JP4395005B2 - Strain producing low degree of polymerization ε-poly-L-lysine and method for producing low degree of polymerization ε-poly-L-lysine using the same - Google Patents
Strain producing low degree of polymerization ε-poly-L-lysine and method for producing low degree of polymerization ε-poly-L-lysine using the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP4395005B2 JP4395005B2 JP2004138040A JP2004138040A JP4395005B2 JP 4395005 B2 JP4395005 B2 JP 4395005B2 JP 2004138040 A JP2004138040 A JP 2004138040A JP 2004138040 A JP2004138040 A JP 2004138040A JP 4395005 B2 JP4395005 B2 JP 4395005B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lysine
- strain
- poly
- polymerization
- degree
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する新規な菌株及びそれを用いた特定重合度のε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に含む低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法に関する。 The present invention relates to a novel strain producing a low degree of polymerization ε-poly-L-lysine and a low degree of polymerization ε-poly-L- containing a significant amount of ε-poly-L-lysine having a specific degree of polymerization using the same. The present invention relates to a method for producing lysine.
ε−ポリ−Ｌ−リジンは、Ｌ−リジンのε位のアミノ基が、隣り合うＬ−リジンのカルボン酸基とアミド結合で結合した高分子化合物である。ε−ポリ−Ｌ−リジンは、必須アミノ酸であるＬ−リジンのポリマーであるため、安全性が高く、また、カチオン含量が高いので特異な物性を有する。これらの特徴により、ε−ポリ−Ｌ−リジンはトイレタリー用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電子材料等の用途への展開が期待できる。特に、食品添加物の分野では、天然物系の添加物として注目されている。 ε-poly-L-lysine is a polymer compound in which the amino group at the ε position of L-lysine is bonded to the carboxylic acid group of adjacent L-lysine through an amide bond. Since ε-poly-L-lysine is a polymer of L-lysine, which is an essential amino acid, it is highly safe and has a specific physical property because of its high cation content. Due to these characteristics, ε-poly-L-lysine can be expected to be used for toiletries, cosmetics, feed additives, medicines, agricultural chemicals, food additives, electronic materials and the like. In particular, in the field of food additives, it has attracted attention as a natural product-based additive.
ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法としては、ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株を培地にて培養し、得られた培養物からε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する方法が知られている。このような方法に使用される菌株としては、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp. lysinopolymerus) No.346-D株（微工研菌寄第3834号、以下、No.346-D株という。）（例えば特許文献１参照）、No.346-D株のＳ−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性変異株である11011A-1株（微工研条寄第1109号）（例えば特許文献２参照）、No.346-D株のプラスミド増幅変異株である50833株（微工研条寄第1110号）（例えば特許文献３、４参照）、高濃度のＳ−アミノエチル−Ｌ−システインに対して耐性を有する、11011A-1株の変異株であるB21021株（FERM BP-5926）（例えば特許文献５参照）、ストレプトマイセス・ノールセイ(Streptomyces noursei)に属する菌株（FERM P-9797）（例えば特許文献６参照）、ストレプトマイセスsp.SP-72株（FERM P-16810）（例えば特許文献７参照）、ストレプトマイセスsp.SP-66株（FERM P-17223）（例えば特許文献８参照）、ストレプトマイセス・ヘルバリカラー(Streptomyces herbaricolor) SP-13株（FERM P-17845）（例えば特許文献９参照）、ストレプトマイセス アルブルス・サブスペシーズ(Streptomyces albulus subsp.) SP-25株（FERM P-17988）（例えば特許文献１０参照）及びストレプトマイセス・ラベンデュラエ(Streptomyces lavendulae)USE-53株（FERM P-18305）（例えば特許文献１１参照）が知られている。 As a method for producing ε-poly-L-lysine, a method of culturing a strain producing ε-poly-L-lysine in a medium and collecting ε-poly-L-lysine from the obtained culture is known. It has been. As a strain used in such a method, Streptomyces albulus subsp. Lysinopolymerus No.346-D strain (Makken Kenyo No. 3834, hereinafter, No.346- (Refer to Patent Document 1, for example), No. 346-D strain S11-aminoethyl-L-cysteine resistant mutant 11011A-1 strain (Mikokenjo No. 1109) (for example, patent) Reference No. 2), 50833 (No. 1110) of the plasmid amplification mutant of No. 346-D strain (for example, see Patent References 3 and 4), high concentration S-aminoethyl-L- B21021 strain (FERM BP-5926) which is a mutant of 11011A-1 strain resistant to cysteine (see, for example, Patent Document 5), a strain belonging to Streptomyces noursei (FERM P-9797) (See, for example, Patent Document 6), Streptomyces sp. SP-72 strain (FERM) P-16810) (see, for example, Patent Document 7), Streptomyces sp. SP-66 strain (FERM P-17223) (see, for example, Patent Document 8), Streptomyces herbaricolor SP-13 strain (FERM P-17845) (see, for example, Patent Document 9), Streptomyces albulus subsp. SP-25 strain (FERM P-17988) (see, for example, Patent Document 10) and Streptomyces lavendulae (Streptomyces lavendulae) USE-53 strain (FERM P-18305) (for example, see Patent Document 11) is known.
しかしながら前述の菌株を用いて生産したε−ポリ−Ｌ−リジンを食品添加物として使用する際、使用量の増加に応じて苦みが増す傾向があった。通常ε−ポリ−Ｌ−リジンの生産菌として用いられるNo.346-D株が生産するε−ポリ−Ｌ−リジンの重合度は１３〜３５であるが、この苦みは主としてε−ポリ−Ｌ−リジンに含まれる重合度の高い成分に由来すると考えられる。そこで苦みを低減するため、重合度の高い成分の含有割合が低く、重合度が２０以下のε−ポリ−Ｌ−リジンを選択的に生産する菌株並びに重合度が２０以下のε−ポリ−Ｌ−リジンの含有割合が極めて高いε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法が望まれていた。 However, when ε-poly-L-lysine produced using the aforementioned strain was used as a food additive, bitterness tended to increase as the amount used increased. The degree of polymerization of ε-poly-L-lysine produced by the No. 346-D strain, which is usually used as a producer of ε-poly-L-lysine, is 13 to 35, but this bitterness is mainly ε-poly-L. -It is thought that it originates from a component with a high degree of polymerization contained in lysine. Therefore, in order to reduce bitterness, a strain that selectively produces ε-poly-L-lysine having a low content of components having a high degree of polymerization and a degree of polymerization of 20 or less, and ε-poly-L having a degree of polymerization of 20 or less. A method for producing ε-poly-L-lysine having an extremely high lysine content has been desired.
