JP4418016B2 - Detection and identification system for mites and molds that cause house dust allergies - Google Patents
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Description
本発明は、ハウスダストアレルギーの原因となるダニ・カビ類の検出・識別システムに関し、特に、ダニ類及びカビ類を同時に検出・識別できるマイクロアレイを用いた検出・識別システムに関する。 The present invention relates to a detection / identification system for mites and molds that cause house dust allergy, and more particularly to a detection / identification system using a microarray that can simultaneously detect and identify mites and molds.
ハウスダストアレルギーは通年性アレルギーであり、主にダニ・カビ類がアレルゲンとなる。ハウスダストアレルギーを持つ患者は年々増加しており、ダニ・カビの評価と有効な対策のニーズが高まっている。通常、ダニ・カビの検出・同定は、専門家による顕微鏡鑑定で行われるため、非常に多くの時間と労力が必要とる。近年、ダニ類が持つアレルゲンとされるタンパク質に対する特異的な抗体を用いて免疫学的にアレルゲンを検出する技法が試みられているが、本手法ではダニ類の種の識別が困難であるといった問題がある。その上、本手法では、カビ類を検出することができず、アレルゲンを包括的に評価することができないといった問題もある。 House dust allergies are perennial allergies, mainly mites and molds. The number of patients with house dust allergy is increasing year by year, and there is a growing need for evaluation of mites and molds and effective countermeasures. Normally, detection and identification of ticks and molds are performed by microscopic examination by experts, and thus a great deal of time and effort are required. In recent years, techniques have been attempted to detect allergens immunologically using specific antibodies against the allergen proteins of mites, but this technique has the problem that it is difficult to identify mite species. There is. In addition, this method has a problem that molds cannot be detected and allergens cannot be comprehensively evaluated.
また、現在、アレルゲンとなるダニ・カビを検査するためには、一度カビ類を培養し、顕微鏡観察により同定を行う必要があるため、一定の期間と、分類に関する高度な知識が必要となる。このため、多くの検査サービスではカビ類については属レベルの調査に留まっている。これらのサービスは時間と手間と専門知識を要するため、コストが高価になり、容易に検査を依頼できるものではない。 At present, in order to inspect mites and molds that become allergens, it is necessary to cultivate molds once and identify them by microscopic observation, so a certain period of time and advanced knowledge about classification are required. For this reason, many inspection services are limited to genus-level investigation of molds. Since these services require time, labor, and expertise, they are expensive and cannot be easily requested for inspection.
現状でも簡便・短時間でアレルゲンを識別するシステムは存在するが、対象がダニ１〜2種のみであり、カビについては検出ができない（例えば、商品名『マイティーチェッカー』シントーファイン社製）。現状におけるハウスダスト中のダニ・カビの検査はユーザーが手軽に利用でき、満足の行く結果を受け取ることができると言える状態ではない。 Even now, there are systems that can identify allergens simply and in a short time, but only target one or two ticks, and mold cannot be detected (for example, trade name “Mighty Checker” manufactured by Shinto Fine). At present, the inspection of ticks and molds in house dust is not in a state where users can easily use it and receive satisfactory results.
そこで、本発明は上述したような実状に鑑み、専門的な知識を必要とせず、簡便な操作で、短時間で正確にアレルゲンを一括して同定可能なシステムを提供することを目的とする。 Therefore, in view of the actual situation as described above, an object of the present invention is to provide a system capable of accurately identifying allergens in a short time with a simple operation without requiring specialized knowledge.
上述した目的を達成した本発明は、以下を包含する。
（１） 検査対象から採取したダニ類及びカビ類由来のゲノムDNA又はmRNAを鋳型とし、ダニ遺伝子特異的プライマーセット及びカビ遺伝子特異的プライマーセットを用いて増幅された検出対象DNA領域に対してハイブリダイズ可能である、ダニ類及びカビ類の検出及び識別用核酸プローブ。
The present invention that has achieved the above-described object includes the following.
(1) Using mite and mold-derived genomic DNA or mRNA collected from the test target as a template, hybridize to the detection target DNA region amplified using the tick gene-specific primer set and the mold gene-specific primer set. A nucleic acid probe for detection and identification of mites and molds, which is soybean-capable.
（２） 上記ダニ類としてDermatophagoides farinae（コナヒョウヒダニ）、Dermatophagoides pteronyssinus（ヤケヒョウヒダニ）又はTyrophagus pterescentiae（ケナガコナダニ）であり、上記カビ類としてAlternaria alternata、Aspergills restrictus、Aspergills versicolor、Candida albicans、Cladosporium sphaerosporum又はEurotium herboriorum由来の検出対象DNA領域に対してハイブリダイズ可能であることを特徴とする（１）記載のダニ類及びカビ類の検出及び識別用核酸プローブ。 (2) The above mites are Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus or Tyrophagus pterescentiae, and the above molds are Alternaria alternata, Aspergillsrumsporum, Aspergills restricts, Aspergills The nucleic acid probe for detection and identification of ticks and molds according to (1), which is hybridizable to a DNA region to be detected.
（３） 上記ダニ遺伝子特異的プライマーセットは以下の（a）、（b）又は（c）であることを特徴とする（１）記載のダニ類及びカビ類の検出及び識別用核酸プローブ。
（a）配列番号５６に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるプライマーとのセット
（b）配列番号５６に示す塩基配列において１〜５個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマーと配列番号５７塩基配列において１〜５個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるからなるプライマーとからなり、上記（a）のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
（c）配列番号５６に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーと配列番号５７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーとからなり、上記（a）のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
(3) The nucleic acid probe for detection and identification of ticks and molds according to (1), wherein the tick gene-specific primer set is the following (a), (b) or (c):
(A) A set of a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 56 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 57 (b) Substituting, deleting or deleting 1 to 5 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 56 A region consisting of a primer consisting of an added base sequence and a primer consisting of a base sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 5 bases in SEQ ID NO: 57 base sequence, and the same region as the primer set of (a) above (C) a primer consisting of a nucleic acid fragment capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 56, and SEQ ID NO: 57 Nucleic acid capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a base sequence complementary to the indicated base sequence A set of primers consisting of fragments and capable of amplifying the same region as the primer set (a) above
（４） 上記カビ遺伝子特異的プライマーセットは以下の（a）、（b）又は（c）であることを特徴とする（１）記載のダニ類及びカビ類の検出及び識別用核酸プローブ。
（a）配列番号５８に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるプライマーとのセット
（b）配列番号５８に示す塩基配列において１〜５個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマーと配列番号５９塩基配列において１〜５個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるからなるプライマーとからなり、上記（a）のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
（c）配列番号５８に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーと配列番号５９に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーとからなり、上記（a）のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
(4) The nucleic acid probe for detection and identification of ticks and molds according to (1), wherein the mold gene-specific primer set is the following (a), (b) or (c):
(A) A set of a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 58 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 59 (b) Substituting, deleting or deleting 1 to 5 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 58 A region consisting of a primer consisting of an added base sequence and a primer consisting of a base sequence obtained by substituting, deleting, or adding 1 to 5 bases in SEQ ID NO: 59 base sequence, and the same region as the primer set of (a) above (C) a primer consisting of a nucleic acid fragment capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 59 Nucleic acid that can hybridize under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a base sequence complementary to the indicated base sequence A set of primers consisting of fragments and capable of amplifying the same region as the primer set (a) above
（５） 配列番号１、５、９、１３、１７及び２１からなる群より選ばれる１の塩基配列の一部又は全部を含むことを特徴とする（１）記載のダニ類及びカビ類の検出及び識別用核酸プローブ。
（６） 配列番号２４、２８、３２、３６、４０、４４及び４８〜５３からなる群より選ばれる１の塩基配列の一部又は全部を含むことを特徴とする（１）記載のダニ類及びカビ類の検出及び識別用核酸プローブ。
（７） （１）〜（６）いずれかに記載の核酸プローブと、前記核酸プローブを固定化した支持担体とを備える、ダニ類及びカビ類の検出及び識別用アレイ。
(5) Detection of ticks and molds according to (1), comprising part or all of one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 5, 9, 13, 17, and 21 And a nucleic acid probe for identification.
