JP4390428B2 - Calcium-containing tissue strengthening agent - Google Patents

Description

（式中、Ｘは単結合又は２重結合を示し、Ｒ_１乃至Ｒ_１０は任意の置換基を示す。）
【００１１】
【表１】

【００１２】
一般式２の基本構造を有する物質は、アントシアニジン類と呼称される物質であり、本発明においては、例えば、表２に示す化合物が用いられる。なお、表２中、Ｈは水素原子、ＯＨはヒドロキシ基、ＯＣＨ_３はメトキシ基、ＯＧｌｕは配糖化されたグルコースを示す。
【００１３】
【化７】
一般式２：

（式中、Ｒ_１乃至Ｒ_１０は任意の置換基を示す。）
【００１４】
【表２】

【００１５】
一般式３の基本構造を有する物質は、フラバノール類と呼称される物質であり、本発明においては、例えば、表３に示す化合物が用いられる。なお、表３中、Ｈは水素原子、ＯＨはヒドロキシ基を示す。
【００１６】
【化８】
一般式３：

（式中、Ｒ_１乃至Ｒ_１０は任意の置換基を示す。）
【００１７】
【表３】

【００１８】
一般式４の基本構造を有する物質は、カルコン類と呼称される物質であり、本発明においては、例えば、表４に示す化合物が用いられる。なお、表４中、Ｈは水素原子、ＯＨはヒドロキシ基を示す。
【００１９】
【化９】
一般式４：

（式中、Ｒ_１乃至Ｒ_１１は任意の置換基を示す。）
【００２０】
【表４】

【００２１】
一般式５の基本構造を有する物質は、オーロン類と呼称される物質であり、本発明においては、例えば、表５に示す化合物が用いられる。なお、表５中、Ｈは水素原子、ＯＨはヒドロキシ基、ＯＣＨ_３はメトキシ基を示す。
【００２２】
【化１０】
一般式５：

（式中、Ｒ_２乃至Ｒ_１０は任意の置換基を示す。）
【００２３】
【表５】

【００２４】
本発明に用いられる一般式１乃至５の物質、つまり、フラボン類、フラボノール類、フラバノン類、フラバノノール類、アントシアニジン類、フラバノール類、カルコン類及びオーロン類、又はその前駆体は、通常は、アグリコンあるいは配糖体の形態のものが用いられる。また、それらの重合体などの天然に存在する誘導体であっても、また、一般式１乃至５で表される基本構造を有してなくとも、摂取後に生体内の代謝により、構造が変化して一般式１乃至５で表される基本構造を有する物質に変化する物質、いわゆる誘導体であってもよく、含カルシウム組織のカルシウムを増強できるものであればよい。このようなものにアントシアニジン類の一種のシアニジンの前駆体であるプロアントシアニジンや、プロアントシアニジンの重合体であるプロアントシアニジンポリマー（柿のタンニン）などがある。一般式１乃至５の物質又はその誘導体は、その由来や純度は問わず、必要に応じて、例えば、比較的多量に含まれる植物材料を適宜の溶媒で抽出し、得られた抽出液をそのまま用いたり、さらに精製して純度を高めて用いることができる。また、人工的に合成されて得られたものであってもよく、市販品も好適に用いることができる。また、必要に応じて、適宜な化学的又は生化学的な手法により、メチル化、エチル化、メトキシ化、エトキシ化、硫酸化、配糖化などの誘導体化や、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子を結合させ、水溶性及び／又は安定性を向上させた誘導体として利用することも有利に実施にできる。このような例として、α−グルコシルルチン（商品名『αＧルチン』、株式会社林原商事販売）、α−グルコシルヘスペリジン（商品名『αＧヘスペリジン』、株式会社林原商事販売）、メチル化ヘスペリジン（アルプス薬品工業販売）、α−グリコシルケルセチン、α−グリコシルナリンジンなどがある。水に溶解しにくい物質を用いる場合には、必要に応じて、本発明の効果を損ねない範囲内で、ジメチルスルホキシド、エタノールなどの溶媒によって溶解したり、トレハロースなどの糖質とともに溶解して利用することも、懸濁状態で利用することも有利に実施できる。
【００２５】
また、本発明に用いられる一般式１乃至５の物質は、骨粗鬆症治療又は予防作用の知られているイソフラボン類と併用した場合、含カルシウム組織を強化する作用が相乗的に著しく増強されるという特徴を持っている。イソフラボン類は、一般式６に示される構造を有する物質の総称であり、本発明の含カルシウム組織強化剤に配合される物質としては、そのアグリコン及び／又はその配糖体が用いられる。例えば、本発明においては、表６に示される物質が挙げられ、本発明の含カルシウム組織強化剤に好適に配合される。イソフラボン類は、本発明に用いられる一般式１乃至５の物質が発揮する含カルシウム組織へのカルシウム沈着作用をさらに増強できるものであればよく、その由来や純度は問わず、必要に応じて、例えば、比較的多量に含まれている植物材料を適宜の溶媒で抽出し、得られた抽出液をそのまま用いたり、さらに精製して純度を高めて用いることができる。この例としては、大豆イソフラボンがある。また、人工的に合成されて得られたものであってもよく、さらには、市販品も好適に用いることができる。水に溶解しにくい物質を用いる場合、必要に応じて、本発明の効果を損ねない範囲内で、ジメチルスルホキシド、エタノールなどの溶媒を用いて溶解して利用することも、α，α−トレハロースなどの糖質とともに溶解させたり、また、懸濁状態で利用することも有利に実施できる。また、必要に応じて、適宜な化学的又は生化学的な手法により更に修飾して、例えば、メチル化、エチル化、メトキシ化、エトキシ化、硫酸化、配糖化などの処理を行ない、水溶性及び／又は安定性を向上させた誘導体として利用することも有利に実施にできる。このような例として、α−グリコシルイソフラボンがある。
【００２６】
【化１１】
一般式６：

