JP4360763B2 - Food inspection method - Google Patents

Description

一方、PCR法による検査方法が遺伝子組換えで新たに導入された遺伝子を直接調べるのに対して、ELISA法による検査方法は、その遺伝子により発現、生成された蛋白質の有無を抗原―抗体反応により検出する方法である。GMOに対する抗体（一次抗体）、酵素標識抗体（二次抗体）および発色溶液から構成される試験紙を用いて、その発色の違いを吸光度測定法によって測定しGMOの有無を判定することができる（表１参照）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記PCR法による検査方法は、検査精度は良いが、PCRを用いるためサンプル間のコンタミネイション（混入）やPCR阻害物質の確認が必要であること、また、PCRでは非常に短いDNAを増やすことができないため遺伝子が短く分解された加工食品や醤油・大豆油などは検査できないこと、高価であること、そして検査工程が複雑であり検査時間が長いなどといった種々の問題がある（表２参照）。
【０００６】
また、上記ELISA法による検査方法は、上述したPCR法による検査方法に比べて簡便な方法であり、また安価であり、検査時間も短いといった長所がある。しかしながら、蛋白質は熱により変性し易いため、この方法は加熱処理を施された加工品には用いられないといった問題がある。また、検出限界がPCR法による検査方法に比べて一桁悪いといった問題もある（表２参照）。
【０００７】
【表２】

そこで、本発明は上記問題に鑑みてなされたもので、可視化・計測法の技術を利用して一つ一つのDNAを可視化して、長さや形状を計測することにより、原料から加工品まで、高感度かつ短時間に試料のミクロな構造を検査することを可能とする食品の検査方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者らは、生体分子可視化・計測技術を応用して、新規なGMO検査法（HVM法：hybridization visible method）を確立した。
【０００９】
本発明の第１の特徴は、検査対象となる試料を粉砕するステップと、粉砕された試料からDNAを抽出するステップと、抽出されたDNAを遺伝子組換え体のDNAに特異的にハイブリダイズする二本鎖DNAプローブとハイブリダイゼーションするステップと、ハイブリダイゼーションによって得られた産物を基板にアンカリングするステップと、その基板を走査型プローブ顕微鏡を用いて可視化するステップと、可視化された産物がY字型である場合、DNAの末端が遺伝子組換えされていると判定するステップとからなることにある。「ミクロな構造を判定する」とは、原子レベルや生体分子レベルの構造を判定することであり、たとえば試料が遺伝子組換え食品であるか否かを判定することを意味する。
【００１０】
また、本発明の第２の特徴は、検査対象となる試料を粉砕するステップと、前記粉砕された試料からDNAを抽出するステップと、抽出されたDNAを遺伝子組換え体のDNAに特異的にハイブリダイズし、かつ磁性粒子と結合するビオチン化プローブとハイブリダイゼーションするステップと、そのビオチン化プローブに磁性粒子を結合させ、磁石により前記磁性粒子の付いたハイブリダイゼーション産物を抽出するステップと、抽出されたハイブリダイゼーション産物を基板にアンカリングするステップと、その基板を走査型プローブ顕微鏡を用いて可視化するステップと、可視化された産物がY字型形状にさらに磁性粒子の形状が加わったものである場合、DNAの末端が遺伝子組換えされていると判定するステップとからなることにある。このような遺伝子組換え食品の検査方法によれば、可視化・計測法の技術を利用して一つ一つのDNAを可視化して、長さや形状を計測することにより、原料から加工品まで、高感度かつ短時間に遺伝子組換え食品であるか否かを検査することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
（本発明の要旨）
本発明の食品の検査方法(HVM法)は、検査すべきサンプルDNAを特異的な形状に変化させるためにサンプルDNA をプローブDNA とハイブリダイゼーションさせ、そのハイブリダイゼーション産物を可視化して、そのDNA形状情報から生体分子レベルのミクロな構造の判定を行う、簡便で素性のよい検査方法である。
【００１２】
本発明の食品の検査方法(HVM法)の検査工程は、図１に示すように、基本的に次のように実施する。
【００１３】
（イ）ステップＳ１０１において、サンプルを粉砕する。
【００１４】
（ロ）ステップＳ１０２において、DNAを抽出する。
【００１５】
（ハ）ステップＳ１０３において、GMOと相同性のあるプローブDNA（nonGMO）と測定サンプルDNA（GMO）をハイブリダイゼーションさせる。
【００１６】
（ニ）ステップＳ１０４において、ハイブリダイゼーション産物を基板にアンカリングさせる。
【００１７】
（ホ）ステップＳ１０５において、可視化・計測法でハイブリダイゼーション産物を可視化する。