(6) The tick according to (1), comprising a part or all of one base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 24, 28, 32, 36, 40, 44, and 48 to 53, and Nucleic acid probe for mold detection and identification.
(7) An array for detecting and identifying mites and fungi comprising the nucleic acid probe according to any one of (1) to (6) and a support carrier on which the nucleic acid probe is immobilized.
また、本発明によれば、上述したダニ類及びカビ類の検出及び識別用核酸プローブとハイブリダイズする検出対象DNA領域を増幅するためのダニ遺伝子特異的プライマー及びカビ遺伝子特異的プライマーを提供することができる。 The present invention also provides a mite gene-specific primer and a mold gene-specific primer for amplifying a detection target DNA region that hybridizes with the nucleic acid probe for detection and identification of mites and molds described above. Can do.
さらに、本発明によれば、検査対象から塵芥を採取する工程と、採取した塵芥からダニ類及びカビ類を分離し、分離されたダニ類及びカビ類からDNAを抽出する工程と、抽出したDNAを鋳型とし、上記ダニ遺伝子特異的プライマーセット及び上記カビ遺伝子特異的プライマーセットを用いて検出対象DNA領域を増幅する工程と、上述した核酸プローブを用いて検出対象DNA領域を検出する工程とを含む、ダニ類及びカビ類の検出及び識別方法を提供することができる。 Furthermore, according to the present invention, a step of collecting dust from the test object, a step of separating mites and molds from the collected dust, a step of extracting DNA from the separated mites and molds, and the extracted DNA And a step of amplifying the detection target DNA region using the mite gene specific primer set and the mold gene specific primer set, and a step of detecting the detection target DNA region using the nucleic acid probe described above. A method for detecting and identifying ticks and molds can be provided.
さらにまた、本発明によれば、検査対象から採取した塵芥からダニ類及びカビ類を分離し、分離されたダニ類及びカビ類からDNAを抽出するDNA抽出手段と、上述したダニ遺伝子特異的プライマーセット及び上述したカビ遺伝子特異的プライマーセットと、上述した核酸プローブを含み、前記ダニ遺伝子特異的プライマーセット及び前記カビ遺伝子特異的プライマーセットにより増幅された検出対象DNA領域を検出する検出手段とを含む、ダニ類及びカビ類の検出及び識別キットを提供することができる。 Furthermore, according to the present invention, a DNA extraction means for separating mites and molds from dust collected from a test object, and extracting DNA from the separated mites and molds, and the above-described mite gene-specific primer. A set and a mold gene-specific primer set described above, and a detection means for detecting the detection target DNA region amplified by the mite gene-specific primer set and the mold gene-specific primer set, including the nucleic acid probe described above A kit for detection and identification of ticks and molds can be provided.
本発明によれば、専門的な知識を必要とせず、簡便な操作で、短時間で正確にアレルゲンを一括して同定可能なシステムを提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide a system capable of accurately identifying allergens in a short time with a simple operation without requiring specialized knowledge.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るダニ・カビ類の検出・識別システムは、ハウスダストアレルギーの原因となるダニ類及びカビ類を検出及び識別できるシステムである。本システムにおいて検出及び識別対象のダニ類としては、Dermatophagoides farinae（コナヒョウヒダニ）、Dermatophagoides pteronyssinus（ヤケヒョウヒダニ）、Tyrophagus pterescentiae（ケナガコナダニ）、Hirstia domicola(イエチリダニ)、Malayoglyphus intermedius（ニセチリダニ）、Euroglyphus maynei（シワダニ）、Acarus siro（アシブトコナダニ）、Acarus immobilis（オソアシブトコナダニ）、Aleuroglyphus ovatus（ムギコナダニ）、Lardoglyphus konoi（コウノホシカダニ）、Suidasia nesbitti（チビコナダニ）、Calvolia domicola（ゴミウスケダニ）、Carpoglyphus lactis（サトウダニ）、Chortoglyphus domicola（イエマルニクダニ）、Glycyphagus destructor（サヤアシニクダニ）、Glycyphagus domesticus（イエニクダニ）、Glycyphagus privates（チリニクダニ）、Gohieria fusca（キナコダニ）、Sarcoptes scabiei (ヒゼンダニ)、Notoedres cati（ネコショウヒゼンダニ）、Dermanyssus hirundinis（スズメサシダニ）、Ornithonyssus sylviarum（トリサシダニ）、Ornithonyssus bacoti（イエダニ）、Cheyletus eruditus（ホソツメダニ）、Cheyletus malaccensis（フトツメダニ）、Chelacaropsis moorei（ミナミツメダニ）、Cheyletus malaccensis（クワガタツメダニ）、Chelatomorpha lepidopterorum（アシナガツメダニ）、Demodex folliculorum（ニキビダニ）、Pyemotes tritici（ムギシラミダニ）、Tarsonemus granaries（ナミホコリダニ）、Haplochthonius simplex（イエササラダニ）、Cosmochthonius reticulates（カザリヒワダニ）等を挙げることができる。本システムにおいて検出及び識別対象のカビ類としては、Alternaria alternata、Aspergills restrictus、Aspergills versicolor、Candida albicans、Cladosporium sphaerosporum、Eurotium herboriorum、Wallemia sebi、Botrytis cinerea、Mucor racemosus、Rhizopus stolonifer、Stachybotrys chartarum、Trichoderma viride Fusarium solani、Aspergillus fumigatus、Aspergillus niger、Aureobasidium pullulans、Cladosporium cladosporioides、Cladosporium herbarum、Epicoccum nigrum、Paecilomyces variotii、Penicillium chrysogenum、Penicillium citrinum、Ulocladium chartarum、Penicillium brevi-compactum、Penicillium aurantiogriseum、Aspergillus amstelodami（Eurotium amstelodami）、Aspergillus chevalieri（Eurotium chevalieri）、Acremonium strictum、Phoma glomerata、Scopulariopsis brevicaulis、Chaetomium globosum等を挙げることができる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The system for detecting and identifying mites and molds according to the present invention is a system that can detect and identify mites and molds that cause house dust allergy. The mites that are detected and identified in this system include Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus, Tyrophagus pterescentiae, Hirstia domicola, tuna, maleoglyphus intermedius, mite siro (Ashibutokonidai), Acarus immobilis (Osoashibutokonada mite), Aleuroglyphus ovatus (Amanita mite), Lardoglyphus konoi (Acarina tick), Suidasia nesbitti (Mite aphid), Carpia tick Glycyphagus destructor, Glycyphagus domesticus, Glycyphagus privates, Gohieria fusca, Sarcoptes scabiei, Notoe dres cati (Dermanyssus hirundinis), Ornithonyssus sylviarum, Ornithonyssus bacoti, Cheyletus eruditus, ticklet, Cheletus malaccensis, tuna ), Chelatomorpha lepidopterorum, Demodex folliculorum, Pyemotes tritici, Tarsonemus granaries, Haplochthonius simplex, Cosmochthonius reticulates, etc. As molds to be detected and identified in this system, Alternaria alternata, Aspergills restrictus, Aspergills versicolor, Candida albicans, Cladosporium sphaerosporum, Eurotium herboriorum, Wallemia sebi, Botrytis cinerea, Mucor racemosus, Rhizopus stoloncho, , Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aureobasidium pullulans, Cladosporium cladosporioides, Cladosporium herbarum, Epicoccum nigrum, Paecilomyces variotii, Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinum, Ulocladium chartarum, Penicillium brevi-compactum, Penicillium aurantiogriseum, Aspergillus amstelodami (Eurotium amstelodami), Aspergillus chevalieri (Eurotium chevalieri), Acremonium strictum, Phoma glomerata, Scopulariopsis brevicaulis, Chaetomium globosum and the like.