（式中、Ｒ_１乃至Ｒ_１０は任意の置換基を示す。）
【００２７】
【表６】

【００２８】
本発明でいう含カルシウム組織とは、固体結晶状のカルシウム、例えば、ヒドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウム塩が比較的多量に存在する組織であり、このような組織として、骨組織、とりわけ硬骨組織、及び歯の組織が挙げられ、これら組織において本発明の含カルシウム組織強化剤の有する効果が発揮される。
【００２９】
本発明の含カルシウム組織強化剤は、有効成分である一般式１乃至５の物質、又は、一般式１乃至５の物質及びイソフラボン類以外に、必要に応じて、例えば、無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、乳糖、α，α−トレハロース、α，β−トレハロース、アラビアゴム、コーンスターチ、結晶セルロース等の賦形剤、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、澱粉、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤、水、エタノール等の溶媒等を含有させることができる。また、これらによって、粉末、顆粒、錠剤、顆、液状、ペースト状、懸濁状など、適宜な形態とすることができる。とりわけ、α，α−トレハロースについては、特開２０００−３８３４３号公報及び特開２０００−１９８７３６号公報に開示されているように骨粗鬆症予防、治療薬として有利に利用できることから、有利に利用できる。
【００３０】
本発明の含カルシウム組織強化剤の有効成分として含まれる一般式１乃至５の物質、又は、一般式１乃至５の物質及びイソフラボン類は、有効成分のみの配合、又は、有効成分と製剤上許容し得る担体又は希釈剤との混合物の何れでも製剤として使用できる。製剤中の有効成分の量は、無水物換算で、０．０００１重量％以上、望ましくは０．００１重量％以上である。本発明の含カルシウム組織強化剤は、経口、非経口何れでも投与できる。本発明の含カルシウム組織強化剤の投与量は、投与形態、投与対象者に応じて、本発明の効果が発揮するのに十分な量を投与すべきであるので、投与量を限定することは無意味であるものの、一般的な目安として表記するならば、ヒトを対象にする場合、通常は、１回又は数回に分けて投与し、１日あたり有効成分量として０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５〜２００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００３１】
本発明の含カルシウム組織強化剤の有効成分として用いられる一般式１乃至５の物質、又は一般式１乃至５の物質及びイソフラボン類は、食品添加物、化粧品原料、医薬品原料などとして、既にその多くが、安全性を確認されており、含カルシウム組織強化剤としてはもとより、これを配合してなる飲食物、化粧品又は医薬品としても、極めて安全に投与、摂取若しくは使用することができる。
【００３２】
本発明の含カルシウム組織強化剤の適用対象としては、固体状のカルシウムを主成分とした骨組織や歯組織を有する動物、つまり、人若しくは人以外の哺乳類を含む脊椎動物全般に対して適用することができる。
【００３３】
本発明の含カルシウム組織強化剤は、骨粗鬆症、骨折などの骨に関する疾患、虫歯及び歯周病に伴う歯槽骨の弱体化などの歯に関する疾患の治療、回復促進、または、それらの予防に効果を発揮する。さらに、他の疾患の治療などに投与されたホルモン剤、サイトカイン剤などの薬剤の副作用による骨吸収や脱灰による骨量低下の防止、天然骨又は人工骨の移植時の定着促進にも用いられる。また、健常者においても、さまざまな骨量低下を防止することに用いることができ、例えば、閉経後又は産前産後の女性におけるホルモン分泌異常による骨量の低下、過度のダイエットや栄養失調などに起因するホルモン分泌異常による骨量の低下、高齢者の寝たきり、上下肢の麻痺や長期入院などによる寝たきりによる運動不足による骨量の低下、宇宙や水中生活による無重力若しくは低重力による骨量の低下、過度の運動トレーニングなどに起因する骨量の低下を回復させたり、骨量低下を事前に防止する効果を発揮する。また、幼少者の成長時の骨形成促進、高齢者の骨量維持にも効果的である。さらに、血漿中のカルシウムを含カルシウム組織に沈着させるので、使用方法によっては、高カルシウム血漿を改善する効果も期待できる。以上の効果は、人にのみに限定されることはなく、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、シカ、サイ、ゾウ、イノシシなどを含む脊椎動物全般に対しても有利に適用できる。
【００３４】
医薬品に配合させる本発明の含カルシウム組織強化剤は、本発明の含カルシウム組織強化剤の有効量とともに、必要に応じて、従来知られている骨粗鬆症治療薬を併用することにより、さらに高い効果が期待できる。骨粗鬆症治療薬としては、例えば、カルシトニン製剤、エストロゲン製剤、ビスホスホネート製剤、ビタミンＤ製剤、ビタミンＫ製剤などが挙げられる。また、この他に医薬品に通常用いられる、例えば、麻酔剤、催眠鎮痛剤、抗不安剤、抗てんかん剤、解熱鎮痛消炎剤、興奮剤、覚醒剤、抗パーキンソン剤、精神神経用剤、中枢神経用剤、骨格筋弛緩剤、自律神経用剤、鎮痙剤、眼科用剤、耳鼻科用剤、鎮暈剤、強心剤、不整脈用剤、利尿剤、血圧降下剤、血管収縮剤、冠血管拡張剤、末梢血管拡張剤、高脂血症剤、呼吸促進剤、鎮咳去痰剤、気管支拡張剤、アレルギー用剤、止瀉剤、整腸剤、消化性潰瘍治療剤、健胃消化剤、制酸剤、利胆剤、脳下垂体ホルモン剤、唾液腺ホルモン剤、甲状腺ホルモン剤、抗甲状腺ホルモン剤、蛋白同化ステロイド剤、副腎皮質ホルモン剤、男性ホルモン剤、卵胞ホルモン剤、黄体ホルモン剤、混合ホルモン剤、泌尿生殖器剤、肛門剤、外科用殺菌消毒剤、創傷保護剤、化膿性疾患用外用剤、鎮痛剤、鎮痒剤、収斂剤、消炎剤、寄生虫皮膚疾患外用剤、皮膚軟化剤、腐蝕剤、歯科・口腔用剤、ビタミン剤、無機質製剤、補液剤、止血剤、血液凝固阻止剤、肝臓疾患用剤、解毒剤、習慣性中毒用剤、痛風治療剤、酵素製剤、糖尿病用剤、抗悪性腫瘍剤、抗ヒスタミン剤、刺激療法剤、抗生物質、化学療法剤、生物学的製剤、駆虫剤、抗原虫剤、調製用剤、Ｘ線造影剤及び診断用薬などの薬剤、さらに、本発明の含カルシウム組織強化剤の摂取を容易にさせる、例えば、補助剤、増量剤、希釈剤、賦形剤、安定剤、防腐剤、着色剤、着香剤などの１又は複数を適宜配合し、使用形態に応じて、例えば、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、眼軟膏剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、坐剤、散剤、酒精剤、錠剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、注射剤、チンキ剤、点眼剤、トローチ剤、軟膏剤、パップ剤、芳香水剤、リニメント剤、リモナーデ剤、流エキス剤、ローション剤、ドリンク剤、さらには、必要に応じて、点鼻剤、鼻噴霧剤、下気道用吸入剤、眼科用徐放剤、口腔粘膜貼付剤、浣腸剤などに調製することができる。
【００３５】
本発明の含カルシウム組織強化剤は、その調製が完了するまでの工程において、例えば、混和、混捏、溶解、浸漬、散布、塗布、噴霧、注入などの方法により所定量の有効成分を含有させればよい。
【００３６】
また、本発明に用いられる一般式乃至５の物質、又は、一般式１乃至５の物質及びイソフラボンは、その有する作用効果、すなわち含カルシウム組織にカルシウムを沈着させる作用を十分に発揮させるために、ミネラル、とりわけカルシウム化合物と同じに摂取させることが望ましく、本発明の含カルシウム組織強化剤に含有させるのが好ましい。また、この含カルシウム組織強化剤を配合させた飲食物、化粧品又は医薬品に更に配合することも有利に実施できる。カルシウム化合物としては、塩化カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ニ水素カルシウム、ホパンテン酸カルシウム、パントテン酸カルシウム、フッ化カルシウム、チオグリコール酸カルシウム、硫酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、酢酸カルシウム、Ｌ−アスパラギン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、リンゴ酸カルシウム、コハク酸カルシウム等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３７】
さらに、本発明の含カルシウム組織強化剤の作用効果をさらに発揮させるためには、前記のカルシウム化合物とともに、カルシウム以外のミネラル、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、リン、鉄、亜鉛などをバランス良く配合するのが好ましい。特に、マグネシウム化合物は、高カルシウム血漿などを防止するうえでもカルシウムと同時に摂取するのが望ましく、マグネシウム化合物の本発明の含カルシウム組織強化剤への配合量は、カルシウム化合物に対して等モル以下、望ましくは、カルシウム化合物１モルに対し、０．５モル乃至０．０５モルの範囲で配合される。マグネシウム化合物としては、酸化マグネシウム、塩化マグネシウム、炭酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等が挙げられ、これらの１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３８】
また、ミネラルは腸内において不溶化しやすく、そのため吸収効率が低下しやすいことから、腸管吸収を助け、生体への利用性を高めるミネラル吸収促進作用を有する物質を本発明の含カルシウム組織強化剤に含有させることも有利に実施できる。例えば、カゼインホスホペプチドなどの蛋白質若しくはオリゴペプチド、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、ラクトスクロース、大豆オリゴ糖、α，α―トレハロース、α，β−トレハロース、乳糖などのオリゴ糖、乳酸、酢酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸などの有機酸が挙げられ、有利に利用できる。
【００３９】
また、本発明の含カルシウム組織強化剤の作用効果をさらに発揮させるためにビタミン類を、本発明の含カルシウム組織強化剤に含有させることが望ましい。ビタミン類としては、活性型ビタミンＤ、ビタミンＫ、Ｌ−アスコルビン酸、又はそれらの誘導体などが挙げられる。
【００４０】
以下、実験によって本発明を説明する。
【００４１】
【実験１】
＜アルカリホスファターゼ活性を指標とする各種有機化合物の検索＞
カルシウム沈着作用を有する骨芽細胞を数的に増加させることが骨量増加において重要であることから、マウス前骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（ＲＣＢ１１２６、理研ジーンバンク）を骨芽細胞へ分化させる物質を、植物成分として知られている有機化合物について検索した。その指標として、前骨芽細胞では活性が低く、前骨芽細胞が分化した骨芽細胞においては活性が高いことが知られているアルカリホスファターゼ活性の測定を採用した。
【００４２】
＜マウス前骨芽細胞の培養＞
マウス前骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０（ｖ／ｖ）％牛胎児血清（ギブコ ビーアールエル社販売）を含む表７に示す組成のα−ＭＥＭ培地ｐＨ６．８によって、細胞濃度５×１０^４個／ｍｌに調製し、２４穴プレート（ファルコン ベクトン ディッキンソン社販売）に１穴当り１ｍｌずつ５×１０^４個の細胞を播種し、細胞がプレート底面に付着するまで、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気中で培養した。培地除去後、エタノールに溶解した有機化合物、すなわち、インドメタシン（フナコシ株式会社販売）（陽性対照）、ケンフェロール（フナコシ株式会社販売）、没食子酸（ナカライテスク株式会社販売）、カフェ酸（和光純薬工業株式会社販売）、４−メチルウンベリフェロン（和光純薬工業株式会社販売）、カフェイン（和光純薬工業株式会社販売）、β−カロチン（シグマ社販売）、グリチルリチン（片山化学工業株式会社販売）、メントール（和光純薬工業株式会社販売）、テオフィリン（和光純薬工業株式会社販売）、トコフェロール（シグマ社販売）、バニリン（和光純薬工業株式会社販売）をそれぞれ２０μＭの濃度で含有するα−ＭＥＭ培地（１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清、１０ｍＭβ−グリセロホスフェートを含む）を１ｍｌずつ添加した。なお、培地中には最終濃度０．２％（ｖ／ｖ）エタノールを含有するので、陰性対照としては、０．２％（ｖ／ｖ）エタノールを含有するα−ＭＥＭ培地とした。３日おきに新鮮な各試料を含む培地、又は含まない培地に交換しつつ８日間連続培養した。
【００４３】
【表７】

【００４４】
＜アルカリホスファターゼ活性の測定＞
アルカリホスファターゼ活性の測定は、アルカリホスファＢ−テストワコー（和光純薬工業株式会社販売）を用いて、カジイらの方法に準じて行った（アーチーブズ・オブ・オーラル・バイオロジー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第４４巻、２３３乃至２４１頁（１９９９））。すなわち、上記マウス前骨芽細胞から培地を除去し、０．２５Ｍスクロース溶液１ｍｌで３回洗浄し、１ｍＭ塩化マグネシウム、５０ｍＭスクロースを含む５０ｍＭ炭酸塩緩衝液ｐＨ９．８を０．４５ｍｌ、３．４ｍＭｐ−ニトロフェニルリン酸ニナトリウムを０．０５ｍｌ順次添加し、２５℃、５分間放置した後、０．６Ｎ水酸化ナトリウム１．５ｍｌを添加することで反応を停止させた。上記反応液中において、アルカリホスファターゼの作用によって生成したｐ−ニトロフェノールの量を波長４０５ｎｍの吸光度を測定し、その値をアルカリフォスファターゼ活性とした。表８には、各試料におけるアルカリホスファターゼ活性と０．２％（ｖ／ｖ）エタノールを含有する培地のみ添加した陰性対照の活性との比を示した相対活性を纏めた。
【００４５】
【表８】

【００４６】
表８の結果から、ケンフェロールは、陽性対象であるインドメタシンよりも、マウス前骨芽細胞株（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）のアルカリホスファターゼ活性を増強させた。この結果から、ケンフェロールは、マウス前骨芽細胞のアルカリホスファターゼ活性を増強させることから、前骨芽細胞を骨芽細胞に分化させる作用を有することが判明した。
【００４７】
【実験２】
＜カルシウム沈着作用を指標にした各種有機化合物の検索＞
実験１では、各種有機化合物を含有する被験試料の有する前骨芽細胞から骨芽細胞への分化誘導促進作用を調べた。次に、実際にカルシウム沈着作用を増強させているかを調べた。有機化合物として、インドメタシン（フナコシ株式会社販売販売）（陽性対照）、ケンフェロール（フナコシ株式会社販売）、ヘスペレチン（フナコシ株式会社販売）、没食子酸（ナカライテスク株式会社販売）、カフェ酸（和光純薬工業株式会社販売）を用いた。これらをそれぞれ２０μＭの濃度で含有するα−ＭＥＭ培地（１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清、１０ｍＭβ−グリセロホスフェートを含む）を１ｍｌずつマウスＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株に添加した。なお、培地中には最終濃度０．２％（ｖ／ｖ）エタノールを含有するので、陰性対照としては、０．２％（ｖ／ｖ）エタノールを含有するα−ＭＥＭ培地とした。３日おきに新鮮な各試料を含む培地、又は含まない培地に交換しつつ８日間連続培養した。これらを常法にしたがって、アリザリンレッド−Ｓ染色法を行い、カルシウム沈着量を測定した。すなわち、培養プレートから培地を除去した後、ダルベッコ−リン酸緩衝生理食塩水１ｍｌで２回洗浄し、５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液を１ｍｌ添加して１０分間室温で放置した。添加した５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液を除去した後、蒸留水１ｍｌを添加して再び１０分間室温で放置した。添加した蒸留水を除去した後、１％（ｗ／ｖ）アリザリンレッド−Ｓ（和光純薬工業株式会社販売）溶液１ｍｌを添加して１０分間放置した後、アリザリンレッド−Ｓ溶液を除去し、蒸留水１ｍｌで３回洗浄した。上記の処理によって、沈着したカルシウムは培養プレート底面において赤色に染色されるので、カルシウム沈着量を赤色化の度合いにより肉眼判定した。判定基準は陰性対照（０．２％（ｖ／ｖ）エタノールを含む培地のみ）と同程度の染色を＋、陽性対照（インドメタシン）と同程度の染色を＋＋＋として、陽性対照の染色の５割程度の染色の度合いを＋＋とした。結果を表９に示す。
【００４８】
【表９】

