JP4382881B2 - Fusion protein comprising bacteriophage coat protein and single chain T cell receptor - Google Patents

Description

を参照されたい。
しかながら、ｓｃＴＣＲ単離方法の多くは、変則的に折り畳まれた不溶性分子を生成すると報告されている。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／１８１０５公報には、ｓｃＴＣＲを大腸菌において発現させる方法が開示されているが、開示方法では、ｓｃＴＣＲを入手するには厄介なタンパク質を再び折り畳むステップや可溶化ステップが必要であり、ｓｃＴＣＲの生産率は通常低い。上述のWard,E.S.et al.及び上述のSchlueter,C.J.を参照されたい。
ｓｃＴＣＲの精製度を高める方法が数種開発されている。該方法では、細胞表面、または細菌原形質空間において、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現させている。例えば、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ｓｃＴＣＲとＣ−β鎖および細胞内シグナル領域（ＷＯ９６／１８１０５参照）とを融合させることで生成される。しかしながら、生成したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、細胞表面より取りはずさなくてはならない上に、変則的に折り畳まれていることが多く、その生産率が低下する。他のｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成方法では、マルトース（麦芽糖）結合タンパク質を融合させ、原形質空間で発現させることに焦点を当てている（ＷＯ９６／１３５９３参照）。しかしながら、通常、大量のｓｃＴＣＲ融合タンパク質を得るためには、タンパク質を再び折り畳むという厄介なステップが必要とされる。
イン・ビトロおよびイン・ビボにおける、免疫システムに関わる分子の相互作用の研究には、以前から重大な関心が寄せられていた。該相互作用の研究方法の一つに、免疫システムに関わる分子を簡便な形態で提供することがあった。例えば、バクテリオファージ・ライブラリは、イン・ビトロにおいて結合分子をスクリーニングするための抗体およびエピトープ（抗原決定基）を呈示する目的で使用されてきた。Smith,G.P.and Scott,J.K.Methods in Enzym.217,228（1993）;Winter,G.et al.Ann.Rev.Immunol.12,433（1994）等を参照されたい。
従って、その取りはずしステップや、タンパク質を再び折り畳むステップを行うことなく、十分な機能性を有する可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を大量に生成する方法が望まれる。さらに、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、結合分子の生体外（イン・ビトロ）スクリーニングが可能な形態で提供されるのが望ましい。
発明の開示
本発明は、バクテリオファージ外殻タンパク質（例えば、遺伝子IIIタンパク質または遺伝子VIIIタンパク質）と共有結合（つまり融合）されたｓｃＴＣＲ分子を含んでなるｓｃＴＣＲ融合タンパク質に関するものである。バクテリオファージ外殻タンパク質は、予期する以上にｓｃＴＣＲ融合タンパク質の可溶性を高めるので、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生産率および機能性を著しく向上させる。このｓｃＴＣＲ融合タンパク質は十分な可溶性かつ機能性を有しており、可溶化、取りはずし、または、再び折り畳むという厄介なステップを行うことなく大量に単離される。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の可溶性および機能性は、低速ホスト（宿主）細胞誘導条件の付与、ならびに融合タンパク質の発現に作用するベクター配列（リボソーム結合配列、リーダ（誘導）配列、およびプロモータ配列）を最適化することでさらに向上する。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、様々な形態で提供することが可能であり、例として、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と特異的に結合する結合分子のスクリーニングに使用されるバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリを挙げることができる。
本発明の融合タンパク質（以降、場合によりｓｃＴＣＲ融合タンパク質または可溶性融合タンパク質と称す）は、予期する以上の可溶性を有する。つまり、ｓｃＴＣＲとバクテリオファージ外殻タンパク質とを融合させると、可溶化、取りはずし、あるいはタンパク質を再び折り畳むという厄介なステップを行うことなく可溶性融合タンパク質が生成されることが発見された。発現細胞において形成される封入体はごくわずかであるので、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成率が飛躍的に向上する。加えて、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、予期する以上の機能性を有する。つまり、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、融合されたバクテリオファージ外殻タンパク質の存在下で、特異的に結合分子（抗原）またはその他のリガンド（配位子）と結合する。
本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、融通性のあるペプチドリンカー配列を介してＶ−α鎖と共有結合されたＶ−β鎖と融合される、バクテリオファージ外殻タンパク質またはそのフラグメント（断片）を含んでなる。
一般に、バクテリオファージ外殻タンパク質とは、バクテリオファージ遺伝子IIIタンパク質または遺伝子VIIIタンパク質を意味する。本発明において、バクテリオファージ外殻タンパク質は、全長を有する外殻タンパク質またはその好適なフラグメント（下記参照）を含む。バクテリオファージ外殻タンパク質またはその好適なフラグメントは、バクテリオファージ内にｓｃＴＣＲを包含し、該ｓｃＴＣＲをバクテリオファージ外殻をなす融合タンパク質構成分として呈示する。具体的なバクテリオファージ外殻タンパク質フラグメントおよびバクテリオファージ包含方法については、以下に詳細に記載される。
また、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、通常融合タンパク質標識を１つ以上（通常１つか２つ）有しており、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と共存する細胞成分からｓｃＴＣＲ融合タンパク質を精製する際に利用される。あるいは、さらに、該タンパク質標識を使用して、特異的な分解サイト（部位）を可溶性融合タンパク質に導入し、ｓｃＴＣＲ分子を該融合タンパク質から分解（分離）することも可能である。従って、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質を使用して、融合タンパク質を含まない十分な可溶性かつ機能性を有するｓｃＴＣＲ分子を入手することが可能である。
本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質から、重要な利益が多数得られる。例えば、従来では、ｓｃＴＣＲ融合を入手するのには長時間にわたる調製過程が必要であり、大量に生産する場合は、可溶化、およびタンパク質を再び折り畳むステップが必要な場合が多かった。一方、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、上記ステップを行うことなく容易に単離および精製できるので、融合タンパク質の可溶性、生産率、安定性および機能性が十分向上する。ここで重要なのは、融合タンパク質を使用することで、抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびスーパー抗原とｓｃＴＣＲとの相互作用がより容易に分析可能となることである。加えて、以下に詳細に記載するが、スーパー抗原やＡＰＣとの相互作用に関し、広範な種類の融合タンパク質が提供可能となった。
本発明の融合タンパク質は、十分な可溶性かつ機能性を有するｓｃＴＣＲを含む。従って、該融合タンパク質は、融合タンパク質と所望のリガンドとの相互作用テストに使用可能な種々の発現システムと組み合わせて使用できる。
このｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、種々の利用法において有用である。例えば、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡ断片（フラグメント）は、バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリの生成に使用可能である。ｓｃＴＣＲフラグメントを発現するライブラリとは対照的に、本バクテリオファージ・ライブラリは、全長を有するｓｃＴＣＲを融合タンパク質として発現する。よって、本バクテリオファージ・ライブラリを使用すれば、ｓｃＴＣＲ、特にｓｃＴＣＲ抗原結合ポケットの分析が促進される。従って、本バクテリオファージ・ライブラリは、抗原、抗体、小分子、スーパー抗原、ＭＨＣ／ＨＬＡペプチド複合体等、種々の結合分子を使用してのスクリーニングにおいて有用である。ここで重要なのは、本バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリは、Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖を伴った融合タンパク質を発現するので、生体内で発見されるＴＣＲにより類似した融合タンパク質が生成されることである。
加えて、本バクテリオファージ・ライブラリは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と結合分子との特異的結合複合体を最大量形成するため、逆に、殆ど結合していない、または結合力の弱い結合分子の検出がより増強される。本バクテリオファージ・ライブラリは、生体パニング技術（biopanning technique）、例えば、細胞パニングや免疫パニング技術、への応用が容易である。
バクテリオファージ・ライブラリの構成および使用
本発明のバクテリオファージ・ライブラリは、種々の結合分子のスクリーニングに使用されるキット中に備えられる。つまり、キットには、Ｔ細胞等の対象とされる細胞から生成された１つ以上のバクテリオファージ・ライブラリと、適切な宿主細胞株（例えば、大腸菌株）と、キット使用説明書とが含まれる。
本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、十分な可溶性と機能性を有するポリペプチドとして発現する。バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリの構成として使用する場合、ｓｃＴＣＲを、遺伝子IIIタンパク質、もしくは遺伝子VIIIタンパク質、またはそれらの適切なフラグメントに融合させ、ｓｃＴＣＲをバクテリオファージ外殻（カプシド）成分として発現させる。何れの形態でも、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を適切な結合分子に接触させて、特異的結合複合体を形成する。該結合分子は、以下に記載の標準的な方法により検出可能、また（所望する場合）精製可能でもある。
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を構成する目的で使用されるｓｃＴＣＲは、様々なソースから生成される。該ソースには、以下に記載の市販のＴＣＲ ＤＮＡ配列、または哺乳類、とくに人等の霊長類から採取される免疫細胞等の生物的ソースが含まれる。
本バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質突然変異物を呈示するように構成しても良い。通常、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質突然変異物とは、ｓｃＴＣＲ突然変異物に共有結合したバクテリオファージ外殻タンパク質、またはその適切適当なフラグメントを含んでなる。該ｓｃＴＣ突然変異物は、所望する結合分子に対する特異的結合親和性を高めるため、本発明に従って選択可能である。ｓｃＴＣＲ突然変異物およびｓｃＴＣＲ融合タンパク質突然変異物の生成方法は、以下に詳細に記載する。
また、本発明は、ｓｃＴＣＲに共有結合したバクテリオファージ外殻タンパク質またはその適切なフラグメントを含む可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質、をエンコードする配列からなるＤＮＡセグメントに関連する。通常、該ＤＮＡセグメントは、適切な宿主細胞中で融合タンパク質を発現可能なＤＮＡベクターとして提供される。該ＤＮＡセグメントは、機能可能に連結されたプロモータおよびリーダ配列を含み、以下に記載の宿主細胞培養条件下でより多くの可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現させる。
さらに、本発明の可溶性融合タンパク質を単離する方法が試みられている。該方法においては、可溶性融合タンパク質をエンコードする配列を含んでなるＤＮＡベクターを適切な宿主細胞に導入し（形質転換またはトランスフェクション）、低速誘導条件下で宿主細胞を培地中で培養する。通常、低速誘導条件とは、培地から必須栄養素（アミノ酸やリン酸塩等）が数時間かけて緩やかに取り出され、融合タンパク質をエンコードする配列の発現が誘導される細胞培養条件のことを指す。通常、低速誘導条件で誘導可能なＤＮＡベクターが選択される。そして、生成された融合タンパク質は、（所望する場合）精製され、実質的に純粋なｓｃＴＣＲ融合タンパク質が生成される。以下に詳細に記載するが、低速誘導条件は、可溶性と十分な機能性を有するｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生産を向上させる。あるいは、上記方法を、一本鎖Ｔ細胞レセプターをエンコードするＤＮＡベクターを含む場合に適用し、可溶性の一本鎖Ｔ細胞レセプターを発現させ、（所望する場合）それを精製することも可能である。宿主細胞とは、細菌、昆虫、あるいは哺乳類の細胞である。
本ｓｃＴＣＲ融合タンパク質に、１つ以上の適切なタンパク質標識（例えば、６ＸＨｉｓ）を付与し、融合タンパク質の細胞からの精製を容易とすることが望ましい場合がある。通常、細胞培地あるいは細胞抽出物を、タンパク質標識を結合した合成マトリックスに接触させる。あるいは、または、さらに、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質に、ｓｃＴＣＲを該融合タンパク質より分離する目的で使用可能な１つ以上の分解性タンパク質標識を付与し、これにより可溶性かつ十分な機能性を有するｓｃＴＣＲ分子を生成しても良い。
本発明には、本発明の可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードする配列を含んでなるＤＮＡセグメントの単離方法も含まれる。通常、該方法では、本発明により生成されたバクテリオファージ・ライブラリを宿主細胞に感染させ、細胞内でバクテリオファージが増殖可能な条件下（例えば、低速誘導条件）で、該細胞を培養する。次に、結合分子と少なくとも１つのバクテリオファージとが結合可能な条件下で、感染細胞を所望の結合分子、望ましくは検知可能な標識が付された結合分子に接触させる。バクテリオファージ・ライブラリのスクリーニング方法は当該技術分野では公知であり、例えば、以下に記載のSambrook et al.に説明されている。結果として形成される特異的結合複合体は認識され、続いて、それを有するバクテリオファージが単離され、さらに、（所望する場合）精製される。このようにして、該複合体に含まれるｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントが単離される。
タンパク質、ポリペプチド、および核酸等の結合分子に、検出可能な標識を付す方法は当該技術分野では公知であり、例えば下記のSmbrook et al.やAusubel et al.に説明されている。
さらに、所望のｓｃＴＣＲの特異的結合親和性の向上方法も提供される。通常、該方法では、ｓｃＴＣＲと所望の結合分子（例えば、抗原やその他のリガンド）との間の特異的結合親和性が決定され、続いて、適切な宿主細胞を融合タンパク質突然変異物を発現するバクテリオファージ・ライブラリにより感染させる。次に、感染細胞を、所望の結合分子、望ましくは検知可能な標識を付した結合分子に接触させて特異的結合複合体を形成した後、該特異的結合複合体が認識される。次に、対応する融合タンパク質突然変異物をエンコードするＤＮＡセグメントが、標準的な手段で単離される。所望する場合、ＤＮＡセグメントを、適切なＤＮＡベクターにサブクローン化し、宿主細胞内で増殖させても良い。上記方法により生成されたｓｃＴＣＲ突然変異物は、（所望する場合）適当なタンパク質標識を分解して融合タンパク質から分離される。次に、抗原とｓｃＴＣＲ突然変異物との間の特異的結合親和性が決定される。向上された特異的結合親和性を示すｓｃＴＣＲは、ｓｃＴＣＲタンパク質よりも大きな特異的結合親和性を有するｓｃＴＣＲ突然変異物として、容易に識別される。
哺乳類における不所望な免疫反応は、１つの方法、または、該方法に代わる他の方法を組み合わせることで本発明により抑制または排除できる。通常、本発明は、薬学上可能な処方で有効量のｓｃＴＣＲを供給することにより、哺乳類における免疫反応（応答）を抑制または排除する治療法を提供する。通常、ｓｃＴＣＲは、特に、ウイルス感染、自己免疫疾患、移植拒絶、またはガン等に伴う病原性Ｔ細胞において発生するＴＣＲのうちの１つ以上のＴＣＲと、抗原をめぐり競合しうるものである。特に、対応ＴＣＲと比較して、抗原に対する特異的結合親和性が大きな（例えば２〜１０倍）ｓｃＴＣＲを使用して、所望の免疫反応を抑制または排除することが可能である。タンパク質競合分析法は、当該技術分野では公知であり、ｓｃＴＣＲの競合活性のスクリーニングに使用される。
加えて、本発明は、ｓｃＴＣＲまたはｓｃＴＣＲ融合タンパク質の精製サンプルを使用した、標準的免疫技術による（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体の生成方法を含む。通常、ｓｃＴＣＲは本発明の可溶性融合タンパク質より入手されるので、ｓｃＴＣＲの生産率が従来と比較して向上する。抗体は、１つ以上のｓｃＴＣＲのエピトープを含んでなる免疫原性ペプチドからも生成可能である。上記のような抗体、特にモノクローナル抗体は、血液または血清などの生体サンプル中の病原性Ｔ細胞の検出など、様々な応用で有用である。また、該抗体を使用して特に標的Ｔ細胞と抗原またはＭＨＣ／ＨＬＡペプチド複合体との相互作用を抑えることにより、イン・ビボまたはイン・ビトロにおける標的Ｔ細胞の活性を大幅に抑制、または、阻害しても良い。公知のように、適当な細胞障害性物質または代謝拮抗物質を、該抗体に共有結合させておくことが望ましい場合もある。
さらに、本発明は、有効量のｓｃＴＣＲ（本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質から分離されたもの）を投与して、哺乳類、とくに人等の霊長類の免疫反応を誘導する方法にも関連する。ｓｃＴＣＲの単離は、本発明にかかる可溶性かつ十分な機能性を有するｓｃＴＣＲ融合タンパク質からｓｃＴＣＲを入手することで行われる。該ｓｃＴＣＲは、Ｔ細胞（つまり、標的Ｔ細胞）の表面に発生し、免疫反応において病原性、または、不所望な機能を果たすＴＣＲ抗原性構造に対する免疫を、哺乳類に付与する目的で使用される。上記Ｔ細胞は生体サンプル中で、従来公知の種々の方法により認識される。次に、該Ｔ細胞は精製され、以下に記載の実施例に従い、イン・ビトロにおいて増殖反応が可能か否かが分析される。増殖反応を示すＴ細胞は培養細胞系として確立され、該培養細胞系から、本発明で開示の方法により、ＴＣＲをエンコードするＤＮＡが単離され、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質突然変異物などの、対応するｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成に使用される。対象となるＴＣＲ抗原構造とは、通常、クロノトピックエピトープ（clonotypic epitope）、Ｖ−αまたはＶ−βファミリー特異的エピトープ（Ｖ−α or Ｖ−β family-specific epitope）、配座エピトープ（conformational epitope）、直線エピトープ等を指す。Ｔ細胞の表面に発生するＴＣＲ抗原構造に対する免疫が付与されると、Ｔ細胞の活動が阻止され、該Ｔ細胞の病原性または不所望な作用が抑制または排除される。通常、哺乳類は、有効量のｓｃＴＣＲ（本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質から分離されたもの）を薬学上可能な処方により投与されることで該免疫を取得し、これにより宿主免疫システムが標的Ｔ細胞を著しく減少させる、または、排除する。
さらに、ＴＣＲと特異的に結合可能な結合分子（例えば、抗原）の検出方法も試みられている。通常、該方法はイン・ビトロ スクリーニングにより行われ、本発明のバクテリオファージ・ライブラリは、上記分子がライブラリ中の少なくとも１つのバクテリオファージと特異的に結合する条件下で、該分子共の存下でインキュベートされる。バクテリオファージにより呈示されるｓｃＴＣＲ融合タンパク質と、結合分子との間で形成された特異的結合複合体は、容易に検出される。通常、該特異的結合複合体の存在は、バクテリオファージによりエンコードされたｓｃＴＣＲに対応する、ＴＣＲと特異的に結合可能な結合分子の存在を示唆する。選択されたバクテリオファージは、本発明で開示する方法により容易に増殖され、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントが単離される。
さらに、本発明は、抗原とＴＣＲとの間の特異的な結合を阻害可能な結合分子の検出方法に関連する。該方法は、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質を、抗原と該融合タンパク質とが特異的結合複合体を形成可能な条件下で、結合分子と共にインキュベートするイン・ビトロ スクリーニングを含むものである。他の反応において、該融合タンパク質は、同一または類似のインキュベート条件下で、抗原と結合分子と共にインキュベートされる。以降、リガンドの存在下および非存在下での抗原と融合タンパク質との相互作用が、標準的な結合分析法により分析される。抗原とＴＣＲとの間の特異的な結合を阻害可能なリガンドとは、該リガンドの存在下で、融合タンパク質と抗原との相互作用がより低頻度で観測されるものを指す。
【図面の簡単な説明】
図１ＡはｐＪＲＳ１４９ベクターを、図１ＢはｐＫＣ１２ベクターを示す図である。
図２は、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡベクター形成のアウトラインを説明するフローチャートである。
図３は、ｐＫＣ４４、ｐＫＣ４６、およびｐＫＣ５１ ＤＮＡベクターの一部を示す図である。
図４は、ｐＫＣ４５、ｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）、およびｐＫＣ５１ ＤＮＡベクター形成のアウトラインを説明するフローチャートである。
図５は、ＰＥＮ２ ＤＮＡベクターを示す図である。
図６Ａは、ｐＫＣ６１、ｐＫＣ６３、およびｐＫＣ６５ ＤＮＡベクターの一部を示す図であり、図６Ｂは、ｐＫＣ６０、ｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）、ｐＫＣ６４、ｐＫＣ６６、およびｐＫＣ６７ ＤＮＡベクターの一部を示す図である。
図７は、ｐＫＣ６０、および、ｐＫＣ４６ ＤＮＡベクターそれぞれからの融合タンパク質の合成を比較するウエスタン・ブロットである。
図８は、ＭＭ２９４、Ｋ９１Ｋａｎ、ＸＬ１−Ｂ、ＴＢ−１、およびＵＴ−５６００細胞系における、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現を示すウエスタン・ブロットである。
図９は、バクテリオファージ遺伝子VIIIタンパク質を含んでなるｓｃＴＣＲ融合タンパク質の免疫親和精製のアウトラインを示す図である。
図１０は、ＤＮＡベクターｐＫＣ５１およびｐＫＣ４６、ならびにその精製フラクション（画分）由来の融合タンパク質の発現を示すウエスタン・ブロットである。
図１１は、ｐＫＣ５１ベクター由来の精製ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を示すクーマシーブルー染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ ゲルである。
図１２は、ｐＫＣ５１ベクター由来の精製ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のウエスタン・ブロットである。
図１３は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質ｐＫＣ６０およびｐＫＣ６２による免疫沈降（immunoprecipitation）実験を示すウエスタン・ブロットである。
図１４は、ｐＫＣ５１がエンコードする融合タンパク質の表面プラズマ共鳴分析を示すグラフである。
図１５は、表面プラズマ共鳴分析による、抗−ＴＣＲ（Ｖ−β ８．２）抗体（ＭＲ５−２）、抗−αβＴＣＲ抗体（Ｈ５７−５９７抗体）、および抗−Ｍ１３抗体間の相互作用を示す模式図である。
図１６は、ｐＫＣ６０がエンコードするｓｃＴＣＲ融合タンパク質と、ＳＥＣ３スーパー抗原との間の結合の、表面プラズマ共鳴分析を示すグラフである。
図１７は、抗−ＨＳ７抗体を用いたエライザ法による、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現するバクテリオファージの捕獲を比較するグラフである。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ｐｃＫ４６ベクターから発現したものである。
図１８は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現する、ｐＫＣ５１ベクターを用いて構成されたバクテリオファージの、エライザ法による滴定分析を示すグラフである。
図１９Ａは、ｐＫＣ５１ベクターがエンコードするｓｃＴＣＲ融合タンパク質による、ｇＤ１２ハイブリドーマ細胞のＩＬ−２産生阻害を示す図であり、図１９Ｂは、ｐＫＣ５１ベクターがエンコードするｓｃＴＣＲ融合タンパク質による、Ｄ０１１．１０Ｔハイブリドーマ細胞のＩＬ−２産生阻害を示す図である。
図２０は、ｐＫＣ７０、ｐＫＣ７１、およびｐＫＣ７２バクテリオファージベクターを示す図である。
図２１Ａ〜２１Ｇは、以下に記載のＤＡＮベクターの構築に使用されるＤＮＡオリゴヌクレオチド・プライマーを示す表である。図２１Ａには（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：１−１６）、図２１Ｂには（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：１７−３０）、図２１Ｃには（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：３１−４５）、図２１Ｄには（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：４６−６３）、図２１Ｅには（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：６４−７９）、図２１Ｆには（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：８０−９５）、図２１Ｇには（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：９７−１００）を示す。
図２２は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＶ−β鎖の構築に使用されるＤＮＡオリゴヌクレオチド・プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：１１６−１３１）を示す表である。
図２３は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＶ−α鎖の構築に使用されるＤＮＡオリゴヌクレオチド・プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：１０１−１１５）を示す表である。
発明の詳細な記述
ここまでの記述でまとめたように、我々は、ｓｃＴＣＲ分子に共有結合したバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはその好適なフラグメントを含んでなる、十分に可溶でかつ機能的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質を得た。該ｓｃＴＣＲは、一本鎖ペプチドリンカー配列によってＶ−β鎖に共有結合したＶ−α鎖を含む。該ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードしているＤＮＡのセグメントとベクターとは、イン・ビトロにおいて結合分子を検出するのに好適な形でｓｃＴＣＲ融合タンパク質を呈示するバクテリオファージ・ライブラリを構築するのに役に立つ。
一般に、本ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ここに開示する過程と、一般に知られた組換えＤＮＡ技術とを用いて調製することができる。従来の技術には、例えば、プラズマＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡの切り出し、ＤＮＡのライゲーション、宿主細胞の形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、あるいはバイオリスティック転換、宿主細胞の培養、発現させたＤＮＡの単離と精製などがあげられる。一般的な説明については、Sambrook et al.in Molecular Cloning:A Laboratory Manual（2nd ed.1989）;及びAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,1989を参照されたい。なお、これらの文献は参考文献としてここに記されるものである。
本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、あるｓｃＴＣＲに融合したバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはその適当なフラグメントを含んだ一本鎖融合タンパク質である。通常、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントは、大腸菌の繊維状ファージ由来の遺伝子IIIタンパク質または遺伝子VIIIタンパク質である。該ｓｃＴＣＲは、好適なペプチドリンカーによりＶ−β鎖に融合されたＶ−α鎖を含んでなる。したがって、該ｓｃＴＣＲはＴ細胞に関連したＴＣＲ由来のＶ−α鎖及びＶ−β鎖に相当する。Ｔ細胞は自然の状態でも存在するし、あるいは癌に付随して起こる免疫機構疾患、自己免疫機構障害、アレルギー、あるいはウイルス感染などの病気と関連しても見つかる。一般に、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＶ−α鎖及びＶ−β鎖は、長さがおよそ２００個から４００個のアミノ酸に相当し、好ましくは、およそ３００個から３５０個のアミノ酸に相当し、また、ＴＣＲのＶ−α鎖及びＶ−β鎖に少なくとも９０％、好ましくは１００％相同なものである。ここで、”相同である”とは、該Ｖ−α鎖及びＶ−β鎖をなすアミノ酸が、対応するＴＣＲのＶ−α鎖及びＶ−β鎖と１００％同一であることを意味する。本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質と結合分子との間の特異的な結合は、免疫吸着や免疫滴下などの方法で評価することができる。
先に述べたように、該ｓｃＴＣＲは大腸菌の繊維状ファージ由来のバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントと融合させることができる。繊維状ファージの典型的な例は、上記のSambrook et al.とSmith and Scottとが開示している。ここで”フラグメント”とは、バクテリオファージにパッケージングする（包含される）ことができ、かつバクテリオファージの表面に本発明に係る可溶性融合タンパク質を呈示できるバクテリオファージ外殻タンパク質の一部を意味している。一般に、バクテリオファージ遺伝子VIIIフラグメントは、長さが４０個から５０個のアミノ酸に相当し、好ましくは、およそ５０個のアミノ酸に相当する。バクテリオファージ遺伝子IIIフラグメントは、長さがおよそ２００個から４００個のアミノ酸に相当し、好ましくは、およそ４００個のアミノ酸に相当する。バクテリオファージ外殻タンパク質フラグメントが好適にバクテリオファージにパッケージされているかどうかを決定する方法は公知であり、一般に血小板型分析に関する方法で行われる。さらに、バクテリオファージ外殻タンパク質フラグメントは、下記の生体パニング分析などの標準的な免疫学的方法で決定したものにしたがってｓｃＴＣＲ融合タンパク質をバクテリオファージの表面に呈示することができる。バクテリオファージ外殻タンパク質フラグメントは、ここで記述するように、バクテリオファージ外殻タンパク質をエンコードするＤＮＡの一部が除去されるようにＤＮＡベクターを突然変異（つまり、サイト標的突然変異誘導あるいは端末の欠失）させる、等の様々な方法で作ることができる。そして、該ＤＮＡベクターは、フラグメントをエンコードするＤＮＡを、ｓｃＴＣＲをエンコードする所望のＤＮＡのセグメントに融合させる目的で使用される。
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＶ−α鎖は、Ｖ−α鎖のＣ末端とＶ−β鎖のＮ末端とに融合する好適なペプチドリンカーを介してＶ−β鎖に共有結合している。Ｖ−β鎖は、Ｖ−β鎖のＣ末端に融合したＣ−β鎖フラグメントをさらに含んでいても良く、Ｖ−α鎖は、Ｖ−α鎖のＣ末端とペプチドリンカーのＮ末端とに融合したＣ−αフラグメントをさらに含んでいても良い。一般に、Ｃ−β鎖フラグメントは、長さがおよそ５０個から１２６個のアミノ酸に相当する。重要なことは、該Ｃ−β鎖フラグメントが、第１２７位（最後）のシステイン残基を含まないことである。Ｃ−α鎖フラグメントは、長さがおよそ１個から２１個のアミノ酸に相当し、おおよそＣ−α鎖の第１位のアミノ酸（イソロイシン）から第２１位のアミノ酸に相当する。該Ｃ−α鎖フラグメントはシステイン残基を一切含まない。バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントは、Ｖ−β鎖あるいはＣ−βフラグメントのＣ末端と融合される。また、これとは異なり、タンパク質標識をＶ−β鎖（あるいはＣ−β鎖フラグメント）のＣ末端と、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントのＮ末端とに融合させても良い。また、該タンパク質標識をＶ−β鎖（あるいはＣ−β鎖フラグメント）のＣ末端と、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントのＮ末端とに融合させ、第２のタンパク質標識（同じでも良いし、異なっていても良い）をバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントのＣ末端に融合させても良い。これとはさらに異なり、該タンパク質標識をバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントのＣ末端に融合させ、このバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントをＮ末端においてさらにＶ−β鎖（あるいはＣ−β鎖フラグメント）のＣ末端に融合させても良い。
さらに手が加えられたｓｃＴＣＲ融合タンパク質としては、Ｖ−α鎖のＮ末端に融合されたタンパク質標識を有するｓｃＴＣＲ融合タンパク質が挙げられる。また、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントをＶ−α鎖（あるいはＣ−αフラグメント）のＣ末端に融合させ、この鎖をＶ−α鎖のＮ末端に融合したペプチドリンカーによってＶ−β（あるいはＣ−βフラグメント）のＣ末端と共有結合的にリンクさせても良い。
本発明に係る別のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ペプチドリンカー配列を２つ含んでおり、第１のペプチドリンカー配列はＶ−α鎖のＣ末端とＶ−β鎖のＮ末端とに融合している。Ｖ−β鎖のＣ末端は、適当なＣ−β鎖フラグメントのＮ末端に融合している。さらに、第２のペプチドリンカー配列は、Ｃ−β鎖フラグメントのＣ末端とバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントのＮ末端とに融合している。
融合タンパク質に含まれるｓｃＴＣＲ分子は、ペプチドリンカー配列を含んでなり、該ペプチドリンカー配列はＶ−α鎖とＶ−β鎖を効果的に配置する目的で柔軟な使い方ができる。つまり、ペプチドリンカー配列によりＶ−α鎖とＶ−β鎖とは、抗原などの分子を特異的に結合可能なポケットに配置される。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質に結合する抗原は、下記の分析で決定したＴ細胞の活性を調節する目的で使用できる。こういった分析の典型的な例として、ＴＣＲを発現するＴ細胞を培養して増殖させ、Ｔ細胞をｓｃＴＣＲ融合タンパク質（あるいはそこから得られたｓｃＴＣＲ）と接触させ、次に該融合タンパク質がＴ細胞の活性を調節できるかどうか評価する一連のステップを含んだイン・ビトロ分析が挙げられる。
以上で述べたｓｃＴＣＲ融合タンパク質のいずれにおいても、Ｖ−β鎖は、Ｖ−β鎖のＣ末端とＶ−α鎖のＮ末端とに融合する好適なペプチドリンカーを介してＶ−α鎖に共有結合している。
所望のＶ−α鎖とＶ−β鎖とをエンコードするＤＮＡセグメントは、Ｔ細胞ハイブリドーマや、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）などのＴ細胞を初めとする様々なものから得ることができる。ＣＴＬは自然の状態でも存在するし、また、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギ）あるいは霊長類（人、チンパンジー）の病原免疫機構反応と関連しても存在する。例えば、ＣＴＬはウイルス感染、癌、自己免疫疾患、アレルギー、あるいは移植拒絶反応を起こしている患者、あるいはその疑いのある患者から採取することができる。さらに具体的には、ＣＴＬを、ＤＮＡあるいはＲＮＡウイルスに罹患した患者から単離して、本発明の方法にしたがってｓｃＴＣＲ融合タンパク質を作り出すことができる。例えば、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、長期非進行と類別されたＨＩＶ患者から得られるＣＴＬを使って調製できる。下記の実施例１８を参照されたい。ＣＴＬは、これ以外に、定着（established）悪性腫瘍や黒色腫の患者から単離される、抗原特異的なＣＴＬやＴＩＬからも得られる（例えば、Cox A.et al.Science（1994）264:716;Rosenberg,S.A.et al.N.Eng.J.Med.（1988）319:1676;Kawakami,Y.et al.J.Exp.Med.（1994）180:347;Kawkami,Y.et al.PNAS（1994）91:6458を参照）。特に注目される病原免疫反応としては、硬化症、インシュリン依存糖尿病、リュウマチ性の関節炎、アレルギー、癌（つまり、ＣＥＡなど、腫瘍に関連する抗原に対する免疫反応）、組織や皮膚などの移植手術を行った患者の細胞組織拒絶反応、感染性の疾患、特にＲＮＡウイルスあるいはＤＮＡウイルスが関与する感染性の疾患などが挙げられる。具体的に注目されるウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、ポックスウイルス、エプステインバー（Epstein Barr）、アデノウイルス、ポリオーマウイルスなどが挙げられる。また、該Ｖ−α鎖とＶ−β鎖とをエンコードするＤＮＡのセグメントは、以下に記すＴＣＲのＤＮＡ配列を開示する公共のデータベースからも入手可能である。
細胞からＶ−α鎖とＶ−β鎖とを得ることに関し、そのＤＮＡセグメントを調製するにはいくつかの方法がある。具体的には、α鎖ＤＮＡとβ鎖ＤＮＡとを調製するために、所望のＴＣＲ結合特異性を示す細胞よりｍＲＮＡを分離する。この方法では、一般に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、つまりｍＲＮＡから作った第１ストランドｃＤＮＡ鋳型を用いるプロトコールが使用される。そして、標準的な組換え技術を使って該所望のＶ−α鎖とＶ−β鎖を作る。上記所望のα鎖とβ鎖とをエンコードするＤＮＡセグメントを、次に、適当なペプチドリンカー配列とタンパク質標識とを含むように調製する。次に、必要に応じて、ＤＮＡを適当なパッケージングシステムにパッケージし、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を呈示する組換えバクテリオファージを生成する。該ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントは、サブクローニング技術、あるいは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の挿入片の側方に付されたバクテリオファージＤＮＡにハイブリッドするＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅法など、従来の組換え技術でバクテリオファージから容易に分離できる。一般に、オリゴヌクレオチドは、その長さがおよそ１２個から５０個のヌクレオチドよりなり、より好ましくは、およそ２０個から２５個のヌクレオチドよりなる。このようにして得られた、該融合タンパク質をエンコードするＤＮＡを使えば、大腸菌などの好適な宿主細胞内で相当量の可溶性融合タンパク質（１ｇの細胞に対してミリグラム単位の量）が調製できる。
ＤＮＡセグメントは通常リーダー配列を含み、適切な細胞プロセシングを行うことができる。一般に、リーダー配列はｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードする配列の５’末端に融合している。具体的には、該リーダーはＶ−α鎖を（実施の形態によってはＶ−β鎖を）エンコードするＤＮＡ配列の５’末端に共有結合している。ただし、特異的なリーダー配列はベクター中の特定のα鎖あるいはβ鎖にリンクしているのであるが、組換え技術を使って融合タンパク質のプロセシングに悪影響を及ぼすことなくリーダー配列を入れ替えることができることが理解されよう。したがって、好適な実施例のうちの一つでは、Ｖ−α鎖の５’末端がリーダー配列の３’末端に共有結合している。リーダー配列は、長さがおよそ１２個から２６個のアミノ酸残基よりなる。好適なリーダー配列は、下記の実施例３で開示する改変Ｐｅｌ Ｂ配列である。
ＤＮＡセグメントは通常、ｔｒｐオペロンプロモーター、ラックプロモーター、ｔｒｐ−ラックプロモーター、ラック^uvsプロモーターあるいはｐｈｏＡプロモーターなどのプロモーターをさらに含んでなる。好適なプロモーターは、例えばｐｈｏＡなどの、数時間（例えば２時間から１０時間）にわたる低速誘導条件下において、強力かつ調節的な発現に寄与するものである。好適な培養条件下では、強力なプロモーターのほとんどが、宿主細胞のタンパク質総量の１０％程度、あるいはそれを超える融合タンパク質を生成しうる。
本発明のバクテリオファージ・ライブラリは、数ステップで容易に作ることができる。例えば、ｓｃＴＣＲをエンコードするＤＮＡセグメントは、上で概説した方法で作ることができる。次にＤＮＡを好適なファージあるいはファージ由来のベクター（例えばファージミド）にライゲーションし、該ＤＮＡを、バクテリオファージ外殻タンパク質、通常は、遺伝子IIIタンパク質または遺伝子VIIIタンパク質をエンコードする配列に融合させる。これ以外に、バクテリオファージ外殻タンパク質フラグメントに融合させても良い。このようにして生成された組換えファージ、あるいはファージ由来の組換えベクターは、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントに融合したｓｃＴＣＲを含んでいる。場合によっては、上記のように単数あるいは複数のタンパク質標識をエンコードする配列、あるいは停止コドンをさらに含んでいることが望ましい。続いて、好適な大腸菌系統に感染させると、バクテリオファージの表面に該融合タンパク質が多数部（通常は数十部から数百部）呈示される。注目しているｓｃＴＣＲを呈示する組換えビリオンの生成量を増やすためには、ヘルパーファージを加える。異なるバクテリオファージと大腸菌系統とを用いてバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリを構築する一般的な方法は開示されている。一般の記述については、上記のSmith and ScottやParmley,S.F.,and Smith,G.P..（1988）Gene 73,305を参照されたい。
バクテリオファージ・ライブラリを作成するに使用される特定のｓｃＴＣＲとしては、哺乳類から得られるＶ−α鎖及び／またはＶ−β鎖を有するｓｃＴＣＲが挙げられる。哺乳類の典型例としては霊長類やげっ歯類が挙げられるが、霊長類中では特に人とチンパンジーが挙げられ、げっ歯類としては、免疫的に虚弱な、ヌードマウス、あるいはＨＬＡ−ＡＳ抗原複合体を発現可能なトランスジーンを含んだマウスが挙げられる（Vitiello,A.et al.,J.Exp.Med.,（1991）175,1002）。人の中で特に注目すべきは癌、感染症、自己免疫疾患、あるいは移植拒絶反応を起こしている、あるいはその疑いのある患者である。
本発明に係るバクテリオファージ・ライブラリは、融合タンパク質突然変異物を呈示するようにも構築できる。この”突然変異物”とは、突然変異したアミノ酸を１分子当たり平均１つ含んだ融合タンパク質を指す。さらに具体的には、アミノ酸の突然変異とは、融合タンパク質のｓｃＴＣＲ部分においてアミノ酸が置換されたものを指し、これによりｓｃＴＣＲ突然変異物が生成される。一般に、ｓｃＴＣＲ突然変異物は、平均して１つのアミノ酸置換を含むように構築される。突然変異物の生成及び分析方法については以下に詳しく記す。
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質突然変異物を呈示するバクテリオファージ・ライブラリは数ステップで容易に生成できる。例えば、上記のようにペプチドリンカー配列によって結合された、好適なＶ−α鎖をエンコードするＤＮＡセグメントとＶ−β鎖をエンコードするＤＮＡセグメントとを単離することで、所望のｓｃＴＣＲが得られる。該ＤＮＡをライゲーションし、次に、ｓｃＴＣＲのＶ−α鎖およびＶ−β鎖における所望の領域内に、例えば、局所的に突然変異を導入することで該ＤＮＡを改変する。突然変異の誘導方法の典型例としては、アラニン走査突然変異誘導（alanine scanning mutagenesis）が挙げられる（例えば、Nisbet,I.T.et al.（1985）Gene Anal.Tech.2,23;Hines,J.C.,Gene（1980）11,207;及び上記のSambrook et al.を参照）。上記突然変異は、ｓｃＴＣＲの相補性決定領域（すなわちＣＤＲ、あるいは高頻度可変領域とも呼ばれる）が有する結合親和性に影響を及ぼすアミノ酸置換であれば、ここでは好適である。更に具体的には、該アミノ酸置換とは同類置換あるいは非同類置換であり、ここで使用するように、あるアミノ酸とｓｃＴＣＲ中のアミノ酸とを置き換えることを意味している。場合によっては、この置換には、あるアミノ酸を、化学的性質が相当類似した他のアミノ酸で置き換える（同類置換）ことが含まれるし、また、場合によっては、あるアミノ酸を、化学的性質が相当異なる他のアミノ酸で置き換える（非同類置換）ことが含まれる。したがって、フェニルアラニン残基でｓｃＴＣＲ中のチロシン残基の置換が行われると、これは同類アミノ酸置換であり、プロリン残基でアラニン残基の置換が行われると、これは非同類アミノ酸置換である。当業者であれば、突然変異誘導によって、ｓｃＴＣＲのＶ−α鎖とＶ−β鎖とを分かつペプチドリンカー配列のアミノ酸構成の長さも変化する可能性があると解するであろう。しかしながら、大抵の場合、突然変異誘導はＶ−α鎖とＶ−β鎖とに焦点を絞っており、融合タンパク質のＶ−α鎖あるいはＶ−β鎖内で平均１つのアミノ酸突然変異置換を引き起こすものである。突然変異誘導の程度は、突然変異を起こしたＶ−α鎖あるいはＶ−β鎖のＤＮＡ配列の解析を行うことで容易に分析できる。
上記方法ほど好適ではないが、本発明に係るバクテリオファージ・ライブラリを、アミノ酸置換基の導入作用が知られる化学的突然変異原（例えばＥＭＳ）に曝しても良い。これにより、バクテリオファージの表面に呈示されるｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、融合タンパク質突然変異物を含むこととなる。このような方法を取る場合、化学的突然変異原の使用量（あるいは、該突然変異原への暴露の程度）は、Ｖ−α鎖あるいはＶ−β鎖毎に平均１つのアミノ酸置換をおこす程度に調整することが好ましい。上記のような、融合タンパク質突然変異物（ｓｃＴＣＲ突然変異物も含む）を発現するバクテリオファージ・ライブラリは、所望の抗原に対する特異的な結合親和性が強化された融合タンパク質を検出する際に特に有用である。
本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、通常、ある一つのＴＣＲに対応したある一つのｓｃＴＣＲを含んでなる。一般に、ＴＣＲを発現するＴ細胞は、自然条件下で、あるいは、イン・ビボにおいては病理学的条件下（例えばＴ_S、Ｔ_C、あるいはＴ_H細胞）で存在する。あるいは、Ｔ細胞ハイブリドーマとして培養することもできる（例えば、Ｄ１０あるいはＢ１２細胞系）。下記の実施例１を参照されたい。上記のように、Ｔ細胞は、癌、感染症、自己免疫不全、あるいはアレルギーを発症している、またはその疑いのある患者から分離したＣＴＬを含んでいる。このＴ細胞は、ＴＣＲ配列（すなわちＶ−α鎖配列、Ｃ−α鎖配列、Ｖ−β鎖配列、及びＣ−β鎖配列）をエンコードするＤＮＡを生成するが、こういったＤＮＡは本発明中で開示する方法で得られる。該ＤＮＡを得るには、これ以外にも、従来の方法で、公的に入手可能なＤＮＡ配列に相応のオリゴヌクレオチドプライマーを形成し、そのＤＮＡをＰＣＲ増幅しても良い。例えば、Kabat,E.A.,et al.（1987）Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th ed.Public Health Service,N.I.H.Washington,D.C.and Chotia,C.et al.（1988）EMBO J.7:3745を参照されたい。
より具体的には、所望されるＶ−α鎖配列、Ｃ−α鎖配列、Ｖ−β鎖配列、あるいはＣ−β鎖配列をエンコードするＤＮＡは、ＰＣＲ法やその他好適なＤＮＡクローニング方法により増幅することができる。ＰＣＲ法を選択した場合には、オリゴヌクレオチドプライマーに隣接する既定のＴＣＲ ＤＮＡ（Ｖ−α鎖配列、Ｃ−α鎖配列、Ｖ−β鎖配列、あるいはＣ−β鎖配列）を増幅すべく、ＰＣＲ用ＤＮＡオリゴヌクレオチドが選択される。ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドは、通常、長さがおよそ１２個から５０個のヌクレオチドに相当し、好ましくは、およそ２０個のヌクレオチドに相当する。該プライマーは、所望のＴ細胞から分離されたゲノムＤＮＡ、あるいは、Ｖ−α鎖配列、Ｃ−α鎖配列、Ｖ−β鎖配列、あるいはＣ−β鎖配列をエンコードするＤＮＡを含んでなるＤＮＡベクター内のＤＮＡを増幅する目的で使用される。ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ生成物に、必要に応じてライゲーション部位を導入するための特異的な制限酵素切断部位を付加する制限部位を含んでいれば好適である。プライマーの典型的な例は、以下の実施例と図面とに記す。生成したＰＣＲ生成物は増幅されたＶ−α鎖配列とＶ−β鎖配列とを含んでなり、さらに、融合タンパク質を最適に発現できるよう、以下に記すようにリボソーム結合配列と、リーダー配列と、プロモーター配列とを含むよう調節しても良い。好適な、プライマー、ＰＣＲ条件、及び発現ベクターは以下の実施例と図面とに開示する。
上記ペプチドリンカー配列により、融合タンパク質のＶ−α鎖とＶ−β鎖とは、抗原結合ポケットの形成が効果的に行われるように配置される。こうすることにより可溶性融合タンパク質は、抗原（例えば、スーパー抗原、あるいはＭＨＣ／ＨＬＡペプチド複合体中の抗原）と特異的に結合することができる。重要なのは、これによって、融合タンパク質が、自然にあるいは病理学的に存在するＴ細胞の表面に位置するＴＣＲと競合することができる点にある。”競合する”とは、対応するＴＣＲの特異的結合親和性に等しいか、好適にはそれを超えたレベルで該融合タンパク質が抗原と結合できることを意味する。一般に、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質（あるいはそこから派生したｓｃＴＣＲ分子）は、対応するＴＣＲに比べておよそ２倍から１０倍高い結合親和性を示す。結合親和性を決定する方法は公知であり、ここで開示する。”対応する”とは、ｓｃＴＣＲのＶ−α鎖及び／或いはＶ−β鎖を作るためにＴＣＲ（あるいはそれをエンコードするＤＮＡ）を使用することを意味する。
本発明の好適な実施例では、ポリペプチドリンカー配列はおよそ７個から２０個のアミノ酸からなり、好適にはおよそ１０から２０個のアミノ酸からなり、さらに好適にはおよそ１２から２０個のアミノ酸からなっている。リンカー配列は、抗原を最適に結合できるかたちにＶ−α鎖とＶ−β鎖とを配置すべく該融合タンパク質中に設けられるが、この配置には通常、融通性が持たされる。リンカーは好ましくは、その大部分がグリシン、アラニン、セリンなどの小さな側鎖を持ったアミノ酸からなっていて、これが上記融通性を与えている。好ましくは、およそ８０％から９０％、あるいはそれ以上のリンカー配列が、グリシン残基、アラニン残基、あるいはセリン残基からなり、中でも特にグリシン残基とセリン残基とからなっている。リンカー配列に、融通性を阻害するプロリン残基が一切含まれないことが好適である。リンカー配列は、好適には融合タンパク質のＶ−α鎖のＣ末端とＶ−β鎖のＮ末端とに連結されている。実施例１、実施例２、及び図３、図６Ａ、図６Ｂ、及び図２０を参照されたい。
（ＧＧＧＧＳ）₄配列（すなわち、Gly Gly Gly Gly Sel）₄を含んだ好適なリンカー配列には、ＪＡ３０２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）とＪＡ３０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）とがある。リンカー配列は、ｓｃＴＣＲのＶ−α鎖のＣ末端残基と同Ｖ−β鎖の第１アミノ酸との間にリンクしていることが好ましい。抗体可変領域を好適に組合わせることによる融通性にすぐれたリンカー設計を含めた、異なるリンカー配列が使用できる（M.Whitlow et al.,Methods:A Companion to Methods in Enzymology,2:97-105（1991）を参照）。このような好適なリンカー配列は実験的に簡単に識別できる。例えば、リンカー配列を含んだ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントを含んでなるＤＮＡベクターは、クローン化して発現することが可能であり、融合分子は、例えば標準抗原結合分析（上記のHarlow and Laneを参照）にあるように、実験によって、該分子が抗原と結合可能がどうかを決定することができる。これ以外に、以下に記す実施例８及び実施例１０〜１２に開示した分析法によりＴ細胞活性の調節能についてテストし、発現された、リンカー配列を含んでなる融合タンパク質を決定することができる。リンカー配列の好適な大きさと配列とは、融合タンパク質の想定した大きさと形状とに基づき行われる、コンピュータを用いた従来のモデル化技術で決定することもできる。
好ましくは、Ｖ−α鎖あるいはＶ−β鎖をコードする、実質的にいかなるヌクレオチド配列であっても、これをベクターに組み込むことができるように、ＤＮＡベクター内の制限部位が加工される。さらに、ＤＮＡベクターは、好適なバクテリオファージ外殻タンパク質（遺伝子IIIタンパク質、遺伝子VIIIタンパク質）あるいはその好適なフラグメントをエンコードするＤＮＡを組み込むための制限部位を、１つあるいはそれ以上含むように設計されてもよい。さらに、ｍｙｃ、ＥＥ、あるいは６ＸＨＩＳなどのタンパク質標識を１つあるいはそれ以上エンコードするＤＮＡを、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡベクターに従来公知の方法で連結することもできる。例えば、Manstein,D.S.et al.Gene（1995）162（1）,129;Grussenmeyer,T.et al.PNAS（USA）（1985）82 7952,Tang,E.and Henry,H.L.J.Biol.Chem.（1993）268（7）,5069を参照されたい。
さらに具体的には、以下の実施例で具体的に示す好適な系においては、好適な制限部位（例えば、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ部位）が、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＶ−α鎖とＶ−β鎖との間に位置するポリペプチドリンカー配列の両端に存在する。適当なＤＮＡベクターに融合させると、該制限部位とバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントとの融合が生じる。
ここで開示するｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードする配列を含んだＤＮＡベクターは、一般的に次の（１）から（８）を満たしてなる：（１）大腸菌中で作用する、例えばＰＢＲ３２２由来の複製起点を有するもの、（２）選択可能な抗生物質耐性遺伝子、例えば、アンピシリン耐性遺伝子を有するもの、（３）転写終結領域、例えば、大腸菌ｔｒｐオペロンの終結領域を有するもの、（４）転写プロモーター、例えば、ｐｈｏＡ、ｔａｃ、ｔａｃ−ｌａｃ、ｌａｃＺ、ｌａｃ^uvs、Ｔ７、あるいはＴ３プロモーターを有するもの、（５）リーダー配列、例えば、ｐｅｌＢやｏｍｐＡリーダーを有するもの、（６）ｓｃＴＣＲをエンコードするＤＮＡセグメントを有するもの、（７）バクテリオファージ外殻タンパク質、例えば、遺伝子IIIタンパク質や遺伝子VIIIタンパク質（あるいは、その好適なフラグメント）を有するもの、（８）転写ターミネーター、例えば、大腸菌のリボソームＲＮＡ座由来のＴ１Ｔ２配列を有するもの。場合によっては、ＤＮＡベクターが、上記のようにタンパク質標識をエンコードするＤＮＡ配列をさらに１つあるいはそれ以上含んでいても良い。
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現とその安定性とを、特にここで記述する低速誘導条件下で最適化するために、特定のヌクレオチド配列をＤＮＡベクターに含有させても良い。例えば、以下で記述するｐｈｏＡプロモーター配列とｐｅｌＢリーダー配列とは、リン酸欠乏誘導環境下においてｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現させるのに特に好ましい。下記の実施例４を参照されたい。翻訳効率を上げるために、強力な翻訳開始配列を該構成に含有させてもよい。哺乳動物の細胞における発現の場合、好適な開始配列はＫｏｚａｋ共通配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）である。
ＤＮＡベクターに含まれるリーダー配列は、融合タンパク質の発現を宿主細胞の細胞膜上あるいは宿主細胞培地中に好適に誘導するためのものであり、注目のＶ−α鎖をエンコードするＤＮＡが融合タンパク質をエンコードする構成に好適にライゲーションされるよう、効果的に配置された制限部位を含んでいる。好適には、制限部位は、当業界では結合配列（Junction Sequence）と称されることもあるリーダー配列（例えば、長さがおよそ２個から１０個のコドンに相当する）の３’末端に組み込まれ、Ｖ−α鎖に連結している。その結果、Ｖ−α鎖のコード領域は、通常Ｖ−αコード領域の第１アミノ酸となる。例として、１つの制限部位がＳＦｉＩ部位であり、一方、他の切断部位がＶ−α鎖のコード領域の前に組み込まれ、Ｖ−α鎖をより好適にベクター構成に挿入可能となっているものを挙げることができる。以上議論したように、このような制限部位を、通常Ｖ−α鎖の頭に位置する別の制限部位と共に使用することにより、多種多様なＶ−α鎖、あるいはＶ−α、Ｃ−α鎖のコード配列を迅速かつ容易に挿入できるようになる。好ましいリーダー配列は強力な翻訳開始部位を含むものであり、また、時には、そのｍＲＮＡの３’末端にキャップ部位を含んでいても良い。典型的なリーダー配列としは、ｐｅｌＢとＯｍｐＡが挙げられる。下記の実施例４に記すように、特に好ましいリーダー配列はｐｅｌＢである。
ここで、”ベクター”という語は、宿主細胞に取り込ませることが可能な注目の核酸配列のいずれかであり、注目の核酸が発現する結果、上記ｓｃＴＣＲ融合タンパク質などが生成する。ベクターとしては、例えば、線形核酸配列、プラスミド、コスミド、ファージミドや、染色体外ＤＮＡなどが挙げられ、具体的にはベクターは組み替えＤＮＡであってもよい。また、ここでいう、”発現”、あるいは”遺伝子発現”とは、ＤＮＡの転写やＲＮＡの翻訳を含み、注目している核酸配列に対応したタンパク質生成物が生成することを指す。通常は、本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントが、ベクター、好ましくはＤＮＡベクターに挿入され、好適な宿主細胞の中で該ＤＮＡセグメントの複製が行われる。
本発明に係る、十分に可溶性かつ機能的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡベクターは、好ましくは、低速誘導される宿主細胞により長時間かけて発現される。特定の理論に言及するわけではないが、およそ２〜８時間をかけた、好ましくはおよそ４〜６時間をかけた低速での誘導により、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現が安定し、細胞間におけるタンパク質の折り畳みが最適化される。特に、強力なプロモーターによって発現がなされている場合には、低速誘導にかかるこれらの効果が明らかである。例えば、ＤＮＡベクターは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードする配列に機能可能に連結されたｐｈｏＡプロモーター（強力）を含んで生成される。そしてＤＮＡベクターによって、宿主細胞が宿主細胞培地中で形質転換される。そして、宿主細胞培地中のリン酸塩は数時間、一般には２〜１０時間かけて、通常は４〜６時間かけて培地中で使い切られるよう設定された。上記の低速誘導条件と強力なプロモーターとを組み合わせて使用すると、化学的誘導物質と弱いプロモーターとを使用した高速誘導法（例えば、ＬａｃＺプロモーターのＩＰＴＧ誘導法）と比較して、十分に可溶性かつ機能的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質の産生量が大幅に増加することが分かった。下記の実施例４を参照されたい。好適な宿主細胞は、レトロウイルスによる転換、カルシウム、リポソーム、あるいはポリブレン仲介トランスフェクション、生体分解による転換、など、従来公知の様々な方法で形質変換することができるものである。
上記のように、本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、１つあるいは複数個のタンパク質標識（同じでも良いし、異なっていても良い）を含んでいても良い。このタンパク質標識には、プロテアーゼ分解部位を含んでなるものも含まれる。例えば、タンパク質標識は６ＸＨＩＳなどの、生理的ｐＨ条件下で電荷を保持するポリペプチドであり、この場合、好適な合成マトリックスを使って融合タンパク質を純化することができる。さらに具体的には、該合成マトリックスは、Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどの商業的に入手可能なセファロースマトリックスであってもよく、あるは６ＸＨＩＳ標識をｐＨ６〜９条件下で結合させうる他のマトリックスであっても良い。これ以外の好適な標識としては、商業的に入手可能なモノクローナル抗体により特異的に結合される、ＥＥあるいはｍｙｃエピトープが挙げられる。一般に、抗体、好ましくは商用的に入手可能なモノクローナル抗体により特異的に結合される、様々なエピトープがタンパク質標識として機能する。他の好適な合成マトリックスとしては、本ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と特異的な結合が形成される結合抗体、を有する合成マトリックスが挙げられる。分解部位を含んでなる典型的なタンパク質標識としては、エンテロキナーゼ、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、ヘビ毒、あるいは、トロンビン分解部位を含んでなるタンパク質標識が挙げられる。例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９６／１３５９３を参照されたい。
原核生物、真核生物、あるいは昆虫細胞の中で、本発明に係る可溶性融合タンパク質を発現させる方法は幾つか挙げられる。例えば、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡは、例えば、該ＤＮＡがベクターにライゲーションされるように、酵素を使用して既定の場所でベクターを制限する、などの既知の手段で好適なベクター内に取り込ませることができる。上記のように、ベクターには、バクテリオファージ外殻タンパク質、あるいはその好適なフラグメントをエンコードする配列も含まれている場合がある。そして、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡを含んでなるベクターが好適な宿主に導入され、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質が発現される。好適なベクターは、クローニングプロトコールに関する要因に基づいて、実験的に選択される。例えば、ベクターは、使用する宿主細胞に適合したものであり、かつ、適当なレプリコンをもっているものでなければならない。さらに、ベクターは、発現される融合タンパク質に対応するＤＮＡ配列コードを収容できるものでなければならない。典型的なベクターの例としては、大腸菌中、特に、バクテリオファージ・ライブラリの構築に好適な宿主系統中で融合タンパク質を発現できるものが挙げられる（上記、Smith,G.P.and J.K.Scott参照）。これ以外のＤＮＡベクターとしては、哺乳動物の細胞中で融合タンパク質を発現可能なｐＣＤＶＡ３（InVitrogenより入手可能）などが挙げられる。その他哺乳動物で使用可能なＤＮＡベクターについては、上記Sambrook et al.及びAusubel et al.を参照されたい。
さらに具体的には、本発明に係る融合タンパク質を発現するに好適な宿主細胞としては、容易に形質転換可能であり、培地中で急速な成長を見せる細胞などが挙げられる。特に好ましい宿主細胞としては、大腸菌や枯草菌などがあげられる。宿主細胞としては、これ以外に動物細胞や、S.cerevisiaeなどの酵母や、昆虫細胞などの真核細胞が挙げられる。ここで開示したバクテリオファージ・ライブラリを増殖する目的では、ＸＬ１−Ｂ、Ｋ９１や、Ｋ９１Ｋａｎなどの大腸菌系統が好適である。昆虫細胞での発現に好適な細胞は、バキュロウイルスが感染可能なＳｆ９などの細胞である。一般には従来の培養条件を採用し、さらに、例えば好適な細胞選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子、あるいは、Ｇ４１８）をベクターに取り込むことで、安定に形質変換やトランスフェクションがなされた細胞系が選択される。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現する細胞は、以下に記すようにＶ−α鎖あるいはＶ−β鎖と特異的に結合する、商業的に入手可能なモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ分析などの、既知の手法で決定することができる。
発現されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、免疫アフィニティークロマトグラフィー、免疫吸着、免疫沈降などの既知の方法で単離・精製することができる。重要なことは、調製工程で時間をかけて再度折り畳むステップを実行することなく、相当量の融合タンパク質が生成される点である。以下でタンパク質精製法を詳しく記述するが、この方法によれば、大半のｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成量は、宿主細胞ペースト５０〜１００グラム当たり２〜２０ミリグラムの範囲内となる。
一般に、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を調製するためには、細胞の抽出物あるいは宿主細胞培養培地を遠心分離し、その結果得られた上澄みを、例えばＡタンパク質あるいはＧタンパク質アフィニティークロマトグラフィーや、発現されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質分子と特異的に結合する抗体を使用した免疫プロトコールなどの、アフィニティークロマトグラフィーあるいは免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。該抗体としては、例えば、ｓｃＴＣＲのＶ−α鎖あるいはＶ−β鎖と特異的に結合可能な、商業的に入手可能なモノクローナル抗体が挙げられる。該抗体の典型的な例としては、Ｐｈａｒｍａｇｅｎ社の製品である、Ｈ５７、ＭＲ５−２、Ｆ２３．１などが挙げられる。モノクローナル抗体を使ったタンパク質の親和（アフィニティー）精製は公知であり、例えば、Harlow and Lane著Antiboides:A Laboratory Manual（1988）などに開示されている。
本発明に係る融合タンパク質は可溶で十分に機能的なかたち、すなわち、培地中に安定して分泌されうるかたちで提供される。さらに具体的には、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、界面活性剤などの撹乱物質が殆どあるいは一切無いという条件をほぼ満たす環境下、すなわち、生理的条件下で安定するかたちで提供される。すなわち、本融合タンパク質は、ＴＣＲ貫膜タンパク質領域内で見られるアミノ酸のような、疎水性アミノ酸リッチな領域を一般に含まない。しかしながら、場合によっては、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質が十分に可溶性である限り、疎水性アミノ酸リッチな領域が一部含まれていてもよい。すなわち、融合タンパク質の発現は、相当量の封入体を好適な宿主細胞中で形成することにはつながらないかもしれない。封入体は、顕微鏡を用いて、あるいは従来の生化学的手法で容易に検出することができる。
本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は上記説明のように調製できるが、以下に記す実施例でも同様の方法で調製できる。一般に、所望のＶ−α鎖をコードするＤＮＡ、及びＶ−β鎖をコードするＤＮＡは、上記のように、Ｔ細胞やＴハイブリドーマ系、あるいは公的に入手可能な上記Ｖ−α鎖及びＶ−β鎖配列など、適当なところから得られる。該ＤＮＡは、ＰＣＲ法、クローニング、あるいはその他の好適な手段で増幅することができる。例えば、所望のＶ−α鎖をエンコードするＤＮＡを好適なベクターとしてクローン化し、次に所望のＶ−β鎖をエンコードするＤＮＡと好適な一本鎖リンカー配列とをクローン化することで、所望のｓｃＴＣＲを生成することができる。上記のように、場合によっては、ｓｃＴＣＲにはＣ−α鎖フラグメント及び／またはＣ−β鎖フラグメントをエンコードするＤＮＡが含まれている。そして、バクテリオファージタンパク質あるいはそのフラグメントとバクテリオファージ機能に必要なその他の配列とをエンコードするＤＮＡ配列を含んでなる、好適な部位で切断されたＤＮＡベクターに、ｓｃＴＣＲをエンコードするＤＮＡをライゲーションすることで、ｓｃＴＣＲ分子構造にバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはその好適なフラグメント（例えば遺伝子IIIタンパク質あるいは遺伝子VIIIタンパク質）がさらに融合される。バクテリオファージ遺伝子IIIタンパク質あるいはバクテリオファージ遺伝子VIIIタンパク質をエンコードする配列を含んでなるＤＮＡベクターの典型的な例は以下に記す。上記のように、１つあるいは複数のタンパク質標識をエンコードするＤＮＡは、好適には所望のタンパク質標識を既に含んだＤＮＡベクターを選択することにより、必要に応じて融合タンパク質に加えても良い。これにより、ライゲーションされたＤＮＡベクターが、好適な宿主中で発現され、さらに必要に応じて融合タンパク質を回収・精製することができる。
本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、一般に、プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖；プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖・Ｃ−β鎖フラグメント；プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖・Ｃ−α鎖フラグメント／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖；あるいは、プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖・Ｃ−α鎖フラグメント／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖・Ｃ−β鎖フラグメント；の配列が共有結合したＤＮＡ構造によってエンコードされている。融合タンパク質を発現し精製するために、ここで開示した特異的な発現体系を含んでなるＤＮＡベクターは、バクテリア細胞、バキュロウイルス−昆虫系細胞、または哺乳類細胞中に、好適に導入される。
本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質の分子量は、例えば、融合バクテリオファージ外殻タンパク質またはフラグメントとして何を選択したのか、あるいは、採用したタンパク質標識は１つかそれ以上なのかといった、いくつかの要素によって変化する。一般に、可溶性で十分に機能的な融合タンパク質は、その分子量がおよそ４５ｋＤＡを越え、かつ、その内にしめるＶ−α鎖とＶ−β鎖の分子量が２０ｋＤＡを越えるが、通常該分子量は２１〜２６ｋＤａの範囲内である。また、本発明に係る融合タンパク質は通常、分子量がおよそ４８〜５０ｋＤａである。上記の分子量は全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法などの従来の分子サイズ決定実験で決定することができる。一般的な説明については上記Harlow and Lane及びAusubel et al.による著作を参照されたい。
本発明に係る多価ｓｃＴＣＲ融合タンパク質も、有用な応用がいろいろ可能である。例えば、ｓｃＴＣＲの価数が増加すると機能が強化されると考えられている。多価融合タンパク質は、例えば標準ビオチン・ストレプタビジン（streptavidin）・ラベリング技術を用いて、あるいはラテックスビーズなどの適当な固体支持具に接合させることで、融合タンパク質を１個ないし４個（同じでも良いし、異なっていても良い）共有結合させて作出することができる。化学的に架橋されてなる融合タンパク質（例えば、架橋によりデンドリマー（dendrimer）としたもの）も、同じく多価種として適当である。例えば、融合タンパク質は、化学的に活性な側鎖を有する、例えば、ＣｙｓあるいはＨｉｓ等のアミノ酸残基をエンコードする配列を含むことで修飾することができる。化学的に活性な側鎖を有するこれらのアミノ酸は、該融合タンパク質中で様々な位置に配置することができるが、ｓｃＴＣＲの抗原結合領域から遠位に配置することが好ましい。例えば、融合タンパク質のＣ−β鎖フラグメントのＣ末端は、タンパク質精製標識と、あるいは、活性なアミノ酸を含んだ他の融合タンパク質と共有結合させることができる。好適な側鎖を含むことで複数の融合タンパク質を化学的に結合させて好適なデンドリマー粒子とし、多価分子を作ることができる。デンドリマーとは科学的に合成された重合体であり、その表面に複数の異なる官能基のいずれかを含んでなるものでもよい（D.Tomalia,Aldrichimica Acta,26:91:101（1993）を参照）。本発明で使用するに好適な典型的なデンドリマーとしては、例えば、システイン残基と結合可能な、Ｅ９スターバースト（starburst）・ポリアミン・デンドリマーや、Ｅ９コンバースト（comburst）・ポリアミン・デンドリマーなどが挙げられる。多価融合タンパク質の例は、下記の実施例９に記す。
本発明に係る融合タンパク質であって、さらに他の物質、特にＢ−７遺伝子族（例えばＢ７−１やＢ７−２）などのＴ細胞共刺激因子（T cell co-stimulatory factor）を含んだものをエンコードするＤＮＡベクターを構築し、融合タンパク質を含む細胞を活性化することも、また望ましい。
本発明に係る融合タンパク質は、組換えペプチド抗原、例えば、ＭＨＣ分子あるいはＨＬＡ分子中のスーパー抗原や抗原を検出し、特徴づける目的で使用可能である。例えば、本発明に係る方法を用いて、Ｔ細胞に対し非特徴的なエピトープを以下のようにマッピングすることができる。すなわち、ランダムペプチド・ライブラリ、あるいは選択ペプチド・ライブラリをエンコードする配列が、ペプチドライブラリ内に提供される。そして、該ライブラリは融合タンパク質、好ましくは検出可能にラベリングされた融合タンパク質を用いてスクリーニングされる。続いて、該融合タンパク質と特異的に結合したペプチドが好適に増幅される。次に、該ペプチドの配列の解析を行い、融合タンパク質と結合した配列を識別する。さらに、該融合タンパク質のＶ−α鎖とＶ−β鎖とに対応のＴＣＲを発現するＴ細胞との結合について、クローニングしたペプチド配列の試験が行われる。数個あるランダムペプチドライブラリのいずれを採用しても良い。例えば、J.Scott et al.,Science（1990）249:386;J.Devlin et al.,Science,（1990）249:404;S.Cwirla et al.,PNAS（USA）,（1990）;87:6378;J.Hammer et al.,J.Exp.Med.（1992）176:1007;Rhode,P.R.et al.J.Immunol.（1996）157:4885;及びD.O’Sullivan et al.,J.Immunolo.,（1991）147:2663を参照されたい。
極めて有用な一本鎖クラスＩ、及びクラスIIＭＨＣ／ペプチド複合体（すなわち”ｓｃＭＨＣ複合体”）が、公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４（出願日１９９５年２月１日）及び同シリアル番号０８／５９６，３８７（出願日１９９６年１月３１日）とに開示されている。上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４（出願日１９９５年２月１日）及び同シリアル番号０８／５９６，３８７（出願日１９９６年１月３１日）とにおいては、ここに開示したｓｃＴＣＲ融合タンパク質の機能を試験する目的で使用可能な、極めて有用なイン・ビトロ及びイン・ビボでのＴ細胞結合分析方法が開示されている。
より具体的には、上記公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び同シリアル番号０８／５９６，５８７には、オボアルブミン（ＯＶＡ）のアミノ酸３２３−３３９由来の提示（presenting）ペプチド、あるいは、ＨＳＶ−１ ｇＤペプチド（ｇＤ１２等）のアミノ酸２４６−２６１由来の提示ペプチドを含んだ一本鎖ＭＨＣクラスIIＩＡ^d複合体（例えば、ｓｃＩａ^d分子等）が開示されている。上記の審査中の米国特許出願シリアル番号０８／５９６，５８７が開示しているように、ＯＶＡペプチドとｇＤ１２ペプチドとは、融合、あるいは、ｓｃＩＡ^d複合体に非共有結合的にリンクさせたかたちで提供されうる。上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，５８７とは、参考文献としてここに記す。
本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＴ細胞活性の調節能（例えば、増殖などに関するＴ細胞活性を抑制する、あるいは消滅させる）は、イン・ビトロ分析で容易に決定される。イン・ビトロ分析と、該分析を行うに必要な典型材料については、上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，３８７とに開示されている。
一般に、該分析に好適に使用されるＴ細胞は、Ｔ細胞ハイブリドーマや、哺乳類、例えば、人などの霊長類；ネズミ、ウサギといったげっ歯類；から単離したＴ細胞などの、形質転換されたＴ細胞系から得られる。これ以外の好適なＴ細胞には、１）公的に入手可能、または、既知の方法で調製可能なＴ細胞ハイブリドーマ、２）ヘルパーＴ細胞、３）Ｔ細胞障害細胞、好ましくは細胞障害ＣＤ８⁺細胞がある。Ｔ細胞は、既知の方法で哺乳類から単離することができる。例えば、R.Shimonkevitz et al.,J.Exp.Med.,（1983）158:303を参照されたい。
上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，３８７とに開示されているように、イン・ビトロ分析をすることで、ある分子がＴ細胞の活性を調節することが可能であるか否かを決定することができる。特に、該分析は、本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質に対し、容易に適用可能である。一般に、該分析は以下に示す１から５の連続ステップで行われる。Ｔ細胞は分析可能なマーカーを発現し、該マーカーは、Ｔ細胞の活性、あるいは、活性化後に調節を受けたＴ細胞の活性を示すものである。したがって、例えば、下記の実施例８に開示するように、活性化時にインターロイキン−２（ＩＬ−２）を発現するマウスのＴ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０を使用することができる。ＩＬ−２の濃度を測定することにより、ある特定のｓｃＴＣＲが該Ｔ細胞ハイブリドーマの活性を調節できるか否かを決定することができる。該分析は、一般に例えば次のような工程を順に行うことにより実行される。
１．Ｔ細胞ハイブリドーマ、あるいは本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質に対応するＴＣＲを含んだＴ細胞を得る。典型的なＴ細胞は、上記のように、増殖可能な人のＣＴＬである。
２．上記Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を、増殖可能な条件下で培養する。
３．増殖したＴ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を、上記のｓｃＴＣＲ融合タンパク質に接触させる。
４．該ＴＣＲ（及びｓｃＴＣＲ融合タンパク質）と特異的に結合し、加えて、該Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を活性化する能力のある抗原に、該Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を接触させる。典型的な抗原としては、スーパー抗原、上記の提示ペプチドを有するｓｃ−ＭＨＣクラスＩあるいはクラスII複合体、あるいは、好適なＡＰＣなどが挙げられる。
５．該Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を好適な共刺激因子（co-stimulatory factor）に接触させて、活性化に必要なシグナルを供給する。次に、該Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を、マーカーにより分析する。すなわち、例えば、ＩＬ−２産生量を計測する。ＩＬ−２産生量が、例えば２４時間で４０％またはそれ以上減少したとすると、この減少はすなわち、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質がＴ細胞の活性を調節して免疫反応を抑制したことを示す。
下記の実施例８が該分析の典型例である。
上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，３８７とに開示されているように、分析において使用されるＴ細胞は、通常、増殖に好適な条件下でインキュベートされる。例えば、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞ハイブリドーマは、完全培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、及び５×１０^-5Ｍ ２−メルカプトエタノールを添加してなるＰＲＭＩ １６４０）中で、３７℃、ＣＯ₂５％条件下でインキュベートされると好適である。通常１０^-12〜１０^-6Ｍの濃度となるように、ある融合タンパク質を連続希釈した希釈液が、Ｔ細胞の培養培地に加えられる。Ｔ細胞の活性化シグナルは、相応しい抗原を保持した抗原提示細胞により供給されることが好ましい。抗原薬物（antigen dose）と、Ｔ細胞を最高値より若干低いレベルにまで活性化するＡＰＣ群とを使用することが、融合タンパク質に対するＴ細胞の応答阻害を検出するに好適であると考えられている。ｓｃＴＣＲとの接触に後続してＩＬ−２の産生量が減少することは、すなわち、融合タンパク質がＴ細胞の活性を調節していることを示す。
上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，３８７とに開示されているように、Ｔ細胞活性調節の同定は、ＩＬ−２などの発現されたタンパク質量を測定するよりは、むしろ、当業者にとって周知の放射線ラベリング技術を用いて抗原依存性Ｔ細胞の増殖の変化を測定することにより、好適に行われる。例えば、検出可能にラベリングした（例えば、トリチウム化した）ヌクレオチドを分析用の培養培地に導入しても良い。このような標識付きのヌクレオチドのＤＮＡへの取り込みは、Ｔ細胞増殖の目安となる。この分析は、その成長に抗原の提示を要しないＴ細胞、例えば、Ｔ細胞ハイブリドーマには適していない。この分析は、哺乳類から単離した非形質転換Ｔ細胞ついて、該Ｔ細胞の活性調節を測定するに好適である。融合タンパク質との接触に後続しておこるＴ細胞の増殖レベルの低下は、分子がＴ細胞の活性を調節し免疫反応を抑制可能であることを示している。下記の実施例８や実施例１０を参照されたい。イン・ビトロでのＴ細胞増殖分析法は、上記の融合タンパク質が、イン・ビボでのＴ細胞クローナル増殖の抗原特異的な変化におよぼす影響を測定するに好適に使用される。この分析については以下の例１１で具体的に記述する。
以下の実施例に説明されるように、ＩＬ−２産生量の測定、もしくはＴ細胞増殖の測定は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質がＴ細胞の活性を調節しうるかどうかを調べる目的で使用することができる。例えば、融合タンパク質との接触に後続しておこる、ＡＰＣで刺激されたＴ細胞によるＩＬ−２産生の減少は、融合分子がＴ細胞の活性を調節し、Ｔ細胞仲介型の免疫反応を抑制可能であることを示している。
また、イン・ビボ分析は、Ｔ細胞の発達を阻害、もしくは該細胞を不活性化する能力などの、融合タンパク質のＴ細胞の活性を調節する能力を調べる目的で使用することもできる。例えば、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の有する、免疫グロブリンのクラス変更（即ち、ＩｇＭからＩｇＧ）阻害能力を分析することができる。例えば、P.Linsley et al.,Science,（1992）252:792-795参照。
融合タンパク質を用いる診断法は、イン・ビボ診断イメージングおよびＨＬＡ型分析としても実現されている（例えば、A.K.Abbas,Cellular and Molucular Immunology,Page 328（W.B.Saunders Co.1991）を参照）。イン・ビボ イメージングへの適用の際には、融合タンパク質は放射性標識（例えば、¹²⁵I、³²P、⁹⁹Tc）、もしくは哺乳類に投与可能な他の検出可能標識を含んで構成され、被験者はｓｃＴＣＲの結合を検出する目的で公知の方法によりスキャンされる。哺乳類に対するこのような分析は、例えば、免疫システムの疾患に係るＡＰＣの不所望な発現などの、多くの疾患の診断および治療に際し助けとなりうる。
また、分析は、自己免疫疾患の治療のために使用されるｓｃＴＣＲ融合タンパク質（もしくは、好ましくは、融合タンパク質から得られたｓｃＴＣＲ）を評価する目的でも使用可能である。例えば、上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，３８７とに開示されているように、実験用アレルギー性脳髄炎（experimental allergic encephalomyelitis（ＥＡＥ））は、マウスの自己免疫疾患であり、多発性硬化症の認められたモデルである。一つの分析例では、あるマウスの系統がＥＡＥを発症するように処理され、その後に、適当なｓｃＴＣＲ融合タンパク質（もしくは、融合タンパク質から得られたｓｃＴＣＲ）が投与される。その後、該動物は、融合タンパク質もしくはｓｃＴＣＲの投与によってＥＡＥの進行が阻害もしくは防止されたか否かを調べるべく評価される。このような検定は、特に、以下の実施例１２において詳しく説明される。
本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質の有する、免疫反応（上記記載の標的疾患に対する予防接種などを含む）を封じこめる能力は、イン・ビボ検定によって簡単に調べることができる。例えば、融合タンパク質（もしくは、好ましくは、融合タンパク質から得られたｓｃＴＣＲ）をマウスなどの哺乳類に投与し、その血液サンプルを、最初の投与時、およびその後定期的に数回（例えば、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の投与の２、５、および８週間後）摂取する。続いて、血清を血液サンプルより採取し、免疫感作により産生された抗原が存在するか否かの分析が行われる。抗体の濃度は、一般的な免疫学的方法によって調べることができる。
また、本発明は、哺乳類、特に人などの霊長類の細胞内で融合タンパク質を発現する、該融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントの投与方法を提供するものである。好ましくは、融合タンパク質のコーディング領域を有するＤＮＡは、ＣＭＶプロモーターのような適切なプロモーターにより制御された状態で、公知の方法により被験者の骨格筋へ直接注入される。プラスミドＤＮＡの投与方法、そのＤＮＡが投与された被験者の細胞への該ＤＮＡの取り込み、および、タンパク質の発現について報告がなされている（J.Ulmer et al.Science,（1993）259:1745-1749参照）。
本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、治療学上さまざまに適用することができる。例えば、融合タンパク質（もしくは、好ましくは、融合タンパク質から得られたｓｃＴＣＲ）を、哺乳類の免疫反応を低減もしくは除去する目的で投与することができる。これにより、例えば、癌、感染症、アレルギー、もしくは、例えば、多発性硬化症、インシュリンによる真性糖尿病、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患などを患っている、もしくはその虞れがある人などの哺乳類を治療することができる。投与は、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡの直接投与など、適切な手段を介して行うことができる。また、この治療に適しているのは、不所望な免疫反応を患っているか、患う虞れのある患者、例えば、心臓、腎臓、皮膚、または他の器官の移植手術を経験している患者などである。移植拒絶を伴う状況では、治療プロトコールは、手術が行われる以前に適切に開始されてもよい。
本発明によれば、哺乳類の免疫反応を低減もしくは除去するために、いくつかの特有のアプローチを使用することができる。例えば、不所望な免疫反応を低減するための一つの治療法では、病原性Ｔ細胞と抗原との相互作用を低減もしくは除去するために、好適なｓｃＴＣＲ融合タンパク質（もしくは、好ましくは、それ由来のｓｃＴＣＲ）が有効量投与される。これにより、Ｔ細胞の増殖、分化、活性化、もしくは、Ｂリンパ球刺激などの、Ｔ細胞仲介型の免疫反応を選択的に制御することができる。融合タンパク質は、不所望な免疫反応を仲介する病原性Ｔ細胞と、少なくとも同レベル、好ましくはそれ以上の、抗原特異的結合親和性を示すことが好ましい。これに関し特に好ましいのは、上述したリガンドに対して大きな特異的結合親和性を表すｓｃＴＣＲ突然変異物である。
ここに開示されている方法で調製されたｓｃＴＣＲもしくはＴＣＲに対する抗体の投与は、例えば、腹膜腔内注射もしくは静脈注射などの注射方法によって哺乳類に投与することができる。融合タンパク質のうち、少なくとも治療への応用において用いられる分子は、哺乳類細胞もしくは他の適切な細胞から生産され、実質的に、もしくは完全に発熱物質（pyrogen）が存在しないように使用前に精製されることが好ましい。ある治療へ応用する際の最適投与量は、従来の手段に基づいて決められてもよいが、一般的には、投与経路、患者の体重、健康状態、性別、および当業者によって認められる要因を含むいくつかの要因によって変動する。
投与は、一回投与でもよく、日もしくは週間隔での連続的な投与であってもよい。ここで用いられる「一回投与」とは、単一（solitary）投与であってもよいし、継続放出（sustained release）投与であってもよい。被験者は哺乳類（例えば、人、もしくは牛のような家畜、もしくは犬や猫のようなペット）であってもよく、また、ｓｃＴＣＲもしくは抗体を含む製薬組成としての治療を含むものとする。本発明のこのような製薬組成は、当該技術において公知の手順に従って製造および使用される。例えば、融合タンパク質の治療有効量を含む処方は、例えば、封止されたアンプルおよびバイアルなどの単一服用単位もしくは複数服用単位として提供されてもよく、例えば、水注入による無菌液体キャリアーの添加のみを使用直前に要する凍結乾燥状態として保存されてもよい。リポソームの処方も多くの適用に際し好適である。また、その他の組成も非経口投与の目的で適切に用いることができ、これには、抗酸化剤、バッファ、静菌剤、および標的受領者の血液と等張となる量の溶質を含んでなる、水溶性および非水溶性無菌注入溶液が含まれ、また、懸濁剤および濃化剤などを含む、水溶性および非水溶性無菌懸濁液が含まれる。
Ｔ細胞反応（応答）の低減もしくは除去を含んでなる本発明の方法は、Ｔ細胞仲介型の疾患に対するより効果的な治療を提供する目的で、公知の免疫抑制剤、抗ウイルス剤、抗癌剤、もしくは抗炎症剤を併用して行われてもよい。例えば、融合タンパク質は、自己免疫疾患およびアレルギーの治療のため、従来の、シクロスポリン（cyclosporin）などの免疫抑制薬剤、もしくはコルチコステロイド（corticosteroid）のような抗炎症薬剤、および非ステロイド薬剤と共に使用することができる。
上述したように、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質（もしくは、それから分離されたｓｃＴＣＲ分子）は、一般的に当該技術において知られる方法により抗体を産生する目的で使用可能であり、通常、融合タンパク質の精製サンプルとして生成される。ほとんどの場合、抗体を増産させるために選択されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、上述したように、まず、バクテリオファージ外殻タンパク質もしくはそのフラグメントを除去するべく分解される。このようにして得られたｓｃＴＣＲは、免疫原として使用される。抗体は、注目ｓｃＴＣＲの１つもしくはそれ以上のエピトープからなる免疫原性ペプチドから構築することもできる。
さらに詳しく述べると、抗体は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の精製サンプル、融合タンパク質から分離されたｓｃＴＣＲ分子、もしくは上記の免疫原性ペプチド（それ単独もしくは適切なキァリアーとの複合体）により、哺乳類を免疫感作することで得られる。好ましくは、ｓｃＴＣＲ分子を免疫原として使用する。また、適切な哺乳類としては、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ラット、およびマウスなどの一般的な実験動物が挙げられる。ラットおよびマウス、特にマウスは、モノクローナル抗体を得る目的で好適に使用される。抗原は、皮下注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、および皮膚内注射などの数ある経路のいずれによっても哺乳類に投与可能である。最適な免疫感作間隔および免疫感作量などは、比較的大きな範囲内をとることができ、ここでの開示に基づいて実験的に求めることができる。通常の手順では、抗原は、数週間に渡り数回注射される。抗体は、免疫感作された動物の血清から一般的な方法で採取され、ｓｃＴＣＲに対して特有の抗体を検出するためにスクリーニングされる。特に注目すべきは、Ｖ−αもしくはＶ−β鎖、該鎖中でも特に高可変性領域に限定的に結合する抗体、例えば、該領域上にある直鎖状もしくは立体配座のエピトープを認識する抗体である。モノクローナル抗体は、抗体を産生する細胞内、およびハイブリドーマ細胞形成のための標準的な融合方法を用いてモノクローナル抗体を産生するために用いられる細胞内、において産生することができる（G.Kohler,et al.,Nature,（1975）256:456参照）。通常、ここにおいては、ハイブリッド細胞を生成するために、抗体産生細胞を骨髄膜細胞などの不朽細胞系統と融合する工程を伴う。もしくは、モノクローナル抗体は、Huse,et al.,Science,（1989）256:1275の方法により、細胞より産生されてもよい。
一つの適切なプロトコールは、精製ｓｃＴＣＲ複合体を含んでなる組成を用いて、約２〜７ケ月間にわたって行われる、マウスの腹膜腔内注射による免疫感作である。その後、免疫感作マウスから脾臓細胞を摘出することができる。免疫感作マウスの血清は、脾臓細胞を切除する以前に、ｓｃＴＣＲに特異的な抗体を用いた滴定により分析される。その後、切除されたマウスの脾臓細胞は、適当な均質もしくは不均質（好ましくは均質）のリンパ系細胞系統と融合される。該リンパ系細胞系統は、ヒポキサンチン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠失（hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase deficiency （HGPRT^-））、もしくは、チミジン キナーゼ欠失（thymidine kinase deficiency（TK^-））などの標識を有する。好ましくは、リンパ系細胞系統として骨髄膜細胞が使用される。骨髄膜細胞と脾臓細胞とは、例えば、骨髄膜細胞１に対して脾臓細胞４の割合で混合される。これら細胞は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法により融合することができる（G.Kohler,et al.,Nature,Supra参照）。このようにクローン化されたハイブリドーマは、例えば、RPMI-1640培地で培養される（G.E.More,et al.,Journal of American Medical Association,（1967）199:549参照）。融合処理後成長したハイブリドーマは、精製ｓｃＴＣＲに特異的に結合する抗体を分泌することを利用して、放射線免疫分析法もしくは酵素免疫分析法などによりスクリーニングされる。従来の方法に従いＥＬＩＳＡ法を用いて、血清を含む抗体をスクリーニングすることもできる。このようなスクリーニング処理に対し正の結果を示すハイブリドーマは、限界希釈培養法により増殖およびクローン化することもできる。好ましくは、溶液内および生サンプル内で、ｓｃＴＣＲに結合可能な抗体を選択するためのさらなるスクリーニングが行われる。単離された抗体は、アフィニティークロマトグラフィーなどの適切な免疫学的方法によりさらに精製することもできる。
いくつかの適用においては、ｓｃＴＣＲと特異的に結合するキメリック抗体誘導体（例えば、人間以外の動物の可変領域と人間の不変領域とを結合する抗体分子）を産生し、これにより、被験者（人）内における免疫原性を、対応する非キメリック抗体と比較して低減することが好ましい場合がある。このようなキメリック抗体は、例えば、可変領域のいくつかの部分、特に抗原結合領域において保存領域が人間に起源し、高可変領域のみが非人間に起源する人可変領域キメラを産生する方法により、様々な種類のものを得ることができる。（S.L.Morrison,Science,（1985）229:1202;Oi et al.,BioTechniques,（1986）4:214;Teng et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,（1983）80:7308-7312;Kozbor et al.,Immunology Today,（1983）4:7279;Olsson et al.,Meth.Enzymol.,（1982）9:3-16に記載の人キメリック抗体およびその生成方法を参照）。
ここで用いられる用語「抗体」とは、一般的に、ｓｃＴＣＲに結合する、全免疫グロブリン、および、免疫的に活性な断片（フラグメント）を指す。免疫グロブリン、およびその免疫的に活性なフラグメントには、抗体結合部位（融合タンパク質に特異的に結合可能なペリトープ）が含まれる。抗体フラグメントの例としては、例えば、Fab,F（v）,Fab’,F（ab’）₂フラグメント、免疫グロブリンのジスルフィド結合を還元することにより得られる「半分子」、一本鎖免疫グロブリン、および他の抗原結合フラグメントなどが挙げられる（例えば、Bird et al.,Science,（1988）242;Huston et al.,PNAS,（USA）,（1988）85:5879;Webber et al.,Mol.Immunol.,（1995）32:249参照）。抗体、もしくはその免疫的に活性なフラグメントは、動物（例えば、マウスやラットなどのげっ歯類）のものであってもよいし、キメラ体であってもよい（例えば、Morrison et al.,PNAS,（1984）81:6851;Jones et al,Nature,（1986）321参照）。
「特異的結合」およびこれと同様の用語は、ここで開示されている分子が別の分子に結合し、特異的結合ペアを形成することを意味する。しかしながら、該分子は、例えば、ウエスタンブロッティング・エライザ法（western blotting ELISA）、RIA法、移動度変位分析法（mobility shift assey）、酵素免疫分析法（enzyme-immuno assay）、競合分析法（competitive assey）、飽和分析法（saturation assey）、もしくは当該技術分野において公知の他のタンパク質結合分析法によって得られる他の分子を認識せず、またそれらに結合もしない。分子同士の特異的結合の検出方法の例については、一般的に、Ausubel,et al supra;Sambrook,et al,supra;Harlow and Lane,supraおよびその中の参照文献を参照されたい。
ここで文言されている全ての文献は、それらを完全な形で参照することによってここに取り入れられている。
本発明の、実施例を以下に示すが、本発明は特にこれらに限定されるものではない。
実施例１−可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の形成
マウスＤＯ１１．１０細胞ＴＣＲのＤＮＡ配列は報告されている（Kappler,J.et al.PNAS（1994）91 8462）。ＴＣＲは、１−Ａ^dＭＨＣクラスII分子中に含まれたかたちのニワトリ オボアルブミン（ＯＶＡ）ペプチド・スパニングアミノ酸３２３−３３９を認識し、これに結合する。ＴＣＲをエンコードするＤＮＡは、概して、KapplerおよびMarrack,supraに開示の方法に従い調製された。
簡単に説明すると、１×１０⁶個のＤＯ１１．１０細胞は、製造者（Ｄｙｎａｌ）の指示に従い、oligo-dTコーティング・マグネティックビーズを用いて単離された。ＴＣＲのα鎖ｃＤＮＡは、Ｃ−α特異的「バック」プライマーＫＣ１１３（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．６）と、ＤＯ１１．１０ ｍＲＮＡとを含んでなる混合物をインキュベートすることにより得られた。該ｃＤＮＡを得るために、後続して、標準量のヌクレオチドおよび逆転写酵素をこの混合物に添加した。同様にしてβ鎖ｃＤＮＡが得られたが、ＫＣ１１３プライマーの代わりに、「バック」プライマーＫＣ１１１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）が使用された。アルファ鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーＫＣ１１２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）およびＫＣ１１３の共存下でＰＣＲ反応が行われ、６５０ｂｐの５’ＸｈｏＩ−３’ＸｍａＩα鎖フラグメントが増幅された。７５０ｂｐのβ鎖は、５’および３’末端に、順にＳｆｉＩおよびＳｐｅＩ部位を含んでなるプライマーＫＣ１１１及びＫＣ１１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）を用いたＰＣＲ法により増幅された。
ｓｃＴＣＲは、ＤＯ１１．１０ ＴＣＲより、共有結合されたＶ−α鎖およびＶ−β鎖を含むかたちで構築された。場合によっては、Ｖ−α鎖は、Ｃ−α鎖フラグメントおよびＣ−β鎖フラグメントをさらに含んでいた（例えば、図３、および図６Ａ、６Ｂ参照）。一般的に、Ｃα鎖フラグメントは、アミノ酸約９個分の長さを有していた。Ｃ−β鎖は、通常、完全な長さのＣ−β鎖におけるアミノ酸残基１２７（すなわちシステイン残基）の直前のアミノ酸残基１２６の位置で切断された。このシステイン残基が含まれているとｓｃＴＣＲの発現に有害であることが見いだされた。Ｖ−β鎖（もしくは、Ｃ−β鎖）フラグメントの３’末端には、通常、バクテリオファージ遺伝子III外殻タンパク質、もしくはバクテリオファージ遺伝子IV外殻タンパク質をエンコードする融合タンパク質精製標識（例えば、ＥＥもしくは６ｘＨｉｓ）ＤＮＡが付加されていた。
実施例２−ｓｃＴＣＲ融合タンパク質発現のためのベクター
実施例１で得られたｓｃＴＣＲ ＤＮＡは、強い細菌プロモーター（ｐｈｏＡ）もしくは弱い細菌プロモーター（ｌａｃＺ）を有するベクター内へ挿入された。ｓｃＴＣＲを発現させるために使用されたベクターは、それぞれ図１Ａおよび図１Ｂに示すｐＪＲＳ１４９およびｐＫＣ１２ ＤＮＡベクターである。これらベクターは、ｓｃＴＣＲのバクテリオファージ外殻タンパク質への融合を可能にする。融合タンパク質をエンコードするＤＮＡベクターの構築については、図２および以下に概略的にアウトラインを示す。
Ａ．ＤＮＡベクターｐＪＲＳ１４９
ｐＪＲＳ１４９ ＤＮＡベクターは、pBluScript^TM（Invitrogen）バックボーンを有するファージミドである。このベクターは、以下の実施例１４〜１８に説明するバクテリオファージ・ディスプレイ実験で使用される、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を生成するために使用される。
Ｂ．ＤＮＡベクターｐＫＣ１２
遺伝子IIIをエンコードするＤＮＡは、図１Ｂに示すｐＫＣ１２ベクターにクローン化された。
Ｃ．ＤＮＡベクターｐＫＣ１４およびベクターｐＫＣ１５
遺伝子VIIIＤＮＡ配列は、鋳型（テンプレート）としてのfd tetバクテリオファージ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３７０００）、プライマーＯＰＲ１５６（「フロント」ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５８）、並びに、プライマーＯＰＲ１５７（「バック」ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ．５９）を用いてＰＣＲ法により増幅された。その後、遺伝子VIIIのＰＣＲ産物は、ベクターｐＫＣ１４を得るために、ＸｍａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてベクターｐＬＬ００１内にクローン化された。ｐＬＬ００１プラスミドは、ＰＵＶＣ−１９ ＤＮＡ由来であり、遺伝子VIIIセグメントをサブクローニングできるように、そのポリリンカー領域にＸｍａIおよびＥｃｏＲI部位を含んでいる。また、ｐＬＬ００１ベクターは、遺伝子VIIIＤＮＡをクローン化するためのシャトルベクターとして使用される。ベクターｐＫＣ１５はｐＫＣ１４由来であり、９６ｂｐのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、図１に示すｐＪＲＳ１４９ベクターにクローン化することにより得られる。ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは、複数のクローニング部位（例えば、ＳｆｉＩ、ＮｃｏＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩおよびＸｍａＩ）を有する合成ポリリンカー、ｐｅｌＢリーダ、ｐｈｏＡプロモーター、および遺伝子VIII遺伝子を含んでなる。ベクターｐＫＣ１５は、ｐＪＲＳバックボーンから得られる第二のｐｅｌＢリーダを有し、ジ−シストロニック（di-cistronic）オペロン制御下での遺伝子クローニングを可能にする。
Ｄ．ＤＮＡベクターｐＫＣ１６およびｐＫＣ１８
ｐＫＣ１６由来のＸｈｏＩ−ＸｍａＩフラグメントをクローン化するため、アルファ鎖ｃＤＮＡは、プライマーＫＣ１１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）（「フロント」）およびＫＣ１１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）（「バック」）を用いてＴＣＲ Ｖ−α、Ｃ−α遺伝子を増幅するための鋳型として使用された。Ｖ−β、Ｃ−β遺伝子フラグメントは、プライマーＫＣ１１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）（「フロント」）およびプライマーＫＣ１１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）（「バック」）、並びに、β鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ法により増幅された。続いて、該遺伝子フラグメントは、ベクターｐＫＣ１８を得るためにｐＫＣ１５内にクローン化された。
図３は、これら実験で用いられている、ｐＫＣ４４、ｐＫＣ４６、およびｐＫＣ５１ ＤＮＡベクターを示すものである。ｐＫＣ１５からのＤＮＡベクターの形成については、図２および以下にそのアウトラインが示されている。
Ｅ．ＤＮＡベクターｐＫＣ２７、ｐＫＣ４２、およびｐＫＣ４４
ベクターｐＫＣ２７は、アニーリングされたプライマーＪＡ３０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９５）およびＪＡ３０２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９６）によって形成され、これにより（Ｇ₄Ｓ）₄ポリペプチドリンカーを得た。その後、該リンカーは、ＳｐｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてｐＫＣ１５ベクター内にクローン化された。その後、Ｖ−α１３．１、及びＶ−β、Ｃ−β領域は、それぞれ、ｐＫＣ２７ ＤＮＡ内にクローン化された。簡単に説明すると、Ｖ−α１３．１遺伝子フラグメントは、鋳型としてのベクターｐＫＣ１６ ＤＮＡと、プライマーＫＣ１１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）（「フロント」）およびＫＣ１２６（「バック」）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）とを用いて、ＰＣＲ法を用いて増幅することにより生成された。Ｖ−α１３．１遺伝子は、ＳｆｉＩ−ＳｐｅＩフラグメントとして、ｐＫＣ４２内にクローン化された。Ｖ−β８．２、および、Ｃ−β鎖ＤＮＡは、ｐＫＣ１８をＸｈｏＩおよびＸｍａＩにより切断された後にゲル精製された。このフラグメントは、ｐＫＣ４４ベクターを得る目的でｐＫＣ４２内にクローン化された。一般的に、ｐＫＣ４４ベクターは、ｐｈｏＡプロモーターによる転写制御下で、ｓｃＴＣＲをｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質のかたちで含むよう構成された。
Ｆ．ｐＫＣ１２、ｐＫＣ４５、ｐＫＣ４６、およびｐＫＣ５１ ＤＮＡベクター
ｐＫＣ１２（図２）からの、ベクターｐＫＣ４５、ｐＫＣ４６、およびｐＫＣ５１の形成のアウトラインについては図４に記載され、また、以下に説明される。
ｐＫＣ１２ベクターは、ｓｃＴＣＲをエンコードする実施例１のＤＮＡが、ｌａｃＺプロモーターの転写制御下で発現されるように修飾された。簡単に説明すると、ｐＫＣ１２ベクターはｐＫＣ４５ベクターを得るために、アニーリングされたプライマーＫＣ１３４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）（「フロント」）およびプライマーＫＣ１３５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）（「バック」）をｐＫＣ１２内にクローン化することにより修飾された。この修飾により、すでにＳｆｉＩ部位（サイト）およびＥｃｏＲＩ部位を含んでなるｐＫＣ１２のポリリンカー領域に対し、ＸｍａＩ部位がさらに付加された。また、ｐＫＣ４５は、ＥＥ−標識の５’末端およびアンバーストップコドンに付された遺伝子VIIIをエンコードするＤＮＡ配列を含んだ。
アンバーストップコドンは、ＸＬ１−ｂｌｕｅなどのｌａｃＩ^qアンバーサプレッサー宿主内で、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現レベルを約１５〜２０％低下させた。ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質をエンコードするＤＮＡをｐＫＣ４５内にクローン化するために、ｐＫＣ４４ＤＮＡは、ＳｆｉＩおよびＸｍａＩで分割（切断）された。その後、ｓｃＴＣＲフラグメントは、ｐＫＣ４６を得るために、ゲル精製された後にｐＫＣ４５内にクローン化された。ｐＫＣ４６へのｓｃＴＣＲ挿入断片は図３に示されるように、ＥＥ−標識、及び遺伝子VIII外殻タンパク質と融合されている。
ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質は、ｐＫＣ４４およびｐＫＣ４６ベクターをＸｍａＩおよびＥｃｏＲＩで消化（切断）することにより、ｌａｃＺプロモーターの転写制御下に置かれた。遺伝子VIIIのＤＮＡ配列は、ベクターｐＫＣ５１を得るために、消化されたｐＫＣ４４ＤＮＡから単離され、ＳｆｉＩおよびＸｍａＩフラグメントとしてゲル精製されたベクターＤＮＡ ｐＫＣ４６内にクローン化された。そのあと、ベクターｐＫＣ５１内の該ｓｃＴＣＲ挿入断片は、図３ｃに概略的に示すように、遺伝子VIII外殻タンパク質と融合された。ベクターｐＫＣ４６とは異なり、ｐＫＣ５１ベクターは、ＥＥ−標識およびアンバーストップコドンを含んでいない。
実施例３−融合タンパク質をエンコードするＤＮＡのＤＮＡベクターｐＥＮ２へのクローニング
実施例１で生成された可溶性ｓｃＴＣＲの発現は、図５に示すように、ｐＥＮ２ベクター内にサブクローニングすることにより増大された。ｐＥＮ２ベクターは、ｐｈｏＡプロモーター、遺伝子１０リボゾーム結合部位、および修飾ｐｅｌＢリーダを有している。ｐＥＮ２ベクターフォーマット内の可溶性ｓｃＴＣＲ挿入断片は、図６Ａおよび図６Ｂに概略的に示され、以下に説明される。図６Ａおよび６Ｂでは、ＤＮＡベクターは、ｐＥＮ２ベクターから構築される。
Ａ．ＤＮＡベクターｐＫＣ６０の構築
ｐＫＣ６０ベクターは、１２０４ｂｐのＳｆｉＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＥＮ２へ導入することによって得られた。ＳｆｉＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは、Ｖ−α、Ｖ−β、およびＣ−β領域（ドメイン）からなっている。このフラグメントは、プライマーＫＣ１１４（「フロント」ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）およびＪＷＴＣＲ２０８（「バック」ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）を用いて、テンプレート（鋳型）としてのｐＫＣ５１ ＤＮＡを増幅することにより得られた。ＪＷＴＣＲ２０９プライマーは、ＥＥ−標識およびＣ−β領域３’末端のＸｍａＩ部位（サイト）を含んでいる。ＸｍａＩ部位の付加は、遺伝子IIIおよび遺伝子VIIIのクローニングを促進した。ｐＫＣ６０ベクターは、上述したｓｃＴＣＲ ＸｍａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＥＮ２ベクター内にクローン化することにより得られた。
Ｂ．ＤＮＡベクターｐＫＣ６１の構築
切断されたｓｃＴＣＲを形成するために、ベクターｐＫＣ４６のＶ−αおよびＶ−β配列は、プライマーＫＣ１１５（「フロント」ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）およびＪＷＴＣＲ２０９（「バック」ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）を用いてＰＣＲ法により増幅された。形成されたＰＣＲ増幅産物はベクターｐＫＣ６０内にサブクローン化され、これによりベクターｐＫＣ６１を得た。ｐＫＣ６１ベクターは、６ＸＨｉｓ標識をＥＥ標識配列の３’末端に付加することにより更なる修飾を受けた。
Ｃ．ｐＣＫ６２およびｐＫＣ６４ ＤＮＡベクターの構築
バクテリオファージ遺伝子IIIをエンコードするＤＮＡは、ｐＫＣ６４ベクターＤＮＡをテンプレートとして用い、また、プライマーＴＣＲ２１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６８）および２１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６４）を用いて増幅された。続いて、該ＤＮＡはｐＫＣ６０内にクローン化されてベクターｐＫＣ６４を得た。遺伝子VIII遺伝子は、ベクターｐＫＣ５１ ＤＮＡをテンプレートとして用い、また、プライマーＴＣＲ２１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７１）および２１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７０）を用いて増幅され、ベクターｐＫＣ６２を得るためにｐＫＣ６０内にクローン化された。
Ｄ．ＤＮＡベクターｐＫＣ６３およびｐＫＣ６５の構築
遺伝子III（ｐＫＣ６５）および遺伝子III（ｐＫＣ６３）融合タンパク質は、それぞれに対応の遺伝子フラグメントがＰＣＲ法により増幅された後、ベクターバックボーンｐＫＣ６１内にクローン化される。これにより、ｐＫＣ６５およびｐＫＣ６３双方は、そのプライマー配列中にエンコードされた６ＸＨｉｓ末尾を含むことになる。
Ｅ．ｐＫＣ６６およびｐＫＣ６７ ＤＮＡベクターの構築
ｐＫＣ６６およびｐＫＣ６７ベクターは、Ｖ−α鎖フラグメント、およびＣ−α鎖フラグメントの最初の８個のアミノ酸を含んでなるＳｆｉＩ−ＳｐｅＩフラグメントを、テンプレートとしてのｐＫＣ５１ ＤＮＡ、並びに、プライマーＫＣ１１４（フロント ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）およびＪＷＴＣＲ２１７−β（バック ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）を用いて増幅することにより得られた。ｐＫＣ６６およびｐＫＣ６７ベクターを得るために、ＫＣ１１４およびＪＷＴＣＲ２１７−βプライマーを用いてＴＣＲ ＤＮＡがＰＣＲ法により増幅された。その後、増幅されたＤＮＡは、ｐＫＣ６２内に、もしくはＳｆｉＩおよびＳｐｅＩで予め消化されたｐＫＣ６０内にサブクローン化された。これらベクターは、それぞれ、Ｃ−α領域のＮ−末端から数えて８個のアミノ酸残基を含んでいる。これらベクターは、以下に説明されるＴＣＲライブラリの形成に使用される。ベクターｐＫＣ６６は、遺伝子VIII遺伝子を含んでいる。
ＤＮＡベクターｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）およびｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）は、12301 Parklawn Drive,Rockville,MDのBudapest Treaty（ブダペスト条約）with the American Type Culture Collection（ATCC）に準じて寄託されている。これらＤＮＡベクターは、１９９７年２月２６日にＡＴＣＣに寄託され、Accession Nos.97895（ｐＳＵＮ１８）および97896（ｐＳＵＮ１９）に指定された。ＤＮＡベクターｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）は、ｐｈｏＡプロモータ、修飾ｐｅｌＢ配列、遺伝子１０リボソーム結合部位、およびバクテリオファージ遺伝子VIIIプロモータを含んでなる。ＤＮＡベクターｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）は、ｌａｃＺプロモータ、ＥＥ標識、およびバクテリオファージ遺伝子IIIタンパク質を含んでなる。これらＤＮＡベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）、もしくは他の適切な宿主細胞内で、標準的な方法により増殖させることができる。
ＤＮＡベクターｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）およびｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）は、様々なＶα、Ｖβ−Ｃβおよびポリペプチドリンカー配列を収容（accomodate）可能に設計されている。これら両ＤＮＡベクターのＶα鎖は、ＳＦｉＩおよびＳｐｅIの制限消化により切除することができる。Ｖβ−Ｃβ鎖は、ＸｈｏＩ−ＸｍａＩの制限消化により切除することができる。また、これらＤＮＡベクターでは、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩの制限消化により、ペプチドリンカー配列の交換が可能である。
実施例４−ＴＣＲ融合タンパク質の発現の調節
１．ｐｈｏＡプロモータ
ＸＬ１−Ｂ細胞は、ｐｈｏＡプロモータを含むベクターｐＫＣ４４で形質転換された。形質転換された細胞は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の誘導を防止するため、リン酸を含む培地で一晩生育された。培地からリン酸を取り除くと、ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIIIタンパク質が発現する。シェーカーフラスコで一晩成長された後、細胞は、リン酸欠乏培地で数回洗浄された。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現は、洗浄された細胞を、リン酸欠乏培地に再び懸濁することによって開始された。４時間の誘導の後、細胞は収集された。通常、４時間の誘導により、ウエスタンブロット分析により分析可能な、適切なレベルの可溶性ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質が供給される。ｐｈｏＡプロモータ制御下におけるｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質のより高い収率（例えば、約１０〜４００mgの間）は、細胞を、３〜１０リットルのファーメンター、もしくはバイオリアクターなどの他の大規模な作成容器内で増殖することにより得られる。
一般的に、ｐｈｏＡプロモータを含むベクターは、Ｌａｃなどの他のプロモータを含むベクターよりも好適に使用された。また、ｐＥＮ２ベクターを用いた発現は、多くの理由から特に好ましいとされた。例えば、ｐＥＮ２ベクターは、ｐｈｏＡプロモータの他に、翻訳を増強する遺伝子１０リボゾーム結合部位を含んでいる。ｐＥＮ２ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにとって好適なコドンを含むべく修飾されたｐｅｌＢリーダペプチドをさらに含んでいる。修飾されたｐｅｌＢリーダ配列およびペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９および１３０に図示されている。図７に示すウエスタンブロットは、このような修飾が、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現を約１０〜５０倍と、大幅に向上する様を示している。
図７に示すウエスタンブロットは、抗−ＥＥ標識抗体（１：５０００希釈）を用いてプローブされ、その後、ヤギ 抗−マウスＨＲＰ抗体（１：２００００希釈）を用いてプローブされた。視覚化は、標準的な免疫学的手法によって行われた。レーン１は、分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を示す。レーン２は、１０ＯＤ／ｍｌのｐＫＣ６０由来ｓｃＴＣＲ（誘導された）５マイクロリットルを示す。レーン３は、誘導されていない（derepressed）ことを除けばレーン２と同一条件である。レーン４は、１０ＯＤ／ｍｌのｐＫＣ５１由来ｓｃＴＣＲ（ＥＥ標識なし）５マイクロリットルを示す。レーン５は、５０ＯＤ／ｍｌのＩＰＴＧで誘導されたｐＫＣ４６由来ｓｃＴＣＲ５マイクロリットルを示す。
２．ＬａｃＺプロモーター
ｓｃＴＣＲ／遺伝子III（ベクターｐＫＣ４６）およびｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII（ベクターｐＫＣ５１）融合タンパク質は、約３リットルのファーメンター内で発現された。ｐｈｏＡプロモーターによる転写制御下でｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現させると、Ｌａｃプロモーターを含むベクターを用いる場合よりも多量の融合タンパク質が生成した。よって、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、一般的に、ｐｈｏＡプロモーターを含むベクターを用いて発現された。
実施例５−ｓｃＴＣＲ融合タンパク質系の発現
いくつかのＥ．ｃｏｌｉ菌株（系統：ＸＬ１−Ｂ、ＭＭ２９４、ＴＢ１、ＵＴ５６００、および，Ｋ９１Ｋａｎ）につき、そのｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現能に関し分析がなされた。上記の宿主細胞系統は、実施例４で得られたｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現させるべく、ｐＫＣ６０で形質転換された。全ての形質転換された系統は、３０℃のリン酸培地で成長するように適応された。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の誘導は、リン酸欠乏培地内で成長させることにより行われた。ｓｃＴＣＲ発現のレベルは、図８に示すウエスタンブロット分析により求められた。図８では、レーン１は、分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を示す。レーン２は、１０ＯＤ／ｍｌのＭＭ２９４ ライゼート（ｐＫＣ６０）４マイクロリットルを示す。レーン３は、宿主系統がＫ９１Ｋａｎであることを除けばレーン２と同一条件である。レーン４〜６も、宿主系統が、順にＸＬ１−Ｂ、ＴＢ１、および、ＵＴ５６００であることを除けばレーン２と同一条件である。全ての免疫沈降（沈澱）は、可溶性細胞画分でｐｈｏＡ誘導細胞から調製された。簡単に説明すると、ウエスタンブロットは、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に、形質転換細胞の５ＯＤ／ｍｌの細胞懸濁液５μｌを添加することによって行われ、続いて、標準的なウエスタンブロット法によりブロットへ写しとられた。ｓｃＴＣＲは、University of San Diego,San Diego CalforniaのGernot Walter’s Labratoryから認可された、抗−ＥＥ標識抗体を用いてブロットをプローブする方法で検出された。これとは別に、他の抗−ＥＥ標識抗体およびＥＥ標識を使用することもできる（例えば、pharmaciaから得られるもの）。抗体を結合後、ヤギ 抗−マウスＨＲＰで標識されたコンジュゲート（Jackson Laboratories）が添加された。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現は、Ｋ９１Ｋａｎ系統で最大であった（図８）。
実施例６−ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の精製
ベクターｐＫＣ５１によりエンコードされた融合タンパク質は、従来の免疫アフィニティークロマトグラフィーにより、形質転換細胞から精製された。図９は、ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質の免疫アフィニティークロマトグラフィーによる精製を概略的に示すものである。
簡単に説明すると、精製は、タンパク質−Ａ被覆（coated）セファロースビーズ１ｍｌに対し、ハムスター 抗マウスαβＴＣＲ抗体Ｈ５７−５９７（ＡＴＴＣ Accession ＨＢ−２１８）５ｍｇをカップリングすることで、クロマトグラフィー用のカラムを作成することにより行われた。Ｅ．ｃｏｌｉライゼートは、ファーメンターから取り出した細胞ペースト５０gを、溶解バッファ（0.05M Tris,pH8.0,150mM NaClおよび5mM EDTA）１００ｍｌに溶解することにより得られた。再懸濁後の細胞は、フレンチプレスにより、２経路で溶解された。不溶性物質は、１０，０００Ｇの遠心分離を２０分間行うことにより除去された。上澄みは保持され、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで抗体カラムに供された。その後、カラムは、２０カラム量のＰＢＳにより洗浄され、結合したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）により溶離され、その１ｍｌ画分が、２Ｍ Tris ０．０５ｍｌ（ｐＨ８．０）を含む管内に収集された。ｓｃＴＣＲを含む画分はプールされ、ＰＢＳ４リットルにより一晩透析された。次の日に、精製されたタンパク質は、セントリコン濾過装置（ｍｗ １００カットオフ）を用いて、５〜１０倍に濃縮された。
得られたｓｃＴＣＲタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での電気泳動、その後のクーマシー・ブリリアントブルー染色により評価された。タンパク質の完全度は、抗体Ｈ５７−５９７もしくは抗Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（ＥＥ）標識抗体をプローブとして用いたウエスタンブロット分析により求められた。ＥＥ抗体は、９つのアミノ酸よりなる直鎖状エピトープ、EEEEYMPME（SEQ ID NO 98）（図１０）を認識する。Ｖ−β８．２立体配座エピトープに結合するその他２つの抗体（ＭＲ５−２抗体、およびＦ２３．１抗体（PherMingen））も、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の精製のために用いられた。また、Ｎｉ²⁺ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによるｓｃＴＣＲタンパク質の精製を容易とするため、６ＸＨｉｓ末尾（テール）が、いくつかの構造物（図６Ａ参照）に付加された。
図１０は、ｐＫＣ５１（レーン２）、ｐＫＣ４６（レーン３）、Ｈ５７抗体カラムで精製されたｐＫＣ４６（レーン５）、Ｈ５７カラムにおいて再度折り畳まれ、精製されたｐＫＣ４６（レーン６）由来のｓｃＴＣＲタンパク質の、発現を示すウエスタンブロットを表したものである。レーン７には、レーン１もしくは６と比較して約５倍量の融合タンパク質が付与された。分子量マーカーは、レーン１に示されている。可溶性カラム画分（レーン１）および不溶性カラム画分（レーン１０）からのフロースルーも示されている。レーン４および８はブランクである。該ブロットは、抗−ＥＥ標識モノクローナル抗体の1:5000希釈液を用いてプローブされ、その後、ヤギ 抗マウスＨＲＰ抗体の1:20,000希釈液を用いて視覚化された。着色は標準的な方法によって行われた。
実施例７−ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の特徴分析（characterization）
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の特徴分析のために、抗−αβＴＣＲ ｍＡｂｓパネルが使用された。ハムスターｍＡｂであるＨ５７−５９７は、Ｃ−β領域上のエピトープを認識する。競合テストが行われ、ＭＲ５−２とＨ５７−５９７との競合効果が示された。このことは個々の抗体により接合されるエピトープは近位であることを示唆している。同じＴＣＲ分子に工学的に導入された、９つのアミノ酸よりなるＥＥ配列、および、遺伝子III・遺伝子VIIIタンパク質に特異性を有するポリクローナル ヒツジ 抗−バクテリオファージ血清（Phermacia）等の他の抗体もｓｃＴＣＲの特徴分析に使用された。
Ａ．分子量
ベクターｐＫＣ５１から発現されたｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供され、その後、クーマシーブルー（図１１参照）で染色された。図１１において、レーン２は、ＸＬ１−Ｂ細胞の１０ＯＤ／ｍｌ培養物から産生された融合タンパク質を示す。図１１のレーン３は、ｓｃＴＣＲを精製するのに使用されるＨ５７抗体カラムからのフロースルーを示す。図中のレーン４は、カラムからの精製ｓｃＴＣＲを示す。図１１のレーン１は、分子量マーカーを示す。ゲルの観察により、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ゲル内を約４６ｋＤの位置まで移動したことが明らかになった。この結果は、ｓｃＴＣＲは完全であることを示す。
図１２に示すウエスタンブロットは、４６−５０ｋｄの分子量を示すタンパク質の、ＥＥ−標識，バクテリオファージタンパク質、もしくはＣ−β領域内のエピトープそれぞれと結合する抗体を用いてプローブされた（図１２）。他のＤＮＡベクターから産生されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、同様の方法で分析された。
Ｂ．立体配座折り畳み（Conformational Folding）
ｐＫＣ６０ ＤＮＡベクターによってエンコードされた融合タンパク質は、抗−Ｖ−β８．２抗体（ＭＲ５−２およびＦ２３．１）および抗−idotype mab ＫＪ１（Dr.KapplerおよびMarrackの好意による提供）を用いた結合検定を行うことにより、その折り畳み構造の適切さのテストが行われた。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、抗−Ｖ−β８．２抗体と共に４℃で一晩インキュベートされ、翌日、ヤギ 抗−マウス被覆（coated）マグネティックビーズ（Dynal）と結合された。この物質は、さらに一時間、室温（ＲＴ）でインキュベートされた。免疫複合体は、標準的な手順により沈降された。その後、ビーズは、非特異的に結合したタンパク質を除去するために、０．５ｍｌのＰＢＳ＋０．５Ｍ ＮａＣｌにより丁寧に洗浄された。４回の洗浄後、マグネティックビーズは、β-2 メルカプトエタノールを含有する、もしくは含有しないＳＤＳを含んでなる５０μｌのクラッキングバッファー内に再懸濁され、それぞれ３分間煮沸された。続いて、マグネティックビーズを除去し、その溶液は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、１２０ボルトで１時間さらされた。これにより、サンプルは電気泳動された。続いて、得られたブロットを、ＨＲＰ標識された抗−ＴＣＲ抗体（Phermingenより得られたＨ５７）もしくは抗−ＥＥ標識抗体でプローブすることにより、サンプルに対するウエスタンブロットが行われた（図１３）。
図１３は、抗−ＥＥ標識抗体の1:5000希釈液によりプローブされたウエスタンブロット、および、それに後続する、ヤギ 抗−マウス−ＨＲＰの1:20,000希釈液による視覚化の結果を示すものである。ｐＫＣ６０およびｐＫＣ６２双方の培養物は、リン酸欠乏により誘導された。レーン１は、ｐＫＣ可溶性画分の１０ＯＤ／ｍｌサンプル１０マイクロリットルを示す。レーン２は、ＭＲ５−２モノクローナル抗体により形成された、ｐＫＣ６０由来のｓｃＴＣＲ融合タンパク質の免疫沈降を示す。レーン３は、ＭＡｂＦ２３．１を使用することを除いては、レーン２と同様にして得られた免疫沈降を示す。レーン４は、ＭＡｂＫＪ１により形成された、ｐＫＣ６０由来のｓｃＴＣＲ融合タンパク質の免疫沈降を示すものである。レーン５〜８は、ｐＫＣ６２由来のｓｃＴＣＲ融合タンパク質が分析されたこと以外は、順にレーン１〜４と対応する（同様の）ものである。全てのレーンは、誘導培養物からのものである。ｓｃＴＣＲタンパク質は、立体配座的に正しいＶ−β部を持つことが、このデータにより示唆される。
３．表面プラズマ共鳴分析（BiaCore）
ｐＫＣ５１によりエンコードされたｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、表面プラズマ共鳴分析により、さらにその特徴が分析された（図１４）。融合タンパク質はまず、ｓｃＴＣＲ分子をＭＲ５−２もしくはＨ５７抗体で被覆されたバイオセンサーチップ上に捕捉する、従来のサンドウィッチ検定により検出された。この検出は、概して製造者（Phermacia）の指示に従い行われた。一般的に、抗体の一方がｓｃＴＣＲ融合タンパク質を捕捉するために使用された場合、他方の抗体は、サンドウィッチ複合体を形成するために使用される。２つの抗体は、β鎖の異なる領域を認識し、ｓｃＴＣＲとの結合において競合することが、データにより示唆された（図１４）。図１５は、相互作用を概略的に示す。ｓｃＴＣＲは、抗−Ｍ１３抗体によって、さらに結合されることも可能であり、このことは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質上に、バクテリオファージタンパク質が存在することを示している。
スーパー抗原（例えば、ＳＡｇ）は、ＭＨＣフォーマットにおける提示とは無関係に、いくつかのＶ−β鎖と結合可能である。ＴＣＲとＳＡｇとの相互作用は、Ｖ−β鎖の高可変性４（ＨＶ４）領域で起こる。ＳＡｇとＨＶ４領域との相互作用は立体配座による。そのため、ｓｃＴＣＲタンパク質が、チップ上にコートされたＳＡｇと結合可能か否かを調べるために、表面プラズマ共鳴分析が使用された（図１６）。ＳＡｇは、ＴＣＲ Ｖ−β８．２と結合することが知られている。表面プラズマ共鳴分析が行われたうち、報告されている最も高い親和性は５×１０^-5モルであると信じられており、この相互作用が、ＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチド相互作用と比較可能である。
ＳＥＣ３（Toxin Technology,Tempa FL.）として知られるStreptococcus ＳＡｇが、標準的なアミン結合化学的手法を用いてチップと結合された。精製されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質を、濃度約２μＭ〜１６μＭの範囲内で、かつ、流速２μｌ／ｍｉｎでチップ上を通過させた。コントロールとして、融合タンパク質とブランクチップとの非特異的結合の計測が、ＳＥＣ３により被覆されたチップとの特異的結合の計測実験と並行して行われた。結合データは、２つのチップ間での、ｓｃＴＣＲ結合の違いを比較することによりまとめられた。該データは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質とチップ上のＳＥＣ３ ＳＡｇとの間には、特異的相互作用があることを示した。さらに、これらデータは抗体結合データをサポートし、ｓｃＴＣＲが立体配座的に正しいＶ−β８．２領域を含んでなることを示唆する（図１６）。
実施例８−ＯＶＡ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ結合分析における融合タンパク質の活性
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の機能と生物学的作用を調べるため、細胞ベースの競合（拮抗）阻害検定が使用された。一般的に、ＭＨＣ分子中に捕捉された抗原からＤＯ１１．１０細胞をブロックする目的で、上記実施例４で精製された融合タンパク質（Ｔ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０由来）が使用された。相互作用は、ＩＬ−２の産生を計測することにより検出された。
上述したように、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の機能性をテストするための分析の例は、上記の公開ＰＣＴ出願番号／ＵＳ９５／０９８１６、および審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に記載されている。特に、上記審査中の米国特許出願番号０８／５９６，３８７には、Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞検定、該検定に使用される細胞（例えば、ＤＯ１１．１０）、ｓｃ−ＭＨＣクラスＩおよびII分子、特に、共有結合された、もしくは非共有的に結合された提示ペプチド（例えば、ＯＶＡもしくはＨＳＶｇＤ１２ペプチド）を有するｓｃ−ＭＨＣ ＩＡ_dクラスII分子が開示されている。
Ａ）Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞検定
ｓｃＴＣＲ誘導タンパク質分子の機能性をテストするＴ細胞ハイブリドーマ検定は、上記の公開ＰＣＴ出願番号／ＵＳ９５／０９８１６、および審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に記載されている。
簡単に説明すると、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマ系統は、ニワトリ オボアルブミン由来の１７アミノ酸よりなるＯＶＡペプチトフラグメント（アミノ酸３２３〜３３９）に特異性を有する細胞表面Ｔ細胞レセプターを発現する。ＯＶＡペプチドは、マウス クラスIIＭＨＣ分子Ｉ−Ａｄを発現するＡＰＣにより、ＤＯ１１．１０細胞に提示される。ペプチドが、適切なＡＰＣにより提示された場合、ＤＯ１１．１０細胞は、ＩＬ−２を産生すべく応答し、これはＴ細胞活性の指標として使用することができる。Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞検定の例を以下に簡単に示す。
ｓｃ−ＩＡｄ／ＯＶＡ複合体は、ＤＰＢＳ（Ｍｇ²⁺およびＣａ²⁺イオン非含有）により希釈され、９６ウェルプレートの有するウェルに受動的に供給された。ｓｃ−ＩＡｄ／ＯＶＡペプチドは、共有結合された提示ペプチドを含んでいることが好ましい。室温で一晩インキュベートされた後、ウェルを、Ｍｇ²⁺およびＣａ²⁺イオン非含有ＤＰＢＳで、２回洗浄してもよい。約１×１０⁵ＤＯ１１．１０細胞は、０．５μg ＭＨＣ／ペプチド分子が供給されたウェルの存在化もしくは非存在化で、３５℃で４時間または７時間インキュベートされる。
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の特異性をさらに実証するために、ＩＡｄ制限型であるがＨＳＶペプチドを認識する、第二のＴ細胞ハイブリドーマ（ｇＤ）を使用することもできる。ｇＤＴ細胞ハイブリドーマは、上記の審査中の米国特許出願シリアル番号０８／５９６，３８７に開示されている。この検定は、以下のことを実証するために行われる。すなわち、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ＤＯ１１．１０ハイブリドーマ細胞によるＩＬ−２産生を阻害可能であり、一方、ｇＤ１２Ｔ細胞ハイブリドーマによるＩＬ−２の産生に対しては、仮にあるとしても、非常に小さい阻害効果を有することを実証するためである。培養は、完全培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびＬ−グルタミンを添加してなるＲＰＭＩ１６４０）で、９６ウェル平底マイクロプレート上で行われた。４時間もしくは７時間のインキュベーションの後、ＩＬ−２の存在を調べるため、培養物の上澄みをＩＬ−２サンドウィッチＥＬＩＺＡ法により分析した。
適切なＩＬ−２検出プロトコールは、上記の公開ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、および審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に記載されている。ここで行われるＩＬ−２サンドウィッチＥＬＩＺＡ法のプロトコールは、基本的には、PharMingenに説明されているものである。簡単に説明すると、ウェルは、２μｇ／ｍｌのラット 抗−マウスＩＬ−２抗体５０μｌによりコートされる。抗体を、４℃で一晩インキュベート後、これを受動拡散によりプラスチックに結合する。プレートは、ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０により２回洗浄される。その後、細胞培養物の上澄み１００μｌがそれぞれのウェルに加えられ、室温で４時間インキュベートされる。その後、プレートは、ビオチニル化（biotinylated）ラット 抗−マウスＩＬ−２抗体、すなわち、第二の抗体が加えられる前に、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎにより６回洗浄される。この抗体は、室温で１時間インキュベートされ、その後、該プレートは、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎにより６回洗浄される。最後に、２５μｇ／ｍｌのstrepavidnperoxidase１００μlが、各ウェルに加えられ、室温で３０分間インキュベートされる。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで8回洗浄後、ＡＢＴＳ基質１００μｌが加えられ、シグナルが、ＯＤ４０５ｎｍで読まれる。産生ＩＬ−２の濃度は、ＩＬ−２スタンダード曲線に対するプロットにより数量化された。ＤＯ１１．１０およびｇＤ１２細胞の活性化のためのＩ−Ａ^d／ペプチド分子の最適投与量は、最大反応よりも若干低めの反応を促すものである。従い、実験は、０．５μg Ｉ−Ａｄ／ペプチドでコートされたウェル、および、４時間もしくは７時間のインキュベーションにて行うことができる。
本発明の可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質に関し、その濃度１０^-9〜１０^-4Ｍの範囲内での、ＤＯ１１．１０細胞内におけるＩＬ−２の産生をブロックする能力についてテスト可能である。テストは、可溶性ｓｃＴＣＲとプレート上にコートされた可溶性Ｉ−Ａｄ／ペプチド分子とのモル比が、約１０：１から１：１の範囲内で行うことができる。濃度は、必要に応じて調節することができる。期待されることは、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質共存下でのプレインキュベーション後に、ｇＤ１２と比較して、ＤＯ１１．１０のＩＬ−２産生が低下することであり、これは可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質が、ＴＣＲ特異的な免疫反応を抑制可能であることを示す。
ＴＣＲはＭＨＣ／ペプチドに対する結合親和性が低いので、阻害検定において、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を用いたＩＬ−２産生の低下が常に観察できるとは限らない。しかしながら、相互作用の親和性は、多価ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を構築することにより増大できる。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の親和性を増大すること（また、その解離を妨げること）により、ＭＨＣ／ペプチド複合体と結合する機会が与えられるＴＣＲ量がより少なくなると考えられている。
実施例９−多価融合タンパク質の調製
多価分子をつくるには、広く知られた方法がいくつかある。多価融合タンパク質は、標準的な方法でｓｃＴＣＲをビオチニル化し、その後、分子に対し、streptavidin添加後、架橋することで得られる。biotin-streptavidin接合によれば、通常、４量体型の多価融合タンパク質が形成される。
多価融合タンパク質は、公知の方法（例えば、Newman,S.L.et al.J.Immunol.（1995）154,753参照）に従って、融合タンパク質をラテックスビーズ（Polysciences,Inc.Warrington,PA）に共有結合することによっても作出できる。例えば、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、アミン基もしくはジスルフィド基を介して、ビーズに直接結合することもできる。ｓｃＴＣＲの変性は、ラテックスビーズを、strepavidinもしくはｓｃＴＣＲに特異的に結合する抗体でコートすることにより最低限にすることができる。例えば、上記のようにｓｃＴＣＲがＥＥ−標識を含む場合、ＥＥ−標識抗体は、ラテックスビーズをコートするために使用できる。
実施例１０−イン・ビトロでの抗原刺激性Ｔ細胞増殖に対するｓｃＴＣＲ融合タンパク質の効果
上記の各実施例で形成された可溶性融合タンパク質に関し、抗体刺激性Ｔ細胞増殖の抑制能についてテスト可能である。このようなテストの例は、上記の公開ＰＣＴ出願番号／ＵＳ９５／０９８１６、および審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に記載されている。
この公開ＰＣＴ出願番号／ＵＳ９５／０９８１６、並びに、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に記載されている方法の一つでは、Ｔ細胞は、マウスなどの全ての哺乳類から単離することができる。例えば、完全フロイントアジュバント中の５０μｇＯＶＡ３２３−３３９−ＫＬＨを用いて、皮下注射により尾の付け根から免疫感作することで、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＭＨＣクラスII：Ｉ−Ａｄ）からＯＶＡ−ｐｒｉｍｅｄ Ｔ細胞を得ることができる（Harlow and Lane,Supra参照）。例えば、７日間隔で２回の免疫感作を行うことが可能であり、２回目の注射から１週間後にマウスは解剖され、鼠蹊およびリンパ腺が切除され、これが分散されて単一細胞懸濁液が得られる。その後、単一細胞懸濁液はナイロンウールおよびSephadex G-10カラムでのインキュベーションにより、抗原提示細胞が取り除かれる。精製されたＴ細胞群は、Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地のみ、もしくはＣｌｉｃｋ’ｓ培地に溶解されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質と共に、さらにインキュベートされる。
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の活性化Ｂ細胞を、従来のＢ細胞増殖検定（assay）において抗原提示細胞として用いる。例えば、Ｂ細胞は以下の方法で調製する。即ち、脾臓細胞に５０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（即ち、リポサッカライド）を加えて４８−７２時間培養する。培養終了後、活性化された細胞を、Ficoll／Hypaque（Pharmacia製）を用いて密度勾配遠心分離により単離する。その後、活性化されたＢ細胞にＯＶＡ３２３−３３９ペプチドの存在下で３時間パルスをかけ、厳密に洗浄し、さらに、Ｂ細胞の増殖を阻害するべくパラホルムアルデヒドを加えて固定したものを、精製Ｔ細胞単独、あるいはＴ細胞と可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質との混合物に加える（Selected Methods in Cellular Immunol.（1980）B.B.Mishell and S.M.Hiigi W.H.Freeman and Co.San Franciscoを主に参照）。
標準のＢ細胞増殖検定は、９６ウェル丸底マイクロプレート中、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で、３−５日かけて行われる。ウェルに、ＷＳＴ−１（Boehringer Mannheim製）試薬を加えて４時間パルスをかけた後、培養を終結させる。その後、培養物の光学濃度を記録する。免疫感作（免疫付与）後のマウス中で起こったＴ_H細胞応答（即ち、クローンの増殖）は、ペプチド反応性Ｔ細胞の増殖度により示される。
実施例１１−イン・ビボにおける、抗原刺激性Ｔ細胞増殖に対するｓｃＴＣＲ融合タンパク質の影響
可溶性融合タンパク質に対し、さらに、イン・ビボにおけるＴ細胞クローンの増殖阻害試験を以下の出願に記載された方法に従って行う。即ち、公開ＰＣＴ国際出願番号ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。
例えば、３つの試験用グループを次のようにして準備する。即ち、１５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに対し、完全フロイントアジュバント中に混合されたＯＶＡ３２３−３３９−ＫＬＨを、腹膜腔内注射（ＩＰ）により約１０−１００μｇ投与し、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに対する免疫応答を誘導する。ＯＶＡ−ＫＬＨによる免疫感作の前日及び２日後に、５匹のマウスに対して、抗−ＯＶＡ／Ｉ−Ａｄ ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をＰＢＳに加えたものを、ＩＰによる約１０−１００μｇ投与する。このｓｃＴＣＲはＩ−Ａｄ／ＯＶＡ ＭＨＣクラスII分子に結合して、抗原特異的Ｔ細胞上のＴＣＲ分子がＡＰＣ上のＩ−Ａｄ／ＯＶＡ分子に結合するのを抑制あるいは排除する。残りの１０匹のマウスは、コントロールとして用いる。例えば、５匹のマウスにはＰＢＳを与え、他の５匹のマウスには異なる特異性を有するｓｃＴＣＲを与える。マウスは、免疫感作の１０日後に解剖する。リンパ節を除去し、これを分散することで、単一細胞の懸濁液を調製する。該懸濁液をナイロンウール上でインキュベートし、Sephadex G-10カラムにかけることにより、懸濁液から抗原提示細胞を取り除く。
得られた精製Ｔ細胞群に対し、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドと共にパルスをかけたＡＰＣを加え、該精製Ｔ細胞群をインキュベートする。ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の活性化されたＢ細胞を、増殖検定におけるＡＰＣとして用いる。Ｂ細胞は以下の方法で調製する。即ち、マウスの脾臓細胞に５０μｇ／ｍｌのＬＰＳを加えて４８−７２時間培養する。培養終了後、活性化された細胞を、Lymphoprepを用いた密度勾配遠心分離により単離する。その後、活性化されたＢ細胞にＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを加えて３時間パルスをかけ、厳密に洗浄し、さらに、Ｂ細胞の増殖を阻害するべくパラホルムアルデヒドを加えて固定したものを、精製Ｔ細胞に加える。
Ｔ細胞増殖検定は、９６ウェル丸底マイクロプレート中、３７℃、５％ＣＯ₂条件下で、３−５日かけて行う。ウェルにＷＳＴ−１試薬を加えて４時間パルスをかけた後に培養を終結させ、異なる波長における吸光度を読みとる。免疫感作後のマウス中で起こったＴh細胞応答（即ち、クローンの増殖）は、この検定におけるペプチド反応性Ｔ細胞の増殖度により示される。予想されることは、ＯＶＡ−ＫＬＨあるいはＨＳＶ−ＫＬＨによる免疫感作を行うとともに、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の投与を行ったことにより、クローンの増殖量が制限され、それに続くＯＶＡ反応性Ｔ細胞系のイン・ビトロにおける増殖は、ＨＳＶ反応性Ｔ細胞系の増殖に影響を及ぼすことなく、制限されるということである。
実施例１２−マウスの自己免疫疾患の抑制
実験用アレルギー性脳髄炎（experimental allergic encephalomyelitis（ＥＡＥ））は、マウスの自己免疫疾患であり、一般に多発性硬化症に対応する動物モデルと考えられている。２つのタンパク質の起脳炎領域、すなわちミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ アミノ酸９１−１０３）及びプロテオリポタンパク質（proteolipoprotein）（ＰＬＰ アミノ酸１３９−１５１）の起脳炎領域は決定されている（Martin,R.et al.Ann.Rev.Immunol.（1992）10:153を主に参照）。
ＳＪＬマウス系統では、ＥＡＥの誘導・発症は、起脳炎ペプチドによる免疫感作、あるいはＭＢＰ反応性Ｔ細胞の養子免疫伝達によってもたらされる。可溶性の抗−ＭＢＰ９１−１０３Ｔ細胞受容体（レセプター）、又は可溶性の抗−ＰＬＰ１３９−１５１ Ｔ細胞レセプターのうち、いずれにより処理するとＴ細胞活性化後のＥＡＥの発症が防止されるかを決定するために、ＳＪＬマウスに対してＭＢＰ９１−１０３反応性Ｔ芽細胞、及びＰＬＰ１３９−１５１反応性Ｔ芽細胞をイン・ビボで投与する。このようなマウスにおいてＴ細胞の増殖を検出する適切な方法は、以下の出願に記載されている。即ち、公開されたＰＣＴ国際出願番号ＵＳ９５／０９８１６、米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。
また、公開されたＰＣＴ国際出願番号ＵＳ９５／０９８１６、米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７は、さらに以下の内容を記載している。即ち、ＳＪＬマウスでＥＡＥを誘導するには、ＳＪＬマウスの背（dorsum）に対し、完全フロインド・アジュバント中のＭＢＰ９１−１０３を約４００μｇ投与して免疫感作する。１０−１４日後、部分的に流れ出た（regional draining）リンパ系細胞を上述のように収集し、２４ウェルプレートで培養する。該細胞の濃度は、１ウェルあたり細胞６×１０⁶個とし、１．５ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地／１０％ウシ胎児血清／１％ペニシリン／ストレプトマイシン／ＭＢＰ５０μｇ／ｍｌ中で培養する。４日間イン・ビトロで刺激を与えた後、ＭＢＰ９１−１０３反応性Ｔ芽細胞を、Ficoll／Hypaque密度勾配（Pharmacia製）により収集し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１．３×１０⁷個の該細胞を個々のマウスに投与する。
起脳炎ＭＢＰ９１−１０３反応性Ｔ細胞を与えたマウスには、さらに以下のものを投与する。即ち、ＭＢＰ９１−１０３特異的ｓｃＴＣＲ融合タンパク質約１００μｇ（IAsコンテクスト（context））、ＰＬＰ１３９−１５１特異的ｓｃＴＣＲ融合タンパク質１００μｇ（ネガティブコントロール）、あるいは生理食塩水（模擬コントロール（sham control））を、その同日、３日後、７日後に、静脈注射（i.v.）により投与する（トータル投与量３００μｇ）。続いて、臨床評価または組織学的評価を行い、ＭＢＰ９１−１０３＋ＩＡｓに対し反応性を有するｓｃＴＣＲ分子が、マウス中のＥＡＥの発症を阻害したことを確認する。
上記公開ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７に記載のように、ＰＬＰペプチド１３９−１５１によりＳＪＬマウス中でＥＡＥを誘導するために、ＰＢＳに溶解したＰＬＰペプチド１３９−１５１と、マイコバクテリア結核菌Ｈ３７Ｒａを４ｍｇ／ｍｌで含有する完全フロイントアジュバントとを１：１の割合で混合したものを、該マウスに投与して免疫感作する。これにより、マウスに１５２μｇのペプチド−アジュバント混合物を投与する。その同日及び４８時間後に、すべてのマウスに百日咳毒素を４００ｎｇ与える。その後、ＥＡＥの養子免疫伝達を上述のように行う。
上述の方法に従って（実施例１参照）、ＴＣＲ ＤＮＡを、正常なＳＪＬマウス及びＥＡＥ疾患のＳＪＬマウスから得る。そして、ＴＣＲ ＤＮＡを用いてｓｃＴＣＲを構築する。ｓｃＴＣＲは、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントを有する適切なＤＮＡベクターにライゲーションされる。その後、ＰＬＰ反応性ｓｃＴＣＲペプチド融合物あるいはＭＢＰ反応性ｓｃＴＣＲペプチド融合物を発現させ、上記実施例に従い、必要に応じて精製する。そして、これらのｓｃＴＣＲペプチド融合タンパク質に対し、ＥＡＥの発症防止能試験を行う。
以下の実施例１４及び１５に述べるように、ＰＬＰ ｓｃＴＣＲ融合タンパク質及びＭＢＰ ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を用いて、バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリを作成することもできる。そのｓｃＴＣＲバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリから、ＩＡsと共同して、ＭＢＰ（９１−１０３）ペプチドあるいはＰＬＰ（１３９−１５１）ペプチドに結合するレセプターをスクリーニングする。以下の実施例１５においてさらに詳しく述べるように、結合したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、適切なパニング技術（panning technique）により単離される。このようにして得られたｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成に用いる。そして、この可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質に関し、ＳＪＬマウスの自己反応性Ｔ細胞に対する阻害作用の評価を行う。
実施例１３−ｓｃＴＣＲ抗原結合領域の親和性向上
親和性の高いｓｃＴＣＲ融合タンパク質に対しては、ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド複合体との不所望な相互作用を抑制あるいは排除する作用が期待される。不所望な相互作用とは、例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び移植時の拒絶反応において生じるものである。親和性の高いｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、例えば、対応するネイティブＴＣＲと競合して、ＴＣＲを有するＴ細胞とＭＨＣ／ペプチド分子を有するＡＰＣとの結合を抑制あるいは排除する。あるいは、該ｓｃＴＣＲ分子はスーパー抗原との結合を抑制する。ネイティブＴＣＲは、結合の親和性が弱く、また、解離速度が速いので、多くのｓｃＴＣＲ融合タンパク質が単一のＭＨＣ／ペプチド分子と相互作用することができると考えられている。
親和性の高いｓｃＴＣＲ融合タンパク質を用いて、自己反応性Ｔ細胞を活性化するＭＨＣ／ペプチド分子との結合を抑制あるいは排除することができる。これを実現するためには、遺伝子工学（例えば、部位特異的突然変異の誘導あるいはリンカー走査突然変異（site directed or linker scanning mutagenesis）の誘導）を利用し、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の親和性を改善すること、特に解離速度を向上することにより実現される。従来の結合検定は、タンパク質の解離速度を研究するために行われてきた。ｓｃＴＣＲに特異的に結合する抗原性ペプチドの配列が分かっているか、あるいはすぐに決定できるものである場合は、該ペプチドを、例えば、アラニン走査突然変異（alanine scanning mutagenesis）の誘導により突然変異させ、ｓｃＴＣＲのＣＤＲ３領域に特異的に結合する残基を同定する。突然変異した抗原性ペプチドとｓｃＴＣＲとの結合は、本願で述べる結合検定により評価する。従って、このペプチドにおいて同定されたアミノ酸残基は、ｓｃＴＣＲ分子における接触残基（contact residue）の同定を可能にする。好ましくは、この方法で生成されたｓｃＴＣＲタンパク質突然変異物が、ＴＣＲの抗原に対する結合特異性、及び抗体の親和性を有することである。改良ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成方法としては、上述したように突然変異融合タンパク質を生産することによって行われる。
改良ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、以下の実施例に述べるバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリを用いて、自己反応性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を単離することにより生成できる。そして、バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリを用いて、ＰＬＰタンパク質及びＭＢＰタンパク質から得られるペプチドに共有結合するＩＡs分子を捕捉することができる。一旦ｓｃＴＣＲを単離すれば、ｓｃＴＣＲタンパク質突然変異物により、上述したように、ペプチド接触残基のさらなるキャラクタリゼーションを行うことができる。
実施例１４−バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリの生成
上記実施例１においては、ＤＮＡベクターｐＫＣ４６及びｐＫＣ５１を用いて、ＩＰＴＧ誘導後、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をバクテリオファージ表面上にディスプレイ（呈示）した。バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリの生成は一般的に知られており、これを用いれば、約５０ＫＤまでのポリペプチドやタンパク質をディスプレイすることができる（Smith,G.P.and Scott,J.K.in Methods in Enzymology（1993）217:228を主に参照）。
要約すれば、２x Luria Broth（ＬＢ）＋０．５％グルコース、及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを入れたフラスコに、大腸菌系統、即ち、プラスミドベクターｐＫＣ４６あるいはｐＫＣ５１を含むＸＬ１−Ｂ細胞を接種した。一晩成長させた後、遠心分離により細胞をペレット状にし、グルコース非含有２x ＬＢに再度懸濁させた。再び細胞を遠心分離し、２x ＬＢ中で２回洗浄した。２回目の洗浄の後、細胞をもう一度５０ｍｌの２x ＬＢに懸濁し、ここにＩＰＴＧを加えて最終濃度を１ｍＭとした。細胞を２時間、３７℃で成長させた後、ヘルパーバクテリオファージであるＶＣＳＭ１３を、細胞培養物５ｍｌ当たり１０ｐｆｕ加えた。１５分後、ＸＬ１−Ｂ細胞、及びヘルパーバクテリオファージの混合物を、テトラサイクリン、アンピシリン、及び１ｍＭのＩＰＴＧを含む加温した２x ＬＢ中に入れて５０倍に希釈した。１時間、３７℃で成長させた後、培養物にカナマイシンを加えてヘルパーバクテリオファージに感染した細胞を選択した。細胞培養物を一晩成長させ、その次の日に、２段階のＰＥＧ沈殿を行ってからバクテリオファージを精製した。大量の残留物をサンプルから除去するために、精製したバクテリオファージ調製物を、０．２ミクロンのフィルタにかけた。さらに、１００セントリコン・メンブレン（centricon membrane）（１００ｍｗカットオフ）を用いて１％ＦＢＳ／ＰＢＳ中でサンプルを洗浄し、残留ＰＥＧをバクテリオファージ調製物から除去した。バクテリオファージの力価は、プレート上で成長するコロニーをカウントして決定した。この力価の決定は、バクテリオファージを１０倍に連続希釈し、希釈したサンプルと感染力に優れたＸＬ１−Ｂ細胞とを混合し、アンピシリンを含む２x ＬＢ寒天上に該混合物を載せて行った。バクテリオファージの力価は、約１０¹⁰〜１０¹⁴ｃｆｕ／ｃｅｌｌの範囲内であった。
２回目のＰＥＧ沈殿後、バクテリオファージを、０．２ミクロンのフィルタにかけて不要な粒子及びバクテリアを取り除いくことで殺菌した。フィルタにかけた調製物は、その後、セントリコン１００（１００ｍｗカットオフ）フィルタを用いて厳密に洗浄し、バクテリオファージを濃縮し、バッファを１％ＦＢＳ／ＰＢＳに交換した。
実施例１５−バクテリオファージライブラリのキャラクタリゼーション
Ａ）ＥＬＩＳＡ検定
ＴＣＲ特異的ＥＬＩＳＡ検定を行って、バクテリオファージ表面にディスプレイされたＴＣＲ分子を分析した。要約すれば、９６穴プレートを、コーティングバッファ（ｐＨ９．０）中のneutrAvidin（Pierce）、２００ｎｇ／ｗｅｌｌ量によりコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、５％無脂肪乾燥ミルク（ＮＦＤＭ）により１時間ブロック後、抗−α，βＴＣＲ（Ｈ５７）ビオチンラベル（標識）抗体あるいは抗−Ｖ−β８．２（ＭＲ５−２）ビオチンラベル抗体を、２．５％ＮＦＤＭを含んだ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中に希釈した。そして、希釈した抗体をそれぞれウェルに加え、１時間、室温でインキュベートした。プレートを、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．５％）（ＴＢＳＴ）中で６回洗浄し、該プレートに結合していない抗体を除去した。
バクテリオファージ上で発現した融合タンパク質の検出は、抗体コーティングしたウェル中で、１時間、室温条件下でバクテリオファージ粒子をインキュベートすることによって行った。プレートをＴＢＳＴで６回洗浄した後、２．５％ＮＦＤＭ中に希釈した抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート（Pharmacia）を加えた。１時間インキュベートした後、プレートをＴＢＳＴで８回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに加え、１０分後、１Ｍ硫酸１００μｌを加えて反応を停止した。そして、プレートの４５０ｎｍでの吸光度を読み取った（図１７）。また、コントロールバクテリオファージ（ＣＡIII遺伝子III抗体ライブラリから調製）に対し、抗体Ｈ５７及び抗体ＭＲ５−２への非特異的結合試験を行った。さらなるコントロールとして、ｗ／ＢＳＡあるいは抗−Ｖ−β１７をコーティングしたウェルに対する非特異的結合検定も行った。
図１７及び１８に示すのは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の、非誘導状態（即ち抑制解除状態）及び誘導状態におけるＥＬＩＳＡ分析の結果である。図１７はｐＫＣ４６から生成したｓｃＴＣＲ融合タンパク質の分析結果、図１８はｐＫＣ５１から生成した融合タンパク質の分析結果を示す。各図において、黒塗りのバーは非誘導状態での培養物を示し、より明るい色のバーは誘導状態での培養物を示す。図１７及び１８から分かることは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質がバクテリオファージ・ライブラリで発現され、バクテリオファージの表面にディスプレイされたということである。４５０ｎｍでの吸光度を比較すると、誘導によりｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現しているバクテリオファージ調製物は、非誘導のバクテリオファージ調製物の約６０−２００倍大きかった（図１８）。ＥＬＩＳＡ検定によって検出されたレベルを比較すると、遺伝子VIIIｓｃＴＣＲ融合タンパク質をディスプレイするバクテリオファージは、遺伝子IIIｓｃＴＣＲ融合物をディスプレイするバクテリオファージの約２００−５００倍高かった（図１７）。この結果から、ＴＣＲ／遺伝子VIIIバクテリオファージは、多数のｓｃＴＣＲ融合タンパク質をバクテリオファージ表面に発現していると考えられる。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のバクテリオファージ・ディスプレイの多価性により、ＭＨＣ／ペプチド複合体を捕捉する機会が増大する。これは、多価であるため結合活性が強くなるからと理由づけられる。
Ｂ）バクテリオファージ・ライブラリにディスプレイされた融合タンパク質の活性
バクテリオファージ上の融合タンパク質が生物学的に活性であることを実証するために、ＤＯ１１．１０ ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合物をディスプレイするバクテリオファージに対し、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞上のＴＣＲと固定化ｓｃＩＡｄ／ＯＶＡ分子との特異的相互作用の阻害能の分析を行った。ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞系及び一本鎖ＭＨＣ分子を用いて上記のような相互作用を検出する模範的な検定については、上述した通りである。
ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞ハイブリドーマ及びＩＡｄ／ＯＶＡの系は、上記実施例８に示した方法にほぼ沿うように用い、バクテリオファージ上に発現したｓｃＴＣＲ（以下、ｓｃＴＣＲ／バクテリオファージ分子と呼ぶこともある）存在下でのＩＬ−２レベルの低下を測定した。実験の結果、バクテリオファージ上で発現したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、固定化ＩＡｄ／ＯＶＡと相互作用したことが分かった。これは、ＩＬ−２レベルが、ｓｃＴＣＲ／バクテリオファージ分子の入ったウェルにおいて低下したためである。これに対して、同じ力価のコントロールバクテリオファージ（ｓｃＴＣＲをディスプレイしない）を加えてインキュベートしたウェルにおいては、阻害作用の低下は見られなかった。従って、バクテリオファージ上で発現したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は生物学的に活性である。
阻害作用の細かな特異性を試験するために、ＤＯ１１．１０とｇＤ１２ Ｔハイブリドーマとの間で阻害レベルを比較する検定を行った。
実施例８にて述べたように、ｇＤ１２ Ｔ細胞ハイブリドーマは、ＩＡ^d制限（ＩＡ^drestricted）であるが、ＨＳＶ−１由来のペプチドを認識する。両細胞ともＩＡ^dにより制限されたペプチドを認識するという点を考慮すると、バクテリオファージ上で発現したＤＯ１１．１０由来のｓｃＴＣＲは、ＩＡ^d／ＨＳＶ−１分子と何らかの相互作用をする可能性があると考えられる。ただし、この相互作用はＩＡ^d／ＯＶＡ ＭＨＣ／ペプチド分子との相互作用に比べてかなり弱いものであると考えられる。図１９Ａに示すように、低レベルのＩＬ−２阻害がｇＤ１２ Ｔ細胞ハイブリドーマグループには見られるものの、ＤＯ１１．１０グループでのＩＬ−２阻害レベルは約８−１０倍高かった。図１９Ａにおいては、約８〜２５０×１０¹⁰個のファージを各実験で用いた。ＣＡIIIとは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をディスプレイしないコントロールファージを指す。図１９Ｂに示すのは、関連実験の結果であり、その実験では、ＩＬ−２の産生がＤＯ１１．１０ Ｔハイブリドーマ細胞から測定された。
Ｃ）融合タンパク質のバイオパニング（BioPanning）
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を呈示するバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリを用いて、公知の方法に従って特異的ＴＣＲ分子を捕捉する（例えば、McCafferty,J.et al.Nature（1990）348:352;Castagroli,L.et al.J.Mol.Biol.（1991）222:301;Lebeddee,S.L.et al.PNAS（USA）（1992）,89:3175;Smith,G.P.and Scott,J.K.supra;Blake,J.et al.J.Exp.Med.（1996）184:121参照）。従来の捕捉技術は一般に、標的抗原と抗体との相互作用の強さに依存している。その強さは、典型的には１０^-6〜１０^-8の範囲内にある。しかしながら、ほとんどのＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチド相互作用は、典型的には５×１０^-5Ｍの範囲であり、ＫＤ値とともに弱くなる。一般に、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質とＭＨＣ／ペプチド複合体との結合活性（avidity）及び結合価は、ファージ上に発現する融合タンパク質の数を増やすことによって増大させることができる。他に採用できる戦略としては、洗浄の厳密さを変える、抗原の量を増やす、温度を下げて解離速度を小さくする、インキュベーション時間を長くするなどが挙げられる。
ｉ）抗体捕捉
ＤＯ１１．１０ ｓｃＴＣＲ融合タンパク質特異的抗体を用いて、ｓｃＴＣＲ分子を捕捉した。要約すれば、複数のマイクロウェルに２００ｎｇのneutrAvidinをコーティングした後、Ｃ−βドメイン、Ｖ−β８．２ドメイン、あるいはＶ−β１７を認識する非特異的抗体に結合するビオチンラベル抗体を加えてインキュベートした。非特異的結合に関しては、ＢＳＡをコーティングしたウェルを用いた場合について調べた。実験は、２×１０⁶個のＴＣＲ／遺伝子VIIIバクテリオファージ粒子を、無関係の抗体バクテリオファージバンク由来の１×１０¹¹個の粒子に希釈して行った。即ち、最終的には１：５０，０００の希釈を行った。抗−ＴＣＲ抗体（Ｈ５７）あるいは抗−Ｖ−β８．２抗体（ＭＲ５−２）の両方に対する集積（enrichment）を１ラウンド行ったところ、５０００倍の集積が見られた。一方、ＢＳＡネガティブコントロールでは、集積が特異的であることを示唆するような陽性クローンは全く得られなかった。１ラウンドでの２０〜１００００倍の集積は、抗体抗原捕捉実験においてはまれではない。したがって、本実験で見られた集積は、報告されている集積実験の許容範囲内にあることが分かる。
ii）細胞捕捉（cell panning）
細胞捕捉は、細胞表面タンパク質に対する抗体の単離を行う方法として、従来より定番である。この方法は、実施例１８にて作成したバクテリオファージ・ライブラリの中から、求める融合タンパク質をスクリーニングする際に容易に適用できる。細胞捕捉に用いる細胞は、任意の適切な細胞源から得られる。例えば、ＭＨＣ／ペプチド分子を発現する細胞、あるいは審査中のＵＳ出願シリアル番号０８／５９６，３８７に記載のような、適当なペプチドが結合可能な空のＭＨＣ複合体を含む細胞である。さらに、一本鎖クラスＩＭＨＣ遺伝子、あるいは一本鎖クラスIIＭＨＣ遺伝子によりトランスフェクトされてなる細胞であり、該細胞中で適当なペプチドがＭＨＣ複合体に結合あるいは共有結合したものも利用できる。適切な一本鎖クラスＩＭＨＣ／ペプチド複合体、あるいは一本鎖クラスIIＭＨＣ／ペプチド複合体を有する細胞の例は、以下の出願に記載されている。即ち、公開ＰＣＴ国際出願番号published ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。
一般に、適切なＭＨＣ複合体を発現する細胞を用いて捕捉すると、いくつかの利点が得られる。即ち、そのような細胞の利用可能な供給量を増大できること、時間のかかるＭＨＣ／ペプチド複合体の精製を行わずに済むことなどである。
細胞捕捉の方法の一例としては、以下の方法が挙げられる。即ち、エッペンドルフチューブ（１．７ｍｌ）中で、約２×１０⁶個のＤＯ１１．１０バクテリオファージを含むトータル約１０¹¹個のバクテリオファージを体積０．２ｍｌの１０⁶個の細胞と混合し、４℃で２時間インキュベートする。その後、５０００×ｇ、１０分間、４℃で遠心分離して細胞をペレット状にし、氷冷したＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ（０．５％ｗ／ｖ）中で５回洗浄する。続いて、５０μｌ、ｐＨ５．０のクエン酸バッファを加えて、細胞からバクテリオファージを溶離する。集積されたバクテリオファージは、大腸菌に感染させて一晩培養することにより、その数を増大させることができる。その後、バクテリオファージを、例えば上記実施例１４にて述べたような標準の手順で精製する。５ラウンドの集積の後、コロニーの中からランダムにサンプリングしたものを取出し、その遺伝子配列を解析する。ＤＯ１１．１０ ＴＣＲ遺伝子の発見頻度により、さらなる集積が必要かどうかを決める。例えば、ＤＯ１１．１０ ＴＣＲ／バクテリオファージの開始時の希釈割合が１：５００００であれば、５ラウンドの集積後にその発見頻度が増大していることが予想される。このときの増大は、約１０００−２０００倍の範囲にあることが予想される。
iii）ｓｃＭＨＣ／ペプチド複合体を用いた捕捉
可溶性ｓｃＭＨＣ／ペプチド複合体の生成は、例えば、昆虫細胞において、上記の公開ＰＣＴ国際出願番号ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７に記載の方法に従って行う。
昆虫細胞中で生産された可溶性ｓｃＭＨＣ／ペプチド分子を用いて、可溶性融合タンパク質を発現するバクテリオファージを捕捉する。例えば、ある量のｓｃＩＡ^d／ＯＶＡ（例えば１−１０μｇ／ウェル）を用いて９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）をコーティングする。続いて、２×１０⁶個のＤＯ１１．１０バクテリオファージを、トータルで１０¹¹個のバクテリオファージに希釈し（１：５００００）、固定化ＩＡ^d／ＯＶＡ共存下でインキュベートした。２時間インキュベートした後、プレートをＴＢＳＴ中で５回洗浄する。結合したバクテリオファージは、１００μｌの０．１Ｍ塩酸／グリシンを加えて溶離する。結合したＤＯ１１．１０ ＴＣＲ／バクテリオファージの頻度決定は次のようにして行う。即ち、標準コロニーリフト（standard colony lifts）を行い、タンパク質標識に対する抗体（例えば、上述の抗−ＥＥ標識抗体）、あるいはＤＮＡ特異的プローブを用いて陽性なものをスクリーニングする。ＤＮＡ特異的プローブとしては、例えばラベルされた３００ｂｐ α鎖ＤＮＡプローブがあり、Amershamから得られる。タンパク質標識に対する抗体あるいはＤＮＡ特異的プローブはそれぞれ、ｓｃＴＣＲ遺伝子あるいはｓｃＴＣＲ遺伝子産生物を認識する。
実施例１６−融合タンパク質の蛍光利用細胞選別同定
蛍光利用細胞選別（Fluorescence Assisted Cell Sorting）（ＦＡＣＳ）は、細胞の検出及び選別に用いる定番の方法である（例えば、Davey,H.M.and Kell,D.B.in Microbiological Reviews（1996）60:641;and Darzynkiewca,Z.et al.（1994）in Flow Cytometry 2nd Ed.,Vols.41 and 42 Academic Press,New York参照）。ＦＡＣＳにより、細胞とｓｃＴＣＲ融合タンパク質をディスプレイするバクテリオファージとの相互作用を検出する。ＦＡＣＳ実験を行うために、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ複合体を発現する細胞を上述のようにして生成した。ＩＡ^d特異的抗体ＡＳＭII−ＦＩＴＣ（Pharmingen）による染色を行い、細胞がＩＡ^dを発現したことを確認した。ＯＶＡペプチドがＩＡ^dグルーブに存在することを確かめるために、以下の出願に記載のように、Ｔ細胞活性検定を行う。即ち、上述の公開ＰＣＴ国際出願番号published ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。
様々な色素原を用いてＦＡＣＳ解析用のバクテリオファージをラベルできる。１つのアプローチとしては、バクテリオファージにフィコエリトリン（phycoerythrin）などの適切な色素原を結合させる。別のアプローチとしては、Flurotag FITC複合キット（Sigma,St.Louis,MO）に示されているような公知の方法に従って、バクテリオファージにＦＩＴＣを結合させる。また別のアプローチとしては、フィコエリトリンとバクテリオファージとを間接的に結合させる。即ち、まずバクテリオファージをビオチニル化（biotinylating）し、それにstrepavidn−フィコエリトリンを結合させる。さらに別のアプローチとしては、異なるフルオレセイン標識を有するような２つの抗体アプローチを用いる。具体的には、一方の抗−バクテリオファージ抗体をＦＩＴＣでラベルし、ｓｃＴＣＲに対する２つめの抗体（例えばＨ５７）をフィコエリトリンでラベルする。
バクテリオファージ結合方法としては、例えば次のようなものがある。即ち、１０¹²ｃｆｕのｐＫＣ５１ファージをバッファ交換して０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファ（０．２ｍｌ、ｐＨ９．０から９．５）に入れる。Flurotag FITC複合キットを用いて、ＦＩＴＣの入ったバイアルに０．１Ｍ炭酸−重炭酸溶液１ｍｌを混合し、すべてのＦＩＴＣが溶解するまで攪拌する。ＦＩＴＣラベル約５０μｌをバクテリオファージ調製物に加え、ＦＩＴＣのファージに対する最終比率を４０対１とし、フルオレセイン／タンパク質（Ｆ／Ｐ）モル比を適切なものにする。そして、サンプルをチューブに入れ、アルミホイルで覆って２時間インキュベートする。ラベルされたバクテリオファージは、サンプルをG-25 Sephandexカラムにかけることによって単離する。典型的には、ラベルされたバクテリオファージは主画分（例えば画分６〜８）に含まれる。Ｆ／Ｐモル比は、その後、分光光度計を用いて２８０ｎｍ及び４９５ｎｍでの吸光度を読み取って決定する。Ｆ／Ｐモル比を決定するのに用いる式は次のようなものである。
Molar F/P=2.77×A₄₉₅/A₂₈₀（0.35×Ａ₄₉₅）
複合サンプルの吸光度の読み取り値は、０．３から１．０の間に適切におさまるべきである。
ＦＩＴＣラベルされたファージは、従来のＦＡＣＳ方法に従って、ｓｃ−ＩＡ^d／ＯＶＡ複合体を発現する細胞を添加してインキュベートする。これにより、細胞に結合するバクテリオファージを検出する。結合したバクテリオファージを細胞から溶離し、標準的方法に従って増殖させる。
実施例１７−バクテリオファージｆ８８におけるｓｃＴＣＲ融合タンパク質のクローニング及び発現
上述の捕捉方法で用いているのは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をディスプレイさせるために、野生型繊維状（filamentous）バクテリオファージ（即ち、ＶＣＭＳ１３）をさらにに感染させた、ファージミド形質転換細胞（phagemid-transformed cell）を用いるものである。この方法は、次のようにすれば改善できる。即ち、組換えｓｃＴＣＲ構築物をより効率よく包含（パッケージング）可能なバクテリオファージベクターを用いればよい（これにより、ビリオン全体数当たりの組換え分子の収率が上がる）。例えば、バクテリオファージｆ８８−４は、８８型ベクター（９２７３塩基対）で、遺伝子VIII遺伝子を２つ含む。そのうち一方は野生型で、他方は組換え遺伝子をディスプレイする（即ち、遺伝子VIII遺伝子融合体）。バクテリオファージｆ８８−４は、ワシントン大学のG.Smith博士から得られる。バクテリオファージｆ８８−４は、遺伝子VIII構築物のパッケージングを効率よく行うので、収率が最大１０％向上する。この収率の向上は、組換えビリオンの多重度（即ち、ビリオン全体数当たりの組換え分子の数）が増加するためであると考えられている。この収率の向上により、１個のビリオン当たり約３００個のｓｃＴＣＲ融合タンパク質が構築されると考えられる。従って、ｆ８８−４バクテリオファージは、収率と多重度を増加させ、標的への結合活性を向上させ、その結果、特異的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質の単離率を増大させる。
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を含む組換えバクテリオファージの構築は、ｆ８８−４バクテリオファージのＰｓｔＩ部位及びＨｉｎｄIII部位にｓｃＴＣＲ遺伝子をクローニングすることによって行った。導入されたｓｃＴＣＲ遺伝子の発現は、従って、ｔａｃプロモーターの制御下で行われ、その誘導は１ｍＭのＩＰＴＧ添加後に起こる。
図２０に概略的に示すのは、いくつかの組換えバクテリオファージベクターであって、ｆ８８−４バクテリオファージ（ｐＫＣ７０、ｐＫＣ７１、及びｐＫＣ７２）を用いて生成したものである。
実施例１８−ＨＩＶ感染細胞からのｓｃＴＣＲバクテリオファージ・ライブラリの構築
ＨＩＶ感染患者のＣＴＬ由来の、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をディスプレイするバクテリオファージ・ライブラリを、ここで述べる方法により作成する。ＨＩＶ感染患者としては、長期非進行であると診断あるいは類別されている患者（即ち、ＬＴＮＰ）を対象とする。こういったＨＩＶ感染患者は、ｇａｇやｐｏｌ等の様々なＨＩＶウイルス抗原に対するＣＴＬ応答の、研究対象とされてきた。このような患者からのＣＴＬプロファイルは、典型的には、ＡＩＤＳになりやすい患者に比べて、ＨＩＶ抗原に対して強い免疫活性を示す（Miedema,F.and Klein,M.R.Science（1996）272,505を主に参照）。
ＣＴＬ応答に関わるＴＣＲを同定し、対応する融合タンパク質を構築するために、クラスＩ ＨＬＡ−Ａ２制限ヒトＴＣＲライブラリをＴ細胞から作成する。このＴ細胞は、上述の実施例で述べた方法によりＬＴＮＰ患者から単離する。
いくつかの方法によりクラスＩ ＨＬＡ−Ａ２制限バクテリオファージ・ライブラリを調製できる。例えば、１０⁷個のＴ細胞を、３人のＨＬＡ−Ａ２ ＬＴＮＰ患者から、上記のようにして単離し、プールする（Altman,J.D.et al.Science（1996）274:94参照）。メッセンジャーＲＮＡを、これらの細胞、及び標準的手順で得たｃＤＮＡから精製する。標準的手順とは、ヒトのＣ−αＴＣＲ及びＣ−βＴＣＲに対応のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるなどの方法である。模範的なプライマーを図２２（SEQ ID NOs.:116-128）及び図２３（SEQ ID NOs.:101-115）に示す。具体的には、Ｖ−α遺伝子は、１２個のフォワードプライマー（図２２ SEQ ID NO.116-127）、及びＣ−α遺伝子配列の５’末端にハイブリダイズする１つのバックプライマー（SEQ ID NO.:128）を用いてＰＣＲ法により増幅される。β鎖は、Ｖ−β鎖の５’末端にハイブリダイズする１３個のフォワードプライマー（図２３，SEQ ID NOs:101-113）、及びβ不変領域中３７８塩基に置かれた２つのバックプライマー（図２３ SEQ ID NOs:114,115）を用いてＰＣＲ法により増幅される。ＰＣＲ法による増幅は標準の方法に従って行う。
ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡは、例えば、実施例１４に記載のＤＮＡベクターのような、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントを発現する適切なＤＮＡベクターに導入される。詳しくは、実施例２で述べたｐＫＣ４５ ＤＮＡベクターを用いて、Ｖ−α鎖をベクターのＳｆｉＩ部位及びＳｐｅＩ部位にサブクローニングし、Ｖ−β／Ｃ−β鎖をベクターのＸｍａＩ部位にクローニングする。そして、ｓｃＴＣＲバクテリオファージ融合タンパク質をエンコードする適切なベクターを上述の実施例に従って生成する。あるいは、Ｖ−α鎖及びＶ−β／Ｃ−β鎖を、例えば挿入可能なＨｉｎｄIII−ＰＳＴＩフラグメントとして、ｆ−８８バクテリオファージベクターに（実施例１７参照）サブクローニングする。このようにして生産された組換えバクテリオファージを適切な宿主細胞に感染させ、上述の実施例に従って該組換えバクテリオファージを増殖させスクリーニングする。
場合によっては、標準的な組換え技術に従ってｆ８８バクテリオファージのクローニング部位を修飾し、例えば適切なリンカー配列を組み込むことによって、特定のフラグメント（例えばＳｆｉＩ−ＸｍａＩフラグメント）のクローニングを可能にすることも望ましい。このような修飾を実現するには、例えば、適切な制限部位プライマーをバクテリオファージのＨｉｎｄIII部位及びＰｓｔＩ部位にアニーリングする。このようにして生産したバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリを、標準の手順に従って増殖させ、保管する。
実施例１９−ＨＩＶ感染細胞由来のバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリのスクリーニング
実施例１８にて生産した組換えバクテリオファージ・ライブラリは、選択可能ないくつかのアプローチによってスクリーニングできる。例えば、ライブラリは、検出可能にラベルした様々なプローブを用いてスクリーニングできる。プローブの例としては、完全（非活性化された）ＨＩＶウィルス、ＨＩＶタンパク質、中でもＨＩＶ外殻タンパク質、及びＭＨＣ／ＨＬＡ複合体としてＨＩＶペプチドを発現しているＡＰＣが挙げられる。また、スクリーニングは、イン・ビボにおいてＨＩＶウイルスに対する免疫応答を刺激することが知られているＨＩＶ外殻タンパク質のペプチドエピトープを用いて行うことができる。そのようなペプチドエピトープに関しては、いくつかの例が知られており、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１６０、ｇａｇ及びｐｏｌ外殻タンパク質から単離されたペプチドがこれに含まれる。
ａ）ＨＩＶ ｇｐ１２０外殻タンパク質を用いたスクリーニング
ｇｐ１２０タンパク質のＶ３ループ由来のペプチドエピトープを用いて、バクテリオファージ・ライブラリをスクリーニングする。典型的なペプチドとしては、ＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質のＴ１（アミノ酸４２８−４４３）ペプチド及びＴ２（アミノ酸１１２−１２４）ペプチドが挙げられる。ｇｐ１２０Ｖ３ループ由来のペプチドエピトープは、ＨＩＶ中和抗体を誘導可能なものの一種である（Berzofsky,J.A.et al.（1991）FASEB J.5:2412;Ahlers,J.D.et al,（1993）J.Immunology 150:5647参照）。バクテリオファージ・ライブラリからのｓｃＴＣＲ融合タンパク質のスクリーニングに利用できるペプチドエピトープの他の例としては、Karzon,D.T.et al.and Hart,J.K.et al.も参照のこと（Karzon,D.T.et al.（1992）Vaccine 14:1039;Hart,J.K et al.PNAS（USA）（1991）88:9448）。
Ｂ．ＨＩＶ外殻タンパク質を発現するＡＰＣを用いたバイオパニング
上記実施例１８にて構築したｓｃＴＣＲライブラリから、例えば、ＨＩＶ ｇａｇあるいはｐｏｌタンパク質から得られる、免疫原性ＨＩＶペプチドに結合するｓｃＴＣＲ融合タンパク質を捕捉することができる。このＨＩＶ外殻タンパク質は、一本鎖ＨＬＡ−Ａ２分子を発現する細胞と関連して存在している。一本鎖ＨＬＡ−Ａ２分子は、Garboczi,D.N.et al.PNAS（USA）（1992）89:3429の記載にしたがって生成する。一本鎖ＨＬＡ−Ａ２分子を発現する細胞は、公知の方法（Altman,J.D.et al.,supra）に従って生成する。
バイオパニングは、いくつかの方法により実現できる。例えば、一つの方法として、ＭＨＣ／ペプチド標的を２つの異なる様式で提示する。すなわち、捕捉の第一段階では、ＨＬＡ−Ａ２を発現するトランスフェクション細胞を用いると共に、ｇａｇあるいはｐｏｌペプチドを標的抗原として用いる。捕捉は、実施例１８にて述べたバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリ由来の約１０¹¹個のバクテリオファージを用いて行う。そして、バクテリオファージ・ライブラリに、ＨＬＡ−Ａ２を提示する細胞、及びｇａｇあるいはｐｏｌペプチドを接触させる。バクテリオファージを、トランスフェクション体約１０⁶個の共存下で２時間、４℃でインキュベートし、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で２回洗浄し、０．１Ｍクエン酸バッファ（ｐＨ５．０）１００μｌ中に溶離させた後、０．１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）１０μｌで中和する。溶離されたバクテリオファージは、大腸菌系統Ｋ９１ｋａｎなどの適切な宿主に感染させて増殖させ、バクテリオファージを一晩成長させる。バクテリオファージ粒子は標準的方法により精製する。
細胞、または、適切なＭＨＣ／抗原を保持する固形支持体に対する捕捉作業を繰り返し行うことにより、細胞捕捉実験で同定されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質を有するバクテリオファージの純度を向上することができる。例えば、細胞捕捉法により単離されたバクテリオファージを、一本鎖ＨＬＡ−Ａ２及びペプチドをコーティングした固形支持体（例えば、マイクロディッシュ）に対する捕捉作業に供して精製する。２時間インキュベートした後、ウェルを、０．３ｍｌのＰＢＳ／０．２％Ｔｗｅｅｎで約８回洗浄して、非特異的なバクテリオファージを除去する。結合したバクテリオファージは、０．１ｍｌの０．１Ｍ塩酸（グリシン中、ｐＨ３．０）に溶離され、１０μｌの２ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）で中和される。さらなる捕捉は、細胞及び固定化ＭＨＣ／ＨＬＡペプチド分子のうち、使用するものを一方から他方に変更して行う。捕捉を約５、６回行うことにより、ｓｃＴＣＲをディスプレイするバクテリオファージ調製物が、十分に高い純度で得られる。続いて、ＤＮＡをバクテリオファージから単離し、バクテリオファージ内にエンコードされたｓｃＴＣＲのα可変領域及びβ可変領域のＤＮＡ配列を決定する。予想されることは、αあるいはβ可変領域の使用頻度に偏りあるいは集積（bias or enrichment）が見られれば、バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリ中のｓｃＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド抗原との間で生産的相互作用が行われたことを示すということである。
検出可能にラベルされたプローブを用いると、バクテリオファージ・ライブラリから所望の組替えバクテリオファージを集積することができる。例えば、プローブがｇｐ１２０Ｖ３ループ由来のペプチドエピトープである場合、そのペプチドに特異的に結合する組換えバクテリオファージを単離できる。典型的には、いくつかの集積過程を経るが、この集積過程のステップ数を左右する因子はいくつかある。例えば、ライブラリ中での、求める組換えバクテリオファージの呈示状態や、検出可能にラベルされたプローブの結合活性がその因子である。組換えバクテリオファージ由来のＤＮＡは、標準的手段により単離する。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡは、標準的方法に従ってその配列が解析される。いくつかの単離された組換えバクテリオファージのＤＮＡ配列を解析すると、検出可能にラベルされたプローブと組換えバクテリオファージによりエンコードされたｓｃＴＣＲ融合タンパク質との特異的結合が示される。
高頻度クローンは、上述のｐＫＣ６０及びｐＫＣ６２ベクターといった適切なベクターにおいて、可溶性で十分に機能的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質として発現される。そして、発現された融合タンパク質は、標準的方法に従って、上記のＨ５７モノクローナル抗体を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーにより必要に応じて個々に精製される。
実施例２０−抗−ＨＩＶ捕捉により検出されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質のキャラクタリゼーション
いくつかの選択可能な方法により、上記のように検出された組換えバクテリオファージとＨＩＶ抗原との特異的結合を評価する。
Ａ）バイオコア分析（Biocore Analysis）
ＨＩＶペプチドを用いて、実施例１８にて述べたバクテリオファージ・ライブラリに対するスクリーニングを行う場合、該ペプチドを用いて以下の出願に記載の方法に従ってｓｃＭＨＣクラスＩ分子を生成する。以下の出願とは即ち、公開ＰＣＴ国際出願番号published ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。好ましくは、該ペプチドをｓｃＭＨＣクラスＩ分子に共有結合させる。そして、ここで得たｓｃＭＨＣクラスＩペプチド複合体を用いて、実施例７及び以下の実施例２０に記載のように、バイオコア分析のチップをコーティングする。より具体的には、ｇａｇあるいはｐｏｌ抗原（Altman,J.D.et al.supra参照）と結合した一本鎖ＨＬＡ−Ａ２分子を、アミン反応性部位を介してバイオセンサチップに共有結合させる。そして、該チップにｓｃＴＣＲ融合タンパク質を含むサンプルを接触させる。すると、上記のように、特異的結合がチップ上で検出される（Seth,A.et al.Nature（1994）369:324;Matsui,K.et al.PNAS（USA）（1994）91:12862も参照のこと）。ほとんどのｓｃＴＣＲ融合タンパク質の相互作用が１０^-5〜１０^-7Ｍの範囲内にあることが予想される。
ｓｃＭＨＣクラスＩペプチド複合体とｓｃＴＣＲ融合タンパク質との特異的結合が検出された場合は、特異的なｓｃＴＣＲ−ペプチド結合複合体が存在することを示している。
単離された各ｓｃＴＣＲ融合タンパク質について結合係数を決定することにより、細胞に結合して細胞死を引き起こすレセプターの有効度を容易に予測することができる。
Ｂ）ｓｃＴＣＲ融合タンパク質４量体への結合
ｓｃＴＣＲ融合タンパク質とＨＩＶペプチドとの特異的結合の検出は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質４量体との結合検定を上記の実施例（実施例９参照）に従って行うことによっても可能である。４量体のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、融合物をエンコードするＤＮＡを、Ｂｉｒ Ａ−依存ビオチニル化部位（Bir A-dependent biotinylation site）を有する適切なＤＮＡベクターに挿入することによっても生成できる（Schatz,P.J.Biotechnology（1993）11:1138参照）。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質に対し、アビジン−フィコエリトリンを標準の方法に従って加えることで修飾を施し、４量体のｓｃＴＣＲ融合タンパク質を生成することもできる。ＨＩＶペプチドをディスプレイするべくトランスフェクションされた細胞は、上記の方法、及び以下の出願に記載の方法に従って調製する。即ち、公開ＰＣＴ国際出願番号published ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。トランスフェクションされた細胞を用いれば、ライブラリに対するスクリーニングを行うことができる。また、トランスフェクションされた細胞に対して、ラベルされたｓｃＴＣＲ融合タンパク質４量体を用いて染色し（stain）、細胞への特異的結合の検出を行うこともできる。ＦＡＣＳ分析で検出されるより強力な結合は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質とＭＨＣクラスＩペプチド複合体との特異的相互作用の指標となる。
上記実施例１９において単離したｓｃＴＣＲ融合タンパク質に対し、結合アフィニティー及び活性の試験を行って、該ｓｃＴＣＲ融合タンパク質がＭＨＣ／ペプチド複合体に特異的に結合するか否かを決定する。この適切な検定は、上記の実施例において述べたようなものである。
Ｃ．ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳを行うことにより、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と上記実施例１６にて述べた標的細胞との相互作用を検出することができる。例えば、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を標準の方法に従ってビオチニル化し、続いて、strepavidin−フィコエリトリンと結合させることでラベルしたｓｃＴＣＲ４量体を形成する。ＦＡＣＳにより、ｓｃＴＣＲとＡ２０細胞や腫瘍細胞系などの適当な標的細胞との相互作用を定量的に測定する。あるいは、実施例１６のｓｃＴＣＲ融合タンパク質を、適切な固形支持体（例えばラテックスビーズ）に結合させ、ｓｃＴＣＲを複数ディスプレイさせることも可能である。これに関連の方法を用いて、４量体のクラスＩＭＨＣ／ペプチド分子が生産されている（例えば、Altman,J.D.et al.supra参照）。
Ｄ．ｇＤ１２Ｔハイブリドーマ細胞におけるＩｌ−発現
ｇＤ１２Ｔハイブリドーマ細胞の活性は、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／５９６，３８７に記載のように、ＩＬ−２活性を測定することで容易に検定することができる。この検定により、実施例１６において生産されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質の機能を検定することができる。例えば、ｇＤ１２Ｔハイブリドーマ細胞に対し、上述の方法に従って実施例で産生したｓｃＴＣＲ分子をエンコードするＤＮＡのトランスフェクションを行う。ＦＡＣＳ染色は、実施例１６にて述べたように行い、細胞表面におけるｓｃＴＣＲレセプターの発現を検出する。レセプター陽性クローンは、以下の出願に記載済のＩＬ−２活性検定に用いる。以下の出願とは即ち、公開されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。ｓｃＴＣＲレセプターが活性である場合（即ち、ｓｃＴＣＲレセプターがＭＨＣ／ペプチド標的に特異的に結合する場合）、ｇＤ１２細胞からのＩｌ−２産生は、容易に検出及び測定できる。
実施例２１−クラスII制限ＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する自己免疫タンパク質融合物の単離
本実施例の方法により、自己免疫タンパク質及びペプチドに特異的に結合するｓｃＴＣＲ融合タンパク質を単離することができる。例えば、Ｔ細胞を、ＤＲ−２＋の個体で、かつ、多発性硬化症であると診断された個体から、従来の方法に従って単離することができる。該Ｔ細胞からＴＣＲ ＤＮＡを得る。そして、得られたＴＣＲ ＤＮＡを用いて、上記実施例にて述べた方法に従いｓｃＴＣＲ融合タンパク質を構築する。バクテリオファージ・ディスプレイライブラリを、上記の実施例１４〜１５に従って、作成し、試験をおこなう。
バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリは、多発性硬化症のＤＲ−２＋患者数人から１０⁷個のＴ細胞を単離することによって作成する。Ｔ細胞ｍＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡを上記実施例１に述べたように生成する。ＴＣＲのＶ−α及びＶ−β／Ｃ−β鎖のＰＣＲ法による増幅を、実施例１と同じプライマーを用いて行う。Ｖ−α及びＶ−β／Ｃ−β鎖は、適切なバクテリオファージ・ディスプレイ・ベクターのクローニング部位にクローニングする。適切なバクテリオファージ・ディスプレイ・ベクターのクローニング部位とは、例えば、実施例１７にて述べたｆ８８−４バクテリオファージ・ベクターＤＮＡの、ＳｆｉＩ−ＳｐｅＩ部位、及びＸｈｏＩ−ＸｍａＩ部位である。ライブラリは、特異的抗原標的を捕捉する標準的方法に従って、増殖させ、保管する。
一本鎖ＤＲ−２分子を、上述及び以下の出願に記載の方法に概ね従って作成する。以下の出願とは即ち、公開ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７、Rhode,P.et al.J.of Mol.Immunology,（1996）32,555である。具体的には、ＨＬＡ−ＤＲ２分子を、ＨＬＡ−ＤＲ２分子を提示するＥＢＶ形質転換リンパ球芽細胞から精製する。簡潔に説明すれば、ＨＬＡ−ＤＲ２分子を、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むバッファに細胞を溶解させ、標準の免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。そして、細胞ライゼートを抗体−セファロースカラムにかける。ＤＲ２を結合させ、これを０．０５％ Ｎ−ドデシルＢ−Ｄ−マルトシド界面活性剤（N-dodecyl-B-D-maltoside detergent）を含むリン酸バッファ（ｐＨ１１．３）中で溶離させる。得られた画分を直ちに１Ｍ酢酸により中和し、これをＤＥＡＥイオン交換カラムを通すことにより、ＤＲ２プールを０．５ＭのＮａＣｌを含むリン酸（ｐＨ８．０）中に収集する。タンパク質の画分に対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動、及び銀染色により、純度の検定を行う。
バクテリオファージ・ライブラリは、いくつかの方法によりスクリーニングできるが、特に、一本鎖ＤＲ−２分子をコーティングした固形支持体を用いて、上記の方法に従って捕捉を行う方法が好適である。捕捉の方法としては、昆虫細胞などの宿主において一本鎖ＤＲ−２分子を生成し、その一本鎖ＤＲ−２分子をマイクロプレート壁などの固形支持体に固定化する。
さらに、バクテリオファージ・ライブラリを、ＤＲ−２分子によりトランスフェクションさせた細胞を用いて精製する（DeKruif,J.et al.PNAS（USA）（1995）92,3938参照）。ＤＲ−２タンパク質と特異的な結合をなすｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現するバクテリオファージ粒子の集積を、上記の実施例に述べた方法により行う。
発明の詳細な説明の項においてなした具体的な実施態様、または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：ウェイダンズ ジョン エー
カード キンバーリン エフ
ウォン ヒン シー
（ｉｉ）発明の名称：バクテリオファージ外殻タンパク質および一本鎖Ｔ細胞レセプターを含んでなる融合タンパク質
（ｉｉｉ）配列の数：１３０
（ｉｖ）住所
（Ａ）名宛人：ダイク、ブロンスタイン、ロバーツ、クッシュマン エル エル ピー
（Ｂ）通り：１３０ ウォーター ストリート
（Ｃ）市：ボストン
（Ｄ）州：マサチューセッツ
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：０２１０９
（ｖ）コンピュータ読み取り方式
（Ａ）媒体のタイプ：ティスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ コンパチブル
（Ｃ）作動システム：ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：ファストＳＥＱ バージョン１．５
（ｖｉ）元の出願データ
（Ａ）出願番号：０８／８１３，７８１
（Ｂ）出願日：１９９７年３月７日
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）先行出願データ
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（ｖｉｉｉ）代理人情報
（Ａ）氏名：ピーター エフ コーレス
（Ｂ）登録番号：３３，８６０
（Ｃ）参照／ドケット番号：４６７４５−ＰＣＴ
（ｉｘ）通信情報
（Ａ）電話番号：６１７ ５２３ ３４００
（Ｂ）ファックス番号：６１７ ５２３ ６４４０
（Ｃ）テレックス：
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２８塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
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（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
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（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：７２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
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（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
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（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５７塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：４９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５６塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３４塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２１塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２２塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６５塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：８塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６３塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０アミノ酸
（Ｂ）種類：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ペプチド
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：Ｎ−末端
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：３０塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ
（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｖ）フラグメントの型：
（ｖｉ）起源：
（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
（Ｂ）種類：核酸
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（ｘｉ）配列の詳細：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７：

（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８：についての情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
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（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２９塩基対
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（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０：についての情報
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（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０：についての情報
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（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２：についての情報
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1. Field of Invention
The present invention relates to a fusion protein comprising a bacteriophage coat protein and a single chain T cell receptor, and methods for producing and using the fusion protein. This fusion protein is useful in a variety of applications, such as the generation of bacteriophage display libraries used for screening binding molecules in vitro.
2. Background of the Invention
The T cell response (response) is regulated by an antigen that binds to the T cell receptor (TCR). One type of TCR is a cell membrane-bound heterodimer that consists of α and β chains and is formed similarly to immunoglobulin variable (V) and constant (C) regions. The α chain of the TCR contains V-α and C-α chains that are covalently bonded, and the β chain contains a V-β chain that is covalently bonded to the C-β chain. The V-α and V-β chains are associated with the major histocompatibility complex (MHC) (in the case of humans, the HLA complex), a pocket (couch) or cleft (cleaved) capable of binding a superantigen or antigen. Groove). For general information, see Fundamental Immunology 3rd Ed., W. Paul Ed. Rsen Press LTD. New York (1993).
The TCR is considered to play an important role in the development and function of the immune system. For example, TCR has already been reported to mediate cellular attack, promote B cell proliferation, and cause the onset and exacerbation of various diseases such as cancer, allergies, viral infections, and autoimmune diseases. Thus, there has long been a great deal of interest in developing TCR acquisition methods for research and medical settings.
In general, it was not easy to isolate large amounts of TCR. For example, most TCR preparation methods make use of expression in E. coli, but in E. coli, inclusion bodies are frequently formed as examples of irregularly folded insoluble TCR molecules. Thus, in the above method, the TCR is not available until after the cumbersome steps of solubilization and refolding of the protein, and the above step significantly reduces the TCR production rate, and the TCR stability and Adversely affects functionality.
As another method for obtaining the TCR, an attempt to construct a TCR having higher solubility has been made exclusively. For example, TCR is fused with various polypeptide sequences such as immunoglobulin constant region, phosphatidylinositol linkage sequences, CD3 chain and the like. In many cases, the goal is to express TCR on the cell surface, leaving more protein in a folded state. Thereafter, the TCR fusion protein is separated from the cell surface to obtain the TCR. However, in the above method, the amount of soluble and functional TCR produced is very small. For example, Gregoire, C., et al. (1991) PNAS, 88, 8077; Matsui, K., et al. (1991) Science 254, 1788 (1991); Engel, I., et al. (1992) Science. 256, 1318; Lin, AY et al., (1990) Science 249,677.
Other attempts have been to generate single chain T cell receptors (ie scTCRs) with fused V-α and V-β chains.

Please refer to.
However, many of the scTCR isolation methods have been reported to produce an irregularly folded insoluble molecule. For example, PCT application WO 96/18105 discloses a method for expressing scTCR in E. coli, but the disclosed method requires a refolding step or solubilization step for a troublesome protein to obtain scTCR. The production rate of scTCR is usually low. See Ward, ES et al., Supra, and Schlueter, CJ, supra.
Several methods have been developed to increase the purity of scTCR. In the method, the scTCR fusion protein is expressed on the cell surface or in the bacterial protoplast space. For example, the scTCR fusion protein is generated by fusing scTCR with a C-β chain and an intracellular signal region (see WO96 / 18105). However, the generated scTCR fusion protein must be removed from the cell surface, and is often irregularly folded, resulting in a decrease in the production rate. Other methods of generating scTCR fusion proteins focus on fusing maltose binding proteins and expressing them in protoplasmic space (see WO96 / 13593). However, usually a cumbersome step of refolding the protein is required to obtain large amounts of scTCR fusion protein.
In vitro and in vivo studies of molecular interactions involving the immune system have long been of great interest. One method for studying the interaction has been to provide molecules involved in the immune system in a simple form. For example, bacteriophage libraries have been used for the purpose of presenting antibodies and epitopes (antigenic determinants) for screening binding molecules in vitro. See Smith, GP and Scott, JK Methods in Enzym. 217, 228 (1993); Winter, G. et al. Ann. Rev. Immunol. 12, 433 (1994) and the like.
Therefore, a method for producing a large amount of a soluble scTCR fusion protein having sufficient functionality is desired without performing the removal step and the step of refolding the protein. Furthermore, the scTCR fusion protein is preferably provided in a form that allows in vitro screening of the binding molecule.
Disclosure of the invention
The present invention relates to scTCR fusion proteins comprising scTCR molecules covalently linked (ie, fused) to bacteriophage coat proteins (eg, gene III protein or gene VIII protein). The bacteriophage coat protein enhances the solubility of the scTCR fusion protein more than expected, thus significantly improving the production rate and functionality of the scTCR fusion protein. This scTCR fusion protein is sufficiently soluble and functional and is isolated in large quantities without the complicated steps of solubilization, removal, or refolding. The solubility and functionality of the scTCR fusion protein optimizes the vector sequences (ribosome binding sequence, leader (inducer) sequence, and promoter sequence) that affect the slow host (host) cell induction conditions and the expression of the fusion protein. It will be further improved. The scTCR fusion protein can be provided in various forms, for example, a bacteriophage display library used to screen for binding molecules that specifically bind to the scTCR fusion protein.
The fusion proteins of the present invention (hereinafter sometimes referred to as scTCR fusion proteins or soluble fusion proteins) have more solubility than expected. In other words, it has been discovered that fusing scTCR with bacteriophage coat protein produces a soluble fusion protein without the cumbersome steps of solubilization, removal, or refolding of the protein. Since very few inclusion bodies are formed in the expressed cells, the production rate of the soluble scTCR fusion protein is dramatically improved. In addition, scTCR fusion proteins have more functionality than expected. That is, the scTCR fusion protein specifically binds to a binding molecule (antigen) or other ligand (ligand) in the presence of the fused bacteriophage coat protein.
The scTCR fusion protein of the present invention comprises a bacteriophage coat protein or fragment thereof fused to a V-β chain covalently linked to a V-α chain via a flexible peptide linker sequence. Become.
In general, bacteriophage coat protein means bacteriophage gene III protein or gene VIII protein. In the present invention, the bacteriophage coat protein comprises a full-length coat protein or a suitable fragment thereof (see below). The bacteriophage coat protein or a suitable fragment thereof includes an scTCR within the bacteriophage and presents the scTCR as a fusion protein component that forms the bacteriophage coat. Specific bacteriophage coat protein fragments and bacteriophage inclusion methods are described in detail below.
Moreover, the scTCR fusion protein of the present invention usually has one or more (usually one or two) fusion protein labels, and is used when purifying the scTCR fusion protein from cell components coexisting with the scTCR fusion protein. . Alternatively, the protein label can also be used to introduce specific degradation sites (sites) into the soluble fusion protein and to degrade (separate) the scTCR molecule from the fusion protein. Thus, using the scTCR fusion protein of the present invention, it is possible to obtain scTCR molecules that are sufficiently soluble and functional without the fusion protein.
A number of important benefits are derived from the scTCR fusion proteins of the present invention. For example, in the past, obtaining a scTCR fusion required a long preparation process, and when producing in large quantities, it often required solubilization and refolding of the protein. On the other hand, since the scTCR fusion protein of the present invention can be easily isolated and purified without performing the above steps, the solubility, production rate, stability and functionality of the fusion protein are sufficiently improved. What is important here is that the use of the fusion protein makes it possible to more easily analyze the interaction between the antigen-presenting cell (APC) and the superantigen and the scTCR. In addition, as described in detail below, a wide variety of fusion proteins can be provided for interaction with superantigens and APCs.
The fusion protein of the present invention comprises a scTCR that is sufficiently soluble and functional. Thus, the fusion protein can be used in combination with various expression systems that can be used to test the interaction between the fusion protein and the desired ligand.
This scTCR fusion protein is useful in a variety of applications. For example, a DNA fragment (fragment) encoding the scTCR fusion protein of the present invention can be used to generate a bacteriophage display library. In contrast to libraries that express scTCR fragments, the bacteriophage library expresses scTCR with the full length as a fusion protein. Thus, the use of this bacteriophage library facilitates analysis of scTCRs, particularly scTCR antigen binding pockets. Therefore, this bacteriophage library is useful in screening using various binding molecules such as antigens, antibodies, small molecules, superantigens, MHC / HLA peptide complexes and the like. Importantly, the bacteriophage display library expresses fusion proteins with V-α and V-β chains, so that similar fusion proteins are generated by TCRs found in vivo. It is.
In addition, the bacteriophage library forms the largest amount of specific binding complex between the scTCR fusion protein and the binding molecule, and on the contrary, detection of binding molecules that are hardly bound or weakly bound is more effective. Be enhanced. This bacteriophage library can be easily applied to a biopanning technique such as cell panning or immunopanning.
Construction and use of bacteriophage libraries
The bacteriophage library of the present invention is provided in kits used for screening various binding molecules. That is, the kit includes one or more bacteriophage libraries generated from cells of interest such as T cells, a suitable host cell line (eg, E. coli strain), and kit instructions. .
The scTCR fusion protein of the present invention is expressed as a polypeptide having sufficient solubility and functionality. When used as a bacteriophage display library construct, the scTCR is fused to the gene III protein or gene VIII protein, or an appropriate fragment thereof, and the scTCR is expressed as a bacteriophage shell (capsid) component. In either form, the scTCR fusion protein is contacted with an appropriate binding molecule to form a specific binding complex. The binding molecule can be detected by standard methods described below and can also be purified (if desired).
The scTCR used to construct the scTCR fusion protein is generated from a variety of sources. Such sources include the commercially available TCR DNA sequences described below, or biological sources such as immune cells taken from mammals, particularly primates such as humans.
The bacteriophage display library may be configured to display scTCR fusion protein mutants. Typically, an scTCR fusion protein mutant comprises a bacteriophage coat protein covalently linked to an scTCR mutant, or a suitable fragment thereof. The scTC mutant can be selected according to the present invention to increase specific binding affinity for the desired binding molecule. Methods for generating scTCR mutants and scTCR fusion protein mutants are described in detail below.
The present invention also relates to a DNA segment consisting of a sequence encoding a soluble scTCR fusion protein comprising a bacteriophage coat protein covalently linked to an scTCR or a suitable fragment thereof. Usually, the DNA segment is provided as a DNA vector capable of expressing the fusion protein in a suitable host cell. The DNA segment includes an operably linked promoter and leader sequence to express more soluble scTCR fusion protein under the host cell culture conditions described below.
Furthermore, methods for isolating the soluble fusion protein of the present invention have been attempted. In the method, a DNA vector comprising a sequence encoding a soluble fusion protein is introduced into a suitable host cell (transformation or transfection), and the host cell is cultured in a medium under slow induction conditions. Usually, low-speed induction conditions refer to cell culture conditions in which essential nutrients (amino acids, phosphates, etc.) are gently removed from the medium over several hours, and the expression of the sequence encoding the fusion protein is induced. Usually, a DNA vector that can be induced under low-speed induction conditions is selected. The resulting fusion protein is then purified (if desired) to produce a substantially pure scTCR fusion protein. As described in detail below, slow induction conditions improve the production of scTCR fusion proteins that are soluble and have sufficient functionality. Alternatively, the above method can be applied where a DNA vector encoding a single-stranded T cell receptor is included to express a soluble single-stranded T cell receptor and purify it (if desired). . A host cell is a bacterial, insect, or mammalian cell.
It may be desirable to provide the scTCR fusion protein with one or more suitable protein labels (eg, 6XHis) to facilitate purification of the fusion protein from cells. Usually, the cell culture medium or cell extract is contacted with a synthetic matrix to which a protein label is bound. Alternatively or additionally, the scTCR fusion protein is provided with one or more degradable protein labels that can be used to separate the scTCR from the fusion protein, thereby producing a scTCR molecule that is soluble and sufficiently functional. You may do it.
The present invention also includes a method for isolating a DNA segment comprising a sequence encoding a soluble scTCR fusion protein of the present invention. In general, the method involves infecting a host cell with the bacteriophage library produced according to the present invention, and culturing the cell under conditions that allow the bacteriophage to grow in the cell (eg, slow induction conditions). The infected cell is then contacted with the desired binding molecule, preferably a binding molecule with a detectable label, under conditions that permit binding of the binding molecule and at least one bacteriophage. Methods for screening bacteriophage libraries are known in the art and are described, for example, in Sambrook et al., Described below. The resulting specific binding complex is recognized and subsequently the bacteriophage carrying it is isolated and further purified (if desired). In this way, a DNA segment encoding the scTCR fusion protein contained in the complex is isolated.
Methods for attaching detectable labels to binding molecules such as proteins, polypeptides, and nucleic acids are known in the art and are described, for example, in Smbrook et al. And Ausubel et al. Below.
Further provided are methods for improving the specific binding affinity of a desired scTCR. Typically, the method determines the specific binding affinity between the scTCR and the desired binding molecule (eg, an antigen or other ligand), followed by expressing the fusion protein mutant in an appropriate host cell. Infect by bacteriophage library. The infected cell is then contacted with a desired binding molecule, preferably a binding molecule with a detectable label, to form a specific binding complex, which is then recognized. The DNA segment encoding the corresponding fusion protein mutant is then isolated by standard means. If desired, the DNA segment may be subcloned into an appropriate DNA vector and propagated in a host cell. The scTCR mutant produced by the above method is separated from the fusion protein by degrading the appropriate protein label (if desired). Next, the specific binding affinity between the antigen and the scTCR mutant is determined. ScTCRs that exhibit improved specific binding affinity are readily identified as scTCR mutants that have greater specific binding affinity than the scTCR protein.
Undesirable immune responses in mammals can be suppressed or eliminated by the present invention by combining one method or other alternatives to the method. In general, the present invention provides a therapy that suppresses or eliminates an immune response (response) in a mammal by providing an effective amount of scTCR in a pharmaceutically acceptable formulation. Usually, the scTCR is capable of competing for antigens with one or more of the TCRs generated in pathogenic T cells associated with viral infections, autoimmune diseases, transplant rejection, cancer or the like. In particular, it is possible to suppress or eliminate the desired immune response using scTCRs that have a large specific binding affinity for the antigen (eg 2-10 times) compared to the corresponding TCR. Protein competition assays are known in the art and are used to screen for scTCR competitive activity.
In addition, the present invention includes methods of generating antibodies (monoclonal or polyclonal) by standard immunization techniques using purified samples of scTCR or scTCR fusion proteins. Since scTCR is usually obtained from the soluble fusion protein of the present invention, the production rate of scTCR is improved as compared with the conventional case. Antibodies can also be generated from immunogenic peptides comprising one or more epitopes of scTCR. The above-described antibodies, particularly monoclonal antibodies, are useful in various applications such as detection of pathogenic T cells in biological samples such as blood or serum. In addition, the activity of the target T cell in vivo or in vitro is greatly suppressed by suppressing the interaction between the target T cell and the antigen or the MHC / HLA peptide complex using the antibody, or It may be inhibited. As is known, it may be desirable to covalently attach an appropriate cytotoxic or antimetabolite to the antibody.
The present invention further relates to a method of inducing an immune response in a mammal, particularly a primate such as a human, by administering an effective amount of scTCR (isolated from the scTCR fusion protein of the present invention). The isolation of scTCR is carried out by obtaining scTCR from a soluble and sufficiently functional scTCR fusion protein according to the present invention. The scTCR is generated on the surface of T cells (ie, target T cells) and is used to confer immunity to mammals on TCR antigenic structures that perform pathogenic or undesired functions in the immune response. . The T cells are recognized in a biological sample by various conventionally known methods. The T cells are then purified and analyzed for proliferative responses in vitro according to the examples described below. T cells exhibiting a proliferative response are established as a cultured cell line from which DNA encoding TCR is isolated by the method disclosed in the present invention and the corresponding scTCR, such as an scTCR fusion protein mutant, is isolated. Used for the production of fusion proteins. The target TCR antigen structure is usually a clonotopic epitope, a V-α or V-β family-specific epitope, a conformational epitope. ), Linear epitopes and the like. Immunization against the TCR antigen structure that develops on the surface of T cells prevents T cell activity and suppresses or eliminates the pathogenic or unwanted effects of the T cells. Usually, mammals obtain this immunity by administering an effective amount of scTCR (separated from the scTCR fusion protein of the present invention) according to a pharmaceutically acceptable formulation, which allows the host immune system to target T cells. Significantly reduce or eliminate.
Furthermore, a method for detecting a binding molecule (for example, an antigen) capable of specifically binding to TCR has been attempted. Usually, the method is carried out by in vitro screening, and the bacteriophage library of the present invention is in the presence of both molecules under conditions in which the molecule specifically binds to at least one bacteriophage in the library. Incubate. Specific binding complexes formed between the scTCR fusion protein displayed by the bacteriophage and the binding molecule are easily detected. Usually, the presence of the specific binding complex suggests the presence of a binding molecule that can specifically bind to the TCR, corresponding to the scTCR encoded by the bacteriophage. The selected bacteriophage is readily grown by the method disclosed in the present invention, and the DNA segment encoding the scTCR fusion protein is isolated.
Furthermore, the present invention relates to a method for detecting a binding molecule capable of inhibiting specific binding between an antigen and a TCR. The method includes in vitro screening in which the scTCR fusion protein of the present invention is incubated with a binding molecule under conditions that allow the antigen and the fusion protein to form a specific binding complex. In other reactions, the fusion protein is incubated with the antigen and binding molecule under the same or similar incubation conditions. Thereafter, the interaction between the antigen and the fusion protein in the presence and absence of the ligand is analyzed by standard binding assays. A ligand capable of inhibiting specific binding between an antigen and a TCR refers to one in which the interaction between the fusion protein and the antigen is observed at a lower frequency in the presence of the ligand.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1A shows the pJRS149 vector, and FIG. 1B shows the pKC12 vector.
FIG. 2 is a flowchart illustrating an outline of the formation of a DNA vector encoding a fusion protein.
FIG. 3 is a diagram showing a part of the pKC44, pKC46, and pKC51 DNA vectors.
FIG. 4 is a flowchart illustrating the outline of pKC45, pKC46 (pSUN18), and pKC51 DNA vector formation.
FIG. 5 is a diagram showing the PEN2 DNA vector.
FIG. 6A shows a part of the pKC61, pKC63, and pKC65 DNA vectors, and FIG. 6B shows a part of the pKC60, pKC62 (pSUN19), pKC64, pKC66, and pKC67 DNA vectors.
FIG. 7 is a Western blot comparing the synthesis of fusion proteins from pKC60 and pKC46 DNA vectors, respectively.
FIG. 8 is a Western blot showing expression of soluble scTCR fusion protein in MM294, K91Kan, XL1-B, TB-1 and UT-5600 cell lines.
FIG. 9 shows an outline of immunoaffinity purification of scTCR fusion protein comprising bacteriophage gene VIII protein.
FIG. 10 is a Western blot showing expression of fusion proteins derived from DNA vectors pKC51 and pKC46 and purified fractions (fractions) thereof.
FIG. 11 is an SDS-PAGE gel after Coomassie blue staining showing a purified scTCR fusion protein derived from the pKC51 vector.
FIG. 12 is a Western blot of purified scTCR fusion protein from pKC51 vector.
FIG. 13 is a Western blot showing immunoprecipitation experiments with scTCR fusion proteins pKC60 and pKC62.
FIG. 14 is a graph showing surface plasma resonance analysis of the fusion protein encoded by pKC51.
FIG. 15 shows the interaction between anti-TCR (V-β 8.2) antibody (MR5-2), anti-αβ TCR antibody (H57-597 antibody), and anti-M13 antibody by surface plasma resonance analysis. It is a schematic diagram.
FIG. 16 is a graph showing surface plasma resonance analysis of the binding between the scTCR fusion protein encoded by pKC60 and the SEC3 superantigen.
FIG. 17 is a graph comparing the capture of bacteriophage expressing scTCR fusion protein by the ELISA method using anti-HS7 antibody. The scTCR fusion protein is expressed from the pcK46 vector.
FIG. 18 is a graph showing the titration analysis of the bacteriophage constructed using the pKC51 vector expressing the scTCR fusion protein, using the ELISA method.
FIG. 19A is a diagram showing inhibition of IL-2 production in gD12 hybridoma cells by the scTCR fusion protein encoded by the pKC51 vector, and FIG. 19B shows IL in D011.10.T hybridoma cells by the scTCR fusion protein encoded by the pKC51 vector. -2 production inhibition.
FIG. 20 shows the pKC70, pKC71, and pKC72 bacteriophage vectors.
21A-21G are tables showing DNA oligonucleotide primers used in the construction of the DAN vectors described below. 21A shows (SEQ ID NOs .: 1-16), FIG. 21B shows (SEQ ID NOs .: 17-30), FIG. 21C shows (SEQ ID NOs .: 31-45), and FIG. (SEQ ID NOs .: 46-63), FIG. 21E (SEQ ID NOs .: 64-79), FIG. 21F (SEQ ID NOs .: 80-95), and FIG. 21G (SEQ ID NOs .: 46-63). 97-100).
FIG. 22 is a table showing DNA oligonucleotide primers (SEQ ID NOs .: 116-131) used for the construction of the V-β chain of the scTCR fusion protein.
FIG. 23 is a table showing DNA oligonucleotide primers (SEQ ID NOs .: 101-115) used in the construction of the V-α chain of the scTCR fusion protein.
Detailed description of the invention
As summarized in the preceding description, we have obtained a sufficiently soluble and functional scTCR fusion protein comprising a bacteriophage coat protein or a suitable fragment thereof covalently linked to an scTCR molecule. The scTCR comprises a V-α chain covalently linked to a V-β chain by a single chain peptide linker sequence. The segment of DNA encoding the scTCR fusion protein and the vector are useful for constructing a bacteriophage library displaying the scTCR fusion protein in a form suitable for detecting binding molecules in vitro.
In general, the scTCR fusion proteins can be prepared using the processes disclosed herein and commonly known recombinant DNA techniques. Conventional techniques include, for example, plasma DNA preparation, DNA excision with restriction enzymes, DNA ligation, host cell transformation, transfection, electroporation, or biolistic transformation, host cell culture, and expression. Examples include isolation and purification of DNA. For a general description, see Sambrook et al. In Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989. . These documents are described here as reference documents.
The scTCR fusion protein according to the present invention is a single-chain fusion protein containing a bacteriophage coat protein fused to a scTCR or an appropriate fragment thereof. Usually, the bacteriophage coat protein or fragment thereof is a gene III protein or gene VIII protein derived from filamentous phage of E. coli. The scTCR comprises a V-α chain fused to a V-β chain by a suitable peptide linker. Thus, the scTCR corresponds to the TCR-derived V-α and V-β chains associated with T cells. T cells are present in the natural state or are found to be associated with diseases such as immune system diseases, autoimmune mechanism disorders, allergies, or viral infections that accompany cancer. In general, the V-α and V-β chains of scTCR fusion proteins correspond to approximately 200 to 400 amino acids in length, preferably approximately 300 to 350 amino acids, and TCR At least 90%, preferably 100% homologous to the V-α and V-β chains. Here, “homologous” means that the amino acids forming the V-α chain and V-β chain are 100% identical to the V-α chain and V-β chain of the corresponding TCR. Specific binding between the scTCR fusion protein according to the present invention and the binding molecule can be evaluated by a method such as immunoadsorption or immunodropping.
As mentioned above, the scTCR can be fused to bacteriophage coat protein derived from filamentous phage of E. coli or a fragment thereof. Typical examples of filamentous phage are disclosed by Sambrook et al. And Smith and Scott, supra. As used herein, “fragment” means a portion of the bacteriophage coat protein that can be packaged (included) in a bacteriophage and can display the soluble fusion protein of the present invention on the surface of the bacteriophage. ing. In general, a bacteriophage gene VIII fragment corresponds to 40 to 50 amino acids in length, and preferably corresponds to approximately 50 amino acids. A bacteriophage gene III fragment corresponds to approximately 200 to 400 amino acids in length, and preferably corresponds to approximately 400 amino acids. Methods for determining whether a bacteriophage coat protein fragment is suitably packaged in a bacteriophage are known and are generally performed by methods related to platelet type analysis. In addition, the bacteriophage coat protein fragment can display the scTCR fusion protein on the surface of the bacteriophage according to those determined by standard immunological methods such as biological panning analysis described below. A bacteriophage coat protein fragment, as described herein, mutates a DNA vector (ie, site-targeted mutagenesis or terminal loss) such that a portion of the DNA encoding the bacteriophage coat protein is removed. It can be made by various methods such as The DNA vector is used for the purpose of fusing the DNA encoding the fragment to the desired DNA segment encoding the scTCR.
The V-α chain of the scTCR fusion protein is covalently linked to the V-β chain via a suitable peptide linker that is fused to the C-terminus of the V-α chain and the N-terminus of the V-β chain. The V-β chain may further comprise a C-β chain fragment fused to the C-terminus of the V-β chain, and the V-α chain is located between the C-terminus of the V-α chain and the N-terminus of the peptide linker. It may further comprise a fused C-α fragment. In general, C-β chain fragments correspond to approximately 50 to 126 amino acids in length. Importantly, the C-β chain fragment does not contain a cysteine residue at position 127 (last). The C-α chain fragment corresponds to approximately 1 to 21 amino acids in length, and approximately corresponds to the first amino acid (isoleucine) to the 21st amino acid of the C-α chain. The C-α chain fragment does not contain any cysteine residues. The bacteriophage coat protein or fragment thereof is fused to the C-terminus of the V-β chain or C-β fragment. Alternatively, the protein label may be fused to the C-terminus of the V-β chain (or C-β chain fragment) and the N-terminus of the bacteriophage coat protein or fragment thereof. In addition, the protein label is fused to the C-terminus of the V-β chain (or C-β chain fragment) and the N-terminus of the bacteriophage coat protein or fragment thereof, and a second protein label (which may be the same, May be fused) to the C-terminus of the bacteriophage coat protein or fragment thereof. Further differently, the protein label is fused to the C-terminus of the bacteriophage coat protein or fragment thereof, and the bacteriophage coat protein or fragment thereof is further added to the V-β chain (or C-β chain fragment) at the N-terminus. ) May be fused to the C-terminus.
Further modified scTCR fusion proteins include scTCR fusion proteins having a protein tag fused to the N-terminus of the V-α chain. Further, bacteriophage coat protein or a fragment thereof is fused to the C-terminus of the V-α chain (or C-α fragment), and this chain is fused to the N-terminus of the V-α chain by a peptide linker. It may be covalently linked to the C-terminus of the (C-β fragment).
Another scTCR fusion protein according to the present invention contains two peptide linker sequences, the first peptide linker sequence being fused to the C-terminus of the V-α chain and the N-terminus of the V-β chain. The C-terminus of the V-β chain is fused to the N-terminus of a suitable C-β chain fragment. Furthermore, the second peptide linker sequence is fused to the C-terminus of the C-β chain fragment and the N-terminus of the bacteriophage coat protein or fragment thereof.
The scTCR molecule contained in the fusion protein comprises a peptide linker sequence, which can be used flexibly for the purpose of effectively arranging the V-α chain and the V-β chain. That is, the V-α chain and the V-β chain are arranged in a pocket capable of specifically binding a molecule such as an antigen by the peptide linker sequence. Antigens that bind to the scTCR fusion protein can be used to modulate the activity of T cells as determined by the following analysis. As a typical example of such an analysis, T cells expressing TCR are cultured and expanded, the T cells are contacted with a scTCR fusion protein (or scTCR obtained therefrom), and then the fusion protein is converted to T An in vitro analysis that includes a series of steps to assess whether a cell's activity can be modulated.
In any of the scTCR fusion proteins described above, the V-β chain is shared with the V-α chain via a suitable peptide linker that is fused to the C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the V-α chain. Are connected.
The DNA segment encoding the desired V-α chain and V-β chain can be obtained from various cells including T cell hybridomas and T cells such as cytotoxic T cells (CTL). CTLs exist in their natural state and are also associated with pathogenic immune response in rodents (mouse, rat, rabbit) or primates (human, chimpanzee). For example, CTL can be collected from a patient who is or suspected of having a viral infection, cancer, autoimmune disease, allergy, or transplant rejection. More specifically, CTLs can be isolated from patients suffering from DNA or RNA viruses to create scTCR fusion proteins according to the methods of the present invention. For example, scTCR fusion proteins can be prepared using CTL obtained from HIV patients categorized as long-term non-progressive. See Example 18 below. CTLs can also be obtained from antigen-specific CTLs and TILs isolated from patients with established malignancies or melanoma (eg, Cox A. et al. Science (1994) 264: 716). Rosenberg, SAet al. N. Eng. J. Med. (1988) 319: 1676; Kawakami, Y. et al. J. Exp. Med. (1994) 180: 347; Kawakami, Y. et al. PNAS ( 1994) 91: 6458). Among the pathogenic immune reactions that have received particular attention are sclerosis, insulin-dependent diabetes mellitus, rheumatoid arthritis, allergies, cancers (ie, immune responses to antigens related to tumors such as CEA), transplantation of tissues and skin, etc. Cell tissue rejection of infectious patients, infectious diseases, particularly infectious diseases involving RNA viruses or DNA viruses. Specific examples of viruses that attract attention include human immunodeficiency virus (HIV), cytomegalovirus (CMV), influenza virus, hepatitis virus, poxvirus, Epstein Barr, adenovirus, and polyoma virus. Can be mentioned. In addition, DNA segments encoding the V-α chain and V-β chain are also available from public databases disclosing the TCR DNA sequences described below.
There are several ways to prepare the DNA segment for obtaining V-α and V-β chains from cells. Specifically, in order to prepare α-chain DNA and β-chain DNA, mRNA is separated from cells exhibiting a desired TCR binding specificity. This method generally uses polymerase chain reaction (PCR), a protocol that uses a first strand cDNA template made from mRNA. The desired V-α and V-β chains are then made using standard recombinant techniques. A DNA segment encoding the desired α and β chains is then prepared to include the appropriate peptide linker sequence and protein label. Next, if necessary, the DNA is packaged in a suitable packaging system to produce a recombinant bacteriophage displaying the scTCR fusion protein. The DNA segment encoding the scTCR fusion protein can be obtained by a conventional method such as a subcloning technique or a PCR amplification method using a DNA oligonucleotide primer that hybridizes to the bacteriophage DNA attached to the side of the scTCR fusion protein insert. It can be easily separated from bacteriophages with a replacement technique. In general, an oligonucleotide consists of approximately 12 to 50 nucleotides in length, and more preferably approximately 20 to 25 nucleotides. Using the DNA encoding the fusion protein thus obtained, a considerable amount of soluble fusion protein (amount in milligrams per 1 g cell) can be prepared in a suitable host cell such as E. coli.
The DNA segment usually contains a leader sequence and can be processed appropriately. Generally, the leader sequence is fused to the 5 'end of the sequence encoding the scTCR fusion protein. Specifically, the leader is covalently linked to the 5 ′ end of the DNA sequence encoding the V-α chain (in some embodiments the V-β chain). However, the specific leader sequence is linked to a specific α or β chain in the vector, but the leader sequence can be replaced using recombinant technology without adversely affecting the processing of the fusion protein. Will be understood. Thus, in one of the preferred embodiments, the 5 ′ end of the V-α chain is covalently linked to the 3 ′ end of the leader sequence. The leader sequence consists of approximately 12 to 26 amino acid residues in length. A preferred leader sequence is the modified Pel B sequence disclosed in Example 3 below.
DNA segments are usually trp operon promoter, rack promoter, trp-rack promoter, rack ^uvs It further comprises a promoter such as a promoter or a phoA promoter. Suitable promoters are those that contribute to strong and regulatable expression under slow inducing conditions over several hours (eg 2 to 10 hours) such as phoA. Under suitable culture conditions, most of the strong promoters can produce fusion proteins on the order of 10% or more of the total host cell protein.
The bacteriophage library of the present invention can be easily created in a few steps. For example, a DNA segment encoding scTCR can be made by the methods outlined above. The DNA is then ligated into a suitable phage or phage-derived vector (eg, a phagemid) and the DNA is fused to a sequence encoding a bacteriophage coat protein, usually a gene III or gene VIII protein. Alternatively, it may be fused to a bacteriophage coat protein fragment. The recombinant phage thus produced, or a phage-derived recombinant vector, contains scTCR fused to a bacteriophage coat protein or a fragment thereof. In some cases, it may be desirable to further include a sequence that encodes one or more protein tags as described above, or a stop codon. Subsequently, when a suitable E. coli strain is infected, a large number (usually several tens to several hundreds) of the fusion protein is displayed on the surface of the bacteriophage. In order to increase the production amount of recombinant virions displaying the scTCR of interest, helper phage is added. A general method for constructing a bacteriophage display library using different bacteriophages and E. coli strains has been disclosed. For a general description, see Smith and Scott, Parmley, SF, and Smith, GP. (1988) Gene 73,305 above.
Specific scTCRs used to create a bacteriophage library include scTCRs having V-α and / or V-β chains obtained from mammals. Typical examples of mammals include primates and rodents. Among primates, there are humans and chimpanzees. Rodents include immunologically weak nude mice or HLA-AS antigen complex. Examples include mice containing a transgene capable of expressing the body (Vitiello, A. et al., J. Exp. Med., (1991) 175, 1002). Of particular note are those patients who have or suspected of having cancer, infections, autoimmune diseases, or transplant rejection.
A bacteriophage library according to the present invention can also be constructed to display fusion protein mutants. This “mutant” refers to a fusion protein containing an average of one mutated amino acid per molecule. More specifically, an amino acid mutation refers to an amino acid substitution in the scTCR portion of the fusion protein, thereby generating an scTCR mutant. In general, scTCR mutants are constructed to contain, on average, one amino acid substitution. The method for generating and analyzing the mutant is described in detail below.
A bacteriophage library displaying scTCR fusion protein mutants can be easily generated in a few steps. For example, a desired scTCR can be obtained by isolating a DNA segment encoding a suitable V-α chain and a DNA segment encoding a V-β chain joined by a peptide linker sequence as described above. The DNA is ligated and then modified by, for example, introducing mutations locally into the desired regions in the V-α and V-β chains of the scTCR. A typical example of a method for inducing mutation is alanine scanning mutagenesis (for example, Nisbet, IT et al. (1985) Gene Anal. Tech. 2,23; Hines, JC, Gene ( 1980) 11,207; and Sambrook et al., Supra). The mutation is preferably an amino acid substitution that affects the binding affinity of the complement determining region of scTCR (ie, also referred to as CDR or hypervariable region). More specifically, the amino acid substitution is a conservative substitution or a non-conservative substitution, and as used herein means to replace a certain amino acid with an amino acid in scTCR. In some cases, this substitution may involve replacing an amino acid with another amino acid of similar chemical nature (conservative substitution), and in some cases, an amino acid may be of chemical nature. Substitution with other different amino acids (non-conservative substitutions) is included. Thus, when a substitution of a tyrosine residue in scTCR is performed with a phenylalanine residue, this is a conservative amino acid substitution, and when a substitution of an alanine residue is performed with a proline residue, this is a non-conservative amino acid substitution. Those skilled in the art will appreciate that mutagenesis can separate the V-α and V-β chains of scTCR and change the length of the amino acid organization of the peptide linker sequence. However, in most cases, mutagenesis focuses on the V-α and V-β chains, causing an average of one amino acid mutation substitution in the V-α or V-β chain of the fusion protein. Is. The degree of mutation induction can be easily analyzed by analyzing the DNA sequence of the mutated V-α chain or V-β chain.
Although not as suitable as the above method, the bacteriophage library according to the present invention may be exposed to a chemical mutagen (for example, EMS), which is known to introduce amino acid substituents. Thereby, the scTCR fusion protein displayed on the surface of the bacteriophage will contain the fusion protein mutant. When using such a method, the amount of chemical mutagen used (or the degree of exposure to the mutagen) is such that an average of one amino acid substitution is made for each V-α chain or V-β chain. It is preferable to adjust to. Bacteriophage libraries that express fusion protein mutants (including scTCR mutants) as described above are particularly useful in detecting fusion proteins with enhanced specific binding affinity for the desired antigen. It is.
The scTCR fusion protein according to the present invention usually comprises one scTCR corresponding to one TCR. In general, T cells that express a TCR may be subjected to natural conditions or in vivo pathological conditions (eg, TCRs). _S , T _C Or T _H Cells). Alternatively, it can be cultured as a T cell hybridoma (eg, D10 or B12 cell line). See Example 1 below. As noted above, T cells contain CTLs isolated from patients who develop or are suspected of developing cancer, infections, autoimmune deficiencies, or allergies. The T cell produces DNA encoding a TCR sequence (ie, V-α chain sequence, C-α chain sequence, V-β chain sequence, and C-β chain sequence), which is the present invention. Obtained by the method disclosed therein. In addition to this, in order to obtain the DNA, oligonucleotide primers corresponding to publicly available DNA sequences may be formed by conventional methods, and the DNA may be PCR amplified. See, for example, Kabat, EA, et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed. Public Health Service, NIH Washington, DC and Chotia, C. et al. (1988) EMBO J. 7: 3745.
More specifically, DNA encoding the desired V-α chain sequence, C-α chain sequence, V-β chain sequence, or C-β chain sequence is amplified by PCR or other suitable DNA cloning methods. can do. When PCR method is selected, in order to amplify a predetermined TCR DNA (V-α chain sequence, C-α chain sequence, V-β chain sequence, or C-β chain sequence) adjacent to the oligonucleotide primer, A DNA oligonucleotide for PCR is selected. PCR oligonucleotides usually correspond to approximately 12 to 50 nucleotides in length, preferably approximately 20 nucleotides. The primer is a genomic DNA isolated from a desired T cell, or a DNA comprising a DNA encoding a V-α chain sequence, C-α chain sequence, V-β chain sequence, or C-β chain sequence Used for the purpose of amplifying DNA in a vector. The PCR primer preferably contains a restriction site that adds a specific restriction enzyme cleavage site for introducing a ligation site into the PCR product, if necessary. Typical examples of primers are given in the examples and figures below. The generated PCR product comprises an amplified V-α chain sequence and a V-β chain sequence, and further, as described below, a ribosome binding sequence, a leader sequence, and a leader sequence so that the fusion protein can be optimally expressed. And may be adjusted to include a promoter sequence. Suitable primers, PCR conditions, and expression vectors are disclosed in the examples and figures below.
By the peptide linker sequence, the V-α chain and V-β chain of the fusion protein are arranged so that an antigen-binding pocket can be effectively formed. By doing so, the soluble fusion protein can specifically bind to an antigen (for example, a superantigen or an antigen in an MHC / HLA peptide complex). Importantly, this allows the fusion protein to compete with a TCR located on the surface of naturally occurring or pathologically present T cells. “Competing” means that the fusion protein can bind the antigen at a level equal to, or preferably greater than, the specific binding affinity of the corresponding TCR. In general, scTCR fusion proteins (or scTCR molecules derived therefrom) exhibit binding affinities that are approximately 2- to 10-fold higher than the corresponding TCR. Methods for determining binding affinity are known and disclosed herein. “Corresponding” means using the TCR (or the DNA that encodes it) to create the scTCR V-α and / or V-β chains.
In a preferred embodiment of the present invention, the polypeptide linker sequence consists of about 7 to 20 amino acids, preferably about 10 to 20 amino acids, more preferably about 12 to 20 amino acids. ing. A linker sequence is provided in the fusion protein to place the V-α and V-β chains in such a way that antigens can be optimally bound, but this arrangement is usually flexible. The linker is preferably mostly composed of amino acids having small side chains such as glycine, alanine, serine, etc., which gives the flexibility described above. Preferably, approximately 80% to 90% or more of the linker sequence consists of a glycine residue, an alanine residue, or a serine residue, especially a glycine residue and a serine residue. It is preferred that the linker sequence does not contain any proline residues that inhibit flexibility. The linker sequence is preferably linked to the C-terminus of the V-α chain and the N-terminus of the V-β chain of the fusion protein. See Example 1, Example 2, and FIG. 3, FIG. 6A, FIG. 6B, and FIG.
(GGGGS) _Four Sequence (ie Gly Gly Gly Gly Sel) _Four Suitable linker sequences including include JA302 (SEQ ID NO: 96) and JA301 (SEQ ID NO: 95). The linker sequence is preferably linked between the C-terminal residue of the scTCR V-α chain and the first amino acid of the V-β chain. Different linker sequences can be used, including flexible linker designs by suitably combining antibody variable regions (M. Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2: 97-105 ( 1991)). Such suitable linker sequences can be easily identified experimentally. For example, a DNA vector comprising a DNA segment encoding a fusion protein containing a linker sequence can be cloned and expressed, and the fusion molecule can be expressed, for example, by standard antigen binding analysis (see Harlow and Lane above). ), The experiment can determine whether the molecule is capable of binding to the antigen. In addition to this, the ability to regulate T cell activity can be tested by the analysis methods disclosed in Example 8 and Examples 10 to 12 described below, and an expressed fusion protein comprising a linker sequence can be determined. . Suitable size and sequence of the linker sequence can also be determined by conventional modeling techniques using a computer based on the assumed size and shape of the fusion protein.
Preferably, the restriction sites in the DNA vector are engineered so that virtually any nucleotide sequence encoding the V-α chain or V-β chain can be incorporated into the vector. In addition, the DNA vector is designed to contain one or more restriction sites for incorporating DNA encoding a suitable bacteriophage coat protein (gene III protein, gene VIII protein) or a suitable fragment thereof. Also good. Furthermore, DNA encoding one or more protein labels such as myc, EE, or 6XHIS can be linked to a DNA vector encoding a fusion protein by a conventionally known method. For example, Manstein, DSet al. Gene (1995) 162 (1), 129; Grussenmeyer, T. et al. PNAS (USA) (1985) 82 7952, Tang, E. and Henry, HLJ Biol. Chem. (1993) 268 (7), see 5069.
More specifically, in the preferred system specifically shown in the examples below, suitable restriction sites (eg, XhoI and SpeI sites) are defined between the V-α and V-β chains of the scTCR fusion protein. Located at both ends of the polypeptide linker sequence located between. When fused to an appropriate DNA vector, fusion of the restriction site with the bacteriophage coat protein or fragment thereof occurs.
A DNA vector containing a sequence encoding the scTCR fusion protein disclosed herein generally satisfies the following (1) to (8): (1) an origin of replication derived from, for example, PBR322 that acts in E. coli (2) a selectable antibiotic resistance gene, eg, an ampicillin resistance gene, (3) a transcription termination region, eg, an E. coli trp operon termination region, (4) a transcription promoter, eg, , PhoA, tac, tac-lac, lacZ, lac ^uvs , Having a T7 or T3 promoter, (5) having a leader sequence, eg, a pelB or ompA leader, (6) having a DNA segment encoding scTCR, (7) bacteriophage coat protein, eg, Those having gene III protein or gene VIII protein (or a suitable fragment thereof), (8) transcription terminators, for example, those having a T1T2 sequence derived from the ribosomal RNA locus of E. coli. In some cases, the DNA vector may further include one or more DNA sequences encoding a protein label as described above.
In order to optimize the expression of the scTCR fusion protein and its stability, particularly under the slow induction conditions described herein, specific nucleotide sequences may be included in the DNA vector. For example, the phoA promoter sequence and the pelB leader sequence described below are particularly preferred for expressing scTCR fusion proteins in a phosphate deficiency-inducing environment. See Example 4 below. In order to increase translation efficiency, a strong translation initiation sequence may be included in the composition. For expression in mammalian cells, the preferred starting sequence is the Kozak consensus sequence (CCACCCATG) (SEQ ID NO: 97).
The leader sequence contained in the DNA vector is for suitably inducing the expression of the fusion protein on the cell membrane of the host cell or in the host cell medium, and the DNA encoding the V-α chain of interest encodes the fusion protein. It includes a restriction site that is effectively positioned so that it can be suitably ligated into the configuration. Preferably, the restriction site is incorporated at the 3 ′ end of a leader sequence (eg, corresponding to approximately 2 to 10 codons in length), sometimes referred to in the art as a junction sequence. Connected to the V-α chain. As a result, the V-α chain coding region is usually the first amino acid of the V-α coding region. As an example, one restriction site is the SFiI site, while the other cleavage site is incorporated in front of the coding region of the V-α chain, allowing the V-α chain to be more suitably inserted into the vector configuration. Things can be mentioned. As discussed above, by using such a restriction site together with another restriction site usually located at the head of the V-α chain, a wide variety of V-α chains, or V-α, C-α chains are used. The coding sequence can be inserted quickly and easily. Preferred leader sequences are those containing a strong translation initiation site, and sometimes a cap site at the 3 ′ end of the mRNA. Typical leader sequences include pelB and OmpA. A particularly preferred leader sequence is pelB, as described in Example 4 below.
Here, the term “vector” is any nucleic acid sequence of interest that can be incorporated into a host cell, and as a result of expression of the nucleic acid of interest, the scTCR fusion protein and the like are generated. Examples of the vector include linear nucleic acid sequences, plasmids, cosmids, phagemids, extrachromosomal DNA, and the like. Specifically, the vector may be recombinant DNA. The term “expression” or “gene expression” as used herein refers to the generation of a protein product corresponding to the nucleic acid sequence of interest, including transcription of DNA and translation of RNA. Usually, a DNA segment encoding the scTCR fusion protein of the present invention is inserted into a vector, preferably a DNA vector, and the DNA segment is replicated in a suitable host cell.
A DNA vector encoding a sufficiently soluble and functional scTCR fusion protein according to the present invention is preferably expressed over a long period of time by a host cell that is slowly induced. Although not referring to a specific theory, slow induction over about 2-8 hours, preferably over about 4-6 hours, stabilizes the expression of the scTCR fusion protein, and the protein between the cells. Folding is optimized. In particular, when the expression is performed by a strong promoter, these effects on low-speed induction are clear. For example, a DNA vector is generated comprising a phoA promoter (strong) operably linked to a sequence encoding an scTCR fusion protein. The host cell is then transformed in the host cell medium with the DNA vector. The phosphate in the host cell medium was set to be used up in the medium for several hours, generally 2 to 10 hours, usually 4 to 6 hours. When combined with the above-mentioned low-speed induction conditions and a strong promoter, it is sufficiently soluble and functional as compared with a high-speed induction method using a chemical inducer and a weak promoter (for example, IPTG induction method of LacZ promoter). It was found that the production amount of a typical scTCR fusion protein was greatly increased. See Example 4 below. Suitable host cells are those that can be transformed by various methods known in the art, such as retroviral transformation, calcium, liposome, or polybrene-mediated transfection, biodegradation transformation, and the like.
As described above, the scTCR fusion protein according to the present invention may contain one or a plurality of protein labels (which may be the same or different). This protein label also includes those comprising a protease degradation site. For example, a protein label is a polypeptide that retains charge under physiological pH conditions, such as 6XHIS, in which case a suitable synthetic matrix can be used to purify the fusion protein. More specifically, the synthetic matrix may be a commercially available sepharose matrix such as Ni-Sepharose, or other matrix that can bind 6XHIS label under pH 6-9 conditions. Also good. Other suitable labels include EE or myc epitopes that are specifically bound by commercially available monoclonal antibodies. In general, various epitopes that are specifically bound by an antibody, preferably a commercially available monoclonal antibody, function as a protein tag. Other suitable synthetic matrices include synthetic matrices having binding antibodies that form specific bonds with the scTCR fusion protein. Typical protein labels comprising a degradation site include enterokinase, Factor Xa, snake venom, or protein labels comprising a thrombin degradation site. See, for example, PCT patent application number WO 96/13593.
There are several methods for expressing the soluble fusion protein according to the present invention in prokaryotes, eukaryotes, or insect cells. For example, DNA encoding the fusion protein is incorporated into a suitable vector by known means such as, for example, using an enzyme to restrict the vector in place so that the DNA is ligated to the vector. be able to. As noted above, the vector may also include a sequence encoding a bacteriophage coat protein, or a suitable fragment thereof. A vector comprising DNA encoding the fusion protein is then introduced into a suitable host and the scTCR fusion protein is expressed. Suitable vectors are selected experimentally based on factors related to the cloning protocol. For example, the vector must be compatible with the host cell used and have an appropriate replicon. In addition, the vector must be able to accommodate the DNA sequence code corresponding to the fusion protein to be expressed. Examples of typical vectors include those capable of expressing the fusion protein in E. coli, particularly in host strains suitable for construction of bacteriophage libraries (see Smith, GPand JKScott, supra). Other DNA vectors include pCDVA3 (available from InVitrogen) capable of expressing a fusion protein in mammalian cells. For other DNA vectors that can be used in mammals, see Sambrook et al. And Ausubel et al.
More specifically, suitable host cells for expressing the fusion protein of the present invention include cells that can be easily transformed and show rapid growth in a medium. Particularly preferred host cells include Escherichia coli and Bacillus subtilis. Other host cells include animal cells, yeasts such as S. cerevisiae, and eukaryotic cells such as insect cells. For the purpose of growing the bacteriophage library disclosed herein, E. coli strains such as XL1-B, K91, and K91Kan are preferred. Suitable cells for expression in insect cells are cells such as Sf9 that can be infected with baculovirus. In general, conventional culture conditions are employed, and further, for example, a suitable cell selection marker (for example, an antibiotic resistance gene or G418) is incorporated into the vector to select a stably transformed or transfected cell line. Is done. Cells expressing the scTCR fusion protein can be obtained by known techniques such as ELISA analysis using commercially available monoclonal antibodies that specifically bind to the V-α chain or V-β chain as described below. Can be determined.
The expressed scTCR fusion protein can be isolated and purified by known methods such as immunoaffinity chromatography, immunoadsorption, and immunoprecipitation. Importantly, a considerable amount of fusion protein is produced without performing the step of refolding over time in the preparation process. The protein purification method is described in detail below, according to which the production of most scTCR fusion proteins is in the range of 2-20 milligrams per 50-100 grams of host cell paste.
In general, to prepare an scTCR fusion protein, the cell extract or host cell culture medium is centrifuged, and the resulting supernatant is subjected to, for example, A protein or G protein affinity chromatography or expressed scTCR fusion. The protein is purified by affinity chromatography or immunoaffinity chromatography, such as an immunization protocol using an antibody that specifically binds to a protein molecule. Examples of the antibody include commercially available monoclonal antibodies capable of specifically binding to the scTCR V-α chain or V-β chain. As typical examples of the antibody, H57, MR5-2, F23.1 and the like, which are products of Pharmagen, can be mentioned. Protein affinity purification using monoclonal antibodies is known and disclosed in, for example, Harbo and Lane, Antiboides: A Laboratory Manual (1988).
The fusion protein according to the present invention is provided in a soluble and sufficiently functional form, that is, it can be stably secreted into the medium. More specifically, the scTCR fusion protein is provided in a form that is stable under an environment that substantially satisfies the condition that there is little or no disturbing substance such as a surfactant, that is, physiological conditions. That is, the fusion protein generally does not include regions that are rich in hydrophobic amino acids, such as amino acids found within the TCR transmembrane protein region. However, in some cases, as long as the scTCR fusion protein is sufficiently soluble, a portion that is rich in hydrophobic amino acids may be included. That is, expression of the fusion protein may not lead to the formation of significant amounts of inclusion bodies in a suitable host cell. Inclusion bodies can be easily detected using a microscope or by conventional biochemical techniques.
The scTCR fusion protein according to the present invention can be prepared as described above, but can also be prepared in the same manner in the examples described below. In general, a DNA encoding a desired V-α chain and a DNA encoding a V-β chain are, as described above, a T cell, a T hybridoma system, or the publicly available V-α chain and V -Obtained from an appropriate place such as a β chain sequence. The DNA can be amplified by PCR, cloning, or other suitable means. For example, by cloning the DNA encoding the desired V-α chain as a suitable vector and then cloning the DNA encoding the desired V-β chain and a suitable single-stranded linker sequence, the desired An scTCR can be generated. As described above, in some cases, the scTCR includes DNA encoding a C-α chain fragment and / or a C-β chain fragment. Then, the DNA encoding scTCR is ligated to a DNA vector cleaved at a suitable site comprising a DNA sequence encoding a bacteriophage protein or fragment thereof and other sequences necessary for bacteriophage function. The bacteriophage coat protein or a suitable fragment thereof (eg, gene III protein or gene VIII protein) is further fused to the scTCR molecular structure. A typical example of a DNA vector comprising a sequence encoding a bacteriophage gene III protein or bacteriophage gene VIII protein is described below. As described above, DNA encoding one or more protein tags may be added to the fusion protein as needed, preferably by selecting a DNA vector that already contains the desired protein label. Thereby, the ligated DNA vector is expressed in a suitable host, and the fusion protein can be recovered and purified as necessary.
The scTCR fusion protein according to the present invention generally comprises a promoter / leader sequence / V-α chain / single stranded linker sequence / V-β chain; promoter / leader sequence / V-α chain / single stranded linker sequence / V- β chain / C-β chain fragment; promoter / leader sequence / V-α chain / C-α chain fragment / single chain linker sequence / V-β chain; or promoter / leader sequence / V-α chain / C- The sequence of α chain fragment / single stranded linker sequence / V-β chain / C-β chain fragment is encoded by a covalently bonded DNA structure. In order to express and purify the fusion protein, a DNA vector comprising the specific expression system disclosed herein is suitably introduced into bacterial cells, baculovirus-insect cells, or mammalian cells.
The molecular weight of the scTCR fusion protein according to the present invention will vary depending on several factors, for example, what was selected as the fusion bacteriophage coat protein or fragment, or whether the protein label employed was one or more. . In general, a soluble and fully functional fusion protein has a molecular weight of more than about 45 kDa, and the molecular weight of the V-α chain and V-β chain contained therein is more than 20 kDa, but usually the molecular weight is 21-26 kDa. Is within the range. In addition, the fusion protein according to the present invention usually has a molecular weight of about 48 to 50 kDa. All of the above molecular weights can be determined by conventional molecular sizing experiments such as SDS-PAGE gel electrophoresis. For a general explanation, see the work by Harlow and Lane and Ausubel et al.
The multivalent scTCR fusion protein according to the present invention can be used in various useful applications. For example, it is considered that the function is enhanced as the valence of scTCR increases. The multivalent fusion protein can be one to four fusion proteins (for example, the same biotin, streptavidin, labeling technology, or by joining to a suitable solid support such as latex beads. It can be different, and can be made covalently. Chemically cross-linked fusion proteins (eg, dendrimers made by cross-linking) are also suitable as multivalent species. For example, the fusion protein can be modified by including a sequence that encodes an amino acid residue, such as Cys or His, having a chemically active side chain. These amino acids having chemically active side chains can be located at various positions in the fusion protein, but are preferably located distal to the antigen binding region of the scTCR. For example, the C-terminus of the C-β chain fragment of the fusion protein can be covalently linked to a protein purification label or other fusion protein containing an active amino acid. By including a suitable side chain, a plurality of fusion proteins can be chemically bonded to form a suitable dendrimer particle to produce a multivalent molecule. Dendrimers are scientifically synthesized polymers that may contain any of several different functional groups on their surface (see D. Tomalia, Aldrichimica Acta, 26: 91: 101 (1993)). ). Typical dendrimers suitable for use in the present invention include, for example, E9 starburst polyamine dendrimers, E9 comburst polyamine dendrimers, and the like, which can bind to cysteine residues. It is done. Examples of multivalent fusion proteins are described in Example 9 below.
The fusion protein according to the present invention, which further contains another substance, particularly a T cell co-stimulatory factor such as B-7 gene family (for example, B7-1 and B7-2). It is also desirable to construct a DNA vector that encodes and activate the cell containing the fusion protein.
The fusion protein according to the present invention can be used for the purpose of detecting and characterizing recombinant peptide antigens such as superantigens and antigens in MHC molecules or HLA molecules. For example, using the method according to the present invention, non-characteristic epitopes for T cells can be mapped as follows. That is, a sequence encoding a random peptide library or a selected peptide library is provided in the peptide library. The library is then screened with a fusion protein, preferably a detectably labeled fusion protein. Subsequently, the peptide specifically bound to the fusion protein is suitably amplified. Next, the sequence of the peptide is analyzed to identify the sequence bound to the fusion protein. In addition, the cloned peptide sequence is tested for binding to T cells that express TCRs corresponding to the V-α and V-β chains of the fusion protein. Any of several random peptide libraries may be adopted. For example, J. Scott et al., Science (1990) 249: 386; J. Devlin et al., Science, (1990) 249: 404; S. Cwirla et al., PNAS (USA), (1990); 87 : 6378; J. Hammer et al., J. Exp. Med. (1992) 176: 1007; Rhode, PR et al. J. Immunol. (1996) 157: 4885; and D. O'Sullivan et al., J .Immunolo., (1991) 147: 2663.
Very useful single chain class I and class II MHC / peptide complexes (ie, “scMHC complexes”) have been published PCT application number PCT / US95 / 09816 and pending US patent application serial number 08 / 382,454. (Filing date: February 1, 1995) and Serial No. 08 / 596,387 (Filing date: January 31, 1996). The above published PCT application number PCT / US95 / 09816 and the pending US patent application serial number 08 / 382,454 (filing date 1 February 1995) and serial number 08 / 596,387 (filing date 1996) (January 31) discloses a very useful in vitro and in vivo T cell binding assay that can be used to test the function of the scTCR fusion proteins disclosed herein.
More specifically, the published PCT application number PCT / US95 / 09816, the pending US patent application serial number 08 / 382,454, and serial number 08 / 596,587 include Single-chain MHC class IIIA containing a presenting peptide derived from amino acids 323-339 or a presenting peptide derived from amino acids 246-261 of an HSV-1 gD peptide (such as gD12) ^d Complex (eg, scIa ^d Molecules, etc.). As disclosed in the pending US patent application serial number 08 / 596,587, an OVA peptide and a gD12 peptide can be fused or scIA. ^d It can be provided in a non-covalent manner linked to the complex. The above published PCT application number PCT / US95 / 09816 and the pending US patent application serial numbers 08 / 382,454 and 08 / 596,587 are listed here as references.
The ability of the scTCR fusion protein of the present invention to modulate T cell activity (for example, to suppress or extinguish T cell activity related to proliferation or the like) is easily determined by in vitro analysis. For in vitro analysis and the typical materials required to perform the analysis, see the published PCT application number PCT / US95 / 09816, and the pending US patent application serial numbers 08 / 382,454 and serial number 08 / 596,387.
In general, T cells suitably used for the analysis have been transformed, such as T cell hybridomas, T cells isolated from mammals, eg, primates such as humans; rodents such as mice and rabbits; Obtained from a T cell line. Other suitable T cells include: 1) T cell hybridomas that are publicly available or can be prepared by known methods, 2) helper T cells, 3) T cell damaged cells, preferably cytotoxic CD8 ⁺ There are cells. T cells can be isolated from mammals by known methods. See, for example, R. Shimonkevitz et al., J. Exp. Med., (1983) 158: 303.
Perform in vitro analysis as disclosed in the above published PCT application number PCT / US95 / 09816 and pending US patent application serial numbers 08 / 382,454 and 08 / 596,387. Thus, it can be determined whether a molecule can modulate the activity of T cells. In particular, the analysis can be easily applied to the scTCR fusion protein according to the present invention. In general, the analysis is performed in the following 1 to 5 consecutive steps: T cells express an analyzable marker, which indicates the activity of T cells or the activity of T cells that are regulated after activation. Thus, for example, as disclosed in Example 8 below, the mouse T cell hybridoma DO11.10 that expresses interleukin-2 (IL-2) upon activation can be used. By measuring the concentration of IL-2, it can be determined whether a particular scTCR can modulate the activity of the T cell hybridoma. The analysis is generally performed by sequentially performing, for example, the following steps.
1. A T cell hybridoma or a T cell containing a TCR corresponding to the scTCR fusion protein of the present invention is obtained. A typical T cell is a proliferative human CTL, as described above.
2. The T cell hybridoma or T cell is cultured under conditions that allow proliferation.
3. Proliferated T cell hybridomas or T cells are contacted with the scTCR fusion protein described above.
4). The T cell hybridoma or T cell is contacted with an antigen that specifically binds to the TCR (and scTCR fusion protein) and in addition is capable of activating the T cell hybridoma or T cell. Typical antigens include superantigens, sc-MHC class I or class II complexes having the above-mentioned presentation peptides, or suitable APCs.
5. The T cell hybridoma or T cell is contacted with a suitable co-stimulatory factor to provide the signal necessary for activation. Next, the T cell hybridoma or T cell is analyzed with a marker. That is, for example, IL-2 production is measured. If IL-2 production is reduced by, for example, 40% or more in 24 hours, this decrease indicates that the scTCR fusion protein modulates T cell activity and suppresses the immune response.
Example 8 below is a typical example of the analysis.
The T used in the analysis, as disclosed in the above published PCT application number PCT / US95 / 09816 and the pending US patent application serial numbers 08 / 382,454 and 08 / 596,387. Cells are usually incubated under conditions suitable for growth. For example, DO11.10 T cell hybridomas are prepared in complete medium (10% FBS, penicillin / streptomycin, L-glutamine, and 5 × 10 5 ^-Five In RPMI 1640) with M 2-mercaptoethanol added at 37 ° C., CO ₂ It is preferred to incubate under 5% conditions. Usually 10 ^-12 -10 ^-6 A dilution obtained by serially diluting a fusion protein so as to have a concentration of M is added to the culture medium for T cells. The T cell activation signal is preferably supplied by an antigen presenting cell carrying a suitable antigen. The use of an antigen dose and the APC group that activates T cells to a level slightly below the maximum is considered suitable for detecting inhibition of T cell responses to fusion proteins. Yes. A decrease in IL-2 production following contact with the scTCR indicates that the fusion protein regulates T cell activity.
Identification of T cell activity regulation as disclosed in the above published PCT application number PCT / US95 / 09816 and pending US patent applications serial number 08 / 382,454 and serial number 08 / 596,387. Rather than measuring the amount of expressed protein such as IL-2, it is preferably done by measuring changes in antigen-dependent T cell proliferation using radiation labeling techniques well known to those skilled in the art. . For example, detectably labeled (eg, tritiated) nucleotides may be introduced into the culture medium for analysis. Incorporation of such labeled nucleotides into DNA is a measure of T cell proliferation. This analysis is not suitable for T cells that do not require presentation of antigen for growth, eg, T cell hybridomas. This analysis is suitable for measuring the modulation of activity of non-transformed T cells isolated from mammals. A decrease in the level of T cell proliferation following contact with the fusion protein indicates that the molecule can modulate the activity of the T cell and suppress the immune response. See Example 8 and Example 10 below. The in vitro T cell proliferation assay is preferably used to measure the effect of the fusion protein on antigen-specific changes in in vivo T cell clonal proliferation. This analysis is specifically described in Example 11 below.
As described in the Examples below, measurement of IL-2 production or measurement of T cell proliferation can be used for the purpose of examining whether the scTCR fusion protein can regulate the activity of T cells. For example, the decrease in IL-2 production by APC-stimulated T cells following contact with the fusion protein allows the fusion molecule to regulate T cell activity and suppress T cell-mediated immune responses It is shown that.
In vivo analysis can also be used to examine the ability of a fusion protein to modulate T cell activity, such as the ability to inhibit or inactivate T cell development. For example, the ability of the scTCR fusion protein to inhibit immunoglobulin class change (ie, IgM to IgG) can be analyzed. See, for example, P. Linsley et al., Science, (1992) 252: 792-795.
Diagnostic methods using fusion proteins have also been realized as in vivo diagnostic imaging and HLA type analysis (see, eg, AKAbbas, Cellular and Molecular Immunology, Page 328 (WBSaunders Co. 1991)). For in vivo imaging applications, the fusion protein is radiolabeled (eg, ¹²⁵ I, ³² P, ⁹⁹ Tc), or other detectable label that can be administered to a mammal, and the subject is scanned by known methods for the purpose of detecting scTCR binding. Such analysis on mammals can aid in the diagnosis and treatment of many diseases, such as, for example, undesired expression of APC associated with diseases of the immune system.
The analysis can also be used to assess scTCR fusion proteins (or preferably scTCRs obtained from fusion proteins) used for the treatment of autoimmune diseases. For example, as disclosed in the above published PCT application number PCT / US95 / 09816, and pending US patent application serial numbers 08 / 382,454 and 08 / 596,387, allergic experimental Encephalomyelitis (experimental allergic encephalomyelitis (EAE)) is an autoimmune disease in mice and is a recognized model of multiple sclerosis. In one analysis example, a mouse strain is treated to develop EAE, followed by administration of an appropriate scTCR fusion protein (or scTCR obtained from the fusion protein). The animal is then evaluated to see if administration of the fusion protein or scTCR inhibited or prevented the progression of EAE. Such an assay is specifically described in Example 12 below.
The ability of the scTCR fusion protein according to the present invention to contain an immune response (including vaccination against the target diseases described above) can be easily examined by an in vivo test. For example, a fusion protein (or preferably a scTCR obtained from a fusion protein) is administered to a mammal such as a mouse and the blood sample is taken at the first dose and periodically thereafter several times (eg, scTCR fusion protein 2), 5 and 8 weeks after administration. Subsequently, serum is collected from the blood sample and analyzed for the presence of the antigen produced by the immunization. The concentration of the antibody can be determined by a general immunological method.
The present invention also provides a method for administering a DNA segment encoding a fusion protein that expresses the fusion protein in cells of mammals, particularly primates such as humans. Preferably, the DNA having the coding region of the fusion protein is directly injected into the subject's skeletal muscle by a known method under the control of an appropriate promoter such as the CMV promoter. There have been reports on the method of administration of plasmid DNA, the uptake of the DNA into the cells of the subject to which the DNA was administered, and the expression of the protein (J. Ulmer et al. Science, (1993) 259: 1745-1749 reference).
The scTCR fusion protein of the present invention can be applied in various therapeutics. For example, a fusion protein (or preferably an scTCR obtained from the fusion protein) can be administered for the purpose of reducing or eliminating a mammalian immune response. As a result, for example, mammals such as cancer, infectious diseases, allergies, or people suffering from or at risk of autoimmune diseases such as multiple sclerosis, insulin-induced diabetes mellitus, rheumatoid arthritis Can be treated. Administration can be via any suitable means, such as direct administration of DNA encoding the fusion protein. Also suitable for this treatment are patients suffering from or at risk of having an unwanted immune response, such as patients undergoing heart, kidney, skin, or other organ transplant surgery It is. In situations involving transplant rejection, the treatment protocol may be properly initiated before surgery is performed.
In accordance with the present invention, several unique approaches can be used to reduce or eliminate the immune response of a mammal. For example, in one treatment to reduce unwanted immune responses, a suitable scTCR fusion protein (or preferably derived from it) is used to reduce or eliminate the interaction between pathogenic T cells and the antigen. scTCR) is administered in an effective amount. Thereby, T cell-mediated immune responses such as T cell proliferation, differentiation, activation, or B lymphocyte stimulation can be selectively controlled. The fusion protein preferably exhibits an antigen-specific binding affinity that is at least at the same level, and preferably greater, than pathogenic T cells that mediate unwanted immune responses. Particularly preferred in this regard are scTCR mutants that exhibit a large specific binding affinity for the ligands described above.
Administration of antibodies against scTCR or TCR prepared by the methods disclosed herein can be administered to mammals by injection methods such as intraperitoneal injection or intravenous injection. Of the fusion proteins, at least molecules used in therapeutic applications are produced from mammalian cells or other suitable cells and purified prior to use so that they are substantially or completely free of pyrogens. It is preferable. Optimal dosages for certain therapeutic applications may be determined based on conventional means, but generally will depend on the route of administration, patient weight, health status, gender, and factors recognized by those skilled in the art. It varies depending on several factors including:
Administration may be a single administration or continuous administration at day or week intervals. As used herein, “single dose” may be a single dose or a sustained release dose. The subject may be a mammal (eg, a person or a domestic animal such as a cow, or a pet such as a dog or cat) and includes treatment as a pharmaceutical composition comprising an scTCR or antibody. Such pharmaceutical compositions of the present invention are manufactured and used according to procedures known in the art. For example, a formulation comprising a therapeutically effective amount of a fusion protein may be provided as a single dose unit or multiple dose units such as, for example, sealed ampoules and vials, eg, addition of a sterile liquid carrier by water injection only May be stored as a lyophilized state required immediately before use. Liposome formulations are also suitable for many applications. Other compositions may also be used appropriately for parenteral administration, including antioxidants, buffers, bacteriostats, and solutes in an amount that is isotonic with the blood of the target recipient. Water-soluble and water-insoluble sterile infusion solutions, and water-soluble and water-insoluble sterile suspensions, including suspending agents and thickeners, are included.
The method of the present invention comprising reducing or eliminating a T cell response (response) is a known immunosuppressive agent, antiviral agent, anticancer agent, for the purpose of providing a more effective treatment for a T cell mediated disease. Or you may carry out together with an anti-inflammatory agent. For example, fusion proteins are used with conventional immunosuppressive drugs such as cyclosporin or anti-inflammatory drugs such as corticosteroids and non-steroidal drugs for the treatment of autoimmune diseases and allergies. be able to.
As noted above, scTCR fusion proteins (or scTCR molecules separated therefrom) can be used to produce antibodies by methods generally known in the art and are typically generated as purified samples of fusion proteins. Is done. In most cases, scTCR fusion proteins selected to increase antibody production are first degraded to remove bacteriophage coat protein or fragments thereof, as described above. The scTCR thus obtained is used as an immunogen. Antibodies can also be constructed from immunogenic peptides consisting of one or more epitopes of the scTCR of interest.
More specifically, antibodies immunize mammals with purified samples of scTCR fusion protein, scTCR molecules isolated from the fusion protein, or the immunogenic peptides described above (alone or in complex with an appropriate carrier). It is obtained by doing. Preferably scTCR molecules are used as immunogens. Suitable mammals also include common laboratory animals such as sheep, goats, rabbits, guinea pigs, rats, and mice. Rats and mice, particularly mice, are preferably used for the purpose of obtaining monoclonal antibodies. The antigen can be administered to the mammal by any of a number of routes such as subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intramuscular injection, and intradermal injection. The optimal immunization interval, immunization amount, and the like can be within a relatively large range and can be experimentally determined based on the disclosure herein. In normal procedures, the antigen is injected several times over several weeks. Antibodies are collected from immunized animal sera in a conventional manner and screened to detect specific antibodies against the scTCR. Of particular note are antibodies that bind specifically to the V-α or V-β chain, particularly the highly variable region of the chain, eg, recognize linear or conformational epitopes on the region. It is an antibody. Monoclonal antibodies can be produced in cells that produce antibodies and in cells that are used to produce monoclonal antibodies using standard fusion methods for hybridoma cell formation (G. Kohler, et. al., Nature, (1975) 256: 456). Usually, this involves the step of fusing antibody-producing cells with an immortal cell line such as myeloma cells to produce hybrid cells. Alternatively, monoclonal antibodies may be produced from cells by the method of Huse, et al., Science, (1989) 256: 1275.
One suitable protocol is immunization by intraperitoneal injection of mice performed for about 2-7 months using a composition comprising purified scTCR complex. Thereafter, spleen cells can be removed from the immunized mouse. The serum of immunized mice is analyzed by titration with an antibody specific for scTCR prior to excision of spleen cells. The excised mouse spleen cells are then fused with a suitable homogeneous or heterogeneous (preferably homogeneous) lymphoid cell line. The lymphoid cell line is hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase deficiency (HGPRT). ^- )) Or thymidine kinase deficiency (TK) ^- )). Preferably, myeloma cells are used as the lymphoid cell lineage. Bone marrow membrane cells and spleen cells are mixed at a ratio of spleen cells 4 to bone marrow membrane cells 1, for example. These cells can be fused by the polyethylene glycol (PEG) method (see G. Kohler, et al., Nature, Supra). The hybridoma thus cloned is cultured in, for example, RPMI-1640 medium (see GE More, et al., Journal of American Medical Association, (1967) 199: 549). Hybridomas grown after the fusion treatment are screened by radioimmunoassay or enzyme immunoassay using the secretion of antibodies that specifically bind to purified scTCR. Antibodies containing serum can also be screened using the ELISA method according to conventional methods. Hybridomas that show positive results for such screening treatment can also be propagated and cloned by limiting dilution culture. Preferably, further screening is performed to select antibodies capable of binding to scTCR in solution and in live samples. The isolated antibody can be further purified by a suitable immunological method such as affinity chromatography.
In some applications, a chimeric antibody derivative that specifically binds to scTCR (eg, an antibody molecule that binds a variable region of a non-human animal and a human constant region), thereby producing a subject (human) It may be preferable to reduce the immunogenicity in the body compared to the corresponding non-chimeric antibody. Such a chimeric antibody is produced, for example, by a method of producing a human variable region chimera in which a conserved region originates in humans and only a hypervariable region originates in non-humans in some parts of the variable region, particularly in the antigen binding region Various types can be obtained. (SLMorrison, Science, (1985) 229: 1202; Oi et al., BioTechniques, (1986) 4: 214; Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1983) 80: 7308-7312; (See Kozbor et al., Immunology Today, (1983) 4: 7279; Olsson et al., Meth. Enzymol., (1982) 9: 3-16, and human chimeric antibodies and methods for producing them).
The term “antibody” as used herein generally refers to whole immunoglobulins and immunologically active fragments that bind to the scTCR. Immunoglobulins, and immunologically active fragments thereof, contain antibody binding sites (peritopes that can specifically bind to fusion proteins). Examples of antibody fragments include, for example, Fab, F (v), Fab ′, F (ab ′) ₂ Fragments, “half molecules” obtained by reducing the disulfide bonds of immunoglobulins, single chain immunoglobulins, and other antigen binding fragments (eg, Bird et al., Science, (1988) 242; Huston et al., PNAS, (USA), (1988) 85: 5879; see Webber et al., Mol. Immunol., (1995) 32: 249). The antibody, or immunologically active fragment thereof, can be animal (eg, rodents such as mice and rats) or chimeric (eg, Morrison et al., PNAS). (1984) 81: 6851; Jones et al, Nature, (1986) 321).
“Specific binding” and like terms mean that a molecule disclosed herein binds to another molecule to form a specific binding pair. However, the molecules are, for example, Western blotting ELISA, RIA method, mobility shift assey, enzyme-immuno assay, competitive assay (competitive assey). ), Saturation molecules, or other molecules obtained by other protein binding assays known in the art, and do not bind to them. For examples of methods for detecting specific binding between molecules, see generally Ausubel, et al supra; Sambrook, et al, supra; Harlow and Lane, supra and references therein.
All references cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
Examples of the present invention are shown below, but the present invention is not particularly limited thereto.
Example 1-Formation of a soluble scTCR fusion protein
The DNA sequence of mouse DO11.10 cell TCR has been reported (Kappler, J. et al. PNAS (1994) 91 8462). TCR is 1-A ^d It recognizes and binds to chicken ovalbumin (OVA) peptide spanning amino acids 323-339 contained in MHC class II molecules. DNA encoding TCR was generally prepared according to the method disclosed in Kappler and Marrack, supra.
In brief, 1 × 10 ⁶ Individual DO11.10 cells were isolated using oligo-dT coated magnetic beads according to the manufacturer's instructions (Dynal). TCR α-chain cDNA was obtained by incubating a mixture comprising C-α-specific “back” primer KC113 (SEQ ID No. 6) and DO11.10 mRNA. Subsequently, standard amounts of nucleotides and reverse transcriptase were added to the mixture to obtain the cDNA. A β-strand cDNA was obtained in the same manner, but the “back” primer KC111 (SEQ ID No. 4) was used instead of the KC113 primer. A PCR reaction was carried out in the presence of primer KC112 (SEQ ID No. 5) and KC113 using the alpha chain cDNA as a template, and a 650 bp 5′XhoI-3′XmaIα chain fragment was amplified. The 750 bp β-strand was amplified by PCR using primers KC111 and KC110 (SEQ ID NO. 3), which in turn contain SfiI and SpeI sites at the 5 ′ and 3 ′ ends, respectively.
The scTCR was constructed from DO11.10 TCR in a form containing a covalently linked V-α chain and V-β chain. In some cases, the V-α chain further included a C-α chain fragment and a C-β chain fragment (see, eg, FIGS. 3 and 6A, 6B). In general, the Cα chain fragment had a length of about 9 amino acids. The C-β chain was usually cleaved at amino acid residue 126 immediately preceding amino acid residue 127 (ie, cysteine residue) in the full length C-β chain. The inclusion of this cysteine residue has been found to be detrimental to scTCR expression. The 3 ′ end of the V-β chain (or C-β chain) fragment is usually labeled with a bacteriophage gene III coat protein or a fusion protein purification label encoding bacteriophage gene IV coat protein (eg, EE or 6xHis) DNA was added.
Example 2-Vector for scTCR fusion protein expression
The scTCR DNA obtained in Example 1 was inserted into a vector having a strong bacterial promoter (phoA) or a weak bacterial promoter (lacZ). The vectors used to express the scTCR are the pJRS149 and pKC12 DNA vectors shown in FIGS. 1A and 1B, respectively. These vectors allow the fusion of the scTCR to the bacteriophage coat protein. The construction of a DNA vector encoding the fusion protein is outlined in FIG. 2 and below.
A. DNA vector pJRS149
pJRS149 DNA vector is pBluScript ^TM (Invitrogen) A phagemid with a backbone. This vector is used to generate soluble scTCR fusion proteins used in the bacteriophage display experiments described in Examples 14-18 below.
B. DNA vector pKC12
The DNA encoding gene III was cloned into the pKC12 vector shown in FIG. 1B.
C. DNA vector pKC14 and vector pKC15
The gene VIII DNA sequence consists of fd tet bacteriophage (ATCC No. 37000) as a template, primer OPR156 (“front” SEQ ID NO. 58), and primer OPR157 (“back” SEQ ID. NO. 59). Was amplified by the PCR method. Subsequently, the PCR product of gene VIII was cloned into the vector pLL001 as an XmaI-EcoRI fragment to obtain the vector pKC14. The pLL001 plasmid is derived from PUVC-19 DNA and contains XmaI and EcoRI sites in its polylinker region so that the gene VIII segment can be subcloned. The pLL001 vector is used as a shuttle vector for cloning the gene VIII DNA. The vector pKC15 is derived from pKC14 and is obtained by cloning a 96 bp NcoI-EcoRI fragment into the pJRS149 vector shown in FIG. The NcoI-EcoRI fragment comprises a synthetic polylinker with multiple cloning sites (eg, SfiI, NcoI, SpeI, XhoI and XmaI), a pelB leader, a phoA promoter, and the gene VIII gene. Vector pKC15 has a second pelB leader derived from the pJRS backbone and allows gene cloning under the control of a di-cistronic operon.
D. DNA vectors pKC16 and pKC18
To clone the XhoI-XmaI fragment from pKC16, the alpha chain cDNA was TCRed using primers KC113 (SEQ ID NO: 6) (“front”) and KC112 (SEQ ID NO. 5) (“back”). It was used as a template for amplifying V-α and C-α genes. V-β and C-β gene fragments were prepared using primer KC110 (SEQ ID NO. 3) (“front”), primer KC111 (SEQ ID NO: 4) (“back”), and β-chain cDNA as a template. Amplified by the conventional PCR method. Subsequently, the gene fragment was cloned into pKC15 to obtain the vector pKC18.
FIG. 3 shows the pKC44, pKC46, and pKC51 DNA vectors used in these experiments. The outline of DNA vector formation from pKC15 is shown in FIG. 2 and below.
E. DNA vectors pKC27, pKC42, and pKC44
Vector pKC27 is formed by annealed primers JA301 (SEQ ID NO.95) and JA302 (SEQ ID NO.96), thereby (G _Four S) _Four A polypeptide linker was obtained. The linker was then cloned into the pKC15 vector as a SpeI-XhoI fragment. Subsequently, V-α13.1 and V-β, C-β regions were each cloned into pKC27 DNA. Briefly, the V-α13.1 gene fragment consists of the vector pKC16 DNA as template and primers KC114 (SEQ ID NO: 7) (“front”) and KC126 (“back”) (SEQ ID NO: 19). And amplified using the PCR method. The V-α13.1 gene was cloned into pKC42 as a SfiI-SpeI fragment. V-β8.2 and C-β chain DNA were gel purified after pKC18 was cleaved with XhoI and XmaI. This fragment was cloned into pKC42 in order to obtain the pKC44 vector. In general, the pKC44 vector was constructed to contain scTCR in the form of a scTCR / gene VIII fusion protein under transcriptional control by the phoA promoter.
F. pKC12, pKC45, pKC46, and pKC51 DNA vectors
The outline of formation of vectors pKC45, pKC46, and pKC51 from pKC12 (FIG. 2) is described in FIG. 4 and described below.
The pKC12 vector was modified so that the DNA of Example 1 encoding scTCR was expressed under the transcriptional control of the lacZ promoter. Briefly, the pKC12 vector contains the annealed primer KC134 (SEQ ID NO: 27) (“front”) and primer KC135 (SEQ ID NO: 28) (“back”) within pKC12 to obtain the pKC45 vector. Modified by cloning into This modification added an additional XmaI site to the polylinker region of pKC12 that already contains an SfiI site (site) and an EcoRI site. PKC45 also contained a DNA sequence encoding gene VIII attached to the 5 'end of the EE-tag and an amber stop codon.
The amber stop codon is a lacI such as XL1-blue. ^q Within the amber suppressor host, the expression level of the scTCR fusion protein was reduced by about 15-20%. In order to clone the DNA encoding the scTCR / gene VIII fusion protein into pKC45, pKC44 DNA was split (cut) with SfiI and XmaI. The scTCR fragment was then cloned into pKC45 after gel purification to obtain pKC46. The scTCR insert into pKC46 is fused to the EE-tag and gene VIII coat protein as shown in FIG.
The scTCR / gene VIII fusion protein was placed under the transcriptional control of the lacZ promoter by digesting (cutting) the pKC44 and pKC46 vectors with XmaI and EcoRI. The DNA sequence of gene VIII was isolated from the digested pKC44 DNA and cloned into the vector DNA pKC46 gel-purified as SfiI and XmaI fragments to obtain the vector pKC51. The scTCR insert in vector pKC51 was then fused with gene VIII coat protein, as shown schematically in FIG. 3c. Unlike the vector pKC46, the pKC51 vector does not contain an EE-tag and an amber stop codon.
Example 3 Cloning of DNA Encoding Fusion Protein into DNA Vector pEN2
The expression of the soluble scTCR produced in Example 1 was increased by subcloning into the pEN2 vector as shown in FIG. The pEN2 vector has a phoA promoter, a gene 10 ribosome binding site, and a modified pelB leader. The soluble scTCR insert in the pEN2 vector format is shown schematically in FIGS. 6A and 6B and described below. In FIGS. 6A and 6B, the DNA vector is constructed from the pEN2 vector.
A. Construction of DNA vector pKC60
The pKC60 vector was obtained by introducing a 1204 bp SfiI-EcoRI fragment into pEN2. The SfiI-EcoRI fragment consists of V-α, V-β, and C-β regions (domains). This fragment was obtained by amplifying pKC51 DNA as a template (template) using primers KC114 (“front” SEQ ID NO: 7) and JWTCR208 (“back” SEQ ID NO: 75). The JWTCR209 primer contains an EE-label and an XmaI site (site) at the 3 ′ end of the C-β region. The addition of the XmaI site facilitated the cloning of gene III and gene VIII. The pKC60 vector was obtained by cloning the scTCR XmaI-EcoRI fragment described above into the pEN2 vector.
B. Construction of DNA vector pKC61
To form the cleaved scTCR, the V-α and V-β sequences of vector pKC46 were used with primers KC115 (“front” SEQ ID NO: 8) and JWTCR 209 (“back” SEQ ID NO: 74). Amplified by PCR. The formed PCR amplification product was subcloned into vector pKC60, thereby obtaining vector pKC61. The pKC61 vector was further modified by adding a 6XHis tag to the 3 'end of the EE tag sequence.
C. Construction of pCK62 and pKC64 DNA vectors
DNA encoding bacteriophage gene III was amplified using pKC64 vector DNA as a template and using primers TCR215 (SEQ ID NO 68) and 218 (SEQ ID NO 64). Subsequently, the DNA was cloned into pKC60 to obtain vector pKC64. The gene VIII gene was amplified using the vector pKC51 DNA as a template and using primers TCR212 (SEQ ID NO 71) and 213 (SEQ ID NO 70) and cloned into pKC60 to obtain vector pKC62 .
D. Construction of DNA vectors pKC63 and pKC65
The gene III (pKC65) and gene III (pKC63) fusion proteins are cloned into the vector backbone pKC61 after the corresponding gene fragments are amplified by the PCR method. This causes both pKC65 and pKC63 to contain the 6XHis tail encoded in the primer sequence.
E. Construction of pKC66 and pKC67 DNA vectors
The pKC66 and pKC67 vectors consist of a V-α chain fragment, and a SfiI-SpeI fragment comprising the first 8 amino acids of the C-α chain fragment, pKC51 DNA as a template, and primer KC114 (front SEQ ID NO : 7) and JWTCR217-β (Buck SEQ ID NO: 66). To obtain pKC66 and pKC67 vectors, TCR DNA was amplified by PCR using KC114 and JWTCR217-β primers. The amplified DNA was then subcloned into pKC62 or into pKC60 previously digested with SfiI and SpeI. Each of these vectors contains 8 amino acid residues counted from the N-terminus of the C-α region. These vectors are used to form the TCR library described below. Vector pKC66 contains the gene VIII gene.
The DNA vectors pKC46 (pSUN18) and pKC62 (pSUN19) are deposited according to the Budapest Treaty with the American Type Culture Collection (ATCC) of 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. These DNA vectors were deposited with the ATCC on February 26, 1997 and designated Accession Nos. 97895 (pSUN18) and 97896 (pSUN19). The DNA vector pKC62 (pSUN19) comprises a phoA promoter, a modified pelB sequence, a gene 10 ribosome binding site, and a bacteriophage gene VIII promoter. The DNA vector pKC46 (pSUN18) comprises a lacZ promoter, an EE tag, and a bacteriophage gene III protein. These DNA vectors are described in E.C. can be grown by standard methods in E. coli or other suitable host cells.
The DNA vectors pKC46 (pSUN18) and pKC62 (pSUN19) are designed to accommodate various Vα, Vβ-Cβ and polypeptide linker sequences. The Vα chain of both these DNA vectors can be excised by restriction digestion of SFiI and SpeI. The Vβ-Cβ chain can be excised by restriction digestion with XhoI-XmaI. In these DNA vectors, peptide linker sequences can be exchanged by restriction digestion with SpeI and XhoI.
Example 4-Regulation of TCR fusion protein expression
1. phoA promoter
XL1-B cells were transformed with the vector pKC44 containing the phoA promoter. Transformed cells were grown overnight in medium containing phosphate to prevent induction of the scTCR fusion protein. When phosphate is removed from the medium, scTCR / gene VIII protein is expressed. After growing overnight in a shaker flask, the cells were washed several times with phosphate-deficient medium. Expression of the scTCR fusion protein was initiated by resuspending the washed cells in phosphate deficient medium. Cells were harvested after 4 hours of induction. In general, induction for 4 hours provides an appropriate level of soluble scTCR / gene VIII fusion protein that can be analyzed by Western blot analysis. Higher yields of scTCR / gene VIII fusion protein under the control of the phoA promoter (eg, between about 10-400 mg) can generate cells in 3-10 liter fermenters, or other large scale production such as bioreactors. It is obtained by growing in a container.
In general, vectors containing the phoA promoter were used more favorably than vectors containing other promoters such as Lac. Also, expression using the pEN2 vector has been particularly preferred for a number of reasons. For example, in addition to the phoA promoter, the pEN2 vector contains a gene 10 ribosome binding site that enhances translation. The pEN2 vector is E. coli. It further includes a pelB leader peptide modified to contain codons suitable for E. coli. The modified pelB leader sequence and peptide are illustrated in SEQ ID NOs: 129 and 130. The Western blot shown in FIG. 7 shows that such modifications significantly improve the expression of the scTCR fusion protein by about 10-50 times.
The Western blot shown in FIG. 7 was probed with anti-EE labeled antibody (1: 5000 dilution) and then probed with goat anti-mouse HRP antibody (1: 20000 dilution). Visualization was performed by standard immunological techniques. Lane 1 shows molecular weight markers (Amersham). Lane 2 shows 5 microliters of 10 OD / ml pKC60-derived scTCR (induced). Lane 3 has the same conditions as Lane 2 except that it is not derepressed. Lane 4 shows 5 microliters of 10 OD / ml pKC51-derived scTCR (without EE label). Lane 5 shows 5 microliters of pKC46-derived scTCR induced with 50 OD / ml IPTG.
2. LacZ promoter
The scTCR / gene III (vector pKC46) and scTCR / gene VIII (vector pKC51) fusion proteins were expressed in about 3 liters of fermenter. When the scTCR fusion protein was expressed under transcriptional control by the phoA promoter, a larger amount of fusion protein was produced than when a vector containing the Lac promoter was used. Thus, scTCR fusion proteins were generally expressed using vectors containing the phoA promoter.
Example 5-Expression of scTCR fusion protein system
Some E. E. coli strains (lines: XL1-B, MM294, TB1, UT5600, and K91Kan) were analyzed for their ability to express the scTCR fusion protein. The above host cell line was transformed with pKC60 to express the scTCR fusion protein obtained in Example 4. All transformed lines were adapted to grow in 30 ° C phosphate medium. Induction of the scTCR fusion protein was performed by growing in phosphate deficient medium. The level of scTCR expression was determined by Western blot analysis as shown in FIG. In FIG. 8, lane 1 shows a molecular weight marker (Amersham). Lane 2 shows 4 microliters of 10 OD / ml MM294 lysate (pKC60). Lane 3 has the same conditions as Lane 2 except that the host strain is K91Kan. Lanes 4 to 6 also have the same conditions as Lane 2 except that the host strains are XL1-B, TB1, and UT5600 in this order. All immunoprecipitations (precipitates) were prepared from phoA-derived cells with a soluble cell fraction. Briefly, Western blots were performed by adding 5 μl of 5 OD / ml cell suspension of transformed cells on a 12% SDS-PAGE gel followed by blotting by standard Western blotting. It was copied to. The scTCR was detected by probing the blot with an anti-EE labeled antibody approved by Gernot Walter's Labratory, University of San Diego, San Diego Calfornia. Alternatively, other anti-EE labeled antibodies and EE labels can be used (eg, obtained from pharmacia). After binding the antibody, a conjugate labeled with goat anti-mouse HRP (Jackson Laboratories) was added. The expression of the scTCR fusion protein was maximal in the K91Kan line (FIG. 8).
Example 6-Purification of scTCR fusion protein
The fusion protein encoded by vector pKC51 was purified from transformed cells by conventional immunoaffinity chromatography. FIG. 9 schematically shows the purification of the scTCR / gene VIII fusion protein by immunoaffinity chromatography.
Briefly, purification is performed by coupling 5 mg of hamster anti-mouse αβTCR antibody H57-597 (ATTC Accession HB-218) to 1 ml of protein-A coated Sepharose beads. Made by creating. E. The E. coli lysate was obtained by dissolving 50 g of cell paste removed from the fermenter in 100 ml of lysis buffer (0.05 M Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl and 5 mM EDTA). The cells after resuspension were lysed by two routes using a French press. Insoluble material was removed by centrifugation at 10,000 G for 20 minutes. The supernatant was retained and applied to the antibody column at a flow rate of 0.2 ml / min. The column is then washed with 20 column volumes of PBS, the bound scTCR fusion protein is eluted with 0.1 M glycine (pH 3.0), and a 1 ml fraction thereof is 2 M Tris 0.05 ml (pH 8.0). Collected in a tube containing. Fractions containing scTCR were pooled and dialyzed overnight against 4 liters of PBS. The next day, the purified protein was concentrated 5 to 10 times using a Centricon filtration device (mw 100 cut-off).
The purity of the obtained scTCR protein was evaluated by electrophoresis on an SDS-PAGE gel followed by Coomassie brilliant blue staining. Protein integrity was determined by Western blot analysis using antibody H57-597 or anti-Glu-Glu (EE) labeled antibody as a probe. The EE antibody recognizes a linear epitope consisting of 9 amino acids, EEEEYMPME (SEQ ID NO 98) (FIG. 10). Two other antibodies that bind to the V-β8.2 conformational epitope (MR5-2 antibody and F23.1 antibody (PherMingen)) were also used for purification of the scTCR fusion protein. Ni ²⁺ To facilitate purification of the scTCR protein by NTA affinity chromatography, a 6XHis tail (tail) was added to some structures (see Figure 6A).
FIG. 10 shows the pTCC protein from pKC51 (lane 2), pKC46 (lane 3), pKC46 (lane 5) purified with the H57 antibody column, refolded and purified with the H57 column. It represents a Western blot showing expression. Lane 7 was given about 5 times the amount of fusion protein compared to Lane 1 or 6. Molecular weight markers are shown in lane 1. Flow through from the soluble column fraction (lane 1) and insoluble column fraction (lane 10) is also shown. Lanes 4 and 8 are blank. The blot was probed with a 1: 5000 dilution of anti-EE labeled monoclonal antibody and then visualized with a 1: 20,000 dilution of goat anti-mouse HRP antibody. Coloring was done by standard methods.
Example 7-Characterization of scTCR fusion protein
An anti-αβ TCR mAbs panel was used for characterization of scTCR fusion proteins. The hamster mAb H57-597 recognizes an epitope on the C-β region. A competition test was performed and showed a competitive effect between MR5-2 and H57-597. This suggests that the epitope joined by the individual antibody is proximal. Other antibodies such as polyclonal sheep anti-bacteriophage sera (Phermacia) with specificities in the EE sequence consisting of 9 amino acids and the gene III and gene VIII proteins, engineered into the same TCR molecule Used for feature analysis.
A. Molecular weight
The scTCR / gene VIII fusion protein expressed from vector pKC51 was subjected to 12% SDS-PAGE gel and then stained with Coomassie blue (see FIG. 11). In FIG. 11, lane 2 shows the fusion protein produced from a 10 OD / ml culture of XL1-B cells. Lane 3 of FIG. 11 shows the flow-through from the H57 antibody column used to purify the scTCR. Lane 4 in the figure shows purified scTCR from the column. Lane 1 in FIG. 11 shows molecular weight markers. Observation of the gel revealed that the scTCR fusion protein migrated within the gel to a position of approximately 46 kD. This result indicates that the scTCR is complete.
The Western blot shown in FIG. 12 was probed with an antibody that binds to an EE-tag, bacteriophage protein, or epitope within the C-β region, respectively, of a protein with a molecular weight of 46-50 kd (FIG. 12). ScTCR fusion proteins produced from other DNA vectors were analyzed in a similar manner.
B. Conformational Folding
The fusion protein encoded by the pKC60 DNA vector was tested for binding using anti-V-β8.2 antibodies (MR5-2 and F23.1) and anti-idotype mab KJ1 (kindly courtesy of Dr. Kappler and Marrack). The suitability of the folded structure was tested. The scTCR fusion protein was incubated overnight at 4 ° C. with anti-V-β8.2 antibody and the next day, bound with goat anti-mouse coated magnetic beads (Dynal). This material was incubated for an additional hour at room temperature (RT). Immune complexes were precipitated by standard procedures. The beads were then carefully washed with 0.5 ml PBS + 0.5M NaCl to remove non-specifically bound protein. After four washes, the magnetic beads were resuspended in 50 μl of cracking buffer with SDS with or without β-2 mercaptoethanol and boiled for 3 minutes each. Subsequently, the magnetic beads were removed and the solution was subjected to 12% SDS-PAGE and exposed to 120 volts for 1 hour. Thereby, the sample was electrophoresed. Subsequently, the resulting blot was probed with an HRP-labeled anti-TCR antibody (H57 obtained from Phermingen) or an anti-EE-labeled antibody, and Western blotting of the sample was performed (FIG. 13).
FIG. 13 shows the western blot probed with a 1: 5000 dilution of anti-EE labeled antibody, followed by visualization with a 1: 20,000 dilution of goat anti-mouse-HRP. . Both pKC60 and pKC62 cultures were induced by phosphate deficiency. Lane 1 shows 10 microliters of a 10 OD / ml sample of the pKC soluble fraction. Lane 2 shows the immunoprecipitation of the pTCC60-derived scTCR fusion protein formed by the MR5-2 monoclonal antibody. Lane 3 shows immunoprecipitation obtained in the same manner as Lane 2 except that MAbF23.1 is used. Lane 4 shows immunoprecipitation of the scTCR fusion protein derived from pKC60 formed by MAbKJ1. Lanes 5 to 8 correspond (similar) to lanes 1 to 4 in order except that the scTCR fusion protein derived from pKC62 was analyzed. All lanes are from induced cultures. This data suggests that the scTCR protein has a conformationally correct V-β moiety.
3. Surface plasma resonance analysis (BiaCore)
The scTCR fusion protein encoded by pKC51 was further characterized by surface plasma resonance analysis (FIG. 14). The fusion protein was first detected by a conventional sandwich assay in which scTCR molecules were captured on a biosensor chip coated with MR5-2 or H57 antibody. This detection was generally performed according to the manufacturer's instructions (Phermacia). Generally, when one of the antibodies is used to capture a scTCR fusion protein, the other antibody is used to form a sandwich complex. The data suggested that the two antibodies recognized different regions of the β chain and competed for binding to scTCR (FIG. 14). FIG. 15 schematically shows the interaction. The scTCR can also be further bound by an anti-M13 antibody, indicating that a bacteriophage protein is present on the scTCR fusion protein.
Superantigens (eg, SAg) can bind to several V-β chains regardless of presentation in the MHC format. The interaction between TCR and SAg occurs in the highly variable 4 (HV4) region of the V-β chain. The interaction between SAg and the HV4 region depends on the conformation. Therefore, surface plasma resonance analysis was used to determine whether scTCR protein can bind to SAg coated on the chip (FIG. 16). SAg is known to bind to TCR V-β8.2. Of the surface plasma resonance analyses, the highest reported affinity is 5 × 10 ^-Five This interaction is believed to be molar and this interaction is comparable to the TCR-MHC / peptide interaction.
Streptococcus SAg known as SEC3 (Toxin Technology, Tempa FL.) Was coupled to the chip using standard amine coupling chemistry techniques. The purified scTCR fusion protein was passed over the chip at a concentration in the range of about 2 μM to 16 μM and at a flow rate of 2 μl / min. As a control, measurement of non-specific binding between the fusion protein and the blank chip was performed in parallel with the measurement experiment of specific binding with the chip coated with SEC3. Binding data was compiled by comparing the differences in scTCR binding between the two chips. The data showed that there was a specific interaction between the scTCR fusion protein and the SEC3 SAg on the chip. Furthermore, these data support antibody binding data, suggesting that the scTCR comprises a conformationally correct V-β8.2 region (FIG. 16).
Example 8-Activity of fusion proteins in OVA-specific T cell hybridoma binding assay
A cell-based competitive (competitive) inhibition assay was used to examine the function and biological effects of scTCR fusion proteins. In general, the fusion protein (derived from T cell hybridoma DO11.10) purified in Example 4 was used for the purpose of blocking DO11.10 cells from the antigen captured in MHC molecules. The interaction was detected by measuring IL-2 production.
As noted above, examples of analyzes for testing the functionality of scTCR fusion proteins include the published PCT application number / US95 / 09816 described above, and the pending US patent application serial numbers 08 / 382,454 and 08/596. 387. In particular, the above-investigated U.S. patent application Ser. No. 08 / 596,387 includes a T cell hybridoma cell assay, cells used in the assay (eg, DO11.10), sc-MHC class I and II molecules, Sc-MHC IA with covalently or non-covalently bound presentation peptide (eg OVA or HSVgD12 peptide) _d Class II molecules are disclosed.
A) T cell hybridoma cell assay
T cell hybridoma assays that test the functionality of scTCR-derived protein molecules are described in the above published PCT application number / US95 / 09816 and pending US patent applications serial numbers 08 / 382,454 and 08 / 596,387. ing.
Briefly, the DO11.10 T cell hybridoma line expresses a cell surface T cell receptor having specificity for a 17 amino acid OVA peptide fragment (amino acids 323-339) derived from chicken ovalbumin. The OVA peptide is presented to DO11.10 cells by APC expressing mouse class II MHC molecule I-Ad. When the peptide is presented by the appropriate APC, DO11.10 cells respond to produce IL-2, which can be used as an indicator of T cell activity. An example of a T cell hybridoma cell assay is briefly shown below.
The sc-IAd / OVA complex is composed of DPBS (Mg ²⁺ And Ca ²⁺ Diluted without ions) and passively fed into the wells of a 96 well plate. The sc-IAd / OVA peptide preferably includes a covalently linked presentation peptide. After overnight incubation at room temperature, the wells were washed with Mg ²⁺ And Ca ²⁺ You may wash twice with ion-free DPBS. About 1 × 10 ^Five DO11.10 cells are incubated at 35 ° C. for 4 or 7 hours with or without wells fed with 0.5 μg MHC / peptide molecules.
To further demonstrate the specificity of the scTCR fusion protein, a second T cell hybridoma (gD) that recognizes the IAd restricted but HSV peptide can also be used. gDT cell hybridomas are disclosed in the above-invested US patent application serial number 08 / 596,387. This test is performed to demonstrate that: That is, the scTCR fusion protein can inhibit IL-2 production by DO11.10 hybridoma cells, while it has a very small, if any, inhibitory effect on IL-2 production by gD12T cell hybridomas. It is for demonstrating having. Culturing was performed on 96-well flat-bottomed microplates in complete medium (RPMI 1640 supplemented with 10% FBS, penicillin / streptomycin, and L-glutamine). After 4 or 7 hours of incubation, the culture supernatant was analyzed by the IL-2 sandwich ELIZA method for the presence of IL-2.
Suitable IL-2 detection protocols are described in the above published PCT / US95 / 09816 and pending US patent application serial numbers 08 / 382,454 and 08 / 596,387. The protocol of the IL-2 sandwich ELIZA method performed here is basically the one described in PharMingen. Briefly, wells are coated with 50 μl of 2 μg / ml rat anti-mouse IL-2 antibody. After incubating the antibody at 4 ° C. overnight, it is bound to the plastic by passive diffusion. Plates are washed twice with PBS / 0.5% Tween-20. Thereafter, 100 μl of cell culture supernatant is added to each well and incubated for 4 hours at room temperature. The plate is then washed 6 times with PBS / Tween before the biotinylated rat anti-mouse IL-2 antibody, ie the second antibody, is added. The antibody is incubated for 1 hour at room temperature, after which the plate is washed 6 times with PBS / Tween. Finally, 100 μl of 25 μg / ml strepavidnperoxidase is added to each well and incubated for 30 minutes at room temperature. After washing 8 times with PBS / Tween, 100 μl of ABTS substrate is added and the signal is read at OD405 nm. The concentration of produced IL-2 was quantified by plotting against an IL-2 standard curve. IA for activation of DO11.10 and gD12 cells ^d / The optimal dose of peptide molecules is to promote a response slightly lower than the maximum response. Therefore, experiments can be performed in wells coated with 0.5 μg I-Ad / peptide and 4 or 7 hours incubation.
Concerning the soluble scTCR fusion protein of the present invention, its concentration is 10 ^-9 -10 ^-Four Within the range of M, it can be tested for the ability to block the production of IL-2 in DO11.10 cells. The test can be performed with a molar ratio of soluble scTCR to soluble I-Ad / peptide molecule coated on the plate in the range of about 10: 1 to 1: 1. The concentration can be adjusted as needed. What is expected is a decrease in IL-2 production of DO11.10 after preincubation in the presence of soluble scTCR fusion protein compared to gD12, which indicates that soluble scTCR fusion protein is TCR specific. It is shown that it can suppress an immune response.
Since TCR has low binding affinity for MHC / peptide, it is not always possible to observe a decrease in IL-2 production using scTCR fusion proteins in inhibition assays. However, the affinity of the interaction can be increased by constructing a multivalent scTCR fusion protein. Increasing the affinity of the scTCR fusion protein (and preventing its dissociation) is believed to reduce the amount of TCR that is given the opportunity to bind to the MHC / peptide complex.
Example 9-Preparation of multivalent fusion protein
There are several well-known methods for creating multivalent molecules. The multivalent fusion protein is obtained by biotinylating scTCR by a standard method, and then cross-linking after adding streptavidin to the molecule. According to biotin-streptavidin conjugation, a tetrameric multivalent fusion protein is usually formed.
Multivalent fusion proteins can also be obtained by covalently binding the fusion protein to latex beads (Polysciences, Inc. Warrington, PA) according to known methods (see, for example, Newman, SL et al. J. Immunol. (1995) 154,753). Can be created. For example, the scTCR fusion protein can be directly attached to the bead via an amine group or a disulfide group. ScTCR denaturation can be minimized by coating the latex beads with an antibody that specifically binds to strepavidin or scTCR. For example, if the scTCR includes an EE-label as described above, the EE-labeled antibody can be used to coat latex beads.
Example 10-Effect of scTCR fusion protein on antigen-stimulated T cell proliferation in vitro
The soluble fusion protein formed in each of the above examples can be tested for its ability to suppress antibody-stimulated T cell proliferation. Examples of such tests are described in the above published PCT application number / US95 / 09816 and pending US patent application serial numbers 08 / 382,454 and 08 / 596,387.
In one of the methods described in this published PCT application number / US95 / 09816 and in the pending US patent application serial numbers 08 / 382,454 and 08 / 596,387, T cells can be Isolated from other mammals. For example, OVA-primed T cells from BALB / c mice (MHC class II: I-Ad) were immunized by subcutaneous injection with 50 μg OVA323-339-KLH in complete Freund's adjuvant. (See Harlow and Lane, Supra). For example, two immunizations can be performed at 7-day intervals, one week after the second injection, the mice are dissected, the sputum and lymph glands are excised, dispersed and single-cell suspended A liquid is obtained. Thereafter, the antigen-presenting cells are removed from the single cell suspension by incubation with nylon wool and Sephadex G-10 columns. The purified T cell population is further incubated with Click's medium alone or with scTCR fusion protein dissolved in Click's medium.
Activated B cells from BALB / c mice are used as antigen presenting cells in conventional B cell proliferation assays. For example, B cells are prepared by the following method. That is, 50 μg / ml LPS (ie, liposaccharide) is added to spleen cells and cultured for 48-72 hours. After completion of the culture, the activated cells are isolated by density gradient centrifugation using Ficoll / Hypaque (Pharmacia). Thereafter, the activated B cells were pulsed for 3 hours in the presence of the OVA323-339 peptide, washed strictly, and further fixed with paraformaldehyde to inhibit the proliferation of B cells. Add to cells alone or to a mixture of T cells and soluble scTCR fusion protein (primarily see Selected Methods in Cellular Immunol. (1980) BBMishell and SMHiigi WHFreeman and Co. San Francisco).
A standard B cell proliferation assay is performed in a 96 well round bottom microplate at 37 ° C., 5% CO 2. ₂ Under conditions, it takes 3-5 days. The well is added with WST-1 (Boehringer Mannheim) reagent and pulsed for 4 hours, and then the culture is terminated. Thereafter, the optical density of the culture is recorded. T occurred in mice after immunization (immunization) _H The cellular response (ie, clonal proliferation) is indicated by the degree of proliferation of peptide reactive T cells.
Example 11-Effect of scTCR fusion protein on antigen-stimulated T cell proliferation in vivo
Further, the in vivo growth inhibition test of T cell clones is performed on the soluble fusion protein according to the method described in the following application. That is, published PCT international application number US95 / 09816, pending US patent application serial numbers 08 / 382,454, and 08 / 596,387.
For example, three test groups are prepared as follows. That is, 15 BALB / c mice were administered about 10-100 μg of OVA323-339-KLH mixed in complete Freund's adjuvant by intraperitoneal injection (IP), and the immune response against OVA323-339 peptide was given. Induce. About 10-100 μg of IP with anti-OVA / I-Ad scTCR fusion protein added to PBS is administered to 5 mice the day before and 2 days after immunization with OVA-KLH. This scTCR binds to I-Ad / OVA MHC class II molecules and inhibits or eliminates binding of TCR molecules on antigen-specific T cells to I-Ad / OVA molecules on APC. The remaining 10 mice are used as controls. For example, 5 mice receive PBS and the other 5 mice receive scTCRs with different specificities. Mice are dissected 10 days after immunization. A single cell suspension is prepared by removing the lymph nodes and dispersing them. The antigen-presenting cells are removed from the suspension by incubating the suspension on nylon wool and applying to a Sephadex G-10 column.
APC pulsed with OVA323-339 peptide is added to the obtained purified T cell group, and the purified T cell group is incubated. Activated B cells from BALB / c mice are used as APCs in proliferation assays. B cells are prepared by the following method. That is, 50 μg / ml LPS is added to mouse spleen cells and cultured for 48-72 hours. After completion of the culture, the activated cells are isolated by density gradient centrifugation using Lymphoprep. Thereafter, OVA323-339 peptide was added to the activated B cells, pulsed for 3 hours, washed strictly, and further fixed with paraformaldehyde to inhibit the proliferation of B cells. Add to.
The T cell proliferation assay was performed in a 96-well round bottom microplate at 37 ° C., 5% CO ₂ Under conditions, take 3-5 days. The WST-1 reagent is added to the wells and pulsed for 4 hours before terminating the culture and reading the absorbance at different wavelengths. The Th cell response (ie, clonal expansion) that occurred in mice following immunization is indicated by the degree of proliferation of peptide reactive T cells in this assay. What is expected is that immunization with OVA-KLH or HSV-KLH and the administration of the scTCR fusion protein limited the amount of clone growth and the subsequent invasion of the OVA-reactive T cell line. -Proliferation in vitro is limited without affecting the proliferation of HSV-responsive T cell lines.
Example 12-Suppression of autoimmune disease in mice
Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) is an autoimmune disease in mice and is generally considered as an animal model corresponding to multiple sclerosis. Two protein encephalitis regions have been determined, namely myelin basic protein (MBP amino acids 91-103) and proteolipoprotein (PLP amino acids 139-151) (Martin, R. et al Ann. Rev. Immunol. (1992) 10: 153).
In the SJL mouse strain, induction and development of EAE is brought about by immunization with an encephalitis peptide or adoptive transfer of MBP-reactive T cells. To determine whether treatment with soluble anti-MBP91-103 T cell receptor (receptor) or soluble anti-PLP139-151 T cell receptor prevents the development of EAE after T cell activation In addition, MBP91-103 reactive T blasts and PLP139-151 reactive T blasts are administered in vivo to SJL mice. Suitable methods for detecting T cell proliferation in such mice are described in the following applications. That is, published PCT international application numbers US95 / 09816, US patent application serial numbers 08 / 382,454, and 08 / 596,387.
Further, published PCT international application numbers US95 / 09816, US patent application serial numbers 08 / 382,454, and 08 / 596,387 further describe the following contents. That is, to induce EAE in SJL mice, about 400 μg of MBP91-103 in complete Freund's adjuvant is administered to the dorsum of SJL mice. After 10-14 days, regional draining lymphoid cells are collected as described above and cultured in 24-well plates. The concentration of the cells is 6 × 10 6 cells per well ⁶ Incubate in 1.5 ml RPMI 1640 medium / 10% fetal calf serum / 1% penicillin / streptomycin / MBP 50 μg / ml. After stimulation in vitro for 4 days, MBP91-103 reactive T blasts were collected by Ficoll / Hypaque density gradient (Pharmacia), washed twice in PBS, 1.3 × 10 6 ⁷ The cells are administered to individual mice.
The following are further administered to mice given encephalitis MBP91-103 reactive T cells. That is, about 100 μg of MBP91-103 specific scTCR fusion protein (IAs context), 100 μg of PLP139-151 specific scTCR fusion protein (negative control), or physiological saline (sham control) on the same day. After 3 days and 7 days, administration is performed by intravenous injection (iv) (total dose 300 μg). Subsequently, clinical or histological evaluation is performed to confirm that scTCR molecules reactive to MBP91-103 + IAs inhibited the onset of EAE in mice.
EAE is induced in SJL mice by PLP peptide 139-151 as described in published PCT International Application No. PCT / US95 / 09816, pending US patent application serial numbers 08 / 382,454, and 08 / 596,387. To induce, a mixture of PLP peptide 139-151 dissolved in PBS and complete Freund's adjuvant containing Mycobacterium tuberculosis H37Ra at 4 mg / ml in a ratio of 1: 1 was administered to the mice. Immunize. This gives the mice 152 μg of peptide-adjuvant mixture. The same day and 48 hours later, all mice receive 400 ng of pertussis toxin. Thereafter, adoptive transfer of EAE is performed as described above.
According to the method described above (see Example 1), TCR DNA is obtained from normal SJL mice and SAE mice with EAE disease. And scTCR is constructed using TCR DNA. The scTCR is ligated to an appropriate DNA vector having a bacteriophage coat protein or fragment thereof. Thereafter, a PLP-reactive scTCR peptide fusion or MBP-reactive scTCR peptide fusion is expressed and purified as necessary according to the above examples. These scTCR peptide fusion proteins are then tested for EAE onset prevention.
As described in Examples 14 and 15 below, PLP scTCR fusion proteins and MBP scTCR fusion proteins can also be used to create bacteriophage display libraries. The scTCR bacteriophage display library is screened for receptors that bind to MBP (91-103) or PLP (139-151) peptides in conjunction with IAs. As described in further detail in Example 15 below, the bound scTCR fusion protein is isolated by a suitable panning technique. The scTCR fusion protein thus obtained is used for the production of a soluble scTCR fusion protein. Then, this soluble scTCR fusion protein is evaluated for its inhibitory action on autoreactive T cells in SJL mice.
Example 13-Improving affinity of scTCR antigen binding region
For high-affinity scTCR fusion proteins, an action that suppresses or eliminates an undesired interaction between the TCR and the MHC / peptide complex is expected. Undesirable interactions occur, for example, in autoimmune diseases, allergic diseases, and rejection during transplantation. A high affinity scTCR fusion protein, for example, competes with the corresponding native TCR to inhibit or eliminate the binding of T cells with TCR and APC with MHC / peptide molecules. Alternatively, the scTCR molecule inhibits superantigen binding. Native TCR is thought to allow many scTCR fusion proteins to interact with a single MHC / peptide molecule due to its low binding affinity and fast dissociation rate.
A high affinity scTCR fusion protein can be used to suppress or eliminate binding to MHC / peptide molecules that activate autoreactive T cells. To achieve this, genetic engineering (eg, site-directed mutagenesis or site directed or linker scanning mutagenesis) is used to improve the affinity of the scTCR fusion protein. In particular by improving the dissociation rate. Traditional binding assays have been performed to study protein dissociation rates. If the sequence of the antigenic peptide that specifically binds to the scTCR is known or can be readily determined, the peptide is mutated, for example, by induction of alanine scanning mutagenesis, Residues that specifically bind to the CDR3 region of the scTCR are identified. The binding between the mutated antigenic peptide and scTCR is assessed by the binding assay described herein. Thus, the amino acid residues identified in this peptide allow the identification of contact residues in the scTCR molecule. Preferably, the scTCR protein mutant generated by this method has the binding specificity of the TCR for the antigen and the affinity of the antibody. An improved scTCR fusion protein is produced by producing a mutant fusion protein as described above.
Improved scTCR fusion proteins can be generated by isolating autoreactive scTCR fusion proteins using the bacteriophage display library described in the Examples below. The bacteriophage display library can then be used to capture IAs molecules that are covalently bound to peptides derived from PLP and MBP proteins. Once the scTCR is isolated, the scTCR protein mutant can be used to further characterize the peptide contact residues as described above.
Example 14-Generation of a bacteriophage display library
In Example 1 above, the scTCR fusion protein was displayed (displayed) on the bacteriophage surface after induction of IPTG using the DNA vectors pKC46 and pKC51. Generation of bacteriophage display libraries is generally known and can be used to display polypeptides and proteins up to about 50 KD (Smith, GP and Scott, JKin Methods in Enzymology (1993) 217 : 228)
Briefly, flasks containing 2 × Luria Broth (LB) + 0.5% glucose and 100 μg / ml ampicillin were inoculated with E. coli strains, ie, XL1-B cells containing plasmid vectors pKC46 or pKC51. After overnight growth, the cells were pelleted by centrifugation and resuspended in 2 × LB without glucose. The cells were again centrifuged and washed twice in 2x LB. After the second wash, the cells were once again suspended in 50 ml of 2x LB, to which IPTG was added to a final concentration of 1 mM. After the cells were grown for 2 hours at 37 ° C., helper bacteriophage VCSM13 was added at 10 pfu per 5 ml of cell culture. After 15 minutes, the XL1-B cell and helper bacteriophage mixture was diluted 50-fold into warmed 2x LB containing tetracycline, ampicillin, and 1 mM IPTG. After growing for 1 hour at 37 ° C., cells infected with helper bacteriophage were selected by adding kanamycin to the culture. Cell cultures were grown overnight and the next day a two-step PEG precipitation was performed before bacteriophage purification. The purified bacteriophage preparation was filtered through a 0.2 micron filter to remove large amounts of residue from the sample. In addition, the sample was washed in 1% FBS / PBS using a 100 centricon membrane (100 mw cutoff) to remove residual PEG from the bacteriophage preparation. The bacteriophage titer was determined by counting the colonies growing on the plate. The titer was determined by serially diluting the bacteriophage 10 times, mixing the diluted sample with XL1-B cells having excellent infectivity, and placing the mixture on 2 × LB agar containing ampicillin. . The bacteriophage titer is about 10 ^Ten -10 ¹⁴ It was within the range of cfu / cell.
After the second PEG precipitation, the bacteriophage was sterilized by filtering through a 0.2 micron filter to remove unwanted particles and bacteria. The filtered preparation was then washed extensively using a Centricon 100 (100 mw cut-off) filter to concentrate the bacteriophage and exchange the buffer with 1% FBS / PBS.
Example 15-Characterization of a bacteriophage library
A) ELISA test
A TCR specific ELISA assay was performed to analyze the TCR molecules displayed on the bacteriophage surface. In summary, 96-well plates were coated with neutrAvidin (Pierce), 200 ng / well, in coating buffer (pH 9.0) and incubated overnight at 4 ° C. After blocking the plate with 5% non-fat dry milk (NFDM) for 1 hour, anti-α, βTCR (H57) biotin-labeled (labeled) antibody or anti-V-β8.2 (MR5-2) biotin-labeled antibody was added. Dilute in 10 mM Tris (pH 8.0) containing 2.5% NFDM. The diluted antibody was then added to each well and incubated for 1 hour at room temperature. The plate was washed 6 times in TBS / Tween (0.5%) (TBST) to remove antibody not bound to the plate.
Detection of the fusion protein expressed on the bacteriophage was performed by incubating the bacteriophage particles in antibody-coated wells for 1 hour at room temperature. After the plate was washed 6 times with TBST, anti-M13-HRP conjugate (Pharmacia) diluted in 2.5% NFDM was added. After 1 hour incubation, the plates were washed 8 times with TBST. 100 μl of TMB substrate was added to each well, 10 minutes later, 100 μl of 1M sulfuric acid was added to stop the reaction. Then, the absorbance at 450 nm of the plate was read (FIG. 17). In addition, a non-specific binding test to antibody H57 and antibody MR5-2 was performed on a control bacteriophage (prepared from CAIII gene III antibody library). As an additional control, non-specific binding assays were also performed on wells coated with w / BSA or anti-V-β17.
Shown in FIGS. 17 and 18 are the results of ELISA analysis of the scTCR fusion protein in the uninduced state (ie, derepressed state) and the induced state. FIG. 17 shows the analysis result of the scTCR fusion protein generated from pKC46, and FIG. 18 shows the analysis result of the fusion protein generated from pKC51. In each figure, the black bars indicate cultures in the non-induced state, and the lighter colored bars indicate cultures in the induced state. It can be seen from FIGS. 17 and 18 that the scTCR fusion protein was expressed in the bacteriophage library and displayed on the surface of the bacteriophage. When comparing absorbance at 450 nm, bacteriophage preparations expressing scTCR fusion proteins by induction were approximately 60-200 times larger than uninduced bacteriophage preparations (FIG. 18). Comparing the levels detected by the ELISA assay, the bacteriophage displaying the gene VIIIscTCR fusion protein was approximately 200-500 times higher than the bacteriophage displaying the gene IIIscTCR fusion (FIG. 17). From this result, it is considered that the TCR / gene VIII bacteriophage expresses many scTCR fusion proteins on the bacteriophage surface. The multivalent nature of the bacteriophage display of the scTCR fusion protein increases the opportunity to capture MHC / peptide complexes. This is because the binding activity is strong due to the multivalent nature.
B) Activity of the fusion protein displayed in the bacteriophage library
To demonstrate that the fusion protein on the bacteriophage is biologically active, the bacteriophage displaying the DO11.10 scTCR / gene VIII fusion was tested against TCR on DO11.10 T cells and immobilized scIAd. The ability to inhibit specific interactions with / OVA molecules was analyzed. An exemplary assay for detecting such interactions using the DO11.10 T cell line and single chain MHC molecules is as described above.
The DO11.10 T cell hybridoma and the IAd / OVA system are used almost in accordance with the method shown in Example 8 above, and the scTCR expressed on the bacteriophage (hereinafter also referred to as scTCR / bacteriophage molecule) The decrease in IL-2 levels in the presence was measured. As a result of the experiment, it was found that the scTCR fusion protein expressed on bacteriophage interacted with immobilized IAd / OVA. This is because IL-2 levels were reduced in wells containing scTCR / bacteriophage molecules. In contrast, no reduction in the inhibitory effect was observed in wells incubated with the same titer of control bacteriophage (not displaying scTCR). Thus, scTCR fusion proteins expressed on bacteriophages are biologically active.
To test the fine specificity of the inhibitory effect, an assay was performed comparing the level of inhibition between DO11.10 and gD12 T hybridoma.
As described in Example 8, gD12 T cell hybridomas are IA ^d Restriction (IA ^d restricted) but recognizes HSV-1 derived peptides. Both cells are IA ^d In view of the recognition of a peptide restricted by, the scTCR derived from DO11.10 expressed on bacteriophage is IA ^d / It is thought that there is a possibility of some interaction with the HSV-1 molecule. However, this interaction is IA ^d The interaction with / OVA MHC / peptide molecule is considered to be considerably weaker. As shown in FIG. 19A, although a low level of IL-2 inhibition was seen in the gD12 T cell hybridoma group, the level of IL-2 inhibition in the DO11.10 group was about 8-10 times higher. In FIG. 19A, about 8-250 × 10 ^Ten Individual phage were used in each experiment. CAIII refers to a control phage that does not display the scTCR fusion protein. FIG. 19B shows the results of a related experiment, in which IL-2 production was measured from DO11.10 T hybridoma cells.
C) BioPanning of fusion protein
Bacteriophage display libraries displaying scTCR fusion proteins are used to capture specific TCR molecules according to known methods (eg, McCafferty, J. et al. Nature (1990) 348: 352; Castagroli, L. et al. J. Mol. Biol. (1991) 222: 301; Lebeddee, SLet al. PNAS (USA) (1992), 89: 3175; Smith, GPand Scott, JKsupra; Blake, J. et al. J. Exp. Med. (1996) 184: 121). Conventional capture techniques generally rely on the strength of the interaction between the target antigen and the antibody. Its strength is typically 10 ^-6 -10 ^-8 It is in the range. However, most TCR-MHC / peptide interactions are typically 5 × 10 ^-Five It is in the range of M and becomes weaker with the KD value. In general, the avidity and valency of scTCR fusion proteins and MHC / peptide complexes can be increased by increasing the number of fusion proteins expressed on the phage. Other strategies that can be adopted include changing the stringency of the wash, increasing the amount of antigen, lowering the temperature to reduce the rate of dissociation, and increasing the incubation time.
i) Antibody capture
The DO11.10 scTCR fusion protein specific antibody was used to capture scTCR molecules. In summary, after coating 200 ng of neutrAvidin to multiple microwells, a biotin-labeled antibody that binds to a non-specific antibody that recognizes C-β domain, V-β8.2 domain, or V-β17 is added and incubated. did. Nonspecific binding was investigated using wells coated with BSA. Experiment is 2 × 10 ⁶ Individual TCR / gene VIII bacteriophage particles from 1 x 10 from an irrelevant antibody bacteriophage bank ¹¹ Dilute to individual particles. That is, a final dilution of 1: 50,000 was performed. When enrichment for both anti-TCR antibody (H57) or anti-V-β8.2 antibody (MR5-2) was performed for one round, 5000-fold accumulation was observed. On the other hand, the BSA negative control did not yield any positive clones suggesting that the accumulation was specific. A 20-10000 fold accumulation in one round is not uncommon in antibody antigen capture experiments. Therefore, it can be seen that the accumulation observed in this experiment is within the acceptable range of the reported accumulation experiment.
ii) Cell panning
Cell capture has traditionally been a standard method for isolating antibodies against cell surface proteins. This method can be easily applied when screening a desired fusion protein from the bacteriophage library prepared in Example 18. The cells used for cell capture are obtained from any suitable cell source. For example, a cell that expresses an MHC / peptide molecule, or a cell that contains an empty MHC complex to which a suitable peptide can bind, such as described in pending US application serial number 08 / 596,387. Furthermore, cells transfected with a single-chain class IMHC gene or a single-chain class II MHC gene, in which an appropriate peptide is bound or covalently bound to an MHC complex, can also be used. Examples of cells having suitable single chain class IMHC / peptide complexes or single chain class II MHC / peptide complexes are described in the following applications. That is, published PCT international application numbers published PCT / US95 / 09816, pending US patent application serial numbers 08 / 382,454, and 08 / 596,387.
In general, capturing with cells that express the appropriate MHC complex provides several advantages. That is, the available supply of such cells can be increased, and time-consuming purification of the MHC / peptide complex can be dispensed with.
The following method is mentioned as an example of the method of cell capture | acquisition. That is, in an Eppendorf tube (1.7 ml), about 2 × 10 ⁶ About 10 total including 10 DO11.10 bacteriophages ¹¹ 10 bacteriophages with a volume of 0.2 ml ⁶ The cells are mixed and incubated at 4 ° C. for 2 hours. The cells are then pelleted by centrifugation at 5000 × g for 10 minutes at 4 ° C. and washed 5 times in ice-cold PBS / tween (0.5% w / v). Subsequently, 50 μl, pH 5.0 citrate buffer is added to elute the bacteriophage from the cells. The accumulated bacteriophage can be increased in number by infecting E. coli and culturing overnight. The bacteriophage is then purified using standard procedures, such as those described in Example 14 above. After 5 rounds of accumulation, a randomly sampled colony is taken out and its gene sequence is analyzed. The frequency of DO11.10 TCR gene discovery determines whether further accumulation is required. For example, if the starting dilution ratio of DO11.10 TCR / bacteriophage is 1: 50000, it is expected that the frequency of discovery will increase after 5 rounds of integration. The increase at this time is expected to be in the range of about 1000-2000 times.
iii) Capture using scMHC / peptide complex
The production of soluble scMHC / peptide complexes is described, for example, in insect cells as described in published PCT International Application No. US95 / 09816, pending US patent application serial numbers 08 / 382,454, and 08 / 596,387. Follow the method.
Soluble scMHC / peptide molecules produced in insect cells are used to capture bacteriophages that express soluble fusion proteins. For example, an amount of scIA ^d Coat 96-well plates (Nunc) with / OVA (eg 1-10 μg / well). Then 2 × 10 ⁶ A total of 10 DO11.10 bacteriophages ¹¹ Diluted in bacteriophage (1: 50000) and immobilized IA ^d Incubated in the presence of / OVA. After incubating for 2 hours, the plates are washed 5 times in TBST. Bound bacteriophage is eluted by adding 100 μl of 0.1 M hydrochloric acid / glycine. The frequency of bound DO11.10 TCR / bacteriophage is determined as follows. That is, standard colony lifts are performed, and positive ones are screened using an antibody against a protein label (for example, the above-mentioned anti-EE labeled antibody) or a DNA-specific probe. An example of a DNA-specific probe is a labeled 300 bp α-strand DNA probe, which is obtained from Amersham. The antibody or DNA specific probe for the protein label recognizes the scTCR gene or the scTCR gene product, respectively.
Example 16-Fluorescence-based cell sorting identification of fusion proteins
Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS) is a standard method used for cell detection and sorting (eg, Davey, HMand Kell, DBin Microbiological Reviews (1996) 60: 641; and Darzynkiewca, Z. et al. (1994) in Flow Cytometry 2nd Ed., Vols. 41 and 42 Academic Press, New York). By FACS, the interaction between the cell and the bacteriophage displaying the scTCR fusion protein is detected. To perform FACS experiments, sc-IA ^d Cells expressing the / OVA complex were generated as described above. IA ^d Staining with specific antibody ASMII-FITC (Pharmingen) ^d It was confirmed that OVA peptide is IA ^d To verify that it is present in the groove, a T cell activity assay is performed as described in the following application. That is, the above-mentioned published PCT international application numbers published PCT / US95 / 09816, pending US patent application serial numbers 08 / 382,454, and 08 / 596,387.
A variety of chromogens can be used to label bacteriophages for FACS analysis. One approach is to attach a suitable chromogen such as phycoerythrin to the bacteriophage. Another approach is to bind FITC to bacteriophage according to known methods such as those shown in the Flurotag FITC conjugate kit (Sigma, St. Louis, MO). Another approach is to indirectly bind phycoerythrin and bacteriophage. That is, the bacteriophage is first biotinylating, and strepavidn-phycoerythrin is bound to it. Yet another approach uses two antibody approaches that have different fluorescein labels. Specifically, one anti-bacteriophage antibody is labeled with FITC and a second antibody against scTCR (eg, H57) is labeled with phycoerythrin.
Examples of bacteriophage binding methods include the following. That is, 10 ¹² cfu pKC51 phage is buffer exchanged into 0.1 M sodium carbonate buffer (0.2 ml, pH 9.0 to 9.5). Using a Flurotag FITC complex kit, mix 1 ml of 0.1 M carbonate-bicarbonate solution into a vial containing FITC and stir until all FITC is dissolved. Approximately 50 μl of FITC label is added to the bacteriophage preparation to give a final ratio of FITC to phage of 40: 1 and the appropriate fluorescein / protein (F / P) molar ratio. The sample is then placed in a tube, covered with aluminum foil and incubated for 2 hours. The labeled bacteriophage is isolated by applying the sample to a G-25 Sephandex column. Typically, labeled bacteriophages are contained in the main fraction (eg, fractions 6-8). The F / P molar ratio is then determined by reading the absorbance at 280 nm and 495 nm using a spectrophotometer. The formula used to determine the F / P molar ratio is as follows:
Molar F / P = 2.77 × A ₄₉₅ / A ₂₈₀ (0.35 × A ₄₉₅ )
The absorbance reading of the composite sample should fit appropriately between 0.3 and 1.0.
FITC-labeled phage can be generated using sc-IA according to conventional FACS methods. ^d Add cells that express the / OVA complex and incubate. Thereby, a bacteriophage that binds to the cell is detected. Bound bacteriophage is eluted from the cells and grown according to standard methods.
Example 17-Cloning and expression of scTCR fusion protein in bacteriophage f88
The capture method described above uses a phagemid-transformed cell that is further infected with a wild-type filamentous bacteriophage (ie, VCMS13) to display the scTCR fusion protein. ). This method can be improved as follows. That is, a bacteriophage vector that can more efficiently contain (package) a recombinant scTCR construct may be used (this increases the yield of recombinant molecules per total number of virions). For example, bacteriophage f88-4 is a type 88 vector (9273 base pairs) and contains two genes VIII. One of them is wild type and the other displays a recombinant gene (ie, gene VIII gene fusion). Bacteriophage f88-4 is obtained from Dr. G. Smith, University of Washington. Bacteriophage f88-4 efficiently packages the gene VIII construct, improving yields by up to 10%. This increase in yield is believed to be due to an increase in multiplicity of recombinant virions (ie, the number of recombinant molecules per total number of virions). This increase in yield is thought to build about 300 scTCR fusion proteins per virion. Thus, f88-4 bacteriophage increases yield and multiplicity and improves target binding activity, resulting in increased isolation of specific scTCR fusion proteins.
Construction of recombinant bacteriophage containing the scTCR fusion protein was performed by cloning the scTCR gene into the PstI and HindIII sites of f88-4 bacteriophage. The expression of the introduced scTCR gene is thus performed under the control of the tac promoter, and its induction occurs after the addition of 1 mM IPTG.
Schematically shown in FIG. 20 is a number of recombinant bacteriophage vectors generated using f88-4 bacteriophages (pKC70, pKC71, and pKC72).
Example 18-Construction of scTCR bacteriophage library from HIV infected cells
A bacteriophage library displaying scTCR fusion proteins from CTL of HIV infected patients is generated by the methods described herein. As HIV-infected patients, patients diagnosed or classified as long-term non-progressive (ie, LTNP) are targeted. These HIV-infected patients have been the subject of research for CTL responses to various HIV viral antigens such as gag and pol. CTL profiles from such patients typically show stronger immunoreactivity against HIV antigens compared to patients prone to AIDS (Miedema, F. and Klein, MRScience (1996) 272,505 mainly) reference).
In order to identify TCRs involved in CTL responses and construct the corresponding fusion proteins, a class I HLA-A2 restricted human TCR library is created from T cells. The T cells are isolated from the LTNP patient by the method described in the examples above.
A class I HLA-A2 restricted bacteriophage library can be prepared by several methods. For example, 10 ⁷ T cells are isolated and pooled from 3 HLA-A2 LTNP patients as described above (see Altman, JD et al. Science (1996) 274: 94). Messenger RNA is purified from these cells and cDNA obtained with standard procedures. Standard procedures include methods such as using oligonucleotide primers corresponding to human C-αTCR and C-βTCR. Exemplary primers are shown in FIG. 22 (SEQ ID NOs .: 116-128) and FIG. 23 (SEQ ID NOs .: 101-115). Specifically, the V-α gene consists of 12 forward primers (FIG. 22 SEQ ID NO. 116-127) and one back primer that hybridizes to the 5 ′ end of the C-α gene sequence (SEQ ID NO. .: 128) is amplified by the PCR method. The β chain consists of 13 forward primers that hybridize to the 5 ′ end of the V-β chain (FIG. 23, SEQ ID NOs: 101-113) and two back primers placed at 378 bases in the β constant region ( FIG. 23 SEQ ID NOs: 114, 115) are used for amplification by the PCR method. Amplification by PCR is performed according to standard methods.
DNA amplified by the PCR method is introduced into an appropriate DNA vector that expresses bacteriophage coat protein or a fragment thereof, such as the DNA vector described in Example 14. Specifically, using the pKC45 DNA vector described in Example 2, the V-α chain is subcloned into the SfiI and SpeI sites of the vector, and the V-β / C-β chain is cloned into the XmaI site of the vector. A suitable vector encoding the scTCR bacteriophage fusion protein is then generated according to the examples described above. Alternatively, the V-α chain and V-β / C-β chain are subcloned into the f-88 bacteriophage vector (see Example 17), for example as an insertable HindIII-PSTI fragment. The recombinant bacteriophage thus produced is infected into an appropriate host cell, and the recombinant bacteriophage is propagated and screened according to the above-mentioned examples.
In some cases, it may also be desirable to modify the cloning site of the f88 bacteriophage according to standard recombination techniques to allow cloning of specific fragments (eg, SfiI-XmaI fragments), eg, by incorporating appropriate linker sequences. . To achieve such modifications, for example, appropriate restriction site primers are annealed to the HindIII and PstI sites of the bacteriophage. The bacteriophage display library thus produced is propagated and stored according to standard procedures.
Example 19-Screening of bacteriophage display libraries from HIV infected cells
The recombinant bacteriophage library produced in Example 18 can be screened by several selectable approaches. For example, the library can be screened with a variety of detectably labeled probes. Examples of probes include fully (deactivated) HIV virus, HIV proteins, especially HIV coat proteins, and APCs expressing HIV peptides as MHC / HLA complexes. Screening can also be carried out using peptide epitopes of HIV coat proteins known to stimulate immune responses against HIV viruses in vivo. Several examples are known for such peptide epitopes, including peptides isolated from HIV gp120, gp41, gp160, gag and pol coat proteins.
a) Screening with HIV gp120 coat protein
Bacteriophage libraries are screened using peptide epitopes derived from the V3 loop of the gp120 protein. Exemplary peptides include the T1 (amino acids 428-443) and T2 (amino acids 112-124) peptides of the HIV gp120 protein. A peptide epitope derived from the gp120V3 loop is one of those capable of inducing an HIV neutralizing antibody (Berzofsky, JA et al. (1991) FASEB J.5: 2412; Ahlers, JDet al, (1993) J. Immunology 150: 5647 reference). For other examples of peptide epitopes that can be used to screen for scTCR fusion proteins from bacteriophage libraries, see also Karzon, DTet al. And Hart, JKet al. (Karzon, DTet al. (1992) Vaccine 14: 1039; Hart, JK et al. PNAS (USA) (1991) 88: 9448).
B. Biopanning using APC expressing HIV coat protein
From the scTCR library constructed in Example 18 above, for example, an scTCR fusion protein that binds to an immunogenic HIV peptide obtained from an HIV gag or pol protein can be captured. This HIV coat protein is present in association with cells expressing single chain HLA-A2 molecules. Single chain HLA-A2 molecules are generated as described in Garboczi, DNet al. PNAS (USA) (1992) 89: 3429. Cells expressing single chain HLA-A2 molecules are generated according to known methods (Altman, JD et al., Supra).
Biopanning can be achieved by several methods. For example, as one method, MHC / peptide targets are presented in two different ways. That is, in the first stage of capture, a transfected cell expressing HLA-A2 is used and a gag or pol peptide is used as a target antigen. Capture is approximately 10 from the bacteriophage display library described in Example 18. ¹¹ Use individual bacteriophages. The bacteriophage library is then contacted with cells presenting HLA-A2 and gag or pol peptides. The bacteriophage is transferred to about 10 transfection bodies. ⁶ Incubate for 2 hours at 4 ° C. in the presence of 2 individuals, wash twice in 2% FBS / PBS, elute in 100 μl of 0.1 M citrate buffer (pH 5.0), and then add 0.1 M Tris (pH 8). 0.0) Neutralize with 10 μl. The eluted bacteriophage is propagated by infecting a suitable host such as E. coli strain K91kan and the bacteriophage is grown overnight. Bacteriophage particles are purified by standard methods.
Repeated capture operations on cells or solid supports carrying the appropriate MHC / antigen can improve the purity of bacteriophages with scTCR fusion proteins identified in cell capture experiments. For example, a bacteriophage isolated by a cell capture method is purified by subjecting it to a capture operation on a solid support (eg, microdish) coated with single-chain HLA-A2 and a peptide. After 2 hours of incubation, the wells are washed about 8 times with 0.3 ml PBS / 0.2% Tween to remove non-specific bacteriophages. Bound bacteriophage is eluted in 0.1 ml 0.1 M hydrochloric acid (in glycine, pH 3.0) and neutralized with 10 μl of 2M Tris (pH 8.0). Further capture is performed by changing the cell or immobilized MHC / HLA peptide molecule used from one to the other. By performing capture about 5-6 times, a bacteriophage preparation displaying scTCR is obtained with sufficiently high purity. Subsequently, DNA is isolated from the bacteriophage and the DNA sequences of the α and β variable regions of the scTCR encoded within the bacteriophage are determined. What is expected is a productive interaction between scTCRs in bacteriophage display libraries and MHC / peptide antigens if there is a bias or enrichment in the usage of α or β variable regions. Indicates that has been done.
Using detectably labeled probes, the desired recombinant bacteriophage can be accumulated from a bacteriophage library. For example, if the probe is a peptide epitope derived from the gp120V3 loop, a recombinant bacteriophage that specifically binds to that peptide can be isolated. Typically, several accumulation processes are performed, but there are several factors that influence the number of steps of the accumulation process. For example, the state of display of the desired recombinant bacteriophage in the library and the binding activity of the detectably labeled probe are factors. DNA from the recombinant bacteriophage is isolated by standard means. The DNA encoding the scTCR fusion protein is analyzed for its sequence according to standard methods. Analysis of the DNA sequence of several isolated recombinant bacteriophages shows specific binding between the detectably labeled probe and the scTCR fusion protein encoded by the recombinant bacteriophage.
High frequency clones are expressed as soluble and fully functional scTCR fusion proteins in appropriate vectors such as the pKC60 and pKC62 vectors described above. The expressed fusion protein is then individually purified as necessary by immunoaffinity chromatography using the H57 monoclonal antibody described above according to standard methods.
Example 20-Characterization of scTCR fusion protein detected by anti-HIV capture
A number of selectable methods assess specific binding between the recombinant bacteriophage detected as described above and the HIV antigen.
A) Biocore Analysis
When screening against the bacteriophage library described in Example 18 using the HIV peptide, the peptide is used to generate scMHC class I molecules according to the method described in the following application. The following applications are published PCT international application numbers published PCT / US95 / 09816, pending US patent application serial numbers 08 / 382,454, and 08 / 596,387. Preferably, the peptide is covalently linked to a scMHC class I molecule. The scMHC class I peptide complex obtained here is then used to coat a chip for biocore analysis as described in Example 7 and Example 20 below. More specifically, a single chain HLA-A2 molecule bound to gag or pol antigen (see Altman, JD et al. Supra) is covalently bound to the biosensor chip via an amine reactive site. Then, a sample containing the scTCR fusion protein is brought into contact with the chip. Then, as described above, specific binding is detected on the chip (Seth, A. et al. Nature (1994) 369: 324; Matsui, K. et al. PNAS (USA) (1994) 91: 12862 See also). The interaction of most scTCR fusion proteins is 10 ^-Five -10 ^-7 It is expected to be in the range of M.
The detection of specific binding between the scMHC class I peptide complex and the scTCR fusion protein indicates the presence of a specific scTCR-peptide binding complex.
By determining the binding coefficient for each isolated scTCR fusion protein, the effectiveness of the receptor that binds to the cell and causes cell death can be easily predicted.
B) Binding to scTCR fusion protein tetramer
The specific binding between the scTCR fusion protein and the HIV peptide can also be detected by performing a binding assay with the scTCR fusion protein tetramer according to the above-described example (see Example 9). A tetrameric scTCR fusion protein can also be generated by inserting the DNA encoding the fusion into an appropriate DNA vector having a Bir A-dependent biotinylation site (Schatz, PJ Biotechnology). (1993) 11: 1138). The scTCR fusion protein can be modified by adding avidin-phycoerythrin according to standard methods to produce a tetrameric scTCR fusion protein. Cells transfected to display HIV peptides are prepared according to the methods described above and in the following applications. That is, published PCT international application numbers published PCT / US95 / 09816, pending US patent application serial numbers 08 / 382,454, and 08 / 596,387. If the transfected cells are used, the library can be screened. Alternatively, the transfected cells can be stained with a labeled scTCR fusion protein tetramer to detect specific binding to the cells. The stronger binding detected by FACS analysis is indicative of a specific interaction between the scTCR fusion protein and the MHC class I peptide complex.
The scTCR fusion protein isolated in Example 19 above is tested for binding affinity and activity to determine whether the scTCR fusion protein specifically binds to the MHC / peptide complex. This suitable assay is as described in the examples above.
C. FACS analysis
By performing FACS, the interaction between the scTCR fusion protein and the target cells described in Example 16 above can be detected. For example, scTCR fusion proteins are biotinylated according to standard methods followed by binding to strepavidin-phycoerythrin to form labeled scTCR tetramers. By FACS, the interaction between scTCR and appropriate target cells such as A20 cells and tumor cell lines is quantitatively measured. Alternatively, the scTCR fusion protein of Example 16 can be bound to a suitable solid support (eg, latex beads) to display multiple scTCRs. Using related methods, tetrameric class IMHC / peptide molecules have been produced (see, for example, Altman, JD et al. Supra).
D. Il-expression in gD12T hybridoma cells
The activity of gD12T hybridoma cells can be readily assayed by measuring IL-2 activity, as described in the pending US patent application serial number 08 / 596,387. By this assay, the function of the scTCR fusion protein produced in Example 16 can be assayed. For example, gD12T hybridoma cells are transfected with DNA encoding the scTCR molecule produced in the examples according to the method described above. FACS staining is performed as described in Example 16 to detect scTCR receptor expression on the cell surface. Receptor positive clones are used in the IL-2 activity assay described in the following application. The following applications are published PCT international application numbers PCT / US95 / 09816, US patent application serial numbers 08 / 382,454, and 08 / 596,387. When the scTCR receptor is active (ie, when the scTCR receptor specifically binds to an MHC / peptide target), Il-2 production from gD12 cells can be easily detected and measured.
Example 21-Isolation of an autoimmune protein fusion that binds to a class II restricted MHC / peptide complex
By the method of this example, scTCR fusion protein that specifically binds to autoimmune proteins and peptides can be isolated. For example, T cells can be isolated according to conventional methods from DR-2 + individuals and from individuals diagnosed with multiple sclerosis. TCR DNA is obtained from the T cells. Then, using the obtained TCR DNA, an scTCR fusion protein is constructed according to the method described in the above example. A bacteriophage display library is created and tested according to Examples 14-15 above.
The bacteriophage display library is available from several DR-2 + patients with multiple sclerosis. ⁷ Create by isolating T cells. T cell mRNA is purified and cDNA is generated as described in Example 1 above. TCR V-α and V-β / C-β chains are amplified by PCR using the same primers as in Example 1. The V-α and V-β / C-β chains are cloned into the cloning site of an appropriate bacteriophage display vector. Suitable cloning sites for bacteriophage display vectors are, for example, the SfiI-SpeI site and the XhoI-XmaI site of the f88-4 bacteriophage vector DNA described in Example 17. The library is grown and stored according to standard methods for capturing specific antigen targets.
Single-stranded DR-2 molecules are made generally according to the methods described above and in the following applications. The following applications are: published PCT international application number PCT / US95 / 09816, pending US patent application serial numbers 08 / 382,454 and 08 / 596,387, Rhode, P. et al. J. of Mol .Immunology, (1996) 32,555. Specifically, HLA-DR2 molecules are purified from EBV transformed lymphoblasts presenting HLA-DR2 molecules. Briefly, HLA-DR2 molecules are lysed in a buffer containing Triton X-100 and purified by standard immunoaffinity chromatography. The cell lysate is then applied to an antibody-Sepharose column. DR2 is bound and eluted in phosphate buffer (pH 11.3) containing 0.05% N-dodecyl-BD-maltoside detergent. The resulting fraction is immediately neutralized with 1M acetic acid and the DR2 pool is collected in phosphoric acid (pH 8.0) containing 0.5M NaCl by passing it through a DEAE ion exchange column. The protein fraction is assayed for purity by SDS-PAGE gel electrophoresis and silver staining.
The bacteriophage library can be screened by several methods. In particular, a method of capturing according to the above method using a solid support coated with a single-stranded DR-2 molecule is preferable. As a capturing method, a single-stranded DR-2 molecule is produced in a host such as an insect cell, and the single-stranded DR-2 molecule is immobilized on a solid support such as a microplate wall.
Further, the bacteriophage library is purified using cells transfected with DR-2 molecules (see DeKruif, J. et al. PNAS (USA) (1995) 92, 3938). Accumulation of bacteriophage particles expressing scTCR fusion proteins that specifically bind to DR-2 protein is performed by the method described in the above examples.
The specific embodiments or examples made in the detailed description of the invention are intended to clarify the technical contents of the present invention, and are limited to such specific examples and interpreted in a narrow sense. It should be understood that various modifications can be made within the spirit of the present invention and the scope of the appended claims.
Sequence listing
(1) General information
(I) Applicant: Waydanz John A
Card Kimberlin F
Won Hin Sea
(Ii) Title of invention: Fusion protein comprising bacteriophage coat protein and single chain T cell receptor
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(Iv) Address
(A) Addressee: Dyke, Bronstein, Roberts, Cushman LLP
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(F) Zip code: 02109
(V) Computer reading method
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(Vi) Original application data
(A) Application number: 08 / 813,781
(B) Application date: March 7, 1997
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(Vii) Prior application data
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(Viii) Agent information
(A) Name: Peter F Corres
(B) Registration number: 33,860
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(2) Information about SEQ ID NO: 35:
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(B) Type: Nucleic acid
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(2) Information about SEQ ID NO: 38:
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(Iii) Hypothetical: NO
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(2) Information about SEQ ID NO: 40:
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(2) Information about SEQ ID NO: 41:
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(Iii) Hypothetical: NO
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(2) Information about SEQ ID NO: 42:
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(C) Number of chains: single chain
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(Iii) Hypothetical: NO
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(Vi) Origin:
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(2) Information about SEQ ID NO: 43:
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(Iii) Hypothetical: NO
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(Vi) Origin:
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(2) Information about SEQ ID NO: 44:
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(C) Number of chains: single chain
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(Iii) Hypothetical: NO
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(Vi) Origin:
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(2) Information about SEQ ID NO: 45:
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(Iii) Hypothetical: NO
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(Vi) Origin:
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(2) Information about SEQ ID NO: 46:
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(Iii) Hypothetical: NO
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(Vi) Origin:
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(2) Information about SEQ ID NO: 47:
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(Vi) Origin:
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(Iii) Hypothetical: NO
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(2) Information about SEQ ID NO: 49:
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(2) Information about SEQ ID NO: 50:
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(Vi) Origin:
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(2) Information about SEQ ID NO: 51:
(I) Sequence features:
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(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
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(Iii) Hypothetical: NO
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(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 51:

(2) Information about SEQ ID NO: 52:
(I) Sequence features:
(A) Length: 15 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
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(Iii) Hypothetical: NO
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(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 52:

(2) Information about SEQ ID NO: 53:
(I) Sequence features:
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(C) Number of chains: single chain
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(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
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(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 53:

(2) Information about SEQ ID NO: 54:
(I) Sequence features:
(A) Length: 15 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
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(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
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(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 54:

(2) Information about SEQ ID NO: 55:
(I) Sequence features:
(A) Length: 16 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
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(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 55:

(2) Information about SEQ ID NO: 56:
(I) Sequence features:
(A) Length: 16 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
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(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 56:

(2) Information about SEQ ID NO: 57:
(I) Sequence features:
(A) Length: 16 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 57:

(2) Information about SEQ ID NO: 58:
(I) Sequence features:
(A) Length: 39 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 58:

(2) Information about SEQ ID NO: 59:
(I) Sequence features:
(A) Length: 39 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 59:

(2) Information about SEQ ID NO: 60:
(I) Sequence features:
(A) Length: 41 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 60:

(2) Information about SEQ ID NO: 61:
(I) Sequence features:
(A) Length: 69 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 61:

(2) Information about SEQ ID NO: 62:
(I) Sequence features:
(A) Length: 86 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 62:

(2) Information about SEQ ID NO: 63:
(I) Sequence features:
(A) Length: 86 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 63:

(2) Information about SEQ ID NO: 64:
(I) Sequence features:
(A) Length: 39 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 64:

(2) Information about SEQ ID NO: 65:
(I) Sequence features:
(A) Length: 60 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 65:

(2) Information about SEQ ID NO: 66:
(I) Sequence features:
(A) Length: 57 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 66:

(2) Information about SEQ ID NO: 67:
(I) Sequence features:
(A) Length: 51 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 67:

(2) Information about SEQ ID NO: 68:
(I) Sequence features:
(A) Length: 32 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 68:

(2) Information about SEQ ID NO: 69:
(I) Sequence features:
(A) Length: 49 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 69:

(2) Information about SEQ ID NO: 70:
(I) Sequence features:
(A) Length: 31 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 70:

(2) Information about SEQ ID NO: 71:
(I) Sequence features:
(A) Length: 31 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 71:

(2) Information about SEQ ID NO: 72:
(I) Sequence features:
(A) Length: 30 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 72:

(2) Information about SEQ ID NO: 73:
(I) Sequence features:
(A) Length: 30 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 73:

(2) Information about SEQ ID NO: 74:
(I) Sequence features:
(A) Length: 56 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 74:

(2) Information about SEQ ID NO: 75:
(I) Sequence features:
(A) Length: 64 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 75:

(2) Information about SEQ ID NO: 76:
(I) Sequence features:
(A) Length: 61 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 76:

(2) Information about SEQ ID NO: 77:
(I) Sequence features:
(A) Length: 34 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 77:

(2) Information about SEQ ID NO: 78:
(I) Sequence features:
(A) Length: 59 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 78:

(2) Information about SEQ ID NO: 79:
(I) Sequence features:
(A) Length: 32 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 79:

(2) Information about SEQ ID NO: 80:
(I) Sequence features:
(A) Length: 34 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 80:

(2) Information about SEQ ID NO: 81:
(I) Sequence features:
(A) Length: 35 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 81:

(2) Information about SEQ ID NO: 82:
(I) Sequence features:
(A) Length: 65 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 82:

(2) Information about SEQ ID NO: 83:
(I) Sequence features:
(A) Length: 65 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 83:

(2) Information about SEQ ID NO: 84:
(I) Sequence features:
(A) Length: 35 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 84:

(2) Information about SEQ ID NO: 85:
(I) Sequence features:
(A) Length: 19 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 85:

(2) Information about SEQ ID NO: 86:
(I) Sequence features:
(A) Length: 21 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
(D) Topology: Linear
(Ii) Molecular type: cDNA
(Iii) Hypothetical: NO
(Iv) Antisense: NO
(V) Fragment type:
(Vi) Origin:
(Xi) Sequence details: SEQ ID NO: 86:

(2) Information about SEQ ID NO: 87:
(I) Sequence features:
(A) Length: 23 base pairs
(B) Type: Nucleic acid
(C) Number of chains: single chain
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Claims (33)

A soluble fusion protein comprising a single chain T cell receptor and a bacteriophage coat protein covalently linked to the single chain T cell receptor comprising:
The single-chain T cell receptor includes a V-α chain, a V-β chain, and a peptide linker that covalently links the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the V-β chain. An array of
The soluble fusion protein comprises a mouse-derived C-β chain fragment that covalently links the C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the bacteriophage coat protein;
The soluble fusion protein, wherein the C-β chain fragment is 50 to 126 amino acids in length and does not contain the cysteine residue at position 127 of the entire mouse C-β chain region. The soluble fusion protein of claim 1, wherein the fusion protein further comprises at least one protein label. The soluble fusion protein of claim 1, wherein the peptide linker sequence comprises 2 to 20 amino acids. The soluble fusion protein according to claim 1, wherein the bacteriophage coat protein is a gene III protein or a gene VIII protein. A soluble fusion protein comprising a single chain T cell receptor and a bacteriophage gene III protein covalently linked to the single chain T cell receptor comprising:
The single-chain T cell receptor includes a V-α chain, a V-β chain, and a peptide linker that covalently links the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the V-β chain. An array of
The soluble fusion protein includes a mouse-derived C-β chain fragment that covalently links the C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the bacteriophage gene III protein;
The soluble fusion protein, wherein the C-β chain fragment is 50 to 126 amino acids in length and does not contain the cysteine residue at position 127 of the entire mouse C-β chain region. 6. The soluble fusion protein of claim 5, further comprising a protein label covalently linked to the C-terminus of the C-β chain fragment and the N-terminus of the bacteriophage gene III protein. A soluble fusion protein comprising a single chain T cell receptor and a bacteriophage gene VIII protein covalently linked to the single chain T cell receptor,
The single-chain T cell receptor includes a V-α chain, a V-β chain, and a peptide linker that covalently links the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the V-β chain. An array of
The soluble fusion protein comprises a mouse-derived C-β chain fragment that covalently links the C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the bacteriophage gene VIII protein;
The soluble fusion protein, wherein the C-β chain fragment is 50 to 126 amino acids in length and does not contain the cysteine residue at position 127 of the entire mouse C-β chain region. The soluble fusion protein according to claim 1, wherein the V-α chain and V-β chain are isolated from cytotoxic T cells. A DNA segment comprising a sequence encoding a soluble fusion protein, and a operably linked promoter and leader sequence,
The soluble fusion protein comprises a single chain T cell receptor and a bacteriophage coat protein covalently linked to the single chain T cell receptor;
The single-chain T cell receptor includes a V-α chain, a V-β chain, and a peptide linker that covalently links the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the V-β chain. An array of
The soluble fusion protein comprises a mouse-derived C-β chain fragment that covalently links the C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the bacteriophage coat protein;
The DNA segment, wherein the C-β chain fragment is 50 to 126 amino acids in length and does not include the cysteine residue at position 127 of the entire mouse C-β chain region. A DNA segment comprising a sequence encoding a soluble fusion protein comprising:
The soluble fusion protein comprises a single chain T cell receptor and a bacteriophage gene III protein covalently linked to the single chain T cell receptor;
The single-chain T cell receptor includes a V-α chain, a V-β chain, and a peptide linker that covalently links the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the V-β chain. An array of
The soluble fusion protein includes a mouse-derived C-β chain fragment that covalently links the C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the bacteriophage gene III protein;
The DNA segment, wherein the C-β chain fragment is 50 to 126 amino acids in length and does not include the cysteine residue at position 127 of the entire mouse C-β chain region. A DNA segment comprising a sequence encoding a soluble fusion protein comprising:
The soluble fusion protein comprises a single chain T cell receptor and a bacteriophage gene VIII protein covalently linked to the single chain T cell receptor;
The single-chain T cell receptor includes a V-α chain, a V-β chain, and a peptide linker that covalently links the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the V-β chain. An array of
The soluble fusion protein comprises a mouse-derived C-β chain fragment that covalently links the C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the bacteriophage gene VIII protein;
The DNA segment, wherein the C-β chain fragment is 50 to 126 amino acids in length and does not include the cysteine residue at position 127 of the entire mouse C-β chain region. A DNA vector comprising the DNA segment according to claim 9 . The DNA segment according to claim 9 , wherein the promoter and leader sequence are phoA and pelB derived from Escherichia coli, respectively. A bacteriophage library comprising a plurality of bacteriophages displaying a soluble fusion protein comprising:
Each of the plurality of soluble fusion proteins comprises a single chain T cell receptor and a bacteriophage coat protein covalently linked to the single chain T cell receptor;
The single-chain T cell receptor includes a V-α chain, a V-β chain, and a peptide linker that covalently links the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the V-β chain. An array of
The soluble fusion protein comprises a mouse-derived C-β chain fragment that covalently links the C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the bacteriophage coat protein;
The bacteriophage library, wherein the C-β chain fragment is 50 to 126 amino acids in length and does not contain the cysteine residue at position 127 of the entire mouse C-β chain region. The bacteriophage library according to claim 14 , wherein the C-terminus of the V-α chain is covalently linked to the N-terminus of the V-β chain by the peptide linker sequence. The bacteriophage library according to claim 14 , wherein the soluble fusion protein further comprises at least one protein label. The bacteriophage library according to claim 14 , wherein the V-α chain and V-β chain are isolated from an immunologically weak mammal. The bacteriophage library according to claim 14 , wherein the V-α chain and V-β chain are isolated from a mouse. The bacteriophage library according to claim 14 , wherein the mouse has a transgene capable of expressing an HLA-A2 antigen complex. The bacteriophage library according to claim 14 , wherein the V-α chain and V-β chain are obtained from a person who develops or is suspected to develop cancer, an infectious disease, an autoimmune disease, or an allergy. . The bacteriophage library according to claim 20 , wherein the infectious disease is caused by infection with an RNA virus or a DNA virus. The bacteriophage library according to claim 21 , wherein the RNA virus is a human immunodeficiency virus. The bacteriophage library according to claim 21 , wherein the DNA virus is selected from the group consisting of cytomegalovirus, adenovirus, polyoma virus, influenza virus, or poxvirus. The bacteriophage library according to claim 14 , wherein the bacteriophage coat protein is a gene VIII protein. A kit comprising the bacteriophage display library according to claim 14 , a host cell sample, and instructions for use thereof. A bacteriophage library comprising a plurality of bacteriophages displaying a soluble fusion protein mutant, comprising:
Each of the plurality of soluble fusion protein mutants comprises a single chain T cell receptor and a bacteriophage coat protein covalently linked to the single chain T cell receptor;
The single-chain T cell receptor includes a V-α chain, a V-β chain, and a peptide linker that covalently links the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the V-β chain. An array of
The soluble fusion protein comprises a mouse-derived C-β chain fragment that covalently links the C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the bacteriophage coat protein;
The bacteriophage library, wherein the C-β chain fragment is 50 to 126 amino acids in length and does not contain the cysteine residue at position 127 of the entire mouse C-β chain region. A method for isolating a soluble fusion protein comprising:
Introducing a DNA vector comprising a sequence encoding a soluble fusion protein into a host cell;
Culturing the host cell in a culture medium under slow induction conditions allowing expression of the fusion protein;
Purifying the fusion protein from the host cell or medium to isolate a soluble fusion protein,
The soluble fusion protein comprises a single chain T cell receptor and a bacteriophage coat protein covalently linked to the single chain T cell receptor;
The single-chain T cell receptor includes a V-α chain, a V-β chain, and a peptide linker that covalently links the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the V-β chain. An array of
The soluble fusion protein comprises a mouse-derived C-β chain fragment that covalently links the C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the bacteriophage coat protein;
A method for isolating a soluble fusion protein, wherein the C-β chain fragment has a length of 50 to 126 amino acids and does not contain the cysteine residue at position 127 of the entire mouse C-β chain region. Contacting the host cell or culture medium extract with a synthetic matrix capable of specifically binding the fusion protein;
The method for isolating a soluble fusion protein according to claim 27 , further comprising the step of purifying the fusion protein from a synthetic matrix and isolating the soluble fusion protein. A method for isolating a DNA segment comprising a sequence encoding a soluble fusion protein, comprising:
Infecting a host cell with a bacteriophage library comprising a plurality of bacteriophages presenting a plurality of soluble fusion proteins;
Culturing the host cell under slow induction conditions allowing the plurality of bacteriophages to grow; and
At least one bacteriophage that has formed a specific binding complex by contacting the molecule with the plurality of bacteriophages under conditions capable of forming a specific bond between the molecule and at least one bacteriophage. Production process,
Identifying one of the bacteriophages that form the specific binding complex;
Growing said bacteriophage and isolating a DNA segment from said bacteriophage,
Each of the soluble fusion proteins comprises a single chain T cell receptor and a bacteriophage coat protein covalently linked to the single chain T cell receptor;
The single-chain T cell receptor includes a V-α chain, a V-β chain, and a peptide linker that covalently links the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the V-β chain. An array of
The soluble fusion protein comprises a mouse-derived C-β chain fragment that covalently links the C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the bacteriophage coat protein;
The method for isolating a DNA segment, wherein the C-β chain fragment has a length of 50 to 126 amino acids and does not contain the cysteine residue at position 127 of the entire mouse C-β chain region. 30. The method for isolating a DNA segment according to claim 29 , further comprising the step of inserting the DNA segment into a DNA vector capable of expressing a soluble fusion protein in the host cell. A method for enhancing the specific binding affinity of a single chain T cell receptor for a ligand comprising the steps of:
Determining a first specific binding affinity between the single chain T cell receptor and a ligand;
Infecting a plurality of host cells with the bacteriophage library according to claim 26 under conditions allowing growth of the bacteriophage;
Contacting the plurality of host cells with the ligand capable of sufficiently binding specifically with at least one bacteriophage produces at least one specific binding complex comprising the bacteriophage and the ligand. Process,
Identifying a bacteriophage that forms the specific binding complex;
Isolating DNA from the bacteriophage comprising a sequence encoding a soluble fusion protein mutant and expressing the soluble fusion protein mutant;
Separating a soluble single chain T cell receptor mutant from the soluble fusion protein mutant;
Determining a second specific binding affinity between the single chain T cell receptor mutant and the ligand;
A single chain T cell receptor mutant having a second specific binding affinity greater than the first specific binding affinity is converted to a single chain T cell receptor having an enhanced specific binding affinity for a ligand. A method for enhancing the specific binding affinity of a single chain T cell receptor for a ligand comprising the step of: A method for detecting a molecule capable of forming a specific binding with a T cell receptor comprising:
A bacteriophage display library comprising a plurality of bacteriophages, each presenting a plurality of fusion proteins, and the molecule specific to the molecule and at least one bacteriophage in the library Incubating under conditions that allow the binding complex to form sufficiently;
Detecting the specific binding complex as indicative of a molecule capable of forming specific binding with a T cell receptor,
The fusion protein comprises a single chain T cell receptor and a bacteriophage coat protein covalently linked to the single chain T cell receptor;
The single-chain T cell receptor includes a V-α chain, a V-β chain, and a peptide linker that covalently links the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the V-β chain. An array of
The soluble fusion protein comprises a mouse-derived C-β chain fragment that covalently links the C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the bacteriophage coat protein;
The C-β chain fragment is 50 to 126 amino acids in length and does not contain the cysteine residue at position 127 of the entire mouse C-β chain region, and forms a specific bond with the T cell receptor. Possible molecular detection methods. A method for detecting a molecule capable of inhibiting specific binding between a ligand and a T cell receptor comprising:
Incubating a soluble fusion protein in the presence of the ligand;
A mouse comprising a bacteriophage coat protein covalently linked to a single chain T cell receptor and covalently linked between the C-terminus of the single chain T cell receptor and the N-terminus of the bacteriophage coat protein Incubating a soluble fusion protein further comprising a derived C-β chain fragment in the presence of the ligand and molecule;
Assessing the interaction between the ligand and the soluble fusion protein in the presence and absence of the molecule,
The soluble fusion protein comprises a single chain T cell receptor and a bacteriophage coat protein covalently linked to the single chain T cell receptor;
The single-chain T cell receptor includes a V-α chain, a V-β chain, and a peptide linker that covalently links the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the V-β chain. An array of
The soluble fusion protein comprises a mouse-derived C-β chain fragment that covalently links the C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the bacteriophage coat protein;
The C-β chain fragment is a fragment that is 50 to 126 amino acids in length and does not include the cysteine residue at position 127 of the entire mouse C-β chain region;
If the interaction between the fusion protein and the ligand in the presence of the molecule is reduced compared to the interaction in the absence of the molecule, the molecule will exhibit specific binding between the ligand and the T cell receptor. A method for detecting a molecule capable of inhibiting specific binding between a ligand and a T cell receptor, which indicates inhibition.

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