本発明は、低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株及びそれを用いた特定重合度のε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に含む低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法を提供することを課題とする。 The present invention relates to a strain which produces a low degree of polymerization ε-poly-L-lysine and a low degree of polymerization ε-poly-L-lysine containing a significant amount of ε-poly-L-lysine having a specific degree of polymerization using the same. It is an object to provide a manufacturing method.
本発明者は前述の従来技術の問題点に鑑み、鋭意研究を重ねた。その結果、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）USE-82株（FERM P-19661）またはその変異株であれば、重合度が５〜２０で、特に重合度１０〜１８程度のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
尚、本発明において低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンとは、重合度が５〜２０であるε−ポリ−Ｌ−リジンをいう。
The present inventor has intensively studied in view of the above-described problems of the prior art. As a result, in the case of Streptomyces aureofaciuens USE-82 strain (FERM P-19661) or a mutant strain thereof, the degree of polymerization is 5 to 20, particularly about 10 to 18 degree of polymerization. The inventors have found that a low degree of polymerization ε-poly-L-lysine containing a high fraction of poly-L-lysine is produced, and the present invention has been completed based on this finding.
In the present invention, the low polymerization degree ε-poly-L-lysine means ε-poly-L-lysine having a polymerization degree of 5 to 20.
本発明は下記の（１）〜（４）の構成を有する。
（１）低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する性質を有するストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens） USE-82株（FERM P-19661）。
（２）低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する性質を有するストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens） USE-82株（FERM P-19661）の変異株。
（３）低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンが、重合度１０〜１８のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有することを特徴とする前記（１）または（２）項記載の菌株。
（４）前記（１）〜（３）項のいずれか１項記載の菌株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積した低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とする低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
（５）低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンが、重合度１０〜１８のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有することを特徴とする前記（４）項記載の低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
The present invention has the following configurations (1) to (4).
(1) Streptomyces aureofaciens USE-82 strain (FERM P-19661) having the property of producing a low degree of polymerization ε-poly-L-lysine.
(2) A mutant of Streptomyces aureofaciuens USE-82 strain (FERM P-19661) having the property of producing a low polymerization degree ε-poly-L-lysine.
(3) Item (1) or (2), wherein the low polymerization degree ε-poly-L-lysine contains ε-poly-L-lysine having a polymerization degree of 10 to 18 in a high fraction. Strains.
(4) The strain according to any one of (1) to (3) is cultured in a liquid medium, and the low polymerization degree ε-poly-L-lysine produced and accumulated in the culture solution is collected. A process for producing a low degree of polymerization ε-poly-L-lysine.
(5) Low degree of polymerization ε-poly-L-lysine contains a high fraction of ε-poly-L-lysine having a degree of polymerization of 10 to 18, low degree of polymerization as described in (4) above A method for producing ε-poly-L-lysine.
本発明の菌株を用いれば、重合度が５〜２０で、特に重合度１０〜１８程度のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを選択的に生産することができる。該菌株を用いた本発明の製造法であれば、著量の低重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを得ることができる。 If the strain of the present invention is used, a low degree of polymerization ε-poly-L-lysine containing a high fraction of ε-poly-L-lysine having a degree of polymerization of 5 to 20, particularly about 10 to 18 is selected. Can be produced. If it is the manufacturing method of this invention using this strain, a remarkably low degree of polymerization ε-poly-L-lysine can be obtained.
＜１＞本発明の菌株
本発明の菌株は、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens） USE-82株（FERM P-19661）またはそのの変異株であり、重合度が５〜２０のε−ポリ−Ｌ−リジン（以下「低重合度ポリリジン」という。）、特に重合度１０〜１８のε−ポリ−Ｌ−リジンを選択的に生産する性質を有する。
低重合度ポリリジンは、重合度が５〜２０であり、且つその平均分子量が１０００以上であることが好ましい。
尚、低重合度ポリリジンを生産するとは、採取可能な量の低重合度ポリリジンを生産することを意味する。
<1> Strain of the Present Invention The strain of the present invention is Streptomyces aureofaciuens USE-82 strain (FERM P-19661) or a mutant strain thereof, and ε having a degree of polymerization of 5-20. -Poly-L-lysine (hereinafter referred to as "low polymerization degree polylysine"), particularly ε-poly-L-lysine having a polymerization degree of 10 to 18 is selectively produced.
The low polymerization degree polylysine preferably has a polymerization degree of 5 to 20 and an average molecular weight of 1000 or more.
The production of low-polymerization polylysine means production of an amount of low-polymerization polylysine that can be collected.
本発明の菌株は培養条件の操作により、低重合度ポリリジンを著量生産することができる。その結果、本菌株が生産する低重合度ポリリジンはNo.346-D株が生産するε−ポリ−Ｌ−リジンよりも平均重合度が相当低い。
培養液中の低重合度ポリリジンは、後記実施例１(1)(c)に記載した方法により検出し測定することができる。
The strain of the present invention can produce a large amount of low-polymerization polylysine by operating the culture conditions. As a result, the low polymerization degree polylysine produced by this strain has a considerably lower average degree of polymerization than the ε-poly-L-lysine produced by the No.346-D strain.
The low polymerization degree polylysine in the culture solution can be detected and measured by the method described in Example 1 (1) (c) below.
本発明の菌株のストレプトマイセス・アウレオファシエンス USE-82株（Streptomyces aureofaciuens）（以下、USE-82株という）は、後記実施例１に示すスクリーニングによって低重合度ポリリジンの生産性を指標として土壌から単離されたものである。 Streptomyces aureofaciens strain USE-82 (hereinafter referred to as USE-82 strain) of the strain of the present invention is obtained by screening the productivity shown in Example 1 below as an indicator of the productivity of polylysine having a low polymerization degree. Isolated from.
国際ストレプトマイセス プロジェクト(ISP)基準に基づいて調査したUSE-82株の菌学的性質は以下の通りである。
（１）形態学的性質
酵母エキス・麦芽エキス寒天培地（ISP Medium 2）上で２８℃、１〜２週間生育したUSE-82株の気菌糸及び基生菌糸を顕微鏡で観察した結果を次に示す。
胞子形成菌糸の分枝法及び形態：屈曲した直状(RF形)。
The bacteriological properties of USE-82 strain investigated based on International Streptomyces Project (ISP) criteria are as follows.
