JP4409295B2

JP4409295B2 - Ｐｔｘ３遺伝子発現抑制方法

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Publication number: JP4409295B2
Application number: JP2003583400A
Authority: JP
Inventors: 滋森川; 明糸泉; 隆雄浜窪; 龍彦児玉
Original assignee: Kowa Co Ltd; Nissan Chemical Corp
Current assignee: Kowa Co Ltd; Nissan Chemical Corp
Priority date: 2002-04-15
Filing date: 2003-04-11
Publication date: 2010-02-03
Anticipated expiration: 2023-04-11
Also published as: DE60329668D1; AU2003226456A8; ATE445395T1; AU2003226456A1; WO2003086380A1; JP2005522490A; MY137134A; TWI349547B; EP1494661B1; TW200403990A; US20080161348A1; EP1494661A1; US20030195167A1

Description

本発明は、自己免疫疾患、特に慢性関節リウマチの治療に有用なペントラキシン３（pentraxin 3、ＰＴＸ３）遺伝子発現抑制剤に関する。

ＰＴＸ３遺伝子は、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）からインターロイキン−１（ＩＬ−１）によりその発現が誘導される新規な遺伝子として発見された（非特許文献１）。また、ヒト線維芽細胞から腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）によりその発現が誘導される遺伝子（ＴＳＧ−１４遺伝子）が発見された（非特許文献２）が、これは構造解析からＰＴＸ３遺伝子と同一であることが判明した。ＰＴＸ３タンパク質は、その分子構造からＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）や血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）等のいわゆるペントラキシンファミリーに属するが、その生理機能については不明な点が多い。また、ＩＬ−６では誘導されず、さらに産生する細胞種が異なる等の違いにより、ＣＲＰやＳＡＰとは異なる機能を持つことが示唆された（非特許文献３）。

まず、動脈硬化層の形成や虚血性心疾患等の炎症反応への関わりとして、急性心筋梗塞患者においてＰＴＸ３の血中濃度が上昇していること（特許文献４）や、血栓形成に重要な因子である組織因子（Tissue Factor）の発現が、ＰＴＸ３によって上昇することが判明した（非特許文献５）。

最近、ＰＴＸ３遺伝子が慢性関節リウマチ患者の滑膜細胞において恒常的に発現しており、この発現がインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）又はトランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）によって抑制されることが明らかとなった（特許文献６）。また、ＰＴＸ３は、補体成分の一つであるＣ１ｑに結合し、補体経路を活性することから（特許文献７）、自己免疫疾患、特に慢性関節リウマチにおける補体経路を介した障害に関与している。
従って、ＰＴＸ３遺伝子の発現を抑制することにより、自己免疫疾患、特に慢性関節リウマチの進行が抑制され、更には治療に繋がるが、しかしこれまで、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β以外に、ＰＴＸ３遺伝子の発現を抑制する物質は、全く知られていない。
Breviarioら：J. Biol. Chem., 267(31),22190-7（1992） Leeら:J. Immunol., 150(5), 1804-12（1993） J. Biol. Chem., 267(31),22190-7(1992)；動脈硬化, 24(7-8),375-80(1996) Circulation, 102, 636-41(2000) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 22,782-7(2002) Clin. Exp. Immunol., 119(1)，196-202（2000） J. Biol. Chem., 272(52),32817-23（1997）

従って、本発明の目的は、ＰＴＸ３遺伝子の発現を抑制し、自己免疫疾患、特に慢性関節リウマチの治療に有効なＰＴＸ３遺伝子発現抑制剤を提供することにある。

そこで本発明者らは、ヒトの培養細胞系を用いてＰＴＸ３遺伝子発現に影響を及ぼす物質を探索した結果、全く意外にもＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤として知られている下記一般式（１）で表わされる化合物、そのラクトン誘導体又はそれらの塩、特にピタバスタチンカルシウム、アトルバスタチンカルシウムが、ＰＴＸ３遺伝子の発現を抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、次式（１）

（式中、Ｒ¹は有機基を示し、Ｘは-CH₂CH₂-又は-CH=CH-を示し、Ｒ²は水素原子又はアルキル基示す。）

で表わされる化合物、そのラクトン誘導体又はそれらの塩を有効成分として含有するＰＴＸ３遺伝子発現抑制剤を提供するものである。
また、本発明は、上記式（１）で表わされる化合物、そのラクトン誘導体又はそれらの塩及び薬学的に許容される担体を含有するＰＴＸ３遺伝子発現抑制剤組成物を提供するものである。
また、本発明は、上記式（１）で表わされる化合物、そのラクトン誘導体又はそれらの塩のＰＴＸ３遺伝子発現抑制剤の製造のための使用を提供するものである。

