JP4414755B2 - ｓｅｓ−１の同定、およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、ｓｅｓ−１または変異ｓｅｓ−１をコードする単離された核酸分子、これら核酸分子を含むベクター及びトランスジェニック生物、医薬製造およびモデル生物生産のためのこれら核酸分子の使用、ｓｅｓ−１活性を改変する物質、または、プレセニリン活性（例えばｓｅｌ−１２またはｈｏｐ−１の活性）をそれぞれ増加させる物質を同定する方法におけるトランスジェニック生物の使用、ならびに対応するＳＥＳ−１タンパク質および変異ＳＥＳ−１タンパク質、同様に、これらタンパク質が産生する抗体に関する。その上、本発明は、アルツハイマー病を治療するためのヒトプレセニリンの発現を増加させる物質の使用、およびこれら物質それ自体、ならびにこれら物質を含む医薬組成物に関する。

パーキンソン病に加えて、最もよく知られた神経変性疾患としてアルツハイマー病がある。アルツハイマー病の特徴は、神経タンパク質の凝集の発達（プラークと称される）であり、これは実質的に、アミロイドβ−ペプチド（Ａβ４）と称されるサイズが４ｋＤａの不溶性のペプチドから成る。ここ数年で行われた調査によれば、Ａβ４の形成が、原因として病気の進行に関与することが示唆される。３つの遺伝子における優性変異が、病気の家族性形態（ＦＡＤ，家族性アルツハイマー病）をもたらす。関連する遺伝子の一つが、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードし、ＡＰＰは３種のプロテアーゼでプロセシングされ、その結果として特にＡβ４が形成されるということがわかっている。ＡＰＰにおけるＦＡＤ変異により、生産されるＡβ４２（４２個のアミノ酸長のＡβ４変異体）の量が増加する。

アルツハイマー病が発症する家族の分子遺伝学的調査により、ヒト遺伝子プレセニリン１およびプレセニリン２が同定され（Ｒｏｇａｅｖ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｎａｔｕｒｅ ３７６，７７５−７７８；Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：９７３−９７７）これらが特定の変異により改変された場合、原因としてアルツハイマー病の発症に関与し、これはまた、病気の進行の際に、ノッチシグナル伝達経路において主要な役割を果たす。プレセニリンタンパク質はＥＲ−ゴルジに存在し、少なくとも６回膜貫通ドメインを有する。ＰＳ１およびＰＳ２における変異が、Ａβ４の形成に影響を及ぼし、おそらくアミロイド沈着が形成されることによりアルツハイマー病発症に関与するということがわかっている。プレセニリンファミリーのメンバーは、特に、マウス、キイロショウジョウバエ、アフリカツメガエル、および、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓで同定されている。ヒトにおいて変異プレセニリンはＡＰＰのプロセシングに影響を与えるが、ヒトにおけるそれらの天然の機能は、詳細にはわかっていない；それらはＡＰＰプロテアーゼ（γ−セクレターゼ）として機能する可能性があると仮定されている。ヒト細胞培養物で行われたその他の調査によれば、プレセニリンは、それらがリガンド結合により活性化された後の細胞内のノッチ様受容体のタンパク質分解において役割を果たすということが示されている。それゆえに、プレセニリンが、少なくとも２種の異なる膜タンパク質（ＡＰＰおよびノッチ）のプロセシングに関与すると考えられる。目下、プレセニリンそれ自体がこのプロセシングにおいてプロテアーゼであるのかどうか、または、それらがこれら反応の補因子なのか、もしくは間接的にタンパク質分解に影響を与えるのかについて物議を醸している（Ｈａａｓｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６（５４４１）：９１６−９１９）。

上述のプレセニリン遺伝子を出発点として、分子レベルの病気のプロセスを明らかにし、アルツハイマー病を治療および予防するための医薬を開発するために集中的なリサーチが行われている。プレセニリン遺伝子の活性に影響を与える因子が探索されており、特に、この点において、プレセニリン変異体表現型のサプレッサーの探索が特に重視されている。サプレッサーは、プレセニリン機能の必要性を除去するその他の遺伝子における変異であってもよいし、または、プレセニリン変異体の欠陥が表現型の結果にいかなる影響も及ぼさないようにその他の遺伝子またはプレセニリンの活性を調節する物質であってもよい。