本システムでは、先ず、検査対象の室内から塵芥を採取する。採取した塵芥には、検出及び識別対象のダニ虫体、カビ菌糸及び胞子が含まれることとなる。塵芥を採取する手段としては、特に限定されないが、一般的な家庭用掃除機に対して容易に脱着可能なフィルターを使用することができる。フィルターとしては、家庭用掃除機の吸引能力を妨げることなく、効率的にダニ虫体、カビ菌糸及び胞子を捕捉することが可能であることが望ましい。フィルターとしては、例えば、合成樹脂材料からなる不織布を使用することができる。なお、検査対象としては、室内全般、エアコン内部、家具、寝具等を挙げることができるがこれに限定されるものではない。 In this system, first, dust is collected from the room to be inspected. The collected dust will contain mite bodies, mold mycelium and spores to be detected and identified. The means for collecting the dust is not particularly limited, and a filter that can be easily attached to and detached from a general household vacuum cleaner can be used. As a filter, it is desirable that mite worms, mold mycelium and spores can be efficiently captured without hindering the suction ability of a household vacuum cleaner. As the filter, for example, a non-woven fabric made of a synthetic resin material can be used. Examples of the inspection object include, but are not limited to, the whole room, the inside of the air conditioner, furniture, bedding, and the like.
本システムでは、次に、検査対象から採取したダニ虫体、カビ菌糸及び胞子からDNAを抽出する。DNA抽出の手段としては、特に限定されないが、上記塵芥から直接的にDNA成分を分離し、精製して回収できる手段であることが好ましい。DNA抽出手段としては、例えば、塵芥からダニ虫体、カビ菌糸及び胞子を分離するための装置、分離されたダニ虫体、カビ菌糸及び胞子からDNA成分を抽出する抽出用溶液、DNA成分を精製するための溶液及び精製用のカラム、精製後のDNA成分を保存するための緩衝液等を挙げることができる。 Next, in this system, DNA is extracted from mite bodies, mold mycelium and spores collected from the test object. The means for DNA extraction is not particularly limited, but it is preferably a means capable of directly separating and purifying DNA components from the dust. Examples of DNA extraction means include a device for separating mite bodies, mold mycelium and spores from dust, an extraction solution for extracting DNA components from the separated mite bodies, mold mycelia and spores, and purification of DNA components. And a column for purification, a buffer solution for storing the purified DNA component, and the like.
特に、ダニ虫体、カビ菌糸及び胞子からDNAを分離する際には、先ず始めに、例えば、ホモジナイズ装置を使用して破砕しても良いし、乳鉢・乳棒を使用して破砕しても良い。次に、ダニ虫体、カビ菌糸及び胞子を破砕した後、蛋白質分解酵素で処理する。また、蛋白質分解酵素で処理した後もしくは蛋白質分解酵素処理を省いて、界面活性剤（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（CTAB）、ソディウムドデシルスルフェイト（SDS）等）で処理しても良い。 In particular, when DNA is separated from mite bodies, mold mycelia and spores, first, for example, it may be crushed using a homogenizer, or may be crushed using a mortar / pestle. . Next, mite bodies, mold mycelium and spores are crushed and then treated with a proteolytic enzyme. Alternatively, after treatment with a proteolytic enzyme or without treatment with a proteolytic enzyme, treatment with a surfactant (for example, cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), sodium dodecyl sulfate (SDS), etc.) may be performed.
本システムでは、次に、抽出したDNAを用いて核酸増幅反応を行い、採取したダニ及びカビに由来する検出対象DNA領域を増幅させる。核酸増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）等を適用することができる。また、検出対象DNA領域とは、検出対象のダニ及びカビを種レベルで同定することができる程度に特異性を有するDNA領域である。より好ましくは、検出対象DNA領域としては、Internal Transcribed Spacer 領域（以下、ITS領域）や非翻訳領域を挙げることができる。より好ましくは、検出対象DNA領域としては、ITS1領域及びITS2領域を含む領域である。 Next, in this system, a nucleic acid amplification reaction is performed using the extracted DNA, and the detection target DNA region derived from the collected mites and molds is amplified. As the nucleic acid amplification reaction, polymerase chain reaction (PCR), LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), or the like can be applied. The detection target DNA region is a DNA region having specificity to the extent that mites and molds to be detected can be identified at the species level. More preferably, examples of the DNA region to be detected include an Internal Transcribed Spacer region (hereinafter referred to as ITS region) and an untranslated region. More preferably, the detection target DNA region is a region including the ITS1 region and the ITS2 region.
また、検出対象DNA領域を増幅させる際には、増幅後のDNA領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅されたDNAを標識する方法としては、特に限定されないが、例えば核酸増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用しても良いし、核酸増幅反応に修飾ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用しても良い。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（DIG）やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。 Further, when amplifying the DNA region to be detected, it is desirable to add a label so that the amplified DNA region can be identified. At this time, the method for labeling the amplified DNA is not particularly limited. For example, a method in which a primer used in the nucleic acid amplification reaction is labeled in advance may be used, or a modified nucleotide may be used as a substrate for the nucleic acid amplification reaction. You may use the method used as. The labeling substance is not particularly limited, and radioisotopes, fluorescent dyes, or organic compounds such as digoxigenin (DIG) and biotin can be used.
特に、検出対象DNA領域を増幅させる際には、検出及び識別対象としているダニ類及びカビ類由来の検出対象DNA領域を１つの反応系で増幅させることが好ましい。すなわち、検出及び識別対象としているダニ類及びカビ類がそれぞれ複数種に亘っていたとしても、複数種のダニ類及び複数種のカビ類由来の検出対象DNA領域を１つの反応容器内で同時に増幅することが望ましい。このような反応系は、核酸増幅反応としてPCRを適用する場合には「1-tube PCR」と呼ばれる。 In particular, when amplifying the detection target DNA region, it is preferable to amplify the detection target DNA region derived from ticks and molds to be detected and identified in one reaction system. That is, even if there are multiple types of mites and molds to be detected and identified, the detection target DNA regions derived from multiple types of mites and multiple types of molds are simultaneously amplified in one reaction vessel. It is desirable to do. Such a reaction system is called “1-tube PCR” when PCR is applied as a nucleic acid amplification reaction.
またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性DNAポリメラーゼ、検出対象DNA領域特異的プライマー、修飾型ヌクレオチド三燐酸（具体的にはDIGラベル等を付加したヌクレオチド三燐酸）、ヌクレオチド三燐酸及び塩化マグネシウム等を含む反応系キットとして提供することができる。 This reaction system also includes a buffer necessary for nucleic acid amplification / labeling, a heat-resistant DNA polymerase, a detection target DNA region-specific primer, a modified nucleotide triphosphate (specifically, a nucleotide triphosphate added with a DIG label or the like), It can be provided as a reaction system kit containing nucleotide triphosphate and magnesium chloride.
特に、ダニ類由来の検出対象DNA領域を増幅する際には、複数のダニ類の全てに共通して使用できる一対のプライマー（ダニ遺伝子特異的プライマー）を使用することが好ましい。ダニ遺伝子特異的プライマーとしては、具体的には、配列番号５６に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるプライマーのセットを挙げることができる。これらダニ遺伝子特異的プライマーによれば、少なくとも、Dermatophagoides farinae、Dermatophagoides pteronyssinus及びTyrophagus pterescentiae由来のITS領域を検出対象DNA領域として増幅することができる。 In particular, when amplifying a detection target DNA region derived from mites, it is preferable to use a pair of primers (tick gene-specific primers) that can be used in common for all of a plurality of mites. Specific examples of the tick gene-specific primer include a primer set consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 56 and a primer set consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 57. According to these tick gene specific primers, at least ITS regions derived from Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus and Tyrophagus pterescentiae can be amplified as detection target DNA regions.
また、ダニ遺伝子特異的プライマーとしては、配列番号５６に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるプライマーのセットに限定されず、上記ITS領域を増幅することができるならばこれら塩基配列において１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマーのセットであってもよい。さらに、ダニ遺伝子特異的プライマーとしては、上記ITS領域を増幅することができるならば、配列番号５６に示す塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー、及び配列番号５７に示す塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーのセットであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、High stringency buf.(0.5xSSC, 0.1% SDS)、６５℃、１５分間程度の洗い条件を指す。 The tick gene-specific primer is not limited to a primer set consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 56 and a primer set consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 57, and these can be used if the ITS region can be amplified. It may be a primer set comprising a base sequence in which 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2 bases are substituted, deleted or added in the base sequence. Furthermore, as a tick gene-specific primer, stringent conditions for a nucleic acid fragment consisting of a base sequence completely complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 56, provided that the ITS region can be amplified. A primer comprising a nucleic acid fragment capable of hybridizing under the above, and a primer comprising a nucleic acid fragment capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid fragment comprising a nucleotide sequence completely complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 57 It may be a set. Here, stringent conditions refer to, for example, high stringency buf. (0.5 × SSC, 0.1% SDS), washing conditions at 65 ° C. for about 15 minutes.