(1) Morphological properties The results of microscopic observation of the aerial mycelium and the basic hyphae of USE-82 strain grown on yeast extract / malt extract agar medium (ISP Medium 2) at 28 ° C. for 1-2 weeks Show.
Branching method and morphology of spore-forming hyphae: bent straight (RF form).
（２）各種培地における気菌糸、基生菌糸の色と溶解生色素の生産
下記表１に示す各種培地における２８℃で２週間培養後の観察結果である。また、いずれの培地においても溶解性色素の生産は見られない。
(2) Production of aerial hyphae and basic hyphae in various media and production of dissolved raw pigment These are observation results after culturing at 28 ° C. for 2 weeks in various media shown in Table 1 below. In addition, no soluble pigment is produced in any medium.
イースト・麦芽寒天(ISP 2)
1.0％ バクト・麦芽エキス（Bacto Malt Extract)
0.4％ バクト・酵母エキスBacto Yeast Extract)
0.4％ グルコース（Glucose）
2.0％ バクト・アガー（Bacto Agar)
pH 7.0
East Malt Agar (ISP 2)
1.0% Bacto Malt Extract
0.4% Bacto Yeast Extract)
0.4% Glucose
2.0% Bacto Agar
pH 7.0
オートミール寒天(ISP 3)
2.4％ バクト・オートミールアガー、脱水品
（Bacto Oatmeal Agar,Dehydrated)
0.0001％ FeSO4・7H2O
0.0001％ MnCl2・4H2O
1.4％ バクト・アガー（Bacto Agar Difco社製)
pH 6.0±0.2
Oatmeal agar (ISP 3)
2.4% Bacto oatmeal agar, dehydrated
(Bacto Oatmeal Agar, Dehydrated)
0.0001% FeSO 4・ 7H 2 O
0.0001% MnCl 2・ 4H 2 O
1.4% Bacto Agar (Bacto Agar Difco)
pH 6.0 ± 0.2
スターチ・無機塩寒天(ISP 4)
1.0％ バクト・可溶性澱粉（Bacto Soluble Starch)
0.2％ CaCO3
0.2％ (NH4)2SO4
0.1％ K2HPO4
0.1％ MgSO4・7H2O
0.1％ NaCl
0.0001％ FeSO4・7H2O
0.0001％ MnCl2・4H2O
0.0001％ ZnSO4・7H2O
2.0％ バクト・アガー（Bacto Agar)
pH 7.0
Starch and inorganic salt agar (ISP 4)
1.0% Bacto Soluble Starch
0.2% CaCO 3
0.2% (NH 4 ) 2 SO 4
0.1% K 2 HPO 4
0.1% MgSO 4・ 7H 2 O
0.1% NaCl
0.0001% FeSO 4・ 7H 2 O
0.0001% MnCl 2・ 4H 2 O
0.0001% ZnSO 4・ 7H 2 O
2.0% Bacto Agar
pH 7.0
グリセリン・アスパラギン寒天(ISP 5)
1.0％ グリセロール（Glycerol）
0.114％ Ｌ−アスパラギン・H2O（L-Asparagine ・H2O）
0.1％ K2HPO4
0.0001％ FeSO4・7H2O
0.0001％ MnCl2・4H2O
0.0001％ ZnSO4・7H2O
2.0％ バクト・アガー（Bacto Agar)
pH 7.2
Glycerin asparagine agar (ISP 5)
1.0% Glycerol
0.114% L-asparagine · H 2 O (L-Asparagine · H 2 O)
0.1% K 2 HPO 4
0.0001% FeSO 4・ 7H 2 O
0.0001% MnCl 2・ 4H 2 O
0.0001% ZnSO 4・ 7H 2 O
2.0% Bacto Agar
pH 7.2
（３）生理的性質
(a)細胞壁組成：細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸の型についてスタネック(Staneck)らの方法(アプライド・マイクロバイオロジー（Applied Microbiology）第２８巻第２２６頁(1974年)参照)により分析した結果、Ｌ，Ｌ型であった。
(b)各種炭素源の同化性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地上）を表２に示した。
(3) Physiological properties
(a) Cell wall composition: As a result of analysis by the method of Staneck et al. (see Applied Microbiology, Vol. 28, page 226 (1974)), the type of diaminopimelic acid in the cell wall composition component, L and L type.
(b) Table 2 shows the assimilation properties of various carbon sources (on the Prideham Gotrib agar medium).
(c)メラニン様色素の生成：
チロシン寒天培地：あり、ペプトン・イースト鉄寒天：なし。
(c) Formation of melanin-like pigment:
Tyrosine agar medium: yes, peptone yeast iron agar: no.