線虫、特にＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓは、このような調査における好ましいモデル生物として頻繁に用いられてきた。線虫モデル、特にＣ．ｅｌｅｇａｎｓモデルの利点は、特に、ハイスループット法（ＨＴＳ；ハイスループットスクリーニング）に適していること、世代時間が短いために（２〜３日）速い遺伝分析が可能であること、および、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの神経系の分子および機能的特性の知識が詳細であることにある。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓはマイクロタイタープレート上で維持できるために、この試験系を用いて、ＨＴＳにより１００００またはそれ以上の物質を、生きた線虫において短い期間で試験することが可能である。

これまでのところ、ｓｅｌ−１２、ｈｏｐ−１およびｓｐｅ−４と指定される３種のプレセニリン遺伝子が線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓで同定されている。ｓｐｅ−４は、最も分岐したファミリーメンバーである。ｓｐｅ−４における変異により、精子形成の際の細胞質分配において異常が生じる（Ｌ’Ｈｅｒｎａｕｌｔ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．１９９２，Ｊ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１９：５５−６８）。ｈｏｐ−１における変異は目に見える表現型を全く示さないが、その変異とｓｅｌ−１２の変異とを組み合わせると、合成的な致死性の表現型がもたらされる（Ｌｉ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：１２２０４−１２２０９）。ｓｅｌ−１２は、ヒトＰＳ１およびＰＳ２に最もよく似た遺伝子であり、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて最もよく研究されたプレセニリン遺伝子でもある。特定のｓｅｌ−１２変異体は産卵異常を示し、さらに産卵口発達における形態学的変化も示すということがわかっている（Ｌｅｖｉｔａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｎａｔｕｒｅ ３７７：３５１−４）。ｓｅｌ−１２はヒトプレセニリンと５０％同一であり、ｓｅｌ−１２変異体における産卵異常は、ｓｅｌ−１２プロモーターからＰＳ１またはＰＳ２が遺伝子導入により発現させることにより相殺される（Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ.，１９９７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ １：１４９−１５９）。これは、ＰＳ１およびＰＳ２が、ｓｅｌ−１２と機能的に相同であることを示している。当初は、ｓｅｌ−１２変異は、ｌｉｎ−１２およびｇｌｐ−１ノッチ受容体遺伝子における機能獲得型突然変異体の複数の産卵口の表現型のサプレッサーとして同定された。ノッチ受容体は、多くの多細胞生物における細胞運命の決定を制御する。加えて、ｓｅｌ−１２変異体の表現型が、ｌｉｎ−１２の弱い機能喪失型変異体の表現型と類似していることが示されている。要約すれば、哺乳動物など多数の生物におけるノッチシグナル伝達においてプレセニリンは重要な役割を果たすと言える。

そこで本発明の発明者等は、驚くべきことに、他の遺伝子における特定の変異（例えば図１で示される）、すなわち本発明者により初めて同定されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓのｓｅｓ−１遺伝子における変異が、欠陥、特にｓｅｌ−１２変異体の産卵異常を抑制することができることを見出した。これは、ｓｅｓ−１遺伝子における特定の変異により、例えば、特定のｓｅｌ−１２変異により生じる産卵異常が除去され、二重変異体（ｓｅｌ−１２^-；ｓｅｓ−１^-）が再び正常な野生型表現型を示すようになることを意味する。より詳細な調査によれば、ｓｅｓ−１遺伝子におけるこれら変異により、ｓｅｌ−１２変異体において、ｈｏｐ−１が活性化されるようになり、すなわちｈｏｐ−１プレセニリンタンパク質が、欠陥ｓｅｌ−１２プレセニリンタンパク質の機能に取って代わることが示された。

本発明の発明者により、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのゲノムにおいて新規のｓｅｓ−１遺伝子の位置決定がなされ、さらに、それを配列決定した。

その結果として、本発明はまず、ＳＥＳ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子に関し、および、変異ＳＥＳ−１タンパク質をコードする他の核酸分子に関する。

これに加えて、本発明は、これら単離された核酸分子、またはそれらの断片を含むベクターに関する。

その上、本発明は、前記核酸分子によりコードされたＳＥＳ−１タンパク質および変異ＳＥＳ−１タンパク質またはそれらの断片に関し、および、これらタンパク質を用いて生産された抗体に関する。

加えて、本発明は、ＳＥＳ−１タンパク質または変異ＳＥＳ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト生物に関する。特に、本発明は、ｓｅｓ−１の活性を減少させ、ｓｅｌ−１２またはｈｏｐ−１の活性をそれぞれ増加させるｓｅｓ−１対立遺伝子を示すトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物に関する。この点において、トランスジェニック生物は、ゲノムが変異により改変され、その結果として変異ｓｅｓ−１遺伝子が示される、または、ｓｅｓ−１遺伝子が除去された生物と理解される。