また、同様に、複数のカビ類の全てに共通して使用できる一対のプライマー（カビ遺伝子特異的プライマー）を使用することが好ましい。カビ遺伝子特異的プライマーとしては、具体的には、配列番号５８に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるプライマーのセットを挙げることができる。これらダニ遺伝子特異的プライマーによれば、少なくとも、Alternaria alternata、Aspergills restrictus、Aspergills versicolor、Candida albicans、Cladosporium sphaerosporum及びEurotium herboriorum由来のITS領域を検出対象DNA領域として増幅することができる。 Similarly, it is preferable to use a pair of primers (mold gene-specific primers) that can be used in common for all of a plurality of molds. Specific examples of mold gene-specific primers include a primer set consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 58 and a primer set consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 59. According to these tick gene-specific primers, at least an ITS region derived from Alternaria alternata, Aspergills restrictus, Aspergills versicolor, Candida albicans, Cladosporium sphaerosporum and Eurotium herboriorum can be amplified as a DNA region to be detected.
また、カビ遺伝子特異的プライマーとしては、配列番号５８に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５９に示す塩基配列からなるプライマーのセットに限定されず、上記ITS領域を増幅することができるならばこれら塩基配列において１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマーのセットであってもよい。さらに、カビ遺伝子特異的プライマーとしては、上記ITS領域を増幅することができるならば、配列番号５８に示す塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマー、及び配列番号５９に示す塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーのセットであってもよい。 The mold gene-specific primer is not limited to a primer set consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 58 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 59, and these primers can be used if they can amplify the ITS region. It may be a primer set comprising a base sequence in which 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2 bases are substituted, deleted or added in the base sequence. Furthermore, as a mold gene-specific primer, stringent conditions for a nucleic acid fragment consisting of a base sequence that is completely complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 58, provided that the ITS region can be amplified. A primer comprising a nucleic acid fragment capable of hybridizing under the above, and a primer comprising a nucleic acid fragment capable of hybridizing under a stringent condition to a nucleic acid fragment comprising a nucleotide sequence completely complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 59 It may be a set.
次に、本システムでは、増幅した検出対象DNA領域を、特定の塩基配列を有する核酸プローブによって検出する。本システムにおいては、検出及び識別対象のダニ類及びカビ類それぞれについて核酸プローブを準備する。核酸プローブは、検出及び識別対象のダニ類及びカビ類からゲノムDNA或いはmRNAを抽出し、抽出したゲノムDNA或いはmRNAを鋳型としてPCR等の核酸増幅反応を利用してクローニングすることができる。 Next, in the present system, the amplified detection target DNA region is detected by a nucleic acid probe having a specific base sequence. In this system, nucleic acid probes are prepared for mites and molds to be detected and identified. The nucleic acid probe can be cloned by extracting genomic DNA or mRNA from mites and molds to be detected and identified, and using the extracted genomic DNA or mRNA as a template using a nucleic acid amplification reaction such as PCR.
例えば、Dermatophagoides farinae（コナヒョウヒダニ）を検出及び識別対象のダニ類とする場合、核酸プローブは、配列番号１に示す塩基配列の一部又は全部を含むITS1領域と配列番号５に示す塩基配列の一部又は全部を含むITS2領域とすることができる。より具体的には、Dermatophagoides farinaeから抽出したゲノムDNAを鋳型として、配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーを使用したPCRによって、配列番号４に示す塩基配列からなるDermatophagoides farinae由来ITS1領域の一部を増幅することができる。また、Dermatophagoides farinaeから抽出したゲノムDNAを鋳型として、配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーを使用したPCRによって、配列番号８に示す塩基配列からなるDermatophagoides farinae由来ITS2領域の一部を増幅することができる。すなわち、配列番号４に示す塩基配列からなる核酸プローブ及び配列番号８に示す塩基配列からなる核酸プローブを、Dermatophagoides farinaeの検出及び識別用の核酸プローブとすることができる。 For example, when Dermatophagoides farinae is used as a mite to be detected and identified, the nucleic acid probe is an ITS1 region containing part or all of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5. Alternatively, it can be an ITS2 area including all. More specifically, using the genomic DNA extracted from Dermatophagoides farinae as a template, the base shown in SEQ ID NO: 4 is obtained by PCR using the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. A part of the ITS1 region derived from Dermatophagoides farinae consisting of a sequence can be amplified. In addition, Dermatophagoides consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 by PCR using the genomic DNA extracted from Dermatophagoides farinae as a template and using the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 A part of the farinae-derived ITS2 region can be amplified. That is, the nucleic acid probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and the nucleic acid probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 can be used as nucleic acid probes for detection and identification of Dermatophagoides farinae.
Dermatophagoides pteronyssinus（ヤケヒョウヒダニ）を検出及び識別対象のダニ類とする場合、核酸プローブは、配列番号９に示す塩基配列の一部又は全部を含むITS1領域と配列番号１３に示す塩基配列の一部又は全部を含むITS2領域とすることができる。より具体的には、Dermatophagoides pteronyssinusから抽出したゲノムDNAを鋳型として、配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーを使用したPCRによって、配列番号１２に示す塩基配列からなるDermatophagoides pteronyssinus由来ITS1領域の一部を増幅することができる。また、Dermatophagoides pteronyssinusから抽出したゲノムDNAを鋳型として、配列番号１４に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１５に示す塩基配列からなるプライマーを使用したPCRによって、配列番号１６に示す塩基配列からなるDermatophagoides pteronyssinus由来ITS2領域の一部を増幅することができる。すなわち、配列番号１２に示す塩基配列からなる核酸プローブ及び配列番号１６に示す塩基配列からなる核酸プローブを、Dermatophagoides pteronyssinusの検出及び識別用の核酸プローブとすることができる。 When Dermatophagoides pteronyssinus is used as a mite to be detected and identified, the nucleic acid probe is an ITS1 region containing part or all of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 and part or all of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13. ITS2 area including More specifically, using the genomic DNA extracted from Dermatophagoides pteronyssinus as a template, the base shown in SEQ ID NO: 12 by PCR using the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 A part of the ITS1 region derived from Dermatophagoides pteronyssinus consisting of a sequence can be amplified. Further, Dermatophagoides consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 by PCR using the genomic DNA extracted from Dermatophagoides pteronyssinus as a template and using the primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 and the primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15. A part of the ITS2 region derived from pteronyssinus can be amplified. That is, the nucleic acid probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12 and the nucleic acid probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 can be used as nucleic acid probes for detection and identification of Dermatophagoides pteronyssinus.
Tyrophagus pterescentiae（ケナガコナダニ）、を検出及び識別対象のダニ類とする場合、核酸プローブは、配列番号１７に示す塩基配列の一部又は全部を含むITS1領域と配列番号２１に示す塩基配列の一部又は全部を含むITS2領域とすることができる。より具体的には、Tyrophagus pterescentiaeから抽出したゲノムDNAを鋳型として、配列番号１８に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１９に示す塩基配列からなるプライマーを使用したPCRによって、配列番号２０に示す塩基配列からなるTyrophagus pterescentiae由来ITS1領域の一部を増幅することができる。また、Tyrophagus pterescentiaeから抽出したゲノムDNAを鋳型として、配列番号２２に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２３に示す塩基配列からなるプライマーを使用したPCRによって、配列番号２１に示す塩基配列からなるTyrophagus pterescentiae由来ITS2領域を増幅することができる。すなわち、配列番号２０に示す塩基配列からなる核酸プローブ及び配列番号２１に示す塩基配列からなる核酸プローブを、Tyrophagus pterescentiaeの検出及び識別用の核酸プローブとすることができる。 When Tyrophagus pterescentiae is used as a mite to be detected and identified, the nucleic acid probe is an ITS1 region containing a part or all of the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 and a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 or It can be an ITS2 area that includes everything. More specifically, using the genomic DNA extracted from Tyrophagus pterescentiae as a template, the base shown in SEQ ID NO: 20 by PCR using the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 18 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 A part of the ITS1 region derived from Tyrophagus pterescentiae consisting of the sequence can be amplified. Further, Tyrophagus consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 was obtained by PCR using the genomic DNA extracted from Tyrophagus pterescentiae as a template and using the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23. pterescentiae-derived ITS2 region can be amplified. That is, the nucleic acid probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 and the nucleic acid probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 can be used as nucleic acid probes for detecting and identifying Tyrophagus pterescentiae.