【００１８】
（ヘ）ステップＳ１０６において、可視化画像の形状から試料のミクロな構造としてGMOの有無を判定する。
【００１９】
以上のように、６段階の工程からなる。
【００２０】
次に、図面を参照して、本発明の第１乃至第２の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分は同一又は類似の符号を付している。ただし、図面は模式的なものであり、厚みと平面寸法との関係、各層の厚みの比率等は現実のものとは異なることに留意すべきである。従って、具体的な厚みや寸法は以下の説明を参酌して判断すべきものである。また図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
【００２１】
（第１の実施の形態）
図２は、本発明の第１の実施の形態に係る食品の検査方法の一例として遺伝子組換え食品の検査方法(HVM法)の詳細を示すフローチャート図である。以下、各ステップを追って説明する。
【００２２】
（ａ）まず、ステップＳ２００において、検査対象となるサンプルのDNA抽出及び標的となる遺伝子組換え体とハイブリダイズするDNAプローブの調製を行う。上記検査対象となるサンプルの形態はDNAを含むものであれば特に限定されず、原料（ダイズ、コーン、ジャガイモなど）から加工品（加熱処理を施されたものなど）まで用いることができるが、サンプルDNAとプローブDNAとのハイブリダイズ可能となるためには、サンプルからDNAを抽出する必要がある。そこで、サンプルを適宜に粉砕し（図１のステップＳ１０１）、蛋白質、脂質、その他の細胞成分を除去してDNAを抽出する（図１のステップＳ１０２）。抽出されたサンプルDNAは緩衝液に懸濁させた試料とするのが好ましい。上記DNAプローブは、目的のDNAに特異的にハイブリダイズするように作製する。そのプローブDNAはクローニングによって得るか、あるいは短いものなら化学的に合成することが可能である。プローブDNAの長さは１２〜数千塩基までさまざまであるが、プローブDNAが検出すべきDNAに完全に相補的である必要はなく、検出すべきDNAプローブと特異的に結合するのに有効的な長さであれば、DNA分子の一部だけが相補的であってもよい。一般に、DNAプローブには固有の標識（放射性標識あるいは化学標識）をして、ハイブリダイゼーションによって二本鎖DNAに取り込まれるのを追跡できるようにするが、本発明に用いるDNAプローブは無標識のままでよい。
【００２３】
（ｂ）上記サンプルDNAとDNAプロ−ブとの混合は、混合試料中のサンプルDNAとDNAプロ−ブの高次構造が解消され、相補的配列同士がハイブリダイズする必要がある。このため、ステップＳ２１０における加熱変性前にサンプルDNAとDNAプローブとを混合するか、あるいはサンプルDNAとDNAプローブとをそれぞれ加熱変性した後に混合すればよい。したがって、ステップＳ２１０において、上記DNAプローブとサンプルDNAの混合試料を加熱変性、あるいは高いpH（pH>=13）にさらすことによって、DNAプローブ及びサンプルDNAの二重らせんの二本鎖を結びつけている相補的塩基対をこわし、二重らせんを一本鎖に解離する。ステップＳ２１０にける混合試料の加熱変性は、混合試料中の核酸分子高次構造を解消して一本鎖に解離するものであれば、特に限定されず、例えば、PCR用の温度コントローラや恒温糟などを使用し、８０〜１００℃の間、好ましくは１００℃で行う。加熱変性に要する時間は、混合試料中のサンプルDNA及びDNAプロ−ブの性質により決定されるが、少なくとも３分間、より好ましくは１０分間で行う。
【００２４】
（ｃ）次に、サンプルDNA中のその配列と上記DNAプロ−ブとをハイブリダイズさせる（図１のステップＳ１０３）ために、ステップＳ２１０において加熱変性された混合試料の温度を下げる。サンプルDNAとDNAプローブがハイブリダイズすると、両端または末端が一本鎖であるような一本鎖と二本鎖の混合試料が形成される。ハイブリダイゼーションの温度低下の条件（温度の下げ方、最終低下温度など）は、ハイブリダイズするDNAプローブとサンプルDNAとの相同性の程度、DNAプローブ濃度およびDNAプローブと相補的なサンプルDNAの濃度に応じて決定される。その条件は、ハイブリダイズの際の塩濃度などで調節することができる。ハイブリダイゼーションに関するその他の条件としては、ハイブリダイズするDNAが自由に構造変化することが可能であることが必要であり、DNA中のハイブリダイズしない部分が高次構造をとることを許容するものでなくてはならない。
【００２５】
（ｄ）上記ハイブリダイゼーションによって得られる混合試料は、走査型プローブ顕微鏡で画像化するために、走査型プローブ顕微鏡による観察用の基板上に固定化する（図１のステップＳ１０４におけるアンカリングする）。固定化するための基板は、固定化されるDNAの形状及び構造変化を著しく阻害しないものであれば、特に限定されず、シリコン基板、ガラス基板などの、走査型プローブ顕微鏡での観察に用いられ、なお且つプロ−ブの固定化を許容するものであればよく、好ましくは表面に劈開面を有するマイカ（雲母基板）を用いるとよい。例えば、基板としてマイカを用いた場合、マイカの新鮮剥離面に試料懸濁液をピペットで滴下するだけで基板面に吸着される。より好ましくは、劈開したマイカ表面上はマイナス電荷を有しているので、DNAのリン酸基からのマイナス電荷を静電結合するため、試料吸着前にマイカを２価カチオン（Mg(II)）等の溶液中に浸しておくとよい。