最後に、本発明は、アルツハイマー病に向けられた医薬を製造するため、および、この病気をさらに調査するためのモデル系を作製するためのこれら核酸分子の使用に関する。

特に、本発明は、ｓｅｓ−１の活性を減少させる物質またはｓｅｌ−１２またはｈｏｐ−１の活性をそれぞれ増加させる物質を同定および／または特徴付ける方法における、トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓの使用に関する。

その上本発明はまた、アルツハイマー病を治療するためのヒトプレセニリン１または２の発現を増加させる物質の使用、および、これら物質それ自体、および、これら物質を含む医薬組成物に関する。

発明の詳細な説明
本発明は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて新規の遺伝子ｓｅｓ−１を同定することができたという事実に基づき、この遺伝子は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓプレセニリン遺伝子ｓｅｌ−１２およびｈｏｐ−１と相互作用し、それによりアルツハイマー病の進行において重要な役割を果たす。

従って、ｓｅｓ−１遺伝子の完全な欠失もまた含むｓｅｓ−１遺伝子における様々な変異は、ｓｅｌ−１２変異が抑制されることにより引き起こされる特定の改変された表現型を生じる。ｓｅｓ−１変異体におけるこれらｓｅｌ−１２の欠陥の抑制は、ｈｏｐ−１発現を後半に目立って活性化すること、および、ＨＯＰ−１タンパク質がおそらく欠陥ＳＥＬ−１２タンパク質の機能に取って代わることが可能なことにより達成される。

同定されたｓｅｓ−１遺伝子は、７個以下の予想のＣ２Ｈ２ジンクフィンガードメインと、核局在化シグナルとして作用する可能性のある２つの領域とを含む（図４）。

ＢＬＡＳＴプログラムを用いてその配列とＧｅｎｂａｎｋデータベースとを比較したところ、推定のＳＥＳ−１タンパク質は、他の既知タンパク質のどれとも明白な類似性を示
さなかった。かろうじてジンクフィンガードメインも含む多種多様なタンパク質とわずかな類似性を示したに過ぎなかった。

その結果として、本発明は、ＳＥＳ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。

その上、本発明は、変異ＳＥＳ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子を含む。特に、本発明は、図１で示される少なくとも１つの変異を含む変異ＳＥＳ−１タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。

これに加えて、本発明の他の観点は、単離された核酸分子、特にＤＮＡ分子、例えばｃＤＮＡ分子またはゲノムＤＮＡ分子、さらにＲＮＡ分子に関し、これらは、例えば、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＳＥＳ−１タンパク質をコードし、特に、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６で示される核酸配列を示す核酸分子である。

本発明はまた、ヌクレオチド配列が、上述の核酸分子と、少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列類似性を示し、特にストリンジェントな条件下で上述の核酸分子とハイブリダイズする単離された核酸分子を含む。このようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、低いストリンジェンシー条件で起こり；他の実施形態においては、高いストリンジェンシー条件下でも起こる。本明細書においては、低いストリンジェンシーの条件は、３×ＳＳＣ中の、室温〜６５℃でのハイブリダイゼーションを意味するものと理解され、高いストリンジェンシーの条件は、０.１×ＳＳＣ中の、６８℃でのハイブリダイゼーションを意味するものと理解される。ＳＳＣとは、０.１５Ｍ塩化ナトリウム、０.０１５Ｍクエン酸三ナトリウム緩衝液の略語である。

配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６で示される核酸配列に類似した核酸配列を有する本発明に係る核酸分子はまた、特に所定の核酸配列の対立遺伝子変異体を含み、この変異体は、特に上述の変異を含む。

本発明はまた、それぞれの場合において上述の核酸配列に相補的な核酸配列を含む核酸分子にも及ぶ。

本明細書において、用語「単離された核酸分子」は、初発細胞または生産細胞から生じた性質が異なる核酸分子の主な量から実質的に精製された形態で存在する核酸分子を意味する。しかしながら、本発明に係る単離された核酸分子の調製物は、その他の成分、例えば塩、培地からの物質または生産細胞の残留成分、例えば様々なタンパク質を含んでいてもまったく問題がない。