一方、Alternaria alternataを検出及び識別対象のカビ類とする場合、核酸プローブは、配列番号２４に示す塩基配列の一部又は全部を含むITS1領域とすることができる。より具体的には、Alternaria alternataから抽出したゲノムDNAを鋳型として、配列番号２５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号２６に示す塩基配列からなるプライマーを使用したPCRによって、配列番号２７に示す塩基配列からなるAlternaria alternata由来ITS1領域の一部を増幅することができる。すなわち、配列番号２７に示す塩基配列からなる核酸プローブを、Alternaria alternataの検出及び識別用の核酸プローブとすることができる。 On the other hand, when Alternaria alternata is a fungus to be detected and identified, the nucleic acid probe can be an ITS1 region containing part or all of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24. More specifically, using the genomic DNA extracted from Alternaria alternata as a template, the base shown in SEQ ID NO: 27 by PCR using the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26 A part of the Alternaria alternata-derived ITS1 region consisting of the sequence can be amplified. That is, the nucleic acid probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 can be used as a nucleic acid probe for detection and identification of Alternaria alternata.
Aspergills restrictusを検出及び識別対象のカビ類とする場合、核酸プローブは、配列番号２８に示す塩基配列の一部又は全部を含むITS1領域とすることができる。より具体的には、Aspergills restrictusから抽出したゲノムDNAを鋳型として、配列番号２９に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号３０に示す塩基配列からなるプライマーを使用したPCRによって、配列番号３１に示す塩基配列からなるAspergills restrictus由来ITS1領域の一部を増幅することができる。すなわち、配列番号３１に示す塩基配列からなる核酸プローブを、Aspergills restrictusの検出及び識別用の核酸プローブとすることができる。 When Aspergills restrictus is a mold to be detected and identified, the nucleic acid probe can be an ITS1 region including a part or all of the base sequence shown in SEQ ID NO: 28. More specifically, using the genomic DNA extracted from Aspergills restrictus as a template, the base shown in SEQ ID NO: 31 by PCR using the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 30 A part of the Aspergills restrictus-derived ITS1 region consisting of the sequence can be amplified. That is, the nucleic acid probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 31 can be used as a nucleic acid probe for detection and identification of Aspergills restrictus.
Aspergills versicoloを検出及び識別対象のカビ類とする場合、核酸プローブは、配列番号３２に示す塩基配列の一部又は全部を含むITS1領域とすることができる。より具体的には、Aspergills versicoloから抽出したゲノムDNAを鋳型として、配列番号３３に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号３４に示す塩基配列からなるプライマーを使用したPCRによって、配列番号３５に示す塩基配列からなるAspergills versicolo由来ITS1領域の一部を増幅することができる。すなわち、配列番号３５に示す塩基配列からなる核酸プローブを、Aspergills versicoloの検出及び識別用の核酸プローブとすることができる。 When Aspergills versicolo is a mold to be detected and identified, the nucleic acid probe can be an ITS1 region including a part or all of the base sequence shown in SEQ ID NO: 32. More specifically, using the genomic DNA extracted from Aspergills versicolo as a template, the base shown in SEQ ID NO: 35 by PCR using the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 33 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 34 A part of the ITS1 region derived from Aspergills versicolo consisting of the sequence can be amplified. That is, the nucleic acid probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 35 can be used as a nucleic acid probe for detection and identification of Aspergills versicolo.
Candida albicansを検出及び識別対象のカビ類とする場合、核酸プローブは、配列番号３６に示す塩基配列の一部又は全部を含むITS1領域とすることができる。より具体的には、Candida albicansから抽出したゲノムDNAを鋳型として、配列番号３７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号３８に示す塩基配列からなるプライマーを使用したPCRによって、配列番号３９に示す塩基配列からなるCandida albicans由来ITS1領域の一部を増幅することができる。すなわち、配列番号３９に示す塩基配列からなる核酸プローブを、Candida albicansの検出及び識別用の核酸プローブとすることができる。 When Candida albicans is a fungus to be detected and identified, the nucleic acid probe can be an ITS1 region containing a part or all of the base sequence shown in SEQ ID NO: 36. More specifically, using the genomic DNA extracted from Candida albicans as a template, the base shown in SEQ ID NO: 39 by PCR using the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 37 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 38 A part of the Candida albicans-derived ITS1 region consisting of the sequence can be amplified. That is, the nucleic acid probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 39 can be used as a nucleic acid probe for detection and identification of Candida albicans.
Cladosporium sphaerospermumを検出及び識別対象のカビ類とする場合、核酸プローブは、配列番号４０に示す塩基配列の一部又は全部を含むITS1領域とすることができる。より具体的には、Cladosporium sphaerospermumから抽出したゲノムDNAを鋳型として、配列番号４１に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４２に示す塩基配列からなるプライマーを使用したPCRによって、配列番号４３に示す塩基配列からなるCladosporium sphaerospermum由来ITS1領域の一部を増幅することができる。すなわち、配列番号４３に示す塩基配列からなる核酸プローブを、Cladosporium sphaerospermumの検出及び識別用の核酸プローブとすることができる。 When Cladosporium sphaerospermum is a fungus to be detected and identified, the nucleic acid probe can be an ITS1 region containing a part or all of the base sequence shown in SEQ ID NO: 40. More specifically, using the genomic DNA extracted from Cladosporium sphaerospermum as a template, the base shown in SEQ ID NO: 43 by PCR using the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 41 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 42 A part of Cladosporium sphaerospermum-derived ITS1 region consisting of the sequence can be amplified. That is, the nucleic acid probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 43 can be used as a nucleic acid probe for detection and identification of Cladosporium sphaerospermum.
Eurotium herbariorumを検出及び識別対象のカビ類とする場合、核酸プローブは、配列番号４４に示す塩基配列の一部又は全部を含むITS1領域とすることができる。より具体的には、Eurotium herbariorumから抽出したゲノムDNAを鋳型として、配列番号４５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号４６に示す塩基配列からなるプライマーを使用したPCRによって、配列番号４７に示す塩基配列からなるEurotium herbariorum由来ITS1領域の一部を増幅することができる。すなわち、配列番号４７に示す塩基配列からなる核酸プローブを、Eurotium herbariorumの検出及び識別用の核酸プローブとすることができる。 When Eurotium herbariorum is a mold to be detected and identified, the nucleic acid probe can be an ITS1 region including a part or all of the base sequence shown in SEQ ID NO: 44. More specifically, using the genomic DNA extracted from Eurotium herbariorum as a template, the base shown in SEQ ID NO: 47 by PCR using the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 45 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 46 A part of the ITS1 region derived from the Eurotium herbariorum consisting of the sequence can be amplified. That is, the nucleic acid probe consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 47 can be used as a nucleic acid probe for detection and identification of Eurotium herbariorum.