チロシン寒天
1.5％ グリセロール（Glycerol）
0.05％ Ｌ−チロシン（L-Tyrosine）
0.114％ Ｌ−アスパラギン・H2O（L-asparagine・H2O）
0.05％ K2HPO4
0.05％ MgSO4・H20
0.05％ NaCl
0.001136％ FeSO4・7H2O
0.000285％ H3BO3
0.00018％ MnCl2・4H2O
0.00021％ (+)−酒石酸ナトリウム２水和物
（Sodium(+)-tartrate・2H2O）
0.000004％ CoCl2・6H2O
0.0000027％ CuCl2・2H2O
0.0000025％ Na2Mo4O4・2H2O
0.000002％ ZnCl2
2.0％ バクト・アガー（Bacto Agar Difco社製）
pH 7.2
Tyrosine agar
1.5% Glycerol
0.05% L-Tyrosine
0.114% L-asparagine · H 2 O (L-asparagine · H 2 O)
0.05% K 2 HPO 4
0.05% MgSO 4 · H 2 0
0.05% NaCl
0.001136% FeSO 4・ 7H 2 O
0.000285% H 3 BO 3
0.00018% MnCl 2 · 4H 2 O
0.00021% (+)-Sodium tartrate dihydrate
(Sodium (+)-tartrate ・ 2H 2 O)
0.000004% CoCl 2 · 6H 2 O
0.0000027% CuCl 2・ 2H 2 O
0.0000025% Na 2 Mo 4 O 4・ 2H 2 O
0.000002% ZnCl 2
2.0% Bacto Agar (Bacto Agar Difco)
pH 7.2
ペプトン・イースト鉄寒天
1.5％ バクト・ペプトン（Bacto Peptone)
0.5％ バクト・プロテオーゼ・ペプトン
（Bacto Proteose Peptone)
0.1％ K2HPO4
0.1％ バクト・酵母エキス（Bacto Yeast Extract)
0.05％ クエン酸アンモニウム鉄(III)−褐色
（Ammonium Iron(III)Citrate,Brown）
0.0126％ Na2S2O3・5H2O
1.5％ バクト・アガー（Bacto Agar)
pH 7.2
Pepton East Iron Agar
1.5% Bacto Peptone
0.5% Bacto proteose peptone
(Bacto Proteose Peptone)
0.1% K 2 HPO 4
0.1% Bacto Yeast Extract
0.05% iron (III) ammonium citrate-brown
(Ammonium Iron (III) Citrate, Brown)
0.0126% Na 2 S 2 O 3・ 5H 2 O
1.5% Bacto Agar
pH 7.2
上記の菌学的性質、特に形態学的性質及び細胞壁のジアミノピメリン酸の型等から、USE-82株はストレプトマイセス属に属すると判定される。Ｅ.キュスター(E.Kuester)のインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Intern. J. Syst. Bacteriol.)第２２巻第１３９−１４８頁(1972年)並びにP.ケムファー(P.Kaempher)らのジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー(J.Gen.Microbiol.)第１３７巻第１８３１−１８９１頁(1991年)を参照して類縁菌種を検索し、更にバージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)第２４５２−２４９２頁並びにＥ．Ｂ．シーリング(E. B. Shirling)及びＤ．ゴットリーブ(D. Gottlieb)のインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Intern. J. Syst. Bacteriol.)第２２巻第２７１−２７３頁(1972年)を参照して類縁菌種を検索したところ、本発明菌株はストレプトマイセス・ミサキエンシス（Streptomyces misakiensis ）クラスター（クラスターNo.22-24）に属し、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）あるいはストレプトマイセス・ヘルバリカラー(Streptomyces herbaricolor)と同定されたが、そのどちらであるのかは菌学的性質からだけでは決定が困難であった。 The USE-82 strain is determined to belong to the genus Streptomyces from the above mycological properties, particularly morphological properties and the type of diaminopimelic acid in the cell wall. E. Kuester's International Journal of Systematic Bacteriology Vol. 22, pp. 139-148 (1972) and P. Kaempher The Journal of General Microbiology (J. Gen. Microbiol.) 137, 1831-1891 (1991) was searched for related bacterial species, and the Burjays Manual of Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, pages 2452-2492 and E.I. B. EB Shirling and D.C. A search for related bacterial species with reference to D. Gottlieb's International Journal of Systematic Bacteriology (Intern. J. Syst. Bacteriol.) Vol. 22, pp. 271-273 (1972) The strain of the present invention is Streptomyces misakiensis. ) It belongs to the cluster (Cluster No.22-24) and has been identified as Streptomyces aureofaciuens or Streptomyces herbaricolor, which is mycology It was difficult to make a decision only from the physical properties.
そこで本発明菌株の16S rRNAの部分遺伝子配列を分析した。すなわち、本発明菌株の16S rRNAをPCRで増幅し、初めから５００番目までの塩基配列を決定した。次いでドイツの菌株保存・分譲機関DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)のストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）のタイプカルチャーであるDSM 40127T 及び同ストレプトマイセス・ヘルバリカラー(Streptomyces herbaricolor) のタイプカルチャーであるDSM 40123Tの16S rRNAの５００塩基までの部分遺伝子配列と比較した。 Therefore, the partial gene sequence of 16S rRNA of the strain of the present invention was analyzed. That is, 16S rRNA of the strain of the present invention was amplified by PCR, and the base sequence from the beginning to the 500th was determined. Next, DSM 40127 T , the type culture of Streptomyces aureofaciuens (Streptomyces aureofaciuens) of DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) and the Streptomyces herbaricolor (Streptomyces herbaricolor) The partial gene sequence of up to 500 bases of 16S rRNA of DSM 40123 T , which is a type culture of).
その結果、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）のタイプカルチャーとは９９．８％の相同性を示し、同ストレプトマイセス・ヘルバリカラー(Streptomyces herbaricolor) のタイプカルチャーとは１００％の相同性を示した。しかし、ストレプトマイセス属の場合は他の多くの細菌の場合と異なり、この方法で種のレベルまで同定することは不可能であることが知られている。本発明菌株の場合もそうであると思われる。 As a result, it showed 99.8% homology with Streptomyces aureofaciuens type culture and 100% homology with Streptomyces herbaricolor type culture. Showed sex. However, it is known that in the case of Streptomyces, unlike many other bacteria, it is impossible to identify to the species level by this method. This seems to be the case for the strain of the present invention.
そこで次に、本発明菌株のリボソームのRNAをコードしている遺伝子の制限酵素による切断パターン（リボプリント）を比較検討した。その結果、本発明菌株はストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）と０．７１という高い相関性を有していた。同ストレプトマイセス・ヘルバリカラー(Streptomyces herbaricolor)との相関性は０．４９という低い値であった。以上全ての結果を総合して、本発明菌株はストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）と同定し、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）USE-82株と命名した。ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）USE-82株は、独立行政法人 産業技術総合研究所に２００４年２月２日に寄託され、受託番号FERMP-19661が付与されている。 Then, next, we compared the cleavage pattern (riboprint) of the gene encoding the ribosomal RNA of the strain of the present invention with a restriction enzyme. As a result, the strain of the present invention had a high correlation of 0.71 with Streptomyces aureofaciuens. The correlation with Streptomyces herbaricolor was as low as 0.49. By combining all the above results, the strain of the present invention was identified as Streptomyces aureofaciuens, and named Streptomyces aureofaciuens USE-82. The Streptomyces aureofaciuens USE-82 strain was deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on February 2, 2004 and assigned the accession number FERMP-19661.
