JP4426365B2 - Glycoprotein structure analysis method - Google Patents

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Description

本発明は、MSの２乗以上の分析が可能な質量分析装置を用いた糖タンパク質又は糖ペプチドの構造解析手法に関する。   The present invention relates to a structure analysis method for glycoproteins or glycopeptides using a mass spectrometer capable of analyzing MS squared or higher.

糖タンパク質又は糖ペプチドの構造解析を行うためには、（i）ペプチドシーケンス、（ii）糖鎖シーケンス、及び（iii）糖鎖結合部位の情報を得ることが必要となる。   In order to analyze the structure of glycoprotein or glycopeptide, it is necessary to obtain information on (i) peptide sequence, (ii) sugar chain sequence, and (iii) sugar chain binding site.

糖タンパク質又は糖ペプチドの解析法としては、糖タンパク質又は糖ペプチド（以下、単に糖タンパク質と表記する。）から糖鎖を酵素的或いは化学的に分離した後、タンパク質又はペプチド（以下、単にタンパク質と表記する。）と糖鎖とを別々に分析する方法がある。近年、これらの分析には、質量分析装置が利用されている。質量分析の際、ポストソース分解（PSD）や衝突誘起解離（CID）機能が用いられる。これらの機能は、糖鎖及びペプチドのフラグメントの重要な構造情報を与える。   As an analysis method of glycoprotein or glycopeptide, a sugar chain is enzymatically or chemically separated from glycoprotein or glycopeptide (hereinafter simply referred to as glycoprotein), and then protein or peptide (hereinafter simply referred to as protein and protein). There is a method for analyzing sugar chains separately). In recent years, mass spectrometers have been used for these analyses. In mass spectrometry, post source decomposition (PSD) and collision induced dissociation (CID) functions are used. These functions provide important structural information about sugar chains and peptide fragments.

タンパク質と糖鎖とを別々に分析する方法としては、例えば次の方法が挙げられる。まず、2次元電気泳動や各種クロマトグラフィーにより得られた糖タンパク質を、プロテアーゼによりペプチド或いは糖ペプチドに断片化する。さらに、グリカナーゼ消化やβ−脱離等により糖鎖とペプチドに分離する。その後ペプチドは、糖鎖結合部位となるアミノ酸残基に化学的にタグを付加した後、質量分析装置のMS分析によるペプチドマスフィンガープリント(PMF)、或いはCIDやPSD機能によるMS/MS分析により、ペプチドシーケンス解析及び糖鎖結合部位の特定が行われる。一方糖鎖は、質量分析装置によるMS及びMS/MS分析、HPLCによる多次元マッピング、グリコシダーゼによる遂次消化などにより、糖鎖シーケンス解析が行われる。   Examples of methods for separately analyzing proteins and sugar chains include the following methods. First, glycoproteins obtained by two-dimensional electrophoresis or various chromatographies are fragmented into peptides or glycopeptides by protease. Furthermore, it is separated into sugar chains and peptides by glycanase digestion or β-elimination. After that, the peptide is chemically added to the amino acid residue that becomes the sugar chain binding site, then the peptide mass fingerprint (PMF) by MS analysis of the mass spectrometer, or by MS / MS analysis by CID or PSD function, Peptide sequence analysis and sugar chain binding site identification are performed. On the other hand, sugar chains are subjected to sugar chain sequence analysis by MS and MS / MS analysis using a mass spectrometer, multidimensional mapping by HPLC, sequential digestion by glycosidase, and the like.

また、上述のように糖鎖を分離することなく糖タンパク質のまま構造解析することも試みられている。これには質量分析装置のMSn分析が利用される。糖タンパク質の質量分析装置による解析を可能にするものとして、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析装置(FTICR-MS)があり、特に近年開発された電子捕獲解離(ECD)と赤外多光子吸収解離(IRMPD)機能とが用いられる。ECD機能は、糖鎖を壊すことなくペプチド骨格のみ切断できるため、糖鎖結合部位及び糖鎖の分子量情報を与える。IRMPD機能は、ペプチド骨格を切断することなく糖鎖のみ切断できるため、糖鎖シーケンス情報を与える。そして、これら2つの機能を組み合わせることで、FTICR-MSで、ペプチドシーケンス解析、糖鎖シーケンス解析、及び糖鎖結合部位の解析が行われている。 In addition, as described above, attempts have been made to analyze the structure of glycoproteins without separating sugar chains. For this, MS n analysis of a mass spectrometer is used. The analysis of glycoproteins using a mass spectrometer is the Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer (FTICR-MS), especially recently developed electron capture dissociation (ECD) and infrared multiphoton absorption dissociation. (IRMPD) function is used. Since the ECD function can cleave only the peptide backbone without breaking the sugar chain, it gives information on the sugar chain binding site and the molecular weight of the sugar chain. Since the IRMPD function can cleave only sugar chains without cleaving the peptide backbone, it provides sugar chain sequence information. By combining these two functions, peptide sequence analysis, sugar chain sequence analysis, and sugar chain binding site analysis are performed by FTICR-MS.