【００４９】
表９の結果から、ケンフェロールとヘスペレチンは、陽性対照として採用したインドメタシンとほぼ同等のカルシウム沈着量であると判定された。この結果から、ケンフェロールとヘスペレチンは、前骨芽細胞のカルシウム沈着を増強する作用があることが判明した。
【００５０】
実験１及び２の結果から、ケンフェロールは、前骨芽細胞のアルカリフォスファターゼ活性を増加させる作用、つまり、前骨芽細胞を骨芽細胞に分化させる作用を有すること、また、ケンフェロールやヘスペレチンはカルシウム沈着を増強させる作用を有することが判明した。
【００５１】
【実験３】
＜各種フラボノイドでの比較＞
ケンフェロールやヘスペレチン以外の他のフラボノイドに属する化合物についても同様の効果を有するかどうか調べた。フラボン（関東化学株式会社販売）、アピゲニン（フナコシ株式会社販売）、フラボノール（東京化成工業株式会社販売）、ケルセチン（関東化学株式会社販売）、ケンフェロール（フナコシ株式会社販売）、ルチン（関東化学株式会社販売）、フラバノン（関東化学株式会社販売）、ナリンゲニン（アルドリッチ販売）、ヘスペレチン（フナコシ株式会社販売）、ヘスペリジン（関東化学株式会社販売）、カルコン（メルク社販売）、フロレチン（シグマ社販売）、カテキン（シグマ社販売）、イプリフラボン（ダイト株式会社販売）、タキシホリン（フナコシ株式会社販売）、スルフレチン（フナコシ株式会社販売）、シアニジン（フナコシ株式会社販売）を被験試料として採用した。アルカリフォスファターゼ活性は実験１の方法で測定した。一方、カルシウム沈着量の測定は、カルシウムＣテストワコー（和光純薬社製）を用いて常法にしたがって行なった。すなわち、培養細胞から培地を除去して、ダルベッコ−リン酸緩衝生理食塩水１ｍｌで３回洗浄した後、沈着したカルシウムを溶解させるために、２Ｎ塩酸０．５ｍｌを添加した。この溶解液から５μｌを採取し、０．８８Ｍモノエタノールアミン緩衝液（ｐＨ１１）を０．５ｍｌ、６９ｍＭ８−キノリノールを含む０．６３ｍＭオルトクレゾールフタレインコンプレクソン（カルシウムイオンとキレート複合体を形成する。）０．０５ｍｌを添加・混合した。これを、波長５７０ｎｍの吸光度を測定し、標準カルシウム溶液を同波長で測定した値と比較して、プレート１穴あたりのカルシウム量を算出した。評価方法は、各試料におけるアルカリホスファターゼ活性及びカルシウム沈着量について、それぞれ、０．２％（ｖ／ｖ）エタノールを含有する培地のみ添加した陰性対照アルカリホスファターゼ活性及びカルシウム沈着量に対する相対活性及び相対量で比較することでおこなった。結果を表１０に示す。
【００５２】
【表１０】

【００５３】
表１０の結果より、本発明の有効成分とするフラボノイドには、カルシウム沈着量の増加が認められた。この結果から、前骨芽細胞を骨芽細胞に分化させ、カルシウムの沈着を増強する作用効果は、フラボン類、フラボノール類、フラバノン類、フラバノノール類、アントシアニジン類、フラバノール類、カルコン類又はオーロン類に共通するものであることが判明した。
【００５４】
【実験４】
＜アルカリフォスファターゼ活性増強におけるケンフェロール、ヘスペレチン又はイプリフラボンの作用効果の比較＞
ケンフェロール又はヘスペレチンと、すでに骨粗鬆症の治療薬として知られるイプリフラボンを被験試料として用いて、前骨芽細胞を骨芽細胞に分化誘導させる作用の強度を比較した。各被験試料を含有する培地中での培養日数を３日、６日及び９日、培地中の被験試料濃度を５、１０、２０μＭとした以外は、実験１の方法に準じて行った。培地のエタノール濃度は、各披検試料濃度が５μＭの時に０．０５％（ｖ／ｖ）、１０μＭの時に０．１％（ｖ／ｖ）、２０μＭの時に０．２％（ｖ／ｖ）となる。これらエタノール濃度と同一の培地であって被験試料を含まないものを対照として設け、対照の活性に対する相対活性を求めた。結果を図１に示す。
【００５５】
図１の結果から、被験試料がケンフェロールでは、濃度２０μＭの場合で、やや遅れて培養６日で著しいアルカリホスファターゼ活性の増強が認められ、また、被験試料がヘスペレチンでは、イプリフラボンに比べてやや活性は劣るものの、培養３日で著しいアルカリホスファターゼ活性の増強が認められた。この結果から、ケンフェロール及びヘスペレチンの、マウス前骨芽細胞株（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）のアルカリフォスファターゼ活性を増強させる効果は、骨粗鬆症剤としてのイプリフラボンの効果に匹敵することが判明した。
【００５６】
【実験５】
＜カルシウム沈着増強におけるケンフェロールとイプリフラボンの作用効果の比較＞
カルシウム沈着量増強作用ついて、ケンフェロールとイプリフラボンとを比較した。被験試料及び被験試料の添加方法は実験４と同様にして行った。カルシウム沈着量の測定は、カルシウムＣテストワコー（和光純薬社製）を用いて常法にしたがって行なった。すなわち、培養細胞から培地を除去して、ダルベッコ−リン酸緩衝生理食塩水１ｍｌで３回洗浄した後、沈着したカルシウムを溶解させるために、２Ｎ塩酸０．５ｍｌを添加した。この溶解液から５μｌを採取し、０．８８Ｍモノエタノールアミン緩衝液（ｐＨ１１）を０．５ｍｌ、６９ｍＭ８−キノリノールを含む０．６３ｍＭオルトクレゾールフタレインコンプレクソン（カルシウムイオンとキレート複合体を形成する。）０．０５ｍｌを添加・混合した。これを、波長５７０ｎｍの吸光度を測定し、標準カルシウム溶液を同波長で測定した値と比較して、プレート１穴あたりのカルシウム量を算出した。ケンフェロールとイプリフラボンの比較したものを図２に示す。なお、図には、対照のエタノールのみで処理したものも示してある。
【００５７】
図２の結果から、ケンフェロールはイプリフラボンよりも、優れたカルシウム沈着増強作用を示した。
【００５８】
実験４及び５から、ケンフェロール及びヘスペレチンは、マウス前骨芽細胞に対して、従来の抗骨粗鬆症薬として知られているイプリフラボンと同様のアルカリホスファターゼ活性の上昇、及びカルシウム沈着増強作用を有しており、含カルシウム組織を強化する作用を有することが示された。
【００５９】
【実験６】
＜カルシウム沈着増強におけるケンフェロールとイプリフラボン、又はヘスペレチンとイプリフラボンの併用効果＞
ケンフェロール又はヘスペレチンを用いて、イソフラボン類であるイプリフラボンとの併用によるカルシウム沈着の増強作用を調べた。試料の調製方法、細胞の培養方法は、各被験試料を含有する培地中での培養日数を５日間のみとした以外は実験１に準じて、カルシウムの測定方法は実験３及び実験５に準じて行なった。なお、各披検試料を含有する培地に含まれるエタノール濃度は同一にした。被験試料として、ケンフェロール５μＭ、１０μＭ、２０μＭ単独、イプリフラボン５μＭ、１０μＭ、２０μＭ単独、又はケンフェロールとともにイプリフラボンをそれぞれ５μＭ、１０μＭ、２０μＭ併用したものを図３に、ヘスペレチン５μＭ、１０μＭ、２０μＭ単独、イプリフラボン５μＭ、１０μＭ、２０μＭ単独、又はヘスペレチンとともにイプリフラボンをそれぞれ５μＭ、１０μＭ、２０μＭ併用したものを図４に示した。
【００６０】
図３及び図４の結果から、前骨芽細胞に対し、ケンフェロール及びヘスペレチンはイプリフラボンと併用すると単独の場合より著しくカルシウム沈着が増強され、併用による相乗効果が認められた。
【００６１】
【実験７】
＜ラット大腿骨及び脛骨におけるカルシウム沈着増強効果＞
３週齢雌性ウイスター系ラット６匹を１群として用いた。各被験試料、すなわち、ヘスペレチン（フナコシ株式会社販売）、ケルセチン（株式会社東京化成販売）、α−グリコシルヘスペリジン（商品名『αＧヘスペリジンＰ』、林原商事株式会社販売）、α−グリコシルルチン（商品名『αＧルチンＰ』、林原商事株式会社販売）、イプリフラボン（ダイト株式会社販売）（陽性対照）各１重量部を、表１１に示す配合比率の高スクロース添加飼料（表１１における各数値は重量％を示す）に配合し、それを餌としてラットに与えた。被験試料の代わりにスクロース１重量部を添加した餌を与えたラットを対照とした。水は自由摂取とした。試験開始８週間後にラットを屠殺し、大腿骨及び脛骨を摘出した。摘出した大腿骨及び脛骨は１００℃で約６時間乾燥させた後、高精度分析用上皿電子天秤（商品名『ＨＡ１８０Ｍ／１２ＱＭ』、株式会社エーアンドディー販売）で乾燥重量を計測した。次に、大腿骨及び脛骨をるつぼに入れ、灰化炉で９５０℃、６時間処理して、十分に灰化した後に塩酸液に溶解させ、これを試料液として、カルシウム量を原子吸光光度計で定量した。カルシウム量は、乾燥骨一本当りのカルシウム量を算出し、対照と比較した。結果を表１２に示す。
【００６２】
【表１１】