また、本発明菌株には低重合度ポリリジンをUSE-82株と同等以上に生産する性質（好ましくは本発明菌株の上記の好ましい性質）を有する限り、USE-82株の変異株も包含される。USE-82株の変異株とは、USE-82株に変異処理をして誘導することのできる低重合度ポリリジン生産性変異株またはUSE-82株の自然突然変異株を意味する。 The strain of the present invention includes mutants of the USE-82 strain as long as it has the property of producing polylysine having a low polymerization degree equivalent to or higher than that of the USE-82 strain (preferably the above preferred properties of the strain of the present invention). . The mutant of USE-82 strain means a low-polymerization polylysine-producing mutant strain that can be induced by mutation treatment of USE-82 strain or a natural mutant strain of USE-82 strain.
USE-82株の変異株は、USE-82株の細胞を変異誘発処理することによって得られる変異株やUSE-82株の自然突然変異株を、ε−ポリ−Ｌ−リジン（以下「ポリリジン」ということがある）を生産する性質等を指標としてスクリーニングすることによって得られる。変異誘発処理としては、紫外線照射やＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異誘発物質による処理が挙げられる。ポリリジンを生産する性質等を指標とするスクリーニングは、例えば、後記実施例１に記載された方法によって行うことができる。 The mutant strain of USE-82 strain is a mutant strain obtained by mutagenesis treatment of cells of USE-82 strain or a natural mutant strain of USE-82 strain, which is ε-poly-L-lysine (hereinafter referred to as “polylysine”). It may be obtained by screening using the property of producing the index as an index. Examples of the mutagenesis treatment include ultraviolet irradiation and treatment with a mutagen such as N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine. Screening using the property of producing polylysine as an index can be performed, for example, by the method described in Example 1 below.
＜２＞本発明の製造法
本発明の製造法は、本発明の菌株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積した低重合度ポリリジンを採取することを特徴とする。本発明の菌株は、好ましくは、USE-82株である。
<2> Production method of the present invention The production method of the present invention is characterized by culturing the strain of the present invention in a liquid medium and collecting polylysine having a low polymerization degree produced and accumulated in the culture medium. The strain of the present invention is preferably the USE-82 strain.
液体培地は、炭素源、窒素源、無機塩及びその他の栄養物が含まれていれば、いかなるものでもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、グリセロール、スターチ等が挙げられ、その含有量は０．１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましい。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カゼイン加水分解物、アミノ酸等の有機化合物や、硫酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩等が挙げられ、その含有量は０．１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。液体培地は、好ましくは炭素源としてブドウ糖またはグリセロールを含み、窒素源として硫酸アンモニウムまたは酵母エキスもしくはペプトンを含むものである。無機塩としては、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、硫酸イオン等を与えるものが挙げられる。 The liquid medium may be any medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other nutrients. Examples of the carbon source include glucose, fructose, glycerol, starch and the like, and the content is preferably 0.1 to 10% (w / v). Examples of the nitrogen source include yeast extract, peptone, casein hydrolyzate, organic compounds such as amino acids, inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, and the content is preferably 0.1 to 5% (w / v). . The liquid medium preferably contains glucose or glycerol as a carbon source and contains ammonium sulfate or yeast extract or peptone as a nitrogen source. Examples of the inorganic salt include phosphate ions, potassium ions, sodium ions, magnesium ions, zinc ions, iron ions, manganese ions, nickel ions, sulfate ions and the like.
培養は、好気的条件下で振盪培養、攪拌培養等により行うことができる。培養温度は２０〜４０℃が好ましい。培地のｐＨは３〜９が好ましい。培養期間は、通常には、１〜１０日であるが、本発明の菌株では、それ以上の期間、培養を続けることができる。培養途中で、炭素源、窒素源を逐次添加してもよい。また、Ｌ−リジンを液体培地に添加することが好ましく、その量は通常０．１〜２％（ｗ／ｖ）である。また、クエン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸を添加することは好ましく、その量は通常0.1〜５％である。このような培養により、培養液中に低重合度ポリリジンが生成蓄積する。 Culturing can be carried out by shaking culture, stirring culture or the like under aerobic conditions. The culture temperature is preferably 20 to 40 ° C. The pH of the medium is preferably 3-9. The culture period is usually 1 to 10 days, but the strain of the present invention can be cultured for a longer period. During the cultivation, a carbon source and a nitrogen source may be added sequentially. Moreover, it is preferable to add L-lysine to a liquid culture medium, and the quantity is 0.1 to 2% (w / v) normally. Moreover, it is preferable to add a citric acid, (alpha) -ketoglutaric acid, and malic acid, and the quantity is 0.1 to 5% normally. By such culture, polylysine having a low polymerization degree is generated and accumulated in the culture solution.
培養液中に著量生成蓄積した低重合度ポリリジンの採取は、培養液から遠心分離やフィルター濾過で菌体を除き、得られる菌体除去液から公知の方法により低重合度ポリリジンを単離することによって行うことができる。具体的には、例えば、菌体除去液をアニオン交換樹脂のカラムを通して不純物の大部分を除き、更にカチオン交換樹脂のカラムを通して精製し、濃縮する。得られる濃縮液からアセトン、エタノール等の有機溶媒で晶析することにより低重合度ポリリジンが得られる。 To collect polylysine with a low degree of polymerization that has been generated and accumulated in the culture solution, remove the cells from the culture solution by centrifugation or filter filtration, and isolate the low-polymerization polylysine from the resulting cell removal solution by a known method. Can be done. Specifically, for example, most of the impurities are removed from the microbial cell removal solution through an anion exchange resin column, and further purified through a cation exchange resin column and concentrated. A low polymerization degree polylysine is obtained by crystallizing from the obtained concentrated liquid with an organic solvent such as acetone or ethanol.
以下、実施例にて本発明を具体的に説明する。
低重合度ポリリジン生産菌の取得
(1)低重合度ポリリジン生産菌のスクリーニング
(a)土壌からの分離方法
土壌１ｇ（湿重量）を滅菌した生理食塩水（10ml）に懸濁し、３０℃で振とう（200rpmで10分間）、静置（30分間）後、上澄液を生理食塩水で希釈し、この希釈液を放線菌分離用培地（培地１）に塗布した。これを２８℃で２週間程度培養し、生育した放線菌のコロニーを酵母エキス−麦芽エキス寒天培地（培地２）に植継ぎ、単離、保存した。
Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples.