本発明はまた、ＳＥＳ−１タンパク質または変異ＳＥＳ−１タンパク質をコードする本発明に係る核酸分子を含むベクターを含む。本発明はまた、本発明に係る核酸分子の断片を含むベクターを含む。この点において、該核酸分子は、発現のために用いられる生物で該核酸分子を発現させるプロモーターに連結される。この点において、既知のＣ．ｅｌｅｇａｎｓプロモーターの一つ（http://chinook.uoregon.edu/promoters.html）が、特にＣ．ｅｌｅｇａｎｓで発現させるために用いられる。

ベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、ウイルスまたはバクテリオファージが可能である。

他の観点は、上記核酸分子でコードされたポリペプチドまたはタンパク質、特に配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＳＥＳ−１タンパク質、および、上述の変異ＳＥＳ−１タンパク質に関し、また、アミノ酸の置換、修飾、欠失、挿入または付加によりそれらから誘導され、かつ、上述のアミノ酸配列と、少なくとも７５％、特に少なくとも８０％、特に少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列類似性を示すポリペプチドまたはタンパク質に関する。本発明はまた、融合タンパク質を含み、該融合タンパク質は、性質が異なるタンパク質または性質が異なるタンパク質セグメント（例えばマーカータンパク質または指標タンパク質）に融合した本発明に係るポリペプチド、タンパク質またはタンパク質断片を含む。本発明はまた、上述のタンパク質またはポリペプチドの断片を含む。

同様に、これらタンパク質を用いて得られ、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る抗体も本発明に含まれる。

本発明はまた、トランスジェニック生物、特に微生物、例えば細菌、ウイルス、原生動物、菌類および酵母、藻類、植物または動物、ならびに、部分（例えば細胞）、ならびに、これらトランスジェニック生物からの繁殖のための物質（例えば種子）にも及び、該トランスジェニック生物は、必要に応じて染色体または染色体外に組み込まれる組換え核酸配列を含み、この組換え核酸配列は導入遺伝子としてＳＥＳ−１タンパク質もしくは変異ＳＥＳ−１タンパク質またはそれらの断片をコードする本発明に係る核酸分子を含む。好ましい観点において、トランスジェニック生物はまた、上述の導入遺伝子でコードされたポリペプチドまたはタンパク質、すなわちＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＳＥＳ−１タンパク質またはそれらから誘導されたポリペプチドもしくはタンパク質を発現し得る。

本発明の一つの観点によれば、トランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物は、ｓｅｓ−１の活性を減少させるか、増幅させるか、または除去するｓｅｓ−１対立遺伝子を示す。本発明はまた、ｓｅｓ−１遺伝子が完全に除去されたトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物を含む。特に、本発明は、ｓｅｌ−１２変異体における産卵異常表現型（Ｅｇｌ）を相殺するｓｅｓ−１対立遺伝子を示すトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物に関する。加えて、本発明は、ｈｏｐ−１またはｓｅｌ−１２の活性を増加させるｓｅｓ−１対立遺伝子を示すトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物に関する。

本発明はまた、神経疾患、特に神経変性疾患、特に好ましくはアルツハイマー病を治療するための医薬を製造するため、または、神経疾患、特に神経変性疾患のさらなる調査および解明のためのモデル生物を作製するための、本発明に係る核酸分子の使用を含む。

上述の医薬は、例えば、遺伝子治療剤として本発明に係る核酸分子自体を用いることにより、または、このような核酸分子を用いてモデル生物を構築し、このモデル生物を用いて見出された物質を製剤化することにより得ることができる。これに関するさらなる詳細については、読者は、例えば同出願人が所有する国際出願ＰＣＴ／ＥＰ０１／０３２１４を参照することができる。

特に、本発明は、ｓｅｓ−１の活性を改変する、特に減少または除去する物質を同定および／または特徴付ける方法における、本発明に係る核酸分子を含むトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物の使用に関する。その上、本発明は、ｈｏｐ−１またはｓｅｌ−１２の活性を増加させる物質を同定および／または特徴付ける方法における、本発明に係る核酸分子を含むトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物の使用に関する。

その上、本発明は、アルツハイマー病を治療および／または予防するための活性化合物
として用いることができる物質を同定および／または特徴付ける方法における、この同じトランスジェニックＣ．ｅｌｅｇａｎｓ生物の使用に関する。ヒト細胞との類似性を考慮し、さらに、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびヒトにおいて実証されたノッチシグナル経路およびプレセニリン機能の機能的類似性という背景において、ＦＡＤプレセニリン変異体の機能不全は、ヒトにおけるｓｅｓ−１と相同または機能的に同等な遺伝子に変異を入れることにより同じような方法で相殺され得ると考えられる。それゆえに、本発明の内容において、ヒトｓｅｓ−１相同体または機能的に同等な遺伝子における欠陥により、ＦＡＤ変異により影響を受けないプレセニリン遺伝子の発現が増加すると予想される。

