JP2001514503A - Fusion protein comprising bacteriophage coat protein and single-chain T cell receptor - Google Patents

Fusion protein comprising bacteriophage coat protein and single-chain T cell receptor

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(57)【要約】 本発明は、バクテリオファージ外殻タンパク質と一本鎖Ｔ細胞レセプターとを含んでなる新規な融合タンパク質、及び、この複合体の使用方法に関するものである。ある側面から見れば、本発明は、一本鎖Ｔ細胞レセプターに共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質を含んでなる可溶性融合タンパク質に関するものであり、上記の一本鎖Ｔ細胞レセプターは、ペプチドリンカー配列によりＶ−ベータ鎖に共有結合されたＶ−アルファ遺伝子を含んで構成されている。本発明に係る可溶性融合タンパク質は、様々な応用において有用である。その中には例えば、１）一本鎖Ｔ細胞レセプターを呈示するバクテリオファージ・ライブラリを構築し、該ライブラリを一本鎖Ｔ細胞レセプターに結合するリガンドの同定および単離のためのスクリーニングに使用すること、及び、２）該融合タンパク質から、可溶性かつ十分な機能性を有する一本鎖Ｔ細胞レセプターを単離する方法、等が含まれる。   (57) [Summary] The present invention relates to a novel fusion protein comprising a bacteriophage coat protein and a single-chain T cell receptor, and a method for using this complex. In one aspect, the invention relates to a soluble fusion protein comprising a bacteriophage coat protein covalently linked to a single-chain T cell receptor, wherein the single-chain T cell receptor is a peptide linker. It comprises a V-alpha gene covalently linked to a V-beta chain by a sequence. The soluble fusion protein according to the present invention is useful in various applications. Among them are, for example, 1) constructing a bacteriophage library displaying single-chain T cell receptors and using the library for screening for identification and isolation of ligands that bind to single-chain T cell receptors. And 2) a method for isolating a soluble and sufficiently functional single-chain T cell receptor from the fusion protein.

Description

【発明の詳細な説明】 バクテリオファージ外殻タンパク質および一本鎖Ｔ細胞レセプターを含んでなる 融合タンパク質 １．発明の分野 本発明は、バクテリオファージ外殻タンパク質と一本鎖Ｔ細胞レセプターとを 含んでなる融合タンパク質、ならびに該融合タンパク質の製造および使用方法に 関するものである。この融合タンパク質は、イン・ビトロにおいて結合分子のス クリーンニングに使用されるバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリの 生成等、様々な応用で有用である。 ２．発明の背景 Ｔ細胞反応（応答）は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）に結合する抗原により調 節される。ＴＣＲの一種に、α・β鎖からなり、免疫グロブリン可変（Ｖ）およ び不変（Ｃ）領域に類似に形成される細胞膜結合ヘテロダイマーがある。ＴＣＲ のα鎖は、共有結合したＶ−αとＣ−α鎖を含んでおり、β鎖はＣ−β鎖に共有 結合したＶ−β鎖を含んでいる。Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖は、主要組織適合遺伝 子複合体（ＭＨＣ）（人の場合、ＨＬＡ複合体）と関連して、スーパー抗原また は抗原を結合可能なポケット（嚢）またはクレフト（裂溝）を形成する。一般的 な事項に関しては、Fundamental Immunology 3rd Ed.，W.Paul Ed．Rsen Press LTD．New York(1993)を参照されたい。 ＴＣＲは、免疫システムの発生および機能に関して重要な役割を担うと見なさ れている。例えば、ＴＣＲは、細胞攻撃を仲介し、Ｂ細胞の増殖を促進し、ガン 、アレルギー、ウイルス感染、自己免疫疾患等の種々の疾患の発症および悪化の 原因となることがすでに報告されている。従って、以前から、研究および医療現 場用のＴＣＲ入手方法の開発には、多大な関心が寄せられている。 一般に、ＴＣＲを大量に単離することは容易ではなかった。例えば、大部分の ＴＣＲ調製方法は、大腸菌における発現を利用しているが、大腸菌では、変則的 に折り畳まれた不溶性ＴＣＲ分子の実例としての封入体が頻繁に形成される。従 って、上記の方法では、可溶化およびタンパク質を再び折り畳むという厄介なス テップを実施してからでないとＴＣＲは入手できず、しかも上記ステップは、Ｔ ＣＲの生産率を著しく低下させ、ＴＣＲの安定性および機能性に悪影響を与える 。 他のＴＣＲの入手法として、より可溶性が高いＴＣＲを構成する試みが専らな されている。例えば、ＴＣＲと、免疫グロブリンの不変領域、ホスファチジルイ ノシトール結合配列(phosphatidylinositol linkage sequences)、ＣＤ３鎖等の 様々なポリペプチド配列とを融合させている。多くの場合、その目的は、ＴＣＲ を細胞表面に発現させ、より多くのタンパク質を折り畳まれた状態とすることに ある。その後、ＴＣＲ融合タンパク質を細胞表面から分離してＴＣＲを入手する 。しかしながら、上記方法では、可溶性かつ機能性を有するＴＣＲの生成量はと ても少ない。例えば、Gregoire，C.，et al．(1991)PNAS，88,8077;Matsui，K. ，et al．(1991)Science 254，1788(1991);Engel，I.，et al．(1992)Science 2 56，1318;Lin,A.Y．et al.，(1990)Science 249，677を参照されたい。 他の試みとして、融合Ｖ−αおよびＶ−β鎖を有する一本鎖Ｔ細胞レセプター （つまりｓｃＴＣＲ）を生成するものがある。Novotny，J，et al．PNAS（USA） C．and Pluckthun，A.,J.Mol.Biol.242,655(1994);Kurucz,I.et al.PNAS（USA） 90 3830(1993);and PCT WO 96/13593;Ward，E.S．et al.，J.Mol.Biol.224,885, (1992);and Schlueter，C.J．et al．J.Mol.Biol.256,859(1996)を参照されたい 。 しかながら、ｓｃＴＣＲ単離方法の多くは、変則的に折り畳まれた不溶性分子 を生成すると報告されている。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／１８１０５公報に は、ｓｃＴＣＲを大腸菌において発現させる方法が開示されているが、開示方法 では、ｓｃＴＣＲを入手するには厄介なタンパク質を再び折り畳むステップや可 溶化ステップが必要であり、ｓｃＴＣＲの生産率は通常低い。上述のWard，E.S ．et al．及び上述のSchlueter，C.J．を参照されたい。 ｓｃＴＣＲの精製度を高める方法が数種開発されている。該方法では、細胞表 面、または細菌原形質空間において、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現させてい る。例えば、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ｓｃＴＣＲとＣ−β鎖および細胞内 シグナル領域（ＷＯ９６／１８１０５参照）とを融合させることで生成される。 しかしながら、生成したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、細胞表面より取りはずさ なくてはならない上に、変則的に折り畳まれていることが多く、その生産率が低 下する。他のｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成方法では、マルトース（麦芽糖） 結合タンパク質を融合させ、原形質空間で発現させることに焦点を当てている（ ＷＯ９６／１３５９３参照）。しかしながら、通常、大量のｓｃＴＣＲ融合タン パク質を得るためには、タンパク質を再び折り畳むという厄介なステップが必要 とされる。 イン・ビトロおよびイン・ビボにおける、免疫システムに関わる分子の相互作 用の研究には、以前から重大な関心が寄せられていた。該相互作用の研究方法の 一つに、免疫システムに関わる分子を簡便な形態で提供することがあった。例え ば、バクテリオファージ・ライブラリは、イン・ビトロにおいて結合分子をスク リーニングするための抗体およびエピトープ（抗原決定基）を呈示する目的で使 用されてきた。Smith,G.P．and Scott,J.K．Methods in Enzym．217,228（1993 ）;Winter，G．et al．Ann.Rev.Immunol.12,433（1994）等を参照されたい。 従って、その取りはずしステップや、タンパク質を再び折り畳むステップを行 うことなく、十分な機能性を有する可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を大量に生 成する方法が望まれる。さらに、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、結合分子の生体 外（イン・ビトロ）スクリーニングが可能な形態で提供されるのが望ましい。 発明の開示 本発明は、バクテリオファージ外殻タンパク質（例えば、遺伝子IIIタンパク 質または遺伝子VIIIタンパク質）と共有結合（つまり融合）されたｓｃＴＣＲ分 子を含んでなるｓｃＴＣＲ融合タンパク質に関するものである。バクテリオファ ージ外殻タンパク質は、予期する以上にｓｃＴＣＲ融合タンパク質の可溶性を高 めるので、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生産率および機能性を著しく向上させる 。このｓｃＴＣＲ融合タンパク質は十分な可溶性かつ機能性を有しており、可溶 化、取りはずし、または、再び折り畳むという厄介なステップを行うことなく大 量に単離される。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の可溶性および機能性は、低速ホス ト（ 宿主）細胞誘導条件の付与、ならびに融合タンパク質の発現に作用するベクター 配列（リボソーム結合配列、リーダ（誘導）配列、およびプロモータ配列）を最 適化することでさらに向上する。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、様々な形態で提 供することが可能であり、例として、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と特異的に結合 する結合分子のスクリーニングに使用されるバクテリオファージ・ディスプレイ ・ライブラリを挙げることができる。 本発明の融合タンパク質（以降、場合によりｓｃＴＣＲ融合タンパク質または 可溶性融合タンパク質と称す）は、予期する以上の可溶性を有する。つまり、ｓ ｃＴＣＲとバクテリオファージ外殻タンパク質とを融合させると、可溶化、取り はずし、あるいはタンパク質を再び折り畳むという厄介なステップを行うことな く可溶性融合タンパク質が生成されることが発見された。発現細胞において形成 される封入体はごくわずかであるので、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成 率が飛躍的に向上する。加えて、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、予期する以上の 機能性を有する。つまり、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、融合されたバクテリオ ファージ外殻タンパク質の存在下で、特異的に結合分子（抗原）またはその他の リガンド（配位子）と結合する。 本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、融通性のあるペプチドリンカー配列を 介してＶ−α鎖と共有結合されたＶ−β鎖と融合される、バクテリオファージ外 殻タンパク質またはそのフラグメント（断片）を含んでなる。 一般に、バクテリオファージ外殻タンパク質とは、バクテリオファージ遺伝子 IIIタンパク質または遺伝子VIIIタンパク質を意味する。本発明において、バク テリオファージ外殻タンパク質は、全長を有する外殻タンパク質またはその好適 なフラグメント（下記参照）を含む。バクテリオファージ外殻タンパク質または その好適なフラグメントは、バクテリオファージ内にｓｃＴＣＲを包含し、該ｓ ｃＴＣＲをバクテリオファージ外殻をなす融合タンパク質構成分として呈示する 。具体的なバクテリオファージ外殻タンパク質フラグメントおよびバクテリオフ ァージ包含方法については、以下に詳細に記載される。 また、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、通常融合タンパク質標識を１つ 以上（通常１つか２つ）有しており、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と共存する細胞 成分からｓｃＴＣＲ融合タンパク質を精製する際に利用される。あるいは、さら に、該タンパク質標識を使用して、特異的な分解サイト（部位）を可溶性融合タ ンパク質に導入し、ｓｃＴＣＲ分子を該融合タンパク質から分解（分離）するこ とも可能である。従って、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質を使用して、融合 タンパク質を含まない十分な可溶性かつ機能性を有するｓｃＴＣＲ分子を入手す ることが可能である。 本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質から、重要な利益が多数得られる。例えば 、従来では、ｓｃＴＣＲ融合を入手するのには長時間にわたる調製過程が必要で あり、大量に生産する場合は、可溶化、およびタンパク質を再び折り畳むステッ プか必要な場合が多かった。一方、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、上記 ステップを行うことなく容易に単離および精製できるので、融合タンパク質の可 溶性、生産率、安定性および機能性が十分向上する。ここで重要なのは、融合タ ンパク質を使用することで、抗原提示細胞（ＡＰＣ）およびスーパー抗原とｓｃ ＴＣＲとの相互作用がより容易に分析可能となることである。加えて、以下に詳 細に記載するが、スーパー抗原やＡＰＣとの相互作用に関し、広範な種類の融合 タンパク質が提供可能となった。 本発明の融合タンパク質は、十分な可溶性かつ機能性を有するｓｃＴＣＲを含 む。従って、該融合タンパク質は、融合タンパク質と所望のリガンドとの相互作 用テストに使用可能な種々の発現システムと組み合わせて使用できる。 このｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、種々の利用法において有用である。例えば 、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡ断片（フラグメン ト）は、バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリの生成に使用可能であ る。ｓｃＴＣＲフラグメントを発現するライブラリとは対照的に、本バクテリオ ファージ・ライブラリは、全長を有するｓｃＴＣＲを融合タンパク質として発現 する。よって、本バクテリオファージ・ライブラリを使用すれば、ｓｃＴＣＲ、 特にｓｃＴＣＲ抗原結合ポケットの分析が促進される。従って、本バクテリオフ ァージ・ライブラリは、抗原、抗体、小分子、スーパー抗原、ＭＨＣ／ＨＬＡペ プチド複合体等、種々の結合分子を使用してのスクリーニングにおいて有用であ る。ここで重要なのは、本バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリは、 Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖を伴った融合タンパク質を発現するので、生体内で発見 されるＴＣＲにより類似した融合タンパク質が生成されることである。 加えて、本バクテリオファージ・ライブラリは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と 結合分子との特異的結合複合体を最大量形成するため、逆に、殆ど結合していな い、または結合力の弱い結合分子の検出がより増強される。本バクテリオファー ジ・ライブラリは、生体パニング技術(biopanning technique)、例えば、細胞パ ニングや免疫パニング技術、への応用が容易である。 バクテリオファージ・ライブラリの構成および使用 本発明のバクテリオファージ・ライブラリは、種々の結合分子のスクリーニン グに使用されるキット中に備えられる。つまり、キットには、Ｔ細胞等の対象と される細胞から生成された１つ以上のバクテリオファージ・ライブラリと、適切 な宿主細胞株（例えば、大腸菌株）と、キット使用説明書とが含まれる。 本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、十分な可溶性と機能性を有するポリペ ブチドとして発現する。バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリの構成 として使用する場合、ｓｃＴＣＲを、遺伝子IIIタンパク質、もしくは遺伝子VII Iタンパク質、またはそれらの適切なフラグメントに融合させ、ｓｃＴＣＲをバ クテリオファージ外殻（カプシド）成分として発現させる。何れの形態でも、ｓ ｃＴＣＲ融合タンパク質を適切な結合分子に接触させて、特異的結合複合体を形 成する。該結合分子は、以下に記載の標準的な方法により検出可能、また（所望 する場合）精製可能でもある。 ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を構成する目的で使用されるｓｃＴＣＲは、様々な ソースから生成される。該ソースには、以下に記載の市販のＴＣＲ ＤＮＡ配列 、または哺乳類、とくに人等の霊長類から採取される免疫細胞等の生物的ソース が含まれる。 本バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリは、ｓｃＴＣＲ融合タンパ ク質突然変異物を呈示するように構成しても良い。通常、ｓｃＴＣＲ融合タンパ ク質突然変異物とは、ｓｃＴＣＲ突然変異物に共有結合したバクテリオファージ 外殻タンパク質、またはその適切適当なフラグメントを含んでなる。該ｓｃＴＣ 突然変異物は、所望する結合分子に対する特異的結合親和性を高めるため、本発 明に従って選択可能である。ｓｃＴＣＲ突然変異物およびｓｃＴＣＲ融合タンパ ク質突然変異物の生成方法は、以下に詳細に記載する。 また、本発明は、ｓｃＴＣＲに共有結合したバクテリオファージ外殻タンパク 質またはその適切なフラグメントを含む可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質、をエ ンコードする配列からなるＤＮＡセグメントに関連する。通常、該ＤＮＡセグメ ントは、適切な宿主細胞中で融合タンパク質を発現可能なＤＮＡベクターとして 提供される。該ＤＮＡセグメントは、機能可能に連結されたプロモータおよびリ ーダ配列を含み、以下に記載の宿主細胞培養条件下でより多くの可溶性ｓｃＴＣ Ｒ融合タンパク質を発現させる。 さらに、本発明の可溶性融合タンパク質を単離する方法が試みられている。該 方法においては、可溶性融合タンパク質をエンコードする配列を含んでなるＤＮ Ａベクターを適切な宿主細胞に導入し（形質転換またはトランスフェクション） 、低速誘導条件下で宿主細胞を培地中で培養する。通常、低速誘導条件とは、培 地から必須栄養素（アミノ酸やリン酸塩等）が数時間かけて緩やかに取り出され 、融合タンパク質をエンコードする配列の発現が誘導される細胞培養条件のこと を指す。通常、低速誘導条件で誘導可能なＤＮＡベクターが選択される。そして 、生成された融合タンパク質は、（所望する場合）精製され、実質的に純粋なｓ ｃＴＣＲ融合タンパク質が生成される。以下に詳細に記載するが、低速誘導条件 は、可溶性と十分な機能性を有するｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生産を向上させ る。あるいは、上記方法を、一本鎖Ｔ細胞レセプターをエンコードするＤＮＡベ クターを含む場合に適用し、可溶性の一本鎖Ｔ細胞レセプターを発現させ、（所 望する場合）それを精製することも可能である。宿主細胞とは、細菌、昆虫、あ るいは哺乳類の細胞である。 本ｓｃＴＣＲ融合タンパク質に、１つ以上の適切なタンパク質標識（例えば、 ６ＸＨｉｓ）を付与し、融合タンパク質の細胞からの精製を容易とすることが望 ましい場合がある。通常、細胞培地あるいは細胞抽出物を、タンパク質標識を結 合した合成マトリックスに接触させる。あるいは、または、さらに、ｓｃＴＣＲ 融合タンパク質に、ｓｃＴＣＲを該融合タンパク質より分離する目的で使用可能 な１つ以上の分解性タンパク質標識を付与し、これにより可溶性かつ十分な機能 性を有するｓｃＴＣＲ分子を生成しても良い。 本発明には、本発明の可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードする配列 を含んでなるＤＮＡセグメントの単離方法も含まれる。通常、該方法では、本発 明により生成されたバクテリオファージ・ライブラリを宿主細胞に感染させ、細 胞内でバクテリオファージが増殖可能な条件下（例えば、低速誘導条件）で、該 細胞を培養する。次に、結合分子と少なくとも１つのバクテリオファージとが結 合可能な条件下で、感染細胞を所望の結合分子、望ましくは検知可能な標識が付 された結合分子に接触させる。バクテリオファージ・ライブラリのスクリーニン グ方法は当該技術分野では公知であり、例えば、以下に記載のSambrook et al． に説明されている。結果として形成される特異的結合複合体は認識され、続いて 、それを有するバクテリオファージが単離され、さらに、（所望する場合）精製 される。このようにして、該複合体に含まれるｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエン コードするＤＮＡセグメントが単離される。 タンパク質、ポリペプチド、および核酸等の結合分子に、検出可能な標識を付 す方法は当該技術分野では公知であり、例えば、下記のSambrook et al．やAusu bel et al.に説明されている。 さらに、所望のｓｃＴＣＲの特異的結合親和性の向上方法も提供される。通常 、該方法では、ｓｃＴＣＲと所望の結合分子（例えば、抗原やその他のリガンド ）との間の特異的結合親和性が決定され、続いて、適切な宿主細胞を融合タンパ ク質突然変異物を発現するバクテリオファージ・ライブラリにより感染させる。 次に、感染細胞を、所望の結合分子、望ましくは検知可能な標識を付した結合分 子に接触させて特異的結合複合体を形成した後、該特異的結合複合体が認識され る。次に、対応する融合タンパク質突然変異物をエンコードするＤＮＡセグメン トが、標準的な手段で単離される。所望する場合、ＤＮＡセグメントを、適切な ＤＮＡベクターにサブクローン化し、宿主細胞内で増殖させても良い。上記方法 により生成されたｓｃＴＣＲ突然変異物は、（所望する場合）適当なタンパク質 標識を分解して融合タンパク質から分離される。次に、抗原とｓｃＴＣＲ突然変 異物との間の特異的結合親和性が決定される。向上された特異的結合親和性を示 すｓｃＴＣＲは、ｓｃＴＣＲタンパク質よりも大きな特異的結合親和性を有する ｓｃＴＣＲ突然変異物として、容易に識別される。 哺乳類における不所望な免疫反応は、１つの方法、または、該方法に代わる他 の方法を組み合わせることで本発明により抑制または排除できる。通常、本発明 は、薬学上可能な処方で有効量のｓｃＴＣＲを供給することにより、哺乳類にお ける免疫反応（応答）を抑制または排除する治療法を提供する。通常、ｓｃＴＣ Ｒは、特に、ウイルス感染、自己免疫疾患、移植拒絶、またはガン等に伴う病原 性Ｔ細胞において発生するＴＣＲのうちの１つ以上のＴＣＲと、抗原をめぐり競 合しうるものである。特に、対応ＴＣＲと比較して、抗原に対する特異的結合親 和性が大きな（例えば２〜１０倍）ｓｃＴＣＲを使用して、所望の免疫反応を抑 制または排除することが可能である。タンパク質競合分析法は、当該技術分野で は公知であり、ｓｃＴＣＲの競合活性のスクリーニングに使用される。 加えて、本発明は、ｓｃＴＣＲまたはｓｃＴＣＲ融合タンパク質の精製サンプ ルを使用した、標準的免疫技術による（モノクローナルまたはポリクローナル） 抗体の生成方法を含む。通常、ｓｃＴＣＲは本発明の可溶性融合タンパク質より 入手されるので、ｓｃＴＣＲの生産率が従来と比較して向上する。抗体は、１つ 以上のｓｃＴＣＲのエピトープを含んでなる免疫原性ペプチドからも生成可能で ある。上記のような抗体、特にモノクローナル抗体は、血液または血清などの生 体サンプル中の病原性Ｔ細胞の検出など、様々な応用で有用である。また、該抗 体を使用して特に標的Ｔ細胞と抗原またはＭＨＣ／ＨＬＡペプチド複合体との相 互作用を抑えることにより、イン・ビボまたはイン・ビトロにおける標的Ｔ細胞 の活性を大幅に抑制、または、阻害しても良い。公知のように、適当な細胞障害 性物質または代謝拮抗物質を、該抗体に共有結合させておくことが望ましい場合 もある。 さらに、本発明は、有効量のｓｃＴＣＲ（本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質 から分離されたもの）を投与して、哺乳類、とくに人等の霊長類の免疫反応を誘 導する方法にも関連する。ｓｃＴＣＲの単離は、本発明にかかる可溶性かつ十分 な機能性を有するｓｃＴＣＲ融合タンパク質からｓｃＴＣＲを入手することで行 われる。該ｓｃＴＣＲは、Ｔ細胞（つまり，標的Ｔ細胞）の表面に発生し、免疫 反応において病原性、または、不所望な機能を果たすＴＣＲ抗原性構造に対する 免疫を、哺乳類に付与する目的で使用される。上記Ｔ細胞は生体サンプル中で、 従来公知の種々の方法により認識される。次に、該Ｔ細胞は精製され、以下に記 載の実施例に従い、イン・ビトロにおいて増殖反応が可能か否かが分析される。 増殖反応を示すＴ細胞は培養細胞系として確立され、該培養細胞系から、本発明 で開示の方法により、ＴＣＲをエンコードするＤＮＡが単離され、ｓｃＴＣＲ融 合タンパク質突然変異物などの、対応するｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成に使 用される。対象となるＴＣＲ抗原構造とは、通常、クロノトピックエピトープ(c lonotypic epitope)、Ｖ−αまたはＶ−βファミリー特異的エピトープ（Ｖ−α or Ｖ−β family-specific epitope）、配座エピトープ(conformational epito pe)、直線エピトープ等を指す。Ｔ細胞の表面に発生するＴＣＲ抗原構造に対す る免疫が付与されると、Ｔ細胞の活動が阻止され、該Ｔ細胞の病原性または不所 望な作用が抑制または排除される。通常、哺乳類は、有効量のｓｃＴＣＲ（本発 明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質から分離されたもの）を薬学上可能な処方により 投与されることで該免疫を取得し、これにより宿主免疫システムが標的Ｔ細胞を 著しく減少させる、または、排除する。 さらに、ＴＣＲと特異的に結合可能な結合分子（例えば、抗原）の検出方法も 試みられている。通常、該方法はイン・ビトロ スクリーニングにより行われ、 本発明のバクテリオファージ・ライブラリは、上記分子がライブラリ中の少なく とも１つのバクテリオファージと特異的に結合する条件下で、該分子の共存下で インキュベートされる。バクテリオファージにより呈示されるｓｃＴＣＲ融合タ ンパク質と、結合分子との間で形成された特異的結合複合体は、容易に検出され る。通常、該特異的結合複合体の存在は、バクテリオファージによりエンコード されたｓｃＴＣＲに対応する、ＴＣＲと特異的に結合可能な結合分子の存在を示 唆する。選択されたバクテリオファージは、本発明で開示する方法により容易に 増殖され、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントが単離 される。 さらに、本発明は、抗原とＴＣＲとの間の特異的な結合を阻害可能な結合分子 の検出方法に関連する。該方法は、本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質を、抗原 と該融合タンパク質とが特異的結合複合体を形成可能な条件下で、結合分子と共 にインキュベートするイン・ビトロ スクリーニングを含むものである。他の反 応において、該融合タンパク質は、同一または類似のインキュベート条件下で、 抗原と結合分子と共にインキュベートされる。以降、リガンドの存在下および非 存在下での抗原と融合タンパク質との相互作用が、標準的な結合分析法により分 析される。抗原とＴＣＲとの間の特異的な結合を阻害可能なリガンドとは、該リ ガンドの存在下で、融合タンパク質と抗原との相互作用がより低頻度で観測され るものを指す。 図面の簡単な説明 図１ＡはｐＪＲＳ１４９ベクターを、図１ＢはｐＫＣ１２ベクターを示す図で ある。 図２は、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡベクター形成のアウトライン を説明するフローチャートである。 図３は、ｐＫＣ４４、ｐＫＣ４６、およびｐＫＣ５１ ＤＮＡベクターの一部 を示す図である。 図４は、ｐＫＣ４５、ｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）、およびｐＫＣ５１ ＤＮ Ａベクター形成のアウトラインを説明するフローチャートである。 図５は、ＰＥＮ２ ＤＮＡベクターを示す図である。 図６Ａは、ｐＫＣ６１、ｐＫＣ６３、およびｐＫＣ６５ ＤＮＡベクターの一 部を示す図であり、図６Ｂは、ｐＫＣ６０、ｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）、ｐＫ Ｃ６４、ｐＫＣ６６、およびｐＫＣ６７ ＤＮＡベクターの一部を示す図である 。 図７は、ｐＫＣ６０、および、ｐＫＣ４６ ＤＮＡベクターそれぞれからの融 合タンパク質の合成を比較するウエスタン・ブロットである。 図８は、ＭＭ２９４、Ｋ９１Ｋａｎ、ＸＬ１−Ｂ、ＴＢ−１、およびＵＴ−５ ６００細胞系における、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現を示すウエスタ ン・ブロットである。 図９は、バクテリオファージ遺伝子VIIIタンパク質を含んでなるｓｃＴＣＲ融 合タンパク質の免疫親和精製のアウトラインを示す図である。 図１０は、ＤＮＡベクターｐＫＣ５１およびｐＫＣ４６、ならびにその精製フ ラクション（画分）由来の融合タンパク質の発現を示すウエスタン・ブロットで ある。 図１１は、ｐＫＣ５１ベクター由来の精製ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を示すク ーマシーブルー染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。 図１２は、ｐＫＣ５１ベクター由来の精製ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のウエス タン・ブロットである。 図１３は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質ｐＫＣ６０およびｐＫＣ６２による免疫 沈降（immunoprecipitation)実験を示すウエスタン・ブロットである。 図１４は、ｐＫＣ５１がエンコードする融合タンパク質の表面プラズマ共鳴分 析を示すグラフである。 図１５は、表面プラズマ共鳴分析による、抗−ＴＣＲ（Ｖ−β ８．２）抗体 （ＭＲ５−２）、抗−αβＴＣＲ抗体（Ｈ５７−５９７抗体）、および抗−Ｍ１ ３抗体間の相互作用を示す模式図である。 図１６は、ｐＫＣ６０がエンコードするｓｃＴＣＲ融合タンパク質と、ＳＥＣ ３スーパー抗原との間の結合の、表面プラズマ共鳴分析を示すグラフである。 図１７は、抗−ＨＳ７抗体を用いたエライザ法による、ｓｃＴＣＲ融合タンパ ク質を発現するバクテリオファージの捕獲を比較するグラフである。ｓｃＴＣＲ 融合タンパク質は、ｐｃＫ４６ベクターから発現したものである。 図１８は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現する、ｐＫＣ５１ベクターを用い て構成されたバクテリオファージの、エライザ法による滴定分析を示すグラフで ある。 図１９Ａは、ｐＫＣ５１ベクターがエンコードするｓｃＴＣＲ融合タンパク質 による、ｇＤ１２ハイブリドーマ細胞のＩＬ−２産生阻害を示す図であり、図１ ９Ｂは、ｐＫＣ５１ベクターがエンコードするｓｃＴＣＲ融合タンパク質による 、Ｄ０１１．１０Ｔハイブリドーマ細胞のＩＬ−２産生阻害を示す図である。 図２０は、ｐＫＣ７０、ｐＫＣ７１、およびｐＫＣ７２バクテリオファージベ クターを示す図である。 図２１Ａ〜２１Ｇは、以下に記載のＤＡＮベクターの構築に使用されるＤＮＡ オリゴヌクレオチド・プライマーを示す表である。図２１Ａには（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：１−１６）、図２１Ｂには（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：１７−３０ ）、図２１Ｃには（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：３１−４５）、図２１Ｄには（Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：４６−６３）、図２１Ｅには（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ． ：６４−７９）、図２１Ｆには（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：８０−９５）、図２ ＩＧには（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：９７−１００）を示す。 図２２は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＶ−β鎖の構築に使用されるＤＮＡオ リゴヌクレオチド・プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：１１６−１３１）を 示す表である。 図２３は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＶ−α鎖の構築に使用されるＤＮＡオ リゴヌクレオチド・プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ．：１０１−１１５）を 示す表である。 発明の詳細な記述 ここまでの記述でまとめたように、我々は、ｓｃＴＣＲ分子に共有結合したバ クテリオファージ外殻タンパク質あるいはその好適なフラグメントを含んでなる 、十分に可溶でかつ機能的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質を得た。該ｓｃＴＣＲは 、一本鎖ペプチドリンカー配列によってＶ−β鎖に共有結合したＶ−α鎖を含む 。該ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードしているＤＮＡのセグメントとベク ターとは、イン・ビトロにおいて結合分子を検出するのに好適な形でｓｃＴＣＲ 融合タンパク質を呈示するバクテリオファージ・ライブラリを構築するのに役に 立つ。 一般に、本ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ここに開示する過程と、一般に知ら れた組換えＤＮＡ技術とを用いて調製することができる。従来の技術には、例え ば、プラズマＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡの切り出し、ＤＮＡのライゲ ーション、宿主細胞の形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーショ ン、あるいはバイオリスティック転換、宿主細胞の培養、発現させたＤＮＡの単 離と精製などがあげられる。一般的な説明については、Sambrook et al．in Mol ecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed．1989);及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，198 9を参照されたい。なお、これらの文献は参考文献としてここに記されるもので ある。 本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、あるｓｃＴＣＲに融合したバクテ リオファージ外殻タンパク質あるいはその適当なフラグメントを含んだ一本鎖融 合タンパク質である。通常、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフ ラグメントは、大腸菌の繊維状ファージ由来の遺伝子IIIタンパク質または遺伝 子VIIIタンパク質である。該ｓｃＴＣＲは、好適なペプチドリンカーによりＶ− β鎖に融合されたＶ−α鎖を含んでなる。したがって、該ｓｃＴＣＲはＴ細胞に 関連したＴＣＲ由来のＶ−α鎖及びＶ−β鎖に相当する。Ｔ細胞は自然の状態で も存在するし、あるいは癌に付随して起こる免疫機構疾患、自己免疫機構障害、 アレルギー、あるいはウイルス感染などの病気と関連しても見つかる。一般に、 ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＶ−α鎖及びＶ−β鎖は、長さがおよそ２００個か ら４００個のアミノ酸に相当し、好ましくは、およそ３００個から３５０個のア ミノ酸に相当し、また、ＴＣＲのＶ−α鎖及びＶ−β鎖に少なくとも９０％、好 ましくは１００％相同なものである。ここで、”相同である”とは、該Ｖ−α鎖 及びＶ−β鎖をなすアミノ酸が、対応するＴＣＲのＶ−α鎖及びＶ−β鎖と１０ ０％同一であることを意味する。本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質と結合 分子との間の特異的な結合は、免疫吸着や免疫滴下などの方法で評価することが できる。 先に述べたように、該ｓｃＴＣＲは大腸菌の繊維状ファージ由来のバクテリオ ファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントと融合させることができる。 繊維状ファージの典型的な例は、上記のSambrook et al．とSmith and Scottと が開示している。ここで”フラグメント”とは、バクテリオファージにパッケー ジングする（包含される）ことができ、かつバクテリオファージの表面に本発明 に係る可溶性融合タンパク質を呈示できるバクテリオファージ外殻タンパク質の 一部を意味している。一般に、バクテリオファージ遺伝子VIIIフラグメントは、 長さが４０個から５０個のアミノ酸に相当し、好ましくは、およそ５０個のアミ ノ酸に相当する。バクテリオファージ遺伝子IIIフラグメントは、長さがおよそ ２０ ０個から４００個のアミノ酸に相当し、好ましくは、およそ４００個のアミノ酸 に相当する。バクテリオファージ外殻タンパク質フラグメントが好適にバクテリ オファージにパッケージされているかどうかを決定する方法は公知であり、一般 に血小板型分析に関する方法で行われる。さらに、バクテリオファージ外殻タン パク質フラグメントは、下記の生体パニング分析などの標準的な免疫学的方法で 決定したものにしたがってｓｃＴＣＲ融合タンパク質をバクテリオファージの表 面に呈示することができる。バクテリオファージ外殻タンパク質フラグメントは 、ここで記述するように、バクテリオファージ外殻タンパク質をエンコードする ＤＮＡの一部が除去されるようにＤＮＡベクターを突然変異（つまり、サイト標 的突然変異誘導あるいは端末の欠失）させる、等の様々な方法で作ることができ る。そして、該ＤＮＡベクターは、フラグメントをエンコードするＤＮＡを、ｓ ｃＴＣＲをエンコードする所望のＤＮＡのセグメントに融合させる目的で使用さ れる。 ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＶ−α鎖は、Ｖ−α鎖のＣ末端とＶ−β鎖のＮ末 端とに融合する好適なペプチドリンカーを介してＶ−β鎖に共有結合している。 Ｖ−β鎖は、Ｖ−β鎖のＣ末端に融合したＣ−β鎖フラグメントをさらに含んで いても良く、Ｖ−α鎖は、Ｖ−α鎖のＣ末端とペプチドリンカーのＮ末端とに融 合したＣ−αフラグメントをさらに含んでいても良い。一般に、Ｃ−β鎖フラグ メントは、長さがおよそ５０個から１２６個のアミノ酸に相当する。重要なこと は、該Ｃ−β鎖フラグメントが、第１２７位（最後）のシステイン残基を含まな いことである。Ｃ−α鎖フラグメントは、長さがおよそ１個から２１個のアミノ 酸に相当し、おおよそＣ−α鎖の第１位のアミノ酸（イソロイシン）から第２１ 位のアミノ酸に相当する。該Ｃ−α鎖フラグメントはシステイン残基を一切含ま ない。バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントは、Ｖ−β 鎖あるいはＣ−βフラグメントのＣ末端と融合される。また、これとは異なり、 タンパク質標識をＶ−β鎖（あるいはＣ−β鎖フラグメント）のＣ末端と、バク テリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントのＮ末端とに融合させ ても良い。また、該タンパク質標識をＶ−β鎖（あるいはＣ−β鎖フラグメント ）のＣ末端と、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントの Ｎ末端とに融合させ、第２のタンパク質標識（同じでも良いし、異なっていても 良い）をバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントのＣ末端 に融合させても良い。これとはさらに異なり、該タンパク質標識をバクテリオフ ァージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントのＣ末端に融合させ、このバク テリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントをＮ末端においてさら にＶ−β鎖（あるいはＣ−β鎖フラグメント）のＣ末端に融合させても良い。 さらに手が加えられたｓｃＴＣＲ融合タンパク質としては、Ｖ−α鎖のＮ末端 に融合されたタンパク質標識を有するｓｃＴＣＲ融合タンパク質が挙げられる。 また、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントをＶ−α鎖 （あるいはＣ−αフラグメント）のＣ末端に融合させ、この鎖をＶ−α鎖のＮ末 端に融合したペプチドリンカーによってＶ−β（あるいはＣ−βフラグメント） のＣ末端と共有結合的にリンクさせても良い。 本発明に係る別のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ペプチドリンカー配列を２つ 含んでおり、第１のペプチドリンカー配列はＶ−α鎖のＣ末端とＶ−β鎖のＮ末 端とに融合している。Ｖ−β鎖のＣ末端は、適当なＣ−β鎖フラグメントのＮ末 端に融合している。さらに、第２のペプチドリンカー配列は、Ｃ−β鎖フラグメ ントのＣ末端とバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントの Ｎ末端とに融合している。 融合タンパク質に含まれるｓｃＴＣＲ分子は、ペプチドリンカー配列を含んで なり、該ペプチドリンカー配列はＶ−α鎖とＶ−β鎖を効果的に配置する目的で 柔軟な使い方ができる。つまり、ペプチドリンカー配列によりＶ−α鎖とＶ−β 鎖とは、抗原などの分子を特異的に結合可能なポケットに配置される。ｓｃＴＣ Ｒ融合タンパク質に結合する抗原は、下記の分析で決定したＴ細胞の活性を調節 する目的で使用できる。こういった分析の典型的な例として、ＴＣＲを発現する Ｔ細胞を培養して増殖させ、Ｔ細胞をｓｃＴＣＲ融合タンパク質（あるいはそこ から得られたｓｃＴＣＲ）と接触させ、次に該融合タンパク質がＴ細胞の活性を 調節できるかどうか評価する一連のステップを含んだイン・ビトロ分析が挙げら れる。 以上で述べたｓｃＴＣＲ融合タンパク質のいずれにおいても、Ｖ−β鎖は、Ｖ −β鎖のＣ末端とＶ−α鎖のＮ末端とに融合する好適なペプチドリンカーを介し てＶ−α鎖に共有結合している。 所望のＶ−α鎖とＶ−β鎖とをエンコードするＤＮＡセグメントは、Ｔ細胞ハ イブリドーマや、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）などのＴ細胞を初めとする様々な ものから得ることができる。ＣＴＬは自然の状態でも存在するし、また、げっ歯 類（マウス、ラット、ウサギ）あるいは霊長類（人、チンパンジー）の病原免疫 機構反応と関連しても存在する。例えば、ＣＴＬはウイルス感染、癌、自己免疫 疾患、アレルギー、あるいは移植拒絶反応を起こしている患者、あるいはその疑 いのある患者から採取することができる。さらに具体的には、ＣＴＬを、ＤＮＡ あるいはＲＮＡウイルスに罹患した患者から単離して、本発明の方法にしたがっ てｓｃＴＣＲ融合タンパク質を作り出すことができる。例えば、ｓｃＴＣＲ融合 タンパク質は、長期非進行と類別されたＨＩＶ患者から得られるＣＴＬを使って 調製できる。下記の実施例１８を参照されたい。ＣＴＬは、これ以外に、定着（ established）悪性腫瘍や黒色腫の患者から単離される、抗原特異的なＣＴＬや ＴＩＬからも得られる（例えば、Cox A．et al．Science（1994）264:716;Rosen berg，S.A．et al．N．Eng．J．Med．(1988)319:1676;Kawakami，Y．et al．J． Exp．Med．(1994)180:347;Kawkami，Y．et al．PNAS（1994）91:6458を参照）。 特に注目される病原免疫反応としては、硬化症、インシュリン依存糖尿病、リュ ウマチ性の関節炎、アレルギー、癌（つまり、ＣＥＡなど、腫瘍に関連する抗原 に対する免疫反応）、組織や皮膚などの移植手術を行った患者の細胞組織拒絶反 応、感染性の疾患、特にＲＮＡウイルスあるいはＤＮＡウイルスが関与する感染 性の疾患などが挙げられる。具体的に注目されるウイルスとしては、ヒト免疫不 全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザウイ ルス、肝炎ウイルス、ポックスウイルス、エプステインバー（Epstein Barr）、 アデノウイルス、ポリオーマウイルスなどか挙げられる。また、該Ｖ−α鎖とＶ −β鎖とをエンコードするＤＮＡのセグメントは、以下に記すＴＣＲのＤＮＡ配 列を開示する公共のデータベースからも入手可能である。 細胞からＶ−α鎖とＶ−β鎖とを得ることに関し、そのＤＮＡセグメントを調 製するにはいくつかの方法がある。具体的には、α鎖ＤＮＡとβ鎖ＤＮＡとを調 製するために、所望のＴＣＲ結合特異性を示す細胞よりｍＲＮＡを分離する。こ の方法では、一般に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、つまりｍＲＮＡから作 った第１ストランドｃＤＮＡ鋳型を用いるプロトコールが使用される。そして、 標準的な組換え技術を使って該所望のＶ−α鎖とＶ−β鎖を作る。上記所望のα 鎖とβ鎖とをエンコードするＤＮＡセグメントを、次に、適当なペプチドリンカ ー配列とタンパク質標識とを含むように調製する。次に、必要に応じて、ＤＮＡ を適当なパッケージングシステムにパッケージし、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を 呈示する組換えバクテリオファージを生成する。該ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を エンコードするＤＮＡセグメントは、サブクローニング技術、あるいは、ｓｃＴ ＣＲ融合タンパク質の挿入片の側方に付されたバクテリオファージＤＮＡにハイ ブリッドするＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅法など、 従来の組換え技術でバクテリオファージから容易に分離できる。一般に、オリゴ ヌクレオチドは、その長さがおよそ１２個から５０個のヌクレオチドよりなり、 より好ましくは、およそ２０個から２５個のヌクレオチドよりなる。このように して得られた、該融合タンパク質をエンコードするＤＮＡを使えば、大腸菌など の好適な宿主細胞内で相当量の可溶性融合タンパク質（１ｇの細胞に対してミリ グラム単位の量）が調製できる。 ＤＮＡセグメントは通常リーダー配列を含み、適切な細胞プロセシングを行う ことができる。一般に、リーダー配列はｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコード する配列の５’末端に融合している。具体的には、該リーダーはＶ−α鎖を（実 施の形態によってはＶ−β鎖を）エンコードするＤＮＡ配列の５’末端に共有結 合している。ただし、特異的なリーダー配列はベクター中の特定のα鎖あるいは β鎖にリンクしているのであるが、組換え技術を使って、融合タンパク質のプロ セシングに悪影響を及ぼすことなくリーダー配列を入れ替えることができること が理解されよう。したがって、好適な実施例のうちの一つでは、Ｖ−α鎖の５’ 末端がリーダー配列の３’末端に共有結合している。リーダー配列は、長さがお よそ１２個から２６個のアミノ酸残基よりなる。好適なリーダー配列は、下記の 実施例３で開示する改変Ｐｅｌ Ｂ配列である。 ＤＮＡセグメントは通常、ｔｒｐオペロンプロモーター、ラックプロモーター 、ｔｒｐ−ラックプロモーター、ラックuvsプロモーターあるいはｐｈｏＡプロ モーターなどのプロモーターをさらに含んでなる。好適なプロモーターは、例え ばｐｈｏＡなどの、数時間（例えば２時間から１０時間）にわたる低速誘導条件 下において、強力かつ調節的な発現に寄与するものである。好適な培養条件下で は、強力なプロモーターのほとんどが、宿主細胞のタンパク質総量の１０％程度 、あるいはそれを超える融合タンパク質を生成しうる。 本発明のバクテリオファージ・ライブラリは、数ステップで容易に作ることが できる。例えば、ｓｃＴＣＲをエンコードするＤＮＡセグメントは、上で概説し た方法で作ることができる。次にＤＮＡを好適なファージあるいはファージ由来 のベクター（例えばファージミド）にライゲーションし、該ＤＮＡを、バクテリ オファージ外殻タンパク質、通常は、遺伝子IIIタンパク質または遺伝子VIIIタ ンパク質をエンコードする配列に融合させる。これ以外に、バクテリオファージ 外殻タンパク質フラグメントに融合させても良い。このようにして生成された組 換えファージ、あるいはファージ由来の組換えベクターは、バクテリオファージ 外殻タンパク質あるいはそのフラグメントに融合したｓｃＴＣＲを含んでいる。 場合によっては、上記のように単数あるいは複数のタンパク質標識をエンコード する配列、あるいは停止コドンをさらに含んでいることが望ましい。続いて、好 適な大腸菌系統に感染させると、バクテリオファージの表面に該融合タンパク質 が多数部（通常は数十部から数百部）呈示される。注目しているｓｃＴＣＲを呈 示する組換えビリオンの生成量を増やすためには、ヘルパーファージを加える。 異なるバクテリオファージと大腸菌系統とを用いてバクテリオファージ・ディス プレイ・ライブラリを構築する一般的な方法は開示されている。一般の記述につ いては、上記のSmith and ScottやParmley，S.F.，and Smith，G.P..(1988)Gene 73,305を参照されたい。 バクテリオファージ・ライブラリを作成するに使用される特定のｓｃＴＣＲと しては、哺乳類から得られるＶ−α鎖及び／またはＶ−β鎖を有するｓｃＴＣＲ が挙げられる。啼乳類の典型例としては霊長類やげっ歯類が挙げられるか、霊長 類中では特に人とチンパンジーが挙げられ、げっ歯類としては、免疫的に虚弱な 、ヌードマウス、あるいはＨＬＡ−ＡＳ抗原複合体を発現可能なトランスジーン を含んだマウスが挙げられる（Vitiello，A．et al.，J．Exp．Med.，(1991)175 ,1002）。人の中で特に注目すべきは癌、感染症、自己免疫疾患、あるいは移植 拒絶反応を起こしている、あるいはその疑いのある患者である。 本発明に係るバクテリオファージ・ライブラリは、融合タンパク質突然変異物 を呈示するようにも構築できる。この”突然変異物”とは、突然変異したアミノ 酸を１分子当たり平均１つ含んだ融合タンパク質を指す。さらに具体的には、ア ミノ酸の突然変異とは、融合タンパク質のｓｃＴＣＲ部分においてアミノ酸が置 換されたものを指し、これによりｓｃＴＣＲ突然変異物が生成される。一般に、 ｓｃＴＣＲ突然変異物は、平均して１つのアミノ酸置換を含むように構築される 。突然変異物の生成及び分析方法については以下に詳しく記す。 ｓｃＴＣＲ融合タンパク質突然変異物を呈示するバクテリオファージ・ライブ ラリは数ステップで容易に生成できる。例えば、上記のようにペプチドリンカー 配列によって結合された、好適なＶ−α鎖をエンコードするＤＮＡセグメントと Ｖ−β鎖をエンコードするＤＮＡセグメントとを単離することで、所望のｓｃＴ ＣＲが得られる。該ＤＮＡをライゲーションし、次に、ｓｃＴＣＲＣのＶ−α鎖 およびＶ−β鎖における所望の領域内に、例えば、局所的に突然変異を導入する ことで該ＤＮＡを改変する。突然変異の誘導方法の典型例としては、アラニン走 査突然変異誘導(alanine scanning mutagenesis)が挙げられる（例えば、Nisbet ,I.T．et al．(1985)Gene Anal．Tech．2,23;Hines，J.C.，Gene（1980）11,207 ;及び上記のSambrook et al．を参照）。上記突然変異は、ｓｃＴＣＲの相補性 決定領域（すなわちＣＤＲ、あるいは高頻度可変領域とも呼ばれる）が有する結 合親和性に影響を及ぼすアミノ酸置換であれば、ここでは好適である。更に具体 的には、該アミノ酸置換とは同類置換あるいは非同類置換であり、ここで使用す るように、あるアミノ酸とｓｃＴＣＲ中のアミノ酸とを置き換えることを意味し ている。場合によっては、この置換には、あるアミノ酸を、化学的性質が相当類 似した他のアミノ酸で置き換える（同類置換）ことが含まれるし、また、場合に よっては、あるアミノ酸を、化学的性質が相当異なる他のアミノ酸で置き換える （非同類置換）ことが含まれる。したがって、フェニルアラニン残基でｓｃＴＣ Ｒ中のチロシン残基の置換が行われると、これは同類アミノ酸置換であり、プロ リン残基でアラニン残基の置換が行われると、これは非同類アミノ酸置換である 。当業者であれば、突然変異誘導によって、ｓｃＴＣＲＣのＶ−α鎖とＶ−β鎖 とを分かつペプチドリンカー配列のアミノ酸構成の長さも変化する可能性がある と解するであろう。しかしながら、大抵の場合、突然変異誘導はＶ−α鎖とＶ− β鎖とに焦点を絞っており、融合タンパク質のＶ−α鎖あるいはＶ−β鎖内で平 均１つのアミノ酸突然変異置換を引き起こすものである。突然変異誘導の程度は 、突然変異を起こしたＶ−α鎖あるいはＶ−β鎖のＤＮＡ配列の解析を行うこと で容易に分析できる。 上記方法ほど好適ではないが、本発明に係るバクテリオファージ・ライブラリ を、アミノ酸置換基の導入作用が知られる化学的突然変異原（例えばＥＭＳ）に 曝しても良い。これにより、バクテリオファージの表面に呈示されるｓｃＴＣＲ 融合タンパク質は、融合タンパク質突然変異物を含むこととなる。このような方 法を取る場合、化学的突然変異原の使用量（あるいは、該突然変異原への暴露の 程度）は、Ｖ−α鎖あるいはＶ−β鎖毎に平均１つのアミノ酸置換をおこす程度 に調整することが好ましい。上記のような、融合タンパク質突然変異物（ｓｃＴ ＣＲ突然変異物も含む）を発現するバクテリオファージ・ライブラリは、所望の 抗原に対する特異的な結合親和性が強化された融合タンパク質を検出する際に特 に有用である。 本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、通常、ある一つのＴＣＲに対応し たある一つのｓｃＴＣＲを含んでなる。一般に、ＴＣＲを発現するＴ細胞は、自 然条件下で、あるいは、イン・ビボにおいては病理学的条件下（例えばＴS、ＴC 、あるいはＴH細胞）で存在する。あるいは、Ｔ細胞ハイブリドーマとして培養 することもできる（例えば、Ｄ１０あるいはＢ１２細胞系）。下記の実施例１を 参照されたい。上記のように、Ｔ細胞は、癌、感染症、自己免疫不全、あるいは アレルギーを発症している、またはその疑いのある患者から分離したＣＴＬを含 んでいる。このＴ細胞は、ＴＣＲ配列（すなわちＶ−α鎖配列、Ｃ−α鎖配列、 Ｖ−β鎖配列、及びＣ−β鎖配列）をエンコードするＤＮＡを生成するが、こう いったＤＮＡは本発明中で開示する方法で得られる。該ＤＮＡを得るには、これ 以外にも、従来の方法で、公的に入手可能なＤＮＡ配列に相応のオリゴヌクレ オチドプライマーを形成し、そのＤＮＡをＰＣＲ増幅しても良い。例えば、Kaba t，E.A.，et al．(1987)Sequences of Proteins of Immunological Interest，4 th ed．Public Health Service，N.I.H．Washington，D.C．and Chotia，C．et al．(1988)EMBOJ．7:3745を参照されたい。 より具体的には、所望されるＶ−α鎖配列、Ｃ−α鎖配列、Ｖ−β鎖配列、あ るいはＣ−β鎖配列をエンコードするＤＮＡは、ＰＣＲ法やその他好適なＤＮＡ クローニング方法により増幅することができる。ＰＣＲ法を選択した場合には、 オリゴヌクレオチドプライマーに隣接する既定のＴＣＲ ＤＮＡ（Ｖ−α鎖配列 、Ｃ−α鎖配列、Ｖ−β鎖配列、あるいはＣ−β鎖配列）を増幅すべく、ＰＣＲ 用ＤＮＡオリゴヌクレオチドが選択される。ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドは、通 常、長さがおよそ１２個から５０個のヌクレオチドに相当し、好ましくは、およ そ２０個のヌクレオチドに相当する。該プライマーは、所望のＴ細胞から分離さ れたゲノムＤＮＡ、あるいは、Ｖ−α鎖配列、Ｃ−α鎖配列、Ｖ−β鎖配列、あ るいはＣ−β鎖配列をエンコードするＤＮＡを含んでなるＤＮＡベクター内のＤ ＮＡを増幅する目的で使用される。ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ生成物に、必要 に応じてライゲーション部位を導入するための特異的な制限酵素切断部位を付加 する制限部位を含んでいれば好適である。プライマーの典型的な例は、以下の実 施例と図面とに記す。生成したＰＣＲ生成物は増幅されたＶ−α鎖配列とＶ−β 鎖配列とを含んでなり、さらに、融合タンパク質を最適に発現できるよう、以下 に記すようにリボソーム結合配列と、リーダー配列と、プロモーター配列とを含 むよう調節しても良い。好適な、プライマー、ＰＣＲ条件、及び発現ベクターは 以下の実施例と図面とに開示する。 上記ペプチドリンカー配列により、融合タンパク質のＶ−α鎖とＶ−β鎖とは 、抗原結合ポケットの形成が効果的に行われるように配置される。こうすること により可溶性融合タンパク質は、抗原（例えば、スーパー抗原、あるいはＭＨＣ ／ＨＬＡペプチド複合体中の抗原）と特異的に結合することができる。重要なの は、これによって、融合タンパク質が、自然にあるいは病理学的に存在するＴ細 胞の表面に位置するＴＣＲと競合することができる点にある。”競合する”とは 、対応するＴＣＲの特異的結合親和性に等しいか、好適にはそれを超えたレベル で該融合タンパク質が抗原と結合できることを意味する。一般に、ｓｃＴＣＲ融 合タンパク質（あるいはそこから派生したｓｃＴＣＲ分子）は、対応するＴＣＲ に比べておよそ２倍から１０倍高い結合親和性を示す。結合親和性を決定する方 法は公知であり、ここで開示する。”対応する”とは、ｓｃＴＣＲのＶ−α鎖及 ひ／或いはＶ−β鎖を作るためにＴＣＲ（あるいはそれをエンコードするＤＮＡ ）を使用することを意味する。 本発明の好適な実施例では、ポリペプチドリンカー配列はおよそ７個から２０ 個のアミノ酸からなり、好適にはおよそ１０から２０個のアミノ酸からなり、さ らに好適にはおよそ１２から２０個のアミノ酸からなっている。リンカー配列は 、抗原を最適に結合できるかたちにＶ−α鎖とＶ−β鎖とを配置すべく該融合タ ンパク質中に設けられるが、この配置には通常、融通性が持たされる。リンカー は好ましくは、その大部分がグリシン、アラニン、セリンなどの小さな側鎖を持 ったアミノ酸からなっていて、これか上記融通性を与えている。好ましくは、お よそ８０％から９０％、あるいはそれ以上のリンカー配列が、グリシン残基、ア ラニン残基、あるいはセリン残基からなり、中でも特にグリシン残基とセリン残 基とからなっている。リンカー配列に、融通性を阻害するプロリン残基が一切含 まれないことが好適である。リンカー配列は、好適には融合タンパク質のＶ−α 鎖のＣ末端とＶ−β鎖のＮ末端とに連結されている。実施例１、実施例２、及び 図３、図６Ａ、図６Ｂ、及び図２０を参照されたい。 （ＧＧＧＧＳ）4配列（すなわち、Gly Gly Gly Gly Sel）4を含んだ好適なリ ンカー配列には、ＪＡ３０２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）とＪＡ３０１（ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：９５）とがある。リンカー配列は、ｓｃＴＣＲのＶ−α鎖のＣ 末端残基と同Ｖ−β鎖の第１アミノ酸との間にリンクしていることが好ましい。 抗体可変領域を好適に組合わせることによる融通性にすぐれたリンカー設計を含 めた、異なるリンカー配列が使用できる（M．Whitlow et al.，Methods:A Compa nion to Methods in Enzymology，2:97-105(1991)を参照）。このような好適な リンカー配列は実験的に簡単に識別できる。例えば、リンカー配列を含んだ融合 タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントを含んでなるＤＮＡベクターは、 クローン化して発現することが可能であり、融合分子は、例えば標準抗原結合 分析（上記のHarlow and Laneを参照）にあるように、実験によって、該分子が 抗原と結合可能がどうかを決定することができる。これ以外に、以下に記す実施 例８及び実施例１０〜１２に開示した分析法によりＴ細胞活性の調節能について テストし、発現された、リンカー配列を含んでなる融合タンパク質を決定するこ とができる。リンカー配列の好適な大きさと配列とは、融合タンパク質の想定し た大きさと形状とに基づき行われる、コンピュータを用いた従来のモデル化技術 で決定することもできる。 好ましくは、Ｖ−α鎖あるいはＶ−β鎖をコードする、実質的にいかなるヌク レオチド配列であっても、これをベクターに組み込むことができるように、ＤＮ Ａベクター内の制限部位が加工される。さらに、ＤＮＡベクターは、好適なバク テリオファージ外殻タンパク質（遺伝子IIIタンパク質、遺伝子VIIIタンパク質 ）あるいはその好適なフラグメントをエンコードするＤＮＡを組み込むための制 限部位を、１つあるいはそれ以上含むように設計されてもよい。さらに、ｍｙｃ 、ＥＥ、あるいは６ＸＨＩＳなどのタンパク質標識を１つあるいはそれ以上エン コードするＤＮＡを、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡベクターに従来公 知の方法で連結することもできる。例えば、Manstein，D.S．et al．Gene（1995 ）162(1)，129;Grussenmeyer，T．et al．PNAS（USA）(1985)827952，Tang，E． and Henry，H.L．J．Biol．Chem．(1993)268(7)，5069を参照されたい。 さらに具体的には、以下の実施例で具体的に示す好適な系においては、好適な 制限部位（例えば、ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ部位）が、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質 のＶ−α鎖とＶ−β鎖との間に位置するポリペプチドリンカー配列の両端に存在 する。適当なＤＮＡベクターに融合させると、該制限部位とバクテリオファージ 外殻タンパク質あるいはそのフラグメントとの融合が生じる。 ここで開示するｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードする配列を含んだＤＮ Ａベクターは、一般的に次の（１）から（８）を満たしてなる：（１）大腸菌中 で作用する、例えばＰＢＲ３２２由来の複製起点を有するもの、（２）選択可能 な抗生物質耐性遺伝子、例えば、アンピシリン耐性遺伝子を有するもの、（３） 転写終結領域、例えば、大腸菌ｔｒｐオペロンの終結領域を有するもの、（４） 転写プロモーター、例えば、ｐｈｏＡ、ｔａｃ、ｔａｃ−ｌａｃ、ｌａｃＺ、ｌ ａｃuvs、Ｔ７、あるいはＴ３プロモーターを有するもの、（５）リーダー配列 、例えば、ｐｅｌＢやｏｍｐＡリーダーを有するもの、（６）ｓｃＴＣＲをエン コードするＤＮＡセグメントを有するもの、（７）バクテリオファージ外殻タン パク質、例えば、遺伝子IIIタンパク質や遺伝子VIIIタンパク質（あるいは、そ の好適なフラグメント）を有するもの、（８）転写ターミネーター、例えば、大 腸菌のリボソームＲＮＡ座由来のＴ１Ｔ２配列を有するもの。場合によっては、 ＤＮＡベクターが、上記のようにタンパク質標識をエンコードするＤＮＡ配列を さらにｌつあるいはそれ以上含んでいても良い。 ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現とその安定性とを、特にここで記述する低速 誘導条件下で最適化するために、特定のヌクレオチド配列をＤＮＡベクターに含 有させても良い。例えば、以下で記述するｐｈｏＡプロモーター配列とｐｅｌＢ リーダー配列とは、リン酸欠乏誘導環境下においてｓｃＴＣＲ融合タンパク質を 発現させるのに特に好ましい。下記の実施例４を参照されたい。翻訳効率を上げ るために、強力な翻訳開始配列を該構成に含有させてもよい。哺乳動物の細胞に おける発現の場合、好適な開始配列はＫｏｚａｋ共通配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧ） （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）である。 ＤＮＡベクターに含まれるリーダー配列は、融合タンパク質の発現を宿主細胞 の細胞膜上あるいは宿主細胞培地中に好適に誘導するためのものであり、注目の Ｖ−α鎖をエンコードするＤＮＡが融合タンパク質をエンコードする構成に好適 にライゲーションされるよう、効果的に配置された制限部位を含んでいる。好適 には、制限部位は、当業界では結合配列（Junction Sequence）と称されること もあるリーダー配列（例えば、長さがおよそ２個から１０個のコドンに相当する ）の３’末端に組み込まれ、Ｖ−α鎖に連結している。その結果、Ｖ−α鎖のコ ード領域は、通常Ｖ−αコード領域の第１アミノ酸となる。例として、１つの制 限部位がＳＦｉＩ部位であり、一方、他の切断部位がＶ−α鎖のコード領域の前 に組み込まれ、Ｖ−α鎖をより好適にベクター構成に挿入可能となっているもの を挙げることができる。以上議論したように、このような制限部位を、通常Ｖ− α鎖の頭に位置する別の制限部位と共に使用することにより、多種多様なＶ−α 鎖、あるいはＶ−α、Ｃ−α鎖のコード配列を迅速かつ容易に挿入できるように なる。好ましいリーダー配列は強力な翻訳開始部位を含むものであり、また、時 には、そのｍＲＮＡの３’末端にキャップ部位を含んでいても良い。典型的なリ ーダー配列としは、ｐｅｌＢとＯｍｐＡが挙げられる。下記の実施例４に記すよ うに、特に好ましいリーダー配列はｐｅｌＢである。 ここで、”ベクター”という語は、宿主細胞に取り込ませることが可能な注目 の核酸配列のいずれかであり、注目の核酸が発現する結果、上記ｓｃＴＣＲ融合 タンパク質などが生成する。ベクターとしては、例えば、線形核酸配列、プラス ミド、コスミド、ファージミドや、染色体外ＤＮＡなどが挙げられ、具体的には ベクターは組み替えＤＮＡであってもよい。また、ここでいう、”発現”、ある いは”遺伝子発現”とは、ＤＮＡの転写やＲＮＡの翻訳を含み、注目している核 酸配列に対応したタンパク質生成物が生成することを指す。通常は、本発明に係 るｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントが、ベクター、 好ましくはＤＮＡベクターに挿入され、好適な宿主細胞の中で該ＤＮＡセグメン トの複製が行われる。 本発明に係る、十分に可溶性かつ機能的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質をエンコ ードするＤＮＡベクターは、好ましくは、低速誘導される宿主細胞により長時間 かけて発現される。特定の理論に言及するわけではないが、およそ２〜８時間を かけた、好ましくはおよそ４〜６時間をかけた低速での誘導により、ｓｃＴＣＲ 融合タンパク質の発現が安定し、細胞間におけるタンパク質の折り畳みが最適化 される。特に、強力なプロモーターによって発現がなされている場合には、低速 誘導にかかるこれらの効果が明らかである。例えば、ＤＮＡベクターは、ｓｃＴ ＣＲ融合タンパク質をエンコードする配列に機能可能に連結されたｐｈｏＡプロ モーター（強力）を含んで生成される。そしてＤＮＡベクターによって、宿主細 胞が宿主細胞培地中で形質転換される。そして、宿主細胞培地中のリン酸塩は数 時間、一般には２〜１０時間かけて、通常は４〜６時間かけて培地中で使い切ら れるよう設定された。上記の低速誘導条件と強力なプロモーターとを組み合わせ て使用すると、化学的誘導物質と弱いプロモーターとを使用した高速誘導法（例 えば、ＬａｃＺプロモーターのＩＰＴＧ誘導法）と比較して、十分に可溶性かつ 機能的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質の産生量が大幅に増加することが分かった。 下記の実施例４を参照されたい。好適な宿主細胞は、レトロウイルスによる転換 、カルシウム、リポソーム、あるいはポリブレン仲介トランスフェクション、生 体分解による転換、など、従来公知の様々な方法で形質変換することができるも のである。 上記のように、本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、１つあるいは複数 個のタンパク質標識（同じでも良いし、異なっていても良い）を含んでいても良 い。このタンパク質標識には、プロテアーゼ分解部位を含んでなるものも含まれ る。例えば、タンパク質標識は６ＸＨＩＳなどの、生理的ｐＨ条件下で電荷を保 持するポリペプチドであり、この場合、好適な合成マトリックスを使って融合タ ンパク質を純化することができる。さらに具体的には、該合成マトリックスは、 Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅなどの商業的に入手可能なセファロースマトリックス であってもよく、あるは６ＸＨＩＳ標識をｐＨ６〜９条件下で結合させうる他の マトリックスであっても良い。これ以外の好適な標識としては、商業的に入手可 能なモノクローナル抗体により特異的に結合される、ＥＥあるいはｍｙｃエピト ープが挙げられる。一般に、抗体、好ましくは商用的に入手可能なモノクローナ ル抗体により特異的に結合される、様々なエピトープがタンパク質標識として機 能する。他の好適な合成マトリックスとしては、本ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と 特異的な結合が形成される結合抗体、を有する合成マトリックスが挙げられる。 分解部位を含んでなる典型的なタンパク質標識としては、エンテロキナーゼ、Ｆ ａｃｔｏｒ Ｘａ、ヘビ毒、あるいは、トロンビン分解部位を含んでなるタンパ ク質標識が挙げられる。例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９６／１３５９３を参 照されたい。 原核生物、真核生物、あるいは昆虫細胞の中で、本発明に係る可溶性融合タン パク質を発現させる方法は幾つか挙げられる。例えば、融合タンパク質をエンコ ードするＤＮＡは、例えば、該ＤＮＡがベクターにライゲーションされるように 、酵素を使用して既定の場所でベクターを制限する、などの既知の手段で好適な ベクター内に取り込ませることができる。上記のように、ベクターには、バクテ リオファージ外殻タンパク質、あるいはその好適なフラグメントをエンコードす る配列も含まれている場合がある。そして、融合タンパク質をエンコードするＤ ＮＡを含んでなるベクターが好適な宿主に導入され、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質 が発現される。好適なベクターは、クローニングプロトコールに関する要因に基 づいて、実験的に選択される。例えば、ベクターは、使用する宿主細胞に適合し たものであり、かつ、適当なレプリコンをもっているものでなければならない。 さらに、ベクターは、発現される融合タンパク質に対応するＤＮＡ配列コードを 収容できるものでなければならない。典型的なベクターの例としては、大腸菌中 、特に、バクテリオファージ・ライブラリの構築に好適な宿主系統中で融合タン パク質を発現できるものが挙げられる（上記、Smith，G.P．and J.K．Scott参照 ）。これ以外のＤＮＡベクターとしては、哺乳動物の細胞中で融合タンパク質を 発現可能なｐＣＤＶＡ３（InVitrogenより入手可能）などが挙げられる。その他 哺乳動物で使用可能なＤＮＡベクターについては、上記Sambrook et al.及びAus ubel et al.を参照されたい。 さらに具体的には、本発明に係る融合タンパク質を発現するに好適な宿主細胞 としては、容易に形質転換可能であり、培地中で急速な成長を見せる細胞などが 挙げられる。特に好ましい宿主細胞としては、大腸菌や枯草菌などがあげられる 。宿主細胞としては、これ以外に動物細胞や、S．cerevisiaeなどの酵母や、昆 虫細胞などの真核細胞が挙げられる。ここで開示したバクテリオファージ・ライ ブラリを増殖する目的では、ＸＬ１−Ｂ、Ｋ９１や、Ｋ９１Ｋａｎなどの大腸菌 系統が好適である。昆虫細胞での発現に好適な細胞は、バキュロウイルスが感染 可能なＳｆ９などの細胞である。一般には従来の培養条件を採用し、さらに、例 えば好適な細胞選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子、あるいは、Ｇ４１８ ）をベクターに取り込むことで、安定に形質変換やトランスフェクションがなさ れた細胞系が選択される。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を発現する細胞は、以下に 記すようにＶ−α鎖あるいはＶ−β鎖と特異的に結合する、商業的に入手可能な モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ分析などの、既知の手法で決定すること ができる。 発現されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、免疫アフィニティークロマトグラフ ィー、免疫吸着、免疫沈降などの既知の方法で単離・精製することができる。重 要なことは、調製工程で時間をかけて再度折り畳むステップを実行することなく 、相当量の融合タンパク質が生成される点である。以下でタンパク質精製法を詳 しく記述するが、この方法によれば、大半のｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成量 は、宿主細胞ペースト５０〜１００グラム当たり２〜２０ミリグラムの範囲内と なる。 一般に、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を調製するためには、細胞の抽出物あるい は宿主細胞培養培地を遠心分離し、その結果得られた上澄みを、例えばＡタンパ ク質あるいはＧタンパク質アフィニティークロマトグラフィーや、発現されたｓ ｃＴＣＲ融合タンパク質分子と特異的に結合する抗体を使用した免疫プロトコー ルなどの、アフィニティークロマトグラフィーあるいは免疫アフィニティークロ マトグラフィーにより精製する。該抗体としては、例えば、ｓｃＴＣＲのＶ−α 鎖あるいはＶ−β鎖と特異的に結合可能な、商業的に入手可能なモノクローナル 抗体が挙げられる。該抗体の典型的な例としては、Ｐｈａｒｍａｇｅｎ社の製品 である、Ｈ５７、ＭＲ５−２、Ｆ２３．１などが挙げられる。モノクローナル抗 体を使ったタンパク質の親和（アフィニティー）精製は公知であり、例えば、Ha rlow and Lane著Antiboides:A Laboratory Manual(1988)などに開示されている 。 本発明に係る融合タンパク質は可溶で十分に機能的なかたち、すなわち、培地 中に安定して分泌されうるかたちで提供される。さらに具体的には、ｓｃＴＣＲ 融合タンパク質は、界面活性剤などの撹乱物質が殆どあるいは一切無いという条 件をほぼ満たす環境下、すなわち、生理的条件下で安定するかたちで提供される 。すなわち、本融合タンパク質は、ＴＣＲ貫膜タンパク質領域内で見られるアミ ノ酸のような、疎水性アミノ酸リッチな領域を一般に含まない。しかしながら、 場合によっては、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質が十分に可溶性である限り、疎水性 アミノ酸リッチな領域が一部含まれていてもよい。すなわち、融合タンパク質の 発現は、相当量の封入体を好適な宿主細胞中で形成することにはつながらないか もしれない。封入体は、顕微鏡を用いて、あるいは従来の生化学的手法で容易に 検出することができる。 本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は上記説明のように調製できるが、以 下に記す実施例でも同様の方法で調製できる。一般に、所望のＶ−α鎖をコード するＤＮＡ、及びＶ−β鎖をコードするＤＮＡは、上記のように、Ｔ細胞やＴハ イブリドーマ系、あるいは公的に入手可能な上記Ｖ−α鎖及びＶ−β鎖配列など 、適当なところから得られる。該ＤＮＡは、ＰＣＲ法、クローニング、あるいは その他の好適な手段で増幅することができる。例えば、所望のＶ−α鎖をエンコ ードするＤＮＡを好適なベクターとしてクローン化し、次に所望のＶ−β鎖をエ ンコードするＤＮＡと好適な一本鎖リンカー配列とをクローン化することで、所 望のｓｃＴＣＲを生成することができる。上記のように、場合によっては、ｓｃ ＴＣＲにはＣ−α鎖フラグメント及び／またはＣ−β鎖フラグメントをエンコー ドするＤＮＡが含まれている。そして、バクテリオファージタンパク質あるいは そのフラグメントとバクテリオファージ機能に必要なその他の配列とをエンコー ドするＤＮＡ配列を含んでなる、好適な部位で切断されたＤＮＡベクターに、ｓ ｃＴＣＲをエンコードするＤＮＡをライゲーションすることで、ｓｃＴＣＲ分子 構造にバクテリオファージ外殻タンパク質あるいはその好適なフラグメント（例 えば遺伝子IIIタンパク質あるいは遺伝子VIIIタンパク質）がさらに融合される 。バクテリオファージ遺伝子IIIタンパク質あるいはバクテリオファージ遺伝子V IIIタンパク質をエンコードする配列を含んでなるＤＮＡベクターの典型的な例 は以下に記す。上記のように、１つあるいは複数のタンパク質標識をエンコード するＤＮＡは、好適には所望のタンパク質標識を既に含んだＤＮＡベクターを選 択することにより、必要に応じて融合タンパク質に加えても良い。これにより、 ライゲーションされたＤＮＡベクターが、好適な宿主中で発現され、さらに必要 に応じて融合タンパク質を回収・精製することができる。 本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、一般に、プロモーター／リーダー 配列／Ｖ−α鎖／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖；プロモーター／リーダー配列 ／Ｖ−α鎖／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖・Ｃ−β鎖フラグメント；プロモー ター／リーダー配列／Ｖ−α鎖・Ｃ−α鎖フラグメント／一本鎖リンカー配列／ Ｖ−β鎖；あるいは、プロモーター／リーダー配列／Ｖ−α鎖・Ｃ−α鎖フラグ メント／一本鎖リンカー配列／Ｖ−β鎖・Ｃ−β鎖フラグメント；の配列が共有 結合したＤＮＡ構造によってエンコードされている。融合タンパク質を発現し精 製するために、ここで開示した特異的な発現体系を含んでなるＤＮＡベクターは 、バクテリア細胞、バキュロウイルス−昆虫系細胞、または哺乳類細胞中に、好 適に導入される。 本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質の分子量は、例えば、融合バクテリオ ファージ外殻タンパク質またはフラグメントとして何を選択したのか、あるいは 、採用したタンパク質標識は１つかそれ以上なのかといった、いくつかの要素に よって変化する。一般に、可溶性で十分に機能的な融合タンパク質は、その分子 量がおよそ４５ｋＤＡを越え、かつ、その内にしめるＶ−α鎖とＶ−β鎖の分子 量が２０ｋＤＡを越えるが、通常該分子量は２１〜２６ｋＤａの範囲内である。 また、本発明に係る融合タンパク質は通常、分子量がおよそ４８〜５０ｋＤａで ある。上記の分子量は全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動法などの従来の分子 サイズ決定実験で決定することができる。一般的な説明については上記Harlow a nd Lane及びAusubel et al.による著作を参照されたい。 本発明に係る多価ｓｃＴＣＲ融合タンパク質も、有用な応用がいろいろ可能で ある。例えば、ｓｃＴＣＲの価数が増加すると機能が強化されると考えられてい る。多価融合タンパク質は、例えば標準ビオチン・ストレプタビジン(streptavi din)・ラベリング技術を用いて、あるいはラテックスビーズなどの適当な固体支 持具に接合させることで、融合タンパク質を１個ないし４個（同じでも良いし、 異なっていても良い）共有結合させて作出することができる。化学的に架橋され てなる融合タンパク質（例えば、架橋によりデンドリマー(dendrimer)としたも の）も、同じく多価種として適当である。例えば、融合タンパク質は、化学的に 活性な側鎖を有する、例えば、ＣｙｓあるいはＨｉｓ等のアミノ酸残基をエンコ ードする配列を含むことで修飾することができる。化学的に活性な側鎖を有する これらのアミノ酸は、該融合タンパク質中で様々な位置に配置することができる が、ｓｃＴＣＲの抗原結合領域から遠位に配置することが好ましい。例えば、融 合タンパク質のＣ−β鎖フラグメントのＣ末端は、タンパク質精製標識と、ある いは、活性なアミノ酸を含んだ他の融合タンパク質と共有結合させることができ る。好適な側鎖を含むことで複数の融合タンパク質を化学的に結合させて好適な デンドリマー粒子とし、多価分子を作ることができる。デンドリマーとは科学的 に合成された重合体であり、その表面に複数の異なる官能基のいずれかを含んで なるものでもよい（D．Tomalia，Aldrichimica Acta，26:91:101(1993)を参照） 。本発明で使用するに好適な典型的なデンドリマーとしては、例えば、システイ ン残基と結合可能な、Ｅ９スターバースト(starburst)・ポリアミン・デンドリ マーや、Ｅ９コンバースト(comburst)・ポリアミン・デンドリマーなどが挙げら れる。多価融合タンパク質の例は、下記の実施例９に記す。 本発明に係る融合タンパク質であって、さらに他の物質、特にＢ−７遺伝子族 （例えばＢ７−１やＢ７−２）などのＴ細胞共刺激因子(T cell co-stimulatory factor)を含んだものをエンコードするＤＮＡベクターを構築し、融合タンパク 質を含む細胞を活性化することも、また望ましい。 本発明に係る融合タンパク質は、組換えペプチド抗原、例えば、ＭＨＣ分子あ るいはＨＬＡ分子中のスーパー抗原や抗原を検出し、特徴づける目的で使用可能 である。例えば、本発明に係る方法を用いて、Ｔ細胞に対し非特徴的なエピトー プを以下のようにマッピングすることができる。すなわち、ランダムペプチド・ ライブラリ、あるいは選択ペプチド・ライブラリをエンコードする配列が、ペプ チドライブラリ内に提供される。そして、該ライブラリは融合タンパク質、好ま しくは検出可能にラベリングされた融合タンパク質を用いてスクリーニングされ る。続いて、該融合タンパク質と特異的に結合したペプチドが好適に増幅される 。次に、該ペプチドの配列の解析を行い、融合タンパク質と結合した配列を識別 する。さらに、該融合タンパク質のＶ−α鎖とＶ−β鎖とに対応のＴＣＲを発現 するＴ細胞との結合について、クローニングしたペプチド配列の試験が行われる 。数個あるランダムペプチドライブラリのいずれを採用しても良い。例えば、J ．Scott et al.，Science（1990）249:386;J．Devlin et al.，Science，(1990) 249:404;S．Cwirla et al.，PNAS(USA)，(1990);87:6378;J．Hammer et al.，J ．Exp．Med．(1992)176:1007;Rhode，P.R．et al．J．Immunol．(1996)157:4885 ;及びD．0'Sullivan et al.，J．Immunolo.，(1991)147:2663を参照されたい。 極めて有用な一本鎖クラスＩ、及びクラスIIＭＨＣ／ペプチド複合体（すなわ ち”ｓｃＭＨＣ複合体”）が、公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１ ６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４（出願日１９９ ５年２月１日）及び同シリアル番号０８／５９６，３８７（出願日１９９６年１ 月３１日）とに開示されている。上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／ ０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４（出願 日１９９５年２月１日）及び同シリアル番号０８／５９６，３８７（出願日１９ ９６年１月３１日）とにおいては、ここに開示したｓｃＴＣＲ融合タンパク質の 機能を試験する目的で使用可能な、極めて有用なイン・ビトロ及びイン・ビボで のＴ細胞結合分析方法が開示されている。 より具体的には、上記公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、 審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び同シリアル番号 ０８／５９６，５８７には、オボアルブミン（ＯＶＡ）のアミノ酸３２３−３３ ９由来の提示(presenting)ペプチド、あるいは、ＨＳＶ−１ ｇＤペプチド（ｇ Ｄ１２等）のアミノ酸２４６−２６１由来の提示ペプチドを含んだ一本鎖ＭＨＣ クラスIIＩＡd複合体（例えば、ｓｃＩａd分子等）が開示されている。上記の審 査中の米国特許出願シリアル番号０８／５９６，５８７が開示しているように、 ＯＶＡペプチドとｇＤ１２ペプチドとは、融合、あるいは、ｓｃＩＡd複合体に 非共有結合的にリンクさせたかたちで提供されうる。上記の公開ＰＣＴ出願番号 ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３ ８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，５８７とは、参考文献としてこ こに記す。 本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＴ細胞活性の調節能（例えば、増殖 などに関するＴ細胞活性を抑制する、あるいは消滅させる）は、イン・ビトロ分 析で容易に決定される。イン・ビトロ分析と、該分析を行うに必要な典型材料に ついては、上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中 の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５ ９６，３８７とに開示されている。 一般に、該分析に好適に使用されるＴ細胞は、Ｔ細胞ハイブリドーマや、哺乳 類、例えば、人などの霊長類；ネズミ、ウサギといったげっ歯類；から単離した Ｔ細胞などの、形質転換されたＴ細胞系から得られる。これ以外の好適なＴ細胞 には、１）公的に入手可能、または、既知の方法で調製可能なＴ細胞ハイブリド ーマ、２）ヘルパーＴ細胞、３）Ｔ細胞障害細胞、好ましくは細胞障害ＣＤ８+ 細胞がある。Ｔ細胞は、既知の方法で哺乳類から単離することができる。例えば 、R．Shimonkevitz et al.，J．Exp．Med.，(1983)158:303を参照されたい。 上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特 許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，３ ８７とに開示されているように、イン・ビトロ分析をすることで、ある分子がＴ 細胞の活性を調節することが可能であるか否かを決定することができる。特に、 該分析は、本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質に対し、容易に適用可能であ る。一般に、該分析は以下に示す１から５の連続ステップで行われる。Ｔ細胞は 分析可能なマーカーを発現し、該マーカーは、Ｔ細胞の活性、あるいは、活性化 後に調節を受けたＴ細胞の活性を示すものである。したがって、例えば、下記の 実施例８に開示するように、活性化時にインターロイキン−２（ＩＬ−２）を発 現するマウスのＴ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０を使用することができる。 ＩＬ−２の濃度を測定することにより、ある特定のｓｃＴＣＲが該Ｔ細胞ハイブ リドーマの活性を調節できるか否かを決定することができる。該分析は、一般に 例えば次のような工程を順に行うことにより実行される。 １．Ｔ細胞ハイブリドーマ、あるいは本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質 に対応するＴＣＲを含んだＴ細胞を得る。典型的なＴ細胞は、上記のように、増 殖可能な人のＣＴＬである。 ２．上記Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を、増殖可能な条件下で培養する 。 ３．増殖したＴ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を、上記のｓｃＴＣＲ融合タ ンパク質に接触させる。 ４．該ＴＣＲ（及びｓｃＴＣＲ融合タンパク質）と特異的に結合し、加えて、 該Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を活性化する能力のある抗原に、該Ｔ細胞 ハイブリドーマまたはＴ細胞を接触させる。典型的な抗原としては、スーパー抗 原、上記の提示ペプチドを有するｓｃ−ＭＨＣクラスＩあるいはクラスII複合体 、あるいは、好適なＡＰＣなどか挙げられる。 ５．該Ｔ細胞ハイブリドーマまたはＴ細胞を好適な共刺激因子(co-stimulator y factor)に接触させて、活性化に必要なシグナルを供給する。次に、該Ｔ細胞 ハイブリドーマまたはＴ細胞を、マーカーにより分析する。すなわち、例えば、 ＩＬ−２産生量を計測する。ＩＬ−２産生量が、例えば２４時間で４０％または それ以上減少したとすると、この減少はすなわち、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質が Ｔ細胞の活性を調節して免疫反応を抑制したことを示す。 下記の実施例８が該分析の典型例である。 上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特 許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，３ ８７とに開示されているように、分析において使用されるＴ細胞は、通常、増殖 に好適な条件下でインキュベートされる。例えば、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞ハイ ブリドーマは、完全培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ −グルタミン、及び５×１０-5Ｍ ２−メルカプトエタノールを添加してなるＰ ＲＭＩ １６４０）中で、３７℃、ＣＯ2５％条件下でインキュベートされると 好適である。通常１０-12〜１０-6Ｍの濃度となるように、ある融合タンパク質 を連続希釈した希釈液か、Ｔ細胞の培養培地に加えられる。Ｔ細胞の活性化シグ ナルは、相応しい抗原を保持した抗原提示細胞により供給されることが好ましい 。抗原薬物(antigen dose)と、Ｔ細胞を最高値より若干低しルベルにまで活性化 するＡＰＣ群とを使用することが、融合タンパク質に対するＴ細胞の応答阻害を 検出するに好適であると考えられている。ｓｃＴＣＲとの接触に後続してＩＬ− ２の産生量が減少することは、すなわち、融合タンパク質がＴ細胞の活性を調節 していることを示す。 上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６と、審査中の米国特 許出願シリアル番号０８／３８２，４５４及び同シリアル番号０８／５９６，３ ８７とに開示されているように、Ｔ細胞活性調節の同定は、ＩＬ−２などの発現 されたタンパク質量を測定するよりは、むしろ、当業者にとって周知の放射線ラ ベリング技術を用いて抗原依存性Ｔ細胞の増殖の変化を測定することにより、好 適に行われる。例えば、検出可能にラベリングした（例えば、トリチウム化した ）ヌクレオチドを分析用の培養培地に導入しても良い。このような標識付きのヌ クレオチドのＤＮＡへの取り込みは、Ｔ細胞増殖の目安となる。この分析は、そ の成長に抗原の提示を要しないＴ細胞、例えば、Ｔ細胞ハイブリドーマには適し ていない。この分析は、哺乳類から単離した非形質転換Ｔ細胞ついて、該Ｔ細胞 の活性調節を測定するに好適である。融合タンパク質との接触に後続しておこる Ｔ細胞の増殖レベルの低下は、分子がＴ細胞の活性を調節し免疫反応を抑制可能 であることを示している。下記の実施例８や実施例１０を参照されたい。イン・ ビトロでのＴ細胞増殖分析法は、上記の融合タンパク質が、イン・ビボでのＴ細 胞クローナル増殖の抗原特異的な変化におよぼす影響を測定するに好適に使用さ れる。この分析については以下の例１１で具体的に記述する。 以下の実施例に説明されるように、ＩＬ−２産生量の測定、もしくはＴ細胞増 殖の測定は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質がＴ細胞の活性を調節しうるかどうかを 調べる目的で使用することができる。例えば、融合タンパク質との接触に後続し ておこる、ＡＰＣで刺激されたＴ細胞によるＩＬ−２産生の減少は、融合分子が Ｔ細胞の活性を調節し、Ｔ細胞仲介型の免疫反応を抑制可能であることを示して いる。 また、イン・ビボ分析は、Ｔ細胞の発達を阻害、もしくは該細胞を不活性化す る能力などの、融合タンパク質のＴ細胞の活性を調節する能力を調べる目的で使 用することもできる。例えば、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の有する、免疫グロブ リンのクラス変更（即ち、ＩｇＭからＩｇＧ）阻害能力を分析することができる 。例えば、P.Linsley et al.，Science,(1992)257:792-795参照。 融合タンパク質を用いる診断法は、イン・ビボ診断イメージングおよびＨＬＡ 型分析としても実現されている（例えば、A.K.Abbas，Cellular and Molucular Immunology，Page 328（W.B.Saunders Co.1991）を参照）。イン・ビボ イメー ジングへの適用の際には、融合タンパク質は放射性標識(例えば、125I、32P、99 Tc)、もしくは哺乳類に投与可能な他の検出可能標識を含んで構成され、被験者 はｓｃＴＣＲの結合を検出する目的で公知の方法によりスキャンされる。哺乳類 に対するこのような分析は、例えば、免疫システムの疾患に係るＡＰＣの不所望 な発現などの、多くの疾患の診断および治療に際し助けとなりうる。 また、分析は、自己免疫疾患の治療のために使用されるｓｃＴＣＲ融合タンパ ク質（もしくは、好ましくは、融合タンパク質から得られたｓｃＴＣＲ）を評価 する目的でも使用可能である。例えば、上記の公開ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ ９５／０９８１６と、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４ 及び同シリアル番号０８／５９６，３８７とに開示されているように、実験用ア レルギー性脳髄炎（experimental allergic encephalomyelitis（ＥＡＥ））は 、マウスの自己免疫疾患であり、多発性硬化症の認められたモデルである。一つ の分析例では、あるマウスの系統がＥＡＥを発症するように処理され、その後に 、適当なｓｃＴＣＲ融合タンパク質（もしくは、融合タンパク質から得られたｓ ｃＴＣＲ）が投与される。その後、該動物は、融合タンパク質もしくはｓｃＴＣ Ｒの投与によってＥＡＥの進行が阻害もしくは防止されたか否かを調べるべく評 価される。このような検定は、特に、以下の実施例１２において詳しく説明され る。 本発明に係るｓｃＴＣＲ融合タンパク質の有する、免疫反応（上記記載の標的 疾患に対する予防接種などを含む）を封じこめる能力は、イン・ビボ検定によっ て簡単に調べることができる。例えば、融合タンパク質（もしくは、好ましくは 、融合タンパク質から得られたｓｃＴＣＲ）をマウスなどの哺乳類に投与し、そ の血液サンプルを、最初の投与時、およびその後定期的に数回（例えば、ｓｃＴ ＣＲ融合タンパク質の投与の２、５、および８週間後）摂取する。続いて、血清 を血液サンプルより採取し、免疫感作により産生された抗原が存在するか否かの 分析が行われる。抗体の濃度は、一般的な免疫学的方法によって調べることがで きる。 また、本発明は、哺乳類、特に人などの霊長類の細胞内で融合タンパク質を発 現する、該融合タンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントの投与方法を提供 するものである。好ましくは、融合タンパク質のコーディング領域を有するＤＮ Ａは、ＣＭＶプロモーターのような適切なプロモーターにより制御された状態で 、公知の方法により被験者の骨格筋へ直接注入される。プラスミドＤＮＡの投与 方法、そのＤＮＡが投与された被験者の細胞への該ＤＮＡの取り込み、および、 タンパク質の発現について報告がなされている（J.Ulmer et al．Science,(1993 )259:1745-1749参照）。 本発明のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、治療学上さまざまに適用することがで きる。例えば、融合タンパク質（もしくは、好ましくは、融合タンパク質から得 られたｓｃＴＣＲ）を、哺乳類の免疫反応を低減もしくは除去する目的で投与す ることができる。これにより、例えば、癌、感染症、アレルギー、もしくは、例 えば、多発性硬化症、インシュリンによる真性糖尿病、慢性関節リウマチなどの 自己免疫疾患などを患っている、もしくはその虞れがある人などの哺乳類を治療 することができる。投与は、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡの直接投与 など、適切な手段を介して行うことかできる。また、この治療に適しているのは 、不所望な免疫反応を患っているか、患う虞れのある患者、例えば、心腋、腎臓 、皮膚、または他の器官の移植手術を経験している患者などである。移植拒絶を 伴う状況では、治療プロトコールは、手術が行われる以前に適切に開始されても よい。 本発明によれば、哺乳類の免疫反応を低減もしくは除去するために、いくつか の特有のアプローチを使用することができる。例えば、不所望な免疫反応を低減 するための一つの治療法では、病原性Ｔ細胞と抗原との相互作用を低減もしくは 除去するために、好適なｓｃＴＣＲ融合タンパク質（もしくは、好ましくは、そ れ由来のｓｃＴＣＲ）が有効量投与される。これにより、Ｔ細胞の増殖、分化、 活性化、もしくは、Ｂリンパ球刺激などの、Ｔ細胞仲介型の免疫反応を選択的に 制御することができる。融合タンパク質は、不所望な免疫反応を仲介する病原性 Ｔ細胞と、少なくとも同レベル、好ましくはそれ以上の、抗原特異的結合親和性 を示すことが好ましい。これに関し特に好ましいのは、上述したリガンドに対し て大きな特異的結合親和性を表すｓｃＴＣＲ突然変異物である。 ここに開示されている方法で調製されたｓｃＴＣＲもしくはＴＣＲに対する抗 体の投与は、例えば、腹膜腔内注射もしくは静脈注射などの注射方法によって哺 乳類に投与することができる。融合タンパク質のうち、少なくとも治療への応用 において用いられる分子は、哺乳類細胞もしくは他の適切な細胞から生産され、 実質的に、もしくは完全に発熱物質(pyrogen)が存在しないように使用前に精製 されることが好ましい。ある治療へ応用する際の最適投与量は、従来の手段に基 づいて決められてもよいが、一般的には、投与経路、患者の体重、健康状態、性 別、および当業者によって認められる要因を含むいくつかの要因によって変動す る。 投与は、一回投与でもよく、日もしくは週間隔での連続的な投与であってもよ い。ここで用いられる「一回投与」とは、単一(solitary)投与であってもよいし 、継続放出(sustained release)投与であってもよい。被験者は哺乳類（例えば 、人、もしくは牛のような家畜、もしくは犬や猫のようなペット）であってもよ く、また、ｓｃＴＣＲもしくは抗体を含む製薬組成としての治療を含むものとす る。本発明のこのような製薬組成は、当該技術において公知の手順に従って製造 および使用される。例えば、融合タンパク質の治療有効量を含む処方は、例えば 、封止されたアンプルおよびバイアルなどの単一服用単位もしくは複数服用単位 として提供されてもよく、例えば、水注入による無菌液体キャリアーの添加のみ を使用直前に要する凍結乾燥状態として保存されてもよい。リポソームの処方も 多くの適用に際し好適である。また、その他の組成も非経口投与の目的で適切に 用いることができ、これには、抗酸化剤、バッファ、静菌剤、および標的受領者 の血液と等張となる量の溶質を含んでなる、水溶性および非水溶性無菌注入溶液 が含まれ、また、懸濁剤および濃化剤などを含む、水溶性および非水溶性無菌懸 濁液が含まれる。 Ｔ細胞反応（応答）の低減もしくは除去を含んでなる本発明の方法は、Ｔ細胞 仲介型の疾患に対するより効果的な治療を提供する目的で、公知の免疫抑制剤、 抗ウイルス剤、抗癌剤、もしくは抗炎症剤を併用して行われてもよい。例えば、 融合タンパク質は、自己免疫疾患およびアレルギーの治療のため、従来の、シク ロスポリン(cyclosporin)などの免疫抑制薬剤、もしくはコルチコステロイド(co rticosteroid)のような抗炎症薬剤、および非ステロイド薬剤と共に使用するこ とができる。 上述したように、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質（もしくは、それから分離された ｓｃＴＣＲ分子）は、一般的に当該技術において知られる方法により抗体を産生 する目的で使用可能であり、通常、融合タンパク質の精製サンプルとして生成さ れる。ほとんどの場合、抗体を増産させるために選択されたｓｃＴＣＲ融合タン パク質は、上述したように、まず、バクテリオファージ外殻タンパク質もしくは そのフラグメントを除去するべく分解される。このようにして得られたｓｃＴＣ Ｒは、免疫原として使用される。抗体は、注目ｓｃＴＣＲの１つもしくはそれ以 上のエピトープからなる免疫原性ペプチドから構築することもできる。 さらに詳しく述べると、抗体は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の精製サンプル、 融合タンパク質から分離されたｓｃＴＣＲ分子、もしくは上記の免疫原性ペプチ ド（それ単独もしくは適切なキァリアーとの複合体）により、哺乳類を免疫感作 することで得られる。好ましくは、ｓｃＴＣＲ分子を免疫原として使用する。ま た、適切な哺乳類としては、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ラット、およ びマウスなどの一般的な実験動物が挙げられる。ラットおよびマウス、特にマウ スは、モノクローナル抗体を得る目的で好適に使用される。抗原は、皮下注射、 腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、および皮膚内注射などの数ある経路の いずれによっても哺乳類に投与可能である。最適な免疫感作間隔および免疫感作 量などは、比較的大きな範囲内をとることができ、ここでの開示に基づいて実験 的に求めることができる。通常の手順では、抗原は、数週間に渡り数回注射され る。抗体は、免疫感作された動物の血清から一般的な方法で採取され、ｓｃＴＣ Ｒに対して特有の抗体を検出するためにスクリーニングされる。特に注目すべき は、Ｖ−αもしくはＶ−β鎖、該鎖中でも特に高可変性領域に限定的に結合する 抗体、例えば、該領域上にある直鎖状もしくは立体配座のエピトープを認識する 抗体である。モノクローナル抗体は、抗体を産生する細胞内、およびハイブリド ーマ細胞形成のための標準的な融合方法を用いてモノクローナル抗体を産生する ために用いられる細胞内、において産生することかできる（G.Kohler，et al.， Nature,(1975)256:456参照）。通常、ここにおいては、ハイブリッド細胞を生成 するために、抗体産生細胞を骨髄膜細胞などの不朽細胞系統と融合する工程を伴 う。もしくは、モノクローナル抗体は、Huse，et al.，Science,(1989)256:1275 の方法により、細胞より産生されてもよい。 一つの適切なプロトコールは、精製ｓｃＴＣＲ複合体を含んでなる組成を用い て、約２〜７ケ月間にわたって行われる、マウスの腹膜腔内注射による免疫感作 である。その後、免疫感作マウスから脾臓細胞を摘出することができる。免疫感 作マウスの血清は、脾臓細胞を切除する以前に、ｓｃＴＣＲに特異的な抗体を用 いた滴定により分析される。その後、切除されたマウスの脾臓細胞は、適当な均 質もしくは不均質（好ましくは均質）のリンパ系細胞系統と融合される。該リン パ系細胞系統は、ヒポキサンチン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラー ゼ欠失（hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase deficiency（HGPRT- ））、もしくは、チミジン キナーゼ欠失（thymidine kinase deficiency（TK- ））などの標識を有する。好ましくは、リンパ系細胞系統として骨髄膜細胞が 使用される。骨髄膜細胞と脾臓細胞とは、例えば、骨髄膜細胞１に対して脾臓細 胞４の割合で混合される。これら細胞は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法 により融合することができる（G.Kohler，et al.，Nature，Supra参照）。この ようにクローン化されたハイブリドーマは、例えば、RPMI-1640培地で培養され る（G.E.More，et al.，Journal of American Medical Association,(1967)199: 549参照）。融合処理後成長したハイブリドーマは、精製ｓｃＴＣＲに特異的に 結合する抗体を分泌することを利用して、放射線免疫分析法もしくは酵素免疫分 析法などによりスクリーニングされる。従来の方法に従いＥＬＩＳＡ法を用いて 、血清を含む抗体をスクリーニングすることもできる。このようなスクリーニン グ処理に対し正の結果を示すハイブリドーマは、限界希釈培養法により増殖およ びクローン化することもできる。好ましくは、溶液内および生サンプル内で、ｓ ｃＴＣＲに結合可能な抗体を選択するためのさらなるスクリーニングが行われる 。単離された抗体は、アフィニティークロマトグラフィーなどの適切な免疫学的 方法によりさらに精製することもできる。 いくつかの適用においては、ｓｃＴＣＲと特異的に結合するキメリック抗体誘 導体（例えば、人間以外の動物の可変領域と人間の不変領域とを結合する抗体分 子）を産生し、これにより、被験者（人）内における免疫原性を、対応する非キ メリック抗体と比較して低減することが好ましい場合がある。このようなキメリ ック抗体は、例えば、可変領域のいくつかの部分、特に抗原結合領域において保 存領域が人間に起源し、高可変領域のみが非人間に起源する人可変領域キメラを 産生する方法により、様々な種類のものを得ることができる。（S.L.Morrison,S cience,(1985)229:1202;Oi et al.,BioTechniques,(1986)4:214;Teng et al.,Pr oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1983)80:7308-7312;Kozbor et al.,Immunology Toda y,(1983)4:7279;Olsson et al.,Meth.Enzymol.,(1982)9:3-16に記載の人キメ リック抗体およびその生成方法を参照）。 ここで用いられる用語「抗体」とは、一般的に、ｓｃＴＣＲに結合する、全免 疫グロブリン、および、免疫的に活性な断片（フラグメント）を指す。免疫グロ ブリン、およびその免疫的に活性なフラグメントには、抗体結合部位（融合タン パク質に特異的に結合可能なペリトープ）が含まれる。抗体フラグメントの例と しては、例えば、Fab,F(v),Fab',F(ab')2フラグメント、免疫グロブリンのジス ルフィド結合を還元することにより得られる「半分子」、一本鎖免疫グロブリン 、および他の抗原結合フラグメントなどか挙げられる（例えば、Bird et al.，S cience,(1988)242;Huston et al.,PNAS,(USA),(1988)85:5879;Webber et al.,Mo l.Immunol.,(1995)32:249参照）。抗体、もしくはその免疫的に活性なフラグメ ントは、動物（例えば、マウスやラットなどのげっ歯類）のものであってもよい し、キメラ体であってもよい（例えば、Morrison et al.,PNAS,(1984)81:6851;J ones et al.,Nature,(1986)321参照）。 「特異的結合」およびこれと同様の用語は、ここで開示されている分子が別の 分子に結合し、特異的結合ペアを形成することを意味する。しかしながら、該分 子は、例えば、ウエスタンブロッティング・エライザ法（western blotting ELI SA）、RIA法、移動度変位分析法（mobility shif tassey）、酵素免疫分析法（e nzyme-immuno assay）、競合分析法（competitive assey）、飽和分析法（satur atio nassey）、もしくは当該技術分野において公知の他のタンパク質結合分析 法によって得られる他の分子を認識せず、またそれらに結合もしない。分子同士 の特異的結合の検出方法の例については、一般的に、Ausubel，et al supra;Sam brook，et al，supra;Harlow and Lane，supraおよびその中の参照文献を参照さ れたい。 ここで文言されている全ての文献は、それらを完全な形で参照することによっ てここに取り入れられている。 本発明の、実施例を以下に示すが、本発明は特にこれらに限定されるものでは ない。 実施例１−可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の形成 マウスＤＯ１１．１０細胞ＴＣＲのＤＮＡ配列は報告されている（Kappler,J ． et al．PNAS(1994)91 8462）。ＴＣＲは、Ｉ−ＡdＭＨＣクラスII分子中に含ま れたかたちのニワトリ オボアルブミン（ＯＶＡ）ペプチド・スパニングアミノ 酸３２３−３３９を認識し、これに結合する。ＴＣＲをエンコードするＤＮＡは 、概して、KapplerおよびMarrack,supraに開示の方法に従い調製された。 簡単に説明すると、１×１０6個のＤＯ１１．１０細胞は、製造者（Ｄｙｎａ ｌ）の指示に従い、oligo-dTコーティング・マグネティックビーズを用いて単離 された。ＴＣＲのα鎖ｃＤＮＡは、Ｃ−α特異的「バック」プライマ−ＫＣ１１ ３（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．６）と、ＤＯ１１．１０ ｍＲＮＡとを含んでなる混合 物をインキュベートすることにより得られた。該ｃＤＮＡを得るために、後続し て、標準量のヌクレオチドおよび逆転写酵素をこの混合物に添加した。同様にし てβ鎖ｃＤＮＡが得られたが、ＫＣ１１３プライマーの代わりに、「バック」プ ライマ−ＫＣ１１１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）が使用された。アルファ鎖ｃＤ ＮＡを鋳型とし、プライマーＫＣ１１２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）およびＫＣ １１３の共存下でＰＣＲ反応が行われ、６５０ｂｐの5'ＸｈｏＩ−3'ＸｍａＩα 鎖フラグメントが増幅された。７５０ｂｐのβ鎖は、５’および３’末端に、順 にＳｆｉＩおよびＳｐｅＩ部位を含んでなるプライマーＫＣ１１１及びＫＣ１１ ０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）を用いたＰＣＲ法により増幅された。 ｓｃＴＣＲは、ＤＯ１１．１０ ＴＣＲより、共有結合されたＶ−α鎖および Ｖ−β鎖を含むかたちで構築された。場合によっては、Ｖ−α鎖は、Ｃ−α鎖フ ラグメントおよびＣ−β鎖フラグメントをさらに含んでいた（例えば、図３、お よび図６Ａ、６Ｂ参照）。一般的に、Ｃα鎖フラグメントは、アミノ酸約９個分 の長さを有していた。Ｃ−β鎖は、通常、完全な長さのＣ−β鎖におけるアミノ 酸残基１２７（すなわちシステイン残基）の直前のアミノ酸残基１２６の位置で 切断された。このシステイン残基が含まれているとｓｃＴＣＲの発現に有害であ ることが見いだされた。Ｖ−β鎖（もしくは、Ｃ−β鎖）フラグメントの３’末 端には、通常、バクテリオファージ遺伝子III外殻タンパク質、もしくはバクテ リオファージ遺伝子IV外殻タンパク質をエンコードする融合タンパク質精製標識 （例えは、ＥＥもしくは６ｘＨｉｓ）ＤＮＡが付加されていた。 実施例２−ｓｃＴＣＲ融合タンパク質発現のためのベクター 実施例１で得られたｓｃＴＣＲ ＤＮＡは、強い細菌プロモーター（ｐｈｏＡ ）もしくは弱い細菌プロモーター（ｌａｃＺ）を有するベクター内へ挿入された 。ｓｃＴＣＲを発現させるために使用されたベクターは、それぞれ図１Ａおよび 図１Ｂに示すｐＪＲＳ１４９およびｐＫＣ１２ ＤＮＡベクターである。これら ベクターは、ｓｃＴＣＲのバクテリオファージ外殻タンパク質への融合を可能に する。融合タンパク質をエンコードするＤＮＡベクターの構築については、図２ および以下に概略的にアウトラインを示す。 Ａ．ＤＮＡベクターｐＪＲＳ１４９ ｐＪＲＳ１４９ ＤＮＡベクターは、pBluScriptTM(Invitrogen)バックボーン を有するファージミドである。このベクターは、以下の実施例１４〜１８に説明 するバクテリオファージ・ディスプレイ実験で使用される、可溶性ｓｃＴＣＲ融 合タンパク質を生成するために使用される。 Ｂ．ＤＮＡベクターｐＫＣ１２ 遺伝子IIIをエンコードするＤＮＡは、図１Ｂに示すｐＫＣ１２ベクターにク ローン化された。 Ｃ．ＤＮＡベクターｐＫＣ１４およびベクターｐＫＣ１５ 遺伝子VIIIＤＮＡ配列は、鋳型（テンプレート）としてのfd tetバクテリオフ ァージ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３７０００）、プライマーＯＰＲ１５６（「フロント 」ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５８）、並びに、プライマーＯＰＲ１５７（「バック」 ＳＥＱ ＩＤ．ＮＯ．５９）を用いてＰＣＲ法により増幅された。その後、遺伝 子VIIIのＰＣＲ産物は、ベクターｐＫＣ１４を得るために、ＸｍａＩ−ＥｃｏＲ ＩフラグメントとしてベクターｐＬＬ００１内にクローン化された。ｐＬＬ００ １プラスミドは、ＰＵＶＣ−１９ ＤＮＡ由来であり、遺伝子VIIIセグメントを サブクローニングできるように、そのポリリンカー領域にＸｍａＩおよびＥｃｏ ＲＩ部位を含んでいる。また、ｐＬＬ００１ベクターは、遺伝子VIIIＤＮＡをク ローン化するためのシャトルベクターとして使用される。ベクターｐＫＣ１５は ｐＫＣ１４由来であり、９６ｂｐのＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、図１ に示すｐＪＲＳ１４９ベクターにクローン化することにより得られる。ＮｃｏＩ −ＥｃｏＲＩフラグメントは、複数のクローニング部位（例えば、ＳｆｉＩ、Ｎ ｃ ｏＩ、ＳｐｅＩ、ＸｈｏＩおよびＸｍａＩ）を有する合成ポリリンカー、ｐｅｌ Ｂリーダ、ｐｈｏＡプロモーター、および遺伝子VIII遺伝子を含んでなる。ベク ターｐＫＣ１５は、ｐＪＲＳバックボーンから得られる第二のｐｅｌＢリーダを 有し、ジーシストロニック（di-cistronic）オペロン制御下での遺伝子クローニ ングを可能にする。 Ｄ．ＤＮＡベクターｐＫＣ１６およびｐＫＣ１８ ｐＫＣ１６由来のＸｈｏＩ−ＸｍａＩフラグメントをクローン化するため、ア ルファ鎖ｃＤＮＡは、プライマーＫＣ１１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）（「フ ロント」）およびＫＣ１１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）（「バック」）を用い てＴＣＲ Ｖ−α、Ｃ−α遺伝子を増幅するための鋳型として使用された。Ｖ− β、Ｃ−β遺伝子フラグメントは、プライマーＫＣ１１０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０ ．３）（「フロント」）およびプライマーＫＣ１１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ）（「バック」）、並びに、β鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ法により増 幅された。続いて、該遺伝子フラグメントは、ベクターｐＫＣ１８を得るために ｐＫＣ１５内にクローン化された。 図３は、これら実験で用いられている、ｐＫＣ４４、ｐＫＣ４６、およびｐＫ Ｃ５１ ＤＮＡベクターを示すものである。ｐＫＣ１５からのＤＮＡベクターの 形成については、図２および以下にそのアウトラインが示されている。 Ｅ．ＤＮＡベクターｐＫＣ２７、ｐＫＣ４２、およびｐＫＣ４４ ベクターｐＫＣ２７は、アニーリングされたプライマーＪＡ３０１（ＳＥＱＩ Ｄ ＮＯ．９５）およびＪＡ３０２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９６）によって形成 され、これにより（Ｇ4Ｓ）4ポリペプチドリンカーを得た。その後、該リンカー は、ＳｐｅＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてｐＫＣ１５ベクター内にクローン化 された。その後、Ｖ−α１３．１、及びＶ−β、Ｃ−β領域は、それぞれ、ｐＫ Ｃ２７ ＤＮＡ内にクローン化された。簡単に説明すると、Ｖ−α１３．１遺伝 子フラグメントは、鋳型としてのベクターｐＫＣ１６ ＤＮＡと、プライマーＫ Ｃ１１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）（「フロント」）およびＫＣ１２６（「バ ック」）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）とを用いて、ＰＣＲ法を用いて増幅する ことにより生成された。Ｖ−α１３．１遺伝子は、ＳｆｉＩ−ＳｐｅＩフラ グメントとして、ｐＫＣ４２内にクローン化された。Ｖ−β８．２、および、Ｃ −β鎖ＤＮＡは、ｐＫＣ１８をＸｈｏＩおよびＸｍａＩにより切断された後にゲ ル精製された。このフラグメントは、ｐＫＣ４４ベクターを得る目的でｐＫＣ４ ２内にクローン化された。一般的に、ｐＫＣ４４ベクターは、ｐｈｏＡプロモー ターによる転写制御下で、ｓｃＴＣＲをｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質 のかたちで含むよう構成された。 Ｆ．ｐＫＣ１２、ｐＫＣ４５、ｐＫＣ４６、およびｐＫＣ５１ ＤＮＡベクタ ー ｐＫＣ１２（図２）からの、ベクターｐＫＣ４５、ｐＫＣ４６、およびｐＫＣ ５１の形成のアウトラインについては図４に記載され、また、以下に説明される 。 ｐＫＣ１２ベクターは、ｓｃＴＣＲをエンコードする実施例１のＤＮＡが、１ ａｃＺプロモーターの転写制御下で発現されるように修飾された。簡単に説明す ると、ｐＫＣ１２ベクターはｐＫＣ４５ベクターを得るために、アニーリングさ れたプライマーＫＣ１３４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）（「フロント」）およ びプライマーＫＣ１３５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）（「バック」）をｐＫＣ １２内にクローン化することにより修飾された。この修飾により、すでにＳｆｉ Ｉ部位（サイト）およびＥｃｏＲＩ部位を含んでなるｐＫＣ１２のポリリンカー 領域に対し、ＸｍａＩ部位がさらに付加された。また、ｐＫＣ４５は、ＥＥ−標 識の５’末端およびアンバーストップコドンに付された遺伝子VIIIをエンコード するＤＮＡ配列を含んだ。 アンバーストップコドンは、ＸＬ１−ｂｌｕｅなどのｌａｃＩqアンバーサプ レッサー宿主内で、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現レベルを約１５〜２０％低 下させた。ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質をエンコードするＤＮＡをｐ ＫＣ４５内にクローン化するために、ｐＫＣ４４ＤＮＡは、ＳｆｉＩおよびＸｍ ａＩで分割（切断）された。その後、ｓｃＴＣＲフラグメントは、ｐＫＣ４６を 得るために、ゲル精製された後にｐＫＣ４５内にクローン化された。ｐＫＣ４６ へのｓｃＴＣＲ挿入断片は図３に示されるように、ＥＥ−標識、及び遺伝子VIII 外殻タンパク質と融合されている。 ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質は、ｐＫＣ４４およびｐＫＣ４６ベク ターをＸｍａＩおよびＥｃｏＲＩで消化（切断）することにより、ｌａｃＺプロ モーターの転写制御下に置かれた。遺伝子VIIIのＤＮＡ配列は、ベクターｐＫＣ ５１を得るために、消化されたｐＫＣ４４ＤＮＡから単離され、ＳｆｉＩおよび ＸｍａＩフラグメントとしてゲル精製されたベクターＤＮＡ ｐＫＣ４６内にク ローン化された。そのあと、ベクターｐＫＣ５１内の該ｓｃＴＣＲ挿入断片は、 図３ｃに概略的に示すように、遺伝子VIII外殻タンパク質と融合された。ベクタ ーｐＫＣ４６とは異なり、ｐＫＣ５１ベクターは、ＥＥ−標識およびアンバース トップコドンを含んでいない。 実施例３−融合タンパク質をエンコードするＤＮＡのＤＮＡベクターｐＥＮ２ へのクローニング 実施例１で生成された可溶性ｓｃＴＣＲの発現は、図５に示すように、ｐＥＮ ２ベクター内にサブクローニングすることにより増大された。ｐＥＮ２ベクター は、ｐｈｏＡプロモーター、遺伝子１０リボゾーム結合部位、および修飾ｐｅｌ Ｂリーダを有している。ｐＥＮ２ベクターフォーマット内の可溶性ｓｃＴＣＲ挿 入断片は、図６Ａおよび図６Ｂに概略的に示され、以下に説明される。図６Ａお よび６Ｂでは、ＤＮＡベクターは、ｐＥＮ２ベクターから構築される。 Ａ．ＤＮＡベクターｐＫＣ６０の構築 ｐＫＣ６０ベクターは、１２０４ｂｐのSｆｉＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを ｐＥＮ２へ導入することによって得られた。ＳｆｉＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント は、Ｖ−α、Ｖ−β、およびＣ−β領域（ドメイン）からなっている。このフラ グメントは、プライマーＫＣ１１４（「フロント」ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）お よびＪＷＴＣＲ２０８（「バック」ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）を用いて、テン プレート（鋳型）としてのｐＫＣ５１ ＤＮＡを増幅することにより得られた。 ＪＷＴＣＲ２０９プライマーは、ＥＥ−標識およびＣ−β領域３’末端のＸｍａ Ｉ部位（サイト）を含んでいる。ＸｍａＩ部位の付加は、遺伝子IIIおよび遺伝 子VIIIのクローニングを促進した。ｐＫＣ６０ベクターは、上述したｓｃＴＣＲ ＸｍａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＥＮ２ベクター内にクローン化するこ とにより得られた。 Ｂ．ＤＮＡベクターｐＫＣ６１の構築 切断されたｓｃＴＣＲを形成するために、ベクターｐＫＣ４６のＶ−αおよび Ｖ−β配列は、プライマーＫＣ１１５（「フロント」ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８） およびＪＷＴＣＲ２０９（「バック」ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）を用いてＰＣ Ｒ法により増幅された。形成されたＰＣＲ増幅産物はベクターｐＫＣ６０内にサ ブクローン化され、これによりベクターｐＫＣ６１を得た。ｐＫＣ６１ベクター は、６ＸＨｉｓ標識をＥＥ標識配列の３’末端に付加することにより更なる修飾 を受けた。 Ｃ．ｐＣＫ６２およびｐＫＣ６４ ＤＮＡベクターの構築 バクテリオファージ遺伝子IIIをエンコードするＤＮＡは、ｐＫＣ６４ベクタ ーＤＮＡをテンプレートとして用い、また、プライマーＴＣＲ２１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６８）および２１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ６４）を用いて増幅さ れた。続いて、該ＤＮＡはｐＫＣ６０内にクローン化されてベクターｐＫＣ６４ を得た。遺伝子VIII遺伝子は、ベクターｐＫＣ５１ ＤＮＡをテンプレートとし て用い、また、プライマーＴＣＲ２１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７１）および２ １３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７０）を用いて増幅され、ベクターｐＫＣ６２を得 るためにｐＫＣ６０内にクローン化された。 Ｄ．ＤＮＡベクターｐＫＣ６３およびｐＫＣ６５の構築 遺伝子III（ｐＫＣ６５）および遺伝子III（ｐＫＣ６３）融合タンパク質は、 それぞれに対応の遺伝子フラグメントがＰＣＲ法により増幅された後、ベクター バックボーンｐＫＣ６１内にクローン化される。これにより、ｐＫＣ６５および ｐＫＣ６３双方は、そのプライマー配列中にエンコードされた６ＸＨｉｓ末尾を 含むことになる。 Ｅ．ｐＫＣ６６およびｐＫＣ６７ ＤＮＡベクターの構築 ｐＫＣ６６およびｐＫＣ６７ベクターは、Ｖ−α鎖フラグメント、およびＣ− α鎖フラグメントの最初の８個のアミノ酸を含んでなるＳｆｉＩ−ＳｐｅＩフラ グメントを、テンプレートとしてのｐＫＣ５１ ＤＮＡ、並びに、プライマーＫ Ｃ１１４（フロント ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）およびＪＷＴＣＲ２１７−β（ バック ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６）を用いて増幅することにより得られた。ｐ ＫＣ６６およびｐＫＣ６７ベクターを得るために、ＫＣ１１４およびＪＷＴＣＲ ２１７−βプライマーを用いてＴＣＲ ＤＮＡがＰＣＲ法により増幅された。そ の後、増幅されたＤＮＡは、ｐＫＣ６２内に、もしくはＳｆｉＩおよびＳｐｅＩ で予め消化されたｐＫＣ６０内にサブクローン化された。これらベクターは、そ れぞれ、Ｃ−α領域のＮ−末端から数えて８個のアミノ酸残基を含んでいる。こ れらベクターは、以下に説明されるＴＣＲライブラリの形成に使用される。ベク ターｐＫＣ６６は、遺伝子VIII遺伝子を含んでいる。 ＤＮＡベクターｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）およびｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９ ）は、12301 Parklawn Drive，Rockville，MDのBudapest Treaty（ブダペスト条 約）with the American Type Culture Collection(ATCC)に準じて寄託されてい る。これらＤＮＡベクターは、１９９７年２月２６日にＡＴＣＣに寄託され、Ac cession Nos.97895（ｐＳＵＮ１8）および97896（ｐＳＵＮ１９）に指定された 。ＤＮＡベクターｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９）は、ｐｈｏＡプロモータ、修飾ｐ ｅｌＢ配列、遺伝子１０リボソーム結合部位、およびバクテリオファージ遺伝子 VIIIプロモータを含んでなる。ＤＮＡベクターｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）は、 ｌａｃＺプロモータ、ＥＥ標識、およびバクテリオファージ遺伝子IIIタンパク 質を含んでなる。これらＤＮＡベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）、もしくは 他の適切な宿主細胞内で、標準的な方法により増殖させることができる。 ＤＮＡベクターｐＫＣ４６（ｐＳＵＮ１８）およびｐＫＣ６２（ｐＳＵＮ１９ ）は、様々なＶα、Ｖβ−Ｃβおよびポリペプチドリンカー配列を収容(accomod ate)可能に設計されている。これら両ＤＮＡベクターのＶα鎖は、ＳＦｉＩおよ ひＳｐｅＩの制限消化により切除することができる。ｖβ−Ｃβ鎖は、ＸｈｏＩ −ＸｍａＩの制限消化により切除することができる。また、これらＤＮＡベクタ ーでは、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩの制限消化により、ペプチドリンカー配列の交 換が可能である。 実施例４−ＴＣＲ融合タンパク質の発現の調節 １．ｐｈｏＡプロモータ ＸＬ１−Ｂ細胞は、ｐｈｏＡプロモータを含むベクターｐＫＣ４４で形質転換 された。形質転換された細胞は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の誘導を防止するた め、リン酸を含む培地で一晩生育された。培地からリン酸を取り除くと、ｓｃＴ ＣＲ／遺伝子VIIIタンパク質が発現する。シェーカーフラスコで一晩成長された 後、細胞は、リン酸欠乏培地で数回洗浄された。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発 現は、洗浄された細胞を、リン酸欠乏培地に再び懸濁することによって開始され た。４時間の誘導の後、細胞は収集された。通常、４時間の誘導により、ウエス タンブロット分析により分析可能な、適切なレベルの可溶性ｓｃＴＣＲ／遺伝子 VIII融合タンパク質が供給される。ｐｈｏＡプロモータ制御下におけるｓｃＴＣ Ｒ／遺伝子VIII融合タンパク質のより高い収率（例えば、約１０〜４００mgの間 ）は、細胞を、３〜１０リットルのファーメンター、もしくはバイオリアクター などの他の大規模な作成容器内で増殖することにより得られる。 一般的に、ｐｈｏＡプロモータを含むベクターは、Ｌａｃなどの他のプロモー タを含むベクターよりも好適に使用された。また、ｐＥＮ２ベクターを用いた発 現は、多くの理由から特に好ましいとされた。例えば、ｐＥＮ２ベクターは、ｐ ｈｏＡプロモータの他に、翻訳を増強する遺伝子１０リボゾーム結合部位を含ん でいる。ｐＥＮ２ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉにとって好適なコドンを含むべく修 飾されたｐｅｌＢリーダペプチドをさらに含んでいる。修飾されたｐｅｌＢリー ダ配列およびペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９および１３０に図示され ている。図７に示すウエスタンブロットは、このような修飾が、ｓｃＴＣＲ融合 タンパク質の発現を約１０〜５０倍と、大幅に向上する様を示している。 図７に示すウエスタンブロットは、抗−ＥＥ標識抗体（１：５０００希釈）を 用いてプローブされ、その後、ヤギ 抗−マウスＨＲＰ抗体（１：２００００希 釈）を用いてプローブされた。視覚化は、標準的な免疫学的手法によって行われ た。レーン１は、分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を示す。レーン２は、１ ０ＯＤ／ｍｌのｐＫＣ６０由来ｓｃＴＣＲ（誘導された）５マイクロリットルを 示す。レーン３は、誘導されていない(derepressed)ことを除けばレーン２と同 一条件である。レーン４は、１０ＯＤ／ｍｌのｐＫＣ５１由来ｓｃＴＣＲ（ＥＥ 標識なし）５マイクロリットルを示す。レーン５は、５０ＯＤ／ｍｌのＩＰＴＧ で誘導されたｐＫＣ４６由来ｓｃＴＣＲ５マイクロリットルを示す。 ２．ＬａｃＺプロモーター ｓｃＴＣＲ／遺伝子III（ベクターｐＫＣ４６）およびｓｃＴＣＲ／遺伝子VII I（ベクターｐＫＣ５１）融合タンパク質は、約３リットルのファーメンター内 で発現された。ｐｈｏＡプロモーターによる転写制御下でｓｃＴＣＲ融合タンパ ク質を発現させると、Ｌａｃプロモーターを含むベクターを用いる場合よりも多 量の融合タンパク質が生成した。よって、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、一般的 に、ｐｈｏＡプロモーターを含むベクターを用いて発現された。 実施例５−ｓｃＴＣＲ融合タンパク質系の発現 いくつかのＥ．ｃｏｌｉ菌株（系統：ＸＬ１−Ｂ、ＭＭ２９４、ＴＢ１、ＵＴ ５６００、および，Ｋ９１Ｋａｎ）につき、そのｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発 現能に関し分析がなされた。上記の宿主細胞系統は、実施例４で得られたｓｃＴ ＣＲ融合タンパク質を発現させるべく、ｐＫＣ６０で形質転換された。全ての形 質転換された系統は、３０℃のリン酸培地で成長するように適応された。ｓｃＴ ＣＲ融合タンパク質の誘導は、リン酸欠乏培地内で成長させることにより行われ た。ｓｃＴＣＲ発現のレベルは、図８に示すウエスタンブロット分析により求め られた。図８では、レーン１は、分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を示す。 レーン２は、１０ＯＤ／ｍｌのＭＭ２９４ ライゼート（ｐＫＣ６０）４マイク ロリットルを示す。レーン３は、宿主系統がＫ９１Ｋａｎであることを除けばレ ーン２と同一条件である。レーン４〜６も、宿主系統が、順にＸＬ１−Ｂ、ＴＢ １、および、ＵＴ５６００であることを除けばレーン２と同一条件である。全て の免疫沈降（沈澱）は、可溶性細胞画分でｐｈｏＡ誘導細胞から調製された。簡 単に説明すると、ウエスタンブロットは、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に、形 質転換細胞の５ＯＤ／ｍｌの細胞懸濁液５μｌを添加することによって行われ、 続いて、標準的なウエスタンブロット法によりブロットへ写しとられた。ｓｃＴ ＣＲは、University of San Diego,San Diego CalforniaのGernot Walter's Lab ratoryから認可された、抗−ＥＥ標識抗体を用いてブロットをプローブする方法 で検出された。これとは別に、他の抗−ＥＥ標識抗体およびＥＥ標識を使用する こともできる（例えば、pharmaciaから得られるもの）。抗体を結合後、ャギ 抗−マウスＨＲＰで標識されたコンジュゲート(Jackson Laboratories)が添加さ れた。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の発現は、Ｋ９１Ｋａｎ系統で最大であ った（図８）。 実施例６−ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の精製 ベクターｐＫＣ５１によりエンコードされた融合タンパク質は、従来の免疫ア フィニティークロマトグラフィーにより、形質転換細胞から精製された。図９は 、ｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質の免疫アフィニティークロマトグラフ ィーによる精製を概略的に示すものである。 簡単に説明すると、精製は、タンパク質−Ａ被覆(coated)セファロースビーズ １ｍｌに対し、ハムスター 抗マウスαβＴＣＲ抗体Ｈ５７−５９７（ＡＴＴＣ Accession ＨＢ−２１８）５ｍｇをカップリングすることで、クロマトグラフ ィー用のカラムを作成することにより行われた。Ｅ．ｃｏｌｉライゼートは、フ ァーメンターから取り出した細胞ペースト５０ｇを、溶解バッファ(0.05M Tris, pH8.0，150mM NaClおよび5mM EDTA)１００ｍｌに溶解することにより得られた。 再懸濁後の細胞は、フレンチプレスにより、２経路で溶解された。不溶性物質は 、１０，０００Ｇの遠心分離を２０分間行うことにより除去された。上澄みは保 持され、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで抗体カラムに供された。その後、カラムは、 ２０カラム量のＰＢＳにより洗浄され、結合したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、 ０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）により溶離され、その１ｍｌ画分が、２Ｍ Tri s０．０５ｍｌ（ｐＨ８．０）を含む管内に収集された。ｓｃＴＣＲを含む画分 はプールされ、ＰＢＳ４リットルにより一晩透析された。次の日に、精製された タンパク質は、セントリコン濾過装置（ｍｗ １００カットオフ）を用いて、５ 〜１０倍に濃縮された。 得られたｓｃＴＣＲタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での電気泳 動、その後のクーマシー・ブリリアントブルー染色により評価された。タンパク 質の完全度は、抗体Ｈ５７−５９７もしくは抗Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（ＥＥ）標識抗体 をプローブとして用いたウエスタンブロット分析により求められた。ＥＥ抗体は 、９つのアミノ酸よりなる直鎖状エピトープ、EEEEYMPME(SEQ ID NO 98)(図１０ )を認識する。Ｖ−β８．２立体配座エピトープに結合するその他２つの抗体（ ＭＲ５−２抗体、およびＦ２３．１抗体(PherMingen)）も、ｓｃＴＣＲ融合タン パク質の精製のために用いられた。また、Ｎｉ2+ＮＴＡアフィニティークロマト グラフィーによるｓｃＴＣＲタンパク質の精製を容易とするため、６ＸＨｉｓ末 尾（テール）が、いくつかの構造物（図６Ａ参照）に付加された。 図１０は、ｐＫＣ５１（レーン２）、ｐＫＣ４６（レーン３）、Ｈ５７抗体カ ラムで精製されたｐＫＣ４６（レーン５）、Ｈ５７カラムにおいて再度折り畳ま れ、精製されたｐＫＣ４６（レーン６）由来のｓｃＴＣＲタンパク質の、発現を 示すウエスタンブロットを表したものである。レーン７には、レーン１もしくは ６と比較して約５倍量の融合タンパク質が付与された。分子量マーカーは、レー ン１に示されている。可溶性カラム画分（レーン１）および不溶性カラム画分（ レーン１０）からのフロースルーも示されている。レーン４および８はブランク である。該ブロットは、抗−ＥＥ標識モノクローナル抗体の1:5000希釈液を用い てプローブされ、その後、ヤギ 抗マウスＨＲＰ抗体の1:20,000希釈液を用いて 視覚化された。着色は標準的な方法によって行われた。 実施例７−ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の特徴分析（characterization） ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の特徴分析のために、抗−αβＴＣＲ ｍＡｂｓパ ネルが使用された。ハムスターｍＡｂであるＨ５７−５９７は、Ｃ−β領域上の エピトープを認識する。競合テストが行われ、ＭＲ５−２とＨ５７−５９７との 競合効果が示された。このことは個々の抗体により接合されるエピトープは近位 であることを示唆している。同じＴＣＲ分子に工学的に導入された、９つのアミ ノ酸よりなるＥＥ配列、および、遺伝子III・遺伝子VIIIタンパク質に特異性を 有するポリクローナル ヒツジ 抗−バクテリオファージ血清(Phermacia)等の 他の抗体もｓｃＴＣＲの特徴分析に使用された。 Ａ．分子量 ベクターｐＫＣ５１から発現されたｓｃＴＣＲ／遺伝子VIII融合タンパク質は 、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供され、その後、クーマシーブルー（図１１参 照）で染色された。図１１において、レーン２は、ＸＬ１−Ｂ細胞の１０ＯＤ／ ｍｌ培養物から産生された融合タンパク質を示す。図１１のレーン３は、ｓｃＴ ＣＲを精製するのに使用されるＨ５７抗体カラムからのフロースルーを示す。図 中のレーン４は、カラムからの精製ｓｃＴＣＲを示す。図１１のレーン１は、分 子量マーカーを示す。ゲルの観察により、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ゲル内 を約４６ｋＤの位置まで移動したことが明らかになった。この結果は、ｓｃＴＣ Ｒは完全であることを示す。 図１２に示すウエスタンブロットは、４６−５０ｋｄの分子量を示すタンパク 質の、ＥＥ−標識，バクテリオファージタンパク質、もしくはＣ−β領域内のエ ピトープそれぞれと結合する抗体を用いてプローブされた（図１２）。他のＤＮ Ａベクターから産生されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、同様の方法で分析され た。 Ｂ．立体配座折り畳み(Conformational Folding) ｐＫＣ６０ ＤＮＡベクターによってエンコードされた融合タンパク質は、抗 −Ｖ−β８．２抗体（ＭＲ５−２およびＦ２３．１）および抗−idotype mab Ｋ Ｊ１(Dr.KapplerおよびMarrackの好意による提供)を用いた結合検定を行うこと により、その折り畳み構造の適切さのテストが行われた。ｓｃＴＣＲ融合タンパ ク質は、抗−Ｖ−β８．２抗体と共に４℃で一晩インキュベートされ、翌日、ヤ ギ 抗−マウス被覆（coated）マグネティックビーズ(Dynal)と結合された。こ の物質は、さらに一時間、室温（ＲＴ）でインキュベートされた。免疫複合体は 、標準的な手順により沈降された。その後、ビーズは、非特異的に結合したタン パク質を除去するために、０．５ｍｌのＰＢＳ＋０．５Ｍ ＮａＣｌにより丁寧 に洗浄された。４回の洗浄後、マグネティックビーズは、β-2 メルカプトエタ ノールを含有する、もしくは含有しないＳＤＳを含んでなる５０μｌのクラッキ ングバッファー内に再懸濁され、それぞれ３分間煮沸された。続いて、マグネテ ィックビーズを除去し、その溶液は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供され、１２０ボ ルトで１時間さらされた。これにより、サンプルは電気泳動された。続いて、得 られたブロットを、ＨＲＰ標識された抗−ＴＣＲ抗体(Phermingenより得られた Ｈ５７）もしくは抗−ＥＥ標識抗体でプローブすることにより、サンプルに対す るウエスタンブロットが行われた（図１３）。 図１３は、抗−ＥＥ標識抗体の1:5000希釈液によりプローブされたウエスタン ブロット、および、それに後続する、ヤギ 抗−マウス−ＨＲＰの1:20,000希釈 液による視覚化の結果を示すものである。ｐＫＣ６０およびｐＫＣ６２双方の培 養物は、リン酸欠乏により誘導された。レーン１は、ｐＫＣ可溶性画分の１０ ＯＤ／ｍｌサンプル１０マイクロリットルを示す。レーン２は、ＭＲ５−２モノ クローナル抗体により形成された、ｐＫＣ６０由来のｓｃＴＣＲ融合タンパク質 の免疫沈降を示す。レーン３は、ＭＡｂＦ２３．１を使用することを除いては、 レーン２と同様にして得られた免疫沈降を示す。レーン４は、ＭＡｂＫＪ１によ り形成された、ｐＫＣ６０由来のｓｃＴＣＲ融合タンパク質の免疫沈降を示すも のである。レーン５〜８は、ｐＫＣ６２由来のｓｃＴＣＲ融合タンパク質が分析 されたこと以外は、順にレーン１〜４と対応する（同様の）ものである。全ての レーンは、誘導培養物からのものである。ｓｃＴＣＲタンパク質は、立体配座的 に正しいＶ−β部を持つことが、このデータにより示唆される。 ３．表面プラズマ共鳴分析(BiaCore) ｐＫＣ５１によりエンコードされたｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、表面プラズ マ共鳴分析により、さらにその特徴が分析された（図１４）。融合タンパク質は まず、ｓｃＴＣＲ分子をＭＲ５−２もしくはＨ５７抗体で被覆されたバイオセン サーチップ上に捕捉する、従来のサンドウィッチ検定により検出された。この検 出は、概して製造者(Phermacia)の指示に従い行われた。一般的に、抗体の一方 がｓｃＴＣＲ融合タンパク質を捕捉するために使用された場合、他方の抗体は、 サンドウィッチ複合体を形成するために使用される。２つの抗体は、β鎖の異な る領域を認識し、ｓｃＴＣＲとの結合において競合することが、データにより示 唆された（図１４）。図１５は、相互作用を概略的に示す。ｓｃＴＣＲは、抗− Ｍ１３抗体によって、さらに結合されることも可能であり、このことは、ｓｃＴ ＣＲ融合タンパク質上に、バクテリオファージタンパク質が存在することを示し ている。 スーパー抗原（例えば、ＳＡｇ）は、ＭＨＣフォーマットにおける提示とは無 関係に、いくつかのＶ−β鎖と結合可能である。ＴＣＲとＳＡｇとの相互作用は 、Ｖ−β鎖の高可変性４（ＨＶ４）領域で起こる。ＳＡｇとＨＶ４領域との相互 作用は立体配座による。そのため、ｓｃＴＣＲタンパク質が、チップ上にコート されたＳＡｇと結合可能か否かを調べるために、表面プラズマ共鳴分析が使用さ れた（図１６）。ＳＡｇは、ＴＣＲ Ｖ−β８．２と結合することが知られてい る。表面プラズマ共鳴分析が行われたうち、報告されている最も高い親和性は５ ×１０-5モルであると信じられており、この相互作用が、ＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプ チド相互作用と比較可能である。 ＳＥＣ３(Toxin Technology，Tempa FL.)として知られるStreptococcus ＳＡ ｇが、標準的なアミン結合化学的手法を用いてチップと結合された。精製された ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を、濃度約２μＭ〜１６μＭの範囲内で、かつ、流速 ２μｌ／ｍｉｎでチップ上を通過させた。コントロールとして、融合タンパク質 とブランクチップとの非特異的結合の計測が、ＳＥＣ３により被覆されたチップ との特異的結合の計測実験と並行して行われた。結合データは、２つのチップ間 での、ｓｃＴＣＲ結合の違いを比較することによりまとめられた。該データは、 ｓｃＴＣＲ融合タンパク質とチップ上のＳＥＣ３ ＳＡｇとの間には、特異的相 互作用があることを示した。さらに、これらデータは抗体結合データをサポート し、ｓｃＴＣＲが立体配座的に正しいＶ−β８．２領域を含んでなることを示唆 する（図１６）。 実施例８−ＯＶＡ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ結合分析における融合タンパク 質の活性 ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の機能と生物学的作用を調べるため、細胞ベースの 競合（拮抗）阻害検定が使用された。一般的に、ＭＨＣ分子中に捕捉された抗原 からＤＯ１１．１０細胞をブロックする目的で、上記実施例４で精製された融合 タンパク質（Ｔ細胞ハイブリドーマＤＯ１１．１０由来）が使用された。相互作 用は、ＩＬ−２の産生を計測することにより検出された。 上述したように、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の機能性をテストするための分析 の例は、上記の公開ＰＣＴ出願番号／ＵＳ９５／０９８１６、および審査中の米 国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に記 載されている。特に、上記審査中の米国特許出願番号０８／５９６，３８７には 、Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞検定、該検定に使用される細胞（例えば、ＤＯ１１ ．１０）、ｓｃ−ＭＨＣクラスＩおよびII分子、特に、共有結合された、もしく は非共有的に結合された提示ペプチド（例えば、ＯＶＡもしくはＨＳＶｇＤ１２ ペプチド）を有するｓｃ−ＭＨＣ ＩＡdクラスII分子が開示されている。 Ａ）Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞検定 ｓｃＴＣＲ誘導タンパク質分子の機能性をテストするＴ細胞ハイブリドーマ検 定は、上記の公開ＰＣＴ出願番号／ＵＳ９５／０９８１６、および審査中の米国 特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に記載 されている。 簡単に説明すると、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞ハイブリドーマ系統は、ニワトリオ ボアルブミン由来の１７アミノ酸よりなるＯＶＡペプチトフラグメント（アミノ 酸３２３〜３３９）に特異性を有する細胞表面Ｔ細胞レセプターを発現する。Ｏ ＶＡペプチドは、マウス クラスIIＭＨＣ分子Ｉ−Ａｄを発現するＡＰＣにより 、ＤＯ１１．１０細胞に提示される。ペプチドが、適切なＡＰＣにより提示され た場合、ＤＯ１１．１０細胞は、ＩＬ−２を産生すべく応答し、これはＴ細胞活 性の指標として使用することができる。Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞検定の例を以 下に簡単に示す。 ｓｃ−ＩＡｄ／ＯＶＡ複合体は、ＤＰＢＳ（Ｍｇ2+およびＣａ2+イオン非含有 ）により希釈され、９６ウェルプレートの有するウェルに受動的に供給された。 ｓｃ−ＩＡｄ／ＯＶＡペプチドは、共有結合された提示ペプチドを含んでいるこ とが好ましい。室温で一晩インキュベートされた後、ウェルを、Ｍｇ2+およびＣ ａ2+イオン非含有ＤＰＢＳで、２回洗浄してもよい。約１×１０5ＤＯ１１．１ ０細胞は、０．５μｇＭＨＣ／ペプチド分子が供給されたウェルの存在化もしく は非存在化で、35℃で４時間または７時間インキュベートされる。 ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の特異性をさらに実証するために、ＩＡｄ制限型で あるがＨＳＶペプチドを認識する、第二のＴ細胞ハイブリドーマ（ｇＤ）を使用 することもできる。ｇＤＴ細胞ハイブリドーマは、上記の審査中の米国特許出願 シリアル番号０８／５９６，３８７に開示されている。この検定は、以下のこと を実証するために行われる。すなわち、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、ＤＯ１１ ．１０ハイブリドーマ細胞によるＩＬ−２産生を阻害可能であり、一方、ｇＤ１ ２Ｔ細胞ハイブリドーマによるＩＬ−２の産生に対しては、仮にあるとしても、 非常に小さい阻害効果を有することを実証するためである。培養は、完全培地（ １０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびＬ−グルタミンを添加 してなるＲＰＭＩ１６４０）で、９６ウェル平底マイクロプレート上で行われた 。４時間もしくは７時間のインキュベーションの後、ＩＬ−２の存在を調べるた め、培養物の上澄みをＩＬ−２サンドウィッチＥＬＩＺＡ法により分析した。 適切なＩＬ−２検出プロトコールは、上記の公開ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１ ６、および審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４および０８ ／５９６，３８７に記載されている。ここで行われるＩＬ−２サンドウィッチＥ ＬＩＺＡ法のプロトコールは、基本的には、PharMingenに説明されているもので ある。簡単に説明すると、ウェルは、２μｇ／ｍｌのラット 抗−マウスＩＬ− ２抗体５０μｌによりコートされる。抗体を、４℃で一晩インキュベート後、こ れを受動拡散によりプラスチックに結合する。プレートは、ＰＢＳ／０．５％Ｔ ｗｅｅｎ−２０により２回洗浄される。その後、細胞培養物の上澄み１００μｌ がそれぞれのウェルに加えられ、室温で４時間インキュベートされる。その後、 プレートは、ビオチニル化(biotinylated)ラット 抗−マウスＩＬ−２抗体、す なわち、第二の抗体が加えられる前に、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎにより６回洗浄され る。この抗体は、室温で１時間インキュベートされ、その後、該プレートは、Ｐ ＢＳ／Ｔｗｅｅｎにより６回洗浄される。最後に、２５μｇ／ｍｌのstrepavidn peroxidase１００μlが、各ウェルに加えられ、室温で３０分間インキュベート される。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで８回洗浄後、ＡＢＴＳ基質１００μｌが加えられ 、シグナルが、ＯＤ４０５ｎｍで読まれる。産生ＩＬ−２の濃度は、ＩＬ−２ス タンダード曲線に対するプロットにより数量化された。ＤＯ１１．１０およびｇ Ｄ１２細胞の活性化のためのＩ−Ａd／ペプチド分子の最適投与量は、最大反応 よりも若干低めの反応を促すものである。従い、実験は、０．５μｇ Ｉ−Ａｄ ／ペプチドでコートされたウェル、および、４時間もしくは７時間のインキュベ ーションにて行うことができる。 本発明の可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質に関し、その濃度１０-9〜１０-4Ｍ の範囲内での、ＤＯ１１．１０細胞内におけるＩＬ−２の産生をブロックする能 力についてテスト可能である。テストは、可溶性ｓｃＴＣＲとプレート上にコー トされた可溶性Ｉ−Ａｄ／ペプチド分子とのモル比が、約１０：１から１：１の 範囲内で行うことができる。濃度は、必要に応じて調節することができる。期待 されることは、可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質共存下でのプレインキュベーシ ョン後に、ｇＤ１２と比較して、ＤＯ１１．１０のＩＬ−２産生が低下すること であり、これは可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質が、ＴＣＲ特異的な免疫反応を 抑制可能であることを示す。 ＴＣＲはＭＨＣ／ペプチドに対する結合親和性が低いので、阻害検定において 、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を用いたＩＬ−２産生の低下が常に観察できるとは 限らない。しかしながら、相互作用の親和性は、多価ｓｃＴＣＲ融合タンパク質 を構築することにより増大できる。ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の親和性を増大す ること（また、その解離を妨げること）により、ＭＨＣ／ペプチド複合体と結合 する機会が与えられるＴＣＲ量がより少なくなると考えられている。 実施例９−多価融合タンパク質の調製 多価分子をつくるには、広く知られた方法がいくつかある。多価融合タンパク 質は、標準的な方法でｓｃＴＣＲをビオチニル化し、その後、分子に対し、stre ptavidin添加後、架橋することで得られる。biotin-streptavidin接合によれば 、通常、４量体型の多価融合タンパク質が形成される。 多価融合タンパク質は、公知の方法（例えば、Newman，S.L．et al．J.Immuno l.(1995)154,753参照)に従って、融合タンパク質をラテックスビーズ(Polyscien ces，Inc．Warrington,PA)に共有結合することによっても作出できる。例えば、 ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、アミン基もしくはジスルフィド基を介して、ビー ズに直接結合することもできる。ｓｃＴＣＲの変性は、ラテックスビーズを、st repavidinもしくはｓｃＴＣＲに特異的に結合する抗体でコートすることにより 最低限にすることができる。例えば、上記のようにｓｃＴＣＲがＥＥ−標識を含 む場合、ＥＥ−標識抗体は、ラテックスビーズをコートするために使用できる。 実施例１０−イン・ビトロでの抗原刺激性Ｔ細胞増殖に対するｓｃＴＣＲ融合 タンパク質の効果 上記の各実施例で形成された可溶性融合タンパク質に関し、抗体刺激性Ｔ細胞 増殖の抑制能についてテスト可能である。このようなテストの例は、上記の公開 ＰＣＴ出願番号／ＵＳ９５／０９８１６、および審査中の米国特許出願シリアル 番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に記載されている。 この公開ＰＣＴ出願番号／ＵＳ９５／０９８１６、並びに、審査中の米国特許 出願シリアル番号０８／３８２，４５４および０８／５９６，３８７に記載され ている方法の一つでは、Ｔ細胞は、マウスなどの全ての哺乳類から単離すること ができる。例えば、完全フロイントアジュバント中の５０μｇＯＶＡ３２３−３ ３９−ＫＬＨを用いて、皮下注射により尾の付け根から免疫感作することで、Ｂ ＡＬＢ／ｃマウス（ＭＨＣクラスII：Ｉ−Ａｄ）からＯＶＡ−ｐｒｉｍｅｄ Ｔ 細胞を得ることができる(Harlow and Lane，Supra参照)。例えば、７日間隔で２ 回の免疫感作を行うことが可能であり、２回目の注射から１週間後にマウスは解 剖され、鼠蹊およびリンパ腺が切除され、これか分散されて単一細胞懸濁液が得 られる。その後、単一細胞懸濁液はナイロンウールおよびSephadex G-10カラム でのインキュベーションにより、抗原提示細胞が取り除かれる。精製されたＴ細 胞群は、Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地のみ、もしくはＣｌｉｃｋ’ｓ培地に溶解されたｓ ｃＴＣＲ融合タンパク質と共に、さらにインキュベートされる。 ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の活性化Ｂ細胞を、従来のＢ細胞増殖検定(assay)に おいて抗原提示細胞として用いる。例えば、Ｂ細胞は以下の方法で調製する。即 ち、脾臓細胞に５０μｇ／ｍｌのＬＰＳ（即ち、リポサッカライド）を加えて４ ８−７２時間培養する。培養終了後、活性化された細胞を、Ficoll／Hypaque（P harmacia製）を用いて密度勾配遠心分離により単離する。その後、活性化された Ｂ細胞にＯＶＡ３２３−３３９ペプチドの存在下で３時間パルスをかけ、厳密に 洗浄し、さらに、Ｂ細胞の増殖を阻害するべくパラホルムアルデヒドを加えて固 定したものを、精製Ｔ細胞単独、あるいはＴ細胞と可溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパ ク質との混合物に加える（Selected Methods in Cellular Immunol．(1980)B.B ．Mishell and S.M．Hiigi W.H．Freeman and Co．San Franciscoを主に参照） 。 標準のＢ細胞増殖検定は、９６ウェル丸底マイクロプレート中、３７℃、５％ ＣＯ2条件下で、３−５日かけて行われる。ウェルに、ＷＳＴ−１（Boehringer Mannheim製）試薬を加えて４時間パルスをかけた後、培養を終結させる。その後 、培養物の光学濃度を記録する。免疫感作（免疫付与）後のマウス中で起こった ＴH細胞応答（即ち、クローンの増殖）は、ペプチド反応性Ｔ細胞の増殖度に より示される。 実施例１１−イン・ビボにおける、抗原刺激性Ｔ細胞増殖に対するｓｃＴＣＲ 融合タンパク質の影響 可溶性融合タンパク質に対し、さらに、イン・ビボにおけるＴ細胞クローンの 増殖阻害試験を以下の出願に記載された方法に従って行う。即ち、公開ＰＣＴ国 際出願番号ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３ ８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である。 例えば、３つの試験用グループを次のようにして準備する。即ち、１５匹のＢ ＡＬＢ／ｃマウスに対し、完全フロイントアジュバント中に混合されたＯＶＡ３ ２３−３３９−ＫＬＨを、腹膜腔内注射（ＩＰ）により約１０−１００μｇ投与 し、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドに対する免疫応答を誘導する。ＯＶＡ−ＫＬ Ｈによる免疫感作の前日及び２日後に、５匹のマウスに対して、抗−ＯＶＡ／Ｉ −Ａｄ ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をＰＢＳに加えたものを、ＩＰにより約１０ −１００μｇ投与する。このｓｃＴＣＲはＩ−Ａｄ／ＯＶＡ ＭＨＣクラスII分 子に結合して、抗原特異的Ｔ細胞上のＴＣＲ分子がＡＰＣ上のＩ−Ａｄ／ＯＶＡ 分子に結合するのを抑制あるいは排除する。残りの１０匹のマウスは、コントロ ールとして用いる。例えば、５匹のマウスにはＰＢＳを与え、他の５匹のマウス には異なる特異性を有するｓｃＴＣＲを与える。マウスは、免疫感作の１０日後 に解剖する。リンパ節を除去し、これを分散することで、単一細胞の懸濁液を調 製する。該懸濁液をナイロンウール上でインキュベートし、Sephadex G-10カラ ムにかけることにより、懸濁液から抗原提示細胞を取り除く。 得られた精製Ｔ細胞群に対し、ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドと共にパルスを かけたＡＰＣを加え、該精製Ｔ細胞群をインキュベートする。ＢＡＬＢ／ｃマウ ス由来の活性化されたＢ細胞を、増殖検定におけるＡＰＣとして用いる。Ｂ細胞 は以下の方法で調製する。即ち、マウスの脾臓細胞に５０μｇ／ｍｌのＬＰＳを 加えて４８−７２時間培養する。培養終了後、活性化された細胞を、Lymphoprep を用いた密度勾配遠心分離により単離する。その後、活性化されたＢ細胞にＯＶ Ａ３２３−３３９ペプチドを加えて３時間パルスをかけ、厳密に洗浄し、さらに 、Ｂ細胞の増殖を阻害するべくパラホルムアルデヒドを加えて固定したものを、 精製Ｔ細胞に加える。 Ｔ細胞増殖検定は、９６ウェル丸底マイクロプレート中、３７℃、５％ＣＯ2 条件下で、３−５日かけて行う。ウェルにＷＳＴ−１試薬を加えて４時間パルス をかけた後に培養を終結させ、異なる波長における吸光度を読みとる。免疫感作 後のマウス中で起こったＴｈ細胞応答（即ち、クローンの増殖）は、この検定に おけるペプチド反応性Ｔ細胞の増殖度により示される。予想されることは、ＯＶ Ａ−ＫＬＨあるいはＨＳＶ−ＫＬＨによる免疫感作を行うとともに、ｓｃＴＣＲ 融合タンパク質の投与を行ったことにより、クローンの増殖量が制限され、それ に続くＯＶＡ反応性Ｔ細胞系のイン・ビトロにおける増殖は、ＨＳＶ反応性Ｔ細 胞系の増殖に影響を及ぼすことなく、制限されるということである。 実施例１２−マウスの自己免疫疾患の抑制 実験用アレルギー性脳髄炎（experimental allergic encephalomyelitis（Ｅ ＡＥ））は、マウスの自己免疫疾患であり、一般に多発性硬化症に対応する動物 モデルと考えられている。２つのタンパク質の起脳炎領域、すなわちミエリン塩 基性タンパク質（ＭＢＰ アミノ酸９１−１０３）及びプロテオリポタンパク質 （proteolipoprotein）（ＰＬＰ アミノ酸１３９−１５１）の起脳炎領域は決 定されている（Martin，R．et al．Ann．Rev．Immunol．(1992)10:153を主に参 照）。 ＳＪＬマウス系統では、ＥＡＥの誘導・発症は、起脳炎ペプチドによる免疫感 作、あるいはＭＢＰ反応性Ｔ細胞の養子免疫伝達によってもたらされる。可溶性 の抗−ＭＢＰ９１−１０３Ｔ細胞受容体（レセプター）、又は可溶性の抗−ＰＬ Ｐ１３９−１５１ Ｔ細胞レセプターのうち、いずれにより処理するとＴ細胞活 性化後のＥＡＥの発症が防止されるかを決定するために、ＳＪＬマウスに対して ＭＢＰ９１−１０３反応性Ｔ芽細胞、及びＰＬＰ１３９−１５１反応性Ｔ芽細胞 をイン・ビボで投与する。このようなマウスにおいてＴ細胞の増殖を検出する適 切な方法は、以下の出願に記載されている。即ち、公開されたＰＣＴ国際出願番 号ＵＳ９５／０９８１６、米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及 び０８／５９６，３８７である。 また、公開されたＰＣＴ国際出願番号ＵＳ９５／０９８１６、米国特許出願シ リアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７は、さらに以下の 内容を記載している。即ち、ＳＪＬマウスでＥＡＥを誘導するには、ＳＪＬマウ スの背（dorsum）に対し、完全フロインド・アジュバント中のＭＢＰ９１−１０ ３を約４００μｇ投与して免疫感作する。１０−１４日後、部分的に流れ出た（ regional draining）リンパ系細胞を上述のように収集し、２４ウェルプレート で培養する。該細胞の濃度は、１ウェルあたり細胞６×１０6個とし、１．５ｍ １のＲＰＭＩ １６４０培地／１０％ウシ胎児血清／１％ペニシリン／ストレプ トマイシン／ＭＢＰ５０μｇ／ｍｌ中で培養する。４日間イン・ビトロで刺激を 与えた後、ＭＢＰ９１−１０３反応性Ｔ芽細胞を、Ficoll／Hypaque密度勾配(Ph armacia製)により収集し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１．３×１０7個の該細胞を 個々のマウスに投与する。 起脳炎ＭＢＰ９１−１０３反応性Ｔ細胞を与えたマウスには、さらに以下のも のを投与する。即ち、ＭＢＰ９１−１０３特異的ｓｃＴＣＲ融合タンパク質約１ ００μg（IAsコンテクスト(context)）、ＰＬＰ１３９−１５１特異的ｓｃＴＣ Ｒ融合タンパク質１００μｇ（ネガティブコントロール）、あるいは生理食塩水 （模擬コントロール（sham control））を、その同日、３日後、７日後に、静脈 注射（i.v.）により投与する（トータル投与量３００μｇ）。続いて、臨床評価 または組織学的評価を行い、ＭＢＰ９１−１０３＋ＩＡｓに対し反応性を有する ｓｃＴＣＲ分子が、マウス中のＥＡＥの発症を阻害したことを確認する。 上記公開ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特 許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７に記載の ように、ＰＬＰペプチド１３９−１５１によりＳＪＬマウス中でＥＡＥを誘導す るために、ＰＢＳに溶解したＰＬＰペプチド１３９−１５１と、マイコバクテリ ア結核菌Ｈ３７Ｒａを４ｍｇ／ｍｌで含有する完全フロイントアジュバントとを １：１の割合で混合したものを、該マウスに投与して免疫感作する。これにより 、マウスに１５２μｇのペプチド−アジュバント混合物を投与する。その同日及 び４８時間後に、すべてのマウスに百日咳毒素を４００ｎｇ与える。その後、Ｅ ＡＥの養子免疫伝達を上述のように行う。 上述の方法に従って（実施例１参照）、ＴＣＲ ＤＮＡを、正常なＳＪＬマウ ス及びＥＡＥ疾患のＳＪＬマウスから得る。そして、ＴＣＲ ＤＮＡを用いてｓ ｃＴＣＲを構築する。ｓｃＴＣＲは、バクテリオファージ外殻タンパク質あるい はそのフラグメントを有する適切なＤＮＡベクターにライゲーションされる。そ の後、ＰＬＰ反応性ｓｃＴＣＲペプチド融合物あるいはＭＢＰ反応性ｓｃＴＣＲ ペプチド融合物を発現させ、上記実施例に従い、必要に応じて精製する。そして 、これらのｓｃＴＣＲペプチド融合タンパク質に対し、ＥＡＥの発症防止能試験 を行う。 以下の実施例１４及び１５に述べるように、ＰＬＰ ｓｃＴＣＲ融合タンパク 質及びＭＢＰ ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を用いて、バクテリオファージ・ディ スプレイ・ライブラリを作成することもできる。そのｓｃＴＣＲバクテリオファ ージ・ディスプレイ・ライブラリから、ＩＡｓと共同して、ＭＢＰ（９１−１０ ３）ペプチドあるいはＰＬＰ（１３９−１５１）ペプチドに結合するレセプター をスクリーニングする。以下の実施例１５においてさらに詳しく述べるように、 結合したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、適切なパニング技術(panning technique )により単離される。このようにして得られたｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、可 溶性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の生成に用いる。そして、この可溶性ｓｃＴＣＲ 融合タンパク質に関し、ＳＪＬマウスの自己反応性Ｔ細胞に対する阻害作用の評 価を行う。 実施例１３−ｓｃＴＣＲ抗原結合領域の親和性向上 親和性の高いｓｃＴＣＲ融合タンパク質に対しては、ＴＣＲとＭＨＣ／ペプチ ド複合体との不所望な相互作用を抑制あるいは排除する作用が期待される。不所 望な相互作用とは、例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患、及び移植時の拒絶 反応において生じるものである。親和性の高いｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、例 えば、対応するネイティブＴＣＲと競合して、ＴＣＲを有するＴ細胞とＭＨＣ／ ペプチド分子を有するＡＰＣとの結合を抑制あるいは排除する。あるいは、該ｓ ｃＴＣＲ分子はスーパー抗原との結合を抑制する。ネイティブＴＣＲは、結合の 親和性が弱く、また、解離速度が速いので、多くのｓｃＴＣＲ融合タンパク質が 単一のＭＨＣ／ペプチド分子と相互作用することができると考えられている。 親和性の高いｓｃＴＣＲ融合タンパク質を用いて、自己反応性Ｔ細胞を活性化 するＭＨＣ／ペプチド分子との結合を抑制あるいは排除することができる。これ を実現するためには、遺伝子工学（例えば、部位特異的突然変異の誘導あるいは リンカー走査突然変異(site directed or linker scanning mutagenesis)の誘導 ）を利用し、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の親和性を改善すること、特に解離速度 を向上することにより実現される。従来の結合検定は、タンパク質の解離速度を 研究するために行われてきた。ｓｃＴＣＲに特異的に結合する抗原性ペプチドの 配列が分かっているか、あるいはすぐに決定できるものである場合は、該ペプチ ドを、例えば、アラニン走査突然変異(alanine scanning mutagenesis)の誘導に より突然変異させ、ｓｃＴＣＲのＣＤＲ３領域に特異的に結合する残基を同定す る。突然変異した抗原性ペプチドとｓｃＴＣＲとの結合は、本願で述べる結合検 定により評価する。従って、このペプチドにおいて同定されたアミノ酸残基は、 ｓｃＴＣＲ分子における接触残基(contact residue)の同定を可能にする。好ま しくは、この方法で生成されたｓｃＴＣＲタンパク質突然変異物が、ＴＣＲの抗 原に対する結合特異性、及び抗体の親和性を有することである。改良ｓｃＴＣＲ 融合タンパク質の生成方法としては、上述したように突然変異融合タンパク質を 生産することによって行われる。 改良ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、以下の実施例に述べるバクテリオファージ ・ディスプレイ・ライブラリを用いて、自己反応性ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を 単離することにより生成できる。そして、バクテリオファージ・ディスプレイ・ ライブラリを用いて、ＰＬＰタンパク質及びＭＢＰタンパク質から得られるペプ チドに共有結合するＩＡｓ分子を捕捉することができる。一旦ｓｃＴＣＲを単離 すれば、ｓｃＴＣＲタンパク質突然変異物により、上述したように、ペプチド接 触残基のさらなるキャラクタリゼーションを行うことができる。 実施例１４−バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリの生成 上記実施例１においては、ＤＮＡベクターｐＫＣ４６及びｐＫＣ５１を用いて 、ＩＰＴＧ誘導後、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をバクテリオファージ表面上にデ ィスプレイ（呈示）した。バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリの生 成は一般的に知られており、これを用いれば、約５０ＫＤまでのポリペプチドや タンパク質をディスプレイすることかできる（Smith，G.P．and Scott，J.K．in Methods in Enzymology（1993）217:228を主に参照）。 要約すれば、２x Luria Broth（ＬＢ）＋０．５％グルコース、及び１００μ ｇ／ｍｌのアンピシリンを入れたフラスコに、大腸菌系統、即ち、プラスミドベ クターｐＫＣ４６あるいはｐＫＣ５１を含むＸＬ１−Ｂ細胞を接種した。一晩成 長させた後、遠心分離により細胞をペレット状にし、グルコース非含有２x ＬＢ に再度懸濁させた。再び細胞を遠心分離し、２x ＬＢ中で２回洗浄した。２回目 の洗浄の後、細胞をもう一度５０ｍｌの２x ＬＢに懸濁し、ここにＩＰＴＧを加 えて最終濃度を１ｍＭとした。細胞を２時間、３７℃で成長させた後、ヘルパー バクテリオファージであるＶＣＳＭ１３を、細胞培養物５ｍｌ当たり１０ｐｆｕ 加えた。１５分後、ＸＬ１−Ｂ細胞、及びヘルパーバクテリオファージの混合物 を、テトラサイクリン、アンピシリン、及び１ｍＭのＩＰＴＧを含む加温した２ x LB中に入れて５０倍に希釈した。１時間、３７℃で成長させた後、培養物にカ ナマイシンを加えてヘルパーバクテリオファージに感染した細胞を選択した。細 胞培養物を一晩成長させ、その次の日に、２段階のＰＥＧ沈殿を行ってからバク テリオファージを精製した。大量の残留物をサンプルから除去するために、精製 したバクテリオファージ調製物を、０．２ミクロンのフィルタにかけた。さらに 、１００セントリコン・メンブレン（centricon membrane）（１００ｍｗカット オフ）を用いて１％ＦＢＳ／ＰＢＳ中でサンプルを洗浄し、残留ＰＥＧをバクテ リオファージ調製物から除去した。バクテリオファージの力価は、プレート上で 成長するコロニーをカウントして決定した。この力価の決定は、バクテリオファ ージを１０倍に連続希釈し、希釈したサンプルと感染力に優れたＸＬ１−Ｂ細胞 とを混合し、アンピシリンを含む２xＬＢ寒天上に該混合物を載せて行った。バ クテリオファージの力価は、約１０10〜１０14ｃｆｕ／ｃｅｌｌの範囲内であっ た。 ２回目のＰＥＧ沈殿後、バクテリオファージを、０．２ミクロンのフィルタに かけて不要な粒子及びバクテリアを取り除いくことで殺菌した。フィルタにかけ た調製物は、その後、セントリコン１００（１００ｍｗカットオフ）フィルタを 用いて厳密に洗浄し、バクテリオファージを濃縮し、バッファを１％ＦＢＳ／Ｐ ＢＳに交換した。 実施例１５−バクテリオファージライブラリのキャラクタリゼーション Ａ）ＥＬＩＳＡ検定 ＴＣＲ特異的ＥＬＩＳＡ検定を行って、バクテリオファージ表面にディスプレ イされたＴＣＲ分子を分析した。要約すれば、９６穴プレートを、コーティング バッファ（ｐＨ９．０）中のneutrAvidin（Pierce）、２００ｎｇ／ｗｅｌｌ量 によりコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、５％無脂 肪乾燥ミルク（ＮＦＤＭ）により１時間ブロック後、抗−α，βＴＣＲ（Ｈ５７ ）ビオチンラベル（標識）抗体あるいは抗−Ｖ−β８．２（ＭＲ５−２）ビオチ ンラベル抗体を、２．５％ＮＦＤＭを含んだ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０） 中に希釈した。そして、希釈した抗体をそれぞれウェルに加え、１時間、室温で インキュベートした。プレートを、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．５％）（ＴＢＳＴ ）中で６回洗浄し、該プレートに結合していない抗体を除去した。 バクテリオファージ上で発現した融合タンパク質の検出は、抗体コーティング したウェル中で、１時間、室温条件下でバクテリオファージ粒子をインキュベー トすることによって行った。プレートをＴＢＳＴで６回洗浄した後、２．５％Ｎ ＦＤＭ中に希釈した抗−Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート（Pharmacia）を加えた 。１時間インキュベートした後、プレートをＴＢＳＴで８回洗浄した。１００μ ｌのＴＭＢ基質を各ウェルに加え、１０分後、１Ｍ硫酸１００μｌを加えて反応 を停止した。そして、プレートの４５０ｎｍでの吸光度を読み取った（図１７） 。また、コントロールバクテリオファージ（ＣＡIII遺伝子III抗体ライブラリか ら調製）に対し、抗体Ｈ５７及び抗体ＭＲ５−２への非特異的結合試験を行った 。さらなるコントロールとして、ｗ／ＢＳＡあるいは抗−Ｖ−β１７をコーティ ングしたウェルに対する非特異的結合検定も行った。 図１７及び１８に示すのは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の、非誘導状態（即ち 抑制解除状態）及び誘導状態におけるＥＬＩＳＡ分析の結果である。図１７はｐ ＫＣ４６から生成したｓｃＴＣＲ融合タンパク質の分析結果、図１８はｐＫＣ５ １から生成した融合タンパク質の分析結果を示す。各図において、黒塗りのバー は非誘導状態での培養物を示し、より明るい色のバーは誘導状態での培養物を示 す。図１７及び１８から分かることは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質がバクテリオ ファージ・ライブラリで発現され、バクテリオファージの表面にディスプレイさ れたということである。４５０ｎｍでの吸光度を比較すると、誘導によりｓｃＴ ＣＲ融合タンパク質を発現しているバクテリオファージ調製物は、非誘導のバク テリオファージ調製物の約６０−２００倍大きかった（図１８）。ＥＬＩＳＡ検 定によって検出されたレベルを比較すると、遺伝子VIIIｓｃＴＣＲ融合タンパク 質をディスプレイするバクテリオファージは、遺伝子IIIｓｃＴＣＲ融合物をデ ィスプレイするバクテリオファージの約２００−５００倍高かった（図１７）。 この結果から、ＴＣＲ／遺伝子VIIIバクテリオファージは、多数のｓｃＴＣＲ融 合タンパク質をバクテリオファージ表面に発現していると考えられる。ｓｃＴＣ Ｒ融合タンパク質のバクテリオファージ・ディスプレイの多価性により、ＭＨＣ ／ペプチド複合体を捕捉する機会が増大する。これは、多価であるため結合活性 が強くなるからと理由づけられる。 Ｂ）バクテリオファージ・ライブラリにディスプレイされた融合タンパク質の 活性 バクテリオファージ上の融合タンパク質が生物学的に活性であることを実証す るために、ＤＯ１１．１０ ｓｃＴＣＲ／遺伝子・融合物をディスプレイするバ クテリオファージに対し、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞上のＴＣＲと固定化ｓｃＩＡ ｄ／ＯＶＡ分子との特異的相互作用の阻害能の分析を行った。ＤＯ１１．１０Ｔ 細胞系及び一本鎖ＭＨＣ分子を用いて上記のような相互作用を検出する模範的な 検定については、上述した通りである。 ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞ハイブリドーマ及びＩＡｄ／ＯＶＡの系は、上記実施 例８に示した方法にほぼ沿うように用い、バクテリオファージ上に発現したｓｃ ＴＣＲ（以下、ｓｃＴＣＲ／バクテリオファージ分子と呼ぶこともある）存在下 でのＩＬ−２レベルの低下を測定した。実験の結果、バクテリオファージ上で発 現したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、固定化ＩＡｄ／ＯＶＡと相互作用したこと が分かった。これは、ＩＬ−２レベルが、ｓｃＴＣＲ／バクテリオファージ分子 の入ったウェルにおいて低下したためである。これに対して、同じ力価のコント ロールバクテリオファージ（ｓｃＴＣＲをディスプレイしない）を加えてインキ ュベートしたウェルにおいては、阻害作用の低下は見られなかった。従って、バ クテリオファージ上で発現したｓｃＴＣＲ融合タンパク質は生物学的に活性であ る。 阻害作用の細かな特異性を試験するために、ＤＩ１１．１０とｇＤ１２ Ｔハ イブリドーマとの間で阻害レベルを比較する検定を行った。 実施例８にて述べたように、ｇＤ１２ Ｔ細胞ハイブリドーマは、ＩＡd制限 （ＩＡdrestricted）であるが、ＨＳＶ−１由来のペプチドを認識する。両細胞 ともＩＡ“により制限されたペプチドを認識するという点を考慮すると、バクテ リオファージ上で発現したＤＯ１１．１０由来のｓｃＴＣＲは、ＩＡd／ＨＳＶ −１分子と何らかの相互作用をする可能性があると考えられる。ただし、この相 互作用はＩＡd／ＯＶＡ ＭＨＣ／ペプチド分子との相互作用に比べてかなり弱 いものであると考えられる。図１９Ａに示すように、低レベルのＩＬ−２阻害が ｇＤ１２ Ｔ細胞ハイブリドーマグループには見られるものの、ＤＯ１１．１０ グループでのＩＬ−２阻害レベルは約８−１０倍高かった。図１９Ａにおいては 、約８〜２５０×１０10個のファージを各実験で用いた。ＣＡIIIとは、ｓｃＴ ＣＲ融合タンパク質をディスプレイしないコントロールファージを指す。図１９ Ｂに示すのは、関連実験の結果であり、その実験では、ＩＬ−２の産生がＤＯ１ １．１０ Ｔハイブリドーマ細胞から測定された。 Ｃ）融合タンパク質のバイオパニング（BioPanning） ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を呈示するバクテリオファージ・ディスプレイ・ラ イブラリを用いて、公知の方法に従って特異的ＴＣＲ分子を捕捉する（例えば、 McCafferty，J．et al．Nature（1990）348:352;Castagroli，L．et al．J．Mol ．Blol.（1991）222:301;Lebeddee，S．L．et al．PNAS（USA）(1992)，89:3175 ;Smith，G.P．and Scott，J.K．supra;Blake，J．et al．J．Exp．Med.（1996） 184:121参照）。従来の捕捉技術は一般に、標的抗原と抗体との相互作用の強さ に依存している。その強さは、典型的には１０-6〜１０-8の範囲内にある。しか しながら、ほとんどのＴＣＲ−ＭＨＣ／ペプチド相互作用は、典型的には５×１ ０-5Ｍの範囲であり、ＫＤ値とともに弱くなる。一般に、ｓｃＴＣＲ融合タンパ ク質とＭＨＣ／ペプチド複合体との結合活性(avidity)及び結合価は、ファージ 上に発現する融合タンパク質の数を増やすことによって増大させることがで きる。他に採用できる戦略としては、洗浄の厳密さを変える、抗原の量を増やす 、温度を下げて解離速度を小さくする、インキュベーション時間を長くするなど が挙げられる。 ｉ）抗体捕捉 ＤＯ１１．１０ ｓｃＴＣＲ融合タンパク質特異的抗体を用いて、ｓｃＴＣＲ 分子を捕捉した。要約すれば、複数のマイクロウェルに２００ｎgのneutrAvidin をコーティングした後、Ｃ−βドメイン、Ｖ−β８．２ドメイン、あるいはＶ− β１７を認識する非特異的抗体に結合するビオチンラベル抗体を加えてインキュ ベートした。非特異的結合に関しては、ＢＳＡをコーティングしたウェルを用い た場合について調べた。実験は、２×１０6個のＴＣＲ／遺伝子VIIIバクテリオ ファージ粒子を、無関係の抗体バクテリオファージバンク由来の１×１０11個の 粒子に希釈して行った。即ち、最終的には１：５０，０００の希釈を行った。抗 −ＴＣＲ抗体（Ｈ５７）あるいは抗−Ｖ−β８．２抗体（ＭＲ５−２）の両方に 対する集積（enrichment）を１ラウンド行ったところ、５０００倍の集積が見ら れた。一方、ＢＳＡネガティブコントロールでは、集積が特異的であることを示 唆するような陽性クローンは全く得られなかった。１ラウンドでの２０〜１００ ００倍の集積は、抗体抗原捕捉実験においてはまれではない。したがって、本実 験で見られた集積は、報告されている集積実験の許容範囲内にあることが分かる 。 ii）細胞捕捉(cell panning) 細胞捕捉は、細胞表面タンパク質に対する抗体の単離を行う方法として、従来 より定番である。この方法は、実施例１８にて作成したバクテリオファージ・ラ イブラリの中から、求める融合タンパク質をスクリーニングする際に容易に適用 できる。細胞捕捉に用いる細胞は、任意の適切な細胞源から得られる。例えば、 ＭＨＣ／ペプチド分子を発現する細胞、あるいは審査中のＵＳ出願シリアル番号 ０８／５９６，３８７に記載のような、適当なペプチドが結合可能な空のＭＨＣ 複合体を含む細胞である。さらに、一本鎖クラスＩＭＨＣ遺伝子、あるいは一本 鎖クラスIIＭＨＣ遺伝子によりトランスフェクトされてなる細胞であり、該細胞 中で適当なペプチドがＭＨＣ複合体に結合あるいは共有結合したものも利用でき る。適切な一本鎖クラスＩＭＨＣ／ペプチド複合体、あるいは一本鎖クラスIIＭ ＨＣ／ペプチド複合体を有する細胞の例は、以下の出願に記載されている。即ち 、公開ＰＣＴ国際出願番号published ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中 の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７ である。 一般に、適切なＭＨＣ複合体を発現する細胞を用いて捕捉すると、いくつかの 利点が得られる。即ち、そのような細胞の利用可能な供給量を増大できること、 時間のかかるＭＨＣ／ペプチド複合体の精製を行わずに済むことなどである。 細胞捕捉の方法の一例としては、以下の方法が挙げられる。即ち、エッペンド ルフチューブ（１．７ｍｌ）中で、約２×１０6個のＤＯ１１．１０バクテリオ ファージを含むトータル約１０11個のバクテリオファージを体積０．２ｍｌの１ ０6個の細胞と混合し、４℃で２時間インキュベートする。その後、５０００× ｇ、１０分間、４℃で遠心分離して細胞をペレット状にし、氷冷したＰＢＳ／ｔ ｗｅｅｎ（０．５％ｗ／ｖ）中で５回洗浄する。続いて、５０μｌ、ｐＨ５．０ のクエン酸バッファを加えて、細胞からバクテリオファージを溶離する。集積さ れたバクテリオファージは、大腸菌に感染させて一晩培養することにより、その 数を増大させることができる。その後、バクテリオファージを、例えば上記実施 例１４にて述べたような標準の手順で精製する。５ラウンドの集積の後、コロニ ーの中からランダムにサンプリングしたものを取出し、その遺伝子配列を解析す る。ＤＯ１１．１０ ＴＣＲ遺伝子の発見頻度により、さらなる集積が必要かど うかを決める。例えば、ＤＯ１１．１０ ＴＣＲ／バクテリオファージの開始時 の希釈割合が１：５００００であれば、５ラウンドの集積後にその発見頻度が増 大していることが予想される。このときの増大は、約１０００−２０００倍の範 囲にあることが予想される。 iii）ｓｃＭＨＣ／ペプチド複合体を用いた捕捉 可溶性ｓｃＭＨＣ／ペプチド複合体の生成は、例えば、昆虫細胞において、上 記の公開ＰＣＴ国際出願番号ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国特許出願シリ アル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７に記載の方法に従っ て行う。 昆虫細胞中で生産された可溶性ｓｃＭＨＣ／ペプチド分子を用いて、可溶性融 合タンパク質を発現するバクテリオファージを捕捉する。例えば、ある量のｓｃ ＩＡd／ＯＶＡ（例えば１−１０μｇ／ウェル）を用いて９６穴プレート（Ｎｕ ｎｃ）をコーティングする。続いて、２×１０6個のＤＯ１１．１０バクテリオ ファージを、トータルで１０11個のバクテリオファージに希釈し（１：５０００ ０）、固定化ＩＡd／ＯＶＡ共存下でインキュベートした。２時間インキュベー トした後、プレートをＴＢＳＴ中で５回洗浄する。結合したバクテリオファージ は、１００μｌの０．１Ｍ塩酸／グリシンを加えて溶離する。結合したＤＯ１１ ．１０ ＴＣＲ／バクテリオファージの頻度決定は次のようにして行う。即ち、 標準コロニーリフト（standard colony lifts）を行い、タンパク質標識に対す る抗体（例えば、上述の抗−ＥＥ標識抗体）、あるいはＤＮＡ特異的プローブを 用いて陽性なものをスクリーニングする。ＤＮＡ特異的プローブとしては、例え ばラベルされた３００ｂｐ α鎖ＤＮＡプローブかあり、Amershamから得られる 。タンパク質標識に対する抗体あるいはＤＮＡ特異的プローブはそれぞれ、ｓｃ ＴＣＲ遺伝子あるいはｓｃＴＣＲ遺伝子産生物を認識する。 実施例１６−融合タンパク質の蛍光利用細胞選別同定 蛍光利用細胞選別（Fluorescence Assisted Cell Sorting）（ＦＡＣＳ）は、 細胞の検出及び選別に用いる定番の方法である（例えば、Davey，H.M．and Kell ，D.B．in Microbiological Reviews（1996）60:641;and Darzynkiewca，Z．et al．（1994）in Flow Cytometry 2nd Ed.，Vols．41 and 42 Academic Press，N ew York参照）。ＦＡＣＳにより、細胞とｓｃＴＣＲ融合タンパク質をディスプ レイするバクテリオファージとの相互作用を検出する。ＦＡＣＳ実験を行うため に、ｓｃ−ＩＡd／ＯＶＡ複合体を発現する細胞を上述のようにして生成した。 ＩＡd特異的抗体ＡＳＭII−ＦＩＴＣ（Pharmingen）による染色を行い、細胞が ＩＡdを発現したことを確認した。ＯＶＡペプチドかＩＡdグルーブに存在するこ とを確かめるために、以下の出願に記載のように、Ｔ細胞活性検定を行う。即ち 、上述の公開ＰＣＴ国際出願番号published ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、 審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６， ３８７である。 様々な色素原を用いてＦＡＣＳ解析用のバクテリオファージをラベルできる。 １つのアプローチとしては、バクテリオファージにフィコエリトリン(phycoeryt hrin)などの適切な色素原を結合させる。別のアプローチとしては、Flurotag FI TC複合キット（Sigma，St．Louis，MO）に示されているような公知の方法に従っ て、バクテリオファージにＦＩＴＣを結合させる。また別のアプローチとしては 、フィコエリトリンとバクテリオファージとを間接的に結合させる。即ち、まず バクテリオファージをビオチニル化（biotinylating）し、それにstrepavidn− フィコエリトリンを結合させる。さらに別のアプローチとしては、異なるフルオ レセイン標識を有するような２つの抗体アプローチを用いる。具体的には、一方 の抗−バクテリオファージ抗体をＦＩＴＣでラベルし、ｓｃＴＣＲに対する２つ めの抗体（例えばＨ５７）をフィコエリトリンでラベルする。 バクテリオファージ結合方法としては、例えば次のようなものがある。即ち、 １０12ｃｆｕのｐＫＣ５１ファージをバッファ交換して０．１Ｍ炭酸ナトリウム バッファ（０．２ｍｌ、ｐＨ９．０から９．５）に入れる。Flurotag FITC複合 キットを用いて、ＦＩＴＣの入ったバイアルに０．１Ｍ炭酸−重炭酸溶液１ｍｌ を混合し、すべてのＦＩＴＣが溶解するまで攪拌する。ＦＩＴＣラベル約５０μ ｌをバクテリオファージ調製物に加え、ＦＩＴＣのファージに対する最終比率を ４０対１とし、フルオレセイン／タンパク質（Ｆ／Ｐ）モル比を適切なものにす る。そして、サンプルをチューブに入れ、アルミホイルで覆って２時間インキュ ベートする。ラベルされたバクテリオファージは、サンプルをG-25 ephandexカ ラムにかけることによって単離する。典型的には、ラベルされたバクテリオファ ージは主画分（例えば画分６〜８）に含まれる。Ｆ／Ｐモル比は、その後、分光 光度計を用いて２８０ｎｍ及び４９５ｎｍでの吸光度を読み取って決定する。Ｆ ／Ｐモル比を決定するのに用いる式は次のようなものである。 MolarF/P=2.77×A495/A280（0.35×A495） 複合サンプルの吸光度の読み取り値は、０．３から１．０の間に適切におさま るべきである。 ＦＩＴＣラベルされたファージは、従来のＦＡＣＳ方法に従って、ｓｃ−ＩＡd ／ＯＶＡ複合体を発現する細胞を添加してインキュベートする。これにより、 細胞に結合するバクテリオファージを検出する。結合したバクテリオファージを 細胞から溶離し、標準的方法に従って増殖させる。 実施例１７−バクテリオファージｆ８８におけるｓｃＴＣＲ融合タンパク質の クローニング及び発現 上述の捕捉方法で用いているのは、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をデイスプレイ させるために、野生型繊維状(filamentous)バクテリオファージ（即ち、ＶＣＭ Ｓ１３）をさらにに感染させた、ファージミド形質転換細胞(phagemid-transfor med cell)を用いるものである。この方法は、次のようにすれば改善できる。即 ち、組換えｓｃＴＣＲ構築物をより効率よく包含（パッケージング）可能なバク テリオファージベクターを用いればよい（これにより、ビリオン全体数当たりの 組換え分子の収率が上がる）。例えば、バクテリオファージｆ８８−４は、８８ 型ベクター（９２７３塩基対）で、遺伝子VIII遺伝子を２つ含む。そのうち一方 は野生型で、他方は組換え遺伝子をディスプレイする（即ち、遺伝子VIII遺伝子 融合体）。バクテリオファージｆ８８−４は、ワシントン大学のG.Smith博士か ら得られる。バクテリオファージｆ８８−４は、遺伝子VIII構築物のパッケージ ングを効率よく行うので、収率が最大１０％向上する。この収率の向上は、組換 えビリオンの多重度（即ち、ビリオン全体数当たりの組換え分子の数）が増加す るためであると考えられている。この収率の向上により、１個のビリオン当たり 約３００個のｓｃＴＣＲ融合タンパク質が構築されると考えられる。従って、ｆ ８８−４バクテリオファージは、収率と多重度を増加させ、標的への結合活性を 向上させ、その結果、特異的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質の単離率を増大させる 。 ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を含む組換えバクテリオファージの構築は、ｆ８８ −４バクテリオファージのＰｓｔＩ部位及びＨｉｎｄIII部位にｓｃＴＣＲ遺伝 子をクローニングすることによって行った。導入されたｓｃＴＣＲ遺伝子の発現 は、従って、ｔａｃプロモーターの制御下で行われ、その誘導は１ｍＭのＩＰＴ Ｇ添加後に起こる。 図２０に概略的に示すのは、いくつかの組換えバクテリオファージベクターで あって、ｆ８８−４バクテリオファージ（ｐＫＣ７０、ｐＫＣ７１、及びｐＫＣ ７２）を用いて生成したものである。 実施例１８−ＨＩＶ感染細胞からのｓｃＴＣＲバクテリオファージ・ライブラ リの構築 ＨＩＶ感染患者のＣＴＬ由来の、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をディスプレイす るバクテリオファージ・ライブラリを、ここで述べる方法により作成する。ＨＩ Ｖ感染患者としては、長期非進行であると診断あるいは類別されている患者（即 ち、ＬＴＮＰ）を対象とする。こういったＨＩＶ感染患者は、ｇａｇやｐｏｌ等 の様々なＨＩＶウイルス抗原に対するＣＴＬ応答の、研究対象とされてきた。こ のような患者からのＣＴＬプロファイルは、典型的には、ＡＩＤＳになりやすい 患者に比べて、ＨＩＶ抗原に対して強い免疫活性を示す（Miedema，F．and Klei n,M.R．Science（1996）272，505を主に参照）。 ＣＴＬ応答に関わるＴＣＲを同定し、対応する融合タンパク質を構築するため に、クラスＩ ＨＬＡ−Ａ２制限ヒトＴＣＲライブラリをＴ細胞から作成する。 このＴ細胞は、上述の実施例で述べた方法によりＬＴＮＰ患者から単離する。 いくつかの方法によりクラスＩ ＨＬＡ−Ａ２制限バクテリオファージ・ライ ブラリを調製できる。例えば、１０7個のＴ細胞を、３人のＨＬＡ−Ａ２ ＬＴ ＮＰ患者から、上記のようにして単離し、プールする（Altman，J.D．et al．Sc ience（1996）274:94参照）。メッセンジャーＲＮＡを、これらの細胞、及び標 準的手順で得たｃＤＮＡから精製する。標準的手順とは、ヒトのＣ−αＴＣＲ及 びＣ−βＴＣＲに対応のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるなどの方法であ る。模範的なプライマーを図２２（SEQ ID NOs.:116-128）及び図２３（SEQ ID NOs.:101-115）に示す。具体的には、Ｖ−α遺伝子は、１２個のフォワードプラ イマー（図２２SEQ ID NO．116-127）、及びＣ−α遺伝子配列の５’末端にハイ ブリダイズする１つのバックプライマー（SEQ ID NO.:128）を用いてＰＣＲ法に より増幅される。β鎖は、Ｖ−β鎖の５’末端にハイブリダイズする１３個のフ ォワードプライマー（図２３，SEQ ID N0s:101-113）、及びβ不変領域中３７８ 塩基に置かれた２つのバックプライマー（図２３ SEQ ID N0s:114，115）を用い てＰＣＲ法により増幅される。ＰＣＲ法による増幅は標準の方法に従って行う。 ＰＣＲ法により増幅されたＤＮＡは、例えば、実施例１４に記載のＤＮＡベク ターのような、バクテリオファージ外殻タンパク質あるいはそのフラグメントを 発現する適切なＤＮＡベクターに導入される。詳しくは、実施例２で述べたｐＫ Ｃ４５ ＤＮＡベクターを用いて、Ｖ−α鎖をベクターのＳｆｉＩ部位及びＳｐ ｅＩ部位にサブクローニングし、Ｖ−β／Ｃ−β鎖をベクターのＸｍａＩ部位に クローニングする。そして、ｓｃＴＣＲバクテリオファージ融合タンパク質をエ ンコードする適切なベクターを上述の実施例に従って生成する。あるいは、Ｖ− α鎖及びＶ−β／Ｃ−β鎖を、例えば挿入可能なＨｉｎｄIII−ＰＳＴＩフラグ メントとして、ｆ−８８バクテリオファージベクターに（実施例１７参照）サブ クローニングする。このようにして生産された組換えバクテリオファージを適切 な宿主細胞に感染させ、上述の実施例に従って該組換えバクテリオファージを増 殖させスクリーニングする。 場合によっては、標準的な組換え技術に従ってｆ８８バクテリオファージのク ローニング部位を修飾し、例えば適切なリンカー配列を組み込むことによって、 特定のフラグメント（例えばＳｆｉＩ−ＸｍａＩフラグメント）のクローニング を可能にすることも望ましい。このような修飾を実現するには、例えば、適切な 制限部位プライマーをバクテリオファージのＨｉｎｄIII部位及びＰｓｔＩ部位 にアニーリングする。このようにして生産したバクテリオファージ・ディスプレ イ・ライブラリを、標準の手順に従って増殖させ、保管する。 実施例１９−ＨＩＶ感染細胞由来のバクテリオファージ・ディスプレイ・ライ ブラリのスクリーニング 実施例１８にて生産した組換えバクテリオファージ・ライブラリは、選択可能 ないくつかのアプローチによってスクリーニングできる。例えば、ライブラリは 、検出可能にラベルした様々なプローブを用いてスクリーニングできる。プロー ブの例としては、完全（非活性化された）ＨＩＶウィルス、ＨＩＶタンパク質、 中でもＨＩＶ外殻タンパク質、及びＭＨＣ／ＨＬＡ複合体としてＨＩＶペプチド を発現しているＡＰＣが挙げられる。また、スクリーニングは、イン・ビボにお いてＨＩＶウイルスに対する免疫応答を剌激することが知られているＨＩＶ外殻 タンパク質のペプチドエピトープを用いて行うことができる。そのようなペプチ ドエピトープに関しては、いくつかの例が知られており、ＨＩＶ ｇｐ１２０、 ｇｐ４１、ｇｐ１６０、ｇａｇ及びｐｏｌ外殻タンパク質から単離されたペプチ ドがこれに含まれる。 ａ）ＨＩＶ ｇｐ１２０外殻タンパク質を用いたスクリーニング ｇｐ１２０タンパク質のＶ３ループ由来のペプチドエピトープを用いて、バク テリオファージ・ライブラリをスクリーニングする。典型的なペプチドとしては 、ＨＩＶ ｇｐ１２０タンパク質のＴ１（アミノ酸４２８−４４３）ペプチド及 びＴ２（アミノ酸１１２−１２４）ペプチドが挙げられる。ｇｐ１２０Ｖ３ルー プ由来のペプチドエピトープは、ＨＩＶ中和抗体を誘導可能なものの一種である （Berzofsky，J.A．et al．(1991)FASEB J．5:2412;Ahlers，J.D．et al，(1993 )J．Immunology 150:5647参照）。バクテリオファージ・ライブラリからのｓｃ ＴＣＲ融合タンパク質のスクリーニングに利用できるペプチドエピトープの他の 例としては、Karzon，D.T．et al．and Hart，J.K．et al．も参照のこと（Karz on，D.T．et al.(1992)Vaccine 14:1039;Hart，J.K et al．PNAS（USA）(1991)8 8:9448）。 Ｂ．ＨＩＶ外殻タンパク質を発現するＡＰＣを用いたバイオパニング 上記実施例１８にて構築したｓｃＴＣＲライブラリから、例えば、ＨＩＶ ｇ ａｇあるいはｐｏｌタンパク質から得られる、免疫原性ＨＩＶペプチドに結合す るｓｃＴＣＲ融合タンパク質を捕捉することができる。このＨＩＶ外殻タンパク 質は、一本鎖ＨＬＡ−Ａ２分子を発現する細胞と関連して存在している。一本鎖 ＨＬＡ−Ａ２分子は、Garboczl，D.N．et al．PNAS（USA）(1992)89:3429の記載 にしたがって生成する。一本鎖ＨＬＡ−Ａ２分子を発現する細胞は、公知の方法 （Altman，J.D．et al.,supra）に従って生成する。 バイオパニングは、いくつかの方法により実現できる。例えば、一つの方法と して、ＭＨＣ／ペプチド標的を２つの異なる様式で提示する。すなわち、捕捉の 第一段階では、ＨＬＡ−Ａ２を発現するトランスフェクション細胞を用いると共 に、ｇａｇあるいはｐｏ１ペプチドを標的抗原として用いる。捕捉は、実施例１ ８にて述べたバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリ由来の約１０11個 のバクテリオファージを用いて行う。そして、バクテリオファージ・ライブラリ に、ＨＬＡ−Ａ２を提示する細胞、及びｇａｇあるいはｐｏ１ペプチドを接触さ せる。バクテリオファージを、トランスフェクション体約１０6個の共存下で２ 時間、４℃でインキュベートし、２％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で２回洗浄し、０．１Ｍ クエン酸バッファ（ｐＨ５．０）１００μｌ中に溶離させた後、０．１ＭＴｒｉ ｓ（ｐＨ８．０）１０μｌで中和する。溶離されたバクテリオファージは、大腸 菌系統Ｋ９１ｋａｎなどの適切な宿主に感染させて増殖させ、バクテリオファー ジを一晩成長させる。バクテリオファージ粒子は標準的方法により精製する。 細胞、または、適切なＭＨＣ／抗原を保持する固形支持体に対する捕捉作業を 繰り返し行うことにより、細胞捕捉実験で同定されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質 を有するバクテリオファージの純度を向上することができる。例えば、細胞捕捉 法により単離されたバクテリオファージを、一本鎖ＨＬＡ−Ａ２及びペプチドを コーティングした固形支持体（例えば、マイクロディッシュ）に対する捕捉作業 に供して精製する。２時間インキュベートした後、ウェルを、０．３ｍｌのＰＢ Ｓ／０．２％Ｔｗｅｅｎで約８回洗浄して、非特異的なバクテリオファージを除 去する。結合したバクテリオファージは、０．１ｍｌの０．１Ｍ塩酸（グリシン 中、ｐＨ３．０）に溶離され、１０μｌの２ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）で中和さ れる。さらなる捕捉は、細胞及び固定化ＭＨＣ／ＨＬＡペプチド分子のうち、使 用するものを一方から他方に変更して行う。捕捉を約５、６回行うことにより、 ｓｃＴＣＲをディスプレイするバクテリオファージ調製物が、十分に高い純度で 得られる。続いて、ＤＮＡをバクテリオファージから単離し、バクテリオファー ジ内にエンコードされたｓｃＴＣＲのα可変領域及びβ可変領域のＤＮＡ配列を 決定する。予想されることは、αあるいはβ可変領域の使用頻度に偏りあるいは 集積（bias or enrichment）が見られれば、バクテリオファージ・ディスプレイ ・ライブラリ中のｓｃＴＣＲとＭＨＣ／ペプチド抗原との間で生産的相互作用が 行われたことを示すということである。 検出可能にラベルされたプローブを用いると、バクテリオファージ・ライブラ リから所望の組替えバクテリオファージを集積することができる。例えば、プロ ーブがｇｐ１２０Ｖ３ループ由来のペプチドエピトープである場合、そのペプチ ドに特異的に結合する組換えバクテリオファージを単離できる。典型的には、い くつかの集積過程を経るが、この集積過程のステップ数を左右する因子はいくつ かある。例えば、ライブラリ中での、求める組換えバクテリオファージの呈示状 態や、検出可能にラベルされたプローブの結合活性かその因子である。組換えバ クテリオファージ由来のＤＮＡは、標準的手段により単離する。ｓｃＴＣＲ融合 タンパク質をエンコードするＤＮＡは、標準的方法に従ってその配列が解析され る。いくつかの単離された組換えバクテリオファージのＤＮＡ配列を解析すると 、検出可能にラベルされたプローブと組換えバクテリオファージによりエンコー ドされたｓｃＴＣＲ融合タンパク質との特異的結合が示される。 高頻度クローンは、上述のｐＫＣ６０及びｐＫＣ６２ベクターといった適切な ベクターにおいて、可溶性で十分に機能的なｓｃＴＣＲ融合タンパク質として発 現される。そして、発現された融合タンパク質は、標準的方法に従って、上記の Ｈ５７モノクローナル抗体を用いた免疫アフィニティークロマトグラフィーによ り必要に応じて個々に精製される。 実施例２０−抗−ＨＩＶ捕捉により検出されたｓｃＴＣＲ融合タンパク質のキ ャラクタリゼーション いくつかの選択可能な方法により、上記のように検出された組換えバクテリオ ファージとＨＩＶ抗原との特異的結合を評価する。 Ａ）バイオコア分析（Biocore Analysis） ＨＩＶペプチドを用いて、実施例１８にて述べたバクテリオファージ・ライブ ラリに対するスクリーニングを行う場合、該ペブチドを用いて以下の出願に記載 の方法に従ってｓｃＭＨＣクラスＩ分子を生成する。以下の出願とは即ち、公開 ＰＣＴ国際出願番号published ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米国 特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７である 。好ましくは、該ペプチドをｓｃＭＨＣクラスＩ分子に共有結合させる。そして 、ここで得たｓｃＭＨＣクラスＩペプチド複合体を用いて、実施例７及び以下の 実施例２０に記載のように、バイオコア分析のチップをコーティングする。より 具体的には、ｇａｇあるいはｐｏ１抗原（Altman，J.D．et al．supra参照）と 結合した一本鎖ＨＬＡ−Ａ２分子を、アミン反応性部位を介してバイオセンサチ ップに共有結合させる。そして、該チップにｓｃＴＣＲ融合タンパク質を含むサ ンプルを接触させる。すると、上記のように、特異的結合かチップ上で検出され る（Seth，A．et al．Nature（1994）369:324;Matsui，K．et al．PNAS（USA） （1994）91:12862も参照のこと）。ほとんどのｓｃＴＣＲ融合タンパク質の相互 作用か１０-5〜１０-7Ｍの範囲内にあることが予想される。 ｓｃＭＨＣクラスＩペプチド複合体とｓｃＴＣＲ融合タンパク質との特異的結 合が検出された場合は、特異的なｓｃＴＣＲ−ペプチド結合複合体が存在するこ とを示している。 単離された各ｓｃＴＣＲ融合タンパク質について結合係数を決定することによ り、細胞に結合して細胞死を引き起こすレセプターの有効度を容易に予測するこ とができる。 Ｂ）ｓｃＴＣＲ融合タンパク質４量体への結合 ｓｃＴＣＲ融合タンパク質とＨＩＶぺプチドとの特異的結合の検出は、ｓｃＴ ＣＲ融合タンパク質４量体との結合検定を上記の実施例（実施例９参照）に従っ て行うことによっても可能である。４量体のｓｃＴＣＲ融合タンパク質は、融合 物をエンコードするＤＮＡを、Ｂｉｒ Ａ−依存ビオチニル化部位（Bir A-depe ndent biotinylation site）を有する適切なＤＮＡベクターに挿入することによ っても生成できる（Schatz，P.J．Biotechnology（1993）11:1138参照）。ｓｃ ＴＣＲ融合タンパク質に対し、アビジン−フィコエリトリンを標準の方法に従っ て加えることで修飾を施し、４量体のｓｃＴＣＲ融合タンパク質を生成すること もできる。ＨＩＶペプチドをディスプレイするべくトランスフェクションされた 細胞は、上記の方法、及び以下の出願に記載の方法に従って調製する。即ち、公 開ＰＣＴ国際出願番号published ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１６、審査中の米 国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６，３８７であ る。トランスフェクションされた細胞を用いれば、ライブラリに対するスクリー ニングを行うことができる。また、トランスフェクションされた細胞に対して、 ラベルされたｓｃＴＣＲ融合タンパク質４量体を用いて染色し(stain)、細胞へ の特異的結合の検出を行うこともできる。ＦＡＣＳ分析で検出されるより強力な 結合は、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質とＭＨＣクラスＩペプチド複合体との特異的 相互作用の指標となる。 上記実施例１９において単離したｓｃＴＣＲ融合タンパク質に対し、結合アフ ィニティー及び活性の試験を行って、該ｓｃＴＣＲ融合タンパク質がＭＨＣ／ペ プチド複合体に特異的に結合するか否かを決定する。この適切な検定は、上記の 実施例において述べたようなものである。 Ｃ．ＦＡＣＳ分析 ＦＡＣＳを行うことにより、ｓｃＴＣＲ融合タンパク質と上記実施例１６にて 述べた標的細胞との相互作用を検出することができる。例えば、ｓｃＴＣＲ融合 タンパク質を標準の方法に従ってビオチニル化し、続いて、strepavidin−フィ コエリトリンと結合させることでラベルしたｓｃＴＣＲ４量体を形成する。ＦＡ ＣＳにより、ｓｃＴＣＲとＡ２０細胞や腫瘍細胞系などの適当な標的細胞との相 互作用を定量的に測定する。あるいは、実施例１６のｓｃＴＣＲ融合タンパク質 を、適切な固形支持体（例えばラテックスビーズ）に結合させ、ｓｃＴＣＲを複 数ディスプレイさせることも可能である。これに関連の方法を用いて、４量体の クラスＩＭＨＣ／ペプチド分子が生産されている（例えば、Altman，J.D．et al ．supra参照）。 Ｄ．ｇＤ１２Ｔハイブリドーマ細胞におけるＩ１−発現 ｇＤ１２Ｔハイブリドーマ細胞の活性は、審査中の米国特許出願シリアル番号 ０８／５９６，３８７に記載のように、ＩＬ−２活性を測定することで容易に検 定することができる。この検定により、実施例１６において生産されたｓｃＴＣ Ｒ融合タンパク質の機能を検定することができる。例えば、ｇＤ１２Ｔハイブリ ドーマ細胞に対し、上述の方法に従って実施例で産生したｓｃＴＣＲ分子をエン コードするＤＮＡのトランスフェクションを行う。ＦＡＣＳ染色は、実施例１６ にて述べたように行い、細胞表面におけるｓｃＴＣＲレセプターの発現を検出す る。レセプター陽性クローンは、以下の出願に記載済のＩＬ−２活性検定に用い る。以下の出願とは即ち、公開されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０ ９８１６、米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９６ ，３８７である。ｓｃＴＣＲレセプターが活性である場合（即ち、ｓｃＴＣＲレ セプターがＭＨＣ／ペプチド標的に特異的に結合する場合）、ｇＤ１２細胞から のＩ１−２産生は、容易に検出及び測定できる。 実施例２１−クラスII制限ＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する自己免疫タンパ ク質融合物の単離 本実施例の方法により、自己免疫タンパク質及びペプチドに特異的に結合する ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を単離することができる。例えば、Ｔ細胞を、ＤＲ− ２＋の個体で、かつ、多発性硬化症であると診断された個体から、従来の方法に 従って単離することができる。該Ｔ細胞からＴＣＲ ＤＮＡを得る。そして、得 られたＴＣＲ ＤＮＡを用いて、上記実施例にて述べた方法に従いｓｃＴＣＲ融 合タンパク質を構築する。バクテリオファージ・ディスプレイライブラリを、上 記の実施例１４〜１５に従って、作成し、試験をおこなう。 バクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリは、多発性硬化症のＤＲ−２ ＋患者数人から１０7個のＴ細胞を単離することによって作成する。Ｔ細胞ｍＲ ＮＡを精製し、ｃＤＮＡを上記実施例１に述べたように生成する。ＴＣＲのＶ− α及びＶ−β／Ｃ−β鎖のＰＣＲ法による増幅を、実施例１と同じプライマーを 用いて行う。Ｖ−α及びＶ−β／Ｃ−β鎖は、適切なバクテリオファージ・ディ スプレイ・ベクターのクローニング部位にクローニングする。適切なバクテリオ ファージ・ディスプレイ・ベクターのクローニング部位とは、例えば、実施例１ ７にて述べたｆ８８−４バクテリオファージ・ベクターＤＮＡの、ＳｆｉＩ−Ｓ ｐｅＩ部位、及びＸｈｏＩ−ＸｍａＩ部位である。ライブラリは、特異的抗原標 的を捕捉する標準的方法に従って、増殖させ、保管する。 一本鎖ＤＲ−２分子を、上述及び以下の出願に記載の方法に概ね従って作成す る。以下の出願とは即ち、公開ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９８１ ６、審査中の米国特許出願シリアル番号０８／３８２，４５４、及び０８／５９ ６，３８７、Rhode，P．et al．J．of Mol．Immunology，(1996)32，555である 。具体的には、ＨＬＡ−ＤＲ２分子を、ＨＬＡ−ＤＲ２分子を提示するＥＢＶ形 質転換リンパ球芽細胞から精製する。簡潔に説明すれば、ＨＬＡ−ＤＲ２分子を 、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むバッファに細胞を溶解させ、標準の免疫アフィ ニティークロマトグラフィーにより精製する。そして、細胞ライゼートを抗体− セファロースカラムにかける。ＤＲ２を結合させ、これを０．０５％ Ｎ−ドデ シルＢ−Ｄ−マルトシド界面活性剤（N-dodecyl-B-D-maltoside detergent）を 含むリン酸バッファ（ｐＨ１１．３）中で溶離させる。得られた画分を直ちに１ Ｍ酢酸により中和し、これをＤＥＡＥイオン交換カラムを通すことにより、ＤＲ ２プールを０．５ＭのＮａＣｌを含むリン酸（ｐＨ８．０）中に収集する。タン パク質の画分に対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動、及び銀染色により、純 度の検定を行う。 バクテリオファージ・ライブラリは、いくつかの方法によりスクリーニングで きるが、特に、一本鎖ＤＲ−２分子をコーティングした固形支持体を用いて、上 記の方法に従って捕捉を行う方法が好適である。捕捉の方法としては、昆虫細胞 などの宿主において一本鎖DR−２分子を生成し、その一本鎖ＤＲ−２分子をマイ クロプレート壁などの固形支持体に固定化する。 さらに、バクテリオファージ・ライブラリを、ＤＲ−２分子によりトランスフ ェクションさせた細胞を用いて精製する（DeKrulf，J．et al．PNAS（USA）(199 5）92，3938参照）。ＤＲ−２タンパク質と特異的な結合をなすｓｃＴＣＲ融合 タンパク質を発現するバクテリオファージ粒子の集積を、上記の実施例に述べた 方法により行う。 発明の詳細な説明の項においてなした具体的な実施態様、または実施例は、あ くまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例に のみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と特許請求の範 囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Comprising a bacteriophage coat protein and a single-chain T cell receptor Fusion protein 1. Field of the invention   The present invention relates to a bacteriophage coat protein and a single-chain T cell receptor. Fusion proteins comprising, and methods of making and using the fusion proteins It is about. This fusion protein provides a binding molecule in vitro. Bacteriophage display library used for cleaning It is useful in various applications such as generation. 2. Background of the Invention   T cell response (response) is regulated by antigen binding to the T cell receptor (TCR). It is set. One type of TCR is composed of α and β chains, and has immunoglobulin variable (V) and And the constant (C) region are cell membrane bound heterodimers that are formed analogously. TCR Α chain contains a covalently linked V-α and C-α chain, while the β chain is shared by the C-β chain. It contains an attached V-β chain. V-α and V-β chains are major histocompatibility In the context of the child complex (MHC) (in humans, the HLA complex) Form pockets (capsules) or clefts (fissures) that can bind antigen. general For details, refer to Fundamental Immunology 3rd Ed., W. Paul Ed. Rsen Press LTD. See New York (1993).   TCR is considered to play an important role in the development and function of the immune system Have been. For example, TCR mediates cell attack, promotes B cell proliferation, Of various diseases such as, allergies, viral infections and autoimmune diseases The cause has already been reported. Therefore, research and medical There is a great deal of interest in developing TCR acquisition methods for venues.   Generally, it has not been easy to isolate large amounts of TCR. For example, most Although the TCR preparation method utilizes expression in E. coli, Inclusion bodies, which are illustrative of insoluble TCR molecules that fold into, are frequently formed. Obedience Thus, the above method requires the cumbersome steps of solubilization and protein refolding. The TCR can only be obtained after performing the steps and the above steps Significantly reduces CR production and adversely affects TCR stability and functionality .   Other approaches to obtaining TCRs have largely involved attempts to construct more soluble TCRs. Have been. For example, the TCR and the immunoglobulin constant region, Nositol binding sequences (phosphatidylinositol linkage sequences), CD3 chains, etc. It is fused with various polypeptide sequences. In many cases, the purpose is Is expressed on the cell surface, and more proteins are folded is there. Thereafter, the TCR fusion protein is separated from the cell surface to obtain the TCR . However, in the above method, the amount of soluble and functional TCR produced is limited. Even less. For example, Gregoire, C., et al. (1991) PNAS, 88, 8077; Matsui, K. , Et al. (1991) Science 254, 1788 (1991); Engel, I., et al. (1992) Science 2 56, 1318; Lin, A.Y. See, et al., (1990) Science 249, 677.   In another attempt, single-chain T cell receptors with fused V-α and V-β chains (That is, scTCR). Novotny, J, et al. PNAS (USA) C. and Pluckthun, A. , J. Mol. Biol. 242,655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993); and PCT WO 96/13593; Ward, E. S. et al. , J. Mol. Biol. 224,885, (1992); and Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. Please refer to 256, 859 (1996) .   However, many of the scTCR isolation methods rely on irregularly folded insoluble molecules. Is reported to generate. For example, in PCT application WO96 / 18105 Discloses a method for expressing scTCR in Escherichia coli. Now, to get the scTCR, you need to refold the troublesome protein A solubilization step is required and the production rate of scTCR is usually low. Ward, E., supra. S . et al. And Schlueter, C. above. J. Please refer to.   Several methods have been developed to increase the degree of scTCR purification. In the method, the cell surface Expression of the scTCR fusion protein on the surface or in the bacterial plasma space. You. For example, the scTCR fusion protein is composed of scTCR and C-β chain It is produced by fusing with a signal region (see WO96 / 18105). However, the generated scTCR fusion protein was not removed from the cell surface. Must be used and often folded irregularly, resulting in low production rates. Down. In another method for producing the scTCR fusion protein, maltose (maltose) is used. Focuses on fusion of the binding protein and its expression in the cytoplasmic space ( WO 96/13593). However, usually large amounts of scTCR fusion The tricky step of refolding proteins is needed to get protein It is said.   Interaction of molecules involved in the immune system in vitro and in vivo There has long been a great deal of interest in research on applications. The method of studying the interaction One was to provide molecules involved in the immune system in a convenient form. example For example, bacteriophage libraries screen binding molecules in vitro. Used to present antibodies and epitopes (antigenic determinants) for cleaning. Has been used. Smith, G. P. and Scott, J. K. Methods in Enzym. 217,228 (1993 ); Winter, G .; et al. Ann. Rev. Immunol. 12,433 (1994) and the like.   Therefore, the removal step and the step of refolding the protein must be performed. Large amounts of soluble scTCR fusion proteins with sufficient functionality It is desirable to have a method for achieving this. In addition, scTCR fusion proteins are Desirably, it will be provided in a form that allows for in vitro screening. Disclosure of the invention   The present invention relates to bacteriophage coat proteins (for example, gene III protein). ScTCR component covalently linked (ie, fused) to the protein or gene VIII protein) And scTCR fusion proteins comprising a chromosome. Bacteriopha Protein enhances the solubility of the scTCR fusion protein more than expected. Significantly enhance the production rate and functionality of the scTCR fusion protein . This scTCR fusion protein is sufficiently soluble and functional, Without the cumbersome steps of breaking down, removing, or refolding Isolated in quantity. The solubility and functionality of the scTCR fusion protein is To ( Hosts) Vectors that affect cell induction conditions and expression of fusion proteins Sequences (ribosome binding sequence, leader (induction) sequence, and promoter sequence) It can be further improved by optimizing. scTCR fusion proteins can be provided in various forms. And specifically binds to scTCR fusion proteins Display used to screen for binding molecules that bind ・ List libraries.   The fusion protein of the invention (hereinafter optionally scTCR fusion protein or (Referred to as a soluble fusion protein) is more soluble than expected. That is, s When cTCR is fused with bacteriophage coat protein, solubilization and Do not take off or perform the cumbersome steps of refolding the protein. It was discovered that a soluble fusion protein was produced. Formed in expressing cells Since only a few inclusion bodies are used, the production of a soluble scTCR fusion protein The rate is dramatically improved. In addition, the scTCR fusion protein has more than expected Has functionality. That is, the scTCR fusion protein is Specific binding molecules (antigens) or other Binds with ligand (ligand).   The scTCR fusion protein of the present invention has a flexible peptide linker sequence. Outside the bacteriophage, fused to the V-β chain covalently linked to the V-α chain via The shell protein or a fragment thereof.   Generally, a bacteriophage coat protein is a bacteriophage gene III protein or gene VIII protein. In the present invention, The teriophage coat protein is a coat protein having a full length or a suitable coat protein thereof. A fragment (see below). Bacteriophage coat protein or Preferred fragments include the scTCR in a bacteriophage, Presents cTCR as a fusion protein component forming the bacteriophage shell . Specific bacteriophage shell protein fragments and bacteriophages The method of including the image is described in detail below.   In addition, the scTCR fusion protein of the present invention usually has one fusion protein label. Cells that have the above (usually one or two) and coexist with the scTCR fusion protein Used in purifying the scTCR fusion protein from the components. Or even more Next, a specific degradation site (site) is added to the soluble fusion tag using the protein label. The scTCR molecule is degraded (separated) from the fusion protein by introducing it into the protein. Both are possible. Thus, using the scTCR fusion proteins of the invention, fusion Obtain a sufficiently soluble and functional scTCR molecule without protein It is possible to   The scTCR fusion proteins of the present invention provide many significant benefits. For example Conventionally, obtaining a scTCR fusion requires a lengthy preparation process. Solubilization and refolding of the protein if large quantities are to be produced. In many cases, it was necessary. On the other hand, the scTCR fusion protein of the present invention Easy isolation and purification without the need for steps The solubility, production rate, stability and functionality are sufficiently improved. The key here is the fusion tag. By using proteins, antigen-presenting cells (APCs) and superantigens and sc The interaction with the TCR will be easier to analyze. In addition, Although described in detail, a wide variety of fusions with respect to interactions with superantigens and APCs Proteins can now be provided.   The fusion protein of the present invention contains a sufficiently soluble and functional scTCR. No. Thus, the fusion protein interacts with the desired ligand. It can be used in combination with various expression systems that can be used for test.   This scTCR fusion protein is useful in various applications. For example A DNA fragment encoding the scTCR fusion protein of the present invention (fragment Can be used to generate bacteriophage display libraries. You. In contrast to libraries expressing scTCR fragments, Phage library expresses full-length scTCR as fusion protein I do. Therefore, using this bacteriophage library, scTCR, In particular, the analysis of the scTCR antigen binding pocket is facilitated. Therefore, the bacteria Large libraries include antigens, antibodies, small molecules, superantigens, MHC / HLA Useful for screening using various binding molecules such as peptide complexes. You. Importantly, the bacteriophage display library As it expresses a fusion protein with V-α and V-β chains, it is found in vivo A similar fusion protein is produced by the TCR performed.   In addition, the bacteriophage library contains scTCR fusion proteins Conversely, almost no binding occurs to form the maximum amount of specific binding complex with the binding molecule. The detection of binding molecules having weaker or weaker binding power is further enhanced. The bacteriophage The library uses biopanning techniques, such as cell panning. It is easy to apply to skinning and immune panning technology.   Construction and use of bacteriophage libraries   The bacteriophage library of the present invention is used to screen various binding molecules. Provided in the kit used for logging. In other words, the kit includes T cells and other objects One or more bacteriophage libraries generated from the cells to be Host cell strains (eg, E. coli strains) and kit instructions.   The scTCR fusion protein of the present invention is a polypeptide having sufficient solubility and functionality. Expressed as butide. Structure of bacteriophage display library When used as a scTCR, the gene III protein or the gene VII The scTCR is fused to the I protein or an appropriate fragment thereof. It is expressed as a capterid phage outer shell (capsid) component. In either form, s Contacting the cTCR fusion protein with an appropriate binding molecule to form a specific binding complex To achieve. The binding molecule can be detected by standard methods described below, and Can be purified).   scTCRs used to construct scTCR fusion proteins can be of various types. Generated from source. The source includes a commercially available TCR DNA sequence described below. Or biological sources such as immune cells from mammals, especially primates such as humans Is included.   This bacteriophage display library contains scTCR fusion proteins. It may be configured to present a cytoplasmic mutant. Usually, scTCR fusion tamper A protein mutant is a bacteriophage covalently linked to a scTCR mutant. Comprising a coat protein, or a suitable fragment thereof. The scTC Mutants can be used to enhance specific binding affinity for a desired binding molecule. Selectable according to the description. scTCR mutants and scTCR fusion proteins Methods for generating cytoplasmic mutants are described in detail below.   The present invention also provides a bacteriophage outer shell protein covalently linked to a scTCR. A soluble scTCR fusion protein containing the protein or an appropriate fragment thereof. Related to a DNA segment consisting of the coding sequence. Usually, the DNA segment As a DNA vector capable of expressing the fusion protein in a suitable host cell, Provided. The DNA segment comprises an operably linked promoter and And more soluble scTC under the host cell culture conditions described below. Express the R fusion protein.   Further, a method for isolating the soluble fusion protein of the present invention has been attempted. The In a method, a DN comprising a sequence encoding a soluble fusion protein. A vector is introduced into a suitable host cell (transformation or transfection) The host cells are cultured in medium under slow induction conditions. Usually, low-speed induction conditions Essential nutrients (amino acids, phosphates, etc.) are slowly extracted from the ground over several hours. Cell culture conditions that induce the expression of fusion protein-encoding sequences Point to. Usually, a DNA vector that can be induced under low-speed induction conditions is selected. And The resulting fusion protein is purified (if desired) and substantially pure A cTCR fusion protein is generated. As described in detail below, low-speed induction conditions Improves the production of soluble and fully functional scTCR fusion proteins You. Alternatively, the method described above may be performed using a DNA vector encoding a single-chain T cell receptor. This method is applicable when a soluble single-chain T cell receptor is expressed. It is also possible to purify it (if desired). Host cells include bacteria, insects, and Or a mammalian cell.   The scTCR fusion protein can be provided with one or more suitable protein labels (eg, 6XHis) to facilitate the purification of the fusion protein from cells. Sometimes it is better. Usually, cell culture media or cell extracts are combined with protein Contact the combined synthetic matrix. Alternatively or additionally, scTCR Can be used to separate scTCR from fusion protein One or more degradable protein labels, thereby providing a soluble and sufficient function A scTCR molecule having the property may be generated.   The present invention provides a sequence encoding the soluble scTCR fusion protein of the present invention. Also included is a method for isolating a DNA segment comprising Usually, the method Infect host cells with bacteriophage library Under conditions that allow bacteriophage to grow in the vesicles (eg, slow induction conditions) Culture the cells. Next, the binding molecule is bound to at least one bacteriophage. Under compatible conditions, infected cells are labeled with a desired binding molecule, preferably a detectable label. Contact with the bound binding molecule. Bacteriophage library screening Methods are known in the art and are described, for example, in Sambrook et al. Is described in The resulting specific binding complex is recognized, followed by , The bacteriophage carrying it is isolated and further purified (if desired) Is done. In this way, the scTCR fusion protein contained in the complex is The encoding DNA segment is isolated.   Label detectable labels on binding molecules, such as proteins, polypeptides, and nucleic acids Methods are known in the art and are described, for example, in Sambrook et al. And Ausu bel et al. Is described in   Furthermore, a method for improving the specific binding affinity of a desired scTCR is provided. Normal In the method, the scTCR is combined with a desired binding molecule (eg, an antigen or other ligand). ) Is determined and the appropriate host cell is subsequently fused to the fusion protein. Infected by bacteriophage libraries expressing cytoplasmic mutants. The infected cells are then combined with the desired binding molecule, preferably a detectable labeled binding component. After contact with the offspring to form a specific binding complex, the specific binding complex is recognized. You. Next, the DNA segment encoding the corresponding fusion protein mutant Is isolated by standard means. If desired, the DNA segment can be It may be subcloned into a DNA vector and propagated in host cells. The above method The scTCR mutants generated by E.I. The label is degraded and separated from the fusion protein. Next, sudden change of antigen and scTCR The specific binding affinity for the foreign substance is determined. Shows enhanced specific binding affinity ScTCR has greater specific binding affinity than scTCR protein It is easily identified as a scTCR mutant.   Undesired immune responses in mammals can occur in one way or in alternatives to that method. The present invention can be suppressed or eliminated by combining the above methods. Usually, the invention Supplies mammals with an effective amount of scTCR in a pharmaceutically acceptable formulation. Therapeutic methods for suppressing or eliminating an immune response (response) in a subject are provided. Usually scTC R is a pathogen associated with viral infection, autoimmune disease, transplant rejection, cancer, etc. Competes with one or more of the TCRs generated in sexual T cells for antigen It is possible to match. In particular, the specific binding parent for the antigen as compared to the corresponding TCR A highly compatible (eg, 2-10 fold) scTCR is used to suppress the desired immune response. Can be controlled or eliminated. Protein competition assays are available in the art. Is known and is used for screening for competitive activity of scTCR.   In addition, the present invention provides a purified sample of scTCR or scTCR fusion protein. Using standard immunization techniques (monoclonal or polyclonal) Includes methods for producing antibodies. Usually, scTCR is more soluble than the soluble fusion protein of the present invention. Since it is obtained, the production rate of scTCR is improved as compared with the conventional method. One antibody It can also be produced from an immunogenic peptide comprising the above scTCR epitope. is there. Antibodies such as those described above, especially monoclonal antibodies, are not It is useful in various applications, such as detecting pathogenic T cells in body samples. In addition, the anti Using the body to specifically target T cells and the phase of the antigen or MHC / HLA peptide complex Targeted T cells in vivo or in vitro by suppressing interactions May be significantly suppressed or inhibited. As is known, appropriate cytotoxicity When it is desirable to covalently bind an antibiotic or an antimetabolite to the antibody There is also.   Further, the present invention provides an effective amount of a scTCR (scTCR fusion protein of the present invention). Immunization of mammals, especially humans and other primates. It also relates to how to guide. Isolation of the scTCR is soluble and efficient according to the present invention. By obtaining scTCR from scTCR fusion protein having various functions, Will be The scTCR develops on the surface of T cells (ie, target T cells), Against TCR antigenic structures that perform pathogenic or undesired functions in the reaction It is used to confer immunity to a mammal. The T cells are in a biological sample, Recognition is achieved by various conventionally known methods. Next, the T cells were purified and described below. In accordance with the examples provided, it is analyzed whether a proliferative response is possible in vitro. The T cells that exhibit a proliferative response are established as a cultured cell line, and The DNA encoding the TCR is isolated by the method disclosed in Used to generate the corresponding scTCR fusion proteins, such as synthetic protein mutants. Used. The TCR antigen structure of interest is usually a chronotopic epitope (c lonotypic epitope), V-α or V-β family specific epitope (V-α or V-β family-specific epitope), conformational epito pe), linear epitopes, etc. For TCR antigen structure generated on the surface of T cells When the immunity is conferred, the activity of T cells is stopped, and the pathogenicity or absence of the T cells The desired effect is suppressed or eliminated. Usually, mammals are treated with an effective amount of the scTCR (the present invention). Isolated from the light scTCR fusion protein) by a pharmaceutically acceptable formulation When administered, the immunity is acquired, thereby allowing the host immune system to target T cells. Significantly reduce or eliminate.   Furthermore, a method for detecting a binding molecule (for example, an antigen) capable of specifically binding to the TCR is also disclosed. Attempted. Usually, the method is performed by in vitro screening, The bacteriophage library of the present invention is characterized in that the molecule Under the conditions that specifically bind to one bacteriophage, Incubate. ScTCR fusion tag presented by bacteriophage Specific binding complexes formed between the protein and the binding molecule are easily detected. You. Usually, the presence of the specific binding complex is encoded by the bacteriophage The presence of a binding molecule capable of specifically binding to the TCR corresponding to the scTCR Hinting. The selected bacteriophage is easily prepared by the method disclosed in the present invention. Grow and isolate DNA segment encoding scTCR fusion protein Is done.   Furthermore, the present invention relates to a binding molecule capable of inhibiting specific binding between an antigen and a TCR. Related to the detection method. The method comprises the steps of: And a fusion molecule under conditions that allow the formation of a specific binding complex with the fusion protein. This includes in vitro screening in which the cells are incubated at different temperatures. Other anti In response, under the same or similar incubation conditions, the fusion protein Incubate with antigen and binding molecule. Thereafter, in the presence of ligand and non- Interaction of the antigen with the fusion protein in the presence is determined by standard binding assays. Is analyzed. A ligand capable of inhibiting specific binding between an antigen and a TCR is defined as In the presence of ghand, the interaction of the fusion protein with the antigen is less frequently observed Refers to something. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   1A shows the pJRS149 vector, and FIG. 1B shows the pKC12 vector. is there.   Figure 2 shows the outline of the formation of the DNA vector encoding the fusion protein. It is a flowchart explaining.   FIG. 3 shows parts of the pKC44, pKC46, and pKC51 DNA vectors. FIG.   FIG. 4 shows pKC45, pKC46 (pSUN18), and pKC51 DN It is a flowchart explaining the outline of A vector formation.   FIG. 5 is a diagram showing a PEN2 DNA vector.   FIG. 6A shows one of the pKC61, pKC63, and pKC65 DNA vectors. FIG. 6B shows pKC60, pKC62 (pSUN19) and pKC60. FIG. 2 shows a part of a C64, pKC66, and pKC67 DNA vector. .   FIG. 7 shows fusions from pKC60 and pKC46 DNA vectors, respectively. 4 is a western blot comparing the synthesis of synthetic proteins.   FIG. 8 shows MM294, K91Kan, XL1-B, TB-1, and UT-5. Wester showing soluble scTCR fusion protein expression in 600 cell lines This is a blot.   FIG. 9 shows the scTCR fusion comprising the bacteriophage gene VIII protein. FIG. 3 is a diagram showing an outline of immunoaffinity purification of a synthetic protein.   FIG. 10 shows the DNA vectors pKC51 and pKC46, and their purified plasmids. Western blot showing expression of fusion protein from fractions is there.   FIG. 11 shows a purified scTCR fusion protein derived from the pKC51 vector. -SDS-PAGE gel after staining with Masie Blue.   FIG. 12 is a cross-sectional view of the purified scTCR fusion protein derived from the pKC51 vector. This is a Tan blot.   FIG. 13 shows immunization with scTCR fusion proteins pKC60 and pKC62. 4 is a western blot showing an immunoprecipitation experiment.   FIG. 14 shows the surface plasma resonance fraction of the fusion protein encoded by pKC51. 4 is a graph showing analysis.   FIG. 15 shows the results of anti-TCR (V-β8. 2) Antibody (MR5-2), anti-αβ TCR antibody (H57-597 antibody), and anti-M1 It is a schematic diagram which shows the interaction between three antibodies.   FIG. 16 shows the scTCR fusion protein encoded by pKC60 and SEC FIG. 4 is a graph showing surface plasma resonance analysis of binding to 3 superantigens.   FIG. 17 shows a scTCR fusion protein obtained by an ELISA using an anti-HS7 antibody. Figure 4 is a graph comparing capture of bacteriophages expressing proteins. scTCR The fusion protein was expressed from pcK46 vector.   FIG. 18 shows the use of the pKC51 vector expressing the scTCR fusion protein. Is a graph showing titration analysis of bacteriophage composed of is there.   FIG. 19A shows scTCR fusion protein encoded by pKC51 vector FIG. 1 shows inhibition of IL-2 production of gD12 hybridoma cells by 9B is due to the scTCR fusion protein encoded by the pKC51 vector , D011. It is a figure which shows IL-2 production inhibition of a 10T hybridoma cell.   FIG. 20 shows pKC70, pKC71, and pKC72 bacteriophage. FIG.   21A-21G show the DNA used to construct the DNA vector described below. 4 is a table showing oligonucleotide primers. FIG. 21A shows (SEQ ID   NOs. : 1-16), and FIG. 21B shows (SEQ ID NOs. : 17-30 ) And FIG. 21C (SEQ ID NOs.). : 31-45), and FIG. EQ ID NOs. : 46-63), and FIG. 21E shows (SEQ ID NOs. : 64-79), and FIG. 21F shows (SEQ ID NOs. : 80-95), FIG. IG includes (SEQ ID NOs. : 97-100).   FIG. 22 shows the DNA source used to construct the V-β chain of the scTCR fusion protein. Ligonucleotide primers (SEQ ID NOs. : 116-131) It is a table shown.   FIG. 23 shows the DNA source used to construct the V-α chain of the scTCR fusion protein. Ligonucleotide primers (SEQ ID NOs. : 101-115) It is a table shown. Detailed description of the invention   As summarized in the preceding paragraphs, we have developed a covalently attached buffer for the scTCR molecule. Comprising the Cterio phage coat protein or a suitable fragment thereof A fully soluble and functional scTCR fusion protein was obtained. The scTCR is Contains a V-α chain covalently linked to a V-β chain by a single-chain peptide linker sequence . A segment of DNA encoding the scTCR fusion protein and a vector Is a scTCR in a form suitable for detecting binding molecules in vitro. Useful for constructing bacteriophage libraries displaying fusion proteins stand.   In general, the scTCR fusion proteins are known to the process disclosed herein and are generally known. Prepared using recombinant DNA techniques. Conventional technologies include For example, preparation of plasma DNA, excision of DNA with restriction enzymes, Transformation, host cell transformation, transfection, electroporation Or biolistic conversion, culture of host cells, expression of expressed DNA Separation and purification. For a general description, see Sambrook et al. in Mol ecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); and Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 198 Please refer to 9. These references are provided here as references. is there.   The scTCR fusion protein according to the present invention is a Bacterium fused to a certain scTCR. Single-strand fusion containing lyophage coat protein or an appropriate fragment thereof It is a synthetic protein. Usually, bacteriophage coat proteins or their The fragment is a gene III protein or gene derived from E. coli filamentous phage. Child VIII protein. The scTCR is V-linked by a suitable peptide linker. comprising a V-α chain fused to a β chain. Therefore, the scTCR is transmitted to T cells. It corresponds to the V-α and V-β chains from the relevant TCR. T cells are in their natural state Are present or associated with cancer, immune system disorders, autoimmune system disorders, It is also found in relation to allergies or diseases such as viral infections. In general, Are the V-α and V-β chains of the scTCR fusion protein approximately 200 in length? From 400 amino acids, preferably from about 300 to 350 amino acids. Amino acids and at least 90% favorable for the V-α and V-β chains of the TCR. Preferably they are 100% homologous. Here, “homologous” refers to the V-α chain. And V-β chain are 10 amino acids with the corresponding TCR V-α and V-β chains. 0% means identical. Binding with scTCR fusion protein according to the present invention Specific binding to a molecule can be assessed by methods such as immunoadsorption and immunodrip. it can.   As mentioned earlier, the scTCR is a bacterial strain derived from E. coli filamentous phage. It can be fused with a phage coat protein or a fragment thereof. Typical examples of filamentous phage are described in Sambrook et al. And Smith and Scott Discloses. Here, “fragment” refers to the package Of the present invention on the surface of a bacteriophage Of a bacteriophage shell protein capable of displaying a soluble fusion protein according to Means part. Generally, the bacteriophage gene VIII fragment is It corresponds to 40 to 50 amino acids in length, preferably about 50 amino acids. No acid. Bacteriophage gene III fragments are approximately 20 Corresponding to 0 to 400 amino acids, preferably about 400 amino acids Is equivalent to Bacteriophage shell protein fragments are suitable for bacterial Methods for determining whether a cell is packaged in ophages are known and generally First, a platelet type analysis is performed. In addition, bacteriophage shell tan Protein fragments can be obtained by standard immunological methods, such as the biological panning analysis described below. The scTCR fusion protein was converted to a bacteriophage table according to the Surface can be presented. Bacteriophage shell protein fragments Encodes a bacteriophage coat protein, as described here Mutating the DNA vector so that a portion of the DNA is removed (ie, Mutagenesis or deletion of the terminal). You. Then, the DNA vector converts the DNA encoding the fragment into s. Used to fuse the desired segment of DNA encoding cTCR. It is.   The V-α chain of the scTCR fusion protein is composed of the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the V-β chain. It is covalently linked to the V-β chain via a suitable peptide linker fused to the end. The V-β chain further comprises a C-β chain fragment fused to the C-terminus of the V-β chain. The V-α chain may be fused to the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the peptide linker. The combined C-α fragment may further be included. Generally, the C-β chain flag Mentions correspond to approximately 50 to 126 amino acids in length. Important thing Indicates that the C-β chain fragment does not contain a cysteine residue at position 127 (last). That is. C-α chain fragments are approximately 1 to 21 amino acids in length. The amino acid at position 1 of the C-α chain (isoleucine) to position 21 Corresponds to the amino acid at position 1. The C-α chain fragment contains any cysteine residues Absent. The bacteriophage coat protein or a fragment thereof is V-β The chain or the C-terminus of the C-β fragment. Also, unlike this, The protein label is attached to the C-terminus of the V-β chain (or C-β chain fragment) Fused to the N-terminus of the Teriophage coat protein or its fragment May be. In addition, the protein label is labeled with a V-β chain (or C-β chain fragment). ) And the bacteriophage coat protein or fragment thereof Fused to the N-terminus and labeled with a second protein (either the same or different Good) the C-terminus of bacteriophage coat protein or fragment thereof May be fused. Further differently, the protein label is This protein is fused to the C-terminus of The teriophage coat protein or a fragment thereof is further exposed at the N-terminus. May be fused to the C-terminal of the V-β chain (or C-β chain fragment).   Further modified scTCR fusion proteins include the N-terminal of the V-α chain. ScTCR fusion proteins that have a protein label fused to E. coli. Further, the bacteriophage coat protein or a fragment thereof is converted into a V-α chain. (Or C-α fragment), and this chain is fused to the N-terminal of the V-α chain. V-β (or C-β fragment) by peptide linker fused to the end May be covalently linked to the C-terminus.   Another scTCR fusion protein according to the invention has two peptide linker sequences. And the first peptide linker sequence comprises the C-terminal of the V-α chain and the N-terminal of the V-β chain. Fused to the edge. The C-terminus of the V-β chain is the N-terminus of the appropriate C-β chain fragment. Fused to the edge. In addition, the second peptide linker sequence is a C-β chain fragment Of the bacteriophage coat protein or its fragment It is fused to the N-terminus.   The scTCR molecule contained in the fusion protein contains a peptide linker sequence And the peptide linker sequence is used to effectively arrange V-α and V-β chains. Can be used flexibly. In other words, V-α chain and V-β Chains are located in pockets that can specifically bind molecules such as antigens. scTC Antigen binding to the R fusion protein regulates T cell activity as determined by the following analysis It can be used for the purpose of doing. A typical example of such an analysis is expressing the TCR The T cells are cultured and expanded, and the T cells are transformed into the scTCR fusion protein (or (ScTCR) obtained from the above, and then the fusion protein activates the activity of T cells. An in vitro analysis that includes a series of steps to assess It is.   In any of the scTCR fusion proteins described above, the V-β chain Via a suitable peptide linker fused to the C-terminus of the β-chain and the N-terminus of the V-α chain To the V-α chain.   The DNA segment encoding the desired V-α and V-β chains is Various cells including T cells such as hybridomas and cytotoxic T cells (CTL) Can be obtained from things. CTLs exist in their natural state, Immunity of primates (human, chimpanzee) or primates (human, chimpanzee) It is also associated with mechanistic reactions. For example, CTLs can be viral infections, cancer, autoimmunity Patients with or suspected of having a disease, allergy, or transplant rejection Can be obtained from certain patients. More specifically, CTL is converted to DNA Alternatively, it can be isolated from a patient with an RNA virus and purified according to the method of the present invention. To create an scTCR fusion protein. For example, scTCR fusion Protein can be obtained using CTL obtained from HIV patients who have been classified as long-term non-progression Can be prepared. See Example 18 below. CTL also has a fixed ( established) Antigen-specific CTLs isolated from patients with malignant tumors and melanomas It can also be obtained from TIL (eg, Cox A. et al. Science (1994) 264: 716; Rosen berg, S. A. et al. N. Eng. J. Med. (1988) 319: 1676; Kawakami, Y .; et al. J. Exp. Med. (1994) 180: 347; Kawkami, Y .; et al. PNAS (1994) 91: 6458). Pathogenic immune responses of particular interest include sclerosis, insulin-dependent diabetes, Antigens associated with tumors, such as rheumatoid arthritis, allergies, cancer (ie, CEA) Against tissue), cell tissue rejection in patients who underwent transplant surgery on tissue, skin, etc. Infectious diseases, especially infections involving RNA or DNA viruses Sexual diseases and the like. As a virus of particular interest, human immunodeficiency Whole virus (HIV), cytomegalovirus (CMV), influenza virus Ruth, hepatitis virus, poxvirus, Epstein Barr, Adenovirus, polyoma virus and the like. The V-α chain and V The segment of the DNA encoding the β chain is the TCR DNA sequence described below. It is also available from public databases that disclose columns.   The DNA segments were prepared for obtaining V-α and V-β chains from the cells. There are several ways to make it. Specifically, α-chain DNA and β-chain DNA are prepared. For production, mRNA is isolated from cells that exhibit the desired TCR binding specificity. This In general, the polymerase chain reaction (PCR), i. A protocol using the first-strand cDNA template is used. And The desired V-α and V-β chains are made using standard recombinant techniques. The desired α The DNA segments encoding the strand and the β-strand are then converted to a suitable peptide linker. -Prepare to include sequence and protein label. Next, if necessary, Is packaged in a suitable packaging system and the scTCR fusion protein is Generate a recombinant bacteriophage to be displayed. The scTCR fusion protein The DNA segment to be encoded can be obtained by subcloning technology or scT High bacteriophage DNA flanked by inserts of CR fusion protein PCR amplification method using DNA oligonucleotide primers to be bridged, It can be easily separated from bacteriophage by conventional recombinant techniques. Generally, oligo Nucleotides are approximately 12 to 50 nucleotides in length, More preferably, it consists of approximately 20 to 25 nucleotides. in this way Using the DNA encoding the fusion protein obtained in Significant amounts of soluble fusion protein (milligram per gram of cells) Grams) can be prepared.   DNA segments usually contain a leader sequence and carry out appropriate cell processing be able to. Generally, the leader sequence encodes the scTCR fusion protein At the 5 'end of the corresponding sequence. Specifically, the leader inserts the V-α chain (actually, In some embodiments, the DNA sequence encoding the V-β chain is covalently linked to the 5 ′ end. I agree. However, the specific leader sequence is a specific α chain in the vector or It is linked to the β chain, but uses recombinant technology to The ability to swap leader sequences without adversely affecting sexing Will be understood. Thus, in one of the preferred embodiments, the 5 'of the V- [alpha] chain The end is covalently linked to the 3 'end of the leader sequence. The leader sequence is short It consists of approximately 12 to 26 amino acid residues. Suitable leader sequences are: 11 is a modified Pel B sequence disclosed in Example 3.   DNA segments are usually trp operon promoter, lac promoter , Trp-lac promoter, rackuvsPromoter or phoA pro It further comprises a promoter such as a motor. Suitable promoters are, for example, Slow induction conditions over several hours (eg 2 to 10 hours) such as phoA Below, which contributes to strong and regulated expression. Under suitable culture conditions Indicates that most of the strong promoters are about 10% of the total protein of the host cell. Or more fusion proteins.   The bacteriophage library of the present invention can be easily created in a few steps. it can. For example, the DNA segment encoding the scTCR is outlined above. Can be made in different ways. The DNA is then transferred to a suitable phage or phage-derived (For example, phagemid), and the DNA is Ophage coat protein, usually gene III protein or gene VIII protein The protein is fused to the encoding sequence. In addition, bacteriophage It may be fused to a shell protein fragment. The tuple generated in this way Recombinant phage or phage-derived recombinant vectors It contains the scTCR fused to the coat protein or a fragment thereof. In some cases, encode one or more protein tags as described above It is desirable that the sequence further include a stop sequence or a stop codon. Then, good When the appropriate E. coli strain is infected, the fusion protein is placed on the surface of the bacteriophage. Are presented in large numbers (typically tens to hundreds). Presents scTCR of interest Helper phage is added to increase the production of the indicated recombinant virions. Bacteriophage display using different bacteriophages and E. coli strains A general method for constructing a play library has been disclosed. General description And Smith and Scott, Parmley, S.F., and Smith, G.P .. (1988) Gene See 73,305.   Specific scTCRs used to create bacteriophage libraries For example, scTCR having V-α and / or V-β chains obtained from mammals Is mentioned. Typical primates include primates and rodents, or primates. Among species are humans and chimpanzees, and among rodents, immunologically weak , Nude mouse, or transgene capable of expressing HLA-AS antigen complex (Vitiello, A. et al., J. Exp. Med., (1991) 175). , 1002). Of particular note in humans are cancer, infectious diseases, autoimmune diseases, or transplants Patients who have or are suspected of having rejection.   The bacteriophage library according to the present invention comprises a fusion protein mutant. Can also be constructed. The "mutant" is the mutated amino acid Refers to a fusion protein containing an average of one acid per molecule. More specifically, A amino acid mutation is a substitution of an amino acid in the scTCR portion of the fusion protein. Permutation, which produces the scTCR mutant. In general, scTCR mutants are constructed to contain on average one amino acid substitution . The methods for generating and analyzing mutants are described in detail below.   Bacteriophage live presenting scTCR fusion protein mutant Lari can be easily generated in a few steps. For example, a peptide linker as described above A DNA segment encoding a suitable V-α chain, linked by a sequence; By isolating the DNA segment encoding the V-β chain, the desired scT CR is obtained. The DNA is ligated and then the scTCRC V-α chain And in the desired region in the V-β chain, for example, locally This alters the DNA. A typical example of a mutation induction method is alanine Inspection mutagenesis (alanine scanning mutagenesis) (for example, Nisbet , I.T. et al. (1985) Gene Anal. Tech. 2,23; Hines, J.C., Gene (1980) 11,207 And Sambrook et al., Supra. See). The mutation is complementary to the scTCR. Decision region (ie, also called CDR or hypervariable region) Any amino acid substitution that affects the affinity of binding is preferred here. More specific Typically, the amino acid substitution is conservative or non-conservative, and is used herein. Means to replace a certain amino acid with an amino acid in the scTCR. ing. In some cases, this substitution involves replacing an amino acid with a Substitution with other similar amino acids (conservative substitution) is included, and Thus, one amino acid is replaced with another amino acid that has significantly different chemical properties (Non-conservative substitutions). Therefore, scTC with phenylalanine residue When a substitution of a tyrosine residue in R is made, this is a conservative amino acid substitution and When a substitution of an alanine residue is made at a phosphorus residue, this is a non-conservative amino acid substitution . One of skill in the art will appreciate that mutagenesis allows for the sc-TCRC V-α and V-β chains. And the length of the amino acid composition of the peptide linker sequence may vary Will be understood. However, in most cases, the mutagenesis is focuses on the β-chain and is flat within the V-α or V-β chains of the fusion protein. It causes an average of one amino acid mutation substitution. The degree of mutagenesis Analysis of the DNA sequence of the mutated V-α or V-β chain Can be easily analyzed.   Although less preferred than the above method, the bacteriophage library according to the invention To chemical mutagens known to introduce amino acid substituents (eg, EMS) May be exposed. Thereby, scTCR displayed on the surface of bacteriophage The fusion protein will include a fusion protein mutant. Such person Method, the amount of chemical mutagens used (or the amount of exposure to Degree) is the degree to which an average of one amino acid substitution is made for each V-α chain or V-β chain. It is preferable to adjust to. Fusion protein mutants (scT Bacteriophage library expressing the desired mutant (including CR mutants) It is particularly useful for detecting fusion proteins with enhanced specific binding affinity to antigen. Useful for   The scTCR fusion protein according to the present invention usually corresponds to a certain TCR. One scTCR. Generally, T cells expressing a TCR are Under natural conditions or, in vivo, under pathological conditions (eg, TS, TC Or THCells). Alternatively, cultured as T cell hybridoma (Eg, D10 or B12 cell lines). Example 1 below Please refer to. As described above, T cells can be cancer, infectious, autoimmune deficient, or Includes CTLs isolated from patients with or suspected of developing allergies It is. The T cell has a TCR sequence (ie, V-α chain sequence, C-α chain sequence, V-β chain sequence and C-β chain sequence). Such DNA is obtained by the method disclosed in the present invention. To obtain the DNA, Alternatively, oligonucleotides corresponding to publicly available DNA sequences may be used in a conventional manner. An otide primer may be formed and the DNA may be amplified by PCR. For example, Kaba t, E.A., et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4 th ed. Public Health Service, N.I.H. Washington, D.C. and Chotia, C.E. et al. (1988) EMBOJ. See 7: 3745.   More specifically, the desired V-α chain sequence, C-α chain sequence, V-β chain sequence, Alternatively, the DNA encoding the C-β chain sequence may be obtained by PCR or other suitable DNA. It can be amplified by a cloning method. If you choose the PCR method, The defined TCR DNA (V-α chain sequence) adjacent to the oligonucleotide primer , C-α chain sequence, V-β chain sequence, or C-β chain sequence). DNA oligonucleotide is selected. Oligonucleotides for PCR Usually corresponds to approximately 12 to 50 nucleotides in length, and preferably This corresponds to the 20 nucleotides. The primer is separated from the desired T cells. Genomic DNA, or V-α chain sequence, C-α chain sequence, V-β chain sequence, Or D in a DNA vector comprising DNA encoding the C-β chain sequence. Used to amplify NA. PCR primers are required for PCR products Add a specific restriction enzyme cleavage site to introduce a ligation site according to It is preferable to include a restriction site. Typical examples of primers are: This is described in the examples and drawings. The resulting PCR product contains the amplified V-α chain sequence and V-β And a chain sequence, and further, for optimal expression of the fusion protein, As described in, the ribosome binding sequence, leader sequence and promoter sequence are included. May be adjusted. Suitable primers, PCR conditions, and expression vectors are It is disclosed in the following embodiments and drawings.   By the above peptide linker sequence, V-α chain and V-β chain of the fusion protein are , So that the formation of the antigen-binding pocket is effectively performed. Doing this More soluble fusion proteins can be antigen (eg, superantigen, or MHC) / HLA peptide complex). Important This allows the fusion protein to be naturally or pathologically present in T cells. In that it can compete with the TCR located on the surface of the cell. What is "competing" A level equal to or preferably above the specific binding affinity of the corresponding TCR Means that the fusion protein can bind to the antigen. Generally, scTCR fusion The combined protein (or scTCR molecule derived therefrom) is labeled with the corresponding TCR Shows a binding affinity approximately 2 to 10 times higher than that of. How to determine binding affinity Methods are known and are disclosed herein. “Corresponding” means the V-α chain of scTCR and TCR (or the DNA encoding it) ).   In a preferred embodiment of the invention, the polypeptide linker sequence is between about 7 and 20 Amino acids, preferably about 10 to 20 amino acids, More preferably it consists of about 12 to 20 amino acids. The linker sequence is The fusion tag to arrange the V-α chain and the V-β chain so that the antigen can be optimally bound. Although provided in the protein, this arrangement is usually flexible. Linker Preferably, most have small side chains such as glycine, alanine, serine, etc. And the above-mentioned flexibility. Preferably, Approximately 80% to 90% or more of the linker sequence contains glycine residues, It consists of a lanine residue or a serine residue, especially a glycine residue and a serine residue. It consists of a base. The linker sequence contains no proline residues that inhibit flexibility It is preferred that they do not fit. The linker sequence is preferably V-α of the fusion protein. It is linked to the C-terminus of the chain and the N-terminus of the V-β chain. Example 1, Example 2, and See FIG. 3, FIG. 6A, FIG. 6B, and FIG.   (GGGGGS)FourSequence (ie Gly Gly Gly Gly Sel)FourA suitable resource containing The anchor arrangement includes JA302 (SEQ ID NO: 96) and JA301 (SE Q ID NO: 95). The linker sequence is the C-chain of the V-α chain of the scTCR. It is preferably linked between the terminal residue and the first amino acid of the same V-β chain. Includes flexible linker design by suitably combining antibody variable regions Different linker sequences can be used (M. Whitlow et al., Methods: A Compa nion to Methods in Enzymology, 2: 97-105 (1991)). Such suitable The linker sequence can be easily identified experimentally. For example, a fusion containing a linker sequence A DNA vector comprising a DNA segment encoding a protein, The fusion molecule can be cloned and expressed, for example, a standard antigen binding As indicated in the analysis (see Harlow and Lane above), experiments have shown that the molecule One can determine whether it is possible to bind the antigen. Other than the above, The ability to regulate T cell activity by the assays disclosed in Example 8 and Examples 10-12 Testing and determining the expressed fusion protein comprising the linker sequence. Can be. The preferred size and sequence of the linker sequence is based on the assumption of the fusion protein. Conventional computer-based modeling techniques based on the size and shape Can also be determined.   Preferably, virtually any nucleic acid encoding a V-α chain or V-β chain Even the reotide sequence, so that it can be incorporated into a vector, DN A restriction site in the A vector is engineered. Furthermore, DNA vectors are suitable Teriophage coat protein (gene III protein, gene VIII protein ) Or a DNA fragment encoding a suitable fragment thereof. May be designed to include one or more restriction sites. Furthermore, myc One or more protein labels, such as, EE, or 6XHIS Conventionally, the encoding DNA is inserted into a DNA vector encoding the fusion protein. It can also be connected in a known manner. For example, Manstein, D.S. et al. Gene (1995 ) 162 (1), 129; Grussenmeyer, T .; et al. PNAS (USA) (1985) 827952, Tang, E .; and Henry, H.L. J. Biol. Chem. (1993) 268 (7), 5069.   More specifically, in the preferred systems specifically illustrated in the Examples below, Restriction sites (eg, XhoI and SpeI sites) are At both ends of the polypeptide linker sequence located between the V-α and V-β chains of I do. When fused to an appropriate DNA vector, the restriction site and the bacteriophage Fusion with the coat protein or a fragment thereof occurs.   DNs containing sequences encoding the scTCR fusion proteins disclosed herein The A vector generally fulfills the following (1) to (8): (1) in E. coli Having a replication origin derived from PBR322, (2) selectable (3) having a novel antibiotic resistance gene, for example, an ampicillin resistance gene; Those having a transcription termination region, for example, a termination region of Escherichia coli trp operon, (4) Transcription promoters such as phoA, tac, tac-lac, lacZ, l acuvsHaving a T7, T7 or T3 promoter, (5) leader sequence For example, those having a pelB or ompA reader, (6) Having an encoding DNA segment, (7) bacteriophage shell tan Proteins such as the gene III protein and the gene VIII protein (or (8) a transcription terminator, e.g. Those having a T1T2 sequence derived from the ribosomal RNA locus of Enterobacteriaceae. In some cases, The DNA vector contains a DNA sequence encoding a protein tag as described above. Further, one or more may be included.   The expression of the scTCR fusion protein and its stability, Include specific nucleotide sequences in DNA vectors to optimize under inducing conditions. You may have. For example, the phoA promoter sequence described below and pelB Leader sequence refers to a scTCR fusion protein in a phosphate deficiency-inducing environment. Particularly preferred for expression. See Example 4 below. Increase translation efficiency For this purpose, a strong translation initiation sequence may be included in the construction. In mammalian cells For expression in E. coli, a preferred starting sequence is the Kozak consensus sequence (CCACCCATG) (SEQ ID NO: 97).   The leader sequence contained in the DNA vector controls the expression of the fusion protein in the host cell. It is intended to induce on the cell membrane of the cell or in the host cell medium. DNA encoding V-α chain is suitable for encoding a fusion protein It contains an effectively located restriction site to be ligated. Suitable In the art, restriction sites are referred to in the art as junction sequences. Some leader sequences (e.g., correspond to approximately 2 to 10 codons in length) ) And is linked to the V-α chain. As a result, the V-α chain The coding region is usually the first amino acid of the V-α coding region. As an example, one system The restriction site is the SFiI site, while the other cleavage site is in front of the V-α chain coding region. Which allows the V-α chain to be more suitably inserted into a vector construct. Can be mentioned. As discussed above, such restriction sites are usually identified as V- Used with another restriction site located at the head of the α-chain, a wide variety of V-α Chain or the coding sequence of the V-α and C-α chains so that they can be inserted quickly and easily. Become. Preferred leader sequences are those that contain a strong translation initiation site, and May include a cap site at the 3 'end of the mRNA. Typical re Examples of the leader sequence include pelB and OmpA. See Example 4 below. Thus, a particularly preferred leader sequence is pelB.   Here, the term “vector” refers to a vector that can be taken up by host cells. And the expression of the nucleic acid of interest results in the scTCR fusion Protein and the like are produced. Vectors include, for example, linear nucleic acid sequences, plus Mid, cosmid, phagemid, extrachromosomal DNA and the like. The vector may be a recombinant DNA. Also, there is "expression" here Or "gene expression" includes transcription of DNA and translation of RNA, Refers to the production of a protein product corresponding to the acid sequence. Usually, the present invention A DNA segment encoding the scTCR fusion protein, Preferably, the DNA segment is inserted into a DNA vector and placed in a suitable host cell. Is duplicated.   Encoding a fully soluble and functional scTCR fusion protein according to the invention The DNA vector to be loaded is preferably longer for the host cells to be slowly induced. Is expressed. Without mentioning any particular theory, about 2-8 hours By induction at low speed over a period of time, preferably over approximately 4-6 hours, the scTCR Stable fusion protein expression and optimized protein folding between cells Is done. Especially when the expression is driven by a strong promoter, These effects on induction are apparent. For example, a DNA vector is scT PhoA pro operably linked to a sequence encoding a CR fusion protein It is produced including a motor (strong). Then, the host cell is determined by the DNA vector. The vesicle is transformed in the host cell medium. And phosphate in the host cell medium Used up in the medium for a period of time, typically 2-10 hours, usually 4-6 hours. It was set to be. Combines the above low-speed induction conditions with a strong promoter When used in combination, a fast induction method using a chemical inducer and a weak promoter (eg, For example, as compared to the LacZ promoter IPTG induction method), It was found that the production of a functional scTCR fusion protein was greatly increased. See Example 4 below. A preferred host cell is retroviral conversion. , Calcium, liposome, or polybrene-mediated transfection, It can be transformed by various conventionally known methods, such as conversion by biodegradation. It is.   As described above, one or more scTCR fusion proteins of the present invention May contain multiple protein labels (same or different) No. This protein label includes those that contain a protease cleavage site. You. For example, protein labels retain their charge under physiological pH conditions, such as 6XHIS. A fusion protein using a suitable synthetic matrix. The protein can be purified. More specifically, the synthetic matrix comprises: Commercially available Sepharose matrix such as Ni-Sepharose Or other that can bind the 6XHIS label under conditions of pH 6-9. It may be a matrix. Other suitable labels are commercially available EE or myc epithelium specifically bound by a functional monoclonal antibody Soup. Generally, antibodies, preferably commercially available monoclonals Various epitopes that are specifically bound by Works. Other suitable synthetic matrices include the present scTCR fusion proteins A synthetic matrix having a binding antibody on which specific binding is formed. Typical protein labels comprising a cleavage site include enterokinase, F actor Xa, snake venom, or a tamper comprising a thrombin degradation site Quality labels. See, for example, PCT Patent Application No. WO 96/13593. I want to be illuminated.   In a prokaryote, eukaryote, or insect cell, the soluble fusion tan There are several methods for expressing protein. For example, the fusion protein The DNA to be ligated is, for example, such that the DNA is ligated to a vector. Suitable by known means, such as using enzymes to restrict the vector in place. It can be incorporated into a vector. As mentioned above, vectors include Encodes lyophage coat protein or a suitable fragment thereof May also be included. And D, which encodes the fusion protein A vector comprising NA is introduced into a suitable host and the scTCR fusion protein Is expressed. Suitable vectors will depend on factors related to the cloning protocol. Therefore, it is selected experimentally. For example, the vector is compatible with the host cell used. And have an appropriate replicon. In addition, the vector contains a DNA sequence code corresponding to the fusion protein to be expressed. Must be able to accommodate. An example of a typical vector is E. coli. In particular, the fusion protein in a host strain suitable for the construction of a bacteriophage library. And those capable of expressing protein (see Smith, G.P. and J.K. Scott, supra). ). Other DNA vectors include fusion proteins in mammalian cells. PCDVA3 that can be expressed (available from InVitrogen) and the like. Other For DNA vectors usable in mammals, see Sambrook et al. See ubel et al.   More specifically, a host cell suitable for expressing the fusion protein according to the present invention Cells that can be easily transformed and show rapid growth in medium. No. Particularly preferred host cells include Escherichia coli and Bacillus subtilis. . Other host cells include animal cells and S. aureus. yeast such as cerevisiae, Eukaryotic cells such as insect cells. The bacteriophage lye disclosed herein For the purpose of multiplying the varieties, E. coli such as XL1-B, K91 and K91Kan Lines are preferred. Baculovirus-infected cells suitable for expression in insect cells Possible cells such as Sf9. Generally, conventional culture conditions are used, and For example, a suitable cell selection marker (eg, an antibiotic resistance gene, or G418) ) Is incorporated into the vector, which ensures stable transformation and transfection. The selected cell line is selected. Cells expressing the scTCR fusion protein are listed below. Commercially available, which specifically binds to the V-α chain or V-β chain Determination by a known method, such as ELISA analysis using a monoclonal antibody Can be.   The expressed scTCR fusion protein was analyzed by immunoaffinity chromatography. It can be isolated and purified by known methods such as immunoassay, immunoadsorption and immunoprecipitation. Heavy What is important is that without having to perform the time-consuming re-folding step in the preparation process , A significant amount of fusion protein is produced. The details of the protein purification method are described below. According to this method, the production amount of most scTCR fusion proteins Is in the range of 2 to 20 milligrams per 50 to 100 grams of host cell paste. Become.   Generally, to prepare scTCR fusion proteins, cell extracts or Centrifuges the host cell culture medium and separates the resulting supernatant, eg, Protein or G protein affinity chromatography, Immunoprotocol using antibodies that specifically bind to cTCR fusion protein molecules Chromatography or immuno-affinity chromatography Purify by chromatography. Examples of the antibody include sc-TCR V-α Commercially available monoclonal capable of specifically binding to a chain or V-β chain Antibodies. A typical example of the antibody is a product of Pharmagen. H57, MR5-2, F23.1 and the like. Monoclonal anti Affinity purification of proteins using the body is known. rlow and Lane, Antiboides: A Laboratory Manual (1988) .   The fusion protein according to the invention is soluble and fully functional, i.e. It is provided in a form that can be secreted stably. More specifically, scTCR The fusion protein is characterized by little or no disruptors such as detergents. Provided in an environment that almost satisfies the condition, that is, stable under physiological conditions . That is, the fusion protein is an amino acid found in the TCR transmembrane protein region. It generally does not contain regions rich in hydrophobic amino acids, such as carboxylic acids. However, In some cases, as long as the scTCR fusion protein is sufficiently soluble, The amino acid-rich region may be partially contained. That is, the fusion protein Does expression lead to the formation of significant amounts of inclusion bodies in suitable host cells? Maybe. Inclusion bodies can be easily removed using a microscope or conventional biochemical techniques. Can be detected.   The scTCR fusion protein according to the present invention can be prepared as described above. The examples described below can be prepared in a similar manner. Generally, encodes the desired V-α chain DNA that encodes the V-β chain, as described above, An hybridoma system or the publicly available V-α and V-β chain sequences, etc. Obtained from a suitable place. The DNA can be obtained by PCR, cloning, or It can be amplified by other suitable means. For example, the desired V-α chain The DNA to be cloned is cloned as a suitable vector, and then the desired V-β chain is By cloning the encoding DNA and a suitable single-stranded linker sequence, The desired scTCR can be generated. As mentioned above, in some cases, sc Encoding the C-α chain fragment and / or C-β chain fragment into the TCR DNA to be loaded. And a bacteriophage protein or Encode the fragment with other sequences required for bacteriophage function. A DNA vector cleaved at a suitable site comprising a DNA sequence to be By ligation of DNA encoding cTCR, scTCR molecule Structure of bacteriophage coat protein or a suitable fragment thereof (eg For example, gene III protein or gene VIII protein) . Bacteriophage gene III protein or bacteriophage gene V Typical example of a DNA vector comprising a sequence encoding a III protein Is described below. Encode one or more protein tags as described above The DNA to be selected is preferably a DNA vector that already contains the desired protein label. By selection, it may be added to the fusion protein as needed. This allows The ligated DNA vector is expressed in a suitable host and The fusion protein can be recovered and purified according to the conditions.   The scTCR fusion proteins of the present invention generally comprise a promoter / leader Sequence / V-α chain / single-chain linker sequence / V-β chain; promoter / leader sequence / V-α chain / single-chain linker sequence / V-β chain / C-β chain fragment; / Leader sequence / V-α chain / C-α chain fragment / single-chain linker sequence / V-β chain; or promoter / leader sequence / V-α chain / C-α chain flag Sequence / single-chain linker sequence / V-β chain / C-β chain fragment; Encoded by the bound DNA structure. Express fusion protein To produce a DNA vector comprising the specific expression system disclosed herein, , Bacterial cells, baculovirus-insect cells, or mammalian cells. Appropriately introduced.   The molecular weight of the scTCR fusion protein according to the present invention What was chosen as the phage coat protein or fragment, or , Several factors, such as whether one or more protein labels were employed. Therefore, it changes. Generally, a soluble and fully functional fusion protein is V-α and V-β chain molecules whose amount exceeds approximately 45 kDA Although the amount exceeds 20 kDA, usually the molecular weight is in the range of 21 to 26 kDa. Further, the fusion protein according to the present invention usually has a molecular weight of about 48 to 50 kDa. is there. All the above molecular weights are based on conventional molecular weights such as SDS-PAGE gel electrophoresis. It can be determined by sizing experiments. See Harlow a above for general description. See the work by nd Lane and Ausubel et al.   The multivalent scTCR fusion protein according to the present invention can also have various useful applications. is there. For example, it is thought that the function is strengthened when the valence of scTCR increases. You. Multivalent fusion proteins include, for example, standard biotin streptavidin (streptavidin). din) ・ Use a suitable solid support such as latex beads using labeling technology. By joining to the holding tool, 1 to 4 fusion proteins (the same or (They may be different). Chemically crosslinked Fusion protein (eg, dendrimer by crosslinking) Are also suitable as polyvalent species. For example, fusion proteins can be chemically An amino acid residue having an active side chain, for example, Cys or His, is encoded. Can be modified by including a sequence to be loaded. Has chemically active side chains These amino acids can be located at various positions in the fusion protein However, it is preferred to be located distal from the antigen binding region of the scTCR. For example, The C-terminus of the C-β chain fragment of the combined protein is labeled with a protein purification label. Alternatively, it can be covalently linked to other fusion proteins containing active amino acids. You. By including a suitable side chain, a plurality of fusion proteins can be Dendrimer particles can be used to make multivalent molecules. What is dendrimer scientific Is a polymer synthesized to contain any of a plurality of different functional groups on its surface (See D. Tomalia, Aldrichimica Acta, 26: 91: 101 (1993)) . Typical dendrimers suitable for use in the present invention include, for example, cysteine Starburst, polyamine, dendri And E9 combust, polyamine and dendrimer. It is. Examples of multivalent fusion proteins are described in Example 9 below.   The fusion protein according to the present invention, further comprising another substance, especially the B-7 gene family (T cell co-stimulatory such as B7-1 and B7-2)  factor) is constructed, and a fusion vector is constructed. It is also desirable to activate cells containing the quality.   The fusion protein according to the present invention may comprise a recombinant peptide antigen, such as an MHC molecule. Or to detect and characterize superantigens and antigens in HLA molecules It is. For example, using the method of the present invention, a non- Can be mapped as follows: That is, random peptides The sequence encoding the library or selected peptide library is Provided in the library. And the library is a fusion protein, preferably Or using a detectably labeled fusion protein You. Subsequently, the peptide specifically bound to the fusion protein is suitably amplified. . Next, the sequence of the peptide is analyzed to identify the sequence bound to the fusion protein. I do. Furthermore, TCRs corresponding to the V-α and V-β chains of the fusion protein are expressed. The cloned peptide sequence is tested for binding to the T cells . Any of several random peptide libraries may be employed. For example, J . Scott et al., Science (1990) 249: 386; Devlin et al., Science, (1990) 249: 404; Cwirla et al., PNAS (USA), (1990); 87: 6378; Hammer et al., J . Exp. Med. (1992) 176: 1007; Rhode, P.R. et al. J. Immunol. (1996) 157: 4885 And D. 0'Sullivan et al., J.S. See Immunolo., (1991) 147: 2663.   Extremely useful single-chain class I and class II MHC / peptide complexes (i.e. "ScMHC complex"), published PCT application no. PCT / US95 / 0981 6 and U.S. patent application Ser. No. 08 / 382,454 under review (filing date 199). February 1, 5) and the serial number 08 / 596,387 (filed on January 1, 1996) March 31). The above published PCT application number PCT / US95 / 09816 and U.S. Patent Application Serial No. 08 / 382,454, pending. Date February 1, 1995) and the serial number 08 / 596,387 (filing date 19 (January 31, 1996) with the scTCR fusion protein disclosed herein Extremely useful in vitro and in vivo that can be used to test functionality Discloses a T cell binding assay method.   More specifically, the published PCT application number PCT / US95 / 09816, U.S. Patent Application Serial No. 08 / 382,454 Under Examination, and Serial Number 08 / 596,587 include amino acids 323-33 of ovalbumin (OVA). 9-derived presenting peptide or HSV-1 gD peptide (g D12 etc.) single-chain MHC containing a presentation peptide derived from amino acids 246-261 Class IIIAdComplexes (eg, scIadMolecule). Referee above As disclosed in co-pending US patent application Ser. No. 08 / 596,587, OVA peptide and gD12 peptide are fused or scIAdComplex It can be provided in a non-covalently linked form. Published PCT application number above PCT / US95 / 09816 and pending US patent application serial no. 08/3 82,454 and the serial number 08 / 596,587 are hereby incorporated by reference. I write it here.   The ability of the scTCR fusion protein of the present invention to regulate T cell activity (eg, proliferation Suppresses or eliminates T cell activity). It is easily determined by analysis. In-vitro analysis and typical materials needed to perform the analysis As for the above published PCT application number PCT / US95 / 09816, U.S. Patent Application Serial Nos. 08 / 382,454 and 08/5 96,387.   In general, T cells suitably used for the analysis include T cell hybridomas and mammals. Species, eg, primates such as humans; rodents such as rodents and rabbits; Obtained from a transformed T cell line, such as a T cell. Other suitable T cells 1) T cell hybrids that are publicly available or can be prepared by known methods 2) helper T cells; 3) T cell-damaging cells, preferably cytotoxic CD8+ There are cells. T cells can be isolated from mammals by known methods. For example , R. Shimonkevitz et al., J. Am. Exp. See Med., (1983) 158: 303.   The above published PCT application number PCT / US95 / 09816 and the U.S. Patent Application Serial No. 08 / 382,454 and Serial No. 08 / 596,3 87, an in vitro analysis reveals that a molecule has a T It can be determined whether it is possible to modulate the activity of the cell. In particular, The assay is readily applicable to scTCR fusion proteins of the invention. You. Generally, the analysis is performed in one to five consecutive steps, as described below. T cells Expresses a marker that can be analyzed, wherein the marker is used to activate or activate T cells It shows the activity of T cells that were subsequently regulated. Thus, for example, As disclosed in Example 8, upon activation interleukin-2 (IL-2) was released. The resulting mouse T cell hybridoma DO11.10 can be used. By measuring the concentration of IL-2, a particular scTCR can It can be determined whether the activity of the lidoma can be modulated. The analysis is generally For example, it is performed by sequentially performing the following steps.   1. T cell hybridoma or scTCR fusion protein according to the present invention To obtain T cells containing the TCR corresponding to Typical T cells are expanded as described above. It is a CTL of a person who can be bred.   2. The T cell hybridoma or T cell is cultured under conditions that allow it to proliferate. .   3. The expanded T cell hybridomas or T cells are Contact with protein.   4. Specifically binds to the TCR (and scTCR fusion protein), An antigen capable of activating the T cell hybridoma or T cell; Contacting hybridomas or T cells. A typical antigen is a superantibody Original, sc-MHC class I or class II complex having the above-described presentation peptide Or a suitable APC.   5. The T-cell hybridoma or T-cell is transformed into a suitable co-stimulator (co-stimulator). y factor) to provide the signal required for activation. Next, the T cell Hybridomas or T cells are analyzed by markers. That is, for example, The amount of IL-2 production is measured. IL-2 production is, for example, 40% in 24 hours or If it were reduced further, this reduction would mean that the scTCR fusion protein It indicates that the immune response was suppressed by regulating the activity of T cells.   Example 8 below is a typical example of this analysis.   The above published PCT application number PCT / US95 / 09816 and the U.S. Patent Application Serial No. 08 / 382,454 and Serial No. 08 / 596,3 87, the T cells used in the assay are usually expanded And incubated under suitable conditions. For example, DO11.10 T cell high Bridoma was prepared in complete medium (10% FBS, penicillin / streptomycin, L -Glutamine, and 5 x 10-FiveM 2-P by adding mercaptoethanol RMI 1640) at 37 ° C, COTwoWhen incubated under 5% condition It is suitable. Usually 10-12-10-6A certain fusion protein to give a concentration of M Is added to the serially diluted dilution or the culture medium of T cells. T cell activation sig Nulls are preferably supplied by antigen presenting cells bearing the appropriate antigen . Activate T cells slightly lower than the highest level to the level with antigen dose APCs that inhibit T cell responses to the fusion protein It is considered suitable for detection. Following contact with the scTCR, IL- 2 means that the fusion protein regulates the activity of T cells Indicates that you are doing.   The above published PCT application number PCT / US95 / 09816 and the U.S. Patent Application Serial No. 08 / 382,454 and Serial No. 08 / 596,3 87, the identification of T cell activity regulation is based on the expression of IL-2 and the like. Rather than measuring the amount of protein produced, radiation By measuring changes in the proliferation of antigen-dependent T cells using the belling technique, Performed appropriately. For example, detectably labeled (eg, tritiated ) Nucleotides may be introduced into the culture medium for analysis. Nu with such a sign Incorporation of nucleotides into DNA is a measure of T cell proliferation. This analysis is Suitable for T cells that do not require antigen presentation for growth of, for example, T cell hybridomas Not. This analysis is based on non-transformed T cells isolated from mammals. It is suitable for measuring the activity regulation. Subsequent to contact with the fusion protein Decreased levels of T cell proliferation allow molecules to modulate T cell activity and suppress immune responses Is shown. See Example 8 and Example 10 below. In In vitro T cell proliferation assays show that the fusion proteins described above are Suitable for measuring the effect of clonal clonal proliferation on antigen-specific changes It is. This analysis is specifically described in Example 11 below.   As described in the Examples below, measurement of IL-2 production or T cell expansion Proliferation measurements determine whether scTCR fusion proteins can modulate T cell activity. Can be used for research purposes. For example, following contact with the fusion protein The decrease in IL-2 production by APC-stimulated T cells is caused by the fusion molecule Shows that it can regulate T cell activity and suppress T cell mediated immune response I have.   In vivo assays also inhibit T cell development or inactivate the cells. To determine the ability of the fusion protein to regulate T cell activity, such as the ability to Can also be used. For example, an immunoglobul of the scTCR fusion protein The ability of phosphorus to inhibit class changes (ie, IgM to IgG) can be analyzed. . See, for example, P. Linsley et al., Science, (1992) 257: 792-795.   Diagnostic methods using fusion proteins include in vivo diagnostic imaging and HLA It is also realized as type analysis (for example, A.K. Abbas, Cellular and Molucular Immunology, page 328 (W.B.Saunders Co. 1991)). In Vivo Image Upon application to zing, the fusion protein is radiolabeled (e.g.,125I,32P,99 Tc) or other detectable label that can be administered to a mammal, Is scanned by known methods to detect binding of the scTCR. mammalian Such an analysis against APCs, for example, Can be helpful in diagnosing and treating many diseases, such as abnormal expression.   Also, the analysis may be based on scTCR fusion proteins used for the treatment of autoimmune diseases. Quality (or preferably scTCRs obtained from fusion proteins) It can be used for the purpose of doing. For example, the above published PCT application number PCT / US No. 95/09816 and U.S. Patent Application Serial No. 08 / 382,454, pending. And laboratory serial numbers 08/596 and 387. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) , A mouse autoimmune disease and a recognized model of multiple sclerosis. One In one example, one mouse strain was treated to develop EAE, and then , A suitable scTCR fusion protein (or s cTCR) is administered. Thereafter, the animal is treated with the fusion protein or scTC. To evaluate whether the administration of R inhibited or prevented the progression of EAE, Be valued. Such an assay is described in detail in Example 12 below. You.   Immune reaction of the scTCR fusion protein according to the present invention (the target described above) (Including vaccination against disease) can be assessed by in vivo testing. You can easily find out. For example, a fusion protein (or preferably , A scTCR obtained from the fusion protein) is administered to a mammal such as a mouse. Blood samples at the first dose and periodically several times thereafter (eg, scT 2, 5, and 8 weeks after administration of the CR fusion protein). Then, serum From a blood sample to determine whether the antigen produced by immunization is present An analysis is performed. Antibody concentrations can be determined by standard immunological methods. Wear.   The present invention also provides for the production of fusion proteins in cells of mammals, especially primates such as humans. And a method for administering a DNA segment encoding the fusion protein. Is what you do. Preferably, a DN having a fusion protein coding region A is controlled by a suitable promoter, such as the CMV promoter. Is injected directly into the subject's skeletal muscle by known methods. Administration of plasmid DNA Methods, uptake of the DNA into cells of the subject to whom the DNA has been administered, and There have been reports of protein expression (J. Ulmer et al. Science, (1993 ) 259: 1745-1749).   The scTCR fusion protein of the present invention has various therapeutic applications. Wear. For example, a fusion protein (or preferably obtained from a fusion protein). ScTCR) is administered for the purpose of reducing or eliminating an immune response in a mammal. Can be This allows, for example, cancer, infectious diseases, allergies, or Examples include multiple sclerosis, insulin-induced diabetes mellitus, and rheumatoid arthritis. Treat mammals such as those with or at risk of autoimmune diseases can do. Administration involves direct administration of DNA encoding the fusion protein Or any other suitable means. Also suitable for this treatment Patients suffering from or at risk of having an unwanted immune response, eg, axilla, kidney , Patients undergoing transplant surgery on the skin, or other organs. Transplant rejection In situations involving treatment, treatment protocols may be properly started before surgery is performed. Good.   According to the present invention, to reduce or eliminate the immune response of a mammal, A unique approach can be used. For example, reduce unwanted immune response One treatment to reduce or reduce the interaction between pathogenic T cells and antigens For removal, a suitable scTCR fusion protein (or, preferably, (A scTCR derived therefrom) is administered in an effective amount. This allows the proliferation, differentiation, Selectively activates or stimulates T cell-mediated immune responses such as B lymphocyte stimulation Can be controlled. Fusion proteins are pathogenic that mediate unwanted immune responses Antigen-specific binding affinity at least as high, preferably higher than T cells Preferably. Particularly preferred in this regard is for the ligands described above. Is a scTCR mutant that exhibits high specific binding affinity.   Antibodies to scTCRs or TCRs prepared by the methods disclosed herein The administration of the body is performed by an injection method such as intraperitoneal injection or intravenous injection. It can be administered to milk. Among fusion proteins, at least therapeutic applications The molecule used in is produced from a mammalian cell or other suitable cell, Purified before use to be substantially or completely pyrogen-free Is preferably performed. Optimal dosages for certain therapeutic applications will depend on conventional means. In general, the route of administration, the patient's weight, May vary depending on several factors, including those recognized by You.   The administration may be a single administration or a continuous administration at daily or weekly intervals. No. As used herein, a "single dose" may be a single dose. It may also be a sustained release administration. The subject is a mammal (eg, , A person, or a livestock like a cow, or a pet like a dog or cat) And also includes treatment as a pharmaceutical composition comprising a scTCR or antibody. You. Such pharmaceutical compositions of the invention can be manufactured according to procedures known in the art. And used. For example, a formulation containing a therapeutically effective amount of a fusion protein can be, for example, Single or multiple dose units such as sealed ampules and vials May be provided as, for example, only the addition of a sterile liquid carrier by water injection May be stored in a lyophilized state required immediately before use. Liposome formulation Suitable for many applications. Other compositions may also be appropriate for parenteral administration. Can be used, including antioxidants, buffers, bacteriostats, and target recipients Aqueous and non-aqueous sterile injectable solutions containing solutes in amounts that are isotonic with the blood And water-soluble and water-insoluble aseptic suspensions, including suspending agents and thickeners. Includes suspensions.   The method of the invention comprising reducing or eliminating a T cell response (response) In order to provide more effective treatment for mediated diseases, known immunosuppressants, It may be performed in combination with an antiviral agent, an anticancer agent, or an antiinflammatory agent. For example, Fusion proteins are used to treat autoimmune diseases and allergies, Immunosuppressive drugs such as rosporin (cyclosporin) or corticosteroids (co rticosteroid) and non-steroidal drugs. Can be.   As described above, the scTCR fusion protein (or the scTCR molecules) generally produce antibodies by methods known in the art. Can be used for purification purposes and is usually produced as a purified sample of the fusion protein. It is. In most cases, scTCR fusion proteins selected to increase antibody production As described above, the protein is firstly a bacteriophage coat protein or Degraded to remove the fragment. ScTC thus obtained R is used as an immunogen. Antibodies may be one or more of the scTCRs of interest. It can also be constructed from immunogenic peptides consisting of the above epitopes.   More specifically, the antibodies are purified samples of the scTCR fusion protein, A scTCR molecule isolated from the fusion protein, or an immunogenic peptide as described above Immunize mammals with the drug (alone or in combination with a suitable carrier) It is obtained by doing. Preferably, the scTCR molecule is used as an immunogen. Ma Suitable mammals include sheep, goats, rabbits, guinea pigs, rats, and And general experimental animals such as mice. Rats and mice, especially mouse Is preferably used for the purpose of obtaining a monoclonal antibody. Antigen is injected subcutaneously, A number of routes, including intraperitoneal, intravenous, intramuscular, and intradermal injections Any of them can be administered to mammals. Optimal immunization interval and immunization The amount and the like can be within a relatively large range, and may be experimentally determined based on the disclosure herein. Can be sought. In the normal procedure, the antigen is injected several times over several weeks You. Antibodies were collected from sera of immunized animals in a conventional manner and scTC Screened to detect antibodies specific for R. Especially noteworthy Binds specifically to the V-α or V-β chain, and particularly to the highly variable region in the chain. An antibody, for example, that recognizes a linear or conformational epitope on the region Antibodies. Monoclonal antibodies can be found in antibody-producing cells and in hybrids. Monoclonal antibodies using standard fusion methods for tumor cell formation Can be produced in the cells used for this purpose (G. Kohler, et al., Nature, (1975) 256: 456). Usually, here we generate hybrid cells Fusion of antibody-producing cells with immortal cell lines such as bone marrow cells U. Alternatively, monoclonal antibodies are described in Huse, et al., Science, (1989) 256: 1275. May be produced from the cells by the method described above.   One suitable protocol uses a composition comprising a purified scTCR complex. Immunization by intraperitoneal injection of mice over a period of about 2-7 months It is. Thereafter, spleen cells can be removed from the immunized mouse. Immunity Serum from the vaccinated mice was treated with scTCR-specific antibodies before spleen cells were excised. It is analyzed by titration. Thereafter, the spleen cells of the excised mice were collected at an appropriate level. It is fused with a quality or heterogeneous (preferably homogeneous) lymphoid cell line. The phosphorus The pa cell line is hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferer Deletion (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase deficiency (HGPRT- )) Or thymidine kinase deficiency (TK- )). Preferably, a bone marrow cell line is a lymphoid cell lineage. used. For example, the bone marrow cells and the spleen cells The cells are mixed at a ratio of 4 cells. These cells are prepared using the polyethylene glycol (PEG) method. (See G. Kohler, et al., Nature, Supra). this The hybridoma cloned as above is, for example, cultured in RPMI-1640 medium. (G.E.More, et al., Journal of American Medical Association, (1967) 199: 549). Hybridomas that grew after the fusion treatment were specific for the purified scTCR. Utilizing the secretion of binding antibodies, radioimmunoassay or enzyme immunoassay It is screened by an analysis method or the like. Using the ELISA method according to the conventional method Alternatively, antibodies including serum can be screened. Such a screenin Hybridomas that show a positive result for And can be cloned. Preferably, in solution and in raw samples, Further screening is performed to select antibodies capable of binding to cTCR . The isolated antibodies can be purified by appropriate immunological methods such as affinity chromatography. It can be further purified by a method.   In some applications, chimeric antibodies that specifically bind scTCRs A conductor (eg, an antibody component that binds the variable region of a non-human animal to the constant region of a human) Offspring), which in turn reduces the immunogenicity in the subject (human) by the corresponding non- In some cases, it is preferable to reduce the amount as compared with a meric antibody. Such kimeri Antibodies include, for example, protection in some parts of the variable region, particularly in the antigen binding region. Human variable region chimera in which the living region originates in humans and only the highly variable region originates in non-humans. Depending on the method of production, various types can be obtained. (S.L.Morrison, S cience, (1985) 229: 1202; Oi et al., BioTechniques, (1986) 4: 214; Teng et al., Pr oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., (1983) 80: 7308-7312; Kozbor et al., Immunology Toda y, (1983) 4: 7279; Olsson et al., Meth.Enzymol., (1982) 9: 3-16. (See Rick antibodies and methods for their production).   As used herein, the term “antibody” generally refers to a whole antibody that binds to a scTCR. It refers to epiglobulin and immunologically active fragments. Immunoglobulin Brin, and immunologically active fragments thereof, have an antibody binding site (fusion protein). Peritopes) that can specifically bind to proteins. Examples of antibody fragments Then, for example, Fab, F (v), Fab ', F (ab')TwoFragments, immunoglobulin dis "Semi-molecules" obtained by reducing sulfide bonds, single-chain immunoglobulins And other antigen binding fragments (eg, Bird et al., S cience, (1988) 242; Huston et al., PNAS, (USA), (1988) 85: 5879; Webber et al., Mo l. Immunol., (1995) 32: 249). Antibodies or immunologically active fragments thereof The animal may be of an animal (eg, a rodent such as a mouse or rat) And may be a chimera (for example, Morrison et al., PNAS, (1984) 81: 6851; J ones et al., Nature, (1986) 321).   "Specific binding" and like terms are used when the molecule disclosed herein Means binding to the molecule to form a specific binding pair. However, The offspring may be prepared, for example, by Western blotting ELI SA), RIA, mobility displacement assay (mobility shif tassey), enzyme immunoassay (e nzyme-immuno assay), competitive assay, saturation assay atio nassey), or other protein binding assays known in the art It does not recognize or bind to other molecules obtained by the method. Molecules For an example of a method for detecting specific binding of, see Ausubel, et al supra; brook, et al, supra; see Harlow and Lane, supra, and references therein. I want to be.   All documents mentioned herein are by their full reference. Is adopted here.   Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not particularly limited thereto. Absent.   Example 1-Formation of a soluble scTCR fusion protein   The DNA sequence of the mouse DO11.10 cell TCR has been reported (Kappler, J . et al. PNAS (1994) 91 8462). TCR is IAdIncluded in MHC class II molecules Chicken Ovalbumin (OVA) Peptide Spanning Amino Recognizes and binds to acids 323-339. DNA encoding TCR is Prepared generally according to the methods disclosed in Kappler and Marrack, supra.   Briefly, 1 × 106DO11.10 cells were obtained from the manufacturer (Dyna Isolate using oligo-dT coated magnetic beads according to the instructions in l) Was done. The TCR α chain cDNA is a C-α specific “back” primer-KC11 3 (SEQ ID No. 6) and DO11.10 mRNA Obtained by incubating the material. To obtain the cDNA, Standard amounts of nucleotides and reverse transcriptase were then added to the mixture. Likewise Β-chain cDNA was obtained, but instead of the KC113 primer, a “back” Lymer-KC111 (SEQ ID No. 4) was used. Alpha chain cD Using NA as a template, primers KC112 (SEQ ID No. 5) and KC112 PCR reaction was carried out in the presence of 113, and 650 bp of 5′XhoI-3′XmaIα The strand fragment was amplified. The 750 bp β chain has 5 ′ and 3 ′ Primers KC111 and KC11 comprising SfiI and SpeI sites 0 (SEQ ID NO. 3).   The scTCR is a more covalently linked V-α chain than the DO11.10 TCR. It was constructed to include the V-β chain. In some cases, the V-α chain may be Fragment and C-β chain fragment (see, eg, FIG. 3, FIG. And FIGS. 6A and 6B). Generally, a Cα chain fragment contains about 9 amino acids. Had a length of The C-β chain is usually the amino acid in the full-length C-β chain. At amino acid residue 126 immediately before acid residue 127 (ie, a cysteine residue) disconnected. The inclusion of this cysteine residue is detrimental to scTCR expression. Was found. 3 'end of V-β chain (or C-β chain) fragment At the end, usually the bacteriophage gene III coat protein or bacteriophage Purification label of fusion protein encoding lyophage gene IV coat protein (Eg, EE or 6 × His) DNA was added.   Example 2 Vector for scTCR Fusion Protein Expression   The scTCR DNA obtained in Example 1 has a strong bacterial promoter (phoA ) Or inserted into a vector with a weak bacterial promoter (lacZ) . The vectors used to express the scTCR are shown in FIG. It is a pJRS149 and pKC12 DNA vector shown in FIG. 1B. these Vector enables fusion of scTCR to bacteriophage coat protein I do. For the construction of a DNA vector encoding the fusion protein, see FIG. The outline is shown below.   A. DNA vector pJRS149   pJRS149 DNA vector is pBluScriptTM(Invitrogen) backbone This is a phagemid having This vector is described in Examples 14-18 below. Soluble scTCR fusion used in a growing bacteriophage display experiment Used to produce synthetic proteins.   B. DNA vector pKC12   DNA encoding gene III was ligated into the pKC12 vector shown in FIG. 1B. It was loaned.   C. DNA vector pKC14 and vector pKC15   The gene VIII DNA sequence is used as a fd tet bacterium as a template. (ATCC No. 37000), primer OPR156 ("front "SEQ ID NO. 58) and primer OPR157 ("back") SEQ ID. NO. 59) and amplified by the PCR method. Then heredity The PCR product of the offspring VIII was transformed with Xmal-EcoR to obtain the vector pKC14. It was cloned into the vector pLL001 as an I fragment. pLL00 One plasmid is derived from PUVC-19 DNA and contains the gene VIII segment. XmaI and Eco were added to the polylinker region to allow subcloning. Contains the RI site. Also, the pLL001 vector closes out gene VIII DNA. Used as a shuttle vector for loan. Vector pKC15 A 96 bp NcoI-EcoRI fragment derived from pKC14 was And obtained by cloning into the pJRS149 vector shown in FIG. NcoI -The EcoRI fragment contains multiple cloning sites (eg, SfiI, N c oI, SpeI, XhoI and XmaI), synthetic polylinker with pel It comprises the B leader, the phoA promoter, and the gene VIII gene. Baek PKC15 uses a second pelB reader derived from the pJRS backbone. A gene clone under the control of the di-cistronic operon Enable   D. DNA vectors pKC16 and pKC18   To clone the XhoI-XmaI fragment from pKC16, The rufa chain cDNA was obtained using primer KC113 (SEQ ID NO: 6) (“F Lonto ") and KC112 (SEQ ID NO.5) (" Back ") Used as a template to amplify the TCR V-α, C-α gene. V- The β, C-β gene fragment was prepared using primer KC110 (SEQ ID NO . 3) ("front") and primer KC111 (SEQ ID NO: 4) ) (“Back”) and PCR using β-strand cDNA as a template. It was width. Subsequently, the gene fragment was used to obtain the vector pKC18. It was cloned into pKC15.   FIG. 3 shows pKC44, pKC46, and pKC used in these experiments. 1 shows a C51 DNA vector. DNA vector from pKC15 The formation is shown in FIG. 2 and its outline below.   E. FIG. DNA vectors pKC27, pKC42, and pKC44   The vector pKC27 contains the annealed primer JA301 (SEQ. D NO. 95) and JA 302 (SEQ ID NO. 96). This gives (GFourS)FourA polypeptide linker was obtained. Then, the linker Was cloned into the pKC15 vector as a SpeI-XhoI fragment. Was done. Thereafter, the V-α13.1 and V-β, C-β regions, respectively, were pK It was cloned into C27 DNA. Briefly, V-α13.1 genetics The child fragment is composed of the vector pKC16 DNA as a template and the primer K C114 (SEQ ID NO: 7) ("front") and KC126 (" (SEQ ID NO: 19) and the PCR method. Generated by The V-α13.1 gene is a SfiI-SpeI plasmid. As a fragment, it was cloned into pKC42. V-β8.2 and C -Β-strand DNA was obtained after pKC18 was cut with XhoI and XmaI. Purified. This fragment was used to obtain pKC4 vector for the purpose of obtaining pKC44 vector. 2 cloned. Generally, the pKC44 vector is a phoA promoter. ScTCR under the transcriptional control of the scTCR / gene VIII fusion protein It was configured to include it in the form.   F. pKC12, pKC45, pKC46, and pKC51 DNA vectors ー   Vectors pKC45, pKC46, and pKC from pKC12 (FIG. 2) An outline of the formation of 51 is set forth in FIG. 4 and described below. .   The pKC12 vector contains the scTCR-encoding DNA of Example 1 at 1 It was modified to be expressed under the transcriptional control of the acZ promoter. Briefly explain Then, the pKC12 vector was annealed to obtain the pKC45 vector. Primer KC134 (SEQ ID NO: 27) ("front") and And primer KC135 (SEQ ID NO: 28) ("back") 12 was modified by cloning. With this modification, Sfi Polylinker of pKC12 comprising an I site (site) and an EcoRI site An Xmal site was added to the region. Also, pKC45 is EE-standard Encodes the gene VIII attached to the 5 'end of the sense and the amber stop codon DNA sequence.   The amber stop codon is lacI such as XL1-blue.qAmber sap In the lesser host, the expression level of the scTCR fusion protein is reduced by about 15-20%. Let down. The DNA encoding the scTCR / gene VIII fusion protein is p For cloning into KC45, pKC44 DNA contains SfiI and Xm It was divided (cut) by aI. Thereafter, the scTCR fragment generated pKC46. To obtain it, it was cloned into pKC45 after gel purification. pKC46 The scTCR insert into the EE-tag, as shown in FIG. It is fused with an outer shell protein.   The scTCR / gene VIII fusion protein is a pKC44 and pKC46 vector. Digestion (cut) with XmaI and EcoRI gives a lacZ pro It was placed under motor transfer control. The DNA sequence of gene VIII can be found in the vector pKC To obtain 51, isolated from digested pKC44 DNA, SfiI and The DNA is purified by gel-purified vector DNA pKC46 as an XmaI fragment. It was loaned. Thereafter, the scTCR insert in the vector pKC51 is: It was fused to the gene VIII coat protein, as shown schematically in Figure 3c. Vector -Unlike pKC46, the pKC51 vector is EE-tagged and inverse Does not contain top codons.   Example 3-DNA vector pEN2 for DNA encoding fusion protein Cloning to   The expression of the soluble scTCR generated in Example 1 was as shown in FIG. 2 by subcloning into a vector. pEN2 vector Is the phoA promoter, the gene 10 ribosome binding site, and the modified pel It has a B reader. Soluble scTCR insertion in pEN2 vector format The input fragments are shown schematically in FIGS. 6A and 6B and are described below. FIG. 6A In 6B and 6B, the DNA vector is constructed from the pEN2 vector.   A. Construction of DNA vector pKC60   The pKC60 vector contains a 1204 bp SfiI-EcoRI fragment. Obtained by introduction into pEN2. SfiI-EcoRI fragment Consists of V-α, V-β, and C-β regions (domains). This hula The primer KC114 ("front" SEQ ID NO: 7) And JWTCR 208 ("Back" SEQ ID NO: 75) It was obtained by amplifying pKC51 DNA as a plate (template). The JWTCR209 primer has an EE-label and Xma at the 3 'end of the C- [beta] region. It contains an I site (site). The addition of the XmaI site is dependent on gene III and genetic The cloning of offspring VIII was promoted. The pKC60 vector contains the scTCR described above.   The XmaI-EcoRI fragment was cloned into the pEN2 vector. And obtained by   B. Construction of DNA vector pKC61   To form a truncated scTCR, the V-α of vector pKC46 and The V-β sequence was prepared using primer KC115 (“front” SEQ ID NO: 8). And PC using JWTCR209 ("Back" SEQ ID NO: 74) Amplified by the R method. The formed PCR amplification product is stored in the vector pKC60. This resulted in the vector pKC61. pKC61 vector Is further modified by adding a 6XHis tag to the 3 'end of the EE tag sequence. Received.   C. Construction of pCK62 and pKC64 DNA vectors   The DNA encoding bacteriophage gene III is a pKC64 vector DNA as a template and primer TCR215 (SEQ. Amplified using ID NO 68) and 218 (SEQ ID NO 64). Was. Subsequently, the DNA was cloned into pKC60 and the vector pKC64 I got The gene VIII gene was prepared using the vector pKC51 DNA as a template. And primers TCR212 (SEQ ID NO 71) and 2 13 (SEQ ID NO 70) to obtain the vector pKC62 Cloned into pKC60.   D. Construction of DNA vectors pKC63 and pKC65   Gene III (pKC65) and gene III (pKC63) fusion proteins After the corresponding gene fragments are amplified by PCR, It is cloned into the backbone pKC61. Thereby, pKC65 and Both pKC63s have the 6XHis tail encoded in their primer sequences. Will be included.   E. FIG. Construction of pKC66 and pKC67 DNA vectors   The pKC66 and pKC67 vectors contain a V-α chain fragment, and a C- SfiI-SpeI flag comprising the first eight amino acids of the α chain fragment Fragment with pKC51 DNA as a template and primer K C114 (front SEQ ID NO: 7) and JWTCR217-β ( Back SEQ ID NO: 66). p To obtain KC66 and pKC67 vectors, KC114 and JWTCR TCR DNA was amplified by PCR using the 217-β primer. So After that, the amplified DNA is placed in pKC62 or SfiI and SpeI. Was subcloned into pKC60 previously digested with These vectors are Each contains eight amino acid residues counted from the N-terminus of the C-α region. This These vectors are used to form the TCR library described below. Baek Ter pKC66 contains the gene VIII gene.   The DNA vectors pKC46 (pSUN18) and pKC62 (pSUN19) ) Is the Budapest Treaty of 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. About) deposited with the American Type Culture Collection (ATCC) You. These DNA vectors were deposited with the ATCC on February 26, 1997 and cession Nos. 97895 (pSUN18) and 97896 (pSUN19) . The DNA vector pKC62 (pSUN19) contains the phoA promoter, modified p ElB sequence, gene 10 ribosome binding site, and bacteriophage gene VIII promoter. DNA vector pKC46 (pSUN18) lacZ promoter, EE tag, and bacteriophage gene III protein Comprising quality. These DNA vectors are E. coli. E. coli, or It can be grown in other suitable host cells by standard methods.   The DNA vectors pKC46 (pSUN18) and pKC62 (pSUN19) ) Contains various Vα, Vβ-Cβ and polypeptide linker sequences (accomod ate) Designed to be possible. The Vα chain of both of these DNA vectors contains SFiI and It can be excised by restriction digestion of spleen SpeI. The vβ-Cβ chain is XhoI -Can be excised by restriction digestion with XmaI. In addition, these DNA vectors In the first, the exchange of peptide linker sequences was performed by restriction digestion of SpeI and XhoI. Exchange is possible.   Example 4-Regulation of TCR fusion protein expression   1. phoA promoter   XL1-B cells were transformed with the vector pKC44 containing the phoA promoter. Was done. Transformed cells prevent scTCR fusion protein induction. The cells were grown overnight in a medium containing phosphoric acid. When phosphate is removed from the medium, scT The CR / gene VIII protein is expressed. Grown overnight in a shaker flask Subsequently, the cells were washed several times in phosphate-starved medium. Generation of scTCR fusion protein The current begins by resuspending the washed cells in phosphate-starved medium. Was. After 4 hours of induction, cells were harvested. Usually 4 hours of induction, Appropriate levels of soluble scTCR / gene that can be analyzed by Tan blot analysis A VIII fusion protein is provided. scTC under phoA promoter control Higher yields of R / gene VIII fusion protein (eg, between about 10-400 mg ) Is to transfer cells to a 3-10 liter fermentor or bioreactor It is obtained by propagation in other large-scale production containers.   Generally, vectors containing the phoA promoter are compatible with other promoters such as Lac. Used more favorably than vectors containing In addition, expression using the pEN2 vector Present is particularly preferred for a number of reasons. For example, the pEN2 vector In addition to the hoA promoter, contains a gene 10 ribosome binding site that enhances translation In. The pEN2 vector is E. coli. modified to include preferred codons for E. coli It further contains a decorated pelB leader peptide. Modified pelB Lee The sequences and peptides are illustrated in SEQ ID NOs: 129 and 130. ing. The Western blot shown in FIG. 7 shows that such a modification shows that the scTCR fusion This shows that the expression of the protein is greatly improved, about 10 to 50 times.   The Western blot shown in FIG. 7 shows that the anti-EE-labeled antibody (1: 5000 dilution) was used. Probe followed by a goat anti-mouse HRP antibody (1: 20,000 dilution). Probed. Visualization is performed using standard immunological techniques. Was. Lane 1 shows the molecular weight marker (Amersham). Lane 2 is 1 5 microliters of 0 OD / ml pKC60 derived scTCR (induced) Show. Lane 3 is the same as lane 2 except that it is derepressed. One condition. Lane 4 shows 10 OD / ml scKCR derived from pKC51 (EE Shows 5 microliters (no label). Lane 5 shows 50 OD / ml IPTG. 5 shows 5 microliters of the pKC46-derived scTCR induced in.   2. LacZ promoter   scTCR / gene III (vector pKC46) and scTCR / gene VII The I (vector pKC51) fusion protein was placed in an approximately 3 liter fermenter. Was expressed. scTCR fusion protein under transcriptional control by phoA promoter Expression of the protein is more frequent than when a vector containing the Lac promoter is used. Amount of fusion protein was produced. Thus, scTCR fusion proteins are commonly used Was expressed using a vector containing the phoA promoter.   Example 5-Expression of scTCR fusion protein system   Some E. coli strain (strains: XL1-B, MM294, TB1, UT 5600 and K91Kan), the generation of the scTCR fusion protein Analyzes were made on performance. The above host cell line is the scT It was transformed with pKC60 to express the CR fusion protein. All shapes Transformed lines were adapted to grow in phosphate medium at 30 ° C. scT Induction of the CR fusion protein is performed by growing in a phosphate-deficient medium. Was. The level of scTCR expression was determined by Western blot analysis shown in FIG. Was done. In FIG. 8, lane 1 shows a molecular weight marker (Amersham). Lane 2 is a 10 OD / ml MM294 lysate (pKC60) 4 microphone Indicate liter. Lane 3 is the lane except that the host strain is K91Kan. The conditions are the same as those in the second condition. Lanes 4-6 also show that the host strains are XL1-B, TB 1 and the same conditions as in lane 2 except that they are UT5600. all Was prepared from phoA-induced cells in a soluble cell fraction. Simple Briefly, Western blots were run on 12% SDS-PAGE gels. By adding 5 μl of a cell suspension of 5 OD / ml of the transformed cells, Subsequently, they were transferred to blots by standard Western blotting. scT CR is Gernot Walter's Lab of the University of San Diego, San Diego Calfornia to probe blots using anti-EE labeled antibodies approved by Ratory Detected in. Separately, use other anti-EE labeled antibodies and EE labels (Eg, those obtained from pharmacia). After binding the antibody, A conjugate labeled with anti-mouse HRP (Jackson Laboratories) was added. Was. Expression of the scTCR fusion protein is maximal in the K91Kan strain. (FIG. 8).   Example 6-Purification of scTCR fusion protein   A fusion protein encoded by the vector pKC51 Purified from transformed cells by affinity chromatography. Figure 9 And affinity chromatography of scTCR / gene VIII fusion protein 1 schematically illustrates purification by E.   Briefly, purification was performed on protein-A coated Sepharose beads. 1 ml of hamster anti-mouse αβ TCR antibody H57-597 (ATTC  Accession HB-218) is coupled with 5 mg for chromatography. This was done by creating a column for the key. E. FIG. coli lysate 50 g of the cell paste removed from the mentor was added to a lysis buffer (0.05 M Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl and 5 mM EDTA). The cells after resuspension were lysed by a French press in two routes. Insoluble substances And removed by centrifugation at 10,000 G for 20 minutes. The supernatant is kept And applied to the antibody column at a flow rate of 0.2 ml / min. After that, the column The scTCR fusion protein, washed and washed with 20 column volumes of PBS, It was eluted with 0.1 M glycine (pH 3.0) and its 1 ml fraction was s Collected in tubes containing 0.05 ml (pH 8.0). Fraction containing scTCR Were pooled and dialyzed overnight with 4 liters of PBS. The next day, purified The protein was analyzed using a centricon filtration device (mw 100 cutoff) for 5 days. Concentrated to 10-fold.   The purity of the scTCR protein obtained was determined by electrophoresis on an SDS-PAGE gel. And then assessed by Coomassie Brilliant Blue staining. Protein Quality integrity is determined by antibody H57-597 or anti-Glu-Glu (EE) labeled antibody Was determined by Western blot analysis using as a probe. EE antibody , A linear epitope consisting of 9 amino acids, EEEEYMPME (SEQ ID NO 98) (FIG. 10) ) Recognize. Two other antibodies that bind to the V-β8.2 conformational epitope ( MR5-2 antibody and F23.1 antibody (PherMingen)) Used for purification of protein. Also, Ni2+NTA affinity chromatography To facilitate purification of the scTCR protein by chromatography, 6X His A tail has been added to some structures (see FIG. 6A).   FIG. 10 shows pKC51 (lane 2), pKC46 (lane 3), H57 antibody Lam purified pKC46 (lane 5), refolded on H57 column. Expression of the purified and purified scTCR protein from pKC46 (lane 6). It is a representation of the Western blot shown. In lane 7, lane 1 or Approximately 5 times the amount of the fusion protein was given as compared to 6. Molecular weight markers are This is shown in FIG. The soluble column fraction (lane 1) and the insoluble column fraction (lane 1) The flow through from lane 10) is also shown. Lanes 4 and 8 are blank It is. The blot used a 1: 5000 dilution of anti-EE labeled monoclonal antibody. And then using a 1: 20,000 dilution of goat anti-mouse HRP antibody. Visualized. Coloring was performed by standard methods.   Example 7-characterization of scTCR fusion proteins   For characterization of scTCR fusion proteins, anti-αβ TCR mAbs Flannel was used. H57-597, a hamster mAb, is located on the C-β region. Recognize the epitope. A competition test was performed and MR5-2 and H57-597 Competitive effects were shown. This means that epitopes conjugated by individual antibodies are proximal Is suggested. Nine amino acids engineered into the same TCR molecule Specificity for EE sequence consisting of amino acids and gene III and gene VIII proteins Polyclonal sheep having anti-bacteriophage serum (Phermacia), etc. Other antibodies were also used for scTCR characterization.   A. Molecular weight   The scTCR / gene VIII fusion protein expressed from the vector pKC51 is , 12% SDS-PAGE gel, followed by Coomassie Blue (see FIG. 11). )). In FIG. 11, lane 2 shows 10 OD / XL1-B cells. 1 shows a fusion protein produced from a ml culture. Lane 3 in FIG. Figure 5 shows a flow-through from an H57 antibody column used to purify CR. Figure Middle lane 4 shows the purified scTCR from the column. Lane 1 in FIG. Shows the amount marker. The observation of the gel showed that the scTCR fusion protein was Was moved to a position of about 46 kD. The result is scTC R indicates completeness.   The western blot shown in FIG. 12 shows a protein with a molecular weight of 46-50 kd. Quality, EE-tagged, bacteriophage protein, or Probes were performed with antibodies that bind to each of the pitopes (FIG. 12). Other DN The scTCR fusion protein produced from the A vector was analyzed in a similar manner. Was.   B. Conformational Folding   The fusion protein encoded by the pKC60 DNA vector -V-β8.2 antibody (MR5-2 and F23.1) and anti-idotype mab K Performing a binding assay using J1 (courtesy of Dr. Kappler and Marrack) Tested the suitability of the folded structure. scTCR fusion tamper The protein was incubated overnight at 4 ° C. with anti-V-β8.2 antibody and the next day GI was coupled with anti-mouse coated magnetic beads (Dynal). This Were incubated for an additional hour at room temperature (RT). Immune complexes Was sedimented by standard procedures. The beads are then replaced with non-specifically bound proteins. Carefully with 0.5 ml of PBS + 0.5 M NaCl to remove protein Was washed. After four washes, the magnetic beads were converted to β-2 mercaptoethanol. 50 μl crackers with SDS with or without knol And re-suspended in boiling buffer for 3 minutes each. Next, magneto The beads were removed and the solution was subjected to 12% SDS-PAGE, and Exposed for one hour. Thereby, the sample was electrophoresed. Then, get The resulting blot was purified using an HRP-labeled anti-TCR antibody (obtained from Phermingen). H57) or by probing with an anti-EE labeled antibody Western blot was performed (FIG. 13).   FIG. 13 shows Western probed with a 1: 5000 dilution of anti-EE labeled antibody. Blot followed by a 1: 20,000 dilution of goat anti-mouse-HRP It shows the result of visualization with liquid. Culture of both pKC60 and pKC62 Nutrition was induced by phosphate deficiency. Lane 1 shows 10 pKC soluble fractions. Shows 10 microliters of OD / ml sample. Lane 2 is MR5-2 mono PKC60-derived scTCR fusion protein formed by clonal antibodies FIG. Lane 3 shows that, except using MAbF23.1, The immunoprecipitation obtained in the same manner as in Lane 2 is shown. Lane 4 is from MAbKJ1. FIG. 4 shows the immunoprecipitation of the formed pKC60-derived scTCR fusion protein. It is. Lanes 5 to 8 show that the scTCR fusion protein derived from pKC62 was analyzed. Except for what has been done, they correspond (similarly) to lanes 1-4 in order. All of Lanes are from induced cultures. The scTCR protein is conformational Have the correct V-β part in the data.   3. Surface plasma resonance analysis (BiaCore)   The scTCR fusion protein encoded by pKC51 is a surface plasmid Its characteristics were further analyzed by MA resonance analysis (FIG. 14). Fusion proteins First, a biosensor coated with the scTCR molecule with the MR5-2 or H57 antibody was used. Detected by conventional sandwich assay, capturing on surface chips. This inspection Delivery was generally performed according to the manufacturer's instructions (Phermacia). Generally, one of the antibodies Was used to capture the scTCR fusion protein, the other antibody was Used to form sandwich composites. The two antibodies have different β chains The data show that the region recognizes and competes for binding to the scTCR. Incited (FIG. 14). FIG. 15 schematically illustrates the interaction. scTCR is anti- It is also possible for the M13 antibody to be further bound, which means that scT Indicates that bacteriophage protein is present on the CR fusion protein ing.   Superantigens (eg, SAg) are not displayed in MHC format. Relatedly, it can bind several V-β chains. The interaction between TCR and SAg Occur in the highly variable 4 (HV4) region of the V-β chain. Mutual interaction between SAg and HV4 region The effect depends on the conformation. Therefore, scTCR protein is coated on the chip Surface plasma resonance analysis was used to determine if it could bind to the (Fig. 16). SAg is known to bind to TCR V-β8.2. You. The highest affinity reported among surface plasma resonance analyzes was 5 × 10-FiveMolar, and this interaction is described as TCR-MHC / peptidic. Comparable with the tide interaction.   Streptococcus SA known as SEC3 (Toxin Technology, Tempa FL.) g was attached to the chip using standard amine coupling chemistry techniques. Refined The scTCR fusion protein is used at a concentration of about 2 μM to 16 μM and at a flow rate of Passed over the chip at 2 μl / min. As a control, the fusion protein Measurement of non-specific binding between SEC3 and blank chip The experiment was performed in parallel with the measurement of the specific binding to. Coupling data between two chips By summarizing the differences in scTCR binding. The data is A specific phase between the scTCR fusion protein and the SEC3 SAg on the chip It showed that there was interaction. In addition, these data support antibody binding data Suggesting that the scTCR comprises a conformationally correct V-β8.2 region. (FIG. 16).   Example 8-Fusion protein in OVA-specific T cell hybridoma binding assay Quality activity   To investigate the function and biological effects of the scTCR fusion protein, a cell-based A competitive (competitive) inhibition assay was used. Generally, antigens captured in MHC molecules Purified from Example 4 above to block DO11.10 cells from The protein (from T cell hybridoma DO11.10) was used. Interaction Was detected by measuring the production of IL-2.   As described above, assays to test the functionality of scTCR fusion proteins Examples of the above are published PCT Application No./US95/09816, and No. 08 / 382,454 and 08 / 596,387 It is listed. In particular, the above-examined U.S. patent application Ser. No. 08 / 596,387 includes , T cell hybridoma cell assay, cells used in the assay (eg, DO11 . 10), sc-MHC class I and II molecules, especially covalently bound or Is a non-covalently attached presentation peptide (eg, OVA or HSVgD12 Sc-MHC IA having peptidedClass II molecules have been disclosed.   A) T cell hybridoma cell assay   T cell hybridoma test to test the functionality of scTCR-derived protein molecules The published PCT Application No./US95/09816 above, and the United States under review Patent application serial numbers 08 / 382,454 and 08 / 596,387 Have been.   Briefly, the DO11.10 T cell hybridoma line is a chicken trio. OVA peptide fragment consisting of 17 amino acids derived from boalbumin (amino Acids 323-339) express cell surface T cell receptors with specificity. O VA peptide is synthesized by APC expressing mouse class II MHC molecule I-Ad. , DO11.10 cells. The peptide is presented by the appropriate APC In response, DO11.10 cells respond to produce IL-2, which is indicative of T cell activity. Can be used as an indicator of gender. The following is an example of a T cell hybridoma cell assay. Briefly shown below.   The sc-IAd / OVA complex is DPBS (Mg2+And Ca2+Ion free ) And passively supplied to the wells of a 96-well plate. The sc-IAd / OVA peptide contains a covalently linked presentation peptide. Is preferred. After overnight incubation at room temperature, the wells were2+And C a2+Washing may be performed twice with ion-free DPBS. About 1 × 10FiveDO11.1 0 cells may be present in wells supplied with 0.5 μg MHC / peptide molecules. Is incubated for 4 hours or 7 hours at 35 ° C. in the absence.   To further demonstrate the specificity of the scTCR fusion protein, the IAd restricted form Uses a second T cell hybridoma (gD), but which recognizes the HSV peptide You can also. The gDT cell hybridoma is disclosed in the above pending US patent application It is disclosed in serial number 08 / 596,387. This test must: Done to demonstrate. That is, the scTCR fusion protein is DO11 . 10 can inhibit IL-2 production by hybridoma cells, while gD1 For the production of IL-2 by 2T cell hybridomas, if any, This is to demonstrate that it has a very small inhibitory effect. Culture is performed in complete medium ( Add 10% FBS, penicillin / streptomycin, and L-glutamine RPMI 1640) on a 96-well flat bottom microplate . After 4 or 7 hours of incubation, the presence of IL-2 was determined. The supernatant of the culture was analyzed by the IL-2 sandwich ELISA method.   A suitable IL-2 detection protocol is described in published PCT / US95 / 0981, supra. 6, and pending US patent application serial numbers 08 / 382,454 and 08 / 596,387. IL-2 sandwich E performed here The protocol of the LIZA method is basically the one described in PharMingen. is there. Briefly, wells contained 2 μg / ml rat anti-mouse IL- 2 Coated with 50 μl of antibody. After incubating the antibody at 4 ° C overnight, It is bonded to the plastic by passive diffusion. Plate is PBS / 0.5% T Washed twice with ween-20. Then, 100 μl of cell culture supernatant Is added to each well and incubated for 4 hours at room temperature. afterwards, The plate contains biotinylated rat anti-mouse IL-2 antibody, That is, before the second antibody was added, it was washed 6 times with PBS / Tween. You. The antibody is incubated for 1 hour at room temperature, after which the plate is Washed 6 times with BS / Tween. Finally, 25 μg / ml of strepavidn 100 μl of peroxidase is added to each well and incubated at room temperature for 30 minutes Is done. After washing 8 times with PBS / Tween, 100 μl of ABTS substrate was added. , The signal is read at OD 405 nm. The concentration of produced IL-2 was Quantified by plots against tandard curves. DO11.10 and g IA for activation of D12 cellsd/ Optimal dose of peptide molecule is maximal response It promotes a slightly lower response than that. Therefore, the experiment was performed with 0.5 μg I-Ad / Wells coated with peptides and 4 or 7 hour incubations It can be done in a solution.   The soluble scTCR fusion protein of the present invention has a concentration of 10-9-10-FourM Ability to block the production of IL-2 in DO11.10 cells within the range Testable for power. The test was performed with soluble scTCR coated on a plate. Of the soluble I-Ad / peptide molecule is about 10: 1 to 1: 1. It can be done within a range. The concentration can be adjusted as needed. Expectation The pre-incubation in the presence of the soluble scTCR fusion protein After the reaction, the IL-2 production of DO11.10 is reduced as compared to gD12. This indicates that the soluble scTCR fusion protein activates a TCR-specific immune response. Indicates that suppression is possible.   TCR has a low binding affinity for MHC / peptides, so That decrease in IL-2 production using scTCR fusion protein can always be observed Not exclusively. However, the affinity of the interaction depends on the multivalent scTCR fusion protein Can be increased. Increases affinity of scTCR fusion proteins Binding to the MHC / peptide complex It is believed that less TCR will be given the opportunity to do so.   Example 9-Preparation of multivalent fusion protein   There are several well-known methods for making multivalent molecules. Multivalent fusion protein The quality is determined by biotinylating the scTCR in a standard manner, followed by It is obtained by crosslinking after adding ptavidin. According to biotin-streptavidin junction Usually, a tetrameric multivalent fusion protein is formed.   Multivalent fusion proteins can be prepared by known methods (eg, Newman, S.L. et al., J. Immunol). l. (1995) 154, 753). ces, Inc. Warrington, PA). For example, scTCR fusion proteins can be conjugated via an amine or disulfide group. Can also be directly coupled to The denaturation of scTCR is achieved by adding latex beads to stCCR. By coating with an antibody that specifically binds to repavidin or scTCR Can be minimized. For example, as described above, the scTCR contains an EE-label. If desired, EE-labeled antibodies can be used to coat latex beads.   Example 10-scTCR fusion for antigen-stimulated T cell expansion in vitro Effect of protein   For the soluble fusion protein formed in each of the above examples, the antibody-stimulated T cells It can be tested for its ability to inhibit proliferation. Examples of such tests are published above PCT Application No./US95/09816 and US Patent Application Serials Under Examination Nos. 08 / 382,454 and 08 / 596,387.   This published PCT application no./US95/09816, and US patents under examination. Nos. 08 / 382,454 and 08 / 596,387. In one approach, T cells are isolated from all mammals, including mice. Can be. For example, 50 μg OVA323-3 in complete Freund's adjuvant. Immunization from the base of the tail by subcutaneous injection with 39-KLH gave B OVA-primed T from ALB / c mice (MHC class II: I-Ad) Cells can be obtained (see Harlow and Lane, Supra). For example, 2 at 7 day intervals One immunization can be performed, and one week after the second injection, the mice are released. After necropsy, the inguinal and lymph glands are removed and dispersed to obtain a single cell suspension. Can be The single cell suspension is then applied to a nylon wool and Sephadex G-10 column. Incubation with removes antigen presenting cells. Refined T fine The vesicle group contained only the Click's medium or s dissolved in the Click's medium. It is further incubated with the cTCR fusion protein.   Activated B cells from BALB / c mice were converted to a conventional B cell proliferation assay (assay). Used as an antigen-presenting cell. For example, B cells are prepared by the following method. Immediately Then, 50 μg / ml of LPS (ie, liposaccharide) was added to the spleen cells for 4 hours. Incubate for 8-72 hours. After completion of the culture, the activated cells were removed from Ficoll / Hypaque (P harmacia) (density gradient centrifugation). Then activated B cells were pulsed for 3 hours in the presence of the OVA323-339 peptide, strictly After washing, add paraformaldehyde to inhibit the proliferation of B cells and fix it. Purified T cells alone or T cells and soluble scTCR fusion proteins (Selected Methods in Cellular Immunol. (1980) B.B. . Mishell and S.M. Hiigi W.H. Freeman and Co. (Mainly San Francisco) .   The standard B cell proliferation assay was performed at 37 ° C., 5% in a 96-well round bottom microplate. COTwoIt is performed under conditions for 3-5 days. In a well, WST-1 (Boehringer After adding the reagent (mannheim) and pulsing for 4 hours, the culture is terminated. afterwards Record the optical density of the culture. Occurred in mice after immunization (immunization) THCell response (ie, clonal expansion) depends on the degree of proliferation of peptide-reactive T cells. More shown.   Example 11-scTCR for antigen-stimulated T cell expansion in vivo Effect of fusion protein   In addition to the soluble fusion protein, additional in vivo T cell clone The growth inhibition test is performed according to the method described in the following application. That is, the public PCT country Application No. US95 / 09816, U.S. Patent Application Serial No. 08/3 Under Examination 82,454, and 08 / 596,387.   For example, three test groups are prepared as follows. That is, 15 B For ALB / c mice, OVA3 mixed in complete Freund's adjuvant Approximately 10-100 μg of 23-339-KLH is administered by intraperitoneal injection (IP) And induce an immune response against the OVA323-339 peptide. OVA-KL One day before and two days after immunization with H, 5 mice were treated with anti-OVA / I -Ad scTCR fusion protein added to PBS was added to Administer -100 μg. This scTCR is for I-Ad / OVA MHC class II TCR molecules on antigen-specific T cells bind to I-Ad / OVA on APC Inhibits or eliminates binding to molecules. The remaining 10 mice were Used as a tool. For example, 5 mice receive PBS and the other 5 mice Give scTCRs with different specificities. Mice are 10 days after immunization Dissect. A single cell suspension is prepared by removing the lymph nodes and dispersing them. To make. The suspension is incubated on nylon wool and Sephadex G-10 color The antigen-presenting cells are removed from the suspension by exposure to a suspension.   The obtained purified T cell group was pulsed with the OVA323-339 peptide. The applied APC is added and the purified T cell population is incubated. BALB / c mau Activated B cells from yeast cells are used as APCs in a proliferation assay. B cells Is prepared by the following method. That is, 50 μg / ml LPS was added to mouse spleen cells. Incubate for an additional 48-72 hours. After the culture is completed, the activated cells are Isolate by density gradient centrifugation using Then, the activated B cells are treated with OV. Add A323-339 peptide and pulse for 3 hours, wash rigorously, , Fixed by adding paraformaldehyde to inhibit the proliferation of B cells, Add to purified T cells.   The T cell proliferation assay was performed at 37 ° C., 5% CO 2 in a 96-well round bottom microplate.Two Perform under conditions for 3-5 days. Add WST-1 reagent to wells and pulse for 4 hours After incubation, the culture is terminated and the absorbance at different wavelengths is read. Immunization The Th cell response that occurred in later mice (ie, clonal expansion) was As indicated by the degree of proliferation of peptide-reactive T cells in the cell. What is expected is OV Immunization with A-KLH or HSV-KLH and scTCR The administration of the fusion protein limits the amount of clone growth, Subsequent expansion of the OVA-reactive T cell line in vitro is due to HSV-reactive T cell lines. Is restricted without affecting the growth of the vesicle system.   Example 12-Inhibition of autoimmune disease in mice   Experimental allergic encephalomyelitis (E AE)) is an autoimmune disease in mice and is generally an animal corresponding to multiple sclerosis. It is considered a model. Encephalitis regions of two proteins, ie myelin salts Basic protein (MBP amino acids 91-103) and proteolipoprotein (Proteolipoprotein) (PLP amino acids 139-151) (Mainly refer to Martin, R. et al. Ann. Rev. Immunol. (1992) 10: 153. See).   In the SJL mouse strain, the induction / onset of EAE depends on the immunity induced by the encephalititis peptide. Or adoptive transfer of MBP-reactive T cells. Soluble Anti-MBP91-103 T cell receptor (receptor), or soluble anti-PL Any of the P139-151 T cell receptors can be treated to activate T cells. To determine whether the development of EAE after sexualization is prevented, SJL mice were MBP91-103 reactive T blasts and PLP139-151 reactive T blasts Is administered in vivo. Suitable for detecting T cell proliferation in such mice An intelligent method is described in the following application. That is, the published PCT international application number No. US95 / 09816, US Patent Application Serial No. 08 / 382,454, and And 08 / 596,387.   Published PCT International Application No. US95 / 09816, U.S. Patent Application Real numbers 08 / 382,454, and 08 / 596,387 are further described below. The contents are described. That is, to induce EAE in SJL mice, SJL mouse For dorsum, MBP91-10 in complete Freund's adjuvant 3 is administered at about 400 μg to immunize. After 10-14 days, it was partially drained ( regional draining) Collect lymphoid cells as described above and place in a 24-well plate Incubate with The concentration of the cells is 6 × 10 6 cells / well61.5m 1 RPMI 1640 medium / 10% fetal bovine serum / 1% penicillin / strep Culture in 50 μg / ml of tomycin / MBP. Stimulate in vitro for 4 days After feeding, MBP91-103 reactive T blasts were transformed with Ficoll / Hypaque density gradient (Ph armacia), washed twice in PBS, 1.3 × 107Of the cells Administer to individual mice.   Mice given encephalitic MBP91-103 reactive T cells also had the following: Is administered. That is, about 1 scPCR fusion protein specific for MBP91-103 00 μg (IAs context), PLP139-151 specific scTC 100 μg of R fusion protein (negative control) or physiological saline (Sham control) on the same day, 3 days and 7 days later, It is administered by injection (i.v.) (total dose 300 μg). Subsequently, clinical evaluation Or perform histological evaluation and have reactivity to MBP91-103 + IAs Confirm that the scTCR molecule inhibited the development of EAE in mice.   Published PCT International Application No. PCT / US95 / 09816, U.S. Patent Nos. 08 / 382,454 and 08 / 596,387. Induces EAE in SJL mice by PLP peptide 139-151 For this, PLP peptide 139-151 dissolved in PBS and mycobacteria Complete Freund's adjuvant containing Mycobacterium tuberculosis H37Ra at 4 mg / ml. The mixture mixed at a ratio of 1: 1 is administered to the mouse for immunization. This Mice receive 152 μg of the peptide-adjuvant mixture. The same day After 48 hours, all mice receive 400 ng pertussis toxin. Then E Adoptive transfer of AEs is performed as described above.   According to the method described above (see Example 1), TCR DNA was replaced with normal SJL mouse. Obtained from SJL mice with disease and EAE disease. Then, using TCR DNA, Build the cTCR. scTCR is a bacteriophage coat protein or Is ligated to an appropriate DNA vector having the fragment. So Followed by a PLP-reactive scTCR peptide fusion or MBP-reactive scTCR The peptide fusion is expressed and, if necessary, purified according to the above examples. And , A test for the ability to prevent the onset of EAE against these scTCR peptide fusion proteins I do.   As described in Examples 14 and 15 below, the PLP scTCR fusion protein Quality and MBP scTCR fusion proteins using bacteriophage You can also create a spray library. The scTCR bacteriopha MBP (91-10) from the Mobile Display Library in collaboration with IAs. 3) Receptor binding to peptide or PLP (139-151) peptide To screen. As described in more detail in Example 15 below, The bound scTCR fusion protein can be purified using a suitable panning technique. ). The scTCR fusion protein thus obtained is compatible with Used to generate soluble scTCR fusion proteins. And this soluble scTCR Evaluation of the inhibitory effect of the fusion protein on autoreactive T cells in SJL mice Do the price.   Example 13-Improvement of affinity of scTCR antigen binding region   For high affinity scTCR fusion proteins, TCR and MHC / pepti An effect of suppressing or eliminating an undesired interaction with the metal complex is expected. Misplacement Desired interactions include, for example, autoimmune diseases, allergic diseases, and transplant rejection It occurs in the reaction. High affinity scTCR fusion proteins are examples For example, T cells with TCR compete with the corresponding native TCR for MHC / It suppresses or eliminates binding to APC having a peptide molecule. Or the s cTCR molecules suppress binding to superantigens. The native TCR is Due to weak affinity and fast dissociation rate, many scTCR fusion proteins It is believed that it can interact with a single MHC / peptide molecule.   Activate self-reactive T cells using high affinity scTCR fusion protein Binding to the MHC / peptide molecule can be suppressed or eliminated. this In order to achieve, genetic engineering (for example, induction of site-directed mutation or Induction of linker scanning mutation (site directed or linker scanning mutagenesis) ) To improve the affinity of the scTCR fusion protein, especially the dissociation rate This is realized by improving. Traditional binding assays measure the dissociation rate of a protein It has been done to study. of an antigenic peptide that specifically binds to the scTCR If the sequence is known or can be determined immediately, the peptide Can be used, for example, to induce alanine scanning mutagenesis. Mutate to identify residues that specifically bind to the CDR3 region of the scTCR You. Binding of the mutated antigenic peptide to the scTCR was determined by the binding assay described in this application. Evaluate by standard. Therefore, the amino acid residues identified in this peptide are Allows identification of contact residues in scTCR molecules. Like Alternatively, the scTCR protein mutant generated by this method is The specificity of binding to the original and the affinity of the antibody. Improved scTCR As a method for producing a fusion protein, a mutant fusion protein is used as described above. It is done by production.   The improved scTCR fusion protein was prepared using the bacteriophage described in the Examples below. ・ Use display libraries to generate self-reactive scTCR fusion proteins It can be produced by isolation. And bacteriophage display Peptides obtained from PLP and MBP proteins using libraries IAs molecules that are covalently linked to the tide can be captured. Once the scTCR is isolated The scTCR protein mutant then allows the peptide Further characterization of the contact residues can be performed.   Example 14-Generation of a bacteriophage display library   In Example 1 described above, the DNA vectors pKC46 and pKC51 were used. After IPTG induction, the scTCR fusion protein was placed on the bacteriophage surface. Displayed (presented). Raw Bacteriophage Display Library Is generally known and can be used to produce polypeptides up to about 50 KD. Can display proteins (Smith, G.P. and Scott, J.K. in Methods in Enzymology (1993) 217: 228).   Briefly, 2 × Luria Broth (LB) + 0.5% glucose and 100 μl g / ml of ampicillin in a flask containing E. coli strain, XL1-B cells containing pKC46 or pKC51 were inoculated. Overnight After lengthening, the cells were pelleted by centrifugation and 2x LB without glucose. Again. The cells were centrifuged again and washed twice in 2 × LB. Second time After washing, cells were suspended again in 50 ml of 2 × LB, and IPTG was added thereto. The final concentration was 1 mM. After allowing the cells to grow for 2 hours at 37 ° C., The bacteriophage VCSM13 was added to 10 pfu per 5 ml of cell culture. added. 15 minutes later, mixture of XL1-B cells and helper bacteriophage Was heated to 2 containing tetracycline, ampicillin, and 1 mM IPTG. Diluted 50-fold in xLB. After growing for 1 hour at 37 ° C, the culture is harvested. Cells infected with helper bacteriophage were selected by adding namycin. Fine Cell cultures are grown overnight and the next day, a two-stage PEG precipitation is performed before Teriophage was purified. Purification to remove large amounts of residue from the sample The prepared bacteriophage preparation was filtered through a 0.2 micron filter. further , 100 centricon membrane (100mw cut) Off) in 1% FBS / PBS to remove residual PEG. Removed from lyophage preparation. Bacteriophage titers Growing colonies were counted and determined. The determination of this titer 10-fold serial dilution of the sample, and the diluted sample and XL1-B cells with excellent infectivity Was mixed, and the mixture was placed on 2 × LB agar containing ampicillin. Ba The titer of Cteriophage is about 10Ten-1014within the range of cfu / cell Was.   After the second PEG precipitation, the bacteriophage was filtered through a 0.2 micron filter. The mixture was sterilized by removing unnecessary particles and bacteria. Filter The preparation was then passed through a Centricon 100 (100 mw cutoff) filter. Wash intensively, concentrate bacteriophage and buffer with 1% FBS / P Changed to BS.   Example 15-Bacteriophage Library Characterization   A) ELISA test   Perform a TCR-specific ELISA assay and display on the bacteriophage surface. The analyzed TCR molecules were analyzed. In summary, a 96-well plate can be coated NeutrAvidin (Pierce) in buffer (pH 9.0), 200 ng / well And incubated at 4 ° C. overnight. Plate 5% non-fat After blocking with fat-dried milk (NFDM) for 1 hour, anti-α, β TCR (H57 ) Biotin-labeled (labeled) antibodies or anti-V-β8.2 (MR5-2) bioti Unlabeled antibody was added to 10 mM Tris (pH 8.0) containing 2.5% NFDM. Diluted in. Then, add the diluted antibodies to the wells for 1 hour at room temperature. Incubated. Plates were washed with TBS / Tween (0.5%) (TBST ) Was washed six times in order to remove antibodies not bound to the plate.   Detection of fusion protein expressed on bacteriophage is achieved by antibody coating Bacteriophage particles for 1 hour at room temperature Was done by After washing the plate 6 times with TBST, 2.5% N Anti-M13-HRP conjugate (Pharmacia) diluted in FDM was added. . After incubation for 1 hour, the plates were washed 8 times with TBST. 100μ l of TMB substrate was added to each well, and after 10 minutes, 100 μl of 1 M sulfuric acid was added to react. Stopped. Then, the absorbance at 450 nm of the plate was read (FIG. 17). . Control bacteriophage (CAIII gene III antibody library Prepared by a non-specific binding test to antibody H57 and antibody MR5-2. . For further control, w / BSA or anti-V-β17 Nonspecific binding assays were also performed on the plated wells.   FIGS. 17 and 18 show the scTCR fusion protein in its uninduced state (ie, It is a result of ELISA analysis in a suppression release state) and an induction state. FIG. As a result of analysis of the scTCR fusion protein generated from KC46, FIG. 18 shows pKC5 5 shows the results of analysis of the fusion protein generated from No. 1. In each figure, black bars Indicates uninduced cultures, lighter bars indicate induced cultures. You. 17 and 18 show that the scTCR fusion protein was Expressed on phage library and displayed on bacteriophage surface That is to say. Comparing the absorbance at 450 nm, the induction of scT The bacteriophage preparation expressing the CR fusion protein is It was approximately 60-200 times larger than the Teriophage preparation (FIG. 18). ELISA test Comparison of the levels detected by the assay revealed that the gene VIIIscTCR fusion protein A bacteriophage displaying quality will be able to delete the gene III scTCR fusion. Approximately 200-500 fold higher than the bacteriophage displayed (FIG. 17). From this result, the TCR / gene VIII bacteriophage was found to contain many scTCR fusions. It is considered that the synthesized protein is expressed on the surface of bacteriophage. scTC Due to the multivalent nature of bacteriophage display of R fusion proteins, MHC / The opportunity to capture the peptide complex is increased. It is polyvalent and therefore has binding activity Is strengthened.   B) of the fusion protein displayed in the bacteriophage library Activity   Demonstrating that biologically active fusion proteins on bacteriophages To display the DO11.10 scTCR / gene / fusion For Cteriophage, TCR on DO11.10 T cells and immobilized scIA An analysis of the ability to inhibit specific interaction with d / OVA molecules was performed. DO11.10T Exemplary cell lines and single chain MHC molecules to detect such interactions The test is as described above.   The DO11.10 T cell hybridoma and IAd / OVA system was The sc expressed on bacteriophage was used almost in accordance with the method described in Example 8. In the presence of TCR (hereinafter sometimes referred to as scTCR / bacteriophage molecule) The decrease in IL-2 levels was measured. As a result of the experiment, The revealed scTCR fusion protein interacted with immobilized IAd / OVA. I understood. This indicates that IL-2 levels are in the scTCR / bacteriophage molecule. The reason is that the temperature was lowered in the wells containing. In contrast, controls of the same titer Add bacteriophage (do not display scTCR) and add ink No reduced inhibitory effect was observed in the incubated wells. Therefore, The scTCR fusion protein expressed on Cterio phage is biologically active. You.   To test the fine specificity of the inhibitory effect, DI11.10 and gD12T An assay was performed to compare the level of inhibition with the hybridoma.   As described in Example 8, gD12 T cell hybridomas were IAdRestriction (IAdRestricted), but recognizes peptides derived from HSV-1. Both cells Taking into account that both recognize peptides restricted by IA ", The scTCR from DO11.10 expressed on lyophage was IAd/ HSV It is thought that there is a possibility of some interaction with the -1 molecule. However, this phase Interaction is IAd/ OVA Much weaker than interaction with MHC / peptide molecules It is considered to be a bad thing. As shown in FIG. 19A, low levels of IL-2 inhibition Although found in the gD12 T cell hybridoma group, DO11.10 The level of IL-2 inhibition in the group was about 8-10 fold higher. In FIG. 19A , About 8-250 × 10TenPhage were used in each experiment. CAIII is scT Refers to a control phage that does not display the CR fusion protein. FIG. B shows the results of a related experiment in which the production of IL-2 was DO1 1.10 Measured from T hybridoma cells.   C) Biopanning of fusion protein   Bacteriophage display cells displaying scTCR fusion proteins Using a library, a specific TCR molecule is captured according to a known method (for example, McCafferty, J.M. et al. Nature (1990) 348: 352; Castagroli, L .; et al. J. Mol . Blol. (1991) 222: 301; Lebeddee, S.M. L. et al. PNAS (USA) (1992), 89: 3175 Smith, G.P. and Scott, J.K. supra; Blake, J .; et al. J. Exp. Med. (1996) 184: 121). Conventional capture techniques generally rely on the strength of the interaction between the target antigen and the antibody. Depends on. Its strength is typically 10-6-10-8Within the range. Only However, most TCR-MHC / peptide interactions are typically 5 × 1 0-FiveIt is in the range of M and becomes weaker with the KD value. Generally, scTCR fusion proteins The avidity and valency between the protein and the MHC / peptide complex are determined by the phage Can be increased by increasing the number of fusion proteins expressed on the Wear. Other strategies that can be used include changing the stringency of washing and increasing the amount of antigen , Lowering the dissociation rate by lowering the temperature, increasing the incubation time, etc. Is mentioned.   i) Antibody capture   Using the DO11.10 scTCR fusion protein specific antibody, the scTCR The molecule was captured. In summary, multiple microwells of 200 ng neutrAvidin After coating, C-β domain, V-β8.2 domain or V-β domain A biotin-labeled antibody that binds to a non-specific antibody that recognizes I was vate. For non-specific binding, use BSA coated wells Was investigated. The experiment was 2 × 106TCR / gene VIII bacterio Phage particles were transformed with 1 × 10 6 irrelevant antibody from bacteriophage bank.11Pieces The dilution was performed on particles. That is, a dilution of 1: 50,000 was finally performed. Anti -For both TCR antibody (H57) and anti-V-β8.2 antibody (MR5-2) One round of enrichment was performed, and 5000-fold enrichment was observed. Was. On the other hand, the BSA negative control shows that the accumulation is specific. No suggestive positive clones were obtained. 20-100 in one round 00-fold accumulation is not uncommon in antibody-antigen capture experiments. Therefore, the real Accumulation found to be within acceptable limits for reported accumulation experiments .   ii) Cell panning   Cell capture is a traditional method of isolating antibodies to cell surface proteins. More classic. This method uses the bacteriophage la Easy application when screening desired fusion proteins from the library it can. Cells used for cell capture can be obtained from any suitable cell source. For example, Cells expressing MHC / peptide molecules or US serial number under review 08 / 596,387, empty MHC to which a suitable peptide can be bound A cell containing the complex. In addition, single-stranded class IMHC genes or A cell transfected with the chain class II MHC gene, In which the appropriate peptide is bound or covalently bound to the MHC complex You. Suitable single-chain class IMHC / peptide complexes or single-chain class IIM Examples of cells having an HC / peptide complex are described in the following applications: That is Published PCT International Application No. published PCT / US95 / 09816, pending US Patent Application Serial Nos. 08 / 382,454 and 08 / 596,387 It is.   In general, when captured using cells expressing the appropriate MHC complex, some Benefits are obtained. That is, the available supply of such cells can be increased, And the elimination of time-consuming purification of the MHC / peptide complex.   As an example of a method for capturing cells, the following method is exemplified. That is, Eppend Approximately 2 × 10 in a luff tube (1.7 ml)6DO11.10 bacteria Total about 10 including phage11Bacteriophage in a volume of 0.2 ml 06Individual cells and incubate at 4 ° C. for 2 hours. Then 5000x g, centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes to pellet the cells, and ice-cold PBS / t Wash 5 times in ween (0.5% w / v). Subsequently, 50 μl, pH 5.0 Add citrate buffer to elute the bacteriophage from the cells. Integrated Bacteriophage is infected with Escherichia coli and cultured overnight. The number can be increased. Then, bacteriophage is performed, for example, as described above. Purify by standard procedures as described in Example 14. After a round of 5 Samples taken at random and analyzed for their gene sequences. You. DO11.10 Depending on the frequency of TCR gene discovery, may further accumulation be required? I decide. For example, at the beginning of the DO11.10 TCR / bacteriophage If the dilution ratio is 1: 50000, the frequency of discovery increases after 5 rounds of accumulation It is expected to be great. The increase at this time is about 1000-2000 times. It is expected to be in the box.   iii) Capture using scMHC / peptide complex   The production of soluble scMHC / peptide complexes has been described above, for example, in insect cells. Published PCT International Application No. US95 / 09816, U.S. Patent Application Serial No. Al. Nos. 08 / 382,454 and 08 / 596,387. Do it.   Soluble fusion using soluble scMHC / peptide molecules produced in insect cells Bacteriophage expressing the combined protein are captured. For example, a certain amount of sc IAd/ OVA (eg, 1-10 μg / well) using a 96-well plate (Nu nc). Then 2 × 106DO11.10 bacteria Phage, 10 total11Diluted into 1 bacteriophage (1: 5000) 0), immobilized IAdIncubation was carried out in the presence of / OVA. 2 hour incubation After washing, the plate is washed 5 times in TBST. Bacteriophage bound Is eluted by adding 100 μl of 0.1 M hydrochloric acid / glycine. DO11 combined . The frequency of 10 TCR / bacteriophage is determined as follows. That is, Perform standard colony lifts for protein labeling Antibody (for example, the above-described anti-EE-labeled antibody) or a DNA-specific probe Use to screen for positive ones. Examples of DNA-specific probes include A 300 bp α-chain DNA probe, obtained from Amersham . The antibody or DNA-specific probe for the protein label is sc Recognize TCR gene or scTCR gene product.   Example 16-Fluorescence based cell sorting identification of fusion proteins   Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS) It is a standard method for detecting and sorting cells (eg, Davey, H.M. and Kell , D.B. in Microbiological Reviews (1996) 60: 641; and Darzynkiewca, Z .; et al. (1994) in Flow Cytometry 2nd Ed., Vols. 41 and 42 Academic Press, N ew York). FACS displays cells and scTCR fusion protein The interaction with the laying bacteriophage is detected. To perform FACS experiments In addition, sc-IAdCells expressing the / OVA complex were generated as described above. IAdStaining with a specific antibody ASMII-FITC (Pharmingen) IAdWas confirmed. OVA peptide or IAdBeing in the groove In order to confirm that a T cell activity assay is performed, as described in the following application: That is Published PCT International Application No. published PCT / US95 / 09816, U.S. Patent Applications Serial Nos. 08 / 382,454 and 08/596, pending. 387.   Various chromogens can be used to label bacteriophages for FACS analysis. One approach is to add bacteriophage to phycoerythrin. Attach a suitable chromogen such as hrin). Another approach is Flurotag FI According to a known method such as that shown in the TC Combination Kit (Sigma, St. Louis, MO). To bind FITC to the bacteriophage. Another approach is Indirectly binds phycoerythrin and bacteriophage. That is, first Biotinylating the bacteriophage and strepavidn- Bind phycoerythrin. Yet another approach is to use a different fluo Two antibody approaches are used, such as with a resane label. Specifically, one side Anti-bacteriophage antibodies were labeled with FITC and two (Eg, H57) is labeled with phycoerythrin.   Examples of the bacteriophage binding method include the following. That is, 1012Buffer exchange of pKC51 phage of cfu with 0.1 M sodium carbonate Place in buffer (0.2 ml, pH 9.0 to 9.5). Flurotag FITC composite Using a kit, add 1 ml of 0.1 M carbonic acid-bicarbonate solution to the vial containing FITC. And stir until all FITC has dissolved. FITC label about 50μ 1 to the bacteriophage preparation and determine the final ratio of FITC to phage. 40: 1 and the appropriate fluorescein / protein (F / P) molar ratio You. Then, place the sample in a tube, cover with aluminum foil and incubate for 2 hours. Beate. Label the bacteriophage with the G-25 ephandex Isolate by laundering. Typically, labeled bacteriopha Page is included in the main fraction (for example, fractions 6 to 8). The F / P molar ratio was then The absorbance at 280 nm and 495 nm is read and determined using a photometer. F The formula used to determine the / P molar ratio is as follows:       MolarF / P = 2.77 × A495/ A280(0.35 × A495)   The absorbance reading of the composite sample should be between 0.3 and 1.0 Should be.   FITC-labeled phage were isolated from sc-IA according to the conventional FACS method.d Cells expressing the / OVA complex are added and incubated. This allows Detect bacteriophages that bind to the cells. The bound bacteriophage Elute from cells and grow according to standard methods.   Example 17-scTCR fusion protein in bacteriophage f88 Cloning and expression   The scTCR fusion protein used in the above capture method is a display. To achieve this, a wild-type filamentous bacteriophage (ie, VCM S13) further infected with phagemid-transformed cells (phagemid-transfor cells). med cell). This method can be improved as follows. Immediately That is, a bag capable of more efficiently containing (packaging) a recombinant scTCR construct. Teriophage vectors may be used (this allows for The yield of the recombinant molecule is increased). For example, bacteriophage f88-4 is 88 A type vector (9273 base pairs) containing two gene VIII genes. One of them Is the wild type and the other displays the recombinant gene (ie, the gene VIII gene Fusion). Bacteriophage f88-4 was from Dr. G. Smith of Washington University Can be obtained. Bacteriophage f88-4 is a package of the gene VIII construct The efficiency is improved, so that the yield is improved by up to 10%. This increase in yield is Virion multiplicity (ie, the number of recombinant molecules per total number of virions) is increased It is thought to be because. With this improved yield, per virion It is believed that about 300 scTCR fusion proteins are constructed. Therefore, f 88-4 bacteriophage increases yield and multiplicity and increases binding activity to the target. To improve the rate of isolation of specific scTCR fusion proteins .   Construction of a recombinant bacteriophage containing the scTCR fusion protein -4 ScTCR Genes in PstI and HindIII Sites of Bacteriophage This was done by cloning the offspring. Expression of the introduced scTCR gene Is thus performed under the control of the tac promoter, the induction of Occurs after G addition.   Shown schematically in FIG. 20 are several recombinant bacteriophage vectors. F88-4 bacteriophage (pKC70, pKC71, and pKC 72).   Example 18-scTCR bacteriophage library from HIV infected cells Building   Display scTCR fusion protein from CTL of HIV infected patient A bacteriophage library is created by the methods described herein. HI V-infected patients are those who have been diagnosed or classified as non-prolonged (LTNP). Such HIV-infected patients include gag and pol CTL responses to various HIV virus antigens have been studied. This CTL profiles from patients such as are typically prone to AIDS Shows stronger immune activity against HIV antigens than patients (Miedema, F. and Klei n, M.R. Science (1996) 272, 505).   To identify TCRs involved in CTL response and construct corresponding fusion proteins Next, a class I HLA-A2 restricted human TCR library is generated from T cells. The T cells are isolated from LTNP patients by the method described in the above example.   Class I HLA-A2 restricted bacteriophage A slurry can be prepared. For example, 107T cells were isolated from three HLA-A2 LT NP patients are isolated and pooled as described above (Altman, J.D. et al. Sc. ience (1996) 274: 94). Messenger RNA is transferred to these cells and targets. Purify from cDNA obtained by standard procedure. Standard procedures include human C-α TCR and And an oligonucleotide primer corresponding to C-βTCR. You. Exemplary primers are shown in FIG. 22 (SEQ ID NOs .: 116-128) and FIG. NOs.:101-115). Specifically, the V-α gene has 12 forward plasmids. At the 5 'end of the C-α gene sequence (FIG. 22 SEQ ID NO. 116-127). PCR using one back primer (SEQ ID NO.:128) More amplified. The β chain has 13 primers that hybridize to the 5 ′ end of the V-β chain. Forward primer (Figure 23, SEQ ID NOs: 101-113) and 378 in the β constant region. Using two back primers (FIG. 23 SEQ ID N0s: 114,115) placed at the base And amplified by the PCR method. Amplification by the PCR method is performed according to a standard method.   The DNA amplified by the PCR method is, for example, a DNA vector described in Example 14. Bacteriophage coat proteins or fragments thereof It is introduced into an appropriate DNA vector to be expressed. Specifically, pK described in Example 2 was used. Using a C45 DNA vector, the V-α chain was added to the SfiI site and Sp of the vector. subcloned into the eI site and place the V-β / C-β chain into the Xmal site of the vector. Cloning. Then, the scTCR bacteriophage fusion protein was A suitable encoding vector is generated according to the examples described above. Alternatively, V- HindIII-PSTI flag capable of inserting α chain and V-β / C-β chain, for example As a reference, the f-88 bacteriophage vector (see Example 17) Cloning. Appropriate recombinant bacteriophage produced in this way Infectious host cells and increase the recombinant bacteriophage according to the examples described above. Breed and screen.   In some cases, f88 bacteriophage cleaving is performed according to standard recombinant techniques. By modifying the roning site, for example by incorporating an appropriate linker sequence, Cloning of specific fragments (eg SfiI-XmaI fragments) It is also desirable to enable To achieve such modifications, for example, Restriction site primers were used for bacteriophage HindIII and PstI sites. Annealing. The bacteriophage display thus produced The library is grown and stored according to standard procedures.   Example 19-Bacteriophage display cell derived from HIV infected cells Buri screening   The recombinant bacteriophage library produced in Example 18 can be selected Can be screened by several approaches. For example, the library , Can be screened using a variety of detectably labeled probes. Plow Examples of viruses include intact (inactivated) HIV virus, HIV proteins, Among them, HIV coat protein and HIV peptide as MHC / HLA complex APC that expresses Screening will be conducted in vivo. HIV shell, which is known to stimulate an immune response against the HIV virus This can be done using peptide epitopes of the protein. Such pepti Some examples of known epitopes are known, including HIV gp120, pepti isolated from gp41, gp160, gag and pol coat proteins Is included in this.   a) Screening using HIV gp120 coat protein   Using the peptide epitope from the V3 loop of the gp120 protein, Screen the Teriophage library. A typical peptide The T1 (amino acids 428-443) peptide of the HIV gp120 protein and And T2 (amino acids 112-124) peptide. gp120V3ru Peptide epitope is one of those that can induce HIV neutralizing antibodies (Berzofsky, J.A. et al. (1991) FASEB J. 5: 2412; Ahlers, J.D. et al., (1993 ) J. Immunology 150: 5647). Sc from bacteriophage library Other peptide epitopes available for screening TCR fusion proteins Examples include Karzon, D.T. et al. and Hart, J.K. et al. See also (Karz on, D.T. et al. (1992) Vaccine 14: 1039; Hart, J.K et al. PNAS (USA) (1991) 8 8: 9448).   B. Biopanning using APC expressing HIV coat protein   From the scTCR library constructed in Example 18 above, for example, HIV g Binds to immunogenic HIV peptides obtained from ag or pol proteins ScTCR fusion proteins can be captured. This HIV shell protein Quality is present in association with cells that express single-chain HLA-A2 molecules. Single strand The HLA-A2 molecule is described in Garboczl, D.N. et al. Description of PNAS (USA) (1992) 89: 3429 Generated according to Cells expressing single-chain HLA-A2 molecules can be prepared by known methods. (Altman, J.D. et al., Supra).   Biopanning can be achieved by several methods. For example, one method Thus, the MHC / peptide target is presented in two different ways. That is, the capture The first step involves using transfected cells expressing HLA-A2. First, a gag or po1 peptide is used as a target antigen. Capture was performed in Example 1. About 10 from the bacteriophage display library described in 811Pieces Using bacteriophage. And a bacteriophage library To a cell presenting HLA-A2 and a gag or po1 peptide. Let Bacteriophage was added to about 10 transfectants.62 in the coexistence of For 2 hours at 4 ° C., washing twice in 2% FBS / PBS, 0.1 M After elution in 100 μl citrate buffer (pH 5.0), 0.1 M Tri Neutralize with 10 μl of s (pH 8.0). The eluted bacteriophage is Infect and grow a suitable host such as strain K91kan, Grow overnight. Bacteriophage particles are purified by standard methods.   Capture work on cells or solid support carrying the appropriate MHC / antigen Repeatedly, scTCR fusion protein identified in cell capture experiments Can improve the purity of a bacteriophage having For example, cell capture The bacteriophage isolated by the method is converted into a single-chain HLA-A2 and a peptide. Capture operation on coated solid support (eg microdish) For purification. After incubation for 2 hours, the wells were filled with 0.3 ml of PB Wash approximately 8 times with S / 0.2% Tween to remove non-specific bacteriophages Leave. The bound bacteriophage was 0.1 ml of 0.1 M hydrochloric acid (glycine , PH 3.0) and neutralized with 10 μl 2M Tris (pH 8.0). It is. Further capture is achieved by using cells and immobilized MHC / HLA peptide molecules. Change what is used from one to the other. By performing capture about 5 or 6 times, The bacteriophage preparation displaying the scTCR is of sufficient purity can get. Subsequently, the DNA is isolated from the bacteriophage and the bacteriophage is isolated. The DNA sequences of the α and β variable regions of the scTCR encoded in decide. It is expected that the frequency of use of the α or β variable region will be biased or If there is bias or enrichment, bacteriophage display Productive interaction between scTCRs in library and MHC / peptide antigens To indicate what was done.   With a detectably labeled probe, the bacteriophage library The desired recombinant bacteriophage can be accumulated from the cells. For example, professional If the peptide is a peptide epitope from the gp120V3 loop, Recombinant bacteriophage that specifically binds to the enzyme can be isolated. Typically, yes After several accumulation processes, how many factors influence the number of steps in this accumulation process? There is. For example, the presentation of the desired recombinant bacteriophage in the library Condition or binding activity of a detectably labeled probe or its factor. Recombinant ba DNA from Cterio phage is isolated by standard means. scTCR fusion The DNA encoding the protein is sequenced according to standard methods. You. Analysis of the DNA sequence of some isolated recombinant bacteriophages Encoding with a detectably labeled probe and recombinant bacteriophage Specific binding to the loaded scTCR fusion protein is shown.   High frequency clones are obtained from suitable pKC60 and pKC62 vectors as described above. Expressed as soluble, fully functional scTCR fusion protein in vector Will be revealed. The expressed fusion protein can then be used as described above according to standard methods. By immunoaffinity chromatography using H57 monoclonal antibody And purified individually as needed.   Example 20-Key of scTCR fusion protein detected by anti-HIV capture Characterization   The recombinant bacterium detected as described above by several alternative methods The specific binding between the phage and the HIV antigen is evaluated.   A) Biocore Analysis   Bacteriophage live as described in Example 18 using HIV peptide When screening for Lari, the following application is described using this peptide. To generate scMHC class I molecules. The following applications are published PCT International Application No. published PCT / US95 / 09816, United States under review Patent application serial numbers 08 / 382,454 and 08 / 596,387. . Preferably, the peptide is covalently linked to a scMHC class I molecule. And Using the scMHC class I peptide complex obtained here, Example 7 and the following The chip for biocore analysis is coated as described in Example 20. Than Specifically, gag or po1 antigen (see Altman, J.D. et al. Supra) The bound single-stranded HLA-A2 molecule is biosensed via an amine-reactive site. Covalently attached to the tip. Then, the chip containing the scTCR fusion protein is included in the chip. Contact the sample. Then, as described above, specific binding is detected on the chip. (Seth, A. et al. Nature (1994) 369: 324; Matsui, K. et al. PNAS (USA)) (1994) 91: 12862). Most scTCR fusion proteins interact Action or 10-Five-10-7It is expected to be in the range of M.   Specific binding of scMHC class I peptide complex to scTCR fusion protein If a match is detected, the presence of a specific scTCR-peptide binding complex is Are shown.   By determining the binding coefficient for each isolated scTCR fusion protein And easily predict the efficacy of receptors that bind to cells and cause cell death. Can be.   B) Binding to scTCR fusion protein tetramer   Detection of specific binding between the scTCR fusion protein and the HIV peptide can be performed using scTCR. The binding assay with the CR fusion protein tetramer was performed according to the above example (see Example 9). It is also possible by doing. The tetrameric scTCR fusion protein is fused The DNA encoding the product is converted to a Bir A-dependent biotinylation site (Bir A-depe by inserting it into an appropriate DNA vector having an ndent biotinylation site). (See Schatz, PJ Biotechnology (1993) 11: 1138). sc For TCR fusion proteins, avidin-phycoerythrin was applied according to standard methods. Modification to produce a tetrameric scTCR fusion protein Can also. Transfected to display HIV peptide Cells are prepared according to the methods described above and in the following applications. That is, public Open PCT International Application No. published PCT / US95 / 09816, rice under examination Nos. 08 / 382,454 and 08 / 596,387. You. With transfected cells, screening against the library Can be performed. Also, for transfected cells, Stain with labeled scTCR fusion protein tetramer and stain cells Can be detected. More powerful detected by FACS analysis Binding is specific for the scTCR fusion protein and the MHC class I peptide complex. It is an indicator of interaction.   The binding affixed to the scTCR fusion protein isolated in Example 19 above. The scTCR fusion protein was tested for affinity and activity by Determine if it specifically binds to the peptide complex. This appropriate test is This is as described in the embodiment.   C. FACS analysis   By performing FACS, the scTCR fusion protein was used in Example 16 above. The described interaction with the target cells can be detected. For example, scTCR fusion Proteins are biotinylated according to standard methods, followed by strepavidin- The labeled scTCR tetramer is formed by conjugation with coerythrin. FA CS allows the phase of scTCR to interact with appropriate target cells such as A20 cells and tumor cell lines. The interaction is measured quantitatively. Alternatively, the scTCR fusion protein of Example 16 Is attached to a suitable solid support (eg, latex beads) and the scTCR is It is also possible to have several displays. Using related methods, the tetramer Class IMHC / peptide molecules have been produced (eg, Altman, J.D. et al. . supra).   D. I1-Expression in gD12T hybridoma cells   The activity of gD12T hybridoma cells is determined by reviewing the U.S. patent application serial no. As described in JP 08 / 596,387, it can be easily detected by measuring IL-2 activity. Can be specified. This assay shows that the scTC produced in Example 16 The function of the R fusion protein can be assayed. For example, gD12T hybrid The scTCR molecule produced in the example according to the above-described method was added to the dorma cells. Transfection of the encoding DNA is performed. FACS staining was performed according to Example 16. To detect the expression of the scTCR receptor on the cell surface. You. Receptor positive clones were used in the IL-2 activity assay described in the following application: You. The following applications are published PCT International Application No. PCT / US95 / 0 9816, US Patent Application Serial Nos. 08 / 382,454, and 08/596. , 387. If the scTCR receptor is active (ie, scTCR receptor If the scepter specifically binds to the MHC / peptide target), from gD12 cells Can be easily detected and measured.   Example 21-Autoimmune proteins binding to class II restricted MHC / peptide complexes Isolation of protein fusion   Specific binding to autoimmune proteins and peptides by the method of this example The scTCR fusion protein can be isolated. For example, T-cells From 2+ individuals and individuals diagnosed with multiple sclerosis, Therefore, it can be isolated. TCR DNA is obtained from the T cells. And gain Using the obtained TCR DNA, scTCR fusion was performed according to the method described in the above example. Build the combined protein. Bacteriophage display library It is prepared and tested according to Examples 14 and 15 described above.   The bacteriophage display library provides multiple sclerosis DR-2 + 10 from several patients7It is made by isolating T cells. T cell mR NA is purified and cDNA is generated as described in Example 1 above. V of TCR Amplification of α and V-β / C-β chains by PCR was performed using the same primers as in Example 1. Perform using The V-α and V-β / C-β chains are ligated to the appropriate bacteriophage Clone into the cloning site of the spray vector. Suitable bacterio The cloning site of the phage display vector is described, for example, in Example 1. SfiI-S of f88-4 bacteriophage vector DNA described in 7 above a peI site and an XhoI-XmaI site. The library contains specific antigen targets Grow and store according to standard methods for capturing targets.   Single-stranded DR-2 molecules are made generally according to the methods described above and in the following applications. You. The following application is published PCT International Application No. PCT / US95 / 0981 6, U.S. Patent Application Serial Nos. 08 / 382,454, and 08/59, pending. 6,387; Rhode, P .; et al. J. of Mol. Immunology, (1996) 32,555 . Specifically, the HLA-DR2 molecule is changed to an EBV form presenting the HLA-DR2 molecule. Purified from transformed lymphoblasts. Briefly, the HLA-DR2 molecule is The cells are lysed in a buffer containing Triton X-100 and standard immunoaffinity Purify by affinity chromatography. Then, the cell lysate is Apply to Sepharose column. DR2 was allowed to bind, and this was added to 0.05% N-dode. Sil-BD-maltoside detergent (N-dodecyl-B-D-maltoside detergent) Eluted in phosphate buffer (pH 11.3). Immediately transfer the obtained fraction to 1 Neutralized with M acetic acid and passed through a DEAE ion exchange column to give a DR Two pools are collected in phosphoric acid (pH 8.0) containing 0.5 M NaCl. Tan The protein fraction was purified by SDS-PAGE gel electrophoresis and silver staining. Perform a degree test.   Bacteriophage libraries can be screened by several methods. In particular, using a solid support coated with a single-stranded DR-2 molecule, The method of performing capture according to the method described above is preferable. As for the method of capture, insect cells A single-stranded DR-2 molecule in a host such as It is immobilized on a solid support such as a black plate wall.   In addition, the bacteriophage library is transferred by DR-2 molecules. Purified using the lysed cells (DeKrulf, J. et al. PNAS (USA) (199). 5) See 92, 3938). ScTCR fusion specifically binding to DR-2 protein The accumulation of bacteriophage particles expressing proteins was described in the above example. The method is performed.   Specific embodiments or examples made in the detailed description section are Only to clarify the technical contents of the present invention, It should not be construed as limiting in a narrow sense, but rather the spirit of the invention and the scope of the appended claims. Various changes can be made within the box.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 ウォン，ヒン，シー アメリカ合衆国 フロリダ州 33332，フ ォート ローダデール，ウエントワース 2966──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12P 21/02 C12N 15/00 ZNA (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES , FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN , TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL , AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, H, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW , MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventors Wong, Hin, Sea United States 33332, Florida, Fort Lauderdale, Wentworth 2966

Claims (1)

【特許請求の範囲】 1．ペプチドリンカー配列によりＶ−β鎖と共有結合されたＶ−α鎖を含んで構 成される一本鎖Ｔ細胞レセプターと、該一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合され たバクテリオファージ外殻タンパク質とを含んでなる可溶性融合タンパク質。 ２．上記ペプチドリンカー配列により、上記Ｖ−α鎖のＣ−末端が上記Ｖ−β鎖 のＮ−末端と共有結合されてなる請求項１に記載の可溶性融合タンパク質。 ３．上記ペプチドリンカー配列により、上記Ｖ−β鎖のＣ−末端が上記Ｖ−α鎖 のＮ−末端と共有結合されてなる請求項１に記載の可溶性融合タンパク質。 ４．上記Ｖ−β鎖のＣ−末端とバクテリオファージ外殻タンパク質のＮ−末端と の間に共有結合されたＣ−β鎖フラグメントをさらに含んでなる請求項２に記載 の可溶性融合タンパク質。 ５．上記Ｖ−α鎖のＣ−末端とペプチドリンカー配列のＮ−末端との間に共有結 合されたＣ−α鎖フラグメントをさらに含んでなる請求項２に記載の可溶性融合 タンパク質。 ６．上記融合タンパク質が、少なくとも１つのタンパク質標識をさらに含んでな る請求項２に記載の可溶性融合タンパク質。 ７．上記ペプチドリンカー配列が、約２〜２０個のアミノ酸を含んでなる請求項 ２に記載の可溶性融合タンパク質。 ８．上記バクテリオファージ外殻タンパク質が、遺伝子IIIタンパク質または遺 伝子VIIIタンパク質である請求項１に記載の可溶性融合タンパク質。 ９．１）Ｖ−α鎖と、２）ペプチドリンカー配列と、３）Ｖ−β鎖と、３）バク テリオファージ遺伝子IIIタンパク質とが、この順に共有結合されてなる可溶性 融合タンパク質。 １０．Ｖ−β鎖のＣ−末端とバクテリオファージ遺伝子IIIタンパク質のＮ−末 端との間に共有結合されたＣ−β鎖フラグメントをさらに含んでなる請求項９に 記載の可溶性融合タンパク質。 １１．上記Ｃ−β鎖フラグメントのＣ−末端とバクテリオファージ遺伝子IIIタ ンパク質のＮ−末端とに共有結合されたタンパク質標識をさらに含んでなる請求 項 １０に記載の可溶性融合タンパク質。 １２．上記Ｖ−β鎖のＣ−末端と上記バクテリオファージ遺伝子IIIタンパク質 のＮ−末端との間に共有結合された第１のタンパク質標識、並びに、上記融合タ ンパク質のＣ−末端と共有結合された第２のタンパク質標識をさらに含んでなる 請求項９に記載の可溶性融合タンパク質。 １３．１）Ｖ−α鎖と、２）ペプチドリンカー配列と、３）Ｖ−β鎖と、４）バ クテリオファージ遺伝子・タンパク質とが、この順に共有結合されてなる可溶性 融合タンパク質。 １４．１）Ｖ−α鎖と、２）ペプチドリンカー配列と、３）Ｃ−β鎖フラグメン トと共有結合されたＶ−β鎖と、４）バクテリオファージ遺伝子VIIIタンパク質 とが、この順に共有結合されてなる可溶性融合タンパク質。 １５．１）Ｃ−α鎖フラグメントと共有結合されたＶ−α鎖と、２）ペプチドリ ンカー配列と、３）Ｃ−β鎖フラグメントと共有結合されたＶ−β鎖と、４）バ クテリオファージ遺伝子VIIIタンパク質とが、この順に共有結合されてなる可溶 性融合タンパク質。 １６．上記Ｖ−β鎖のＣ−末端と上記遺伝子VIIIタンパク質のＮ−末端とに共有 結合された第１のタンパク質標識、並びに、上記融合タンパク質のＣ−末端と共 有結合された第２のタンパク質標識をさらに含んでなる請求項１３に記載の可溶 性融合タンパク質。 １７．上記Ｃ−β鎖フラグメントのＣ−末端と上記遺伝子VIIIタンパク質のＮ− 末端とに共有結合されたタンパク質標識をさらに含んでなる請求項１４または１ ５に記載の可溶性融合タンパク質。 １８．上記Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖が、細胞障害性Ｔ細胞から単離されたもので ある請求項２に記載の可溶性融合タンパク質。 １９．請求項６に記載の可溶性融合タンパク質から、１つ以上の上記タンパク質 標識を分解することで生成されてなる一本鎖Ｔ細胞レセプター。 ２０．人体に適応される、請求項１９に記載の一本鎖Ｔ細胞レセプター。 ２１．一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパ ク質を含んでなる可溶性融合タンパク質をエンコードする配列と、機能可能に連 結されたプロモータとリンカー配列とをさらに含んでなるＤＮＡセグメント。 ２２．１）Ｖ−α鎖と、２）ペプチドリンカー配列と、３）Ｖ−β鎖と、３）バ クテリオファージ遺伝子IIIタンパク質とが、この順に共有結合されてなる可溶 性融合タンパク質をエンコードする配列を含んで構成されるＤＮＡセグメント。 ２３．１）Ｖ−α鎖と、２）ペプチドリンカー配列と、３）Ｖ−β鎖と、４）バ クテリオファージ遺伝子VIIIタンパク質とが、この順に共有結合されてなる可溶 性融合タンパク質をエンコードする配列を含んで構成されるＤＮＡセグメント。 ２４．１）Ｖ−α鎖と、２）ペプチドリンカー配列と、３）Ｃ−β鎖フラグメン トと共有結合されたＶ−β鎖と、４）バクテリオファージ遺伝子VIIIタンパク質 とが、この順に共有結合されてなる可溶性融合タンパク質をエンコードする配列 を含んで構成されるＤＮＡセグメント。 ２５．１）Ｃ−α鎖フラグメントと共有結合されたＶ−α鎖と、２）ペプチドリ ンカー配列と、３）Ｃ−β鎖フラグメントと共有結合されたＶ−β鎖と、４）バ クテリオファージ遺伝子VIIIタンパク質とが、この順に共有結合されてなる可溶 性融合タンパク質をエンコードする配列を含んで構成されるＤＮＡセグメント。 ２６．上記Ｖ−β鎖をエンコードする配列の３’末端と、上記バクテリオファー ジ遺伝子VIIIタンパク質をエンコードする配列の５’末端との間に共有結合され た、タンパク質標識をエンコードする配列をさらに含んでなる請求項２３に記載 のＤＮＡセグメント。 ２７．上記Ｃ−β鎖フラグメントをエンコードする配列の３’末端と、上記バク テリオファージ遺伝子VIIIタンパク質をエンコードする配列の５’末端との間に 共有結合された、タンパク質標識をエンコードする配列をさらに含んでなる請求 項２４または２５に記載のＤＮＡセグメント。 ２８．上記融合タンパク質をエンコードする配列の３’末端と共有結合された、 タンパク質標識をエンコードする配列をさらに含んでなる請求項２６に記載のＤ ＮＡセグメント。 ２９．請求項２１に記載のＤＮＡセグメントを含んでなるＤＮＡベクター。 ３０．上記プロモータおよびリンカーが、それぞれ大腸菌由来のｐｈｏＡおよび ｐｅｌＢである請求項２１に記載のＤＮＡセグメント。 ３１．複数のバクテリオファージを含んでなり、これらが複数の可溶性融合タン パク質を呈示するバクテリオファージ・ライブラリであって、 上記複数の可溶性融合タンパク質はそれぞれ、一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有 結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質を含んでなり、上記一本鎖Ｔ細胞 レセプターはそれぞれ、ペプチドリンカー配列によりＶ−β鎖と共有結合された Ｖ−α鎖を含んでなるバクテリオファージ・ライブラリ。 ３２．上記ペプチドリンカー配列により、Ｖ−α鎖のＣ−末端がＶ−β鎖のＮ− 末端と共有結合されてなる請求項３１に記載のバクテリオファージ・ライブラリ 。 ３３．上記ペプチドリンカー配列により、Ｖ−β鎖のＣ−末端がＶ−α鎖のＮ− 末端と共有結合されてなる請求項３１に記載のバクテリオファージ・ライブラリ 。 ３４．上記可溶性融合タンパク質が、少なくとも１つのタンパク質標識をさらに 含んでなる請求項３１に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。 ３５．上記Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖が、免疫的に虚弱な哺乳類から単離されたも のである請求項３１に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。 ３６．上記Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖が、マウスから単離されたものである請求項 ３１に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。 ３７．上記マウスが、ＨＬＡ−Ａ２抗原複合体を発現可能なトランスジーンを有 するものである請求項３１に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。 ３８．上記Ｖ−α鎖およびＶ−β鎖が、癌、感染症、自己免疫疾患、またはアレ ルギーを発症、または発症の疑いのある人から入手されたものである請求項３１ に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。 ３９．上記感染症が、ＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスの感染によるもので ある請求項３１に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。 ４０．上記ＲＮＡウイルスが、ヒト免疫不全ウイルスである請求項３９に記載の バクテリオファージ・ライブラリ。 ４１．上記ＤＮＡウイルスが、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、ポリオ ーマウイルス、インフルエンザウイルス、またはポックスウイルスより構成され る群から選択されるものである請求項３９に記載のバクテリオファージ・ライブ ラリ。 ４２．上記バクテリオファージ外殻タンパク質が、遺伝子VIIIタンパク質である 請求項３１に記載のバクテリオファージ・ライブラリ。 ４３．請求項３１に記載のバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリ、宿 主細胞サンプル、および、その使用説明書から構成されるキット。 ４４．複数のバクテリオファージを含んでなり、これらが複数の可溶性融合タン パク質突然変異物を呈示するバクテリオファージ・ライブラリであって、 上記複数の可溶性融合タンパク質突然変異物はそれぞれ、一本鎖Ｔ細胞レセプ ター突然変異物と共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質を含んでな るバクテリオファージ・ライブラリ。 ４５．一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパ ク質を含んでなる可溶性融合タンパク質の単離方法であって、 上記融合タンパク質をエンコードする配列を含んでなるＤＮＡベクターを宿主 細胞に導入する工程と、 上記融合タンパク質の発現が可能な低速誘導条件下において、上記宿主細胞を 培養培地中で培養する工程と、 上記融合タンパク質を上記宿主細胞または培地から精製して可溶性融合タンパ ク質を単離する工程とを含んでなる可溶性融合タンパク質の単離方法。 ４６．上記宿主細胞または培養培地の抽出物を、上記融合タンパク質を特異的に 結合可能な合成マトリックスに接触させる工程と、 上記融合タンパク質を合成マトリックスより精製して、可溶性融合タンパク質 を単離する工程とをさらに含んでなる請求項４５に記載の可溶性融合タンパク質 の単離方法。 ４７．一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパ ク質を含んでなる可溶性融合タンパク質をエンコードする配列を含んで構成され るＤＮＡセグメントの単離方法であって、 複数の可溶性融合タンパク質であり、それぞれが、一本鎖Ｔ細胞レセプターと 共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質を含んでなる融合タンパク質 を呈示する、複数のバクテリオファージを含んでなるバクテリオファージ・ライ ブラリを宿主細胞に感染させる工程と、 上記複数のバクテリオファージの増殖が可能な低速誘導条件下において、上記 宿主細胞を培養する工程と、 上記複数のバクテリオファージと分子とを、該分子と少なくとも一つのバクテ リオファージとの間に特異的結合が形成可能な条件下で接触させて、特異的結合 複合体を形成した少なくとも１つのバクテリオファージを生産する工程と、 上記特異的結合複合体を形成するバクテリオファージの１つを同定する工程と 、 上記バクテリオファージを増殖し、該バクテリオファージからＤＮＡセグメン トを単離する工程とを含んでなるＤＮＡセグメントの単離方法。 ４８．上記宿主細胞中で可溶性融合タンパク質を発現可能なＤＮＡベクターに、 上記ＤＮＡセグメントを挿入する工程をさらに含んでなる請求項４７に記載のＤ ＮＡセグメントの単離方法。 ４９．可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターの発現方法であって、 可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターをエンコードする配列を含んでなるＤＮＡベク ターを宿主細胞へ導入する工程と、 上記可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターの発現が可能な条件下において、上記宿主 細胞を培養培地中で培養する工程と、 上記一本鎖Ｔ細胞レセプターを宿主細胞または培地より精製して可溶性一本鎖 Ｔ細胞レセプターを単離する工程とを含んでなる可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター の発現方法。 ５０．上記宿主細胞が、細菌細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞より構成される 群から選択されるものである請求項４９に記載の可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター の発現方法。 ５１．リガンドに対する一本鎖Ｔ細胞レセプターの特異的結合親和性を増強する 方法であって、 上記一本鎖Ｔ細胞レセプターとリガンドとの間の、第１の特異的結合親和性を 決定する工程と、 バクテリオファージの増殖が可能な条件下で、上記請求項４４に記載のバクテ リオファージ・ライブラリを複数の宿主細胞に感染させる工程と、 上記複数の宿主細胞を、少なくとも一つのバクテリオファージとの間で特異的 結合が十分に可能な上記リガンドと接触させることにより、上記バクテリオファ ージとリガンドとからなる少なくとも一つの特異結合複合体を生産する工程と、 上記特異結合複合体を形成するバクテリオファージを同定する工程と、 可溶性融合タンパク質突然変異物をエンコードする配列を含んでなり、該可溶 性融合タンパク質突然変異物を発現するＤＮＡを、上記バクテリオファージより 単離する工程と、 上記可溶性融合タンパク質突然変異物より、可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター突 然変異物を分離する工程と、 上記一本鎖Ｔ細胞レセプター突然変異物とリガンドとの間の、第二の特異的結 合親和性を決定する工程と、 上記第一の特異的結合親和性より大きな第二の特異的結合親和性を有する一本 鎖Ｔ細胞レセプター突然変異物を、リガンドに対する増強された特異的結合親和 性を有する一本鎖Ｔ細胞レセプターとして同定する工程とを含んでなる、リガン ドに対する一本鎖Ｔ細胞レセプターの特異的結合親和性を増強する方法。 ５２．リガンドに対する一本鎖Ｔ細胞レセプターの特異的結合親和性を増強する 方法を用いて生産された一本鎖Ｔ細胞レセプターであって、該方法が、 上記一本鎖Ｔ細胞レセプターとリガンドとの間の、第１の特異的結合親和性を 決定する工程と、 バクテリオファージの増殖が可能な条件下で、上記請求項４４に記載のバクテ リオファージ・ライブラリを複数の宿主細胞に感染させる工程と、 上記複数の宿主細胞を、少なくとも一つのバクテリオファージとの間で特異的 結合が十分に可能な上記リガンドと接触させることにより、上記バクテリオファ ージとリガンドとからなる少なくとも一つの特異結合複合体を生産する工程と、 上記特異結合複合体を形成するバクテリオファージを同定する工程と、 可溶性融合タンパク質突然変異物をエンコードする配列を含んでなり、該可溶 性融合タンパク質突然変異物を発現するＤＮＡを、上記バクテリオファージより 単離する工程と、 上記可溶性融合タンパク質突然変異物より、可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター突 然変異物を分離する工程と、 上記一本鎖Ｔ細胞レセプター突然変異物とリガンドとの間の、第二の特異的結 合親和性を決定する工程と、 上記第一の特異的結合親和性より大きな第二の特異的結合親和性を有する一本 鎖Ｔ細胞レセプター突然変異物を、リガンドに対する増強された特異的結合親和 性を有する一本鎖Ｔ細胞レセプターとして同定する工程とを含んでなる方法であ る、一本鎖Ｔ細胞レセプター。 ５３．哺乳類において、Ｔ細胞レセプターとリガンドとの間の結合を抑制する方 法であって、 請求項５２に記載の一本鎖Ｔ細胞レセプターを、有効量哺乳類に投与する工程 を含んでなる、Ｔ細胞レセプターとリガンドとの間の結合を抑制する方法。 ５４．哺乳類において、免疫応答を誘導する方法であって、 一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質 を含んでなる可溶性融合タンパク質から分解して得られる上記一本鎖Ｔ細胞レセ プターを、上記哺乳類に有効量投与する工程を含んでなり、 上記免疫応答は、上記哺乳類に、病原性Ｔ細胞の表面における複数のＴ細胞レ セプター・エピトープに対する免疫付与が可能である、免疫応答を誘導する方法 。 ５５．Ｔ細胞レセプターと特異的結合が形成可能な抗体の調製方法であって、 一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質 を含んでなる可溶性融合タンパク質から分解して得られる上記一本鎖Ｔ細胞レセ プターを、上記哺乳類に有効量投与する工程を含んでなる、Ｔ細胞レセプターと 特異的結合が形成可能な抗体の調製方法。 ５６．Ｔ細胞レセプターと特異的結合が形成可能な分子の検出方法であって、 それぞれが一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻 タンパク質を含んでなる複数の融合タンパク質を呈示する、複数のバクテリオフ ァージを含んで構成されるバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリと、 上記分子とを、該分子とライブラリ中の少なくとも一つのバクテリオファージと の間に特異的結合複合体が十分に形成可能な条件下でインキュベートする工程と 、 上記特異的結合複合体を、Ｔ細胞レセプターと特異的結合が形成可能な分子を 示すものとして検出する工程とを含んでなる、Ｔ細胞レセプターと特異的結合が 形成可能な分子の検出方法。 ５７．Ｔ細胞レセプターと特異的結合が形成可能な分子の検出方法を用いて生産 される分子であって、上記検出方法が、 それぞれが一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻 タンパク質を含んでなる複数の融合タンパク質を呈示する、複数のバクテリオフ ァージを含んで構成されるバクテリオファージ・ディスプレイ・ライブラリと、 上記分子とを、該分子とライブラリ中の少なくとも一つのバクテリオファージと の間に特異的結合複合体が十分に形成可能な条件下でインキュベートする工程と 、 上記特異的結合複合体を、Ｔ細胞レセプターと特異的結合が形成可能な分子を 示すものとして検出する工程とを含んでなる方法である、分子。 ５８．リガンドとＴ細胞レセプターとの特異的結合を阻害可能な分子の検出方法 であって、 一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質 を含んでなる可溶性融合タンパク質を、上記リガンドの存在下でインキュベート する工程と、 一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質 を含んでなる可溶性融合タンパク質を、上記リガンドおよび分子の存在下でイン キュベートする工程と、 上記分子の存在下および非存在下での、リガンドと可溶性融合タンパク質との 相互作用を評価する工程とを含んでなり、 上記分子の存在下での上記融合タンパク質とリガンドとの相互作用が、該分子 の非存在下での相互作用と比較して低下する場合、該分子がリガンドとＴ細胞レ セプターとの特異的結合を阻害可能であることを示す、リガンドとＴ細胞レセプ ターとの特異的結合を阻害可能な分子の検出方法。 ５９．リガンドとＴ細胞レセプターとの特異的結合を阻害可能な分子の検出方法 を用いて生産される分子であって、上記検出方法が、 一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質 を含んでなる可溶性融合タンパク質を、上記リガンドの存在下でインキュベート する工程と、 一本鎖Ｔ細胞レセプターと共有結合されたバクテリオファージ外殻タンパク質 を含んでなる可溶性融合タンパク質を、上記リガンドおよび分子の存在下でイン キュベートする工程と、 上記分子の存在下および非存在下での、リガンドと可溶性融合タンパク質との 相互作用を評価する工程とを含んでなり、 上記分子の存在下での上記融合タンパク質とリガンドとの相互作用が、該分子 の非存在下での相互作用と比較して低下する場合、該分子がリガンドとＴ細胞レ セプターとの特異的結合を阻害可能であることを示す検出方法である、分子。[Claims] 1． It comprises a V-α chain covalently linked to a V-β chain by a peptide linker sequence. A single-chain T cell receptor to be formed, and a covalent bond to the single-chain T cell receptor. A soluble fusion protein comprising a bacteriophage shell protein. 2. Due to the peptide linker sequence, the C-terminal of the V-α chain is changed to the V-β chain. The soluble fusion protein according to claim 1, which is covalently bound to the N-terminus of the protein. 3. Due to the peptide linker sequence, the C-terminal of the V-β chain is changed to the V-α chain. The soluble fusion protein according to claim 1, which is covalently bound to the N-terminus of the protein. 4. The C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the bacteriophage coat protein 3. The method of claim 2, further comprising a C-beta chain fragment covalently linked between the two. Soluble fusion protein. 5. A covalent bond between the C-terminus of the V-α chain and the N-terminus of the peptide linker sequence 3. The soluble fusion of claim 2, further comprising a combined C-α chain fragment. protein. 6. The fusion protein further comprises at least one protein label. The soluble fusion protein according to claim 2. 7. The peptide linker sequence comprises about 2 to 20 amino acids. 3. The soluble fusion protein according to 2. 8. The bacteriophage coat protein is a gene III protein or a gene III protein. The soluble fusion protein according to claim 1, which is a gene VIII protein. 9.1) V-α chain; 2) peptide linker sequence; 3) V-β chain; Soluble which is covalently linked to Teriophage gene III protein in this order Fusion protein. 10. C-terminus of V-β chain and N-terminus of bacteriophage gene III protein 10. The method of claim 9 further comprising a C-β chain fragment covalently linked to the end. A soluble fusion protein as described. 11. C-terminus of the C-β chain fragment and bacteriophage gene III Further comprising a protein label covalently linked to the N-terminus of the protein. Term 11. The soluble fusion protein according to 10. 12. The C-terminus of the V-β chain and the bacteriophage gene III protein A first protein label covalently linked to the N-terminus of the Further comprising a second protein label covalently linked to the C-terminus of the protein A soluble fusion protein according to claim 9. 13.1) V-α chain; 2) peptide linker sequence; 3) V-β chain; Soluble, which is covalently linked to Cteriophage genes and proteins in this order Fusion protein. 14.1) V-α chain, 2) peptide linker sequence, 3) C-β chain fragment V-β chain covalently linked to b) and 4) bacteriophage gene VIII protein Are covalently linked in this order. 15.1) a V-α chain covalently linked to a C-α chain fragment; 3) a V-β chain covalently linked to a C-β chain fragment; Soluble, which is covalently linked to Cteriophage gene VIII protein in this order Sex fusion protein. 16. Shared by the C-terminus of the V-β chain and the N-terminus of the gene VIII protein Attached to the attached first protein label, and the C-terminus of the fusion protein 14. The soluble according to claim 13, further comprising a second protein label attached. Sex fusion protein. 17． The C-terminus of the C-β chain fragment and the N- 14. The method of claim 14, further comprising a protein label covalently linked to the terminus. 6. The soluble fusion protein according to 5. 18. The V-α and V-β chains are isolated from cytotoxic T cells. A soluble fusion protein according to claim 2. 19. One or more of the above proteins from the soluble fusion protein of claim 6. A single-chain T-cell receptor produced by decomposing a label. 20. 20. The single-chain T cell receptor according to claim 19, which is adapted for the human body. 21. Bacteriophage shell protein covalently linked to single-chain T cell receptor Operably linked to a sequence encoding a soluble fusion protein comprising A DNA segment further comprising a ligated promoter and a linker sequence. 22.1) V-α chain; 2) peptide linker sequence; 3) V-β chain; Soluble which is covalently linked to Cteriophage gene III protein in this order A DNA segment comprising a sequence encoding a sex fusion protein. 23.1) V-α chain; 2) peptide linker sequence; 3) V-β chain; Soluble, which is covalently linked to Cteriophage gene VIII protein in this order A DNA segment comprising a sequence encoding a sex fusion protein. 24.1) V-α chain, 2) peptide linker sequence, 3) C-β chain fragment V-β chain covalently linked to b) and 4) bacteriophage gene VIII protein And a sequence encoding a soluble fusion protein covalently linked in this order. A DNA segment comprising: 25.1) a V-α chain covalently linked to a C-α chain fragment; 3) a V-β chain covalently linked to a C-β chain fragment; Soluble, which is covalently linked to Cteriophage gene VIII protein in this order A DNA segment comprising a sequence encoding a sex fusion protein. 26. The 3 'end of the sequence encoding the V-β chain and the bacteriophage Covalently linked to the 5 'end of the sequence encoding the digene VIII protein 24. The method of claim 23, further comprising a sequence encoding a protein label. DNA segment. 27. The 3 'end of the sequence encoding the C- [beta] chain fragment Between the 5 'end of the sequence encoding the Teriophage gene VIII protein Claims further comprising a covalently linked sequence encoding the protein label Item 29. The DNA segment according to Item 24 or 25. 28. Covalently linked to the 3 'end of the fusion protein-encoding sequence, 27. The D of claim 26 further comprising a sequence encoding a protein tag. NA segment. 29. A DNA vector comprising the DNA segment according to claim 21. 30. The promoter and the linker are respectively phoA and E. coli-derived phoA. 22. The DNA segment according to claim 21, which is pelB. 31. Comprising a plurality of bacteriophages, each comprising a plurality of soluble fusion proteins. A bacteriophage library displaying protein,   Each of the plurality of soluble fusion proteins is shared with a single-chain T cell receptor. Said single-chain T cell comprising a bound bacteriophage coat protein Each of the receptors was covalently linked to the V-β chain by a peptide linker sequence A bacteriophage library comprising a V-α chain. 32. Due to the peptide linker sequence, the C-terminal of the V-α chain is 32. The bacteriophage library of claim 31, which is covalently linked to a terminus. . 33. Due to the peptide linker sequence, the C-terminal of the V-β chain is changed to the N- 32. The bacteriophage library of claim 31, which is covalently linked to a terminus. . 34. The soluble fusion protein further comprises at least one protein label. 32. The bacteriophage library of claim 31, comprising the bacteriophage library. 35. The V-α and V-β chains have been isolated from immunologically weak mammals. 32. The bacteriophage library of claim 31, wherein 36. The V-α and V-β chains are isolated from a mouse. 32. The bacteriophage library according to 31. 37. The mouse has a transgene capable of expressing the HLA-A2 antigen complex. 32. The bacteriophage library of claim 31, wherein the library comprises: 38. The V-α chain and the V-β chain are used for cancer, infectious disease, autoimmune disease, or allele. 32. It has been obtained from a person who has developed or suspected of developing lugi. A bacteriophage library according to claim 1. 39. The infectious disease is caused by infection of RNA virus or DNA virus. 32. The bacteriophage library of claim 31. 40. The method according to claim 39, wherein the RNA virus is a human immunodeficiency virus. Bacteriophage library. 41. The DNA virus is cytomegalovirus, adenovirus, polio Virus, influenza virus, or pox virus The bacteriophage live according to claim 39, which is selected from the group consisting of: Lari. 42. The bacteriophage coat protein is a gene VIII protein A bacteriophage library according to claim 31. 43. 32. The bacteriophage display library according to claim 31, the inn A kit consisting of a main cell sample and instructions for use. 44. Comprising a plurality of bacteriophages, each comprising a plurality of soluble fusion proteins. A bacteriophage library displaying a parkin mutant, comprising:   The plurality of soluble fusion protein mutants are each a single-chain T cell receptor. Bacteriophage coat protein covalently linked to the Bacteriophage library. 45. Bacteriophage shell protein covalently linked to single-chain T cell receptor A method for isolating a soluble fusion protein comprising a protein,   A DNA vector comprising a sequence encoding the fusion protein is used as a host Introducing into cells,   Under low-speed induction conditions capable of expressing the fusion protein, the host cell Culturing in a culture medium,   Purifying the fusion protein from the host cell or medium to obtain a soluble fusion protein Isolating the soluble fusion protein. 46. Extracting the host cell or culture medium extract specifically for the fusion protein Contacting with a bindable synthetic matrix;   Purifying the fusion protein from a synthetic matrix to obtain a soluble fusion protein Isolating the soluble fusion protein of claim 45. Isolation method. 47. Bacteriophage shell protein covalently linked to single-chain T cell receptor Comprising a sequence encoding a soluble fusion protein comprising a protein. A method for isolating a DNA segment comprising:   A plurality of soluble fusion proteins, each with a single-chain T cell receptor Fusion proteins comprising covalently linked bacteriophage coat proteins Bacteriophage line comprising a plurality of bacteriophages Infecting the host cells with the slurry;   Under low-speed induction conditions that allow the growth of the plurality of bacteriophages, Culturing a host cell;   Combining the plurality of bacteriophages and the molecule with at least one bacteriophage; Specific binding by contacting it with lyophages under conditions that allow it to form specific binding. Producing at least one complexed bacteriophage;   Identifying one of the bacteriophages forming the specific binding complex; ,   Propagating the bacteriophage and removing DNA segments from the bacteriophage Isolating the DNA segment. 48. A DNA vector capable of expressing a soluble fusion protein in the host cell, 48. The method of claim 47, further comprising inserting the DNA segment. A method for isolating the NA segment. 49. A method for expressing a soluble single-chain T cell receptor,   DNA vector comprising a sequence encoding a soluble single-chain T cell receptor Introducing a host into a host cell;   Under conditions that allow expression of the soluble single-chain T cell receptor, the host Culturing the cells in a culture medium;   Purifying the above single-chain T cell receptor from a host cell or a medium to obtain a soluble single-chain Isolating the T cell receptor. Expression method. 50. The host cell is composed of a bacterial cell, an insect cell, and a mammalian cell. 50. The soluble single-chain T cell receptor according to claim 49, which is selected from the group Expression method. 51. Enhances the specific binding affinity of single-chain T cell receptors for ligand The method   A first specific binding affinity between the single-chain T cell receptor and the ligand. The step of determining;   45. The bacterium of claim 44, under conditions that allow bacteriophage growth. Infecting the lyophage library with a plurality of host cells;   The plurality of host cells is specifically bound to at least one bacteriophage. By contacting with the ligand capable of sufficiently binding, the bacteriopha Producing at least one specific binding complex consisting of a ligand and a ligand,   Identifying the bacteriophage forming the specific binding complex,   Comprising a sequence encoding a soluble fusion protein mutant, DNA expressing the sex fusion protein mutant was obtained from the bacteriophage Isolating;   From the soluble fusion protein mutant, the soluble single-chain T cell receptor Naturally separating the mutant,   A second specific binding between the single-chain T cell receptor mutant and the ligand. Determining affinity;   One having a second specific binding affinity greater than the first specific binding affinity Chain T cell receptor mutants with enhanced specific binding affinity for ligands Identifying as a single-chain T cell receptor having sexuality For increasing the specific binding affinity of a single-chain T cell receptor for a single-chain T cell receptor. 52. Enhances the specific binding affinity of single-chain T cell receptors for ligand A single-chain T cell receptor produced using the method, wherein the method comprises:   A first specific binding affinity between the single-chain T cell receptor and the ligand. The step of determining;   45. The bacterium of claim 44, under conditions that allow bacteriophage growth. Infecting the lyophage library with a plurality of host cells;   The plurality of host cells is specifically bound to at least one bacteriophage. By contacting with the ligand capable of sufficiently binding, the bacteriopha Producing at least one specific binding complex consisting of a ligand and a ligand,   Identifying the bacteriophage forming the specific binding complex,   Comprising a sequence encoding a soluble fusion protein mutant, DNA expressing the sex fusion protein mutant was obtained from the bacteriophage Isolating;   From the soluble fusion protein mutant, the soluble single-chain T cell receptor Naturally separating the mutant,   A second specific binding between the single-chain T cell receptor mutant and the ligand. Determining affinity;   One having a second specific binding affinity greater than the first specific binding affinity Chain T cell receptor mutants with enhanced specific binding affinity for ligands Identifying it as a single-chain T cell receptor having the property A single-chain T cell receptor. 53. A method for suppressing the binding between a T cell receptor and a ligand in mammals Law,   53. Administering an effective amount of the single-chain T cell receptor of claim 52 to a mammal. A method for suppressing the binding between a T cell receptor and a ligand, comprising the steps of: 54. A method of inducing an immune response in a mammal, comprising:   Bacteriophage coat protein covalently linked to single-chain T cell receptor The single-chain T cell receptor obtained by degradation from a soluble fusion protein comprising Administering a putter to said mammal in an effective amount,   The immune response causes the mammal to receive multiple T cell rescues on the surface of pathogenic T cells. Method for inducing an immune response capable of immunizing against a sceptor epitope . 55. A method for preparing an antibody capable of forming a specific bond with a T cell receptor,   Bacteriophage coat protein covalently linked to single-chain T cell receptor The single-chain T cell receptor obtained by degradation from a soluble fusion protein comprising Administering to the mammal an effective amount of a putter. A method for preparing an antibody capable of forming specific binding. 56. A method for detecting a molecule capable of forming a specific bond with a T cell receptor,   Bacteriophage shell, each covalently linked to a single-chain T cell receptor Multiple bacteriophages displaying multiple fusion proteins comprising the protein A bacteriophage display library comprising Combining the molecule with at least one bacteriophage in a library. Incubating under conditions under which a specific binding complex can be sufficiently formed; and ,   The above specific binding complex is converted to a molecule capable of forming a specific binding with a T cell receptor. Detecting specific indication and binding to the T cell receptor. A method for detecting a formable molecule. 57. Produced using a method for detecting molecules capable of forming specific binding to T cell receptors The detection method, wherein the detection method is   Bacteriophage shell, each covalently linked to a single-chain T cell receptor Multiple bacteriophages displaying multiple fusion proteins comprising the protein A bacteriophage display library comprising Combining the molecule with at least one bacteriophage in a library. Incubating under conditions under which a specific binding complex can be sufficiently formed; and ,   The above specific binding complex is converted to a molecule capable of forming a specific binding with a T cell receptor. Detecting as an indication. 58. Method for detecting molecule capable of inhibiting specific binding between ligand and T cell receptor And   Bacteriophage coat protein covalently linked to single-chain T cell receptor Incubating a soluble fusion protein comprising The process of   Bacteriophage coat protein covalently linked to single-chain T cell receptor A soluble fusion protein comprising A step of cuvating;   Between the ligand and the soluble fusion protein in the presence and absence of the molecule Assessing the interaction.   The interaction of the fusion protein with the ligand in the presence of the molecule If the molecule is reduced compared to the interaction in the absence of Ligand and T-cell receptor showing ability to inhibit specific binding to the receptor A method for detecting a molecule capable of inhibiting specific binding to a protein. 59. Method for detecting molecule capable of inhibiting specific binding between ligand and T cell receptor A molecule produced using   Bacteriophage coat protein covalently linked to single-chain T cell receptor Incubating a soluble fusion protein comprising The process of   Bacteriophage coat protein covalently linked to single-chain T cell receptor A soluble fusion protein comprising A step of cuvating;   Between the ligand and the soluble fusion protein in the presence and absence of the molecule Assessing the interaction.   The interaction of the fusion protein with the ligand in the presence of the molecule If the molecule is reduced compared to the interaction in the absence of A molecule that is a detection method showing that it can inhibit specific binding to a scepter.
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