Acquisition of low polymerization degree polylysine producing bacteria
(1) Screening for low polymerization degree polylysine producing bacteria
(a) Separation method from soil 1 g (wet weight) of soil is suspended in sterilized physiological saline (10 ml), shaken at 30 ° C. (10 minutes at 200 rpm), allowed to stand (30 minutes), and then supernatant Was diluted with physiological saline, and this diluted solution was applied to a medium for isolation of actinomycetes (medium 1). This was cultured at 28 ° C. for about 2 weeks, and the grown actinomycete colonies were transferred to a yeast extract-malt extract agar medium (medium 2), isolated and stored.
(b)低重合度ポリリジンの生産
分離・取得した放線菌について、まず生育培地（培地３）で菌体を十分に生育させた（30℃、30時間）後、遠心分離で無菌的に培地を除き菌体を回収した。次に、回収した菌体を生産培地（培地４）に懸濁し、３０℃で振とう培養した。
(b) Production of low-polymerization polylysine For the actinomycetes isolated and obtained, the cells were first sufficiently grown in a growth medium (medium 3) (30 ° C., 30 hours), and the medium was aseptically removed by centrifugation. The cells were removed and collected. Next, the collected microbial cells were suspended in a production medium (medium 4) and cultured with shaking at 30 ° C.
(c)低重合度ポリリジンの検出・測定
分離・取得株を生産培地（培地４）を用い、３０℃で６日間培養後、培養液を遠心分離して菌体を除いた上澄液について、ポリリジンの検出・測定を行った。ポリリジンの検出はイツアキ(Itzhaki)（アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)第50巻第569頁）の方法によった。すなわち、培養上澄液０．５mlと１mMメチルオレンジ及び５０mM NaH2PO4-Na2HPO4(pH 7.0)の水溶液２mlとを混合し、室温で３０分間放置後、生じたポリリジン−メチルオレンジコンプレックスを遠心分離により除き、その上澄水の吸光度（470nm）を測定して、既知濃度のポリリジン溶液を用いて作成した標準曲線より培養液中のポリリジン量を求めた。
(c) Detection and measurement of low-polymerization polylysine The supernatant obtained by removing the bacterial cells by centrifuging the culture solution after culturing the isolate / acquired strain at 30 ° C. for 6 days using the production medium (medium 4). Polylysine was detected and measured. Polylysine was detected by the method of Itzhaki (Analytical Biochemistry, Vol. 50, p. 569). That is, 0.5 ml of culture supernatant was mixed with 2 ml of an aqueous solution of 1 mM methyl orange and 50 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 (pH 7.0), and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes, and the resulting polylysine-methyl orange complex was formed. Was removed by centrifugation, and the absorbance (470 nm) of the supernatant water was measured, and the amount of polylysine in the culture solution was determined from a standard curve prepared using a polylysine solution of known concentration.
上記培地１〜４の組成を下記に示す。表中、「％」は、％（ｗ／ｖ）である。
培地１：放線菌分離用培地（Glycerol-Czapek培地）
グリセロール 0.3％
NaNO3 0.2％
K2HPO4（pH 7.0） 0.1％
KCl 0.05％
MgSO4・7H2O 0.05％
FeSO4・7H2O 0.001％
寒天 1.5％
シクロヘキシミド 50μg/ml
ナイスタチン 50μg/ml
The composition of the media 1 to 4 is shown below. In the table, “%” is% (w / v).
Medium 1: Actinomycete isolation medium (Glycerol-Czapek medium)
Glycerol 0.3%
NaNO 3 0.2%
K 2 HPO 4 (pH 7.0) 0.1%
KCl 0.05%
MgSO 4・ 7H 2 O 0.05%
FeSO 4・ 7H 2 O 0.001%
Agar 1.5%
Cycloheximide 50μg / ml
Nystatin 50μg / ml
培地２：酵母エキス−麦芽エキス寒天培地（ISP 2）
酵母エキス 0.4％
麦芽エキス 1.0％
グルコース 0.4％
寒天 1.5％
ｐＨ 7.2
Medium 2: Yeast extract-malt extract agar medium (ISP 2)
Yeast extract 0.4%
Malt extract 1.0%
Glucose 0.4%
Agar 1.5%
pH 7.2
培地３：生育培地
グリセロール 2.0％
酵母エキス 0.5％
MgSO4・7H2O 0.05％
KH2PO4-Na2HPO4（pH 6.8） 1/50Ｍ
Medium 3: Growth medium Glycerol 2.0%
Yeast extract 0.5%
MgSO 4・ 7H 2 O 0.05%
KH 2 PO4-Na 2 HPO 4 (pH 6.8) 1 / 50M
培地４：生産培地
グリセロール 3.0％
クエン酸・H2O（pH 4.5） 1.0％
（NH4)2SO4 1.0％
L-リジン・HCl 0.2％
Medium 4: Production medium Glycerol 3.0%
Citric acid / H 2 O (pH 4.5) 1.0%
(NH 4 ) 2 SO 4 1.0%
L-Lysine / HCl 0.2%
上記の検出方法によりポリリジン生産菌を土壌よりスクリーニングした結果、滋賀県大津市山地の土壌より、低重合度ポリリジンを生産する菌株を分離・取得した。 As a result of screening polylysine-producing bacteria from the soil by the above detection method, a strain producing polylysine having a low polymerization degree was isolated and obtained from soil in the mountainous area of Otsu City, Shiga Prefecture.
(2)取得株の菌学的性質
分離・取得株の形態学的性質、各種培地上における生育状態及び生理的性質を調べたところ、上述のような性質が認められた。
本菌株は、形態学的特徴や細胞壁のジアミノピメリン酸タイプ等からストレプトマイセス属と判定された。また、類縁菌種を検索したところ本発明菌株はストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens）と同定した。本菌株は、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス（Streptomyces aureofaciuens） USE-82株と命名され、独立行政法人 産業技術総合研究所に２００４年２月２日に寄託され、受託番号 FERM P-19661が付与されている。
(2) Mycological properties of the acquired strain The morphological properties of the isolated and acquired strain, the growth state on various media and the physiological properties were examined, and the above properties were observed.
This strain was determined to be of the genus Streptomyces from morphological characteristics, the diaminopimelate type of the cell wall, and the like. In addition, as a result of searching for related species, the strain of the present invention was identified as Streptomyces aureofaciuens. This strain was named Streptomyces aureofaciuens USE-82 strain, deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on February 2, 2004, and assigned the accession number FERM P-19661 Has been.