それゆえに、本発明はまた、アルツハイマー病を治療するためのヒトプレセニリンの発現を増加させる物質の使用、および、これら物質それ自体に関する。特に、本発明に係る物質としては、ヒトプレセニリン遺伝子１またはプレセニリン遺伝子２を活性化し、ヒトプレセニリンタンパク質１またはヒトプレセニリンタンパク質２の発現を増加させる物質が挙げられる。また、本発明に係る物質としては、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいてｓｅｓ−１の活性を変化させる物質、および／または、ｓｅｌ−１２またはｈｏｐ−１プレセニリン活性を増加させる物質も挙げられる。本発明はまた、これら物質を含む医薬組成物も含む。

類似の様式において、本発明はまた、年齢依存性であり変異とは関連しない散発性のアルツハイマー病ケースの治療においても利点を有する可能性がある。この点において、発現の減少により、プレセニリン活性が増加することによりＡβ４、特にＡβ４２の形成を減少させ、それにより、年代順に病気の発症を遅らせることができると予想される。

図面および配列表の簡単な説明
図１：ｓｅｓ−１変異である。
図２：ｈｏｐ−１特異的プローブとハイブリダイズしたノーザンブロットである。
図３：発見されたｓｅｓ−１のｍＲＮＡの５’末端である。
図４：ＳＥＳ−１タンパク質に関するドメイン構造の予想である。

配列番号１：長い形態のＳＥＳ−１のアミノ酸配列である。
配列番号２：短い形態のＳＥＳ−１のアミノ酸配列。
配列番号３：ＡＴＧ〜停止の長い形態のＳＥＳ−１タンパク質をコードするｃＤＮＡ（ｙｋ６４ｅ９）。
配列番号４：ＡＴＧ〜停止の短い形態のＳＥＳ−１タンパク質をコードするｃＤＮＡ（ｙｋ２４７ｅ５）。
配列番号５：ＡＴＧ〜停止の長い形態のＳＥＳ−１タンパク質をコードするｃＤＮＡ（ｙｋ６４ｅ９）、および、非コーディング３’末端領域である。
配列番号６：ＡＴＧ〜停止の長い形態のＳＥＳ−１タンパク質をコードするｃＤＮＡ（ｙｋ６４ｅ９）、および、非コーディング３’末端領域である。
配列番号７：ｐＢｙ１０１５の配列である；このセグメントは、ｓｅｓ−１ヌル変異体の欠陥を補足する。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。

ｓｅｓ−１変異体の単離
公開された方法（ｅｌｅｇａｎｓ．ｓｗｍｅｄ．ｅｄｕ）に従ってＥＭＳおよびＵＶ／ＴＭＰ変異誘発を行った。ｓｅｌ−１２サプレッサーを同定するために、Ｌ４段階のｓｅｌ−１２変異体を突然変異誘発要因（例えばエチルメタンスルホネート）に晒し、再回復期の後、４または５のグループで、９ｃｍのペトリ皿にプレーティングした。全ての試験
において、変異誘発後のＦ２段階で動物の産卵を分析した。Ｓｅｌ−１２ヌル変異体は、通常は全く産卵しなかった。単離された動物のＦ３世代を再び試験し、両方の世代において成体動物あたり少なくとも５個の卵を産んだ動物を単離した。この方法において、ホモ接合型サプレッサー系を得た。バックグラウンド変異を除去するために、すべての変異を野生型動物と数回戻し交雑した。強力なサプレッサー変異により、ｓｅｌ−１２ヌル変異体がホモ接合型であるにもかかわらず野生型動物の産卵行動に匹敵する動物の産卵行動を示した。このようなサプレッサー変異の一つをｓｅｓ−１変異と名付けた。一般的に、ｓｅｓ−１／ｓｅｓ−１２二重変異体は、動物あたり約２５０−３５０個の卵を産む。