糖鎖とタンパク質とを分離してそれぞれを別々に計測する方法では、分析全体に時間がかかるだけでなく、糖タンパク質の機能を考える際に、糖鎖修飾の意味、すなわち、どのタンパク質のどの位置にどのような糖鎖が結合してどう機能するか、を論じにくくなる。   In the method of measuring sugar chains and proteins separately and measuring each separately, not only does the entire analysis take time, but when considering the function of the glycoprotein, the meaning of the sugar chain modification, that is, which position of which protein It is difficult to discuss what kind of sugar chain binds and how it functions.

そして、このときよく使用される質量分析装置のポストソース分解(PSD)や衝突誘起解離(CID)機能では、糖鎖とタンパク質のペプチド鎖との両方がそれぞれに断片化するため、スペクトルが複雑で解析しにくいという問題がある。また、これらの機能ではペプチド鎖に比べ糖鎖の方が分解しやすいことから、ペプチド鎖に糖鎖のついた状態でフラグメントが得にくく、すなわち糖鎖結合部位情報を得ることが難しくなる。   In the post-source decomposition (PSD) and collision-induced dissociation (CID) functions of mass spectrometers often used at this time, both the sugar chain and the peptide chain of the protein are fragmented. There is a problem that it is difficult to analyze. In addition, in these functions, the sugar chain is more easily decomposed than the peptide chain, so that it is difficult to obtain a fragment with the sugar chain attached to the peptide chain, that is, it is difficult to obtain sugar chain binding site information.

一方、糖鎖とタンパク質とを分離せずに糖タンパク質として計測する方法では、上述のようにFTICR型質量分析装置が用いられるが、この装置は高価かつ大がかりであるだけでなく、保守・管理に手間がかかるという問題がある。また、FTICR型質量分析装置において使用されるECD機能によるペプチド鎖部分の断片化では、生成するフラグメントが少なすぎるためペプチドシーケンス情報を得ることが難しい。また、操作には多くのパラメータの最適化が必要になるため計測が容易ではない。さらに、ECD機能とIRMPD機能とを組み合わせて一台のFTICR型質量分析装置を用いて糖タンパク質の構造解析を行う際には、例えば、IRMPD 機能のための装置を取り付けるときにはECD用のフィラメントをはずす必要があり、IRMPD分析の設定でECD分析を行うことはできない。すなわち、これらIRMPD及びECDの両機能を使用した糖タンパク質分析は手間と時間を要する。   On the other hand, in the method for measuring glycoproteins without separating sugar chains and proteins, the FTICR type mass spectrometer is used as described above, but this device is not only expensive and large-scale but also maintenance and management. There is a problem that it takes time and effort. In addition, in the fragmentation of the peptide chain portion by the ECD function used in the FTICR type mass spectrometer, it is difficult to obtain peptide sequence information because too few fragments are generated. In addition, it is not easy to measure because many parameters need to be optimized for operation. In addition, when performing structural analysis of glycoproteins using a single FTICR mass spectrometer combining the ECD function and the IRMPD function, for example, when installing a device for the IRMPD function, remove the ECD filament. It is necessary and ECD analysis cannot be performed in the setting of IRMPD analysis. That is, glycoprotein analysis using both the functions of IRMPD and ECD requires labor and time.

そこで本発明の目的は、質量分析装置を用いて、ペプチドシーケンス解析、糖鎖シーケンス解析、及び糖鎖結合部位の解析を正確に且つ迅速に行うことができる、簡便な糖タンパク質の構造解析方法を提供することにある。   Therefore, an object of the present invention is to provide a simple glycoprotein structure analysis method that can perform peptide sequence analysis, sugar chain sequence analysis, and sugar chain binding site analysis accurately and quickly using a mass spectrometer. It is to provide.

本発明者らは、MSの2乗以上の分析が可能な質量分析装置を用いること、及び、質量分析装置によるMS分析で得られたスペクトルから、プロトン付加分子量関連イオンピークと金属付加分子量関連イオンピークとをプリカーサイオンとして選択し、それぞれのプリカーサイオンについてMSn分析を行うことによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors use a mass spectrometer capable of analyzing MS 2 or more, and from a spectrum obtained by MS analysis using a mass spectrometer, a proton-added molecular weight-related ion peak and a metal-added molecular weight-related ion. By selecting a peak as a precursor ion and performing MS n analysis on each precursor ion, it was found that the object of the present invention was achieved, and the present invention was completed.

本発明は、以下の発明を含む。
（１）MSの2乗以上の分析が可能な単一のイオン源からなる一台の質量分析装置のみを用いて、一種類の試料として調製された糖タンパク質又は糖ペプチドのMS分析を行い、
MS分析で観測された特定の糖タンパク質分子又は糖ペプチド分子Mに、タンパク質又はペプチドに付加しやすいプラスチャージイオンA+が付加した、[M+A]+で表されるA付加分子量関連イオンピーク、及び、前記特定の糖タンパク質分子又は糖ペプチド分子Mに、糖鎖に付加しやすいプラスチャージイオンB+が付加した、[M+B]+で表されるB付加分子量関連イオンピークをそれぞれプリカーサイオンとして選んでMSn分析を行い、
前記[M+A]+で表されるA付加分子量関連イオンピークをプリカーサイオンとして得られたMSn解析データのA付加分子量関連イオンピークから、タンパク質又はペプチドの一次構造と糖鎖結合部位とを特定し、
前記[M+B]+で表されるB付加分子量関連イオンピークをプリカーサイオンとして得られたMSn解析データのB付加分子量関連イオンピークから、糖鎖の一次構造を特定する、糖タンパク質又は糖ペプチドの構造解析手法。 The present invention includes the following inventions.
(1) MS analysis of glycoproteins or glycopeptides prepared as one type of sample using only one mass spectrometer consisting of a single ion source capable of analyzing MS squared or higher,
An A-added molecular weight-related ion peak represented by [M + A] + , added to a specific glycoprotein molecule or glycopeptide molecule M observed by MS analysis, with a positively charged ion A + that can be easily added to a protein or peptide And a B-added molecular weight-related ion peak represented by [M + B] + , wherein a positive charge ion B + that is easily added to a sugar chain is added to the specific glycoprotein molecule or glycopeptide molecule M, respectively. MS n analysis selected as ions,
From the A-added molecular weight-related ion peak of the MS n analysis data obtained using the A-added molecular weight-related ion peak represented by [M + A] + as a precursor ion, the primary structure of the protein or peptide and the sugar chain binding site are obtained. Identify,
A glycoprotein or sugar that identifies the primary structure of a sugar chain from the B-added molecular weight-related ion peak of MS n analysis data obtained using the B-added molecular weight-related ion peak represented by [M + B] + as a precursor ion Peptide structure analysis technique.

（２）前記タンパク質又はペプチドに付加しやすいプラスチャージイオンA+がプロトンである、（１）に記載の糖タンパク質又は糖ペプチドの構造解析手法。
（３）前記糖鎖に付加しやすいプラスチャージイオンB+が金属イオンである、（１）又は（２）に記載の糖タンパク質又は糖ペプチドの構造解析手法。
（４）前記金属イオンがナトリウムイオンである、（３）に記載の糖タンパク質又は糖ペプチドの構造解析手法。 (2) The method for analyzing a structure of a glycoprotein or glycopeptide according to (1), wherein the positively charged ion A + that is easily added to the protein or peptide is a proton.
(3) The method for analyzing a structure of a glycoprotein or glycopeptide according to (1) or (2), wherein the positively charged ion B + that is easily added to a sugar chain is a metal ion.
(4) The glycoprotein or glycopeptide structural analysis method according to (3), wherein the metal ion is a sodium ion.

（５）前記質量分析装置が、MALDI-QIT-TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型）質量分析装置である、（１）〜（４）のいずれかに記載の糖タンパク質又は糖ペプチドの構造解析手法。 ( 5 ) The mass spectrometer according to any one of (1) to ( 4 ), wherein the mass spectrometer is a MALDI-QIT-TOF (matrix-assisted laser desorption / ionization quadrupole ion trap type time-of-flight type) mass spectrometer. Structural analysis method of glycoprotein or glycopeptide.

本発明によると、質量分析装置を用いて、ペプチドシーケンス解析、糖鎖シーケンス解析、及び糖鎖結合部位の解析を正確に且つ迅速に行うことができる、簡便な糖タンパク質の構造解析方法を提供することができる。   According to the present invention, there is provided a simple glycoprotein structural analysis method capable of accurately and quickly performing peptide sequence analysis, sugar chain sequence analysis, and sugar chain binding site analysis using a mass spectrometer. be able to.

本発明においては、質量分析装置による分析（MS分析）において、MSの2乗以上の分析が可能な質量分析装置を使用して、糖タンパク質又は糖ペプチド試料のMS及びMSn分析を行う。本明細書においては、質量分析装置によって行われる分析において、試料の1回目の分析をMS分析とし、MS分析において得られたスペクトルのイオンピークから特定のイオンを選択し、選択された特定のイオンをプリカーサイオンとして２回目の分析を行うこと（MS/MS分析）をMS2分析と表記する。同様に、MSn-1分析において得られたスペクトルのイオンピークから特定のイオンを選択し、選択された特定のイオンをプリカーサイオンとしてn回目の分析を行うことをMSn分析と表記し、MSのn乗分析と呼称する。 In the present invention, in the analysis by the mass spectrometer (MS analysis), the MS and MS n analysis of the glycoprotein or glycopeptide sample is performed using a mass spectrometer capable of analyzing MS 2 or more. In this specification, in the analysis performed by the mass spectrometer, the first analysis of the sample is MS analysis, a specific ion is selected from the ion peak of the spectrum obtained in the MS analysis, and the selected specific ion is selected. The second analysis (MS / MS analysis) using as a precursor ion is referred to as MS 2 analysis. Similarly, selecting a specific ion from the ion peak of the spectrum obtained in MS n-1 analysis and performing the nth analysis using the selected specific ion as a precursor ion is denoted as MS n analysis, and MS Called n-th power analysis.

糖タンパク質又は糖ペプチドは、必要に応じて、化学的断片化又は酵素消化を行うことができる。ただしこのとき、試料中の糖鎖とペプチド鎖とを切断することのないように手段を選ぶ必要がある。化学的断片化又は酵素消化によって、試料の糖タンパク質又は糖ペプチドは、複数のより小さなペプチド分子と糖ペプチド分子（すなわち糖鎖が付加したペプチド分子）とに断片化することができる。これらの分子は、混合物試料としてMS分析を行うことができる。以下、このような混合物試料を解析する場合の本発明の方法について説明する。   The glycoprotein or glycopeptide can be subjected to chemical fragmentation or enzymatic digestion as necessary. However, at this time, it is necessary to select means so as not to cleave the sugar chain and the peptide chain in the sample. By chemical fragmentation or enzymatic digestion, a sample glycoprotein or glycopeptide can be fragmented into a plurality of smaller peptide molecules and glycopeptide molecules (ie, peptide molecules with added sugar chains). These molecules can be subjected to MS analysis as a mixture sample. Hereinafter, the method of the present invention in the case of analyzing such a mixture sample will be described.

上述の混合物試料のMS分析により、ペプチド及び糖ペプチドのピークが複数検出される。このうち、ペプチドについては、従来の方法でペプチドシーケンスすることによって同定を行うことができる。一方、糖ペプチドの同定を行うための方法は、以下のようにして行う。   A plurality of peptide and glycopeptide peaks are detected by MS analysis of the above-mentioned mixture sample. Among these, a peptide can be identified by peptide sequencing by a conventional method. On the other hand, the method for identifying glycopeptides is performed as follows.

MS分析で得られたスペクトルのうち、特定の一つの糖ペプチド分子Mに、ペプチドに付加しやすいプラスチャージイオンA+が付加した、[M+A]+で表されるA付加分子量関連イオンピーク、及び、前記特定の一つの糖ペプチド分子Mに、糖鎖に付加しやすいプラスチャージイオンB+が付加した、[M+B]+で表されるB付加分子量関連イオンピークを、別個にプリカーサイオンとして選択して、それぞれをMS2分析する。 Among the spectra obtained by MS analysis, an A-added molecular weight-related ion peak represented by [M + A] + is added to a specific glycopeptide molecule M with a positively charged ion A + that is easily added to the peptide. And a B-added molecular weight-related ion peak represented by [M + B] + , wherein a positive charge ion B + that is easy to add to a sugar chain is added to the specific one glycopeptide molecule M, separately as a precursor. Each is selected as an ion and MS 2 analyzed.

MALDI法のポジティブモード計測におけるイオン化の際、ペプチドに付加しやすいプラスチャージイオンA+としては、プロトンが挙げられる。すなわち、ペプチドはプロトンが付いた形で検出されやすい。一方、糖鎖に付加しやすいプラスチャージイオンB+としては、金属イオンが挙げられる。さらに金属イオンとしては、ナトリウムイオンが挙げられる。すなわち、糖鎖はナトリウムイオンなどの金属イオンが付いた形で検出されやすい。 A proton is mentioned as positively charged ion A + which is easy to add to a peptide in the case of ionization in the positive mode measurement of the MALDI method. That is, the peptide is easily detected in the form of a proton. On the other hand, examples of the positively charged ion B + that is easily added to a sugar chain include metal ions. Furthermore, sodium ion is mentioned as a metal ion. That is, sugar chains are easily detected in the form of metal ions such as sodium ions.

本明細書において、ペプチドがプロトンを付加しやすいとは、ペプチドが他のプラスチャージイオンに比べてプロトンを引き付けやすいということを意味する。この場合、特定の一つの糖ペプチド分子Mにプロトンが付加した、[M+H]+で表されるプロトン付加分子量関連イオンピークがプリカーサイオンとして選択される。 In the present specification, the phrase “a peptide is likely to add a proton” means that the peptide is more likely to attract a proton than other positively charged ions. In this case, a proton-added molecular weight related ion peak represented by [M + H] + in which a proton is added to one specific glycopeptide molecule M is selected as a precursor ion.

同様に、糖鎖が金属イオンを付加しやすいということは、糖鎖が他のプラスチャージイオンに比べて金属イオンを引き付けやすいということを意味する。この場合、特定の一つの糖ペプチド分子Mに金属イオンが付加した、金属付加分子量関連イオンピークがプリカーサイオンとして選択される。さらに金属イオンがナトリウムイオンである場合、特定の一つの糖ペプチド分子MにナトリウムイオンNa+が付加した、[M+Na]+で表されるナトリウム付加分子量関連イオンピークがプリカーサイオンとして選択される。 Similarly, the fact that sugar chains are easy to add metal ions means that sugar chains are easier to attract metal ions than other positively charged ions. In this case, a metal addition molecular weight related ion peak obtained by adding a metal ion to one specific glycopeptide molecule M is selected as a precursor ion. Furthermore, when the metal ion is a sodium ion, a sodium-added molecular weight-related ion peak represented by [M + Na] + in which sodium ion Na + is added to one specific glycopeptide molecule M is selected as a precursor ion. .

[M+A]+をプリカーサイオンとしたときのMS2分析においては、主にペプチド鎖のアミノ酸が順番に一つずつとれた状態で複数のフラグメントが得られる。このことから、ペプチドのシーケンス情報及び糖鎖結合部位の特定ができる。
一方、[M+B]+をプリカーサイオンとしたときのMS2分析においては、糖鎖のみからなる複数のフラグメントが主に得られる。このことから、糖鎖シーケンス情報が得られる。 In MS 2 analysis using [M + A] + as a precursor ion, a plurality of fragments are obtained mainly in a state where amino acids of a peptide chain are taken one by one in order. From this, the peptide sequence information and the sugar chain binding site can be identified.
On the other hand, in MS 2 analysis using [M + B] + as a precursor ion, a plurality of fragments consisting only of sugar chains are mainly obtained. From this, sugar chain sequence information can be obtained.

いずれのMS2分析の場合も、得られたフラグメントからさらにプリカーサイオンを選択してMSn分析を行うことで、さらに詳細なペプチド及び糖鎖のシーケンス情報が得られる。各MSn分析で得られるフラグメントは、それぞれ特定の一つのプリカーサイオンに帰属できるので、目的とする分子量関連イオンピークについての正確な構造解析が可能となる。 In any MS 2 analysis, more detailed peptide and sugar chain sequence information can be obtained by further selecting a precursor ion from the obtained fragments and performing MS n analysis. Since each fragment obtained in each MS n analysis can be attributed to one specific precursor ion, an accurate structural analysis of the target molecular weight-related ion peak can be performed.

以下、糖タンパク質リボヌクレアーゼB（RNaseB）を試料として解析する場合の本発明の方法について、さらに詳細に説明する。RNaseBは、アスパラギンに結合し且つ2つのN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基と5〜9のマンノース残基とからなる1つのオリゴ糖鎖を有していると考えられている。   Hereinafter, the method of the present invention when analyzing glycoprotein ribonuclease B (RNase B) as a sample will be described in more detail. RNase B is considered to have one oligosaccharide chain that binds to asparagine and consists of two N-acetylglucosamine (GlcNAc) residues and 5-9 mannose residues.

RNase B 162μgは、8M尿素溶液950μL中のジチオトレイトール10mgによって還元された後、3.24μgのリジルエンドペプチダーゼ（タンパク質：基質＝50：1（重量比））により消化された。得られた消化物は、脱塩その他の精製処理を一切行うことなく、ポジティブイオンモードでマトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型質量分析計(MALDI-QIT-TOF-MS)で分析した。   162 μg of RNase B was reduced by 10 mg of dithiothreitol in 950 μL of 8M urea solution and then digested with 3.24 μg of lysyl endopeptidase (protein: substrate = 50: 1 (weight ratio)). The resulting digest is subjected to matrix-assisted laser desorption / ionization quadrupole ion trap time-of-flight mass spectrometry (MALDI-QIT-TOF-MS) in positive ion mode without any desalting or other purification processes Analyzed with

なお、マトリックスとしては、2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)を、アセトニトリルと超純水との40:60（体積比）混合溶液に12.5mg/mlの濃度で溶解した溶液を用いた。また、20pmol/μlに調製した酵素消化物溶液の0.2μlのアリコートを、0.5μlのマトリックス溶液に混合して計測した。   As the matrix, a solution in which 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) was dissolved in a 40:60 (volume ratio) mixed solution of acetonitrile and ultrapure water at a concentration of 12.5 mg / ml was used. In addition, a 0.2 μl aliquot of the enzyme digest solution prepared to 20 pmol / μl was mixed with 0.5 μl of the matrix solution and measured.

RNaseBの酵素消化物のMS分析においては、複数のペプチドがプロトン付加イオンとして約77％のカバレッジで得られた。これらのMS2分析は多数のy-シリーズ及びb-シリーズのフラグメント（m/z 2225.5, 2230.5, 2799.1,及び2877.1）としてペプチド構造情報を与えた。 In MS analysis of RNase B enzyme digests, multiple peptides were obtained as protonated ions with approximately 77% coverage. These MS 2 analyzes gave peptide structural information as a number of y-series and b-series fragments (m / z 2225.5, 2230.5, 2799.1, and 2877.1).

さらにRNaseBの酵素消化物のMS分析においては、複数の糖ペプチドがプロトン付加イオンとして5種類のピーク（m/z 1935.9, 2098.0, 2260.2, 2422.3,及び2584.5）を与えた。これは、RNaseBのオリゴ糖鎖が2つのGlcNAc残基と5〜9のヘキソース残基とからなることを示している。これら5種類の糖ペプチドピークのうち、最も強度の高かったm/z 1935.9におけるプロトン付加イオンピークと、同糖ペプチドピークに対応するナトリウム付加イオンピーク（m/z 1957.9）とをプレカーサイオンとして選択し、それぞれのプレカーサイオンに対してMSn分析を行った。 Further, in the MS analysis of the enzyme digest of RNase B, a plurality of glycopeptides gave five types of peaks (m / z 1935.9, 2098.0, 2260.2, 2422.3, and 2584.5) as protonated ions. This indicates that the RNase B oligosaccharide chain consists of two GlcNAc residues and 5-9 hexose residues. Among these five types of glycopeptide peaks, the proton addition ion peak at m / z 1935.9, which had the highest intensity, and the sodium addition ion peak (m / z 1957.9) corresponding to the same glycopeptide peak were selected as precursor ions. MS n analysis was performed on each precursor ion.

プロトン付加イオンピーク（m/z 1935.9）のMS2分析においては、ペプチドにGlcNAcが1つ付いたイオンピーク（m/z 801.7,及び921.7）を優位に与えた。このうち、m/z 801.7のピークに相当するプロダクトイオンは、m/z 921.7のピークに相当するプロダクトイオンのGluNAc環が開裂することによって生成したものである。さらにm/z 921.7をプレカーサイオンとしてMS3分析を行った。このとき得られたスペクトルを図１(a)に示す。図１(a)中、横軸は質量/電荷（Mass/Charge）を、縦軸はイオンの相対強度を表す。GlcNAc付加ペプチド骨格の開裂ピークを順に与え、ペプチドシーケンスと同時に糖鎖結合部位の情報を与えた。なお、図１(b)は、RNaseBのペプチド部分のアミノ酸配列（配列表の配列番号１）を示し、図１(c)は、(a)におけるプリカーサイオンに相当する糖ペプチド（ペプチド部分のアミノ酸配列：配列表の配列番号２）の構造、及びその主なフラグメンテーションを示す。 In the MS 2 analysis of the proton-added ion peak (m / z 1935.9), the ion peak (m / z 801.7 and 921.7) with one GlcNAc attached to the peptide was dominant. Among these, the product ion corresponding to the peak at m / z 801.7 is generated by cleavage of the GluNAc ring of the product ion corresponding to the peak at m / z 921.7. Further, MS 3 analysis was performed using m / z 921.7 as a precursor ion. The spectrum obtained at this time is shown in FIG. In FIG. 1 (a), the horizontal axis represents mass / charge (Mass / Charge), and the vertical axis represents the relative intensity of ions. The cleavage peaks of the GlcNAc-added peptide backbone were given in order, and information on the sugar chain binding site was given simultaneously with the peptide sequence. 1 (b) shows the amino acid sequence of the peptide part of RNaseB (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing), and FIG. 1 (c) shows the glycopeptide corresponding to the precursor ion in (a) (the amino acid of the peptide part). Sequence: The structure of SEQ ID NO: 2) in the sequence listing and its main fragmentation are shown.

一方、ナトリウム付加イオンピーク（m/z 1957.9）のMS2分析においては、主に糖鎖のみからなるナトリウム付加イオンのピークを複数与えた。さらに、これらのMS3及びMS4分析を行った。このとき得られたスペクトルを図２に示す。図２中、横軸は質量/電荷（Mass/Charge）を、縦軸はイオンの相対強度（% Int.）を表す。このように得られたナトリウム付加イオンとしての糖鎖フラグメントは、RNaseBに対する糖鎖部分のシーケンス情報を与えた。 On the other hand, in the MS 2 analysis of the sodium adduct ion peak (m / z 1957.9), a plurality of sodium adduct ion peaks mainly composed of sugar chains were given. In addition, these MS 3 and MS 4 analyzes were performed. The spectrum obtained at this time is shown in FIG. In FIG. 2, the horizontal axis represents mass / charge (Mass / Charge), and the vertical axis represents the relative intensity of ions (% Int.). The thus obtained sugar chain fragment as a sodium addition ion gave sequence information of the sugar chain part to RNaseB.

このように、MS分析に加えプロトン付加イオン及びナトリウム付加イオンのMSn分析を行うことで、単一のイオン源を用いた一台のMS装置で、糖タンパク質の糖鎖及びペプチドシーケンス、糖鎖結合部位を確認することができた。 In this way, by performing MS n analysis of proton-added ions and sodium-added ions in addition to MS analysis, glycoprotein sugar chains and peptide sequences, sugar chains can be obtained with a single MS device using a single ion source. The binding site could be confirmed.

以上のことから、本発明による糖タンパク質の解析方法は、以下の効果を奏する。
１． MSn分析において、ある特定の分子に対して選択される複数のプリカーサイオンは、いずれも同一分子由来のものである。このため、いずれのプリカーサイオンから得られる構造情報もその分子に直接帰属することができる。従って、正確な解析が可能である。
２． MSn分析では、糖鎖のついた状態で特定の糖タンパク質及び糖ペプチドの分析ができる。このため、得られたデータからは、どのタンパク質のどの部分にどのような糖鎖が結合しているか、糖鎖修飾を含めた形で特定の糖タンパク質の機能を論じることができる。
３． 単一のイオン源を用いた一台の質量分析装置のみを用い、一種類の試料として調製された糖ペプチドあるいは糖タンパク質から、構造解析を行うことが可能であるため、迅速な分析ができる。またその際、各MSn分析で基本的な設定は変わらないため、操作も容易である。 From the above, the method for analyzing glycoprotein according to the present invention has the following effects.
1. In MS n analysis, a plurality of precursor ions selected for a specific molecule are all derived from the same molecule. For this reason, structural information obtained from any precursor ion can be directly attributed to the molecule. Therefore, an accurate analysis is possible.
2. In MS n analysis, specific glycoproteins and glycopeptides can be analyzed with a sugar chain attached. For this reason, from the obtained data, it is possible to discuss what kind of sugar chain is bound to which part of which protein and the function of a specific glycoprotein in a form including sugar chain modification.
3. Since only one mass spectrometer using a single ion source can be used and structural analysis can be performed from a glycopeptide or glycoprotein prepared as one type of sample, rapid analysis can be performed. At that time, the basic settings do not change for each MS n analysis, so the operation is easy.

プロトン付加分子量関連イオンピークをプリカーサイオンとして使用したときの、RNaseBの糖ペプチドのMS3スペクトル(a)、RNaseBのペプチド部分のアミノ酸配列(b)、及び、(a)におけるプリカーサイオンに相当する糖ペプチドの構造、及びその主なフラグメンテーション(c)である。MS 3 spectrum of glycopeptide of RNaseB (a), amino acid sequence of peptide portion of RNaseB (b), and sugar corresponding to precursor ion in (a) when proton-added molecular weight related ion peak is used as a precursor ion Peptide structure and its main fragmentation (c). ナトリウム付加分子量関連イオンピークをプリカーサイオンとして使用したときの、RNaseBの糖ペプチドのMS3及びMS4スペクトルである。When using the sodium adduct molecular weight related ion peak as a precursor ion, MS 3 and MS 4 spectra of glycopeptides RNase B.

Claims (5)

MSの2乗以上の分析が可能な単一のイオン源からなる一台の質量分析装置のみを用いて、一種類の試料として調製された糖タンパク質又は糖ペプチドのMS分析を行い、
MS分析で観測された特定の糖タンパク質分子又は糖ペプチド分子Mに、タンパク質又はペプチドに付加しやすいプラスチャージイオンA+が付加した、[M+A]+で表されるA付加分子量関連イオンピーク、及び、前記特定の糖タンパク質分子又は糖ペプチド分子Mに、糖鎖に付加しやすいプラスチャージイオンB+が付加した、[M+B]+で表されるB付加分子量関連イオンピークをそれぞれプリカーサイオンとして選んでMSn分析を行い、
前記[M+A]+で表されるA付加分子量関連イオンピークをプリカーサイオンとして得られたMSn解析データのA付加分子量関連イオンピークから、タンパク質又はペプチドの一次構造と糖鎖結合部位とを特定し、
前記[M+B]+で表されるB付加分子量関連イオンピークをプリカーサイオンとして得られたMSn解析データのB付加分子量関連イオンピークから、糖鎖の一次構造を特定する、糖タンパク質又は糖ペプチドの構造解析手法。 Using only one mass spectrometer consisting of a single ion source capable of MS squared analysis or higher, perform MS analysis of glycoproteins or glycopeptides prepared as one type of sample ,
An A-added molecular weight-related ion peak represented by [M + A] + , added to a specific glycoprotein molecule or glycopeptide molecule M observed by MS analysis, with a positively charged ion A + that can be easily added to a protein or peptide And a B-added molecular weight-related ion peak represented by [M + B] + , wherein a positive charge ion B + that is easily added to a sugar chain is added to the specific glycoprotein molecule or glycopeptide molecule M, respectively. MS n analysis selected as ions,
From the A-added molecular weight-related ion peak of the MS n analysis data obtained using the A-added molecular weight-related ion peak represented by [M + A] + as a precursor ion, the primary structure of the protein or peptide and the sugar chain binding site are obtained. Identify,
A glycoprotein or sugar that identifies the primary structure of a sugar chain from the B-added molecular weight-related ion peak of MS n analysis data obtained using the B-added molecular weight-related ion peak represented by [M + B] + as a precursor ion Peptide structure analysis technique. 前記タンパク質又はペプチドに付加しやすいプラスチャージイオンA+がプロトンである、請求項１に記載の糖タンパク質又は糖ペプチドの構造解析手法。 The method for analyzing a structure of a glycoprotein or glycopeptide according to claim 1, wherein the positively charged ion A + that is easily added to the protein or peptide is a proton. 前記糖鎖に付加しやすいプラスチャージイオンB+が金属イオンである、請求項１又は２に記載の糖タンパク質又は糖ペプチドの構造解析手法。 The method for analyzing a structure of a glycoprotein or glycopeptide according to claim 1 or 2, wherein the positively charged ion B + that is easily added to the sugar chain is a metal ion. 前記金属イオンがナトリウムイオンである、請求項３に記載の糖タンパク質又は糖ペプチドの構造解析手法。 The glycoprotein or glycopeptide structure analysis method according to claim 3, wherein the metal ion is a sodium ion. 前記質量分析装置が、MALDI-QIT-TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化四重極イオントラップ型飛行時間型）質量分析装置である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の糖タンパク質又は糖ペプチドの構造解析手法。 The glycoprotein according to any one of claims 1 to 4 , wherein the mass spectrometer is a MALDI-QIT-TOF (matrix-assisted laser desorption / ionization quadrupole ion trap type time-of-flight type) mass spectrometer. Structural analysis method of glycopeptide.
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