(3)USE-82株の生産物の確認
USE-82株を生産培地（培地４）を用い、３０℃で６日間培養後、培養ろ液をメタノール：アセトン（３：１）の混合液で沈殿させ回収した（４０〜６７％画分）。次に回収したメタノール：アセトン（３：１）の混合液沈殿画分を陽イオン交換カラム（TSKgel CM-5PW）を用いて精製し、精製物が電気泳動的に均一になることを確認した。次に、この精製物を６M塩酸で加水分解し、加水分解物についてアミノ酸分析を行った。アミノ酸分析の方法は、加水分解物のアミノ基を前もってDABS（dimethylaminoazobenzenesulfonyl-）化し、液体クロマトグラフィー（アミノクロームアミノ酸分析システム）を用いて分析を行った。
(3) Confirmation of products of USE-82
The USE-82 strain was cultured for 6 days at 30 ° C. using the production medium (medium 4), and the culture filtrate was precipitated and collected with a mixture of methanol: acetone (3: 1) (40 to 67% fraction). . Next, the collected methanol: acetone (3: 1) mixed fraction was purified using a cation exchange column (TSKgel CM-5PW), and it was confirmed that the purified product was electrophoretically uniform. Next, this purified product was hydrolyzed with 6M hydrochloric acid, and the hydrolyzate was subjected to amino acid analysis. In the amino acid analysis method, the amino group of the hydrolyzate was converted to DABS (dimethylaminoazobenzenesulfonyl-) in advance and analyzed using liquid chromatography (aminochrome amino acid analysis system).
アミノ酸分析の結果、USE-82株の生産物はＬ−リジンを唯一の構成アミノ酸とするポリペプチドすなわちポリリジンであることが確認された。
また、USE-82株の生産するポリリジンの重合度を高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）のイオン会合クロマトグラフィー法によって逆相カラム（TSKgel ODS-80Ts）を用いて、非水溶媒としてアセトニトリルを用いてグラジエントをかけながら測定した。その結果、USE-82株の生産するポリリジンは、８、９量体から２０量体程度の低重合度で１０量体から１０数量体程度の低重合度ポリリジンを高い分率で含有する低重合度ポリリジンであった。結果を重合度検定の基準とするために化学合成して得た５量体及び１０量体のε−ポリ−Ｌ−リジンのピーク位置を基準にしてＸ軸（横軸）を定め、図１に示す。
As a result of amino acid analysis, it was confirmed that the product of USE-82 strain was a polypeptide having L-lysine as a sole constituent amino acid, that is, polylysine.
In addition, the polymerization degree of polylysine produced by USE-82 strain was determined by reversed-phase column (TSKgel ODS-80Ts) using high performance liquid chromatography (HPLC) ion association chromatography method, and acetonitrile as non-aqueous solvent. Measurement was performed while applying a gradient. As a result, the polylysine produced by the USE-82 strain has a low degree of polymerization of about 8, 9 to 20 mer and a low degree of polymerization containing a low degree of polymerization of 10 to 10 mer polylysine. Degree of polylysine. The X-axis (horizontal axis) is defined with reference to the peak positions of pentamer and decamer ε-poly-L-lysine obtained by chemical synthesis in order to use the result as a reference for the degree of polymerization test. Shown in
更に、USE-82株の生産する低重合度ポリリジンは、ε−ポリ−Ｌ−リジンを加水分解するタンパク質分解酵素（Aspergillus oryzae由来のプロテアーゼＡ；天野製薬）により分解され、α−ポリアミド結合したα−ポリ−Ｌ−リジンを加水分解する酵素トリプシンでは加水分解されなかった。 Furthermore, the low polymerization degree polylysine produced by the USE-82 strain is decomposed by a proteolytic enzyme hydrolyzing ε-poly-L-lysine (protease A derived from Aspergillus oryzae; Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) and α-polyamide-linked α -It was not hydrolyzed by the enzyme trypsin which hydrolyzes poly-L-lysine.
USE-82株の生産するポリリジンの抗菌活性をペーパーディスク法で調べたところ、グラム陽性細菌であるBacillus brevis(IFO 3331)及びグラム陰性細菌であるEscherichia coli K-12（IFO 3301）に対してStreptomyces albulus No.346-D株由来のポリリジンと同程度の抗菌活性を有していた。 When the antibacterial activity of polylysine produced by USE-82 strain was examined by the paper disk method, Streptomyces against Bacillus brevis (IFO 3331), a gram-positive bacterium, and Escherichia coli K-12 (IFO 3301), a gram-negative bacterium It had the same antibacterial activity as polylysine derived from albulus No.346-D.
USE-82株の低重合度ポリリジン生産性
USE-82株を生育培地（培地３）で坂口フラスコ（100 ml培地／500 ml容）を用いて３０℃で２８時間培養した後、遠心分離で菌体を回収した。回収した菌体を生理的食塩水で１回洗浄後、生産培地（培地４）に移し、坂口フラスコ（100 ml培地／500 ml容）を用いて３０℃で培養した。この培養中に採取した培養上澄液の低重合度ポリリジン濃度を前記の方法により測定した。
７日間の培養では、USE-82株は３．９g/lの生産性を示した。
Low polymerization degree polylysine productivity of USE-82 strain
The USE-82 strain was cultured in a growth medium (medium 3) in a Sakaguchi flask (100 ml medium / 500 ml volume) at 30 ° C. for 28 hours, and the cells were collected by centrifugation. The collected cells were washed once with physiological saline, transferred to a production medium (medium 4), and cultured at 30 ° C. using a Sakaguchi flask (100 ml medium / 500 ml volume). The low polymerization degree polylysine concentration of the culture supernatant collected during the culture was measured by the method described above.
In 7 days of culture, the USE-82 strain showed a productivity of 3.9 g / l.
USE-82株の低重合度ポリリジン生産性
実施例２と全く同様に生育培養し、回収、洗浄した菌体を培地４のクエン酸・H2Oの代わりにα-ケトグルタル酸を用いた生産培地（培地４'）に写し、実施例２と同様にして７日間培養後、培養上澄液の低重合度ポリリジン濃度を同様にして測定したところ、４．９g/lの生産性を示した。
培地４'：生産培地
グリセロール 3.0％
α-ケトグルタル酸（pH 4.5） 1.0％
（NH4）2SO4 1.0％
L-リジン・HCl 0.2％
Low polymerization degree polylysine productivity of USE-82 strain Production medium in which α-ketoglutaric acid was used instead of citric acid / H 2 O in culture medium 4 after growing, culturing, collecting and washing in the same manner as in Example 2. After copying to (medium 4 ′) and culturing for 7 days in the same manner as in Example 2, the low polymerization degree polylysine concentration of the culture supernatant was measured in the same manner, and showed a productivity of 4.9 g / l.
