JP4370409B2 - Cancer prognosis prediction method - Google Patents

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Description

本発明は、癌患者の癌組織サンプルの遺伝子の発現量から得られた遺伝子発現プロファイルに基づいた、該腫瘍組織/腫瘍細胞におけるp53遺伝子の病的変異の有無の検出方法、癌の予後予測方法、及びそれらの方法に使用し得るキット等に関する。   The present invention relates to a method for detecting the presence or absence of a pathogenic mutation in the p53 gene in a tumor tissue / tumor cell based on a gene expression profile obtained from the expression level of a gene in a cancer tissue sample of a cancer patient, and a method for predicting cancer prognosis And a kit that can be used in those methods.

癌は遺伝子病であり、各腫瘍型には発がんに関するいくつかの共通な分子機構が存在することが示されている。退院した癌患者の予後について、近年、遺伝子やタンパク質の発現プロフィールの測定に関する研究開発が精力的に行われた結果、癌組織の遺伝子やタンパク質の発現状態を測定することが可能となってきている。これらの測定法を適用して、癌患者の予後を予測する方法は多く報告されているが、これまでのところ、多種類の癌に対して簡便にかつ高精度に予後を予測する方法が報告されていないこともまた周知の通りである。   Cancer is a genetic disease and each tumor type has been shown to have several common molecular mechanisms for carcinogenesis. As a result of intensive research and development on the measurement of gene and protein expression profiles in recent years, it has become possible to measure the expression status of genes and proteins in cancer tissues. . Many methods for predicting the prognosis of cancer patients by applying these measurement methods have been reported, but so far, methods for predicting the prognosis easily and accurately for many types of cancer have been reported. It is also well known that this is not done.

腫瘍におけるゲノム上の変化は多様であり、個々の腫瘍を遺伝子レベルで解析し、発がんの分子機構の全容を解明することは容易ではない。この複雑ながんの分子機構を解明するためには2つのアプローチがある。1つは培養細胞や動物モデルを用いた単純化モデルによる研究方法である。この方法は発がん初期の分子機構や分子経路の解明には極めて有用であるが、複雑系の全容を把握することは困難であり、また動物モデルの場合はヒトに応用できるとは限らない欠点がある。   Genomic changes in tumors are diverse, and it is not easy to analyze individual tumors at the genetic level and elucidate the complete molecular mechanism of carcinogenesis. There are two approaches to elucidating the molecular mechanism of this complex cancer. One is a research method based on a simplified model using cultured cells and animal models. Although this method is extremely useful for elucidating the molecular mechanism and molecular pathway in the early stages of carcinogenesis, it is difficult to comprehend the entire complex system, and in the case of animal models, it is not always applicable to humans. is there.

もう1つの方法はヒト腫瘍を用いて複雑な情報を網羅的に収集し、複雑系から共通の分子機構を抽出する方法である。マイクロアレイのデータ解析の方法としては、Unsupervised analysisとSupervised analysisの大きく2つに分けられる。Unsupervised analysisとはサンプルを遺伝子発現パターンの類似性により分類し、分けられた各群と既知の病理組織学的因子や予後との相関を見いだそうとするものである。Florinらは36例の乳癌についてマイクロアレイを行い、Unsupervised analysis によって、エストロゲンレセプター(ER)、リンパ節転移、腫瘍径および臨床病期のそれぞれと相関性の高い遺伝子群を見いだした(非特許文献1)。またSorlieらはUnsupervised analysisにより、乳癌が遺伝子発現パターンにより5つのグループに分けられ、それぞれのグループで予後が異なることを示した(非特許文献2)。これに対してSupervised analysisとは、既知の2群の間で統計学的に有意な発現差のある遺伝子を抽出し、この2群を区別できる遺伝子リストを作成する方法である。Supervised analysisを用いたマイクロアレイ解析はERの発現の有無及びヒト上皮細胞成長因子受容体(HER2)発現の有無など多数報告されているが、その中でvan’t Veerらはリンパ節転移陰性の孤発性乳癌78例を用いて5年以内遠隔転移再発の有無によって70遺伝子を抽出した(非特許文献3)。またこの70遺伝子を用いた予後予測により、これまでの臨床病理学的因子による予測よりも精度が高いことを示している(非特許文献4)。 Another method is to collect complex information exhaustively using human tumors and extract common molecular mechanisms from complex systems. Microarray data analysis methods can be broadly divided into two types: Unsupervised analysis and Supervised analysis. Unsupervised analysis classifies samples according to the similarity of gene expression patterns and seeks to find the correlation between each divided group and known histopathological factors and prognosis. Florin et al. Performed microarray on 36 breast cancers and found genes highly correlated with each of estrogen receptor (ER), lymph node metastasis, tumor diameter and clinical stage by Unsupervised analysis (Non-patent Document 1). . In addition, Sorlie et al. Showed by unsupervised analysis that breast cancers were divided into five groups according to gene expression patterns, and that each group had a different prognosis (Non-patent Document 2). On the other hand, Supervised analysis is a method of extracting genes having a statistically significant difference in expression between two known groups and creating a gene list that can distinguish the two groups. Microarray analysis using supervised analysis has been reported to include the presence or absence of ER expression and the presence or absence of human epidermal growth factor receptor (HER2) expression. Among them, van't Veer et al. 70 genes were extracted from 78 cases of developing breast cancer according to the presence or absence of distant metastasis within 5 years (Non-patent Document 3). In addition, the prognosis prediction using the 70 gene indicates that the accuracy is higher than that of the prediction based on the clinicopathological factors so far (Non-patent Document 4).

DNAが損傷した際、その細胞はアポトーシスに向かうこともあれば、修復されることもある。このDNA修復の過程にエラーが入ることで、その遺伝子に突然変異(mutation)が生じ、突然変異は細胞の癌化を高確率で引き起こす。従って、がん患者の予後を決定する遺伝子の候補として、DNA修復遺伝子(DNA damage repairgenes)、がん遺伝子(oncogenes、tumor-related genes)、がん抑制遺伝子( tumor suppressor genes)、増殖因子(growth factors)、及び、アポトーシス遺伝子(apoptosis genes)などが挙げられる。 When DNA is damaged, the cells can either go to apoptosis or be repaired. When an error occurs in the DNA repair process, a mutation occurs in the gene, and the mutation causes cell canceration with a high probability. Therefore, DNA repair genes (oncogenes, tumor-related genes), tumor suppressor genes, growth factors (growth) factors) and apoptosis genes.

p53遺伝子は、殆どのヒトの癌で見出されるがん抑制遺伝子であり、細胞周期を止める活性を有する。特に、放射線、薬剤などによる損傷を受けた細胞の周期を停止させたり、アポトーシスを引き起こさせるのに働いていると考えられている。従って、p53遺伝子に異常があると、損傷を受けた細胞がそのまま増殖し癌が発生すると考えられる。尚、p53は四量体として機能する転写調節因子であり、細胞周期の制御に関与するCDK(サイクリン依存性キナーゼ)/サイクリン複合体の阻害タンパク質であるp21等、複数の転写を活性化する。   The p53 gene is a tumor suppressor gene found in most human cancers and has an activity to stop the cell cycle. In particular, it is thought to work to stop the cycle of cells damaged by radiation, drugs, etc., or to induce apoptosis. Therefore, if there is an abnormality in the p53 gene, it is considered that damaged cells proliferate as they are and cancer occurs. P53 is a transcriptional regulator functioning as a tetramer, and activates a plurality of transcriptions such as p21 which is an inhibitory protein of CDK (cyclin dependent kinase) / cyclin complex involved in cell cycle control.

特許文献1では、遺伝子および/またはタンパク質の発現パターンを、癌が再発した患者および癌が再発していない患者由来のヒト原発腫瘍の遺伝子および/またはタンパク質発現パターンと比較することによって、癌の再発を予測する方法を提案している。
特許文献2では、56種類の遺伝子の発現状態を測定することにより、乳癌の予後を高い精度で予測できることを示しているが、乳癌に対する予後に限定されている。また、特許文献3では、癌抑制遺伝子であるp53遺伝子により産生されるp53の状態を測定することにより、癌の診断を行うことを提案しているが、予後の予測に関する提案は行っていない。これまでp53遺伝子変異に関して多くの報告があるが、報告された変異には5〜10 %で検出の際のエラーや表記ミスがあるとされている(非特許文献5,6)。従って、p53遺伝子の変異の有無を予測する遺伝子発現ファイルを作成するためには、p53遺伝子変異の検出を最大限として、偽陰性と偽陽性を最小限に抑えることが必要である。
特表2004-536610号 特開2004-344171号 特表2001-523441号 Selaru, F. M., Yin, J., Olaru, A., Mori, Y., Xu, Y., Epstein, S. H., Sato, F., Deacu, E., Wang, S., Sterian, A., Fulton, A., Abraham, J. M., Shibata, D., Baquet, C., Stass, S. A., and Meltzer, S. J. An unsupervised approach to identify molecular phenotypic components influencing breast cancer features. Cancer Res, 64: 1584-1588, 2004. Sorlie, T., Perou, C. M., Tibshirani, R., Aas, T., Geisler, S., Johnsen, H., Hastie, T., Eisen, M. B., van de Rijn, M., Jeffrey, S. S., Thorsen, T., Quist, H., Matese, J. C., Brown, P. O., Botstein, D., Eystein Lonning, P., and Borresen-Dale, A. L. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci U S A, 98: 10869-10874, 2001. van 't Veer, L. J., Dai, H., van de Vijver, M. J., He, Y. D., Hart, A. A., Mao, M., Peterse, H. L., van der Kooy, K., Marton, M. J., Witteveen, A. T., Schreiber, G. J., Kerkhoven, R. M., Roberts, C., Linsley, P. S., Bernards, R., and Friend, S. H. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature, 415: 530-536, 2002. van de Vijver, M. J., He, Y. D., van't Veer, L. J., Dai, H., Hart, A. A., Voskuil, D. W., Schreiber, G. J., Peterse, J. L., Roberts, C., Marton, M. J., Parrish, M., Atsma, D., Witteveen, A., Glas, A., Delahaye, L., van der Velde, T., Bartelink, H., Rodenhuis, S., Rutgers, E. T., Friend, S. H., and Bernards, R. A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med, 347: 1999-2009, 2002. Soussi, T., Kato, S., Levy, P., and Ishioka, C. Reassessment of the TP53 mutation database in human diesase by data mining with a library of TP53 missense mutations. Hum Mutat, 2004. Soussi, T., Dehouche, K., and Beroud, C. p53 website and analysis of p53 gene mutations in human cancer: forging a link between epidemiology and carcinogenesis. Hum Mutat, 15: 105-113, 2000.
In Patent Document 1, the recurrence of cancer is determined by comparing the gene and / or protein expression pattern with the gene and / or protein expression pattern of a human primary tumor derived from a patient with cancer recurrence and a patient with no cancer recurrence. We propose a method to predict
Patent Document 2 shows that the prognosis of breast cancer can be predicted with high accuracy by measuring the expression states of 56 types of genes, but the prognosis for breast cancer is limited. Moreover, in patent document 3, although it proposes performing the diagnosis of cancer by measuring the state of p53 produced by p53 gene which is a tumor suppressor gene, the proposal regarding the prediction of prognosis is not performed. There have been many reports on p53 gene mutations so far, but it has been reported that 5-10% of reported mutations have errors in detection and notation errors (Non-Patent Documents 5 and 6). Therefore, in order to create a gene expression file that predicts the presence or absence of mutations in the p53 gene, it is necessary to maximize detection of p53 gene mutations and to minimize false negatives and false positives.
Special table 2004-536610 JP2004-344171 Special table 2001-523441 Selaru, FM, Yin, J., Olaru, A., Mori, Y., Xu, Y., Epstein, SH, Sato, F., Deacu, E., Wang, S., Sterian, A., Fulton, A., Abraham, JM, Shibata, D., Baquet, C., Stass, SA, and Meltzer, SJ An unsupervised approach to identify molecular phenotypic components influencing breast cancer features.Cancer Res, 64: 1584-1588, 2004. Sorlie, T., Perou, CM, Tibshirani, R., Aas, T., Geisler, S., Johnsen, H., Hastie, T., Eisen, MB, van de Rijn, M., Jeffrey, SS, Thorsen , T., Quist, H., Matese, JC, Brown, PO, Botstein, D., Eystein Lonning, P., and Borresen-Dale, AL Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications.Proc Natl Acad Sci USA, 98: 10869-10874, 2001. van 't Veer, LJ, Dai, H., van de Vijver, MJ, He, YD, Hart, AA, Mao, M., Peterse, HL, van der Kooy, K., Marton, MJ, Witteveen, AT, Schreiber, GJ, Kerkhoven, RM, Roberts, C., Linsley, PS, Bernards, R., and Friend, SH Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer.Nature, 415: 530-536, 2002. van de Vijver, MJ, He, YD, van't Veer, LJ, Dai, H., Hart, AA, Voskuil, DW, Schreiber, GJ, Peterse, JL, Roberts, C., Marton, MJ, Parrish, M ., Atsma, D., Witteveen, A., Glas, A., Delahaye, L., van der Velde, T., Bartelink, H., Rodenhuis, S., Rutgers, ET, Friend, SH, and Bernards, R. A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer.N Engl J Med, 347: 1999-2009, 2002. Soussi, T., Kato, S., Levy, P., and Ishioka, C. Reassessment of the TP53 mutation database in human diesase by data mining with a library of TP53 missense mutations.Hum Mutat, 2004. Soussi, T., Dehouche, K., and Beroud, C. p53 website and analysis of p53 gene mutations in human cancer: forging a link between epidemiology and carcinogenesis.Hum Mutat, 15: 105-113, 2000.

p53遺伝子の変異の有無を決定する方法として、免疫組織染色法、SSCP法、DNAシークエンス法などがある。免疫組織染色、SSCP法は偽陽性及び偽陰性も多く、変異の信頼性という点でDNAシークエンス法に劣る。予後との相関性に関する報告でも、DNAシークエンス法の優位性は明らかである。しかしながら、臨床上、予後因子としてp53遺伝子の変異の有無を用いようとする場合、DNAシークエンス法は、変異状況を正確に決定するためには全翻訳領域のシークエンスを行う必要があり、非常に多くの手間と時間を要する。また、変異の有無のみでp53遺伝子の変異による影響を決定出来ないことは明らかである。このため、以下に述べる病的変異と非病的変異とを区別するために、見つかった変異体の機能評価も必要であり、DNAシークエンス法を臨床応用することは現実問題として難しいと考えられる。   Methods for determining the presence or absence of mutations in the p53 gene include immunohistochemical staining, SSCP, and DNA sequencing. Immunohistochemical staining and SSCP have many false positives and false negatives, and are inferior to DNA sequencing in terms of mutation reliability. The superiority of DNA sequencing is evident in reports on correlation with prognosis. However, clinically, when using the presence or absence of mutations in the p53 gene as a prognostic factor, the DNA sequencing method requires sequencing of the entire translation region in order to accurately determine the mutation status. Takes time and effort. In addition, it is clear that the effect of mutation of the p53 gene cannot be determined only by the presence or absence of mutation. For this reason, in order to distinguish between the pathological mutations described below and non-pathological mutations, it is also necessary to evaluate the functions of the mutants found, and it is considered difficult to apply the DNA sequencing method clinically.

本発明は、上記の問題点を克服し、腫瘍組織/腫瘍細胞におけるp53遺伝子の病的変異の有無を検出し、又、多種類の癌患者に対して、予後に不要な治療を受ける患者数を減らす等、最適な予後の治療方針を決定することを可能とする高感度な予後を予測する方法等を提供することを目的とする。   The present invention overcomes the above problems, detects the presence or absence of pathological mutations in the p53 gene in tumor tissue / tumor cells, and receives a number of patients who receive unnecessary treatment for various types of cancer patients. It is an object of the present invention to provide a highly sensitive method for predicting a prognosis that makes it possible to determine an optimal prognosis treatment policy such as reducing the prognosis.

本発明者らは、上記の点に鑑みて種々の検討を鋭意行った結果、癌抑制遺伝子であるp53遺伝子の病的変異の有無により発現量に影響を受ける特定の遺伝子の内、特に注目すべき遺伝子群(表1に示した70個から成る遺伝子群)を見いだし、それらの遺伝子及び/又はタンパク質の発現量変化を測定することによって、広範囲の種類の癌患者について、野生型(ローリスク)群又は病的変異型(ハイリスク)群を検出することが可能であることを見いだした。尚、本発明において、p53遺伝子の塩基配列における変異であっても、本明細書中の「DNAシークエンシングによるp53遺伝子の変異解析」に示されているような、転写活性が失われるようなミスセンス変異、タンパク切断型変異(ナンセンス変異、フレームシフト変異)及びスプライシング部位の変異のような「病的変異」以外の変異は「非病的変異」とし、このような非病的変異型も本発明の「野生型」に含める。   As a result of diligent investigations in view of the above points, the present inventors pay particular attention to a specific gene that is affected by the expression level depending on the presence or absence of a pathogenic mutation in the p53 gene, which is a tumor suppressor gene. The wild type (low risk) group for a wide variety of cancer patients by finding the power gene group (the gene group consisting of 70 shown in Table 1) and measuring changes in the expression level of those genes and / or proteins Or, it was found possible to detect a pathological variant (high risk) group. In the present invention, even if the mutation is in the nucleotide sequence of the p53 gene, a missense that causes loss of transcriptional activity as shown in “Mutation analysis of p53 gene by DNA sequencing” in the present specification. Mutations other than "pathological mutations" such as mutations, protein-cutting mutations (nonsense mutations, frameshift mutations) and splicing site mutations are referred to as "non-pathological mutations". Included in “wild type”.

本発明は、上記の知見に基づいてなされたものであり、以下のとおりである。
即ち、本発明の第一の態様として、以下の工程:
(1)腫瘍組織/腫瘍細胞における表1中の任意の遺伝子群(「表1中の番号、「Genbank」及び「Common name」で特定された70個から成る遺伝子群」を意味する。以下、同様)の発現量を測定し、
(2)該発現量から得られた遺伝子発現プロファイルと、予め求めたp53遺伝子の病的変異型及び野生型(以下、「非病的変異型」も含む)の遺伝子発現プロファイルとの間の相関係数を求め、
(3)相関係数のより大きい方の型の遺伝子発現プロファイルに得られた遺伝子発現プロファイルを帰属させることから成る、該腫瘍組織/腫瘍細胞におけるp53遺伝子の病的変異の有無の検出方法に係る。
This invention is made | formed based on said knowledge, and is as follows.
That is, as a first aspect of the present invention, the following steps:
(1) An arbitrary gene group in Table 1 in a tumor tissue / tumor cell (meaning “a gene group consisting of 70 identified by the numbers in Table 1,“ Genbank ”and“ Common name ”). The same)),
(2) Phase between the gene expression profile obtained from the expression level and the gene expression profile of the pathogenic variant and the wild type (hereinafter also including “non-pathological variant”) of the p53 gene determined in advance Find the number of relationships
(3) A method for detecting the presence or absence of a pathogenic mutation in the p53 gene in the tumor tissue / tumor cell, comprising assigning the gene expression profile obtained to the gene expression profile of the type with the larger correlation coefficient .

本発明の第二の態様として、以下の工程:
(1)腫瘍組織/腫瘍細胞における表1中の任意の遺伝子群の発現量を測定し、
(2)該発現量から得られた遺伝子発現プロファイルと、予め求めたp53遺伝子の病的変異型及び野生型の遺伝子発現プロファイルとの間の相関係数を求め、
(3)相関係数のより大きい方の型の遺伝子発現プロファイルに得られた遺伝子発現プロファイルを帰属させ、
(4)病的変異型の遺伝子発現プロファイルの場合には予後が不良であり、野生型の遺伝子発現プロファイルの場合には予後が良好であると決定することから成る、癌の予後の予測方法に係る。
As a second aspect of the present invention, the following steps:
(1) Measure the expression level of any gene group in Table 1 in tumor tissue / tumor cells,
(2) Obtaining a correlation coefficient between the gene expression profile obtained from the expression level and the previously determined pathogenic variant and wild type gene expression profiles of the p53 gene,
(3) Assign the obtained gene expression profile to the gene expression profile of the type with the larger correlation coefficient,
(4) A method for predicting the prognosis of cancer, comprising determining that the prognosis is poor in the case of a gene expression profile of a pathological variant and that the prognosis is good in the case of a wild type gene expression profile. Related.

更に、本発明の第三の態様として、表1中の任意の遺伝子群の少なくとも一部の塩基配列から成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む、本発明の方法に用いることが出来るキットに係る。 Furthermore, the third aspect of the present invention relates to a kit that can be used in the method of the present invention, comprising a polynucleotide or oligonucleotide consisting of at least a part of the base sequence of any gene group in Table 1.

Figure 0004370409
Figure 0004370409

本発明によれば、腫瘍組織/腫瘍細胞におけるp53遺伝子の病的変異の有無を、様々な手段を用いて比較的短時間で簡便に、且つ、高い精度で検出することが出来、更に、癌患者の予後の程度を統計学的に有意に予測することが可能となり、それらに基き予後の治療方針を決定することができる。 According to the present invention, the presence or absence of a pathological mutation of the p53 gene in a tumor tissue / tumor cell can be detected in a relatively short time and with high accuracy by using various means. The degree of prognosis of a patient can be predicted statistically significantly, and the prognostic treatment policy can be determined based on them.

本発明方法において使用する遺伝子群は、表1に記載された遺伝子(全70種類)から任意に選択された遺伝子から構成される。選択される遺伝子の数に特に制限はないが、遺伝子群は、好ましくは、例えば、9個以上、10個以上、25個以上、33個以上、若しくは46個以上、又は70個全ての遺伝子から構成される。   The gene group used in the method of the present invention is composed of genes arbitrarily selected from the genes listed in Table 1 (all 70 types). Although the number of genes to be selected is not particularly limited, the gene group is preferably selected from, for example, 9 or more, 10 or more, 25 or more, 33 or more, 46 or more, or all 70 genes. Composed.

表1から本発明方法に使用する遺伝子群を構成する各遺伝子の選択方法も任意である。例えば、ランダムに選択することも出来るし、又は、病的変異型発現プロファイル及び野生型発現プロファイルにおける発現量の差の有意性を示すP値を基準にして、P値が0.05より小さい、又は0.01より小さい遺伝子の中から選択することも出来る。更に、P値の大きい順又は小さい順に適当な間隔で適当な数の遺伝子を選択することも可能である。尚、本発明方法で使用される病的変異型発現プロファイル及び野生型発現プロファイルの代表的例として、表7に示されるものを挙げることが出来る。   From Table 1, the selection method of each gene constituting the gene group used in the method of the present invention is also arbitrary. For example, it can be selected at random, or the P value is less than 0.05 based on the P value indicating the significance of the difference in expression level in the pathological variant expression profile and the wild type expression profile. Alternatively, it can be selected from genes smaller than 0.01. Furthermore, it is possible to select an appropriate number of genes at appropriate intervals in descending order of P value. As typical examples of the pathogenic variant expression profile and the wild type expression profile used in the method of the present invention, those shown in Table 7 can be mentioned.

更に、本発明の癌の予後の予測方法にあっては、相関係数の大小により、得られた発現プロファイルが病的変異型発現プロファイル及び野生型発現プロファイルのいずれに属するか決定する工程において、相関係数におけるP値が0.05以上の場合には、癌の予後の予測不可能とすることによって、その予測精度を一層高めることが出来る。   Furthermore, in the method for predicting the prognosis of cancer according to the present invention, in the step of determining whether the obtained expression profile belongs to a pathological variant expression profile or a wild type expression profile, depending on the magnitude of the correlation coefficient. When the P value in the correlation coefficient is 0.05 or more, the prediction accuracy can be further improved by making the cancer prognosis unpredictable.

遺伝子の発現とは、遺伝子自身がもつ情報をRNA又はタンパク質という機能を有する遺伝子産物を産生することである。従って、遺伝子の発現量は、遺伝子から転写されたmRNA、又は該mRNAから翻訳されたタンパク質の量を測定することによって行うことが出来る。本発明方法においてこのような、腫瘍組織/腫瘍細胞における遺伝子の発現量は、当業者に公知の任意の方法・手段で測定することが出来る。 Gene expression refers to the production of a gene product having the function of RNA or protein based on information held by the gene itself. Therefore, the expression level of a gene can be determined by measuring the amount of mRNA transcribed from the gene or the protein translated from the mRNA. In the method of the present invention, the expression level of the gene in the tumor tissue / tumor cell can be measured by any method / means known to those skilled in the art.

例えば、発現されたmRNA量の測定としては、DNAマイクロアレイ(又は、DNAチップ)、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、ノーザンブロッティング(ノーザンハイブリダイゼーション)、インサイチューハイブリダイゼーション、RNA分解酵素プロテクションアッセイ、及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)等を用いることが出来る。一方、タンパク質量の測定としては、ウェスタンブロッティング、ELISAアッセイ、タンパク質アレイ、免疫組織染色、及びイーストツーハイブリッド(Yeast Two Hybrid)等を挙げることができる。
発現レベルの解析はそうしたシグナル強度の比較によって行う。これには「検査試料中の遺伝子の発現強度」対「対照試料中の遺伝子の発現強度」の比率行列を生成させるのが最善である。
本発明は既存の測定法により得られた発現量を統計的に処理することによって、高精度で癌患者の予後を予測が可能となる特定の遺伝子の発現プロファイルを見いだしたことに基くものである。
遺伝子発現プロファイルはまた、様々な方法で表示することができる。最も一般的な方法は、列が検査試料を、そして行が遺伝子をそれぞれ示すグラフィカル・デンドグラム(graphical dendogram)に、比率行列を配列させる方法である。データは、類似の発現プロファイルを示す遺伝子が互いに近接するように配列される。各遺伝子の発現比率は色で視覚化される。たとえば1未満の比率(下方調節を示す)はスペクトルの青色部分に、また1を超える(上方調節を示す)比率はスペクトルの赤色部分に、それぞれ現れるようにしてもよい。そうしたデータ表示には商業上利用可能なコンピュータソフトウェアたとえばSilicon Genetics, Inc.の“GENESPRING”、およびPartek, Inc.の“DISCOVERY”や“INFER”などを利用できる。
For example, measurement of the amount of mRNA expressed includes DNA microarray (or DNA chip), oligonucleotide microarray, Northern blotting (Northern hybridization), in situ hybridization, RNase protection assay, and reverse transcription polymerase chain reaction ( RT-PCR) and the like can be used. On the other hand, examples of the protein amount measurement include Western blotting, ELISA assay, protein array, immunohistochemical staining, and Yeast Two Hybrid.
Expression level analysis is performed by comparing such signal intensities. It is best to generate a ratio matrix of “expression intensity of gene in test sample” versus “expression intensity of gene in control sample”.
The present invention is based on finding an expression profile of a specific gene that can predict the prognosis of a cancer patient with high accuracy by statistically processing the expression level obtained by an existing measurement method. .
Gene expression profiles can also be displayed in various ways. The most common method is to arrange the ratio matrix into a graphical dendogram where the columns represent the test sample and the rows represent the genes. The data is arranged so that genes showing similar expression profiles are in close proximity to each other. The expression ratio of each gene is visualized by color. For example, a ratio less than 1 (indicating down-regulation) may appear in the blue portion of the spectrum, and a ratio greater than 1 (indicating up-regulation) may appear in the red portion of the spectrum. Such data can be displayed using commercially available computer software such as “GENESPRING” from Silicon Genetics, Inc. and “DISCOVERY” and “INFER” from Partek, Inc.

従って、本発明のキットは、腫瘍組織/腫瘍細胞における遺伝子及び/又は該遺伝子がコードするタンパク質の発現量を測定する方法・手段に応じて、適当な構成をとることが出来る。例えば、本発明キットに含まれる表1中の任意の遺伝子の少なくとも一部の塩基配列から成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの長さは数十塩基対とすること出来、それらの具体的な部分(塩基配列)は、例えば、表1に記載のデータベース(Genbank)等の各種のデータベースから容易に入手できる情報に基き、当業者が適宜、選択・設計し調製することが出来る。又、それらはDNAチップ又はノーザンブロッティングにおけるプロ−ブ、PCRにおけるプライマー等の形態で使用することが出来る。更に、必要に応じて、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは放射性物質、蛍光物質、色素等の適当な標識物質によって標識されていても良い。   Therefore, the kit of the present invention can take an appropriate configuration according to the method / means for measuring the expression level of the gene and / or the protein encoded by the gene in the tumor tissue / tumor cell. For example, the length of a polynucleotide or oligonucleotide consisting of at least a part of the base sequence of any gene in Table 1 included in the kit of the present invention can be several tens of base pairs, and specific parts thereof (bases) The sequence can be appropriately selected, designed and prepared by those skilled in the art based on information that can be easily obtained from various databases such as the database (Genbank) described in Table 1. Further, they can be used in the form of a DNA chip or a probe in Northern blotting, a primer in PCR or the like. Furthermore, if necessary, the polynucleotide or oligonucleotide may be labeled with an appropriate labeling substance such as a radioactive substance, a fluorescent substance, or a dye.

上記キットには、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート(容器)等が含まれる。   The kit includes other elements or components known to those skilled in the art, such as various reagents, enzymes, buffers, reaction plates (containers), and the like, depending on the configuration and purpose of use.

本発明において対象となる癌又は腫瘍組織/腫瘍細胞は特段制限されるものではなく、具体的には、頭頚部癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、及び子宮頚癌などの固形癌や、悪性リンパ腫及び白血病などの血液癌を挙げることができる。   The target cancer or tumor tissue / tumor cell in the present invention is not particularly limited, and specifically includes head and neck cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, gallbladder / bile duct cancer, pancreatic cancer, Examples include solid cancers such as lung cancer, breast cancer, bladder cancer, prostate cancer, and cervical cancer, and blood cancers such as malignant lymphoma and leukemia.

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は当業者に公知の標準的な方法で行われ、又、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, the technical scope of this invention is limited and is not interpreted at all by description of a following example. Further, unless otherwise specified, the following examples are carried out by standard methods known to those skilled in the art, and the contents of the references cited in the present specification are the contents of the disclosure of the present specification. Part of it.

(対象)
平成12年3月より平成14年11月までに東北大学医学部付属病院乳腺・内分泌外科で手術を行った浸潤性乳管癌40症例(医学系研究科倫理委員会の承認を受け、本人よりインフォームド・コンセントが得られたもの)を対象とした。患者の全40症例の背景を表2に示す。年齢は30〜78歳 (平均58.45歳) 、閉経前が17例、閉経後が23例であった。ERは陽性30例、陰性10例、プロゲステロンレセプター(PR)は陽性35例、陰性5例であった。陽性例のうちTotal scoreが5以上 (中等度以上の陽性)となるものはER、PRともに25例あった。また陰性例のうちTotal scoreが0となるものはERで8例、PRで4例あった。HER2は0+が7例、1+が16例、2+が11例、3+が6例であった。
(Target)
Forty-two cases of invasive ductal cancer that were operated on breast and endocrine surgery at Tohoku University Hospital from March 2000 to November 2002 (with the approval of the Ethics Committee of the Graduate School of Medicine) (Formal consent was obtained). The background of all 40 patients is shown in Table 2. Age ranged from 30 to 78 years (average 58.45 years), 17 before menopause and 23 after menopause. ER was positive 30 cases, negative 10 cases, progesterone receptor (PR) was positive 35 cases, negative 5 cases. Of the positive cases, there were 25 cases with a total score of 5 or more (moderate positive) in both ER and PR. Of the negative cases, those with a total score of 0 were ER for 8 cases and PR for 4 cases. As for HER2, 0+ was 7 cases, 1+ was 16 cases, 2+ was 11 cases, and 3+ was 6 cases.

Figure 0004370409
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(方法)
乳癌腫瘍組織の採取・保存
使用した腫瘍組織は、手術にて摘出された腫瘍組織の一部であり、液体窒素にて急速凍結後、-80℃にて保存した。残りの腫瘍組織は病理組織検査用に10%ホルマリン固定し、パラフィンに包埋した。
(Method)
Collection and storage of breast cancer tumor tissue The tumor tissue used was a part of the tumor tissue removed by surgery, and was rapidly frozen in liquid nitrogen and stored at -80C. The remaining tumor tissue was fixed with 10% formalin for histopathological examination and embedded in paraffin.

凍結切片の作成
-80℃にて保存された凍結組織をWhite Tissue-Coat (ユーアイ化成社)に包埋し、ドライアイスを入れて冷却したn-ヘキサン中で凍結させた。包埋した組織を凍結ミクロトームにて厚さ20μmに薄切し、Poly-L-Lysine液 (Sigma社)でコートしたフォイル付きスライドガラス (Leica社) に貼り付けた。氷冷したエタノール/酢酸= 19 : 1 溶液で3分間固定を行った後、氷冷したdiethylpyrocarbonate水 (以下、DEPC水)で1分間洗浄した。氷冷した0.1% Toluidine blue (Chroma社) で3分間染色の後、再び氷冷したDEPC水で2回洗浄し、ドライヤーの冷風にて乾燥させた。作成した凍結組織切片はマイクロダイセクションを行うまで-80℃にて保存した。
Creating frozen sections
The frozen tissue stored at −80 ° C. was embedded in White Tissue-Coat (UI Kasei Co., Ltd.) and frozen in n-hexane cooled with dry ice. The embedded tissue was sliced to a thickness of 20 μm with a freezing microtome and attached to a slide glass with a foil (Leica) coated with Poly-L-Lysine solution (Sigma). After fixing with ice-cooled ethanol / acetic acid = 19: 1 solution for 3 minutes, it was washed with ice-cooled diethylpyrocarbonate water (hereinafter, DEPC water) for 1 minute. After staining with ice-cooled 0.1% Toluidine blue (Chroma) for 3 minutes, it was washed twice with ice-cooled DEPC water again and dried with cool air from a dryer. The prepared frozen tissue sections were stored at −80 ° C. until microdissection.

マイクロダイセクション
作成した凍結組織切片をレーザーマイクロダイセクションシステム (ライカAS LMDシステム: Leica社) にてマイクロダイセクションを行った。切片中で間質、炎症性細胞が少ない腫瘍細胞の集塊の部分をレーザーにて切り抜き、RNA抽出用はRNeasy Micro Kit (Qiagen社) のbuffer RLT (2-Melcaptoethanol 1%を含む) 50μlに、DNA抽出用はDNeasy Tissue Kit (Qiagen社) のBuffer ATL 50μlに回収した。
Microdissection <br/> laser microdissection system frozen tissue section prepared: were microdissected at (Leica AS LMD system Leica, Inc.). Cut out the clumps of tumor cells with few stroma and inflammatory cells in the section with a laser, and for RNA extraction use 50 μl of buffer RLT (including 2-Melcaptoethanol 1%) of RNeasy Micro Kit (Qiagen) For DNA extraction, it was collected in 50 μl Buffer ATL of DNeasy Tissue Kit (Qiagen).

RNA抽出
RNeasy Micro Kit (Qiagen社) を用いてマイクロダイセクションした腫瘍組織 (約2 x 104〜5細胞) よりtotal RNAを抽出した。抽出したRNAは、すべてバイオアナラザ (Agilent社) を用いて18s、28sのribosomal RNAのピークの面積比により分解のないことを確認した。
RNA extraction
Total RNA was extracted from tumor tissue (about 2 × 10 4-5 cells) microdissected using RNeasy Micro Kit (Qiagen). It was confirmed that the extracted RNA was not decomposed by the area ratio of the ribosomal RNA peaks of 18s and 28s using Bioanaraza (Agilent).

DNA抽出
RNA同様に、マイクロダイセクションした腫瘍組織 (5 x 103〜4細胞) よりDNeasy Tissue Kit (Qiagen社) を用いて腫瘍細胞のgenomic DNAを抽出した。各検体20〜200ng程度のgenomic DNAを抽出した。
DNA extraction
Similar to RNA, genomic DNA of tumor cells was extracted from microdissected tumor tissues (5 × 10 3-4 cells) using DNeasy Tissue Kit (Qiagen). About 20 to 200 ng of genomic DNA was extracted from each specimen.

DNAシークエンシングによるp53遺伝子の変異解析
マイクロダイセクションにて抽出した腫瘍細胞のgenomic DNAを用いてp53遺伝子のエクソン4からエクソン8のシークエンス解析を行った。エクソン4内のコドン72の多型を評価後、それ以外の塩基配列変化がある場合は病的変異の種類によって次のように評価した。すなわち、ミスセンス病的変異が見つかった場合はその病的意義を既知の転写機能評価データベース(Kato, S., Han, S. Y., Liu, W., Otsuka, K., Shibata, H., Kanamaru, R., and Ishioka, C. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proc Natl Acad Sci U S A, 100: 8424-8429, 2003)に基づき評価し、転写活性が失われている場合は「病的変異」とした。タンパク切断型病的変異(ナンセンス病的変異、フレームシフト病的変異)とスプライシング部位の病的変異は翻訳された場合、p53がDNA結合ドメインやオリゴマー形成ドメインを欠くことが予測されるので、これらの変異も「病的変異」とした。
Mutation analysis of p53 gene by DNA sequencing Sequence analysis of p53 gene exon 4 to exon 8 was performed using genomic DNA of tumor cells extracted by microdissection. After evaluating the polymorphism of codon 72 in exon 4, if there were other nucleotide sequence changes, it was evaluated as follows according to the type of pathological mutation. That is, if a missense pathogenic mutation is found, its pathological significance is identified by a known transcription function evaluation database (Kato, S., Han, SY, Liu, W., Otsuka, K., Shibata, H., Kanamaru, R , and Ishioka, C. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis.Proc Natl Acad Sci USA, 100: 8424-8429, 2003) When the activity was lost, it was regarded as “pathological mutation”. Since protein-cutting pathogenic mutations (nonsense pathological mutations, frameshift pathological mutations) and splicing site pathogenic mutations are translated, p53 is predicted to lack a DNA-binding domain or oligomerization domain. This mutation was also referred to as a “pathological mutation”.

エクソン4〜8に病的変異が見つからなかった症例は、全翻訳領域をカバーするため、さらにエクソン2、3、9〜11のシークエンス解析を追加した。各検体の2〜10ng genomic DNAを使用し、反応液の組成は250nM各プライマー、250μM dNTP、1.5U Ex Taq (TaKaRa社) 、25mM TAPS Buffer、50mM KCl、2mM MgCl2、1mM 2-Melcaptoethanol、計30μlでPCR反応を行った。エクソン2、3、10、11は、PCR反応を行った後、PCR反応液の1μlをnested PCR法により再度増幅した (使用した各プライマーは表3、反応時間、反応温度、サイクル数は表4に示した)。 In cases where no pathogenic mutation was found in exons 4-8, additional sequence analysis of exons 2, 3, 9-11 was added to cover the entire translation region. Using 2 to 10 ng genomic DNA of each sample, the composition of the reaction solution is 250 nM each primer, 250 μM dNTP, 1.5 U Ex Taq (TaKaRa), 25 mM TAPS Buffer, 50 mM KCl, 2 mM MgCl 2 , 1 mM 2-Melcaptoethanol, total PCR reaction was performed with 30 μl. Exons 2, 3, 10, and 11 were subjected to PCR reaction, and then 1 μl of the PCR reaction solution was amplified again by the nested PCR method (each primer used is shown in Table 3, reaction time, reaction temperature, and cycle number are shown in Table 4). Pointing out toungue).

PCR反応後、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Bioscience社) を用いて精製を行った後、シークエンス反応を行った。シークエンス反応は、0.5μMのプライマー、4.0μl のDTCS Quick Start Master Mix (CEQTM DTCS-Quick Start Kit、Beckman Coulter社)、PCR増幅後のDNA100〜300ngを加えて10μlの反応系を作成し、PCR System 9700 (Biosystems社) を用いて96℃×30秒の熱変性に続いて、熱変性:96℃×20秒、アニーリング:50℃×20秒、伸長反応:60℃×4分を合計40サイクル行った。自動蛍光DNAシークエンサーはCEQTM2000XL DNA Analysis system (Beckman Coulter社) を使用した。 After the PCR reaction, purification was performed using GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Bioscience), and then a sequencing reaction was performed. The sequencing reaction was performed by adding 0.5 μM primer, 4.0 μl of DTCS Quick Start Master Mix (CEQ DTCS-Quick Start Kit, Beckman Coulter), and 100-300 ng of DNA after PCR amplification to create a 10 μl reaction system. Using System 9700 (Biosystems), heat denaturation at 96 ° C for 30 seconds, followed by heat denaturation: 96 ° C for 20 seconds, annealing: 50 ° C for 20 seconds, extension reaction: 60 ° C for 4 minutes for a total of 40 cycles went. The CEQ 2000XL DNA Analysis system (Beckman Coulter) was used as the automatic fluorescent DNA sequencer.

Figure 0004370409
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免疫組織染色
パラフィン固定した腫瘍組織に対して、Monoclonal Mouse Anti-Human p53 Protein (Biomeda社)を用いて p53の免疫組織染色を実施した。各標本から厚さ1.5μmの切片を作成し、キシレンにて脱パラフィン後、内因性ペルオキシダーゼ処理 (10%H2O2メタノール溶液)し、蒸留水にて洗浄後、p53は電子レンジで、その他はオートクレーブで前処理した。共にクエン酸buffer (10mMクエン酸、pH6.0) を用いて、電子レンジで15分、オートクレーブでは121℃で5分間加熱した。その後PBSにて洗浄、非特異的反応阻止の後、各1次抗体と4℃、over nightで反応した。1次抗体反応後、PBSにて洗浄 (5分を3回)し、2次抗体と30分の反応を行った。2次抗体はヒストファインキット (ニチレイ社) が使用したが、PR (Chenicon社)のみはENVISION+ (Dako社)を用いた後 (ヒストファインキットでは2次抗体に10%ヒト血清を加えて反応を行った後、PBSにて洗浄 (5分を3回) 後、ストレプトアビジンに30分間反応が行われた。)、再びPBSにて洗浄 (5分を3回)後、発色 (DAB 30mg + 10%アジ化ナトリウム 667μl + 50mM Tris Buffer (pH7.6))した。その後PBSで洗浄、ヘマトキシリン液にて核染色した。Hercep Testは付属のマニュアルに従って行った。
Immunohistochemical staining The tumor tissue fixed with paraffin was subjected to immunohistochemical staining of p53 using Monoclonal Mouse Anti-Human p53 Protein (Biomeda). A 1.5μm thick section was prepared from each specimen, deparaffinized with xylene, treated with endogenous peroxidase (10% H 2 O 2 in methanol), washed with distilled water, p53 in a microwave oven, etc. Was pretreated in an autoclave. Both were heated using a citric acid buffer (10 mM citric acid, pH 6.0) in a microwave oven for 15 minutes and in an autoclave at 121 ° C. for 5 minutes. After washing with PBS and blocking nonspecific reaction, each primary antibody was reacted at 4 ° C. overnight. After the primary antibody reaction, it was washed with PBS (3 times for 5 minutes), and reacted with the secondary antibody for 30 minutes. Histfine kit (Nichirei) was used as the secondary antibody, but only PR (Chenicon) used ENVISION + (Dako) (in the histofine kit, the reaction was performed by adding 10% human serum to the secondary antibody. After washing with PBS (5 minutes 3 times), the reaction with streptavidin was performed for 30 minutes.) After washing again with PBS (5 minutes 3 times), color development (DAB 30 mg + 10 % Sodium azide 667 μl + 50 mM Tris Buffer (pH 7.6)). Thereafter, the plate was washed with PBS and stained with hematoxylin solution. Hercep Test was performed according to the attached manual.

判定は以下のように行った。p53は切片中にある腫瘍全体の10%以上の核に染まるものを陽性とした(Kandioler-Eckersberger, D., Ludwig, C., Rudas, M., Kappel, S., Janschek, E., Wenzel, C., Schlagbauer-Wadl, H., Mittlbock, M., Gnant, M., Steger, G., and Jakesz, R. TP53 mutation and p53 overexpression for prediction of response to neoadjuvant treatment in breast cancer patients. Clin Cancer Res, 6: 50-56, 2000; 及び Stal, O., Stenmark Askmalm, M., Wingren, S., Rutqvist, L. E., Skoog, L., Ferraud, L., Sullivan, S., Carstensen, J., and Nordenskjold, B. p53 expression and the result of adjuvant therapy of breast cancer. Acta Oncol, 34: 767-770, 1995)。 The determination was performed as follows. p53 was positive if it stained in more than 10% of all nuclei in the section (Kandioler-Eckersberger, D., Ludwig, C., Rudas, M., Kappel, S., Janschek, E., Wenzel , C., Schlagbauer-Wadl, H., Mittlbock, M., Gnant, M., Steger, G., and Jakesz, R. TP53 mutation and p53 overexpression for prediction of response to neoadjuvant treatment in breast cancer patients. Res, 6: 50-56, 2000; and Stal, O., Stenmark Askmalm, M., Wingren, S., Rutqvist, LE, Skoog, L., Ferraud, L., Sullivan, S., Carstensen, J. , and Nordenskjold, B. p53 expression and the result of adjuvant therapy of breast cancer. Acta Oncol, 34: 767-770, 1995).

ノーザンハイブリダイゼーション
(1) 対照RNAプールの作成
各検体から抽出したtotal RNAを等量ずつ混合して対照RNAプールを作成した。
(2) 遺伝子プローブのラベリング
各遺伝子プローブはRediprime II DNA labeling system (Amersham Bioscience社) を用いて32P-dCTPにてラベリングを行った。
(3) ハイブリダイゼーション
対象RNAプールと各検体から抽出したtotal RNAを2.2Mホルムアルデヒド、50%ホルムアミド、1x MOPS buffer液にて65℃、15分加熱した後、1%アガロースゲル(2.2M ホルムアルデヒド、1x MOPS buffer)にて電気泳動を行った。50mM NaOH溶液中で25分間震盪し、200mM 酢酸ナトリウム液にて20分間震盪を2度繰り返した後、Hydrobond N+ (Amersham Bioscience社)に12時間転写を行った。50mM NaOH溶液を含ませた濾紙上に5分静置してアルカリ固定を行い、2x SSC溶液で洗浄を行った。その後、80℃で2時間乾燥させ、トランスイルミネーターを用いてUVクロスリンクを行った。
転写を行ったメンブランをプレハイブリダイゼーション溶液 (5x SSPE、50%ホルムアミド、5x Denhalt’solution、0.5% SDS、20μg/ml salmon sperm DNA) に浸し、60℃にて1時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、熱変性を行ったラベル化プローブを入れ、60℃で17時間ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーションの後、一次洗浄液 (2x SSPE、0.1% SDS)にて10分間 (室温)、二次洗浄液 (1x SSPE、0.1% SDS) にて20分間 (60℃)の洗浄をそれぞれ2回ずつ行った。三次洗浄液 (0.1x SSPE、0.1% SDS) にて20分間 (60℃) 洗浄を行った後、-80℃にてオートラジオグラフィーを行った。オートラジオグラフィーの結果をデンシトメーターにて数値化した。
Northern hybridization
(1) Preparation of control RNA pool A control RNA pool was prepared by mixing equal amounts of total RNA extracted from each sample.
(2) Labeling of gene probes Each gene probe was labeled with 32 P-dCTP using Rediprime II DNA labeling system (Amersham Bioscience).
(3) Total RNA extracted from the RNA pool to be hybridized and each sample was heated in 2.2M formaldehyde, 50% formamide, 1x MOPS buffer solution at 65 ° C for 15 minutes, then 1% agarose gel (2.2M formaldehyde, 1x Electrophoresis was performed using MOPS buffer). The mixture was shaken in a 50 mM NaOH solution for 25 minutes and then shaken twice with 200 mM sodium acetate solution for 20 minutes, and then transferred to Hydrobond N + (Amersham Bioscience) for 12 hours. The solution was allowed to stand on a filter paper containing 50 mM NaOH solution for 5 minutes for alkali fixation and washed with 2 × SSC solution. Then, it was dried at 80 ° C. for 2 hours, and UV cross-linking was performed using a transilluminator.
The transferred membrane was immersed in a prehybridization solution (5x SSPE, 50% formamide, 5x Denhalt'solution, 0.5% SDS, 20 µg / ml salmon sperm DNA), and prehybridization was performed at 60 ° C for 1 hour. Thereafter, a labeled probe subjected to heat denaturation was inserted, and hybridization was performed at 60 ° C. for 17 hours.
After hybridization, wash with primary wash (2x SSPE, 0.1% SDS) for 10 minutes (room temperature) and secondary wash (1x SSPE, 0.1% SDS) for 20 minutes (60 ° C) twice each. It was. After washing with a tertiary washing solution (0.1x SSPE, 0.1% SDS) for 20 minutes (60 ° C), autoradiography was performed at -80 ° C. The results of autoradiography were digitized with a densitometer.

(結果)
p53遺伝子変異の検出
p53遺伝子のエクソン4〜8でシークエンス解析を行った結果、全40例中20例 (50%) で病的変異が見つかった (表5)。病的変異の見つかった20例はミスセンス病的変異12種類、計13例(内2例はヘテロ接合性)、ナンセンス病的変異3例、フレームシフト病的変異 (2塩基欠失) 2例、スプライシング部位の病的変異2例であった。エクソン4〜8に病的変異の見つからなかった検体にはさらにエクソン2、3、9〜11のシークエンス解析を追加したが、新たに病的変異は見つからなかった。病的変異は全てDNA結合ドメインにマップされた。病的変異の見つかったエクソンと症例数は、エクソン4に1例、エクソン5に6例、エクソン6に5例、エクソン7に7例、エクソン8に1例であった。
(result)
Detection of p53 gene mutation As a result of sequence analysis using exons 4 to 8 of the p53 gene, pathological mutations were found in 20 (50%) of all 40 cases (Table 5). Twenty cases of pathogenic mutations were found in 12 types of missense pathogenic mutations, a total of 13 cases (two of which were heterozygous), 3 nonsense pathological mutations, 2 frameshift pathological mutations (2 base deletions), There were 2 pathological mutations in the splicing site. Samples that were not found to have pathological mutations in exons 4 to 8 were further subjected to sequence analysis of exons 2, 3, and 9 to 11, but no new pathological mutations were found. All pathological mutations were mapped to DNA binding domains. The number of exons and cases in which pathogenic variants were found were 1 in exon 4, 6 in exon 5, 5 in exon 6, 7 in exon 7, and 1 in exon 8.

ミスセンス病的変異12種類は網羅的ミスセンス病的変異ライブラリーの転写機能評価データベース(上掲)を参照し、全て転写活性化能を失う機能喪失型変異(病的変異)であることを確認した。タンパク切断型変異 (ナンセンス変異、フレームシフト変異) はC末端の4量体形成ドメインとDNA結合ドメインの一部を欠くため明らかに機能喪失型変異である。またスプライシング部位変異の2例は、それぞれエクソン6、エクソン7をスキップする病的変異と予測された。これらのエクソンはDNA結合ドメインの一部をコードすることから機能喪失型変異(病的変異)であると判断した。 12 types of missense pathogenic mutations were confirmed by referring to the transcriptional function evaluation database of the comprehensive missense pathogenic mutation library (listed above), and all of them were loss-of-function mutations (pathological mutations) that lost transcription activation ability. . Proteolytic mutations (nonsense mutations, frameshift mutations) are apparently loss-of-function mutations due to the lack of a C-terminal tetramerization domain and a portion of the DNA binding domain. Two cases of splicing site mutations were predicted to be pathological mutations that skip exon 6 and exon 7, respectively. Since these exons encode part of the DNA binding domain, they were judged to be loss-of-function mutations (pathological mutations).

Figure 0004370409
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p53の免疫組織染色
免疫染色によりp53遺伝子における変異解析の結果をタンパクの発現レベルから確認する目的でp53の免疫染色を行った。切片中にある腫瘍全体の10%以上の核に染まるものを陽性として判定した結果、陽性14例、陰性25例であった (表6及び図1、計39例の結果。野生型の1例でデータ得られず。)。この中でミスセンス変異例ではすべて陽性、非ミスセンス変異例ではすべて陰性であった。
The results of mutational analysis in p53 gene by immunohistochemistry <br/> immunostaining of p53 was performed immunostaining p53 for the purpose of confirming the protein expression levels. As a result of determining that 10% or more of the whole tumor in the section was stained as positive, there were 14 positive cases and 25 negative cases (Table 6 and FIG. 1, results of 39 cases in total. 1 wild type case) Data is not available.) Of these, all missense mutations were positive, and all non-missense mutations were negative.

通常、p53の発現量は主に転写や翻訳によってではなく、分解によって制御されているとされ、細胞が通常の状態(非ストレス下)では作られてもどんどん分解されるために、野生型p53はほとんど発現が認められない。細胞がストレス下におかれることで初めて、p53の分解が抑制され、タンパク質として発現が認められるようになる。又、ミスセンス変異型p53は分解を受けにくくなることによって細胞内に蓄積し、この結果が免疫染色上陽性として認められる。一方、非ストレス下の野生型p53、タンパク切断型変異などで抗p53抗体に反応しなくなった病的変異型p53(非ミスセンス病的変異:細胞内にタンパク質としては存在するものの、抗体に認識されないため、陰性となる)は陰性を示すものと予想される。 In general, the expression level of p53 is not controlled mainly by transcription or translation but by degradation, and even if cells are produced under normal conditions (under no stress), they are degraded more and more. Is hardly expressed. Only when the cells are under stress, the degradation of p53 is suppressed and expression as a protein is recognized. Missense mutant p53 accumulates in the cells by becoming less susceptible to degradation, and this result is recognized as positive on immunostaining. On the other hand, wild-type p53 under non-stress, pathological mutant p53 that has become non-responsive to anti-p53 antibodies due to protein-cutting mutations, etc. Therefore, it is expected to be negative.

従って、上記のDNAシークエンス解析によって同定されたミスセンス変異、非ミスセンス変異と予想される免疫染色の結果が完全に一致することが確認された。 Therefore, it was confirmed that the results of the immunostaining predicted by the missense mutation and the nonmissense mutation identified by the DNA sequence analysis described above completely coincided with each other.

Figure 0004370409
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p53遺伝子の病的変異の有無を検出する遺伝子発現プロファイル
解析対象とした70遺伝子を表7に示した。
GAPDH(グリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素)を内部標準として、各検体間の遺伝子発現量の標準化を行った。各遺伝子の発現は対照RNAプールの発現量を基準とし、各検体ごとに発現量の比として算出した。検体を遺伝子発現プロファイル作成のためのlearning set (26例) 検証のためのtest set (12例) の2群に分けた。なお、ヘテロ接合性ミスセンス変異の2例は癌細胞のp53の機能が残存している可能性があるので解析対象から除外した。leaning set(病的変異型症例12例、野生型症例14例)を用いて各型の発現値の平均を算出し、これを病的変異型、野生型それぞれの遺伝子発現プロファイルとした。leaning setにおける病的変異型発現プロファイルとして病的変異型群発現比を、野生型遺伝子発現プロファイルとして野生型群発現比を表7に示した。
Gene expression profile for detecting presence or absence of pathological mutation in p53 gene Table 70 shows 70 genes to be analyzed.
Using GAPDH (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase) as an internal standard, the gene expression level between samples was standardized. The expression of each gene was calculated as the ratio of the expression level for each sample based on the expression level of the control RNA pool. Samples were divided into two groups: learning set for gene expression profile creation (26 cases) and test set for validation (12 cases). Two cases of heterozygous missense mutations were excluded from the analysis because there is a possibility that p53 function of cancer cells remains. Using the leaning set (12 pathological variant cases, 14 wild type cases), the average expression value of each type was calculated and used as the gene expression profile for each of the pathological variant and the wild type. Table 7 shows the expression ratio of the pathogenic mutant group as a pathogenic mutant expression profile in the leaning set, and the wild type group expression ratio as the wild type gene expression profile.

Figure 0004370409
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病的変異の有無での発現差の有意性を Wilcoxon rank sum testにより検討したところ、P値は全て0.1より小さい値を取ることが示された。これら70遺伝子について、(a) 全遺伝子(70遺伝子)、(b) P値が0.05より小さい遺伝子(33遺伝子)、(c) P値が0.01より小さい遺伝子(10遺伝子)、(d) P値が0.05以上の遺伝子(37遺伝子)、(e) P値の順に5個おきに選択した14遺伝子、(f) P値の大きい方から10遺伝子、(g) P値の順に7個おきに選択した10遺伝子、(h)病的変異型群において発現量の大きい順に7個おきに選択した10遺伝子、(i)ランダムに選択した10遺伝子の9種類の遺伝子セットについて、各症例ごとに病的変異型、野生型それぞれの遺伝子発現プロファイルとの相関係数(Peason's correlation coefficient)を算出し、相関係数の大きさに基づいて、病的変異型か野生型かを判定した。
全ての遺伝子セットについて、leaning setの予測的中率は100%であった。また全ての遺伝子セットについて、test setの予測的中率は75.0 %以上であった。特に(g)〜(h)以外の遺伝子セットの予測的中率は88.3%であった。
この結果より、表1中の70遺伝子中から選択した任意の遺伝子群の発現量を測定することにより、p53遺伝子における病的変異を75.0%以上の精度で検出(予測)できることが確認された(表8)。
When the significance of the expression difference with and without pathological mutation was examined by Wilcoxon rank sum test, it was shown that all P values were less than 0.1. For these 70 genes, (a) all genes (70 genes), (b) genes with P values less than 0.05 (33 genes), (c) genes with P values less than 0.01 (10 genes), (d) P values (0.05) genes with a score of 0.05 or more, (e) 14 genes selected every 5 in the order of P values, (f) 10 genes from the largest P values, and (g) selected every 7 genes in the order of P values. (H) 10 genes selected every 7 in descending order of expression in the pathological variant group, and (i) 9 gene sets randomly selected 10 genes for each case. The correlation coefficient (Peason's correlation coefficient) with the gene expression profile of each of the mutant type and wild type was calculated, and based on the magnitude of the correlation coefficient, it was determined whether it was pathological mutant type or wild type.
The predictive predictive value of leaning set was 100% for all gene sets. Moreover, the predictive predictive value of the test set was 75.0% or more for all gene sets. In particular, the predictive predictive value of gene sets other than (g) to (h) was 88.3%.
From this result, it was confirmed that the pathogenic mutation in the p53 gene can be detected (predicted) with an accuracy of 75.0% or more by measuring the expression level of an arbitrary gene group selected from the 70 genes in Table 1 ( Table 8).

Figure 0004370409
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検出されたp53遺伝子の病的変異の有無と予後との相関性の検討
(1)実施例1の症例について、本発明の予後予測の正確性を検討した。すなわち、表2の乳癌患者のうち、病期I〜IIBの早期乳癌患者29名(32名のうち、他病死した1名とヘテロ接合性変異の2名を除外した)を表8(b)の33遺伝子の発現パターンに基づき、野生型予測群(ローリスク群)15名と病的変異型予測群(ハイリスク群)14名に分け、経過観察をおこない、その無再発生存(Recuurence free survival)期間に関するカプランマイヤー曲線を作成した(図2)。これまでのところ、再発例は全てハイリスク群であり、ローリスク群からの再発例はない。また、ローリスク群とハイリスク群とにほぼ二等分されており、理想的に層別されている。さらに5年足らずの短期間にもかかわらず、P値として0.0322と非常に小さい値を示しており、予後予測の精度の高さを示している。
Examination of correlation between presence / absence of detected pathogenic mutation of p53 gene and prognosis (1) For the case of Example 1, the accuracy of prognosis prediction of the present invention was examined. That is, among the breast cancer patients in Table 2, 29 early stage breast cancer patients in stage I to IIB (out of 32, one who died of other diseases and 2 heterozygous mutations were excluded) were listed in Table 8 (b). Based on the expression pattern of 33 genes, we divided 15 patients into wild-type prediction group (low risk group) and 14 persons with pathological variant prediction group (high risk group), followed up and observed their recurrence free survival A Kaplan-Meier curve for the period was created (Figure 2). So far, all relapse cases are in the high-risk group and there are no relapse cases from the low-risk group. Moreover, it is roughly divided into a low risk group and a high risk group, and is ideally stratified. Furthermore, despite the short period of less than five years, the P value is very small at 0.0322, indicating the high accuracy of prognosis prediction.

(2)一般に遺伝子発現パターンによる予後などの予測方法は、検体における細胞組成のばらつき、検体の前処理段階におけるばらつきなどから、第三者が追試しても再現できないというケースが少なくない。
本予測方法の再現性を第三者のマイクロアレイデータを用いて検証することにした。即ち、Van’t Veerらは、78症例の早期乳癌患者を対象にしたマイクロアレイデータを公開している(非特許文献3)。公開されている約24,000遺伝子の発現データには、表2の70遺伝子のうち、46遺伝子(表9(a)で「○」付された遺伝子)が含まれている。
(2) In general, prediction methods such as prognosis based on gene expression patterns are often not reproducible even by a third party due to variations in cell composition in the sample, variations in the sample pretreatment stage, and the like.
We decided to verify the reproducibility of this prediction method using third-party microarray data. That is, Van't Veer et al. Published microarray data for 78 patients with early breast cancer (Non-Patent Document 3). The published expression data of about 24,000 genes include 46 genes (genes marked with “◯” in Table 9 (a)) out of the 70 genes in Table 2.

Figure 0004370409
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そこで、彼らのデータを用いて、各症例がハイリスク群(病的変異型)又はローリスク群(野生型)のいずれの遺伝子発現プロファイルに属するか判定し、その型ごとに無遠隔転移再発生存期間(metastasis free survival)に関するカプランマイヤー(Kaplan-Meier)曲線を作成した(図3A、B)。
遺伝子セットには表9に示したようにそれぞれ(a)46個、(b)25個、(c)9個、(d)21個、(e)7個、(f)10個、(g)10個、(h)10個の8種類の遺伝子セットを用いた。この結果、(a)、(c)、(f)、(g)、(h)では予測されたp53遺伝子の病的変異の有無によって予後に統計学的に有意な差が認められた。また(b)、(d)、(e)でも統計学的には有意とは言えないものの、P値として0.0532〜0.0754と非常に小さい値となった。第三者のデータを用いているにもかかわらず、優れた再現性を示していると言える。
Therefore, using their data, we determined whether each case belongs to the gene expression profile of the high-risk group (pathological variant) or low-risk group (wild-type), and for each type, the survival time of recurrence without distant metastasis Kaplan-Meier curves for (metastasis free survival) were generated (FIGS. 3A and 3B).
As shown in Table 9, the gene sets are (a) 46, (b) 25, (c) 9, (d) 21, (e) 7, (f) 10, (g 10) (h) 10 8 gene sets were used. As a result, in (a), (c), (f), (g), and (h), a statistically significant difference in prognosis was observed depending on the presence or absence of the predicted pathogenic mutation of the p53 gene. In addition, although (b), (d), and (e) were not statistically significant, the P value was as very small as 0.0532 to 0.0754. Despite the use of third-party data, it can be said that it shows excellent reproducibility.

また、さらに、予測に用いた相関係数でP≧0.05となるものを統計学的に有意でないと考え、not predictとした場合の結果を図3Cに示す。この結果、カプランマイヤー曲線においてnot predictの群が病的変異型予測群と野生型予測群の中間に位置し、より予後が明確に分かれる傾向が認められた。(a)、(b)ではそれぞれP=0.0036、0.0024となり、統計学的にも非常に有意な結果であった。(c)、(d)でも(a)、(b)と同様の傾向が認められたがP値として統計学的に有意な値は得られなかった。これは予測に用いる遺伝子数が少ないことより、予測に用いた相関係数のP値が大きくなってしまい、not predictとなる症例が多くなって、病的変異型予測群、野生型予測群の症例が少なくなってしまったためと考えられた。同様の理由により、(e)では予測が不能であった。   Furthermore, the correlation coefficient used for prediction with P ≧ 0.05 is considered not statistically significant, and the result when not predicted is shown in FIG. 3C. As a result, in the Kaplan-Meier curve, the not predict group was located between the pathological variant prediction group and the wild type prediction group, and the prognosis tended to be clearly divided. In (a) and (b), P = 0.0036 and 0.0024, respectively, which were statistically very significant results. In (c) and (d), the same tendency as in (a) and (b) was observed, but no statistically significant value was obtained as the P value. This is because the number of genes used for prediction is small, and the P value of the correlation coefficient used for prediction becomes large, the number of cases that become not predict increases, the pathological variant type prediction group, the wild type prediction group This is thought to be because the number of cases has decreased. For the same reason, prediction was impossible in (e).

図3A−Cにおいて、横軸は月数、縦軸が遠隔転移再発を来していない患者の割合(無遠隔転移再発率)を示している。又、これらの図中に示されるP値は2つの群の無遠隔転移再発率の差をログランク検定にて検定したものであり、P値が0.05より小さい場合に統計学的に有意に差があると見なされる。尚、カプランマイヤー曲線は、一般的には生存曲線と呼ばれ(通常”死亡”をイベントとすることが多いため)、カプランマイヤー法を用いて作成される(http://www.medical-tribune.co.jp/BENRI/survival2.htm等参照)。尚、図3の各図における「mt-predict」及び「wt-predict」は、夫々、病的変異型予測群及び野生型予測群を示す。尚、各予測方法に使用された病例の数は以下のとおりである。 3A-C, the horizontal axis indicates the number of months, and the vertical axis indicates the ratio of patients who have not experienced recurrence of distant metastasis (distant metastasis recurrence rate). In addition, the P values shown in these figures are the results of testing the difference in recurrence rate of no distant metastasis between the two groups by the log rank test, and statistically significant differences when the P value is less than 0.05. Is considered to be. The Kaplan-Meier curve is generally called a survival curve (usually because “death” is often the event) and is created using the Kaplan-Meier method (http: //www.medical-tribune) .co.jp / BENRI / survival2.htm etc.) In addition, “mt-predict” and “wt-predict” in each figure of FIG. 3 indicate a pathological mutation type prediction group and a wild type prediction group, respectively. The number of cases used in each prediction method is as follows.

図3A:(a)mt 42 wt 36、(b)mt 48 wt 30、(c)mt 44 wt 34、(d)mt 38 wt 40
図3B:(e)mt 43 wt 35、(f)mt 36 wt 42、(g)mt 39 wt 39、(h)mt 42 wt 36
図3C:(a)mt 18 wt 29 np 31、(b)mt 15 wt 29 np 34、(c)mt 3 wt 6 np 69、(d)mt 12 wt 8 np 58
FIG. 3A: (a) mt 42 wt 36, (b) mt 48 wt 30, (c) mt 44 wt 34, (d) mt 38 wt 40
FIG. 3B: (e) mt 43 wt 35, (f) mt 36 wt 42, (g) mt 39 wt 39, (h) mt 42 wt 36
3C: (a) mt 18 wt 29 np 31, (b) mt 15 wt 29 np 34, (c) mt 3 wt 6 np 69, (d) mt 12 wt 8 np 58

これらの結果から、p53遺伝子における病的変異の有無を検出し、ハイリスク群(病的変異型)とされた群では、ローリスク群(野生型)と予測された群と比較して明らかに予後が不良であることを示された。このように、表1から任意に選択した遺伝子群を用いて癌の予後の予測が可能であることが実証された。 From these results, the presence or absence of pathological mutations in the p53 gene was detected, and the prognosis was clearly higher in the group designated as the high risk group (pathological variant) than in the group predicted as the low risk group (wild type). Was shown to be bad. Thus, it was demonstrated that the prognosis of cancer can be predicted using a gene group arbitrarily selected from Table 1.

実施例1では、遺伝子発現プロファイルによるp53遺伝子における病的変異の検出をノーザンハイブリダイゼーションにより実施したが、既に記載したように、他の任意の方法、例えば、van’t Veerらと同様にマイクロアレイを使用することが可能である。マイクロアレイでは一度の実験でp53遺伝子における病的変異の検出が可能であり、必要とする時間も検体の採取から結果が得られるまで数日以内と考えられる。免疫組織染色でも最低2日間を要することを考慮すると十分に臨床応用が可能であると考えられる。また、ノーザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイ以外にも定量的RT-PCR法などのRNAの半定量を行える方法であればどんな方法でも利用が可能であり、汎用性が高いと考えられる。 In Example 1, detection of pathological mutations in the p53 gene by gene expression profile was performed by Northern hybridization. However, as already described, any other method, for example, microarrays as in van't Veer et al. It is possible to use. The microarray can detect pathological mutations in the p53 gene in a single experiment, and the required time is considered to be within several days until the result is obtained from the collection of the specimen. Considering that immunohistochemical staining also requires at least 2 days, it is considered that clinical application is sufficiently possible. In addition to Northern hybridization and microarray, any method that can perform semi-quantification of RNA, such as quantitative RT-PCR, can be used, and is considered highly versatile.

更に、本発明の遺伝子発現プロファイルによるp53遺伝子における病的変異の検出は、p53遺伝子における変異の有無のみでなく、その病的意義の評価も同時に行うことが可能であり、他の方法と比較しても非常に有用であると考えられる。本発明により、p53遺伝子における病的変異の有無の検出に加えて、遺伝子発現プロファイルによって、予後予測が行うことが可能であることが示され、臨床上有用なデータとなると考えられる。 Furthermore, the detection of pathological mutations in the p53 gene based on the gene expression profile of the present invention allows not only the presence / absence of mutations in the p53 gene but also the evaluation of the pathological significance at the same time, compared with other methods. However, it is considered very useful. According to the present invention, in addition to the detection of the presence or absence of pathological mutations in the p53 gene, it is shown that the prognosis can be predicted by the gene expression profile, which is considered to be clinically useful data.

p53遺伝子における変異と治療に対する感受性についても多数報告されている。Jassonらはp53遺伝子における変異を調べ、変異型では放射線療法により予後の改善が認められるが、野生型では予後の改善が認められないことを報告している(Jansson, T., Inganas, M., Sjogren, S., Norberg, T., Lindgren, A., Holmberg, L., and Bergh, J. p53 Status predicts survival in breast cancer patients treated with or without postoperative radiotherapy: a novel hypothesis based on clinical findings. J Clin Oncol, 13: 2745-2751, 1995)。また、変異型では乳癌の治療に一般的に使用される抗癌剤であるタモキシフェンやパクリタキセル、更には、一般的に行われているレジメンであるCEF療法に対して感受性が低いことが複数報告されている(Kandioler-Eckersberger, D., Ludwig, C., Rudas, M., Kappel, S., Janschek, E., Wenzel, C., Schlagbauer-Wadl, H., Mittlbock, M., Gnant, M., Steger, G., and Jakesz, R. TP53 mutation and p53 overexpression for prediction of response to neoadjuvant treatment in breast cancer patients. Clin Cancer Res, 6: 50-56, 2000; Berns, E. M., Foekens, J. A., Vossen, R., Look, M. P., Devilee, P., Henzen-Logmans, S. C., van Staveren, I. L., van Putten, W. L., Inganas, M., Meijer-van Gelder, M. E., Cornelisse, C., Claassen, C. J., Portengen, H., Bakker, B., and Klijn, J. G. Complete sequencing of TP53 predicts poor response to systemic therapy of advanced breast cancer. Cancer Res, 60: 2155-2162, 2000; Geisler, S., Lonning, P. E., Aas, T., Johnsen, H., Fluge, O., Haugen, D. F., Lillehaug, J. R., Akslen, L. A., and Borresen-Dale, A. L. Influence of TP53 gene alterations and c-erbB-2 expression on the response to treatment with doxorubicin in locally advanced breast cancer. Cancer Res, 61: 2505-2512, 2001.)。しかしながら、抗癌剤や放射線による治療は癌細胞のみならず、正常細胞に対しても少なからず障害作用を有し、さまざまな副作用を伴う。現在のところ、臨床病期、病理組織学的診断により治療法が決定されるが、予後予測の精度が低いことから、現在では術後再発が起こらない患者にも過剰な治療を行わざるを得ない状況にある。また、治療の必要な患者でも効果の期待できない治療を行うことは避けるべきであり、本発明を用いることにより、予後の治療方針を正確かつ迅速に決定することが可能となり、臨床上非常に有用であると考えられる。 A number of mutations in the p53 gene and susceptibility to treatment have also been reported. Jasson et al. Examined mutations in the p53 gene and reported that radiation therapy improved prognosis in the mutant type, but no improvement in the wild type (Jansson, T., Inganas, M. , Sjogren, S., Norberg, T., Lindgren, A., Holmberg, L., and Bergh, J. p53 Status predicts survival in breast cancer patients treated with or without postoperative radiotherapy: a novel hypothesis based on clinical findings. Clin Oncol, 13: 2745-2751, 1995). Multiple variants have been reported to be less sensitive to tamoxifen and paclitaxel, which are commonly used in the treatment of breast cancer, and CEF therapy, which is a commonly used regimen. (Kandioler-Eckersberger, D., Ludwig, C., Rudas, M., Kappel, S., Janschek, E., Wenzel, C., Schlagbauer-Wadl, H., Mittlbock, M., Gnant, M., Steger, G., and Jakesz, R. TP53 mutation and p53 overexpression for prediction of response to neoadjuvant treatment in breast cancer patients.Clin Cancer Res, 6: 50-56, 2000; Berns, EM, Foekens, JA, Vossen, R ., Look, MP, Devilee, P., Henzen-Logmans, SC, van Staveren, IL, van Putten, WL, Inganas, M., Meijer-van Gelder, ME, Cornelisse, C., Claassen, CJ, Portengen, H., Bakker, B., and Klijn, JG Complete sequencing of TP53 predicts poor response to systemic therapy of advanced breast cancer.Cancer Res, 60: 2155-2162, 2000; Geisler, S., Lonning, PE, Aas, T., Johnsen, H., Fluge, O., Haugen, DF, Lillehaug, JR, Akslen, LA, and Borresen-Dale, AL Influence of TP53 gene alterations and c-erbB-2 expression on the response to treatment with doxorubicin in locally advanced breast cancer. Cancer Res, 61: 2505-2512, 2001.). However, treatment with an anticancer drug or radiation has not only a cancer cell but also a normal cell, and has various side effects. At present, the treatment method is determined by clinical stage and histopathological diagnosis, but due to the low accuracy of prognosis prediction, patients who have no recurrence after surgery have to be treated excessively. There is no situation. In addition, treatment that cannot be expected even in patients who need treatment should be avoided. By using the present invention, it becomes possible to determine a prognostic treatment policy accurately and quickly, which is very useful clinically. It is thought that.

実施例1における免疫組織染色図(写真)である。1 is an immunohistological staining diagram (photo) in Example 1. FIG. 実施例2(1)におけるカプランマイヤー曲線を示す図である。It is a figure which shows the Kaplan-Meier curve in Example 2 (1). 実施例2(2)におけるカプランマイヤー曲線を示す図である。It is a figure which shows the Kaplan-Meier curve in Example 2 (2). 実施例2(2)におけるカプランマイヤー曲線を示す図である。It is a figure which shows the Kaplan-Meier curve in Example 2 (2). 実施例2(2)におけるカプランマイヤー曲線を示す図である。It is a figure which shows the Kaplan-Meier curve in Example 2 (2).

Claims (12)

以下の工程:
(1)乳癌組織/乳癌細胞における以下の70個の全ての遺伝子群
CENPF(配列番号29)、ASPM(配列番号30)、PKMYT1(配列番号31)、BIRC5(配列番号32)、HSPC150(配列番号33)、CDCA8(配列番号34)、ANAPC7(配列番号35)、UBE2C(配列番号36)、PTTG1(配列番号37)、LOC51161(配列番号38)、TGS(配列番号39)、BCL11A(配列番号40)、PLK(配列番号41)、CDC45L(配列番号42)、CENPE(配列番号43)、PTP4A2(配列番号44)、C10orf3(配列番号45)、STMN1(配列番号46)、FLJ11280(配列番号47)、FLJ14399(配列番号48)、CCNB2(配列番号49)、FLJ10719(配列番号50)、PRC1(配列番号51)、KIF2C(配列番号52)、HIS1(配列番号53)、BF930764(配列番号54)、MUTYH(配列番号55)、MGC45866(配列番号56)、MGC7036(配列番号57)、SULF2(配列番号58)、MAPRE1(配列番号59)、MKNK2(配列番号60)、RPS27L(配列番号61)、TMSNB(配列番号62)、TTC12(配列番号63)、HCAP-G(配列番号64)、CEAL1(配列番号65)、FLJ33962(配列番号66)、GMNN(配列番号67)、ENST00000332343(配列番号68)、HEC(配列番号69)、GMPR2(配列番号70)、TncRNA(配列番号71)、SMOC2(配列番号72)、DNAJC9(配列番号73)、RAD54B(配列番号74)、CKS2(配列番号75)、I_960269(配列番号76)、BAG1(配列番号77)、AL137566(配列番号78)、BRRN1(配列番号79)、CDC2(配列番号80)、ZF(配列番号81)、THC1577090(配列番号82)、CDKN2C(配列番号83)、I_1842252(配列番号84)、SDOS(配列番号85)、SNAPC2(配列番号86)、EVI2A(配列番号87)、V4b(配列番号88)、BC007934(配列番号89)、ECT2(配列番号90)、RAD21(配列番号91)、MCM7(配列番号92)、AK097469(配列番号93)、MGC39900(配列番号94)、FLJ21439(配列番号95)、STATIP1(配列番号96)、DKFZp434L142(配列番号97)、及び、PLAT(配列番号98)、又は、
配列番号29〜34,36〜38,40〜47,49、51〜53,55,59〜62,64,67,69,70,72,74,75,77,78,80,81,83,86,87,90〜92,96〜98で示される46個の遺伝子群の中の任意の10個以上の遺伝子群、の発現量を測定し、
(2)該発現量から得られた遺伝子発現プロファイルと、予め求めたp53遺伝子の病的変異型及び野生型の遺伝子発現プロファイルとの間の相関係数(Peason's correlation coefficient)を求め、
(3)相関係数のより大きい方の型の遺伝子発現プロファイルに得られた遺伝子発現プロファイルを帰属させ、但し、相関係数におけるP値が0.05以上の場合にはp53遺伝子の病的変異の有無の検出不可能として除外する、ことから成る、該乳癌組織/乳癌細胞におけるp53遺伝子の病的変異の有無の検出方法。
The following steps:
(1) All 70 genes below in breast cancer tissue / breast cancer cells:
CENPF (SEQ ID NO: 29), ASPM (SEQ ID NO: 30), PKMYT1 (SEQ ID NO: 31), BIRC5 (SEQ ID NO: 32), HSPC150 (SEQ ID NO: 33), CDCA8 (SEQ ID NO: 34), ANAPC7 (SEQ ID NO: 35), UBE2C (SEQ ID NO: 36), PTTG1 (SEQ ID NO: 37), LOC51161 (SEQ ID NO: 38), TGS (SEQ ID NO: 39), BCL11A (SEQ ID NO: 40), PLK (SEQ ID NO: 41), CDC45L (SEQ ID NO: 42), CENPE ( SEQ ID NO: 43), PTP4A2 (SEQ ID NO: 44), C10orf3 (SEQ ID NO: 45), STMN1 (SEQ ID NO: 46), FLJ11280 (SEQ ID NO: 47), FLJ14399 (SEQ ID NO: 48), CCNB2 (SEQ ID NO: 49), FLJ10719 (sequence) No. 50), PRC1 (SEQ ID NO: 51), KIF2C (SEQ ID NO: 52), HIS1 (SEQ ID NO: 53), BF930764 (SEQ ID NO: 54), MUTYH (SEQ ID NO: 55), MGC45866 (SEQ ID NO: 56), MGC7036 (SEQ ID NO: 57), SULF2 (SEQ ID NO: 58), MAPRE1 (SEQ ID NO: 58) 59), MKNK2 (SEQ ID NO: 60), RPS27L (SEQ ID NO: 61), TMSNB (SEQ ID NO: 62), TTC12 (SEQ ID NO: 63), HCAP-G (SEQ ID NO: 64), CEAL1 (SEQ ID NO: 65), FLJ33962 ( SEQ ID NO: 66), GMNN (SEQ ID NO: 67), ENST00000332343 (SEQ ID NO: 68), HEC (SEQ ID NO: 69), GMPR2 (SEQ ID NO: 70), TncRNA (SEQ ID NO: 71), SMOC2 (SEQ ID NO: 72), DNAJC9 (sequence) No. 73), RAD54B (SEQ ID NO: 74), CKS2 (SEQ ID NO: 75), I_960269 (SEQ ID NO: 76), BAG1 (SEQ ID NO: 77), AL137566 (SEQ ID NO: 78), BRRN1 (SEQ ID NO: 79), CDC2 (SEQ ID NO: 80), ZF (SEQ ID NO: 81), THC1577090 (SEQ ID NO: 82), CDKN2C (SEQ ID NO: 83), I_1842252 (SEQ ID NO: 84), SDOS (SEQ ID NO: 85), SNAPC2 (SEQ ID NO: 86), EVI2A (SEQ ID NO: 87) ), V4b (SEQ ID NO: 88), BC007934 (SEQ ID NO: 89) ECT2 (SEQ ID NO: 90), RAD21 (SEQ ID NO: 91), MCM7 (SEQ ID NO: 92), AK097469 (SEQ ID NO: 93), MGC39900 (SEQ ID NO: 94), FLJ21439 (SEQ ID NO: 95), STATIP1 (SEQ ID NO: 96), DKFZp434L142 (SEQ ID NO: 97) and PLAT (SEQ ID NO: 98), or
Sequence number 29-34,36-38,40-47,49,51-53,55,59-62,64,67,69,70,72,74,75,77,78,80,81,83, 86, 87, 90 to 92, and the expression level of any 10 or more gene groups of 46 gene groups represented by 96, 98 ,
(2) Obtaining a correlation coefficient (Peason's correlation coefficient) between the gene expression profile obtained from the expression level and the previously obtained pathogenic variant and wild type gene expression profiles of the p53 gene,
(3) The gene expression profile obtained is assigned to the gene expression profile of the type with the larger correlation coefficient, provided that the p53 gene pathological mutation is P value in the correlation coefficient of 0.05 or more. A method for detecting the presence or absence of a pathological mutation of the p53 gene in the breast cancer tissue / breast cancer cell.
配列番号29〜34,36〜38,40〜47,49、51〜53,55,59〜62,64,67,69,70,72,74,75,77,78,80,81,83,86,87,90〜92,96〜98で示される46個の遺伝子群中の任意の25個以上の遺伝子を使用することを特徴とする、請求項1記載の方法。 Sequence number 29-34,36-38,40-47,49,51-53,55,59-62,64,67,69,70,72,74,75,77,78,80,81,83, The method according to claim 1, wherein any 25 or more genes in 46 gene groups represented by 86, 87, 90 to 92, 96 to 98 are used. 配列番号29〜34,36〜38,40〜47,49、51〜53,55,59〜62,64,67,69,70,72,74,75,77,78,80,81,83,86,87,90〜92,96〜98で示される46個の遺伝子群中の任意の33個以上の遺伝子を使用することを特徴とする、請求項1記載の方法。 Sequence number 29-34,36-38,40-47,49,51-53,55,59-62,64,67,69,70,72,74,75,77,78,80,81,83, The method according to claim 1, wherein any 33 or more genes in 46 gene groups represented by 86, 87, 90 to 92, 96 to 98 are used. 使用する全ての遺伝子の病的変異型発現プロファイル及び野生型発現プロファイルにおける発現量の差の有意性を示すP値が0.05より小さいことを特徴とする、請求項2又は3に記載の方法。 The method according to claim 2 or 3, wherein the P value indicating the significance of the difference in expression level in the pathological variant expression profile and the wild type expression profile of all the genes used is less than 0.05. . 請求項1に記載された70個の遺伝子から選択された以下に示す遺伝子群(a), (c), (f), (g)及び (h)のいずれか一つ:
(a) 配列番号29〜34,36〜38,40〜47,49、51〜53,55,59〜62,64,67,69,70,72,74,75,77,78,80,81,83,86,87,90〜92,96〜98で示される46個の遺伝子群;
(c) 配列番号29〜34及び36〜38で示される9個の遺伝子群;
(f) 配列番号80,81,83,86,90〜92,96〜98で示される10個の遺伝子群;
(g) 配列番号29,34,41,46,53,62,72,80,90及び98で示される10個の遺伝子群; 並びに
(h) 配列番号32,41,51,53,55,62,64,77,80及び98で示される10個の遺伝子群、の発現量を測定し、
(2)該発現量から得られた遺伝子発現プロファイルと、予め求めたp53遺伝子の病的変異型及び野生型の遺伝子発現プロファイルとの間の相関係数(Peason's correlation coefficient)を求め、
(3)相関係数のより大きい方の型の遺伝子発現プロファイルに得られた遺伝子発現プロファイルを帰属させることから成る、該乳癌組織/乳癌細胞におけるp53遺伝子の病的変異の有無の検出方法。
Any one of the following gene groups (a), (c), (f), (g) and (h) selected from the 70 genes according to claim 1 :
(a) SEQ ID NOs: 29 to 34, 36 to 38, 40 to 47, 49, 51 to 53, 55, 59 to 62, 64, 67, 69, 70, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 81 , 83, 86, 87, 90-92, 96-98, 46 gene groups;
(c) a group of nine genes represented by SEQ ID NOs: 29-34 and 36-38;
(f) 10 gene groups represented by SEQ ID NOs: 80, 81, 83, 86, 90 to 92, and 96 to 98;
(g) 10 gene groups represented by SEQ ID NOs: 29, 34, 41, 46, 53, 62, 72, 80, 90 and 98; and
(h) measuring the expression level of 10 gene groups represented by SEQ ID NOs: 32, 41, 51, 53, 55, 62, 64, 77, 80 and 98;
(2) Obtaining a correlation coefficient (Peason's correlation coefficient) between the gene expression profile obtained from the expression level and the previously obtained pathogenic variant and wild type gene expression profiles of the p53 gene,
(3) A method for detecting the presence or absence of a pathogenic mutation in the p53 gene in the breast cancer tissue / breast cancer cell, comprising assigning the gene expression profile obtained to the gene expression profile of the type with the larger correlation coefficient.
以下の工程:
(1)乳癌組織/乳癌細胞における以下の70個の全ての遺伝子群
CENPF(配列番号29)、ASPM(配列番号30)、PKMYT1(配列番号31)、BIRC5(配列番号32)、HSPC150(配列番号33)、CDCA8(配列番号34)、ANAPC7(配列番号35)、UBE2C(配列番号36)、PTTG1(配列番号37)、LOC51161(配列番号38)、TGS(配列番号39)、BCL11A(配列番号40)、PLK(配列番号41)、CDC45L(配列番号42)、CENPE(配列番号43)、PTP4A2(配列番号44)、C10orf3(配列番号45)、STMN1(配列番号46)、FLJ11280(配列番号47)、FLJ14399(配列番号48)、CCNB2(配列番号49)、FLJ10719(配列番号50)、PRC1(配列番号51)、KIF2C(配列番号52)、HIS1(配列番号53)、BF930764(配列番号54)、MUTYH(配列番号55)、MGC45866(配列番号56)、MGC7036(配列番号57)、SULF2(配列番号58)、MAPRE1(配列番号59)、MKNK2(配列番号60)、RPS27L(配列番号61)、TMSNB(配列番号62)、TTC12(配列番号63)、HCAP-G(配列番号64)、CEAL1(配列番号65)、FLJ33962(配列番号66)、GMNN(配列番号67)、ENST00000332343(配列番号68)、HEC(配列番号69)、GMPR2(配列番号70)、TncRNA(配列番号71)、SMOC2(配列番号72)、DNAJC9(配列番号73)、RAD54B(配列番号74)、CKS2(配列番号75)、I_960269(配列番号76)、BAG1(配列番号77)、AL137566(配列番号78)、BRRN1(配列番号79)、CDC2(配列番号80)、ZF(配列番号81)、THC1577090(配列番号82)、CDKN2C(配列番号83)、I_1842252(配列番号84)、SDOS(配列番号85)、SNAPC2(配列番号86)、EVI2A(配列番号87)、V4b(配列番号88)、BC007934(配列番号89)、ECT2(配列番号90)、RAD21(配列番号91)、MCM7(配列番号92)、AK097469(配列番号93)、MGC39900(配列番号94)、FLJ21439(配列番号95)、STATIP1(配列番号96)、DKFZp434L142(配列番号97)、及び、PLAT(配列番号98)、又は、
配列番号29〜34,36〜38,40〜47,49、51〜53,55,59〜62,64,67,69,70,72,74,75,77,78,80,81,83,86,87,90〜92,96〜98で示される46個の遺伝子群の中の任意の10個以上の遺伝子群、の発現量を測定し、
(2)該発現量から得られた遺伝子発現プロファイルと、予め求めたp53遺伝子の病的変異型及び野生型の遺伝子発現プロファイルとの間の相関係数(Peason's correlation coefficient)を求め、
(3)相関係数のより大きい方の型の遺伝子発現プロファイルに得られた遺伝子発現プロファイルを帰属させ、但し、相関係数におけるP値が0.05以上の場合には癌の予後の予測不可能として除外する
(4)病的変異型の遺伝子発現プロファイルの場合には予後が不良であり、野生型の遺伝子発現プロファイルの場合には予後が良好であると決定することから成る、乳癌の予後の予測方法。
The following steps:
(1) All 70 genes below in breast cancer tissue / breast cancer cells:
CENPF (SEQ ID NO: 29), ASPM (SEQ ID NO: 30), PKMYT1 (SEQ ID NO: 31), BIRC5 (SEQ ID NO: 32), HSPC150 (SEQ ID NO: 33), CDCA8 (SEQ ID NO: 34), ANAPC7 (SEQ ID NO: 35), UBE2C (SEQ ID NO: 36), PTTG1 (SEQ ID NO: 37), LOC51161 (SEQ ID NO: 38), TGS (SEQ ID NO: 39), BCL11A (SEQ ID NO: 40), PLK (SEQ ID NO: 41), CDC45L (SEQ ID NO: 42), CENPE ( SEQ ID NO: 43), PTP4A2 (SEQ ID NO: 44), C10orf3 (SEQ ID NO: 45), STMN1 (SEQ ID NO: 46), FLJ11280 (SEQ ID NO: 47), FLJ14399 (SEQ ID NO: 48), CCNB2 (SEQ ID NO: 49), FLJ10719 (sequence) No. 50), PRC1 (SEQ ID NO: 51), KIF2C (SEQ ID NO: 52), HIS1 (SEQ ID NO: 53), BF930764 (SEQ ID NO: 54), MUTYH (SEQ ID NO: 55), MGC45866 (SEQ ID NO: 56), MGC7036 (SEQ ID NO: 57), SULF2 (SEQ ID NO: 58), MAPRE1 (SEQ ID NO: 58) 59), MKNK2 (SEQ ID NO: 60), RPS27L (SEQ ID NO: 61), TMSNB (SEQ ID NO: 62), TTC12 (SEQ ID NO: 63), HCAP-G (SEQ ID NO: 64), CEAL1 (SEQ ID NO: 65), FLJ33962 ( SEQ ID NO: 66), GMNN (SEQ ID NO: 67), ENST00000332343 (SEQ ID NO: 68), HEC (SEQ ID NO: 69), GMPR2 (SEQ ID NO: 70), TncRNA (SEQ ID NO: 71), SMOC2 (SEQ ID NO: 72), DNAJC9 (sequence) No. 73), RAD54B (SEQ ID NO: 74), CKS2 (SEQ ID NO: 75), I_960269 (SEQ ID NO: 76), BAG1 (SEQ ID NO: 77), AL137566 (SEQ ID NO: 78), BRRN1 (SEQ ID NO: 79), CDC2 (SEQ ID NO: 80), ZF (SEQ ID NO: 81), THC1577090 (SEQ ID NO: 82), CDKN2C (SEQ ID NO: 83), I_1842252 (SEQ ID NO: 84), SDOS (SEQ ID NO: 85), SNAPC2 (SEQ ID NO: 86), EVI2A (SEQ ID NO: 87) ), V4b (SEQ ID NO: 88), BC007934 (SEQ ID NO: 89) ECT2 (SEQ ID NO: 90), RAD21 (SEQ ID NO: 91), MCM7 (SEQ ID NO: 92), AK097469 (SEQ ID NO: 93), MGC39900 (SEQ ID NO: 94), FLJ21439 (SEQ ID NO: 95), STATIP1 (SEQ ID NO: 96), DKFZp434L142 (SEQ ID NO: 97) and PLAT (SEQ ID NO: 98), or
Sequence number 29-34,36-38,40-47,49,51-53,55,59-62,64,67,69,70,72,74,75,77,78,80,81,83, 86, 87, 90 to 92, and the expression level of any 10 or more gene groups of 46 gene groups represented by 96, 98 ,
(2) Obtaining a correlation coefficient (Peason's correlation coefficient) between the gene expression profile obtained from the expression level and the previously obtained pathogenic variant and wild type gene expression profiles of the p53 gene,
(3) The gene expression profile obtained is assigned to the gene expression profile of the type with the larger correlation coefficient. However, if the P value in the correlation coefficient is 0.05 or more, the prediction of cancer prognosis is not possible. Exclude as possible ,
(4) A method for predicting the prognosis of breast cancer, comprising determining that the prognosis is poor in the case of a pathogenic variant gene expression profile and that the prognosis is good in the case of a wild type gene expression profile.
配列番号29〜34,36〜38,40〜47,49、51〜53,55,59〜62,64,67,69,70,72,74,75,77,78,80,81,83,86,87,90〜92,96〜98で示される46個の遺伝子群中の任意の25個以上の遺伝子を使用することを特徴とする、請求項6記載の方法。 Sequence number 29-34,36-38,40-47,49,51-53,55,59-62,64,67,69,70,72,74,75,77,78,80,81,83, The method according to claim 6, wherein any 25 or more genes in 46 gene groups represented by 86, 87, 90 to 92, 96 to 98 are used. 配列番号29〜34,36〜38,40〜47,49、51〜53,55,59〜62,64,67,69,70,72,74,75,77,78,80,81,83,86,87,90〜92,96〜98で示される46個の遺伝子群中の任意の33個以上の遺伝子を使用することを特徴とする、請求項6記載の方法。 Sequence number 29-34,36-38,40-47,49,51-53,55,59-62,64,67,69,70,72,74,75,77,78,80,81,83, The method according to claim 6, wherein any 33 or more genes in 46 gene groups represented by 86, 87, 90 to 92, 96 to 98 are used. 使用する全ての遺伝子の病的変異型発現プロファイル及び野生型発現プロファイルにおける発現量の差の有意性を示すP値が0.05より小さいことを特徴とする、請求項7又は8に記載の方法。 The method according to claim 7 or 8, wherein the P value indicating the significance of the difference in expression level in the pathological variant expression profile and the wild type expression profile of all the genes used is less than 0.05. . 請求項6に記載された70個の遺伝子から選択された以下に示す遺伝子群(a), (c), (f), (g)及び (h)のいずれか一つ:
(a) 配列番号29〜34,36〜38,40〜47,49、51〜53,55,59〜62,64,67,69,70,72,74,75,77,78,80,81,83,86,87,90〜92,96〜98で示される46個の遺伝子群;
(c) 配列番号29〜34及び36〜38で示される9個の遺伝子群;
(f) 配列番号80,81,83,86,90〜92,96〜98で示される10個の遺伝子群;
(g) 配列番号29,34,41,46,53,62,72,80,90及び98で示される10個の遺伝子群; 並びに
(h) 配列番号32,41,51,53,55,62,64,77,80及び98で示される10個の遺伝子群、の発現量を測定し、
(2)該発現量から得られた遺伝子発現プロファイルと、予め求めたp53遺伝子の病的変異型及び野生型の遺伝子発現プロファイルとの間の相関係数(Peason's correlation coefficient)を求め、
(3)相関係数のより大きい方の型の遺伝子発現プロファイルに得られた遺伝子発現プロファイルを帰属させ、
(4)病的変異型の遺伝子発現プロファイルの場合には予後が不良であり、野生型の遺伝子発現プロファイルの場合には予後が良好であると決定することから成る、乳癌の予後の予測方法。
Any one of the following gene groups (a), (c), (f), (g) and (h) selected from the 70 genes according to claim 6 :
(a) SEQ ID NOs: 29 to 34, 36 to 38, 40 to 47, 49, 51 to 53, 55, 59 to 62, 64, 67, 69, 70, 72, 74, 75, 77, 78, 80, 81 , 83, 86, 87, 90-92, 96-98, 46 gene groups;
(c) a group of nine genes represented by SEQ ID NOs: 29-34 and 36-38;
(f) 10 gene groups represented by SEQ ID NOs: 80, 81, 83, 86, 90 to 92, and 96 to 98;
(g) 10 gene groups represented by SEQ ID NOs: 29, 34, 41, 46, 53, 62, 72, 80, 90 and 98; and
(h) measuring the expression level of 10 gene groups represented by SEQ ID NOs: 32, 41, 51, 53, 55, 62, 64, 77, 80 and 98;
(2) Obtaining a correlation coefficient (Peason's correlation coefficient) between the gene expression profile obtained from the expression level and the previously obtained pathogenic variant and wild type gene expression profiles of the p53 gene,
(3) Assign the obtained gene expression profile to the gene expression profile of the type with the larger correlation coefficient,
(4) A method for predicting the prognosis of breast cancer, comprising determining that the prognosis is poor in the case of a pathogenic variant gene expression profile and that the prognosis is good in the case of a wild type gene expression profile.
請求項1に記載の70個の遺伝子群から選択した各遺伝子の少なくとも一部の数十塩基対の塩基配列から成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法に用いることが出来るキット。 The polynucleotide or oligonucleotide consisting of a base sequence of several tens of base pairs of at least a part of each gene selected from the group of 70 genes according to claim 1. Kit that can be used in the method of ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴とする、請求項11記載のキット。 The kit according to claim 11, wherein the polynucleotide or oligonucleotide is labeled.
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CN112858919B (en) * 2021-01-18 2022-04-01 北京理工大学 Battery system online fault diagnosis method and system based on cluster analysis

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