【００６３】
【表１２】

【００６４】
表１２の結果から、大腿骨及び脛骨のカルシウム沈着量は各被験試料のいずれの場合も陰性対照に比べて増強し、陽性対照のイプリフラボンと同等又は同等以上であった。また、ヘスペリジン、α−グリコシルヘスペリジン及びα−グリコシルルチンといった配糖体においても、カルシウム沈着量の増加が認められた。なお、これらの配糖体を用いて、インビトロのアルカリホスファターゼ活性及びカルシウム沈着増強作用を調べたところ、有意な増強作用は認められなかった。したがって、これらの効果を発揮するには、各フラボノイドがアグリコンの形態をとっている必要があり、インビボ投与では、腸管内若しくは生体内の酵素によって、糖の部分が分解され、アグリコンとなって作用していることが推察される。
【００６５】
【実験８】
＜急性毒性試験＞
４週齢ウイスター系雌性ラットを１群５匹使用した。被験試料として、実験３で用いた各有機化合物、すなわち、フラボン（関東化学株式会社販売）、アピゲニン（フナコシ株式会社販売）、フラボノール（東京化成工業株式会社販売）、ケルセチン（関東化学株式会社販売）、ケンフェロール（フナコシ株式会社販売）、ルチン（関東化学株式会社販売）、フラバノン（関東化学株式会社販売）、ナリンゲニン（アルドリッチ販売）、ヘスペレチン（フナコシ株式会社販売）、ヘスペリジン（関東化学株式会社販売）、カルコン（メルク社販売）、フロレチン（シグマ社販売）、カテキン（シグマ社販売）、イプリフラボン（ダイト株式会社販売）、タキシホリン（フナコシ株式会社販売）、スルフレチン（フナコシ株式会社販売）又はシアニジン（フナコシ株式会社販売）を各１重量部を５（ｗ／ｖ）％アラビアゴム溶液２５重量部に溶解若しくは懸濁し、１８時間絶食したラットに、胃ゾンデを用いて１０ｍｌ／ｋｇラット体重の用量で強制経口投与した。以後、ラットは恒温恒湿の条件で飼育し、餌と水は自由に与えた。投与日を０日として各個体の体重を測定しつつ、１４日間一般症状及び生死の状態を観察した。
【００６６】
２週間飼育した後、どの被験試料においても死亡例はなく、また、体重減少はなく、外観は良好であり、一般症状として顕著なものは認められなかった。よって、本発明の含カルシウム組織強化剤に有効成分として用いる一般式１乃至５の物質は極めて安全性が高いものと判断される。
【００６７】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００６８】
【実施例１】
＜液剤＞
α−グリコシルルチン（商品名『αＧルチンＰ』、株式会社林原商事販売）１重量部及びケルセチン（フナコシ株式会社販売）０．１重量部をエタノール５０重量部に溶解させた後、さらに、水５，０００重量部、α，α−トレハロース（商品名『トレハ』、株式会社林原商事販売）５０重量部、乳酸カルシウム３重量部、塩化マグネシウム１．５重量部及びカゼインホスホペプチド１０重量部を添加し、混合溶解させ、液状の含カルシウム組織強化剤を得た。
【００６９】
手軽に服用でき、吸収効率に優れるカルシウムが配合されている本品は、含カルシウム組織を維持・増強する効果があるため、骨粗鬆症、骨折などの治療・予防又は回復促進などに有利に利用できる。
【００７０】
【実施例２】
＜液剤＞
α−グリコシルヘスペリジン（商品名『αＧヘスペリジンＰＡ』、株式会社林原商事販売）１重量部及びヘスペレチン（フナコシ株式会社販売）０．１重量部をエタノール５０重量部に溶解させた後、さらに、水５，０００重量部、α，α−トレハロース（商品名『トレハ』、株式会社林原商事販売）２０重量部、塩化カルシウム５重量部、塩化マグネシウム２．５重量部及びラクトスクロース１０重量部を添加し、混合溶解させ、液状の含カルシウム組織強化剤を得た。
【００７１】
手軽に服用でき、吸収効率に優れるカルシウムが配合されている本品は、含カルシウム組織を維持・増強する効果があるため、骨粗鬆症、骨折などの治療・予防又は回復促進などに有利に利用できる。
【００７２】
【実施例３】
＜液剤＞
塩化ナトリウム６重量部、塩化カリウム０．３重量部、塩化カルシウム０．２重量部、乳酸ナトリウム３．１重量部、α，β−トレハロース４５重量部及び特開平５−３２６９０公報の実施例Ａ−２の方法で得た粉末状α−グルコシルケルセチン１重量部を水１，０００重量部に溶解し、常法にしたがって、精製濾過してパイロジェンフリーとし、この溶液を滅菌した２５ｍｌアンプルに充填して注射用の含カルシウム組織強化剤を得た。
【００７３】
本品は、注射剤として、カルシウム組織を維持・増強する効果があるため、骨粗鬆症、骨折などの治療・予防又は回復促進などに有利に利用できる。
【００７４】
【実施例４】
＜粉剤＞
α−グリコシルルチン（商品名『αＧルチンＨ』、株式会社林原商事販売）１重量部、大豆イソフラボン（不二製油株式会社販売）５重量部、α，α−トレハロース粉末（商品名『トレハ』、株式会社林原商事販売）１０００重量部、乳酸カルシウム１重量部、硫酸マグネシウム０．５重量部を均一に混ぜ合わせたのち、乾燥し、粉末状の含カルシウム組織強化剤を製造した。
【００７５】
安定な本品は、水に対して易溶であり、カルシウム及びマグネシウムも含有するため、含カルシウム組織を強化する優れた効果を有する。骨粗鬆症、骨折などの治療・予防するための含カルシウム組織強化剤として、又は健康補助食品、保健機能食品などの健康食品として有用である。
【００７６】
【実施例５】
＜粉剤＞
α−グリコシルヘスペリジン（商品名『αＧヘスペリジンＨ』、株式会社林原商事販売）１重量部、α，α−トレハロース粉末（商品名『トレハ』、株式会社林原商事販売）１０００重量部、乳酸カルシウム１重量部、硫酸マグネシウム０．５重量部、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド（商品名『ＡＡ２Ｇ』、株式会社林原商事販売）３重量部を均一に混ぜ合わせた後、乾燥し、粉末状の含カルシウム組織強化剤を製造した。
【００７７】
安定な本品は、水に対して易溶であり、カルシウム及びマグネシウムも含有するため、含カルシウム組織を強化する優れた効果を有する。骨粗鬆症、骨折などの治療・予防するための含カルシウム組織強化剤として、又は健康補助食品、保健機能食品などの健康食品として有用である。
【００７８】
【実施例６】
＜トローチ剤＞
α−グリコシルヘスペリジン（商品名『αＧヘスペリジンＰＡ』、株式会社林原商事販売）１重量部、及びヘスペレチン（フナコシ株式会社販売）０．１重量部をエタノール１重量部に溶解し、乳酸カルシウム２重量部、アラビアゴム１０重量部、α，α−トレハロース粉末（商品名『トレハ』、株式会社林原商事販売）１０重量部、スクラロース（三栄源エフ・エフ・アイ株式会社販売）５重量部、水３重量部をよく混合し、常法により成形し、トローチ剤を得た。
【００７９】
安定な本品は、歯槽骨及び歯のカルシウム量を維持・増強するトローチ剤として有用である。
【００８０】
【実施例７】
＜トローチ剤＞
α−グリコシルルチン（商品名『αＧルチンＰ』、株式会社林原商事販売）１重量部、及びケルセチン（フナコシ株式会社販売）０．１重量部をエタノール１重量部に溶解し、これに乳酸カルシウム２重量部、アラビアゴム１０重量部、α，α−トレハロース粉末（商品名『トレハ』、株式会社林原商事販売）１０重量部、糖転移ステビア２重量部、水３重量部をよく混合し、常法により成形し、トローチ剤を得た。
【００８１】
安定な本品は、歯槽骨及び歯のカルシウム量を維持・増強するトローチ剤として有用である。
【００８２】
【実施例８】
＜健康補助食品＞
α，α−トレハロース粉末（商品名『トレハ』、株式会社林原商事販売）５２重量部、コーンスターチ４０重量部、α−グリコシルルチン（商品名『αＧルチンＰ』、株式会社林原商事販売）０．５重量部、α−グリコシルヘスペリジン（商品名『αＧヘスペリジンＰＡ』、株式会社林原商事販売）０．５重量部、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド（商品名『ＡＡ２Ｇ』、株式会社林原商事販売）塩化カルシウム０．１重量部及び結晶セルロース２．５重量部を混合し、常法にしたがって、適量の水を噴霧滴下しながら混練し、流動層造粒したのち、粉砕し、整粒して打錠用粉体を得た。これに潤沢剤として蔗糖脂肪酸エステル２重量部を均一に混合した後、直径１１ｍｍの杵を装着した打錠機により打錠して錠剤（約３００ｍｇ／錠）を得た。
【００８３】
摂取し易く、消化管における崩壊性に優れた本品は、骨量を維持・増強する健康補助食品、保健機能食品などの健康食品として有用である。
【００８４】
【実施例９】
＜ドリンク剤＞
α−グリコシルルチン（商品名『αＧルチンＰ』、株式会社林原商事販売）１重量部、特開平４−１３６９１号公報実施例Ａ−２に記載された方法に準じて製造したα−グリコシルナリンジン１重量部、グレープフルーツ果汁２０重量部、α，α−トレハロース粉末（商品名『トレハ』、株式会社林原商事販売）２重量部、クエン酸２重量部、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド（商品名『ＡＡ２Ｇ』、株式会社林原商事販売）１重量部、異性化糖５重量部、海水６重量部、塩化カルシウム２重量部及び水１６０重量部を混合し、ガラス瓶に１００ｍｌずつ充填した後、密栓しドリンク剤を得た。
【００８５】
本品は、風味良好のうえ、含カルシウム組織を強化する作用があるので、骨粗鬆症、骨折などの治療・予防するためのドリンク剤として有用である。
【００８６】
【実施例１０】
＜ドリンク剤＞
α−グリコシルヘスペリジン（商品名『αＧヘスペリジンＰＡ』、株式会社林原商事販売）１重量部、リンゴ果汁５０重量部、異性化糖５重量部、Ｌ−アスコルビン酸２重量部、α，α−トレハロース（商品名『トレハ』、株式会社林原商事販売）３重量部、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム２重量部、水３５重量部を混合し、ガラス瓶に１００ｍｌずつ充填した後、密栓しドリンク剤を得た。
【００８７】
本品は、風味良好のうえ、含カルシウム組織を強化する作用があるので、骨粗鬆症、骨折などの治療・予防するためのドリンク剤として有用である。
【００８８】
【実施例１１】
＜ペースト剤＞
常法にしたがって、第二リン酸カルシウム４５重量部、プルラン３重量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５重量部、グリセリン２０重量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート０．５重量部、ソルビトール１０重量部、マルチトール７重量部及び精製水１２重量部にα−グリコシルヘスペリジン（商品名『αＧヘスペリジンＰＡ』、株式会社林原商事販売）を０．４重量部及びヘスペレチン（フナコシ株式会社販売）０．１重量部を含有するエタノール溶液１重量部を配合してペースト剤を得た。
【００８９】
安定な本品は、歯槽骨及び歯のカルシウム量を維持・増強する練歯磨として有用である。
【００９０】
【実施例１２】
＜ペースト剤＞
常法にしたがって、第二リン酸カルシウム４５重量部、プルラン３重量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５重量部、グリセリン２０重量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート０．５重量部、ソルビトール１０重量部、マルチトール７重量部及び精製水１２重量部にα−グリコシルルチン（商品名『αＧルチンＰ』、株式会社林原商事販売）を０．４重量部及びケルセチン（フナコシ株式会社販売）０．１重量部を含有するエタノール溶液１重量部を配合して練歯磨を得た。
【００９１】
安定な本品は、歯槽骨及び歯のカルシウム量を維持・増強する練歯磨として有用である。
【００９２】
【発明の効果】
一般式１乃至５の物質を含有する含カルシウム組織強化剤は、前骨芽細胞若しくは骨芽細胞において、強いカルシウム沈着活性を示し、さらにその作用はイソフラボン類を添加することによって相乗的に著しく増強されるので、骨成長並びに骨形成促進効果及び骨量増加効果を有し、健康補助食品、保健機能食品などの健康食品に含有させて摂取することができるのみならず、日常的に食する飲食物としても違和感なく容易に摂取できる。本発明のカルシウム組織強化剤は、特に高齢者の骨や歯の弱体化を防ぐとともに、骨粗鬆症の治療及び予防にも有用である。さらに、若年層においても、食生活の変調により生じる骨成長や骨形成の遅延を予防するのに高い効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 アルカリフォスファターゼ活性増強作用におけるケンフェロール、ヘスペレチン又はイプリフラボンの各濃度での経日変化を示す図である。
【図２】 カルシウム沈着増強作用におけるケンフェロール又はイプリフラボンの各濃度での経日変化を示す図である。
【図３】 カルシウム沈着増強作用におけるケンフェロールとイプリフラボンとの各濃度での併用効果について示す図である。
【図４】 カルシウム沈着増強作用におけるヘスペレチンとイプリフラボンとの各濃度での併用効果について示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a calcium-containing tissue strengthening agent that can be used to increase the amount of calcium in calcium-containing tissue such as bone or dental tissue, and its use.
[0002]
[Prior art]
Generally, with aging, weakness of calcium-containing tissues such as bones and teeth occurs. In bone tissue, bone formation and bone resorption are constantly performed, and when young, bone formation and bone resorption are usually balanced. However, due to various causes such as extreme diet and hormonal imbalance accompanying aging, the balance between bone formation and bone resorption is lost and the bone resorption tends to occur. If this condition continues for a long time, calcium, which is an important component, is reduced from calcium-containing tissues such as bones and teeth, and bone diseases such as osteoporosis, fractures, and back pain, or tooth diseases such as dental caries and periodontal disease are likely to occur. Become.
[0003]
Calcium in the body is present in the form of calcium phosphate such as hydroxyapatite as a solid state in calcium-containing tissues, forming bones and teeth, not only playing a role in strengthening those tissues, but also necessary for the body. It is a source of calcium ions. It is said that the amount of calcium intake in Japan is in short supply, and various health foods and foods enriched with calcium are commercially available. However, if calcium is simply ingested, a good effect cannot be expected from the viewpoint of absorption efficiency, and if it is excessively consumed, there is a risk of falling into high calcium plasma. Therefore, in order to deposit calcium in calcium-containing tissues such as bones and teeth, it is recommended to take moderate calcium as a nutrient, and to take other minerals such as magnesium in order to improve absorption and metabolism. However, the effect is not sufficient. In addition to the minerals, oily vitamins such as vitamin D, calcitonin preparations, estrogen preparations, anabolic hormone preparations, bisphosphonates, and hormone agents are also administered. Although this method is more effective than simply taking minerals, when using oil-soluble vitamins and hormones, the administration schedule is complicated, and there is a risk of side effects due to overdose, which is not always satisfactory. It is a situation that cannot be said to be a way of
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
This invention makes it a subject to provide the use to the food-drinks, cosmetics, a pharmaceutical, etc. which mix | blend this with the calcium-containing structure | tissue reinforcement | strengthening agent which is nontoxic and safe and high in an effect.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of an extensive search by the present inventors paying attention to plant components, unexpectedly, a substance having a basic structure represented by any one of the following general formulas 1 to 5 or a precursor thereof (hereinafter referred to in this specification). (It may be described as a substance of general formulas 1 to 5) is to induce the calcium metabolism of animals in the direction of calcification, to deposit calcium in the calcium-containing tissue, strengthen the tissue, and consequently increase bone weight discovered. Furthermore, when isoflavones are used together with substances of general formulas 1 to 5, it induces calcium metabolism in animals in the direction of calcification, deposits calcium in calcium-containing tissues, strengthens the tissues, and consequently increases bone weight. The present invention has been discovered.
[0006]
That is, the present invention provides a substance of general formulas 1 to 5 as an active ingredient, for example, flavones, flavonols, flavanones, flavanols, anthocyanidins, flavanols, chalcones or aurones, or a precursor thereof. The present invention provides a calcium-containing tissue strengthening agent containing seeds or two or more kinds.
[0007]
Furthermore, the present invention provides a calcium-containing tissue strengthening agent containing isoflavones together with the above substances.
[0008]
Furthermore, this invention provides the use to food-drinks, cosmetics, a pharmaceutical, etc. which mix | blend the said calcium-containing structure | tissue reinforcement | strengthening agent.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The embodiment of the present invention will be described. The substances of general formulas 1 to 5 used in the present invention are substances belonging to flavonoids that are widely distributed as plant components. Substances having the basic structure of general formula 1 are called flavones, flavonols, flavanones, flavonanols, for example, R ₁ Flavones, wherein R is a hydrogen atom and X is a double bond, R ₁ Flavonols, wherein R is a hydroxy group (or includes those glycosylated with some saccharide), and X is a double bond, R ₁ Flavanones, wherein R is a hydrogen atom and X is a single bond, R ₁ Is a hydroxy group (or includes those that are glycosylated with some saccharide) and X is a single bond, and is referred to as flavonols. In the present invention, the substances shown in Table 1 can be used as the substance having the basic structure of the general formula 1. In Table 1, H is a hydrogen atom, OH is a hydroxy group, OCH ₃ Represents methoxy group, OGlu represents glycosylated glucose, ORha represents glycosylated rhamnose, and ORut represents glycosylated rutinose.
[0010]
[Chemical 6]
General formula 1:

(In the formula, X represents a single bond or a double bond, R ₁ To R ₁₀ Represents an arbitrary substituent. )
[0011]
[Table 1]

[0012]
The substance having the basic structure of the general formula 2 is a substance called anthocyanidins. In the present invention, for example, compounds shown in Table 2 are used. In Table 2, H is a hydrogen atom, OH is a hydroxy group, OCH ₃ Represents a methoxy group, and OGlu represents glycosylated glucose.
[0013]
[Chemical 7]
General formula 2:

(Wherein R ₁ To R ₁₀ Represents an arbitrary substituent. )
[0014]
[Table 2]

[0015]
The substance having the basic structure of the general formula 3 is a substance called flavanols. In the present invention, for example, compounds shown in Table 3 are used. In Table 3, H represents a hydrogen atom and OH represents a hydroxy group.
[0016]
[Chemical 8]
General formula 3:

(Wherein R ₁ To R ₁₀ Represents an arbitrary substituent. )
[0017]
[Table 3]

[0018]
The substance having the basic structure of the general formula 4 is a substance called chalcones. In the present invention, for example, compounds shown in Table 4 are used. In Table 4, H represents a hydrogen atom and OH represents a hydroxy group.
[0019]
[Chemical 9]
General formula 4:

(Wherein R ₁ To R ₁₁ Represents an arbitrary substituent. )
[0020]
[Table 4]

[0021]
The substance having the basic structure of the general formula 5 is a substance called aurones. In the present invention, for example, compounds shown in Table 5 are used. In Table 5, H is a hydrogen atom, OH is a hydroxy group, OCH ₃ Represents a methoxy group.
[0022]
[Chemical Formula 10]
General formula 5:

(Wherein R ₂ To R ₁₀ Represents an arbitrary substituent. )
[0023]
[Table 5]

[0024]
The substances of the general formulas 1 to 5 used in the present invention, that is, flavones, flavonols, flavanones, flavonols, anthocyanidins, flavanols, chalcones and aurones, or precursors thereof are usually aglycone or Those in the form of glycosides are used. Moreover, even if it is a naturally occurring derivative such as a polymer thereof or does not have the basic structure represented by the general formulas 1 to 5, the structure changes due to in vivo metabolism after ingestion. Thus, it may be a substance that changes to a substance having a basic structure represented by general formulas 1 to 5, that is, a so-called derivative, as long as it can enhance calcium of the calcium-containing tissue. These include proanthocyanidins, which are precursors of a kind of anthocyanidins, and proanthocyanidin polymers (tannins) of proanthocyanidins. The substance of general formulas 1 to 5 or a derivative thereof is not limited in its origin or purity, and for example, if necessary, a plant material contained in a relatively large amount is extracted with an appropriate solvent, and the obtained extract is used as it is. Or can be used after further purification to increase purity. Moreover, what was obtained by artificially synthesizing may be used and a commercial item can also be used conveniently. In addition, if necessary, derivatization such as methylation, ethylation, methoxylation, ethoxylation, sulfation, glycosylation, and water-soluble polymers such as polyethylene glycol by an appropriate chemical or biochemical method. It is also possible to advantageously use the derivative as a derivative having improved water solubility and / or stability. Examples of such products include α-glucosyl rutin (trade name “αG rutin”, sold by Hayashibara Corporation), α-glucosyl hesperidin (trade name “αG Hesperidin”, sold by Hayashibara Corporation), methylated hesperidin (Alps Pharmaceuticals). Industrial sales), α-glycosyl quercetin, α-glycosyl naringin and the like. When using a substance that is difficult to dissolve in water, it can be dissolved in a solvent such as dimethyl sulfoxide or ethanol, or dissolved with a sugar such as trehalose, as needed, within the range that does not impair the effects of the present invention. It can be advantageously carried out in the suspended state.
[0025]
In addition, the substances represented by the general formulas 1 to 5 used in the present invention are synergistically remarkably enhanced in strengthening the calcium-containing tissue when used in combination with isoflavones known for osteoporosis treatment or prevention. have. Isoflavones are a general term for substances having a structure represented by the general formula 6, and as a substance to be blended in the calcium-containing tissue strengthening agent of the present invention, its aglycone and / or its glycoside is used. For example, in this invention, the substance shown by Table 6 is mentioned, and it mix | blends suitably with the calcium-containing structure | tissue strengthening agent of this invention. The isoflavones are not particularly limited as long as they can further enhance the calcium depositing action on the calcium-containing tissue exhibited by the substances of the general formulas 1 to 5 used in the present invention, regardless of their origin and purity. For example, a plant material contained in a relatively large amount can be extracted with an appropriate solvent, and the obtained extract can be used as it is, or can be further purified to increase its purity. An example of this is soy isoflavone. Moreover, what was obtained by artificially synthesizing may be used, and furthermore, a commercially available product can also be suitably used. When a substance that is difficult to dissolve in water is used, it can be used by dissolving it in a solvent such as dimethyl sulfoxide and ethanol within the range that does not impair the effects of the present invention, if necessary, such as α, α-trehalose, etc. It is also possible to advantageously carry out the dissolution with the saccharides of the present invention or use in a suspended state. Further, if necessary, it is further modified by an appropriate chemical or biochemical method, for example, treatment such as methylation, ethylation, methoxylation, ethoxylation, sulfation, glycosylation, etc. It can also be advantageously implemented as a derivative with improved stability. An example of this is α-glycosylisoflavones.
[0026]
Embedded image
General formula 6:

(Wherein R ₁ To R ₁₀ Represents an arbitrary substituent. )
[0027]
[Table 6]