ｓｅｓ−１表現型
ｓｅｓ−１における変異は、ｓｅｌ−１２変異体の産卵異常を完全に抑制する。立体顕微鏡検査によれば、ｓｅｌ−１２産卵異常の３つの観点を区別することができる。全てのｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）動物の約７５％が顕著な産卵口の隆起を示し、これは、隆起した産卵口の表現型（Ｐｖｌ）として知られている。この欠陥の正確な理由は報告されていない。実質的に全てのｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）動物は、同等の野生型動物が有するより多くの卵を子宮に有しており、すなわち同等の野生型動物の一定の卵の数は約１５であるのに対し、ｓｅｌ−１２の場合の卵の数は〜６０個である。これにより動物が膨張するが、すなわちこれはＥｇｌ表現型と説明される。卵は子宮に蓄積され、胚は子宮内で孵化し、母体で発生を続けるが、全てのケースの実質的に１００％において、これらはこれに関連して成熟前に死亡する。表現型は、「ｂａｇ−ｏｆ−ｗｏｒｍｓ」表現型と名付けられた。非常に珍しいホモ接合型ｓｅｌ−１２培養において野生型動物はほとんどめったに観察されない。ｓｅｓ−１変異は、このｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）表現型の全ての３つの観点を実質的に完全に抑制する。ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）；ｓｅｓ−１動物は、野生型動物よりわずかに小さく、正常な動物よりも子宮中の卵は少ない（弱いＥｇｌ−構成的表現型）。これは、二重変異体における産卵が、わずかに過剰刺激されていることを示す。ｓｅｓ−１対立遺伝子動物はまた、説明された全てのその他のｓｅｌ−１２変異の産卵異常を抑制する。これは、ｓｅｓ−１変異が対立遺伝子特異的な方法で作用しないことを証明する。

ｓｅｓ−１遺伝子座のクローニング
ｓｅｓ−１を染色体Ｘ左腕においてマッピングした。これに関して、ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）ｓｅｓ−１系を、遺伝子マーカー変異を用いて位置付け、産卵欠陥（Ｅｇｌ）組換え動物を単離し、試験していくつのこれら動物がマーカー変異を受け入れたかを決定した。ｓｅｓ−１をより詳細にマッピングするために、系におけるｓｅｓ−１変異の存在／非存在をｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）産卵異常の抑制により調べた。これに関して、ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）ｓｅｓ−１の雌を、ＡＢ二重変異体系（ＡおよびＢは、遺伝子地図上でｓｅｌ−１２の右に位置する２つの変異であり、Ｂは、２つのマーカーの右側にある）と交雑した。次に、Ｂのみの組換え体でありＡ変異を有さない組換え体を探した。この組換え法の結果として、全ての組換え体は、二重組換えを有する組換え体を除いて、ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）を含むはずである。一連の交雑実験により、ｓｅｓ−１は、ｄｐｙ−２３（ｅ８４０）とｌｉｎ−２（ｅ６７８）との間、ｄｐｙ−２３（ｅ８４０）からｌｏｎ−２までの距離の約１／５にマッピングされた。すべての実験により、ｓｅｓ−１変異が機能の損失を引き起こすことが示された。これを実証するために、２つの自由な重複（ｆｒｅｅ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）によりｓｅｓ−１変異を位置付けた。ｓｅｓ−１対立遺伝子ｂｙ１０８およびｂｙ１０９変異は互いに補足しあわないが、両方とも染色体Ｘ左腕に２つの異なる遺伝子における変異を示す可能性があった。この理由として、当初、ｂｙ１０８およびｂｙ１０９は、それぞれ独立してマッピングされた。マッピングを確かめるために、２つの重複、すなわちｍｎＤｐ３１およびｍｎＤｐ３２を、系ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）ｓｅｓ−１（ｂｙ１０８）ｌｏｎ−２（ｅ６７８）にトランスファーさせ、産卵について試験した。

Ｘ染色体上にｓｅｓ−１遺伝子の２つの変異コピーを有し、また染色体外アレイＤＮＡ上に野生型コピーを有する系ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）ｓｅｓ−１（ｂｙ１０８）ｌｏｎ−２（ｅ６７８）；ｎＤｐ３１は、完全なｓｅｓ−１野生型表現型を有し、これは、試験された変異体が機能喪失型変異体であることを証明する。直線的にデータを挿入することにより、ｓｅｓ−１をｄｐｙ−２３（ｅ８４０）の左側へ約５０ｋｂに位置付け、その後、この染色体領域のコスミドを用いてトランスジェニック抑制を試験した。

ｓｅｓ−１欠陥の導入遺伝子レスキュー
導入遺伝子を、系ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）ｓｅｓ−１（ｂｙ１０８）に注入し、トランスフェクトされたクローンの抗サプレッサー活性を試験した。形質転換マーカーとして、１μｌあたり１００ｎｇのｐＲＦ４、１μｌあたり２０ｎｇのｐＢＹ２１８と共に、すべてのクローンを濃度２０ｎｇ／μｌで注入した。コスミドＦ４６Ｈ６の注入によりｓｅｓ−１表現型は、完全に相殺された（レスキューされた）。その後、ｓｅｓ−１遺伝子の同一性を明らかにするために、このコスミドからのＦ４６Ｈ６サブクローン、精製された制限断片およびＰＣＲ産物を試験した。

Ｆ４６Ｈ６サブフラグメントの単離
様々な制限酵素でＦ４６Ｈ６を切断した。サブフラグメントをＱｉａｑｕｉｃｋゲルエクストラクションキットを用いて精製した。２１.５ｋｂのＮｃｏＩ断片および０.２ｋｂのＢａｍＨＩ断片（プラスミドｐＢＹ１０１５中）を直接注入し、（両方の）表現型をレスキューした。最小のレスキューを示す断片は、４ｋｂの配列に減少された。このセグメントは、多数のジンクフィンガーを有するタンパク質をコードする１つの遺伝子のみを含む。

ｓｅｓ−１の構造
ｓｅｓ−１の２つのｃＤＮＡを同定したところ、１.９ｋｂおよび２.１ｋｂの配列であった。２つのｃＤＮＡは、同一のＤＮＡ配列およびエキソン−イントロン境界を含み、ただし以下の点において異なる：大きいほうのクローンは追加のイントロンを有するが、小さいほうのクローンは６塩基だけ長い５’末端を有する（これについては図３を参照）。

配列決定されたｃＤＮＡは、データベースで予想された遺伝子とはいくつかの位置で異なる。第一の点で、見出された５’末端は、コンピューター分析で予想されたものより相当に短い。第二の点で、コスミドＦ４６Ｈ６およびＣ０７Ａ１２（隣のコスミド）における領域の、インターネットで公開された両方のｃＤＮＡとゲノム配列との間で配列の差異が見出された（図３）。

加えて、ｓｅｓ−１は、ＳＬ１リーダー配列にトランススプライシングされる。ＳＬ１特異的産物を配列決定した。リーダー配列が、２つの予想されたｃＤＮＡの５’末端の５’に隣接して連結されることがわかった。ノーザンブロット実験において、長いほうのｃＤＮＡの場合、全てのＣ．ｅｌｅｇａｎｓ発生段階で検出することができるバンドだけが見出された。短いほうのｃＤＮＡは、人工物であってもよく、あるいは、少量の検出不可能な量でしか出現しない可能性があるが、それでも生物活性をよく示し得る。

細胞内の位置
ｓｅｓ−１融合遺伝子をバキュロウイルスＳＦ９細胞系で発現させ、免疫染色で位置を同定した。ｓｅｓ−１は、細胞核に位置しており、これは、その予想された転写因子としての役割に一致する。

発現
ノーザンブロット分析によれば、ｓｅｓ−１転写物が、全ての発生段階で発現されることが示された（図２）。

ｓｅｓ−１ヌル表現型
ｂｙ１３１は、ｓｅｓ−１機能を全く示すことができない変異体である（遺伝子全体の欠失）。しかしながら、この欠失はまた、隣の遺伝子も欠失している。ｂｙ１３５は、説明されたようにリーディングフレームシフトを起こし、それゆえに、最も強力なｓｅｓ−１変異体であるだろう。ｓｅｓ−１（ｂｙ１３５）およびｂｙ１３１動物を調査した。両方の系は、形態学的に、かつそれらの産卵行動に基づき、両方とも野生型の表現型である。２種の動物の子孫の数は、野生型よりいくらか少ない。両方の対立遺伝子は、全ての対立遺伝子のｓｅｌ−１２表現型を完全に抑制し、さらに野生型の子孫数を有するｓｅｌ−１２対立遺伝子をもたらす。それゆえに、ｓｅｓ−１は、ｓｅｌ−１２の特異的なサプレッサーであると結論付けることができる。ｓｅｌ−１２変異体またはｓｅｌ−１２、ｈｏｐ−１二重変異体の全ての欠陥は、ｌｉｎ−１２およびｇｌｐ−１ノッチシグナル伝達経路におけるこれらプレセニリンの効果による可能性がある。