本発明によれば、自己免疫疾患、特に慢性関節リウマチの処置に有用なＰＴＸ３遺伝子の発現抑制剤を提供することができる。

本発明で使用する式（１）で表わされる化合物、そのラクトン誘導体及びそれらの塩は、高脂血症治療薬として有用なＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤として知られている化合物であるが、ＰＴＸ３遺伝子発現に作用するか否かにつていは、全く知られていない。

式（１）で表わされる化合物のＲ^１で示される有機基は、置換基を有していてもよい環構造を有する有機基が好ましい。
環構造を有する有機基としては、インドリル基、インデニル基、ピリジル基、ピロロピリジル基、ピラゾロピリジル基、チエノピリジル基、ピリミジル基、ピラゾリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、インドリジル基、キノリル基、ナフチル基、ヘキサヒドロナフチル基、シクロヘキシル基、フェニルシリルフェニル基、フェニルチエニル基及びフェニルフリル基が挙げられ、特にヘキサヒドロナフチル基、インドリル基、ピリジル基、ピリミジル基、ピロリル基及びキノリル基が好ましい。

これらの環構造を有する有機基に置換していてもよい置換基としては、ヒドロキシ基、直鎖、分岐鎖又は環状のアルキル基、アルキルオキシアルキル基、アルキルカルボニルオキシ基、アルキル置換アミノ基、置換アルキルスルホニルアミノ基、置換フェニルスルホニルアミノ基、１個又は２個のアルキル又はフェニル等が置換していてもよいカルバモイル基、ハロフェニル基、アルキルフェニル基、アルコキシフェニル基、フェニル基及びオキソ基が挙げられる。

これらの環構造を有する有機基に置換してもよい置換基のうち、炭素数１〜６の直鎖、分岐鎖又は環状アルキル基、炭素数２〜７のアルキルオキシアルキル基、炭素数１〜４のアシルオキシ基、炭素数１〜４のアルキル置換アミノ基、炭素数１〜４のアルキル置換炭素数１〜４のアルキルスルホニルアミノ基、炭素数１〜４のアルキル置換フェニルスルホニルアミノ基、炭素数１〜４のアルキル置換カルバモイル基、フェニル置換カルバモイル基、フルオロフェニル基、ブロモフェニル基、ヨードフェニル基、メチルフェニル基、エチルフェニル基、メトキシフェニル基、エトキシフェニル基及びフェニル基が好ましく、特にイソプロピル基、シクロプロピル基及びｐ−フルオロフェニル基が好ましい。

Ｒ²で表わされるアルキル基としては、炭素数１〜６の直鎖、分岐鎖又は環状のアルキル基が挙げられる。

ラクトン誘導体は、対応する式（１）で表わされる化合物を、常法のラクトン化法、例えば酸性条件下に付すことにより得られる。

式（１）で表わされる化合物及びそのラクトン誘導体の塩は、生理学的に許容し得る塩であって、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、フェネチルアミン塩等の有機アミン塩及びアンモニウム塩等が挙げられるが、ナトリウム塩、カルシウム塩がより好ましい。

これらの化合物は、例えば米国特許第４，７３９，０７３号及びヨーロッパ特許願公開第１１４，０２７号；ヨーロッパ特許出願公開第３６７，８９５号；米国特許第５，００１，２５５号、第４，６１３，６１０号、第４，８５１，４２７号、第４，７５５，６０６号、第４，８０８，６０７号、第４，７５１，２３５号、第４，９３９，１５９号、第４，８２２，７９９号、第４，８０４，６７９号、第４，８７６，２８０号、第４，８２９，０８１号、第４，９２７，８５１号、第４，５８８，７１５号；及びＦ．Ｇ．Ｋａｔｈａｗａｌａ，ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｖｉｅｗｓ，１１，１２１−１４６（１９９１）、ヨーロッパ特許出願公開第３０４，０６３号；ヨーロッパ特許出願公開第３３０，０５７号、米国特許第５，０２６，７０８号、第４，８６８，１８５号；ヨーロッパ特許出願公開第３２４，３４７号；ヨーロッパ特許出願公開第３００，２７８号；米国特許第５，０１３，７４９号、第５，８７２，１３０号、第５，８５６，３３６号、米国特許第４，２３１，９３８号、米国特許第４，４４４，７８４号、米国特許第４，３４６，２２７号、米国特許第５，３５４，７７２号、米国特許第５，２７３，９９５号、米国特許第５，１７７，０８０号、米国特許第３，９８３，１４０号、日本国特許第２，６４８，８９７号、米国特許第５，２６０，４４０号、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，５，４３７，（１９７７）、日本国特許第２，５６９，７４６号、ヨーロッパ特許第３０４，０６３号及び米国特許第５，８５６，３３６号に記載されている。

本発明のＰＴＸ３遺伝子発現抑制方法の有効成分としては、ロバスタチン（米国特許第４，２３１，９３８号：（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル（Ｓ）−２−メチルブチレート）、シンバスタチン（米国特許第４，４４４，７８４号：（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル２，２−ジメチルブタノエート）、プラバスタチン（米国特許第４，３４６，２２７号：（＋）−（３Ｒ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−７−［（１Ｓ，２Ｓ，６Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−６−ヒドロキシ−２−メチル−８−［（Ｓ）−２−メチルブチリルオキシ］−１，２，６，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−１−ナフチル］ヘプタン酸）、フルバスタチン（米国特許第５，３５４，７７２号：（３ＲＳ，５ＳＲ，６Ｅ）−７−［３−（４−フルオロフェニル）−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸）、アトルバスタチン（米国特許第５，２７３，９９５号：（３Ｒ，５Ｒ）−７−［２−（４−フルオロフェニル）−５−イソプロピル−３−フェニル−４−フェニルカルバモイル−１Ｈ−ピロル−１−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプタン酸）、セリバスタチン（米国特許第５，１７７，０８０号：（３Ｒ，５Ｓ）−エリスロ−（Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−２，６−ジイソプロピル−５−メトキシメチル−ピリジン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸）、メバスタチン（米国特許第３，９８３，１４０号：（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−７−メチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル（Ｓ）−２−メチルブチレート）、ロスバスタチン（米国特許第５，２６０，４４０号、日本国特許第２，６４８，８９７号：７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−（Ｎ−メチル−Ｎ−メタンスルホニルアミノピリミジン）−５−イル］−（３Ｒ，５Ｓ）−ジヒドロキシ−（Ｅ）−６−ヘプテン酸）、ピタバスタチン（米国特許第５，８５６，３３６号、日本国特許第２，５６９，７４６号：（３Ｒ，５Ｓ，６Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−３−キノリル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸及びそれらの塩が好ましく、特にピタバスタチン及びその塩、アトルバスタチン及びその塩が好ましい。

本発明の式（１）で表わされる化合物、そのラクトン誘導体及びそれらの塩は、ヒト細胞においてＰＴＸ３のｍＲＮＡの発現を有意に抑制するので、本発明のＰＴＸ３遺伝子発現抑制剤に有用であり、特に慢性関節リウマチ等の自己免疫疾患の処置に有用である。またＰＴＸ３が関与する実験系の開発、新規な医薬のスクリーニングが可能となる。

本発明における前記化合物（１）、そのラクトン誘導体及びそれらの塩の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与及び静脈内注射剤、筋肉注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等による非経口投与が挙げられる。
またこのような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、この有効成分を単独で、又は他の１種以上の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。

これらの投与形態のうち、経口投与が好ましい。経口投与用製剤の調製にあたっては、有効成分の安定性を考慮してｐＨを調整（特開平２−６４０６号、日本国特許第２，７７４，０３７号、ＷＯ９７／２３２００号等）するのが好ましい。

これらの医薬の投与量は、患者の体重、年齢、性別及び症状によって異なるが、通常成人の場合、式（１）で表される化合物として、一日０．０１〜１０００mg、特に０．１〜１００mgを、１回又は数回に分けて経口投与又は非経口投与するのが好ましい。

以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）又はヒト冠状動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣ）を３×１０⁵ｃｅｌｌｓ／１０ｃｍｄｉｓｈに蒔いた２日後に、ピタバスタチンカルシウム又はアトルバスタチンカルシウムを、それぞれ１．１μｍｏｌ／Ｌ、６．６μｍｏｌ／Ｌになるように添加した。コントロールには、両有効成分の溶媒であるジメチルスルホキシド（終濃度０．００６６ｖ／ｖ％）を添加した。添加８時間後に、ＩＳＯＧＥＮ（商標、日本ジーン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。以下の操作は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社の使用手順書に従った。すなわち、得られた全ＲＮＡより常法に従い、ｍＲＮＡを精製し、このｍＲＮＡを元にｃＤＮＡを合成した。さらにｉｎｖｉｔｒｏ転写によりビオチン標識ｃＲＮＡを合成し、精製した後、熱処理により断片化し、遺伝子発現解析に用いた。