[0028]
The calcium-containing tissue referred to in the present invention is a tissue in which a solid crystalline calcium, for example, a calcium phosphate salt such as hydroxyapatite is present in a relatively large amount. Examples of such a tissue include bone tissue, particularly hard bone tissue, and teeth. And the effects of the calcium-containing tissue reinforcing agent of the present invention are exhibited in these tissues.
[0029]
The calcium-containing tissue strengthening agent of the present invention may contain, for example, silicic anhydride, synthetic silica, as necessary, in addition to the substances of general formulas 1 to 5 or the substances of general formulas 1 to 5 and isoflavones that are active ingredients. Aluminum acid, lactose, α, α-trehalose, α, β-trehalose, gum arabic, corn starch, excipients such as crystalline cellulose, binders such as carboxymethylcellulose and polyvinylpyrrolidone, lubricants such as magnesium stearate and talc , Starch, carboxymethylcellulose calcium and other disintegrants, water, ethanol and other solvents. Moreover, by these, it can be set as appropriate forms, such as a powder, a granule, a tablet, a condyle, a liquid, a paste form, and a suspension form. In particular, α, α-trehalose can be advantageously used because it can be advantageously used as an osteoporosis preventive or therapeutic agent as disclosed in JP-A-2000-38343 and JP-A-2000-198736.
[0030]
The substances represented by the general formulas 1 to 5 or the substances represented by the general formulas 1 to 5 and isoflavones included as the active ingredients of the calcium-containing tissue strengthening agent of the present invention include only the active ingredients, or the active ingredients and the pharmaceuticals are acceptable. Any possible carrier or mixture with diluents can be used as the formulation. The amount of the active ingredient in the preparation is 0.0001% by weight or more, preferably 0.001% by weight or more in terms of anhydride. The calcium-containing tissue strengthening agent of the present invention can be administered either orally or parenterally. Since the dosage of the calcium-containing tissue strengthening agent of the present invention should be administered in an amount sufficient to exert the effects of the present invention, depending on the dosage form and the administration subject, it is possible to limit the dosage. Although it is meaningless, if expressed as a general standard, when targeting humans, it is usually administered once or divided into several doses, and the amount of active ingredient per day is 0.1 to 500 mg / kg body weight, preferably 0.5 to 200 mg / kg body weight.
[0031]
Substances of general formulas 1 to 5, or substances of general formulas 1 to 5 and isoflavones used as active ingredients of the calcium-containing tissue strengthening agent of the present invention are already many as food additives, cosmetic raw materials, pharmaceutical raw materials, etc. However, safety has been confirmed, and it can be administered, ingested or used extremely safely not only as a calcium-containing tissue strengthening agent, but also as a food, beverage, cosmetics or pharmaceutical product comprising this.
[0032]
As an application target of the calcium-containing tissue reinforcing agent of the present invention, it is applied to animals having bone tissue and dental tissue mainly composed of solid calcium, that is, general vertebrates including humans or mammals other than humans. be able to.
[0033]
The calcium-containing tissue-strengthening agent of the present invention is effective in the treatment of bone diseases such as osteoporosis and fractures, dental diseases such as weakening of alveolar bone associated with dental caries and periodontal disease, promotion of recovery, or prevention thereof. Demonstrate. Furthermore, it is also used to prevent bone loss due to side effects of drugs such as hormones and cytokines administered for the treatment of other diseases and to prevent bone loss due to decalcification, and to promote colonization when transplanting natural bone or artificial bone. . It can also be used to prevent various bone loss in healthy individuals, for example due to bone loss due to abnormal hormone secretion in postmenopausal or postpartum women, excessive diet or malnutrition. Bone loss due to abnormal hormone secretion, bedridden elderly, bone loss due to bedridden due to paralysis or long-term hospitalization, bone loss due to weightlessness or low gravity due to space or underwater life, excessive bone loss It is effective in restoring the decrease in bone mass caused by exercise training and preventing bone loss in advance. It is also effective in promoting bone formation during the growth of young children and maintaining bone mass in the elderly. Furthermore, since calcium in plasma is deposited on a calcium-containing tissue, an effect of improving high calcium plasma can be expected depending on the method of use. The above effects are not limited to humans, and can be advantageously applied to all vertebrates including dogs, cats, cows, pigs, horses, deer, rhinoceros, elephants, wild boars, and the like.
[0034]
The calcium-containing tissue-strengthening agent of the present invention to be blended with a pharmaceutical product has a higher effect by combining with an effective amount of the calcium-containing tissue-strengthening agent of the present invention and, if necessary, a conventionally known osteoporosis therapeutic agent. I can expect. Examples of osteoporosis therapeutic agents include calcitonin preparations, estrogen preparations, bisphosphonate preparations, vitamin D preparations, vitamin K preparations, and the like. In addition, other commonly used pharmaceuticals, for example, anesthetics, hypnotic analgesics, anti-anxiety agents, antiepileptics, antipyretic analgesics, stimulants, stimulants, anti-parkinsonian agents, neuropsychiatric agents, and central nervous system agents. Agent, skeletal muscle relaxant, autonomic agent, antispasmodic agent, ophthalmic agent, otolaryngological agent, antipruritic agent, cardiotonic agent, arrhythmic agent, diuretic agent, antihypertensive agent, vasoconstrictor, coronary vasodilator, peripheral blood vessel Dilators, hyperlipidemic agents, respiratory stimulants, antitussive expectorants, bronchodilators, allergic agents, antidiarrheal agents, intestinal regulating agents, peptic ulcer treatment agents, digestive stomach digestive agents, antacids, antibacterial agents, brain Pituitary hormone agent, salivary gland hormone agent, thyroid hormone agent, antithyroid hormone agent, anabolic steroid agent, corticosteroid agent, male hormone agent, follicular hormone agent, luteinizing hormone agent, mixed hormone agent, genitourinary agent, anal agent Surgical disinfectant, Wound protectants, external preparations for purulent diseases, analgesics, antipruritics, astringents, antiphlogistics, external preparations for parasitic skin diseases, emollients, corrosives, dental / oral preparations, vitamins, mineral preparations, supplements Solution, Hemostatic, Anticoagulant, Liver disease agent, Antidote, Habitual addiction agent, Gout treatment agent, Enzyme preparation, Diabetes agent, Anti-neoplastic agent, Antihistamine, Stimulation therapy, Antibiotic, Chemical Facilitating ingestion of therapeutic agents, biological agents, anthelmintic agents, antiprotozoal agents, preparation agents, X-ray contrast agents and diagnostic agents, and the calcium-containing tissue strengthening agent of the present invention, for example, One or more of adjuvants, extenders, diluents, excipients, stabilizers, preservatives, colorants, flavoring agents, etc. are appropriately blended, and depending on the form of use, for example, extract, elixir, capsule Agent, granule, pill, eye ointment, suspension, emulsion, plaster, suppository, powder , Spirits, tablets, syrups, soaking agents, infusions, injections, tinctures, eye drops, lozenges, ointments, poultices, fragrances, liniments, limonades, flow extracts, lotions, drinks Furthermore, as required, it can be prepared into nasal drops, nasal sprays, inhalants for the lower respiratory tract, ophthalmic sustained release agents, oral mucosa patches, enemas and the like.
[0035]
The calcium-containing tissue strengthening agent of the present invention can contain a predetermined amount of an active ingredient by a method such as mixing, kneading, dissolving, dipping, spraying, applying, spraying, pouring, etc., until the preparation is completed. That's fine.
[0036]
In addition, the substances of the general formulas to 5 used in the present invention, or the substances of the general formulas 1 to 5 and isoflavone, in order to sufficiently exhibit the action and effect that the substance has, that is, the action of depositing calcium in the calcium-containing tissue, It is desirable to ingest in the same manner as minerals, especially calcium compounds, and it is preferable to include in the calcium-containing tissue strengthening agent of the present invention. Further, it can be advantageously carried out in foods, cosmetics or pharmaceuticals containing this calcium-containing tissue strengthening agent. Calcium compounds include calcium chloride, calcium glycerophosphate, calcium gluconate, calcium lactate, calcium carbonate, calcium hydrogen phosphate, calcium dihydrogen phosphate, calcium hopantenate, calcium pantothenate, calcium fluoride, calcium thioglycolate, sulfuric acid Calcium, calcium silicate, calcium acetate, calcium L-aspartate, calcium citrate, calcium malate, calcium succinate and the like can be mentioned, and these can be used alone or in combination.
[0037]
Furthermore, in order to further exert the action and effect of the calcium-containing tissue strengthening agent of the present invention, a balance other than calcium, for example, potassium, sodium, magnesium, manganese, phosphorus, iron, zinc, etc., is combined with the calcium compound. It is preferable to mix well. In particular, the magnesium compound is desirably taken at the same time as calcium in order to prevent high calcium plasma and the like, and the compounding amount of the magnesium compound in the calcium-containing tissue strengthening agent of the present invention is equal to or less than the equimolar amount with respect to the calcium compound. Desirably, it is blended in the range of 0.5 mol to 0.05 mol with respect to 1 mol of the calcium compound. Examples of the magnesium compound include magnesium oxide, magnesium chloride, magnesium carbonate, magnesium sulfate, and the like, and one or more of these can be used in appropriate combination.
[0038]
In addition, since minerals are easily insolubilized in the intestine, and thus the absorption efficiency tends to decrease, a substance having a mineral absorption promoting action that helps intestinal absorption and enhances the utilization to the living body is used as the calcium-containing tissue strengthening agent of the present invention. It can also be advantageously carried out. For example, protein or oligopeptide such as casein phosphopeptide, isomaltoligosaccharide, fructooligosaccharide, xylooligosaccharide, lactosucrose, soybean oligosaccharide, α, α-trehalose, α, β-trehalose, lactose oligosaccharide, lactic acid, acetic acid And organic acids such as citric acid, gluconic acid, and succinic acid can be used advantageously.
[0039]
Moreover, it is desirable to contain vitamins in the calcium-containing tissue strengthening agent of the present invention in order to further exert the action effect of the calcium-containing tissue reinforcing agent of the present invention. Examples of vitamins include activated vitamin D, vitamin K, L-ascorbic acid, or derivatives thereof.
[0040]
Hereinafter, the present invention will be described by experiments.
[0041]
[Experiment 1]
<Search for various organic compounds using alkaline phosphatase activity as an index>
Since it is important in increasing bone mass to increase the number of osteoblasts having a calcium depositing effect, the mouse pre-osteoblast cell line MC3T3-E1 cells (RCB1126, RIKEN Genebank) are differentiated into osteoblasts. Substances were searched for organic compounds known as plant components. As the index, the measurement of alkaline phosphatase activity, which is known to have low activity in preosteoblasts and high activity in osteoblasts differentiated from preosteoblasts, was employed.
[0042]
<Culture of mouse preosteoblasts>
When the mouse preosteoblast cell line MC3T3-E1 was mixed with α-MEM medium pH 6.8 having the composition shown in Table 7 containing 10 mM HEPES, 10 (v / v)% fetal bovine serum (sold by Gibco BRL), the cell concentration was 5 × 10 ⁴ 5 ml per 1 ml per well in a 24-well plate (sold by Falcon Becton Dickinson) ⁴ Individual cells were seeded and cultured at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide atmosphere until the cells adhered to the bottom of the plate. After removal of the medium, organic compounds dissolved in ethanol, ie, indomethacin (Funakoshi Co., Ltd.) (positive control), kaempferol (Funakoshi Co., Ltd.), gallic acid (Nacalai Tesque Co., Ltd.), caffeic acid (Wako Pure Chemicals) Industrial Co., Ltd.), 4-Methylumbelliferone (Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.), Caffeine (Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.), β-Carotene (Sigma Co., Ltd.), Glycyrrhizin (Katayama Chemical Co., Ltd.) Sales), menthol (sales of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), theophylline (sales of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), tocopherol (sales of Sigma), vanillin (sales of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) are contained at a concentration of 20 μM. 1 m of α-MEM medium (containing 10% (v / v) fetal bovine serum, 10 mM β-glycerophosphate) Each was added. Since the final concentration of 0.2% (v / v) ethanol was contained in the medium, the negative control was an α-MEM medium containing 0.2% (v / v) ethanol. The culture was continued continuously for 8 days while changing to a medium containing each fresh sample or a medium not containing every three days.
[0043]
[Table 7]

[0044]
<Measurement of alkaline phosphatase activity>
The measurement of alkaline phosphatase activity was performed according to the method of Kajii et al. Using an alkaline phosphat B-test Wako (sold by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (Archives of Oral Biology). , 44, 233-241 (1999)). That is, the medium was removed from the mouse preosteoblasts, washed 3 times with 1 ml of a 0.25 M sucrose solution, and 0.45 ml, 3.4 mM p of 50 mM carbonate buffer pH 9.8 containing 1 mM magnesium chloride and 50 mM sucrose. -0.05 ml of disodium nitrophenyl phosphate was sequentially added and allowed to stand at 25 ° C for 5 minutes, and then the reaction was stopped by adding 1.5 ml of 0.6N sodium hydroxide. In the reaction solution, the amount of p-nitrophenol produced by the action of alkaline phosphatase was measured for absorbance at a wavelength of 405 nm, and the value was defined as alkaline phosphatase activity. Table 8 summarizes the relative activities showing the ratio between the alkaline phosphatase activity in each sample and the activity of the negative control to which only medium containing 0.2% (v / v) ethanol was added.
[0045]
[Table 8]

[0046]
From the results shown in Table 8, kaempferol enhanced the alkaline phosphatase activity of the mouse preosteoblast cell line (MC3T3-E1) more than the positive target indomethacin. From this result, it was found that kaempferol has an action of differentiating preosteoblasts into osteoblasts because it enhances alkaline phosphatase activity of mouse preosteoblasts.
[0047]
[Experiment 2]
<Search for various organic compounds using calcium deposition as an index>
In Experiment 1, a test sample containing various organic compounds was examined for promoting the induction of differentiation from preosteoblasts to osteoblasts. Next, it was investigated whether the calcium depositing action was actually enhanced. As organic compounds, indomethacin (sales and sales by Funakoshi Co., Ltd.) (positive control), kaempferol (sales by Funakoshi Co., Ltd.), hesperetin (sales by Funakoshi Co., Ltd.), gallic acid (sales by Nacalai Tesque Co., Ltd.), caffeic acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Kogyo Co., Ltd. sales) was used. 1 ml each of α-MEM medium (containing 10% (v / v) fetal calf serum and 10 mM β-glycerophosphate) containing 20 μM of each of these was added to the mouse MC3T3-E1 cell line. Since the final concentration of 0.2% (v / v) ethanol was contained in the medium, the negative control was an α-MEM medium containing 0.2% (v / v) ethanol. The culture was continued continuously for 8 days while changing to a medium containing each fresh sample or a medium not containing every three days. These were subjected to alizarin red-S staining in accordance with a conventional method, and the amount of calcium deposition was measured. That is, after removing the medium from the culture plate, the medium was washed twice with 1 ml of Dulbecco-phosphate buffered saline, 1 ml of 50 (v / v)% ethanol aqueous solution was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. After removing the added 50 (v / v)% aqueous ethanol solution, 1 ml of distilled water was added and the mixture was allowed to stand again at room temperature for 10 minutes. After removing the added distilled water, 1 ml of 1% (w / v) Alizarin Red-S (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) solution was added and allowed to stand for 10 minutes, and then Alizarin Red-S solution was removed. Washed 3 times with 1 ml of distilled water. Since the deposited calcium is stained red on the bottom surface of the culture plate by the above-mentioned treatment, the amount of calcium deposition was determined visually by the degree of redness. Judgment criteria were + as the same level of staining as the negative control (medium containing 0.2% (v / v) ethanol only) and +++ as the same level as that of the positive control (indomethacin). The degree of staining was defined as ++. The results are shown in Table 9.
[0048]
[Table 9]

[0049]
From the results in Table 9, kaempferol and hesperetin were determined to have approximately the same amount of calcium deposition as indomethacin employed as a positive control. From this result, it was found that kaempferol and hesperetin have an effect of enhancing calcium deposition of preosteoblasts.
[0050]
From the results of Experiments 1 and 2, kaempferol has the effect of increasing the alkaline phosphatase activity of preosteoblasts, that is, the effect of differentiating preosteoblasts into osteoblasts, and kaempferol and hesperetin are It has been found that it has the effect of enhancing calcium deposition.
[0051]
[Experiment 3]
<Comparison with various flavonoids>
Whether compounds having other flavonoids other than kaempferol or hesperetin have the same effect was examined. Flavon (sold by Kanto Chemical Co., Inc.), Apigenin (sold by Funakoshi Co., Ltd.), Flavonol (sold by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), Quercetin (sold by Kanto Chemical Co., Ltd.), Kaempferol (sold by Funakoshi Co., Ltd.), Rutin (Kanto Chemical Co., Ltd.) Company sales), flavanone (sales by Kanto Chemical Co., Ltd.), Naringenin (sales by Aldrich), Hesperetin (sales by Funakoshi Co., Ltd.), Hesperidin (sales by Kanto Chemical Co., Ltd.), Chalcone (sales by Merck), Phloretin (sales by Sigma), Catechin (sold by Sigma), ipriflavone (sold by Daito), taxifolin (sold by Funakoshi), sulfretin (sold by Funakoshi), and cyanidin (sold by Funakoshi) were used as test samples. Alkaline phosphatase activity was measured by the method of Experiment 1. On the other hand, the amount of calcium deposition was measured according to a conventional method using Calcium C Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). That is, after removing the culture medium from the cultured cells and washing 3 times with 1 ml of Dulbecco-phosphate buffered saline, 0.5 ml of 2N hydrochloric acid was added to dissolve the deposited calcium. 5 μl is taken from this lysate, 0.5 ml of 0.88 M monoethanolamine buffer (pH 11), 0.63 mM ortho-cresolphthalein complexone containing 69 mM 8-quinolinol (forms a chelate complex with calcium ions). ) 0.05 ml was added and mixed. This was measured for absorbance at a wavelength of 570 nm, and compared with a value obtained by measuring a standard calcium solution at the same wavelength, to calculate the amount of calcium per hole in the plate. The evaluation method was as follows: for the alkaline phosphatase activity and the calcium deposition amount in each sample, the relative activity and the relative amount with respect to the negative control alkaline phosphatase activity and the calcium deposition amount to which only a medium containing 0.2% (v / v) ethanol was added, respectively. It was done by comparing with. The results are shown in Table 10.
[0052]
[Table 10]

[0053]
From the results of Table 10, an increase in the amount of calcium deposition was observed for the flavonoids used as the active ingredient of the present invention. Based on this result, the effect of differentiating preosteoblasts into osteoblasts and enhancing calcium deposition has been shown to be flavones, flavonols, flavanones, flavonols, anthocyanidins, flavanols, chalcones or aurones. It turned out to be common.
[0054]
[Experiment 4]
<Comparison of action effect of kaempferol, hesperetin or ipriflavone in enhancing alkaline phosphatase activity>
Using kaempferol or hesperetin and ipriflavone, already known as a therapeutic agent for osteoporosis, as test samples, the strength of the action of inducing differentiation of preosteoblasts into osteoblasts was compared. The experiment was carried out according to the method of Experiment 1 except that the culture days in the medium containing each test sample were 3, 6, and 9 and the test sample concentration in the medium was 5, 10, and 20 μM. The ethanol concentration of the medium is 0.05% (v / v) when the test sample concentration is 5 μM, 0.1% (v / v) when 10 μM, and 0.2% (v / v) when 20 μM. It becomes. A culture medium having the same ethanol concentration and not containing the test sample was provided as a control, and the relative activity to the control activity was determined. The results are shown in FIG.
[0055]
From the results shown in FIG. 1, when the test sample is kaempferol, a remarkable increase in alkaline phosphatase activity was observed after 6 days of culture when the concentration was 20 μM, and when the test sample was hesperetin, the activity was slightly more active than ipriflavone. However, a marked increase in alkaline phosphatase activity was observed after 3 days of culture. From these results, it was found that the effect of kaempferol and hesperetin on enhancing the alkaline phosphatase activity of the mouse preosteoblast cell line (MC3T3-E1) is comparable to the effect of ipriflavone as an osteoporosis agent.
[0056]
[Experiment 5]
<Comparison of action effect of kaempferol and ipriflavone in enhancing calcium deposition>
Kaempferol and ipriflavone were compared with respect to the effect of enhancing the amount of calcium deposition. The test sample and the method for adding the test sample were the same as in Experiment 4. The calcium deposition amount was measured according to a conventional method using Calcium C Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). That is, after removing the culture medium from the cultured cells and washing 3 times with 1 ml of Dulbecco-phosphate buffered saline, 0.5 ml of 2N hydrochloric acid was added to dissolve the deposited calcium. 5 μl is taken from this lysate, 0.5 ml of 0.88 M monoethanolamine buffer (pH 11), 0.63 mM ortho-cresolphthalein complexone containing 69 mM 8-quinolinol (forms a chelate complex with calcium ions). ) 0.05 ml was added and mixed. This was measured for absorbance at a wavelength of 570 nm, and compared with a value obtained by measuring a standard calcium solution at the same wavelength, to calculate the amount of calcium per hole in the plate. A comparison of kaempferol and ipriflavone is shown in FIG. In the figure, those treated with only control ethanol are also shown.
[0057]
From the results shown in FIG. 2, kaempferol showed a superior calcium deposition enhancing action than ipriflavone.
[0058]
From Experiments 4 and 5, kaempferol and hesperetin have an increase in alkaline phosphatase activity and a calcium deposition enhancing effect on mouse preosteoblasts similar to ipriflavone, which is known as a conventional anti-osteoporosis drug. It was shown to have an action of strengthening calcium-containing tissue.
[0059]
[Experiment 6]
<Combination effect of kaempferol and ipriflavone or hesperetin and ipriflavone in enhancing calcium deposition>
Kaempferol or hesperetin was used to examine the enhancement effect of calcium deposition by the combined use with ipriflavone, which is an isoflavone. The sample preparation method and cell culture method were the same as those in Experiment 1 except that the number of days of culture in the medium containing each test sample was 5 days, and the calcium measurement method was in accordance with Experiments 3 and 5. I did it. The ethanol concentration contained in the medium containing each test sample was the same. As test samples, kaempferol 5 μM, 10 μM, 20 μM alone, ipriflavone 5 μM, 10 μM, 20 μM alone, or a combination of kaprirol and ipriflavone 5 μM, 10 μM, 20 μM, respectively, is shown in FIG. FIG. 4 shows 5 μM, 10 μM, 20 μM alone or a combination of ipriflavone and 5 μM, 10 μM, and 20 μM, respectively, together with hesperetin.
[0060]
From the results of FIG. 3 and FIG. 4, kaempferol and hesperetin, when used in combination with ipriflavone, significantly increased calcification compared to the case of single osteoblasts, and the synergistic effect of the combined use was recognized.
[0061]
[Experiment 7]
<Enhancement of calcification in rat femur and tibia>
Six 3-week-old female Wistar rats were used as one group. Each test sample, namely, hesperetin (sold by Funakoshi Co., Ltd.), quercetin (sold by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), α-glycosyl hesperidin (trade name “αG Hesperidin P”, sold by Hayashibara Corporation), α-glycosyl rutin (trade name) “ΑG rutin P”, sold by Hayashibara Shoji Co., Ltd., ipriflavone (sold by Daito Co., Ltd.) (positive control), each with 1 part by weight of a high sucrose-added feed with the blending ratio shown in Table 11 (each value in Table 11 is weight%) And was given to rats as food. A control was a rat fed with 1 part by weight of sucrose instead of the test sample. Water was ad libitum. The rats were sacrificed 8 weeks after the start of the test, and the femur and tibia were removed. The extracted femur and tibia were dried at 100 ° C. for about 6 hours, and then the dry weight was measured with a high-precision analytical top plate electronic balance (trade name “HA180M / 12QM”, sold by A & D Corporation). Next, the femur and tibia are placed in a crucible, treated at 950 ° C. for 6 hours in an ashing furnace, sufficiently ashed, and then dissolved in a hydrochloric acid solution. Using this as a sample solution, the amount of calcium is measured by an atomic absorption photometer. Quantified with. For the calcium content, the calcium content per dry bone was calculated and compared with the control. The results are shown in Table 12.
[0062]
[Table 11]

[0063]
[Table 12]

