JP4380977B2

JP4380977B2 - 表面プラズモン共鳴測定用フローセル

Info

Publication number: JP4380977B2
Application number: JP2002313325A
Authority: JP
Inventors: 基樹京; 川上　　文清; 川村　　良久
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 2002-10-28
Filing date: 2002-10-28
Publication date: 2009-12-09
Anticipated expiration: 2022-10-28
Also published as: JP2004150829A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、少量のサンプルで測定可能かつ、サンプルの切り替えの速い表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定用フローセルに関する
【０００２】
【従来の技術】
光学的なセンサー技術として表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が知られている。ＳＰＲは金属薄膜に光を照射して反射光をモニターし、金属薄膜上の屈折率の変化を検出する方法である。ＳＰＲはバイオ分野、環境分野、工業分野へ応用されており、表面に固定化した生体分子の相互作用解析、抗原抗体反応モニター、糖度モニターなどに用いられている。
【０００３】
最近はバイオ分野の生体分子相互作用解析に注目が集まっており、ＳＰＲによるラベルフリーかつリアルタイム解析からＫｉｎｅｔｉｃｓデータを得る試みがなされている。平衡状態を評価するだけでなく、結合、解離、反応などの速度を解析したＫｉｎｅｔｉｃｓデータは生体分子の機能を明らかにする上で非常に有用な情報となる。
【０００４】
通常のＳＰＲは基本的に一点のみの測定であるため、複数点の解析が可能なＳＰＲイメージング技術が注目されている。ＳＰＲイメージングにおいては、複数の生体分子を金蒸着表面に固定化したアレイを作製し、生体分子が固定化された部位の反射光強度をリアルタイムでモニターすることで、リアルタイムにＫｉｎｅｔｉｃｓデータを得ることができる。
【０００５】
最近、ＳＰＲの測定対象はますます微量化し、しかも複雑な相互作用を測定する状況が生まれてきた。よって、フローセル内の容量を小さくすることで、微量なサンプルを測定できるだけでなく、サンプルの切り替えを速くし、複数の物質を逐次的に流すことを可能とする。
【０００６】
ＳＰＲイメージングにおいては広い範囲でサンプル液を送液する必要があるため、細い流路は適さないため、シール材によってサンプル流路を確保する方法が効果的である。
しかし、今までシール材を用いたＳＰＲ装置において、サンプル量をできるだけ減らす努力はあまりなされてこなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、少ないサンプル量で測定可能かつ、サンプルの切り替えが迅速にできるＳＰＲイメージング用フローセルに関する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。
１．Ｏリングによってフローセルと観察用スライドの金表面の隙間にサンプル流路が確保された表面プラズモン共鳴測定用フローセルであり、
観察用スライドの該金表面上に５００μｍ四方のスポット１００個（縦１０×横１０）が配置されており、
線径１．５ｍｍ、内径１５．５ｍｍのＯリングを、該フローセル上の略正方形のＯリング設置溝でありかつ当該設置溝の幅が１．５ｍｍ、深さ１．１ｍｍである設置溝に設置することを特徴とする表面プラズモン共鳴イメージング測定用フローセル。
２．１に記載の表面プラズモン共鳴イメージング測定用フローセルを搭載したことを特徴とするＳＰＲイメージング装置。
３．１に記載の表面プラズモン共鳴イメージング測定用フローセルを用いて表面プラズモン共鳴イメージング測定をすることを特徴とする方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）角は金属の表面に形成される層の厚み、屈折率によって変化する。よって、金属の表面に調べられるべき物質あるいは物質の集合体を固定化し、サンプル中の物質あるいは物質の集合体との相互作用を共鳴角の変化、あるいはある角度での反射光強度の変化で検出可能である。従って、ＳＰＲはラベル不要でリアルタイム評価が可能な定量法である。ＳＰＲを応用したＳＰＲイメージングは広範囲に偏光光束を照射し、その反射像を解析することで、結合、解離、反応などの速度を解析したＫｉｎｅｔｉｃｓデータを得ることができる。
【００１０】
ＳＰＲイメージングにおいては広い範囲でサンプル液を送液する必要があるため、Ｏリングのようなシール材によってサンプル流路を確保する方法が安価かつ効果的である。ただし、フローセル内の容量を小さくすることが非常に重要であり、微量なサンプルを測定できるだけでなく、サンプルの切り替えを速くし、複数の物質を逐次的に流すことが可能となる。
【００１１】
用いるシール材の断面積Ａ₁（ｍｍ²）とシール材設置溝の断面積Ａ₂（ｍｍ²）が式（１）を満たすことが好ましい。
１．００≦Ａ₁／Ａ₂≦１．１０式（１）
【００１２】
Ａ₁／Ａ₂が１．１０より小さい方が好ましい。１．１０より大きいと、フローセルの内部容量が大きくなり、サンプル量が多く必要となるとともに、サンプルの切り替えが遅くなる傾向にある。また、Ａ₁／Ａ₂は１．００より大きいほうが好ましい。１．００以下では十分なシールをしようと締め付けた際にフローセル壁面のチップ表面が触れる場合があり、正しく測定できない場合があるからである。フローセル壁面と金表面の隙間がないとサンプルが流れない、あるいは測定ができないため好ましくないが、基本的に隙間は小さい方が好ましい。
【００１３】
隙間としては隙間の最大部分で３００μｍ以下が好ましく、より好ましくは２５０μｍ以下、さらに好ましくは２００μ以下、特に好ましくは１５０μｍ以下、最も好ましくは１２０μｍ以下である。なお、隙間は現実的には１μ以上であることが好ましい。なお、隙間の最少部分では０．１μ以上であることが好ましく、より好ましくは０．３μ以上である。隙間が狭すぎると、フローセル内のスムーズな流れが阻害され、フローセル内の溶液置換に時間を要することになる場合がある。また、正確に隙間を確保するため、フローセルに凸部を設けても良いし、別途スペーサーを用いても良い。
【００１４】
シール材断面は、円形、楕円形、略四角形、略六角形などの形状が例として挙げられ、溝形状も同様に、底部を平らとしたもの、半円形としたもの、三角形としたもの、溝全体を三角形としたもの等が挙げられる。
【００１５】
シール材は安価かつ入手容易であることからＯリングが好ましい。Ｏリングの材質は特に限定されるものではないが、ゴム系の材質が好ましい。例としては、天然ゴム、スチレンブタジエンゴム、イソプレンゴム、クロロプレンゴム、ＳＩＳゴム、ＳＩＢＳゴム、エチレンプロピレンゴム、エチレンブタジエンゴム、ＥＰＤＭ、ニトリルゴム、アクリル系ゴム、ウレタン系ゴム、ポリエステル系エラストマー、フッ素系ゴム、シリコンゴムなどの素材が挙げられ、発泡体であっても良いし、これらのブレンド体であっても良い。
【００１６】
また、ＳＰＲ観察の際はアレイを上下左右に整列させて観察することが好ましいが、シール材を円形に設置した場合、その中で最大の測定数をとろうとすると、観察するアレイ整列部分を含む状態で真円をとる必要があり、無駄な区域が多い。従って、円形以外の形状で設置する方が好ましい。
【００１７】
シール材を配置する際には、配置された状態でのシール材の長さをa、配置された状態でのシール材の最大径を直径とする真円の円周長さをｂとした場合、式（２）を満たすよう配置することが好ましい（なお、配置された状態でのシール材の長さ、配置された状態でのシール材の最大径の計測はシール材の厚みの中間位置とする）。
ａ／ｂ＜１．０００式（２）
なお、より好ましくはａ／ｂは０．９９５以下であり、さらに好ましくは０．９９０以下である。また、ａ／ｂの下限は０．８００が好ましく、より好ましくは０．８３０、さらに好ましくは０．８５０である。
【００１８】
ａ／ｂ＝１の場合はシール材の設置された形状は真円であり、０．９９５以上の場合は、効率よくアレイ整列部分をとりにくい。また、ａ／ｂを０．８未満にした場合もＳＰＲの視野が通常円形であるため、効率よくアレイ整列部分をとりにくくなる。
シール材を配置する具体的な真円以外の形状としては、略正方形（正方形の場合ａ／ｂ＝０．９００）、略長方形、略六角形（正六角形の場合ａ／ｂ＝０．９５５）、略楕円形、円の相対する一部分づつを直線で切り取った形状、などが挙げられる。
【００１９】
フローセルの材質としては、特に限定されず、金属、ガラス、セラミック、樹脂、などが挙げられる、樹脂としては、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリスチレンやＡＢＳ樹脂などのスチレン系樹脂、酢酸ビニル、塩化ビニル、ＰＥＴやＰＢＴやＰＥＴ−Ｇ（Ｒ）等のポリエステル、６−ナイロンや６，６−ナイロン等のポリアミド、ポリカーボネート、ＰＭＭＡ、メラミン樹脂、フェノール樹脂、デルリン（Ｒ）やジュラコン（Ｒ）等のアセタール樹脂、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、テフロン（Ｒ）等のフッ素系樹脂、ポリジメチルシロキサン等のケイ素系樹脂、各種ゴム類、等がある。加工方法としては、削り出し、焼成、エッチング、射出など、それぞれの素材に適合したものであれば、特に限定されるものではない。
【００２０】
また、溶液の流れ込みのために流入孔、流出孔が設けられるが、セル内への溶液のスムーズな拡散のために、流入孔、流出孔形状に工夫をしても良い。
工夫としては、孔のセル内部側にテーパー角を設ける、孔の角度を傾ける、複数の孔にする、スリット状の孔形状とするなどが挙げられる。
【００２１】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２２】
［実施例］
線径１．５ｍｍ、内径１５．５ｍｍのシリコンゴム製Ｏリングを幅１．５ｍｍ、深さ１．１ｍｍの角を丸くした四角形のＯリング設置溝に設置した。フローセルの図を図１に示す。フローセルの材質はポリアセタールである。この場合のＡ１／Ａ２は１．０７であり、式（１）を満たす。また、ａ／ｂは０．９３１であり、式（２）を満たす。
【００２３】
このフローセルと観察用スライドをＳＰＲイメージング装置（ＳＰＲｉｍａｇｅｒ：ＧＷＣｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）にセットして観察を行った。観察用スライドは以下の手順で用意した。
【００２４】
厚さ１ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍｍのＳＦ１０製透明ガラス基板上にクロム１ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着した。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターした。金が表面に蒸着された基板を８−Ａｍｉｎｏ−１−Ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，Ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ（８−ＡＯＴ，同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、８−ＡＯＴの自己組織化表面を形成させた。分子量２０００のスクシンイミド基末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ，ＳｈｅａｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓ社製）をｐＨ７．４のリン酸緩衝液に１０ｍｇ／ｍｌで溶解し、金表面の８−ＡＯＴに２時間反応させ、ＰＥＧを表面に固定化した。
【００２５】
水晶上にクロムでパターンを描いたフォトマスクを基板上に置き、ウシオ電機社製１０００Ｗ高圧水銀ランプにて一時間照射してパターン化を行った。フォトマスクのパターンは５００μｍ×５００μｍの四角形（スポット）が１００個並んだものである。照射後、ミリＱ水とエタノールで洗浄したのち、７−Ｃａｒｂｏｘｙ−１−Ｈｅｐｔａｎｅｔｈｉｏｌ（７−ＣＨＴ、同仁化学研究所製）の１ｍＭエタノール溶液に１６時間浸漬し、光を照射した部分に７−ＣＨＴの自己組織化表面を形成させた。次に０．２Ｍ水溶性カルボジイミド（ナカライテスク社製）、０．０５ＭＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク社製）をリン酸緩衝液に溶解させ、１５分間反応させ、７−ＣＨＴのカルボキシル基を活性化させた。すぐに１ｍＭのＡＢ−ＮＴＡ（同仁化学研究所製）を３０分反応させ、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）基を固定化部位に導入した。未反応のスクシンイミド基は１Ｍエタノールアミン溶液（ｐＨ８．５）を１０分間反応させブロッキングした。
【００２６】
８Ｍ尿素溶液をフローセル内に充填しておき、ＭｉｌｌｉＱ水を１００μｌ／ｍｉｎで流したときの経時的ＳＰＲ像を図２〜５に示す。図で斜線領域は黒く見える部分であり、非斜線部は白く見える部分である（屈折率の違いにより、尿素濃厚溶液が存在している部分は白くみえ、ｍｉｌｌｉＱ水で洗い流された部分は黒く見える。）、また、外側の太線はＯリングの位置を示し、中の四角はスポットであり、実線は周囲と比較してさらに黒く見え、点線部はスポットが見えなくなっている部分である。なお、ＳＰＲ観察は、角度をもって観察するため、扁平に見える。
図２〜５により、実施例のプローセルは２０秒で尿素溶液を洗い流し、除去できることを示している。また、Ｏリングが四角形に設置されているため、視野が広く、５００μｍ四方のスポット１００個が十分に観察できる。
【００２７】
また、フローセル内を緩衝液で満たしておき、２００μｌの２．５ｍＭ塩化ニッケル（II）を１００μｌ／ｍｉｎでフローセル内に流しいれ、再度緩衝液を流したときのＳＰＲシグナル変化を図６に示す。塩化ニッケル溶液の屈折率の違いによって、溶液が入るとシグナルが増加する。シグナルの立ち上がりは極めて急峻であり、かつ再度緩衝液を流したときの切り替えも非常に速い。
【００２８】
［比較例］
線径１．７８ｍｍ、内径１２．４２ｍｍのニトリルゴム製Ｏリングを内径１２．５ｍｍ、幅１．８ｍｍ、深さ１．２ｍｍの円形のＯリング設置溝に設置した。この場合のＡ₁／Ａ₂は１．１５であり、式（１）を満たさない。ａ／ｂは１．００である。
【００２９】
このフローセルと観察用スライドをＳＰＲイメージング装置にセットして観察を行った。８Ｍ尿素溶液をフローセル内に充填しておき、ＭｉｌｌｉＱ水を１００μｌ／ｍｉｎで流したときの経時的ＳＰＲ像を図７〜９に示す。尿素溶液を洗い流すのは非常に時間がかかり、９０秒流しても十分に洗い流せていない。また、Ｏリングは円形に設置しているため、５００μｍ四方のスポット１００個は端の部分が観察しづらい。
【００３０】
また、フローセル内を緩衝液で満たしておき、２００μｌの２．５ｍＭ塩化ニッケル（II）を１００μｌ／ｍｉｎでフローセル内に流しいれ、再度緩衝液を流したときのＳＰＲシグナル変化を図１０に示す。シグナルの立ち上がりはやや遅く、再度緩衝液を流したとき、切り替わるのが非常に遅い。
【００３１】
【発明の効果】
本発明のＳＰＲフローセルは少ないサンプル量で測定可能かつ、サンプルの切り替えが迅速にできるため、ＳＰＲ観察において、リアルタイムで様々な測定を正確に行うことが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で用いたフローセルの上面および断面図単位（ｍｍ）
【図２】実施例で８Ｍ尿素溶液を洗浄したときのＳＰＲ像の経時変化（５秒後）
【図３】実施例で８Ｍ尿素溶液を洗浄したときのＳＰＲ像の経時変化（１０秒後）
【図４】実施例で８Ｍ尿素溶液を洗浄したときのＳＰＲ像の経時変化（１５秒後）
【図５】実施例で８Ｍ尿素溶液を洗浄したときのＳＰＲ像の経時変化（２０秒後）
【図６】２．５ｍＭ塩化ニッケル注入時のＳＰＲシグナル変化（実施例）
【図７】比較例で８Ｍ尿素溶液を洗浄したときのＳＰＲ像の経時変化（３０秒後）
【図８】比較例で８Ｍ尿素溶液を洗浄したときのＳＰＲ像の経時変化（６０秒後）
【図９】比較例で８Ｍ尿素溶液を洗浄したときのＳＰＲ像の経時変化（９０秒後）
【図１０】２．５ｍＭ塩化ニッケル注入時のＳＰＲシグナル変化（比較例）

Claims

Ｏリングによってフローセルと観察用スライドの金表面の隙間にサンプル流路が確保された表面プラズモン共鳴測定用フローセルであり、
観察用スライドの該金表面上に５００μｍ四方のスポット１００個（縦１０×横１０）が配置されており、
線径１．５ｍｍ、内径１５．５ｍｍのＯリングを、該フローセル上の略正方形のＯリング設置溝でありかつ当該設置溝の幅が１．５ｍｍ、深さ１．１ｍｍである設置溝に設置することを特徴とする表面プラズモン共鳴イメージング測定用フローセル。
請求項１に記載の表面プラズモン共鳴イメージング測定用フローセルを搭載したことを特徴とするＳＰＲイメージング装置。
請求項１に記載の表面プラズモン共鳴イメージング測定用フローセルを用いて表面プラズモン共鳴イメージング測定をすることを特徴とする方法。