遺伝子発現解析方法：調製した断片化ｃＲＮＡを、ＨｕＧｅｎｅｈｕｍａｎＦＬａｒｒａｙ（商標、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）に注入し、４５℃、１６時間ハイブリダイゼーションを行った。洗浄後、フィコエリスリン標識したストレプトアビジン及びビオチン化抗ストレプトアビジン抗体による染色を施し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ^TM用スキャナー（ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ）にて遺伝子発現情報を取り込んだ。得られた情報はＧＥＮＥＣＨＩＰＳＯＦＴＷＡＲＥ（商標、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）にて解析し、発現量を比較した。

測定結果を図１に示す。
ＨＵＶＥＣにおいて有効成分添加８時間後のＰＴＸ３遺伝子の発現は、コントロールでは発現量で１１１３．０であるのに対し、ピタバスタチンカルシウム、アトルバスタチンカルシウム添加群ではそれぞれ３２．７、３９．２と有意に抑制された。さらにＨＣＡＳＭＣにおいても、有効成分添加８時間後のＰＴＸ３遺伝子の発現は、コントロールでは発現量で１０２８．３であるのに対し、ピタバスタチンカルシウム、アトルバスタチンカルシウム添加群ではそれぞれ４５２．５、４３２．１と有意に抑制された。

実施例２
ＨＵＶＥＣを３×１０⁵ｃｅｌｌｓ／１０ｃｍｄｉｓｈに蒔いた２日後に、ピタバスタチンカルシウム、アトルバスタチンカルシウムを、それぞれ１．１μｍｏｌ／Ｌ、６．６μｍｏｌ／Ｌになるように添加した。また、ピタバスタチンのＰＴＸ３遺伝子発現抑制作用における濃度依存性を評価する目的で、ＨＵＶＥＣ又はＨＣＡＳＭＣを３×１０⁵ｃｅｌｌｓ／１０ｃｍｄｉｓｈに蒔いた２日後に、ピタバスタチンカルシウムを１μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌになるように添加した。なおコントロールには、各々の条件において、両有効成分の溶媒であるジメチルスルホキシド（終濃度０．００６６ｖ／ｖ％）を添加した。添加８又は２４時間後に、ＩＳＯＧＥＮ（商標、日本ジーン社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。得られた全ＲＮＡを、常法に従いＲＴ−ＰＣＲに処し、増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、遺伝子発現量を比較した。

ＲＴ−ＰＣＲの反応条件等
ＲＴ反応：RNA PCR Core Kit(商標、Roche Molecular Systems社製)を用いて行った。
ＰＣＲ：Expand^TM High Fidelity PCR system(商標、Boehringer Mannheim社製)を用い、95℃１分−57℃１分−72℃１分を25サイクル行った。なおＰＣＲプライマーとして、以下のセットを用いた。ＰＴＸ３の場合は配列番号１（Ｆｏｒｗａｒｄ）及び配列番号２（Ｒｅｖｅｒｓｅ）；ＧＡＰＤＨの場合は配列番号３（Ｆｏｒｗａｒｄ）及び配列番号４（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を用いた。

結果を図２に示す。
ＨＵＶＥＣにおいてＰＴＸ３遺伝子の発現は、ピタバスタチンカルシウムあるいはアトルバスタチンカルシウムの添加により、８時間後、２４時間後共にコントロールに比べて抑制された。またＨＵＶＥＣ及びＨＣＡＳＭＣにおいてＰＴＸ３遺伝子の発現は、ピタバスタチンカルシウムの添加により、８時間後、２４時間後共に濃度依存的に抑制された。

ＰＴＸ３遺伝子の発現量を示す図である。遺伝子発現抑制を電気泳動法で示す図である。

Claims

ピタバスタチン又はその塩を有効成分として含有するＰＴＸ３遺伝子発現抑制剤。
ピタバスタチン又はその塩、及び薬学的に許容される担体を含有するＰＴＸ３遺伝子発現抑制剤組成物。