また、上述したように、Alternaria alternata、Aspergills restrictus、Aspergills versicolo、Candida albicans、Cladosporium sphaerospermum及びEurotium herbariorumを検出及び識別対象のカビ類とする場合に核酸プローブとして、それぞれITS1領域の一部を使用したが、これらカビ類についてITS2領域の一部を核酸プローブとして使用しても良い。Alternaria alternataにおけるITS2領域の一部を配列番号４８に示し、Aspergills restrictusにおけるITS2領域の一部を配列番号４９に示し、Aspergills versicoloにおけるITS2領域の一部を配列番号５０に示し、Candida albicansにおけるITS2領域の一部を配列番号５１に示し、Cladosporium sphaerospermumにおけるITS2領域の一部を配列番号５２に示し、Eurotium herbariorumにおけるITS2領域の一部を配列番号５３に示す。これら配列番号４８〜５３に示したカビ類由来のITS2領域は、全て配列番号５４に示すプライマー及び配列番号５５に示すプライマーにより増幅することができる。 In addition, as described above, when using Alternaria alternata, Aspergills restrictus, Aspergills versicolo, Candida albicans, Cladosporium sphaerospermum and Eurotium herbariorum as molds to be detected and identified, a part of the ITS1 region was used respectively. For these molds, a part of the ITS2 region may be used as a nucleic acid probe. A part of the ITS2 region in Alternaria alternata is shown in SEQ ID NO: 48, a part of the ITS2 region in Aspergills restrictus is shown in SEQ ID NO: 49, a part of the ITS2 region in Aspergills versicolo is shown in SEQ ID NO: 50, and the ITS2 region in Candida albicans. Is shown in SEQ ID NO: 51, a part of the ITS2 region in Cladosporium sphaerospermum is shown in SEQ ID NO: 52, and a part of the ITS2 region in Eurotium herbariorum is shown in SEQ ID NO: 53. All of the mold-derived ITS2 regions shown in SEQ ID NOs: 48 to 53 can be amplified with the primer shown in SEQ ID NO: 54 and the primer shown in SEQ ID NO: 55.
特に、検出及び識別対象のダニ類及びカビ類を、検出対象DNA領域としてITS1領域及びITS2領域を含むDNA断片を増幅する場合、上述したように、各ダニ類及び各カビ類についてそれぞれ、ITS1領域及びITS2領域をともに核酸プローブとして使用することが好ましい。核酸プローブとしてITS1領域及びITS2領域をともに使用することによって、上述した工程で増幅した検出対象DNA領域の検出精度を向上させることができる。すなわち、ITS1領域を含む核酸プローブ及びITS2領域を含む核酸プローブのうち一方のみにハイブリダイズが生じても、他方に対してハイブリダイズが認められない場合には、一方に生じたハイブリダイズを非特異的ハイブリダイズによる擬陽性であると結論付けることができる。これにより、非特異的ハイブリダイズによる誤判定の生じる可能性を非常に低く抑えることができるため、検出対象DNA領域の存在すなわち、特定のダニ類及びカビ類の検出及び識別を高精度に行うことができる。 In particular, in the case of amplifying a DNA fragment containing the ITS1 region and the ITS2 region as the detection target DNA region for the mites and molds to be detected and identified, as described above, the ITS1 region for each mite and each mold, respectively. And the ITS2 region are preferably used as nucleic acid probes. By using both the ITS1 region and the ITS2 region as the nucleic acid probe, the detection accuracy of the detection target DNA region amplified in the above-described steps can be improved. That is, if hybridization occurs only in one of the nucleic acid probe containing the ITS1 region and the nucleic acid probe containing the ITS2 region, but no hybridization is observed for the other, the hybridization that occurs in one is non-specific. It can be concluded that this is a false positive due to local hybridization. As a result, the possibility of misjudgment due to non-specific hybridization can be kept very low, so that the presence of the DNA region to be detected, that is, specific mites and molds can be detected and identified with high accuracy. Can do.
ところで、核酸プローブとしては、上述したように検出対象DNA領域とのハイブリダイズに寄与する塩基配列のみからなる核酸断片に限定されず、例えば、当該かハイブリダイズに寄与しない塩基配列が含まれていても良い。さらに、核酸プローブは、上述したように一対のプライマーを使用した核酸増幅反応により増幅されたものに限定されず、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することもできる。核酸合成装置としては、DNAシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。 By the way, the nucleic acid probe is not limited to a nucleic acid fragment consisting only of a base sequence that contributes to hybridization with the DNA region to be detected as described above. For example, the nucleic acid probe includes a nucleotide sequence that does not contribute to hybridization. Also good. Furthermore, the nucleic acid probe is not limited to those amplified by a nucleic acid amplification reaction using a pair of primers as described above, and can be obtained by chemically synthesizing with a nucleic acid synthesizer. As the nucleic acid synthesizer, an apparatus called a DNA synthesizer, a fully automatic nucleic acid synthesizer, an automatic nucleic acid synthesizer or the like can be used.
なお、核酸プローブを使用した検出対象DNA領域の検出は、核酸プローブと検出対象DNA領域とのハイブリダイズを検出できる方法であれば特に限定されない。例えば、ナイロンメンブラン等の比較的大型、もしくはスライドグラス等の小型の支持担体上に、核酸プローブを固定したアレイを使用することができる。なお、本システムにおいて、アレイの形状や寸法には何ら限定されず、従来公知のアレイを幅広く適用することできる。また、アレイには、ハウスキーピング遺伝子等のコントロールとなるコントロール・プローブが固定されていても良い。ここで、支持担体としては、核酸プローブを固定化できれば特に限定されず、ガラス板及び樹脂板等を使用することができる。樹脂板としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン及びシリコーン等のプラスティク板、ニトロセルロース及びセルロースアセテート等のセルロース板等を使用することができる。なお、核酸プローブの固定化方法によっては、一主面に表面処理を施した支持担体を使用することもできる。例えば、一主面をポリL-リシンでコーティングしたガラス板を使用することができる。また、支持担体の形状は、板状のものに限定したものではなく、ウェルプレート状の比較的大型、もしくはピコタイタ-プレート状の微細な孔を有するプレートや球状のもの（ビーズ）などがある。 The detection of the detection target DNA region using the nucleic acid probe is not particularly limited as long as it is a method capable of detecting hybridization between the nucleic acid probe and the detection target DNA region. For example, an array in which a nucleic acid probe is immobilized on a relatively large support carrier such as a nylon membrane or a small support carrier such as a slide glass can be used. In this system, the shape and dimensions of the array are not limited at all, and a wide variety of conventionally known arrays can be applied. In addition, a control probe for controlling a housekeeping gene or the like may be fixed to the array. Here, the support carrier is not particularly limited as long as the nucleic acid probe can be immobilized, and a glass plate, a resin plate, and the like can be used. As the resin plate, plastic plates such as polyethylene, polypropylene, polystyrene, nylon and silicone, cellulose plates such as nitrocellulose and cellulose acetate, and the like can be used. Depending on the method for immobilizing the nucleic acid probe, it is possible to use a support having a surface treated on one main surface. For example, a glass plate having one main surface coated with poly L-lysine can be used. Further, the shape of the support carrier is not limited to a plate-like shape, and there are a relatively large well plate-like or pico-titer-plate-like plate having fine holes, a spherical one (beads), and the like.
さらに、検出対象DNA領域とハイブリする核酸プローブは、DNA量を段階的に変化させた複数のスポットとして固定されていてもよい。例えば、個々の核酸プローブについて、DNA量を1ngとしたスポット、100pgとしたスポット及び10pgとしたスポットというように複数のスポットを形成してもよい。これにより、検出対象DNA領域を半定量することができ、検査対象に存在するアレルゲンについて半定量的な評価が可能となる。 Furthermore, the nucleic acid probe that hybridizes with the DNA region to be detected may be immobilized as a plurality of spots in which the amount of DNA is changed stepwise. For example, for each nucleic acid probe, a plurality of spots such as a spot with a DNA amount of 1 ng, a spot with 100 pg, and a spot with 10 pg may be formed. Thereby, the DNA region to be detected can be semi-quantified, and the allergen present in the test object can be semi-quantitatively evaluated.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to a following example.
〔実施例１〕
本実施例では、Dermatophagoides farinae（コナヒョウヒダニ）、Dermatophagoides pteronyssinus（ヤケヒョウヒダニ）、Tyrophagus pterescentiae（ケナガコナダニ）の３種のダニを識別できるPCR条件について検討した。
[Example 1]
In this example, PCR conditions that can distinguish three types of ticks, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides pteronyssinus, and Tyrophagus pterescentiae were examined.
本例では、Dermatophagoides pteronyssinus由来のITS1領域をPCRにより増幅するため、特異的なプライマーDP-ITS1F及びDP-ITS1Rを設計した。また、Dermatophagoides pteronyssinus由来のITS2領域をPCRにより増幅するため、特異的なプライマーDP-ITS2F及びDP-ITS2Rを設計した。 In this example, specific primers DP-ITS1F and DP-ITS1R were designed to amplify the ITS1 region derived from Dermatophagoides pteronyssinus by PCR. In addition, specific primers DP-ITS2F and DP-ITS2R were designed to amplify the ITS2 region from Dermatophagoides pteronyssinus by PCR.
DP-ITS1F：5'- TTC TTg AgC ATT TAT TTg C -3'（配列番号１０）
DP-ITS1R：5'- TTT gTA TCA ATg TTT ATg g -3'（配列番号１１）
DP-ITS2F：5'- TAT CAA ATT ATg ACC AAA C -3'（配列番号１４）
DP-ITS2R：5'- TAC ATT gAT TTg TCA ACC -3'（配列番号１５）
上記プライマーを用いて表１及び２に示す条件でPCRを行った。
DP-ITS1F: 5'-TTC TTg AgC ATT TAT TTg C-3 '(SEQ ID NO: 10)
DP-ITS1R: 5'-TTT gTA TCA ATg TTT ATgg-3 '(SEQ ID NO: 11)
DP-ITS2F: 5'- TAT CAA ATT ATg ACC AAA C-3 '(SEQ ID NO: 14)
DP-ITS2R: 5'-TAC ATT gAT TTg TCA ACC-3 '(SEQ ID NO: 15)
PCR was performed using the above primers under the conditions shown in Tables 1 and 2.
鋳型DNAとしてDermatophagoides farinaeのゲノムDNA、Dermatophagoides pteronyssinusのゲノムDNA又はTyrophagus pterescentiaeのゲノムDNAを使用してそれぞれPCRを行った後、反応液を電気泳動にかけた結果を図１Ａに示す。 FIG. 1A shows the result of subjecting the reaction mixture to electrophoresis after PCR was carried out using Dermatophagoides farinae genomic DNA, Dermatophagoides pteronyssinus genomic DNA or Tyrophagus pterescentiae genomic DNA as template DNA.
また、本実施例では、Dermatophagoides farinae由来のITS1領域をPCRにより増幅するため、特異的なプライマーDF-ITS1F及びDF-ITS1Rを設計した。また、Tyrophagus pterescentiae由来のITS2領域をPCRにより増幅するため、特異的なプライマーTP-ITS2F及びTP-ITS2Rを設計した。 In this example, specific primers DF-ITS1F and DF-ITS1R were designed to amplify the ITS1 region derived from Dermatophagoides farinae by PCR. In addition, specific primers TP-ITS2F and TP-ITS2R were designed to amplify the ITS2 region from Tyrophagus pterescentiae by PCR.
DF-ITS1F：5'- TTg AAC AAT gAA ACA CTT g -3'（配列番号２）
DF-ITS1R：5'- TTg TTT CAA TgA TAC Tgg C -3'（配列番号３）
TP-ITS2F：5'- ATA TgC CAA ACA CCA TgC -3'（配列番号２２）
TP-ITS2R：5'- gAA AgT TAA CAA CAA CTg C -3'（配列番号２３）
上記プライマーを用いて表３及び４に示す条件でPCRを行った。
DF-ITS1F: 5'-TTg AAC AAT gAA ACA CTT g-3 '(SEQ ID NO: 2)
DF-ITS1R: 5'-TTg TTT CAA TgA TAC Tgg C-3 '(SEQ ID NO: 3)
TP-ITS2F: 5'-ATA TgC CAA ACA CCA TgC-3 '(SEQ ID NO: 22)
TP-ITS2R: 5'-gAA AgT TAA CAA CAA CTg C-3 '(SEQ ID NO: 23)
PCR was performed under the conditions shown in Tables 3 and 4 using the above primers.
鋳型DNAとしてDermatophagoides farinaeのゲノムDNA、Dermatophagoides pteronyssinusのゲノムDNA又はTyrophagus pterescentiaeのゲノムDNAを使用してそれぞれPCRを行った後、反応液を電気泳動にかけた結果を図１Ｂに示す。 FIG. 1B shows the results obtained by subjecting the reaction mixture to electrophoresis after performing PCR using Dermatophagoides farinae genomic DNA, Dermatophagoides pteronyssinus genomic DNA, or Tyrophagus pterescentiae genomic DNA as template DNA.
さらに、本実施例では、Dermatophagoides pteronyssinus由来のITS2領域をPCRにより増幅するための、特異的なプライマーDP-ITS2F及びDP-ITS2Rを用いて表５及び６に示す条件でPCRを行った。 Further, in this example, PCR was performed under the conditions shown in Tables 5 and 6 using specific primers DP-ITS2F and DP-ITS2R for amplifying the ITS2 region derived from Dermatophagoides pteronyssinus by PCR.
鋳型DNAとしてDermatophagoides farinaeのゲノムDNA、Dermatophagoides pteronyssinusのゲノムDNA又はTyrophagus pterescentiaeのゲノムDNAを使用してそれぞれPCRを行った後、反応液を電気泳動にかけた結果を図１Ｃに示す。 FIG. 1C shows the result of subjecting the reaction mixture to electrophoresis after PCR was performed using genomic DNA of Dermatophagoides farinae, genomic DNA of Dermatophagoides pteronyssinus or genomic DNA of Tyrophagus pterescentiae as template DNA.
以上、図１Ａ〜Ｃに示したように、本実施例で設計したプライマーは全て特異的にITS領域を増幅することができ、他のダニ類のITS領域等の非特異的な領域を増幅しないことが明らかとなった。 As described above, as shown in FIGS. 1A to 1C, all of the primers designed in this example can specifically amplify ITS regions and do not amplify non-specific regions such as ITS regions of other mites. It became clear.
〔実施例２〕
本実施例では、検出及び標識対象のダニ類からのゲノムDNAを抽出する方法について検討した。本実施例では、供試ダニとしてアレルゲンの原因ダニとして知られるコナヒョウヒダニ（Dermatophagoides farinae）を用いた。虫体の破砕には、ホモジナイゼーションペッスル（フナコシ株式会社）もしくは乳鉢・乳棒を用いた。Proteinase KはMERCK社の製品を用い、酵素反応は定法に従い0.5% SDSの存在下37℃で1時間行った。全ての手法において最終的にCTAB処理を行い、イソプロパノールにてDNAを沈殿させた。遠心分離を行い、上清を除去した後、10μLの滅菌水に溶解した。そのうち4μLを用いてrDNA ITS領域のPCRにより増幅を行った。
[Example 2]
In this example, a method for extracting genomic DNA from mites to be detected and labeled was examined. In this example, Dermatophagoides farinae, which is known as an allergen-causing mite, was used as a test mite. A homogenization pestle (Funakoshi Co., Ltd.) or a mortar / pestle was used for crushing insects. Proteinase K was a product of MERCK, and the enzyme reaction was performed at 37 ° C. for 1 hour in the presence of 0.5% SDS according to a conventional method. In all methods, CTAB treatment was finally performed, and DNA was precipitated with isopropanol. After centrifuging and removing the supernatant, it was dissolved in 10 μL of sterile water. Amplification was performed by PCR of rDNA ITS region using 4 μL.
本例のPCRでは以下のプライマーセットを使用し、表７及び８に示す条件とした。
Arthro-ITSF：5'- TAg Agg AAg TAA Aag TCG-3'（配列番号６０）
Inaect-ITSR：5'- CCT TAg Atg gAg TTT ACC-3'（配列番号６１）
In the PCR of this example, the following primer sets were used and the conditions shown in Tables 7 and 8 were used.
Arthro-ITSF: 5'-TAg Agg AAg TAA Aag TCG-3 '(SEQ ID NO: 60)
Inaect-ITSR: 5'-CCT TAg Atg gAg TTT ACC-3 '(SEQ ID NO: 61)
PCR終了後アガロースゲルにてPCR産物の電気泳動を行い確認した。上述した処理を表９にまとめた。 After completion of PCR, the PCR product was electrophoresed on an agarose gel and confirmed. The processing described above is summarized in Table 9.