Medium 4 ': Production medium Glycerol 3.0%
α-ketoglutaric acid (pH 4.5) 1.0%
(NH 4 ) 2 SO 4 1.0%
L-Lysine / HCl 0.2%
Claims (5)
The low polymerization degree ε-poly-L-lysine according to claim 4, wherein the low polymerization degree ε-poly-L-lysine contains a high fraction of ε-poly-L-lysine having a polymerization degree of 10-18. -Method for producing lysine
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004138040A JP4395005B2 (en) | 2004-05-07 | 2004-05-07 | Strain producing low degree of polymerization ε-poly-L-lysine and method for producing low degree of polymerization ε-poly-L-lysine using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004138040A JP4395005B2 (en) | 2004-05-07 | 2004-05-07 | Strain producing low degree of polymerization ε-poly-L-lysine and method for producing low degree of polymerization ε-poly-L-lysine using the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005318815A JP2005318815A (en) | 2005-11-17 |
| JP4395005B2 true JP4395005B2 (en) | 2010-01-06 |
Family
ID=35466558
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004138040A Expired - Fee Related JP4395005B2 (en) | 2004-05-07 | 2004-05-07 | Strain producing low degree of polymerization ε-poly-L-lysine and method for producing low degree of polymerization ε-poly-L-lysine using the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4395005B2 (en) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101490093B1 (en) | 2008-06-27 | 2015-02-04 | 가부시키가이샤 바이오베르데 | Cryopreservative composition for cell and tissue |
| BR112019003560B1 (en) | 2016-08-22 | 2022-05-10 | Bioverde Inc | Cryopreservation liquids and cryopreservation methods for bovine sperm |
| CN108018328B (en) * | 2016-11-03 | 2021-07-23 | 上海医药工业研究院 | Culture medium for fermenting demethylated aureomycin and fermentation method |
-
2004
- 2004-05-07 JP JP2004138040A patent/JP4395005B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2005318815A (en) | 2005-11-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6181972B2 (en) | Method for producing aromatic compound | |
| JP4395005B2 (en) | Strain producing low degree of polymerization ε-poly-L-lysine and method for producing low degree of polymerization ε-poly-L-lysine using the same | |
| JP2003515311A (en) | Preparation of pseudomonic acid A antibiotics by microbiological method | |
| Tambekar et al. | Optimization of the production and partial characterization of an extracellular alkaline protease from thermo-halo-alkalophilic lonar lake bacteria | |
| JP2006296305A (en) | STRAIN FOR PRODUCING LOW OR MEDIUM POLYMERIZATION DEGREE epsilon-POLY-L-LYSINE AND METHOD FOR PRODUCING THE LOW OR MEDIUM POLYMERIZATION DEGREE epsilon-POLY-L-LYSINE USING THE SAME | |
| KR100991907B1 (en) | Process for producing theanine | |
| KR20070034822A (en) | -1 Novel Bacillus sp. YN1 and method for producing poly gamma glutamic acid using the same | |
| KR100485668B1 (en) | Novel Bacillus subtilis E2 highly producing surfactin and the method for the surfactin production | |
| JP4643873B2 (en) | Heat-resistant laccase and method for producing the same | |
| JP2002095466A (en) | STRAIN CAPABLE OF PRODUCING LOW-MOLECULAR WEIGHT epsi-POLY- L-LYSINE AND METHOD FOR PRODUCING LOW-MOLECULAR WEIGHT epsi-POLY-L-LYSINE USING THE SAME | |
| Chaudhuri et al. | Proteolytic Activity of Bacillus amyloliquefaciens UEF01 Endophytic to Carnivorous Plant Utricularia exoleta R. Br. | |
| Nashima et al. | Production and optimization of lipase from wild and mutant strains of Bacillus sp. and Pseudomonas sp | |
| JP2002095467A (en) | STRAIN CAPABLE OF PRODUCING LOW/MEDIUM POLYMERIZATION DEGREE epsi-POLY-L-LYSINE AND METHOD FOR PRODUCING LOW/ MEDIUM POLYMERIZATION DEGREE epsi-POLY-L-LYSINE USING THE SAME | |
| JP2005006561A (en) | STRAIN CAPABLE OF PRODUCING LOW-POLYMERIZATION DEGREE epsilon-POLY-L-LYSINE AND METHOD FOR PRODUCING THE LOW-POLYMERIZATION DEGREE epsilon-POLY-L-LYSINE USING THE SAME | |
| JP2005006562A (en) | STRAIN CAPABLE OF PRODUCING epsilon-POLY-L-LYSINE AND METHOD FOR PRODUCING MEDIUM-POLYMERIZATION DEGREE epsilon-POLY-L-LYSINE USING THE SAME | |
| KR102021097B1 (en) | Novel bacillus subtilis hb-31 strain having improved poly-gamma-glutamic acid productivity and medium for poly-gamma-glutamic acid production | |
| JP2003052358A (en) | STRAIN FOR PRODUCING epsi-POLY-L-LYSINE OF LOWER DEGREE OF POLYMERIZATION AND METHOD FOR MANUFACTURING epsi-POLY-L- LYSINE OF LOWER DEGREE OF POLYMERIZATION BY USING THE STRAIN | |
| Tambekar et al. | Partial characterization and optimization of alkaline Amaylase from Bacillus spp. from Lonar Crater | |
| JP3873512B2 (en) | Method for producing D-3- (2-naphthyl) alanine | |
| JP6441599B2 (en) | Production method of pravastatin | |
| JP5126707B2 (en) | Method for producing α-hydroxyacylpyridine | |
| JP3327982B2 (en) | New antibiotic MI481-42F4-A related substance | |
| JP2003525604A (en) | A method for searching for a novel obligately symbiotic thermophilic bacterium Symbiobacterium shrimp SC-1 that produces thermostable L-tyrosine phenol lyase and L-tryptophan indole lyase and related microorganisms. | |
| KR20160047431A (en) | Method for producing poly (gamma-glutamic acid) | |
| JP2004254647A (en) | Method for producing l-penicillamine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061128 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091013 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091016 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4395005 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121023 Year of fee payment: 3 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121023 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131023 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |