無添加比として算出した。結果を表１に示す。なお、プロテイナーゼＫの活性は、n-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide を基質とし、単位時間当たりに生成するp-nitroaniline量を、波長４０５ｎｍにおける吸光度変化量を測定することにより測定した。
【００１９】
比較例３のプロテアーゼ含有液は、３７℃で１５日間保存後の活性残存率が約３３％であり、プロテイナーゼＫが溶液中では不安定であることが確認された。比較例１及び２のプロテアーゼ含有液の活性残存率は、比較例３の場合よりさらに低かった。これに対し、実施例１〜６のプロテアーゼ含有液は、比較例３の場合より活性残存率が高く、プロテイナーゼＫが溶液中で安定化したことが確認された。
【００２０】
【発明の効果】
本発明のプロテアーゼ含有液は、凍結乾燥せずにそのまま保存しても、活性の低下が少なく、長期間安定で操作性、経済性にすぐれている。このため、該プロテアーゼ含有液は、プロテアーゼ活性により測定精度が大きく変化するグリコシル化蛋白質の測定に極めて有用である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a protease-containing liquid, and more particularly, to a protease-containing liquid that has a small decrease in protease activity in a solution for a long period of time and is excellent in operability and economy.
[0002]
[Prior art]
The glycosylated protein is a non-enzymatic condensation product of a reducing sugar such as glucose and a protein such as serum albumin, and the main glycosylation sites thereof are the ε-amino group of the lysine residue and the N-terminal amino acid. It is an α-amino group. Such glycosylated proteins are useful tools for monitoring glycemic control in diabetes. For example, fructosamine is a protein in which plasma protein mainly composed of albumin binds to glucose and is stabilized by Amadori transition, and reflects the glucose level in the past 1-3 weeks in blood. HbA1c is a substance in which glucose binds to the N-terminal valine of the hemoglobin β chain and is stabilized by Amadori transition, and reflects the glucose level in the blood for the past 3 to 4 weeks.
[0003]
As a means for measuring a glycosylated protein such as fructosamine, for example, a sample is treated with protease, the protease-treated sample is treated with ketoamine oxidase, and the reaction product is measured. A method for measuring a non-enzymatic glycosylated protein (JP-A-5-192193) is known. This is a method for measuring glycosylated protein by producing sugar osone and hydrogen peroxide from a protease-treated protein by the reaction of ketoamine oxidase and measuring either of them. This method has the excellent advantages of high measurement accuracy and being suitable for automation. However, in this method, since the protease has the property of degrading the protein and releasing the substrate of ketoamine oxidase, there is a problem that when the activity of the protease decreases, the measurement sensitivity decreases. . For this reason, until now, a reagent containing a protease was lyophilized to prevent a decrease in protease activity during storage, and the required amount was dissolved in water each time it was used.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, it has been problematic in terms of operability and quickness to dissolve the necessary amount each time it is used. Further, if the remaining solution is stored as it is, the protease activity decreases, so it must be discarded, which is economically disadvantageous.
[0005]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a protease-containing liquid that is stable in a solution for a long period of time and can be used as it is as a liquefying reagent, and has excellent operability and economy.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research to achieve the above object, the present inventors have selected from the group consisting of protease and Gly-Phe, Gly-Leu, His-Leu, and an amino acid modified with a t-butoxycarbonyl group. Protease-containing liquids containing one or more of the above are stable even if stored for a long period of time with little decrease in protease activity, and can be used as they are for measurement, and are excellent in operability, quickness, and economy. The present invention was completed.
[0007]
That is, the present invention relates to a protease-containing solution used for measuring a glycosylated protein, which is an amino acid obtained by modifying Gly-Phe, Gly-Leu, His-Leu, and α-amino group with a t-butoxycarbonyl group. The present invention provides a protease-containing liquid characterized by containing one or more selected from the group consisting of:
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The protease used in the present invention is not particularly limited as long as it is used for the measurement of glycosylated protein. For example, proteinase K, pronase E, ananain, thermolysin, subtilisin, bovine pancreatic protease and the like can be used, and one or more of these are used. be able to. Of these, proteinase K is preferred. Such a protease is preferably used in the protease-containing solution of the present invention in the range of 0.5 to 10,000 u / mL, particularly 10 to 2000 u / mL.
[0009]
In the present invention, there is no particular limitation on the absolute configuration of an amino acid (hereinafter referred to as “Boc amino acid”) obtained by modifying an α-amino group with a t-butoxycarbonyl (hereinafter referred to as “Boc”) group. Any of them may be used, but L type is particularly preferable.
[0010]
If the Boc amino acid has at least the α-amino group modified with a Boc group, the remaining amino group or carboxyl group is modified with a group other than the Boc group, such as a Boc group, or a benzoxycarbonyl group or a cyclohexyloxy group. May be. For example, in the case of lysine having an amino group at two positions of α-position and ε-position, both may be modified with a Boc group, the α-amino group is modified with a Boc group, and the ε-amino group is other than the Boc group. It may be modified with a group. As such Boc amino acids, for example, in the case of lysine having an amino group at two positions of the Boc-Ala position and the ε position, both may be modified with a Boc group, the α amino group is modified with a Boc group, and ε The amino group may be modified with a group other than the Boc group. Examples of such Boc amino acids include Boc-Ala, N (α) -Boc-Lys, N (α) -Boc-N (ε) -Boc-Lys, N (α) -Boc-N (ε) -benzoxy. Carbonyl-Lys, Boc-Asp, N (α) -Boc-Asp-β-cyclohexyl ester, Boc-Gly, Boc-Val and the like are preferable. Among these, Boc-L-α-Ala, which is Boc-L-α-amino acid, N (α) -Boc-N (ε) -benzoxycarbonyl-L-α-Lys, N (α) -Boc-L- α-Asp-β-cyclohexyl ester, Boc-L-α-Gly and Boc-L-α-Val are particularly preferred. The content of the Boc amino acid in the protease-containing solution of the present invention is preferably 0.1 to 500 mM, particularly preferably 1 to 100 mM. By containing 0.1 to 500 mM, the protease stabilizing effect in the protease-containing solution becomes remarkable. Here, N (α) or N (ε) means N at α-position or N at ε-position.
[0011]
In the present invention, Gly-Phe, Gly-Leu, and His-Leu can also be used, and among these, Gly-Phe is preferable. In the present invention, the dipeptide may be produced in the protease-containing solution by adding the peptide to the protease-containing solution and hydrolyzing the peptide with the protease. The content of the dipeptide in the protease-containing solution of the present invention is preferably 0.1 to 500 mM, particularly preferably 1 to 100 mM. By containing 0.1 to 500 mM, the protease stabilizing effect in the protease-containing solution becomes remarkable. In the present invention, a Boc amino acid and the above dipeptide may be used in combination.
[0012]
In the present invention, a surfactant such as sodium lauryl sulfate, Tween 20, Brigi 35 or the like may be added to the protease-containing liquid in order to facilitate dissolution of the Boc amino acid or the above dipeptide in the protease-containing liquid. Furthermore, in the present invention, in order to stabilize the protease in the protease-containing solution, calcium ions or the like may be added to a known protease stabilizer such as proteinase K.
[0013]
The protease-containing solution of the present invention can be prepared by mixing protease, Boc amino acid, the above-mentioned dipeptide, and other compounds as required, in water and stirring appropriately. There is no restriction | limiting in particular in the temperature of water, and the addition order of the said component. Although there is no restriction | limiting in particular in the storage conditions of the protease containing liquid of this invention, It is preferable to preserve | save at 50 degrees C or less, especially 40 degrees C or less.
[0014]
The protease-containing solution of the present invention can be used for pretreatment for measurement of glycosylated protein. That is, the protease-containing solution of the present invention is allowed to act on the ketoamine produced by the reaction between sugar and protein and further undergoing Amadori transfer to hydrolyze the protein portion. Next, the glycosylated protein can be quantified by allowing ketoamine oxidase or the like to act on the hydrolyzate and quantifying the generated sugar oxone or hydrogen peroxide. In the measurement of such glycosylated proteins, the measurement sensitivity varies greatly depending on the activity of the protease used. However, the protease-containing solution of the present invention is stable without changing its activity for a long period of time, and is excellent as a pretreatment solution for the measurement method. It is a thing. The protease-containing liquid of the present invention is particularly useful for measuring glycated albumin and glycated hemoglobin.
[0015]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
[0016]
Examples 1-6 and Comparative Examples 1-3
Preparation of protease-containing solution Add 25 mL of distilled water to reagent ▲ 1 (freeze-dried reagent containing proteinase K, peroxidase, and Good's buffer) of reagent “GlyPro” for glycated protein measurement (Genzyme Diagnostics). The mixture was dissolved with proper stirring for 10 minutes at room temperature. To this, Boc-L-α-Ala was dissolved to a concentration of 10 mM to prepare a protease-containing solution (Example 1). Examples 2 to 6 and Comparative Examples 1 and 2 were prepared in the same manner as in Example 1 except that the compounds shown in Table 1 were used instead of Boc-L-α-Ala in Example 1. did. In Comparative Example 3, a protease-containing solution was prepared in Example 1 without blending Boc-L-α-Ala. Table 1 shows the modified amino acids, etc. and their concentrations blended in each Example and Comparative Example.
[0017]
[Table 1]

[0018]
Test example 1
Measurement of activity of protease-containing solution The proteinase K activity in each protease-containing solution obtained above was measured. Next, the containing solution was stored at 37 ° C. for 15 days, and then proteinase K activity was measured again. Subsequently, the activity remaining rate (%) was calculated by 100 × (proteinase K activity after storage) / (proteinase K activity before storage). Moreover, the activity remaining rate of each Example and the comparative example with respect to the activity remaining rate of the comparative example 3 was computed as an activity remaining rate with respect to an additive-free ratio. The results are shown in Table 1. The activity of proteinase K is determined by measuring the amount of change in absorbance at a wavelength of 405 nm using n-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide as a substrate and the amount of p-nitroaniline produced per unit time. It was measured.
[0019]
In the protease-containing solution of Comparative Example 3, the residual activity rate after storage at 37 ° C. for 15 days was about 33%, and it was confirmed that proteinase K was unstable in the solution. The activity remaining rate of the protease-containing liquids of Comparative Examples 1 and 2 was even lower than that of Comparative Example 3. In contrast, the protease-containing solutions of Examples 1 to 6 had a higher activity remaining rate than that of Comparative Example 3, and it was confirmed that proteinase K was stabilized in the solution.
[0020]
【The invention's effect】
Even if the protease-containing liquid of the present invention is stored as it is without being lyophilized, the activity is little decreased, it is stable for a long period of time, and is excellent in operability and economy. Therefore, the protease-containing solution is extremely useful for measuring glycosylated proteins whose measurement accuracy varies greatly depending on protease activity.

Claims

A proteinase K-containing solution for measuring glycosylated protein comprising Gly-Phe, t-butoxycarbonyl-Ala, N (α) -t-butoxycarbonyl-N (ε) -benzoxycarbonyl-Lys, Proteinase K-containing, characterized in that it contains one or more selected from the group consisting of N (α) -t-butoxycarbonyl-Asp-β-cyclohexyl ester, t-butoxycarbonyl-Gly and t-butoxycarbonyl-Val liquid.

Glycosylated proteins, proteinase K-containing solution of claim 1 wherein a glycated albumin or glycated hemoglobin.