PCR産物の電気泳動の結果を図２に示す。Arthro-ITSF及びInaect-ITSRを使用した場合、コナヒョウヒダニのrDNA ITS領域の全長は約1,200bpである。どの手法を用いてもほぼ同量のPCR産物が得られた。今回の条件では50個体からでもPCRが可能な量のDNAを抽出することが可能であった。液体窒素未使用の場合でも満足できるといった結果が得られており、操作を簡便化・迅速化することが可能となった。虫体の粉砕法については、ペッスル、乳鉢・乳棒いずれの場合においても大きな差は見られなかった。また、Proteinase Kを用いた場合でも顕著な差は認められなかった。このことから、通常1時間〜１日といった長時間を要するProteinase K処理は必ずしも必要な処理ではないことが明らかとなった。 The result of electrophoresis of the PCR product is shown in FIG. When Arthro-ITSF and Inaect-ITSR are used, the total length of the rDNA ITS region of the white mite is about 1,200 bp. Approximately the same amount of PCR product was obtained using any method. Under these conditions, it was possible to extract as much DNA as possible from 50 individuals. Satisfactory results have been obtained even when liquid nitrogen is not used, and it has become possible to simplify and speed up the operation. As for the pulverization method, there was no significant difference between the pestle, mortar and pestle. Even when Proteinase K was used, no significant difference was observed. From this, it became clear that the proteinase K treatment, which normally takes a long time such as 1 hour to 1 day, is not necessarily a necessary treatment.
〔実施例３〕
本実施例では、ダニ遺伝子特異的プライマー又はカビ遺伝子特異的プライマーを使用した、いわゆる1-tube PCRについて検討した。
Example 3
In this example, so-called 1-tube PCR using a tick gene-specific primer or a mold gene-specific primer was examined.
本実施例では、ダニ遺伝子特異的プライマーとして、配列番号５６に示す塩基配列からなるプライマー（Acari ITS1）と配列番号５７に示す塩基配列からなるプライマー（Acari ITS2 R）を設計した。
Acari ITS1：5'- CAA ggT TTC CgT Agg TgA AC -3' (Tm: 55.4 ℃)（配列番号５６）
Acari ITS2 R：5'- gCT TgA TCT gAg gTC gA -3' (Tm: 52.2 ℃)（配列番号５７）
In this example, as a tick gene-specific primer, a primer (Acari ITS1) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 56 and a primer (Acari ITS2 R) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 57 were designed.
Acari ITS1: 5'-CAA ggT TTC CgT Agg TgA AC-3 '(Tm: 55.4 ° C) (SEQ ID NO: 56)
Acari ITS2 R: 5'-gCT TgA TCT gAg gTC gA-3 '(Tm: 52.2 ° C) (SEQ ID NO: 57)
また、カビ遺伝子特異的プライマーとして、配列番号５８に示す塩基配列からなるプライマー（ITS1-F）と配列番号５９に示す塩基配列からなるプライマー（FO514）を設計した。
ITS1-F：5'- CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A -3' (Tm: 53.0 ℃)（配列番号５８）
FO514：5'- TAT GCT TAA GTT CAG CGG GTA GTC C -3' (Tm: 60.5 ℃)（配列番号５９）
これらプライマーセットにより増幅される領域はITS1~5.8S~ITS2である。
In addition, as a mold gene-specific primer, a primer (ITS1-F) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 58 and a primer (FO514) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 59 were designed.
ITS1-F: 5'-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-3 '(Tm: 53.0 ° C) (SEQ ID NO: 58)
FO514: 5'-TAT GCT TAA GTT CAG CGG GTA GTC C-3 '(Tm: 60.5 ° C) (SEQ ID NO: 59)
The regions amplified by these primer sets are ITS1 to 5.8S to ITS2.
また、本実施例では、鋳型DNAとしてpXcmkn12のXcm I部位に標的領域となるITS領域をクローニングしたサブクローン2種（ダニ１種、カビ１種）をそれぞれ最終濃度0.5ng/μlになるように添加した。コントロールにはDNAの代わりに滅菌水を加えたものを用意した。各反応に供したクローンが含む遺伝子供与生物の組み合わせは以下の通り。
１：Alternaria alternata＋Dermatophagoides farinae
２：Cladsporium sphaerospermum＋Dermatophagoide pteronyssinus
３：Eurotium herbariorum ＋Tyrophagus putrescentiae
In this example, two subclones (one mite and one mold) in which the ITS region as a target region was cloned as the template DNA at the Xcm I site of pXcmkn12 were each adjusted to a final concentration of 0.5 ng / μl. Added. A control was prepared by adding sterilized water instead of DNA. The combinations of gene donor organisms included in the clones subjected to each reaction are as follows.
1: Alternaria alternata + Dermatophagoides farinae
2: Cladsporium sphaerospermum + Dermatophagoide pteronyssinus
3: Eurotium herbariorum + Tyrophagus putrescentiae
本実施例において、1-tube PCR における増幅断片の標識にはDIG ラベルを使用した。本実施例では、表１０及び１１に示す条件でPCRを行った。 In this example, a DIG label was used for labeling the amplified fragment in 1-tube PCR. In this example, PCR was performed under the conditions shown in Tables 10 and 11.
本実施例で行った1-tube PCRの後、反応液を電気泳動に供した結果を図３に示す。図３に示すように、カビ由来の鋳型DNAとダニ由来の鋳型DNAが共存した場合であっても、それぞれ目的とするDNA断片が増幅されていることが確認された。また、図３に示すように、ダニ遺伝子特異的プライマー（Acari ITS1及びAcari ITS2 R）を使用することによって、複数種のダニおいて所望のDNA断片が増幅されていることが確認された。同様に、カビについても、カビ遺伝子特異的プライマー（ITS1-F及びFO514）を使用することによって、複数種のカビにおいて所望のDNA断片が増幅されていることが確認された。したがって、本実施例で使用したダニ遺伝子特異的プライマー及びカビ遺伝子特異的プライマーは、本発明に係るシステムにおいて検査及び識別対象のダニ類及びカビ類に由来する検査対象DNA領域を増幅するのに使用できることが明らかとなった。これらダニ遺伝子特異的プライマー及びカビ遺伝子特異的プライマーは、複数種類のダニ類及びカビ類に対して使用することができる非常に有用なプライマーであるといえる。 The results of subjecting the reaction solution to electrophoresis after 1-tube PCR performed in this example are shown in FIG. As shown in FIG. 3, even when the mold-derived template DNA and the mite-derived template DNA coexist, it was confirmed that each of the target DNA fragments was amplified. Moreover, as shown in FIG. 3, it was confirmed that a desired DNA fragment was amplified in multiple types of mites by using tick gene-specific primers (Acari ITS1 and Acari ITS2 R). Similarly, for mold, it was confirmed that a desired DNA fragment was amplified in multiple types of molds by using mold gene-specific primers (ITS1-F and FO514). Therefore, the tick gene-specific primer and the mold gene-specific primer used in this example are used to amplify the test DNA region derived from the mites and molds to be tested and identified in the system according to the present invention. It became clear that we could do it. These mite gene-specific primers and mold gene-specific primers can be said to be very useful primers that can be used for a plurality of types of mites and molds.
Claims (2)
（a）配列番号５６に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号５７に示す塩基配列からなるプライマーとのセット
（b）配列番号５６に示す塩基配列において１〜５個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるプライマーと配列番号５７塩基配列において１〜５個の塩基を置換、欠失又は付加した塩基配列からなるからなるプライマーとからなり、上記（a）のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット
（c）配列番号５６に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーと配列番号５７に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるプライマーとからなり、上記（a）のプライマーセットと同一の領域を増幅できるプライマーのセット The following (a), (b), or (c) can be used to amplify a detection target DNA region that enables detection and identification of the tick using the mite genomic DNA or mRNA collected from the test target as a template. ) Tick gene-specific primer set.
(A) A set of a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 56 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 57 (b) Substituting, deleting or deleting 1 to 5 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 56 A region consisting of a primer consisting of an added base sequence and a primer consisting of a base sequence obtained by substituting, deleting or adding 1 to 5 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 57, and the same region as the primer set of (a) above (C) a primer consisting of a nucleic acid fragment capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 56, and SEQ ID NO: 57 Nucleic acid capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid fragment consisting of a base sequence complementary to the indicated base sequence A set of primers consisting of fragments and capable of amplifying the same region as the primer set (a) above
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