ｓｅｓ−１は核で発現される遺伝子であり、転写因子として作用し得るために、ｓｅｓ−１変異が、ｌｉｎ−１２／ｇｌｐ−１ノッチシグナル伝達経路のその他の遺伝子の転写を改変させられるかどうかを決定するために調査した。発生段階特異的ＲＮＡを野生型および様々なｓｅｓ−１変異体系から単離し、ノーザンブロットで分析した。サンプルをｈｏｐ−１のｃＤＮＡとハイブリダイズさせることにより試験した。ｈｏｐ−１は、野生型動物の卵中で強く発現されるが、Ｌ１幼生段階ではほとんど検出不可能である。発現は、Ｌ２段階から成体段階にかけてゆっくり増加し、成体動物においてピークに達する。ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）動物において、ｈｏｐ−１の発現は、大体において同一であった。ｓｅｌ−１２（ａｒ１７１）ｓｅｓ−１（ｂｙ１３５）動物およびｓｅｓ−１（ｂｙ１３５）動物において、発現は、一つの段階において顕著に異なった：Ｌ１段階でｈｏｐ−１を検出することが可能であることは明らかである。Ｌ１段階におけるｈｏｐ−１発現はまた、ｓｅｓ−１対立遺伝子ｂｙ１０８およびｂｙ１３６においてかなり多かった。これは、ｓｅｓ−１変異体は、ｈｏｐ−１発現を著しく抑制することによってｓｅｌ−１２欠陥の抑制を達成し、ＨＯＰ−１タンパク質は、おそらく欠陥ＳＥＬ−１２の機能を担う可能性があることを意味する。

ｓｅｓ−１変異である。 ｈｏｐ−１特異的プローブとハイブリダイズさせたノーザンブロットである。 発見されたｓｅｓ−１のｍＲＮＡの５’末端である。 ＳＥＳ−１タンパク質に関するドメイン構造の予想である。

Claims (14)

1. ｈｏｐ−１の発現を抑制するか、および／またはその除去がｈｏｐ−１の発現の増加をもたらすタンパク質をコードする単離された核酸分子であって、該核酸分子は配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６で示されるヌクレオチド配列を有する、核酸分子。
2. ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
3. ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子またはゲノム分子である、請求項２に記載の単離された核酸分子。
4. タンパク質が、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸分子の変異体であって、以下の変異：
   ａ） 配列番号１の少なくとも４９４位から前方のアミノ酸を欠失している、Ｃ末端部が短縮されるようにコードされたタンパク質を生じさせる変異；
   ｂ） 配列番号３の核酸の＋１７８４位におけるＧからＡへの変換；および
   ｃ） 配列番号１のコードされたタンパク質の５９５位でＣの代わりにＹが存在するようにする変異；
   の１またはそれ以上を含み、該変異はｓｅｌ−１２変異体の産卵異常を修復する、核酸分子。
6. 変異が：
   ａ）配列番号１のコードされたタンパク質の２０９、３８８、４６５または４９４位において翻訳停止が導かれる変異；
   ｂ）配列番号３の核酸の＋１３９３位におけるＣからＴへの変換；
   ｃ）配列番号３の＋１４８１位におけるヌクレオチドＣＡＡからＡＡＣへの転換を生じさせる変異；
   ｄ）配列番号３の核酸の＋１７８４位におけるＧからＡへの変換；
   ｅ）配列番号３の＋５４９位におけるＡの除去；または
   ｆ）配列番号３の核酸の＋１１６３位におけるＴからＡへの変換；
   である、請求項５に記載の単離された核酸分子。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
8. 線虫Ｃ.ｅｌｅｇａｎｓの細胞における発現のためのプロモーターを含む、請求項７に記載のベクター。
9. プラスミド、コスミド、バクミド、ウイルスまたはバクテリオファージである、請求項７または８に記載のベクター。
10. ｈｏｐ−１の発現を抑制するか、および／またはその除去がｈｏｐ−１の発現の増加をもたらす単離されたタンパク質であって、配列番号１または配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の配列の１つを有する核酸によりコードされる、単離されたタンパク質。
11. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト生物。
12. Ｃ.ｅｌｅｇａｎｓである、請求項１１に記載のトランスジェニック非ヒト生物。
13. 神経変性疾患を治療するための医薬を製造するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された核酸分子の使用。
14. 神経変性疾患の調査および解明のための非ヒトモデル生物をトランスジェニック方法により作製するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された核酸分子の使用。

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