[0064]
From the results of Table 12, the amount of calcium deposition in the femur and tibia was enhanced in each test sample as compared to the negative control, and was equal to or greater than that of the positive control ipriflavone. In addition, an increase in the amount of calcium deposition was also observed in glycosides such as hesperidin, α-glycosyl hesperidin and α-glycosyl rutin. In addition, when these glycosides were used to examine in vitro alkaline phosphatase activity and calcium deposition enhancing action, no significant enhancing action was observed. Therefore, in order to exert these effects, each flavonoid must be in the form of an aglycon. In in vivo administration, the sugar part is decomposed by an enzyme in the intestinal tract or in vivo to act as an aglycon. It is inferred that
[0065]
[Experiment 8]
<Acute toxicity test>
Four 4-week-old Wistar female rats were used per group. As test samples, each organic compound used in Experiment 3, namely, flavone (sold by Kanto Chemical Co., Inc.), apigenin (sold by Funakoshi Co., Ltd.), flavonol (sold by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), quercetin (sold by Kanto Chemical Co., Ltd.) , Kaempferol (Sold by Funakoshi Co., Ltd.), Rutin (Sold by Kanto Chemical Co., Ltd.), Flavanone (Sold by Kanto Chemical Co., Ltd.), Naringenin (Sold by Aldrich), Hesperetin (Sold by Funakoshi Co., Ltd.), Hesperidin (Sold by Kanto Chemical Co., Ltd.) , Chalcone (sales by Merck), phloretin (sales by Sigma), catechin (sales by Sigma), ipriflavone (sales by Daito Corporation), taxifolin (sales by Funakoshi Corporation), sulfuretin (sales by Funakoshi Corporation) or cyanidin (shares by Funakoshi Corporation) Company sales) each 1 part by weight 5 w / v)% gum arabic solution was dissolved or suspended in 25 parts by weight, the rats fasted for 18 hours were administered by oral gavage at a dose of 10 ml / kg rat body weight using a stomach sonde. Thereafter, the rats were bred under conditions of constant temperature and humidity, and food and water were freely given. The general symptom and the life / death status were observed for 14 days while measuring the body weight of each individual on the day of administration.
[0066]
After 2 weeks of breeding, none of the test samples died, there was no weight loss, the appearance was good, and no significant general symptoms were observed. Therefore, the substances of general formulas 1 to 5 used as active ingredients in the calcium-containing tissue strengthening agent of the present invention are judged to be extremely safe.
[0067]
Examples of the present invention will be described below.
[0068]
[Example 1]
<Liquid>
1 part by weight of α-glycosyl rutin (trade name “αG rutin P”, sold by Hayashibara Shoji Co., Ltd.) and 0.1 part by weight of quercetin (sold by Funakoshi Co., Ltd.) were dissolved in 50 parts by weight of ethanol. 1,000 parts by weight, 50 parts by weight of α, α-trehalose (trade name “Treha”, sold by Hayashibara Corporation), 3 parts by weight of calcium lactate, 1.5 parts by weight of magnesium chloride and 10 parts by weight of casein phosphopeptide Then, it was mixed and dissolved to obtain a liquid calcium-containing tissue strengthening agent.
[0069]
This product, which is easy to take and contains calcium with excellent absorption efficiency, has the effect of maintaining and enhancing the calcium-containing tissue, and therefore can be advantageously used for the treatment / prevention of osteoporosis, fractures, etc., or the promotion of recovery.
[0070]
[Example 2]
<Liquid>
1 part by weight of α-glycosyl hesperidin (trade name “αG Hesperidin PA”, sold by Hayashibara Shoji Co., Ltd.) and 0.1 part by weight of hesperetin (sold by Funakoshi Co., Ltd.) were dissolved in 50 parts by weight of ethanol, and then water 5 , 000 parts by weight, α, α-trehalose (trade name “Treha”, sold by Hayashibara Shoji Co., Ltd.), 5 parts by weight of calcium chloride, 2.5 parts by weight of magnesium chloride and 10 parts by weight of lactosucrose, By mixing and dissolving, a liquid calcium-containing tissue reinforcing agent was obtained.
[0071]
This product, which is easy to take and contains calcium with excellent absorption efficiency, has the effect of maintaining and enhancing the calcium-containing tissue, and therefore can be advantageously used for the treatment / prevention of osteoporosis, fractures, etc., or the promotion of recovery.
[0072]
[Example 3]
<Liquid>
6 parts by weight of sodium chloride, 0.3 parts by weight of potassium chloride, 0.2 parts by weight of calcium chloride, 3.1 parts by weight of sodium lactate, 45 parts by weight of α, β-trehalose and Example A of Japanese Patent Laid-Open No. 5-32690 1 part by weight of powdered α-glucosylquercetin obtained by the method 2 is dissolved in 1,000 parts by weight of water, purified and filtered according to a conventional method to make pyrogen-free, and this solution is filled into a sterilized 25 ml ampoule. A calcium-containing tissue strengthening agent for injection was obtained.
[0073]
Since this product has an effect of maintaining and enhancing calcium tissue as an injection, it can be advantageously used for treatment / prevention of osteoporosis, fractures, etc., or promotion of recovery.
[0074]
[Example 4]
<Dust>
α-glycosylrutin (trade name “αG rutin H”, sold by Hayashibara Shoji Co., Ltd.) 1 part by weight, soy isoflavone (sold by Fuji Oil Co., Ltd.) 5 parts by weight, α, α-trehalose powder (trade name “Treha”, Hayashibara Shoji Sales Co., Ltd.) 1000 parts by weight, calcium lactate 1 part by weight, magnesium sulfate 0.5 part by weight were mixed uniformly and dried to produce a powdery calcium-containing tissue strengthening agent.
[0075]
This stable product is easily soluble in water and also contains calcium and magnesium, and therefore has an excellent effect of strengthening the calcium-containing tissue. It is useful as a calcium-containing tissue strengthening agent for the treatment and prevention of osteoporosis and fractures, or as a health food such as health supplements and health functional foods.
[0076]
[Example 5]
<Dust>
1 part by weight of α-glycosyl hesperidin (trade name “αG Hesperidin H”, sold by Hayashibara Corporation), 1000 parts by weight of α, α-trehalose powder (trade name “Treha”, sold by Hayashibara Corporation), 1 part by weight of calcium lactate Parts, magnesium sulfate 0.5 parts by weight, L-ascorbic acid-2-glucoside (trade name “AA2G”, Hayashibara Shoji Sales Co., Ltd.) 3 parts by weight are mixed uniformly, dried and powdered calcium-containing A tissue strengthening agent was produced.
[0077]
This stable product is easily soluble in water and also contains calcium and magnesium, and therefore has an excellent effect of strengthening the calcium-containing tissue. It is useful as a calcium-containing tissue strengthening agent for the treatment and prevention of osteoporosis and fractures, or as a health food such as health supplements and health functional foods.
[0078]
[Example 6]
<Troche>
1 part by weight of α-glycosyl hesperidin (trade name “αG Hesperidin PA”, sold by Hayashibara Corporation) and 0.1 part by weight of hesperetin (sold by Funakoshi Co., Ltd.) are dissolved in 1 part by weight of ethanol, and 2 parts by weight of calcium lactate. , 10 parts by weight of gum arabic, 10 parts by weight of α, α-trehalose powder (trade name “Treha”, sold by Hayashibara Shoji Co., Ltd.), 5 parts by weight of sucralose (sold by Saneigen FFI Co., Ltd.), 3 parts by weight of water The parts were mixed well and molded by a conventional method to obtain a lozenge.
[0079]
This stable product is useful as a troche that maintains and enhances the amount of calcium in the alveolar bone and teeth.
[0080]
[Example 7]
<Troche>
1 part by weight of α-glycosyl rutin (trade name “αG rutin P”, sold by Hayashibara Corporation) and 0.1 part by weight of quercetin (sold by Funakoshi Co., Ltd.) are dissolved in 1 part by weight of ethanol, and calcium lactate 2 Part by weight, 10 parts by weight of gum arabic, 10 parts by weight of α, α-trehalose powder (trade name “Treha”, sold by Hayashibara Corporation), 2 parts by weight of sugar-transferred stevia and 3 parts by weight of water are mixed well. To obtain a lozenge.
[0081]
This stable product is useful as a troche that maintains and enhances the amount of calcium in the alveolar bone and teeth.
[0082]
[Example 8]
<Health supplement>
α, α-trehalose powder (trade name “Treha”, sold by Hayashibara Corporation) 52 parts by weight, corn starch 40 parts by weight, α-glycosyl rutin (trade name “αG rutin P”, sold by Hayashibara Corporation) 0.5 Part by weight, α-glycosyl hesperidin (trade name “αG Hesperidin PA”, sold by Hayashibara Corporation) 0.5 parts by weight, L-ascorbic acid-2-glucoside (trade name “AA2G”, sold by Hayashibara Corporation) Mix 0.1 parts by weight of calcium and 2.5 parts by weight of crystalline cellulose, knead while spraying an appropriate amount of water in accordance with a conventional method, granulate in fluidized bed, pulverize, size and tablet. A powder was obtained. To this, 2 parts by weight of sucrose fatty acid ester as a lubricant was uniformly mixed, and then tableted with a tableting machine equipped with a paddle having a diameter of 11 mm to obtain a tablet (about 300 mg / tablet).
[0083]
This product, which is easy to ingest and excellent in disintegration in the gastrointestinal tract, is useful as health foods such as health supplements and health functional foods that maintain and enhance bone mass.
[0084]
[Example 9]
<Drink agent>
α-glycosyl rutin (trade name “αG rutin P”, sold by Hayashibara Shoji Co., Ltd.) 1 part by weight, α-glycosyl naringin 1 produced according to the method described in Example A-2 of JP-A-4-13691 Parts by weight, 20 parts by weight of grapefruit juice, 2 parts by weight of α, α-trehalose powder (trade name “Treha”, sold by Hayashibara Corporation), 2 parts by weight of citric acid, L-ascorbic acid-2-glucoside (trade name “ AA2G ”, sold by Hayashibara Shoji Co., Ltd.) 1 part by weight, 5 parts by weight of isomerized sugar, 6 parts by weight of seawater, 2 parts by weight of calcium chloride, and 160 parts by weight of water are mixed, filled into 100 ml portions of glass bottles, sealed and drink An agent was obtained.
[0085]
This product is useful as a drink for treating and preventing osteoporosis, fractures and the like because it has a good flavor and strengthens the calcium-containing tissue.
[0086]
[Example 10]
<Drink agent>
α-glycosyl hesperidin (trade name “αG Hesperidin PA”, Hayashibara Shoji Co., Ltd.) 1 part by weight, apple juice 50 parts by weight, isomerized sugar 5 parts by weight, L-ascorbic acid 2 parts by weight, α, α-trehalose ( (Trade name “Trehha”, sold by Hayashibara Shoji Co., Ltd.) 3 parts by weight, 2 parts by weight of sodium L-aspartate, and 35 parts by weight of water were mixed, filled in 100 ml each in a glass bottle, and sealed to obtain a drink.
[0087]
This product is useful as a drink for treating and preventing osteoporosis, fractures and the like because it has a good flavor and strengthens the calcium-containing tissue.
[0088]
Example 11
<Paste agent>
According to a conventional method, 45 parts by weight of dibasic calcium phosphate, 3 parts by weight of pullulan, 1.5 parts by weight of sodium lauryl sulfate, 20 parts by weight of glycerin, 0.5 parts by weight of polyoxyethylene sorbitan laurate, 10 parts by weight of sorbitol, maltitol 7 parts by weight and 12 parts by weight of purified water contain 0.4 part by weight of α-glycosyl hesperidin (trade name “αG Hesperidin PA”, sold by Hayashibara Corporation) and 0.1 part by weight of hesperetin (sold by Funakoshi Co., Ltd.) A paste was obtained by blending 1 part by weight of an ethanol solution.
[0089]
This stable product is useful as a toothpaste that maintains and enhances the amount of calcium in the alveolar bone and teeth.
[0090]
Example 12
<Paste agent>
According to a conventional method, 45 parts by weight of dibasic calcium phosphate, 3 parts by weight of pullulan, 1.5 parts by weight of sodium lauryl sulfate, 20 parts by weight of glycerin, 0.5 parts by weight of polyoxyethylene sorbitan laurate, 10 parts by weight of sorbitol, maltitol 7 parts by weight and 12 parts by weight of purified water contain 0.4 parts by weight of α-glycosyl rutin (trade name “αG rutin P”, sold by Hayashibara Corporation) and 0.1 part by weight of quercetin (sold by Funakoshi Co., Ltd.) Toothpaste was obtained by blending 1 part by weight of ethanol solution.
[0091]
This stable product is useful as a toothpaste that maintains and enhances the amount of calcium in the alveolar bone and teeth.
[0092]
【The invention's effect】
A calcium-containing tissue strengthening agent containing a substance of the general formulas 1 to 5 exhibits a strong calcification activity in pre-osteoblasts or osteoblasts, and its action is remarkably enhanced synergistically by adding isoflavones. Therefore, it has bone growth and bone formation promoting effect and bone mass increasing effect, and can be ingested in health foods such as health supplements and health functional foods, as well as eating and drinking on a daily basis It can be easily ingested as a product without any discomfort. The calcium tissue strengthening agent of the present invention is particularly useful for the treatment and prevention of osteoporosis as well as the weakening of bones and teeth of the elderly. Furthermore, even in the younger generation, it is highly effective in preventing bone growth and delayed bone formation caused by dietary changes.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing changes over time at various concentrations of kaempferol, hesperetin, or ipriflavone in an alkaline phosphatase activity enhancing action.
FIG. 2 is a graph showing changes over time at various concentrations of kaempferol or ipriflavone in the calcium deposition enhancing action.
FIG. 3 is a diagram showing the combined effect of kaempferol and ipriflavone at various concentrations in the calcium deposition enhancing action.
FIG. 4 is a diagram showing the combined effect of hesperetin and ipriflavone at various concentrations in the calcium deposition enhancing action.

Claims (1)

As an active ingredient, together with ipriflavone, Ke Nferoru, hesperetin, f Superijin, alpha-containing calcium organizational strengthening agent characterized by containing one or more flavonoids selected from glycosyl hesperidin.

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