（ｅ）上記のようにして得られる試料を固定化した基板を可視化・計測する技術として、走査型プローブ顕微鏡を用いる。ここで、「走査型プローブ顕微鏡」とは、微細なプローブを対象物の表面に走査して原子レベルの分解能でその表面を観察する走査型顕微鏡の総称であり、走査型トンネル顕微鏡（scanning tunneling microscopy；STM）、原子間力顕微鏡（atomic force microscopy；AFM）が含まれる。AFMは斥力型、引力型およびタッピング型（「タッピング型」は、デジタルインスツルメント社の登録商標）等に大別される。この分野の研究は著しく進展している最中であり、摩擦力顕微鏡（Lateral force microscopy；LFM）、マクスウエル応力顕微鏡、磁気力顕微鏡（magnetic force microscopy；MFM）、フォトン走査型トンネル顕微鏡等の新しい顕微鏡が開発されつつある。本発明における走査型プローブ顕微鏡とは、その趣旨に鑑み、現在知られているものに限らず、原子レベルの分解能を有する顕微鏡であれば将来開発されるものをも含むものである。
【００２６】
（ｆ）ステップＳ２２０〜Ｓ２５０は、上記の走査型プローブ顕微鏡を用いて、ハイブリダイゼーション産物を可視化・計測した場合の代表的な可視化画像を示す（図１のステップＳ１０５）。
【００２７】
（ｆ−１）ステップＳ２２０においては、サンプルDNAがGMOであった場合に、遺伝子組換えにより導入されたDNAがGMOのDNA末端に位置しており、そのDNA末端にDNAプローブがハイブリダイズした場合である。DNAプローブとハイブリダイズしたGMOのDNA末端の塩基対と相補的な一本鎖が遊離しており、DNA末端の形状がＹ字型の可視化画像が得られる。
【００２８】
（ｆ−２）ステップＳ２３０においては、ステップＳ２２０と同様であるが、GMOのDNA末端にDNAプローブとハイブリダイズしない塩基配列が数塩基あった場合に、それらが相補的に結合した場合である。末端のDNA形状に注目すると、DNAプローブがハイブリダイズした部分が球状の可視化画像が得られる。
【００２９】
（ｆ−３）ステップＳ２４０においては、サンプルDNAがGMOであった場合に、遺伝子組換えにより導入されたDNAがGMOのDNAの中間に位置しており、そのDNAの中間にDNAプローブがハイブリダイズした場合である。DNAプロ−ブと特異的にハイブリダイズしたGMOのDNAは、ハイブリダイズした二本鎖部分とハイブリダイズしていない一本鎖部分とを有している。この一本鎖部分は一本鎖特有の球状構造をとるため、DNAプロ−ブとハイブリダイズしたサンプルDNAの形状は、ハイブリダイズした線状部分とハイブリダイズしなかった球状部分とからなる可視化画像が得られる。
【００３０】
（ｆ−４）サンプルDNAがnonGMOであった場合に、ハイブリダイズしなかった一本鎖DNAプロ−ブ及びハイブリダイズしなかったサンプルDNAの形状は、全体が球状となる。ステップＳ２５０では、ハイブリダイズした二本鎖DNAプロ−ブ及びハイブリダイズしたサンプルDNAの形状は、全体が線状となる可視化画像を示す。
【００３１】
このように、本発明の第１の実施の形態に係る遺伝子組換え食品の検査方法によれば、DNAプロ−ブとのハイブリダイゼーションによって生じる、分子の特異的な形状を画像化して、その情報からプロ−ブと相補的な配列を有するGMOのDNAがサンプル中に存在するか否かを決定することが可能である。従って、本発明に係る遺伝子組換え食品の検査方法は、従来の検査方法と比較して、一つ一つのDNAを可視化して、長さや形状を計測する高感度な検査方法であり、かつ精度の高い検査方法である。
【００３２】
以下に本発明の第１の実施の形態に係る実施例を示す。
【００３３】
測定サンプルDNAの調製：
遺伝子組換えダイズ（GMOダイズ）（ラウンドアップ・レディーダイズ：モンサント社製）と非遺伝子組換えダイズ（nonGMOダイズ）を乳鉢と乳棒で粉砕し、適当な緩衝液、例えば100mMトリス緩衝液（pH8.0）に懸濁し、蛋白質変性剤を加え、DNAを抽出した。この GMO ダイズには除草剤抵抗性遺伝子の CP4EPSPS 領域に 20mer の配列 RR01 ： tggcgcccatggcctgcatg （配列番号：１）と P-E35S 領域に 24mer の配列 RR02 ： ccttcgcaagacccttcctctata （配列番号：２ ) が入っている。抽出したDNAはエタノールやイソプロパノールを加えることによって濃縮や緩衝液交換が可能である。このような操作を経て測定サンプルDNA60ng/mlを得た。
【００３４】
DNAプローブの作製：
まず、 20mer の配列 RR01 ： tggcgcccatggcctgcatg （配列番号：１ ) と上記 GMO ダイズの配列 RR02 ： ccttcgcaagacccttcctctata （配列番号：２ ) をプライマーとし、遺伝子組換えダイズ DNA を鋳型として PCR を行う。次に、PCR後の反応液に含まれるプライマー、酵素、基質などを除去するために、アマシャムファルマシアのGFX PCRDNA and Gel Band Purification Kitを用いてカラムクロマトグラフィーを行い、RR01およびRR02で挟まれた領域の遺伝子断片509bp(RR102)を得た。本DNAを緩衝液に溶解してDNAプローブとした。
【００３５】
ハイブリダイゼーション：
このようにして得られるGMOと相同性のあるDNAプローブと上記測定サンプルDNAのハイブリダイゼーションは、10mMトリス緩衝液（pH7.6）にて100℃10分間加熱してDNAを十分に一本鎖化し、次に、60℃に急冷してこのまま30分間インキュベートして二本鎖を形成させた。さらに、インキュベーション後の反応液は解析まで４℃に保存した。これら一連の行程はいかなる装置を用いても良いが、市販のPCR温度コントローラ（プログラムサーマルコントローラ：フナコシ製）が便利である。
【００３６】
サンプル基板の作製：
次に、４℃に保存されたインキュベーション後の反応液に最終濃度10mMとなるように塩化マグネシウムを加え、得られたサンプル懸濁液をマイカ（雲母基板）の綺麗な劈開面に50μｌ滴下する。そして、室温にて５分間静置後、滅菌水5mlで洗浄し、窒素ガスで乾燥して測定サンプルとした。
【００３７】
測定サンプルの可視化・計測：
上記で得られた測定サンプルを走査型プロ−ブ顕微鏡（米国、デジタル・インスツルメンツ社製、ナノスコープIIIa）のサンプル台に固定し、柔らかいサンプルの測定に最適なタッピングモードで画像化（可視化）した。その可視化例を図３に示す。得られた可視化像は、図２のステップＳ２３０のハイブリダイゼーションDNA画像と同じ形状になっているので、遺伝子組換えされたDNAがGMOダイズの末端に入っていることがわかる。もし、遺伝子組換えされたDNAがGMOダイズの中心部分にある場合は、図２のステップＳ２４０の画像になり（DNA両端に固まりのある画像）、遺伝子組換えされていなければ、図２のステップＳ２５０のような二本鎖DNA画像となる。このように、可視化画像から、GMOであるか、どの領域が遺伝子組換えされているか、nonGMOの区別ができる。
【００３８】
（第２の実施の形態）
本発明の第２の実施の形態に係る遺伝子組換え食品の検査方法は、本発明の第１の実施形態に係る遺伝子組換え食品の検査方法と比較して、本発明の第１の実施形態に係る遺伝子組換え食品の検査方法において使用したDNAプローブの代わりにビオチンでラベル化したDNAプローブを使用し、そのビオチンを介して磁性粒子を結合させ、磁性粒子の付いたハイブリダイゼーション産物を磁石により選択的に抽出する点が異なる。
【００３９】
図４は、本発明の第２の実施の形態に係る遺伝子組換え食品の検査方法(HVM法)の詳細を示すフローチャート図である。以下、本発明の第１の実施の形態に係る遺伝子組換え食品の検査方法と異なる点についてのみ、各ステップを追って説明する。
【００４０】
（ａ）まず、ステップＳ３００において、検査対象となるサンプルのDNA抽出及び標的となる遺伝子組換え体とハイブリダイズするビオチン化DNAプローブの調製を行う。上記ビオチン化DNAプローブは、ビオチンを介して磁性粒子と結合できるように、DNAプローブの末端にビオチンをラベル化（標識）したものである。磁性粒子は、ビオチン化DNAプローブのビオチンと結合するストレプトアビジン（又はアビジン）でコートされた磁性粒子を用いる。
【００４１】
（ｂ）上記サンプルDNAとビオチン化DNAプロ−ブとの混合は、混合試料中のサンプルDNAとDNAプロ−ブの高次構造が解消され、相補的配列同士がハイブリダイズする必要がある。このため、ステップＳ３１０における加熱変性前にサンプルDNAとDNAプローブとを混合するか、あるいはサンプルDNAとDNAプローブとをそれぞれ加熱変性した後に混合すればよい。したがって、ステップＳ３１０において、上記DNAプローブとサンプルDNAの混合試料を加熱変性、あるいは高いpH（pH>=13）にさらすことによって、DNAプローブ及びサンプルDNAの二重らせんの二本鎖を結びつけている相補的塩基対をこわし、二重らせんを一本鎖に解離する。
【００４２】
（ｃ）次に、ステップＳ３１０において加熱変性された混合試料の温度を下げ、サンプルDNA中のその塩基配列と上記DNAプロ−ブとをハイブリダイズさせる（図１のステップＳ１０３）。
【００４３】
（ｄ）続いて、上記ハイブリダイゼーションによって得られる混合試料をストレプトアビジン（又はアビジン）でコートされた磁性粒子と十分に混和し、ビオチン化DNAプローブのビオチンと磁性粒子のストレプトアビジンがビオチン・アビジン結合するようにインキュベートする。
【００４４】
（ｅ）上記ハイブリダイゼーション産物から磁石により選択的に磁性粒子が結合いているハイブリダイゼーション産物のみを抽出する。
【００４５】
（ｆ）上記抽出された磁性粒子結合のハイブリダイゼーション産物は、走査型プローブ顕微鏡で画像化するために、走査型プローブ顕微鏡による観察用の基板上に固定化する（図１のステップＳ１０４におけるアンカリングする）。
【００４６】
（ｇ）ステップＳ３２０〜Ｓ３５０は、上記基板上に固定化されたハイブリダイゼーション産物を走査型プローブ顕微鏡を用いて可視化・計測した場合の代表的な可視化画像を示す（図１のステップＳ１０５）。
【００４７】
（ｇ−１）ステップＳ３２０においては、サンプルDNAがGMOであった場合に、遺伝子組換えにより導入されたDNAがGMOのDNA末端に位置しており、そのDNA末端に磁性粒子結合のビオチン化DNAプローブがハイブリダイズした場合である。磁性粒子結合のビオチン化DNAプローブとハイブリダイズしたGMOのDNA末端の塩基対と相補的な一本鎖が遊離しており、図２のステップＳ２２０におけるDNA末端のＹ字型形状にさらに磁性粒子の形状が加わった可視化画像が得られる。
【００４８】
（ｇ−２）ステップＳ３３０においては、ステップＳ３２０と同様であるが、GMOのDNA末端に磁性粒子結合のビオチン化DNAプローブとハイブリダイズしない塩基配列が数塩基あった場合に、それらが相補的に結合した場合である。末端のDNA形状に注目すると、磁性粒子結合のビオチン化DNAプローブがハイブリダイズした部分が、図２のステップＳ２３０における球状にさらに磁性粒子の形状が加わった可視化画像が得られる。
【００４９】
（ｇ−３）ステップＳ３４０においては、サンプルDNAがGMOであった場合に、遺伝子組換えにより導入されたDNAがGMOのDNAの中間に位置しており、そのDNAの中間に磁性粒子結合のビオチン化DNAプローブがハイブリダイズした場合である。磁性粒子結合のビオチン化DNAプロ−ブと特異的にハイブリダイズしたGMOのDNAは、ハイブリダイズした二本鎖部分とハイブリダイズしていない一本鎖部分とを有している。この一本鎖部分は一本鎖特有の球状構造をとるため、磁性粒子結合のビオチン化DNAプロ−ブとハイブリダイズしたサンプルDNAの形状は、図２のステップＳ２４０におけるハイブリダイズした線状部分とハイブリダイズしなかった球状部分とからなる形状にさらに磁性粒子の形状が加わった可視化画像が得られる。
【００５０】
（ｇ−４）サンプルDNAがnonGMOであった場合に、ハイブリダイズしなかった磁性粒子結合の一本鎖ビオチン化DNAプロ−ブの形状は、全体が球状の可視化画像を示す。
【００５１】
以下に本発明の第２の実施の形態に係る実施例を説明する。
【００５２】
HVM法をさらに高感度するため、図４に示すように、DNAプロ−ブの末端をビオチンでラベル化して磁性粒子を結合させ、磁性粒子の付いたハイブリダイゼーション産物を磁石により拾い上げれた。DNAプロ−ブの末端をビオチンでラベル化して磁性粒子を結合させ可視化した画像の模式図を図５および図６に示す。
【００５３】
以上の実施例により、本発明に係る遺伝子組換え食品の検査方法（HVM法）によれば、PCRでDNAを増幅する必要がないので、
１）サンプル間のコンタミやPCR阻害物質の確認が不必要である。
【００５４】
２）短く分解された加工食品や醤油・大豆にも用いられ、原理的にはすべてのGMOの検査ができる。
【００５５】
３）検出限界もPCR法と同等であり、かつ、安価である。
【００５６】
４）HVM法は従来法に比べて、工程数が少なく、検査時間も短い。
【００５７】
といった効果が得られた。
【００５８】
【発明の効果】
本発明の食品の検査方法によれば、可視化・計測法の技術を利用して一つ一つのDNAを可視化して、長さや形状を計測することができる。
【００５９】
このため、本発明の食品の検査方法によれば、原料から加工品まで、高感度かつ短時間に遺伝子組換え食品であるか否か等のミクロな構造を検査することが可能である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の原理説明図である。
【図２】本発明の第１の実施の形態に係る組換え食品の検査方法の詳細を示すフローチャート図である。
【図３】本発明の第１の実施の形態に係る組換え食品の検査方法を用いて、GMOを可視化した例である。
【図４】本発明の第２の実施の形態に係る組換え食品の検査方法の詳細を示すフローチャート図である。
【図５】本発明の第２の実施の形態に係る組換え食品の検査方法を用いて、GMOを可視化した画像の模式図である。
【図６】本発明の第２の実施の形態に係る組換え食品の検査方法を用いて、GMOを可視化した画像の模式図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an inspection method for inspecting a micro structure in a cell level, a biomolecule level, a gene level or an atomic level in a crop or food.
[0002]
[Prior art]
In recent years, inspection methods for distinguishing genetically modified foods (hereinafter referred to as GMOs) have attracted attention. In the future, the Ministry of Agriculture and Water and the Ministry of Health, Labor and Welfare have decided to require labeling for 31 GMOs, so a business that acts as an agent in response to requests from food companies and distributors is also starting. To check whether a food is manufactured using genetically modified foods, it is only necessary to check for the presence of artificially introduced genes. Currently, PCR (polymerase chain reaction) and ELISA are used. Examination by the method (enzyme linked immunosorbent assay) has been attempted.
[0003]
The PCR method uses a minute gene fragment called a primer, reacts with a specific gene introduced by genetic recombination, and amplifies the target gene tens to millions of times. To be able to inspect. Specifically, first, a primer is selected so that the introduced gene is amplified only when the sample is GMO, and the sample is subjected to PCR using the primer. The obtained PCR product is subjected to electrophoresis (ethidium bromide staining), so that if there is DNA amplified by PCR (that is, if it is GMO), it is detected as an electrophoresis band. If the sample is a non-GMO food (hereinafter abbreviated as nonGMO), a specific gene is not amplified by PCR, so it is not detected as an electrophoresis band. Therefore, it can be inspected whether it is GMO or nonGMO by the presence or absence of the electrophoresis band (see Table 1).
[0004]
[Table 1]

On the other hand, the PCR test method directly examines genes newly introduced by gene recombination, whereas the ELISA test method uses the antigen-antibody reaction to determine the presence or absence of proteins expressed and produced by the gene. It is a method of detection. Using a test paper composed of an antibody against GMO (primary antibody), an enzyme-labeled antibody (secondary antibody), and a coloring solution, the difference in coloration can be measured by an absorbance measurement method to determine the presence or absence of GMO ( (See Table 1).
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The above PCR method has high accuracy, but because PCR is used, contamination between samples and confirmation of PCR inhibitors are necessary, and PCR can increase the number of very short DNA. However, there are various problems such as inability to test processed foods and soy sauce / soybean oil, etc. whose genes have been decomposed short, are expensive, and the inspection process is complicated and requires a long inspection time (see Table 2).
[0006]
In addition, the above-mentioned inspection method by ELISA is simpler than the above-described inspection method by PCR, and is advantageous in that it is inexpensive and has a short inspection time. However, since proteins are easily denatured by heat, there is a problem that this method cannot be used for processed products subjected to heat treatment. Another problem is that the detection limit is an order of magnitude worse than that of the PCR method (see Table 2).
[0007]
[Table 2]

Therefore, the present invention has been made in view of the above problems, by visualizing each DNA using the technique of visualization and measurement, by measuring the length and shape, from raw materials to processed products, An object of the present invention is to provide a food inspection method capable of inspecting a micro structure of a sample with high sensitivity and in a short time.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present inventors established a novel GMO inspection method (HVM method: hybridization visible method) by applying biomolecule visualization / measurement technology.
[0009]
The first feature of the present invention is that the sample to be examined is pulverized, the DNA is extracted from the pulverized sample, and the extracted DNA is specifically hybridized to the DNA of the gene recombinant. Hybridization with a double-stranded DNA probe, anchoring the product obtained by hybridization to a substrate, visualizing the substrate using a scanning probe microscope, and the visualized product is Y-shaped. In the case of a type, the method comprises a step of determining that the end of the DNA has been genetically modified. “Determining a microscopic structure” means determining a structure at an atomic level or a biomolecule level, for example, determining whether a sample is a genetically modified food.
[0010]
The second feature of the present invention is that the sample to be examined is pulverized, the DNA is extracted from the pulverized sample, and the extracted DNA is specific to the DNA of the gene recombinant. A step of hybridization with a biotinylated probe that hybridizes and binds to magnetic particles, a step of binding magnetic particles to the biotinylated probe, and a step of extracting a hybridization product with the magnetic particles by a magnet. When the hybridization product is anchored to the substrate, the substrate is visualized using a scanning probe microscope, and the visualized product is a Y-shaped shape plus magnetic particle shape is to consist and determining the end of the DNA is genetically modified. According to such a genetically modified food inspection method, visualization and measurement techniques are used to visualize each DNA and measure the length and shape, thereby increasing the raw materials to processed products. It is possible to test whether the food is a genetically modified food with high sensitivity and in a short time.
[0011]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(Summary of the present invention)
In the food inspection method (HVM method) of the present invention, in order to change the sample DNA to be inspected into a specific shape, the sample DNA is hybridized with the probe DNA, the hybridization product is visualized, and the DNA shape is visualized. This is a simple and easy-to-use inspection method that determines a micro structure at the biomolecule level from information.
[0012]
As shown in FIG. 1, the inspection process of the food inspection method (HVM method) of the present invention is basically performed as follows.
[0013]
(A) In step S101, the sample is pulverized.
[0014]
(B) In step S102, DNA is extracted.
[0015]
(C) In step S103, probe DNA (nonGMO) having homology with GMO and measurement sample DNA (GMO) are hybridized.
[0016]
(D) In step S104, the hybridization product is anchored to the substrate.
[0017]
(E) In step S105, the hybridization product is visualized by a visualization / measurement method.
[0018]
(F) In step S106, the presence or absence of GMO is determined from the shape of the visualized image as the micro structure of the sample.
[0019]
As described above, the process consists of six steps.
[0020]
Next, first and second embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. In the following description of the drawings, the same or similar parts are denoted by the same or similar reference numerals. However, it should be noted that the drawings are schematic, and the relationship between the thickness and the planar dimensions, the ratio of the thickness of each layer, and the like are different from the actual ones. Accordingly, specific thicknesses and dimensions should be determined in consideration of the following description. Moreover, it is a matter of course that portions having different dimensional relationships and ratios are included between the drawings.
[0021]
(First embodiment)
FIG. 2 is a flowchart showing details of a genetically modified food inspection method (HVM method) as an example of a food inspection method according to the first embodiment of the present invention. Hereinafter, each step will be described.
[0022]
(A) First, in step S200, DNA extraction of a sample to be examined and preparation of a DNA probe that hybridizes with a target gene recombinant are prepared. The form of the sample to be inspected is not particularly limited as long as it contains DNA, and can be used from a raw material (soybean, corn, potato, etc.) to a processed product (heat-treated one, etc.) In order to be able to hybridize sample DNA and probe DNA, it is necessary to extract DNA from the sample. Therefore, the sample is appropriately crushed (step S101 in FIG. 1), and proteins, lipids, and other cell components are removed to extract DNA (step S102 in FIG. 1). The extracted sample DNA is preferably a sample suspended in a buffer solution. The DNA probe is prepared so as to specifically hybridize to the target DNA. The probe DNA can be obtained by cloning or chemically synthesized if it is short. The length of the probe DNA varies from 12 to several thousand bases, but the probe DNA does not have to be completely complementary to the DNA to be detected, and is effective for specifically binding to the DNA probe to be detected. As long as the length is long, only part of the DNA molecule may be complementary. In general, a DNA probe is uniquely labeled (radiolabel or chemical label) so that it can be traced as it is incorporated into double-stranded DNA by hybridization, but the DNA probe used in the present invention remains unlabeled. It's okay.
[0023]
(B) In mixing the sample DNA and the DNA probe, the higher order structures of the sample DNA and the DNA probe in the mixed sample are eliminated, and complementary sequences must be hybridized. For this reason, the sample DNA and the DNA probe may be mixed before heat denaturation in step S210, or the sample DNA and the DNA probe may be mixed after heat denaturation. Therefore, in step S210, the double helix duplex of the DNA probe and the sample DNA is linked by subjecting the mixed sample of the DNA probe and the sample DNA to heat denaturation or high pH (pH> = 13). Breaking complementary base pairs, dissociates the double helix into single strands. The heat denaturation of the mixed sample in step S210 is not particularly limited as long as it eliminates the higher-order structure of the nucleic acid molecule in the mixed sample and dissociates into a single strand. For example, a temperature controller for PCR or a thermostat is used. Etc., and is performed at 80 to 100 ° C., preferably at 100 ° C. The time required for heat denaturation is determined by the properties of the sample DNA and the DNA probe in the mixed sample, but is at least 3 minutes, more preferably 10 minutes.
[0024]
(C) Next, in order to hybridize the sequence in the sample DNA and the DNA probe (step S103 in FIG. 1), the temperature of the mixed sample heat-denatured in step S210 is lowered. When the sample DNA and the DNA probe are hybridized, a single-stranded and double-stranded mixed sample is formed in which both ends or ends are single-stranded. The conditions for lowering the hybridization temperature (how to lower the temperature, final lowering temperature, etc.) depend on the degree of homology between the hybridizing DNA probe and the sample DNA, the DNA probe concentration, and the concentration of the sample DNA complementary to the DNA probe. Will be decided accordingly. The conditions can be adjusted by the salt concentration at the time of hybridization. Other conditions related to hybridization require that the DNA to be hybridized can freely change its structure, and does not allow a non-hybridized portion in DNA to have a higher order structure. must not.
[0025]
(D) The mixed sample obtained by the above hybridization is immobilized on a substrate for observation with a scanning probe microscope in order to form an image with a scanning probe microscope (anchoring in step S104 in FIG. 1). The substrate for immobilization is not particularly limited as long as it does not significantly inhibit the shape and structure of the DNA to be immobilized, and is used for observation with a scanning probe microscope such as a silicon substrate or a glass substrate. In addition, any material that allows the probe to be immobilized may be used. Preferably, mica (a mica substrate) having a cleaved surface is used. For example, when mica is used as the substrate, it is adsorbed on the substrate surface simply by dropping the sample suspension onto the fresh release surface of the mica with a pipette. More preferably, the cleaved mica surface has a negative charge, so that the negative charge from the phosphate group of DNA is electrostatically bound, so that the mica is divalent cation (Mg (II)) before sample adsorption. It is better to immerse in a solution such as
(E) A scanning probe microscope is used as a technique for visualizing and measuring the substrate on which the sample obtained as described above is fixed. Here, the “scanning probe microscope” is a general term for a scanning microscope that scans a fine probe onto the surface of an object and observes the surface with atomic resolution. STM), atomic force microscopy (AFM). AFM is roughly classified into repulsive type, attractive type, and tapping type ("tapping type" is a registered trademark of Digital Instruments). Research in this area is in the midst of significant progress and new microscopes such as frictional force microscopy (LFM), Maxwell stress microscopy, magnetic force microscopy (MFM), and photon scanning tunneling microscopes. Is being developed. The scanning probe microscope in the present invention is not limited to what is currently known in view of the gist thereof, but includes a microscope that will be developed in the future as long as the microscope has atomic level resolution.
[0026]
(F) Steps S220 to S250 show typical visualized images when the hybridization product is visualized and measured using the scanning probe microscope (step S105 in FIG. 1).
[0027]
(F-1) In step S220, when the sample DNA is GMO, the DNA introduced by genetic recombination is located at the DNA end of GMO, and the DNA probe is hybridized to the DNA end It is. A single strand complementary to the base pair at the DNA terminal of GMO hybridized with the DNA probe is released, and a visualized image having a Y-shaped DNA terminal is obtained.
[0028]
(F-2) Step S230 is the same as step S220, except that there are several base sequences that do not hybridize to the DNA probe at the DNA end of the GMO and they are complementarily bound. When attention is paid to the shape of the terminal DNA, a visualized image in which the portion where the DNA probe is hybridized is spherical is obtained.
[0029]
(F-3) In step S240, when the sample DNA is GMO, the DNA introduced by genetic recombination is located in the middle of the GMO DNA, and the DNA probe is hybridized in the middle of the DNA. This is the case. GMO DNA specifically hybridized with the DNA probe has a hybridized double-stranded part and a non-hybridized single-stranded part. Since this single-stranded portion has a spherical structure peculiar to a single strand, the shape of the sample DNA hybridized with the DNA probe is a visualized image consisting of a hybridized linear portion and a non-hybridized spherical portion. Is obtained.
[0030]
(F-4) When the sample DNA is nonGMO, the single-stranded DNA probe that did not hybridize and the shape of the sample DNA that did not hybridize are entirely spherical. In step S250, the shape of the hybridized double-stranded DNA probe and the hybridized sample DNA shows a visualized image that is entirely linear.
[0031]
As described above, according to the method for testing a genetically modified food according to the first embodiment of the present invention, a specific shape of a molecule generated by hybridization with a DNA probe is imaged and the information is obtained. It is possible to determine whether GMO DNA having a sequence complementary to the probe is present in the sample. Therefore, the genetically modified food testing method according to the present invention is a highly sensitive testing method that visualizes each DNA and measures the length and shape as compared with the conventional testing method, and is accurate. This is a high inspection method.
[0032]
Examples according to the first embodiment of the present invention will be described below.
[0033]
Preparation of measurement sample DNA:
Genetically modified soybean (GMO soybean) (round-up ready soybean: manufactured by Monsanto) and non-genetically modified soybean (nonGMO soybean) are pulverized with a mortar and pestle, and a suitable buffer such as 100 mM Tris buffer (pH 8. 0), a protein denaturant was added, and DNA was extracted. The GMO soy 20mer sequence of the CP4EPSPS region of herbicide resistance genes in RR01: tggcgcccatggcctgcatg (SEQ ID NO: 1) and P-E35S region 24mer sequence of RR02: ccttcgcaagacccttcctctata (SEQ ID NO: 2) is on. Extracted DNA can be concentrated and buffer exchanged by adding ethanol or isopropanol. Through such an operation, a measurement sample DNA of 60 ng / ml was obtained.
[0034]
Preparation of DNA probe:
First, PCR is performed using 20- mer sequence RR01 : tggcgcccatggcctgcatg (SEQ ID NO: 1 ) and GMO soybean sequence RR02 : ccttcgcaagacccttcctctata (SEQ ID NO: 2 ) as primers and genetically modified soybean DNA as a template . Next, in order to remove primers, enzymes, substrates, etc. contained in the reaction solution after PCR, column chromatography was performed using Amersham Pharmacia's GFX PCRDNA and Gel Band Purification Kit, and the region between RR01 and RR02. A gene fragment of 509 bp (RR102) was obtained. This DNA was dissolved in a buffer solution to obtain a DNA probe.
[0035]
Hybridization:
Hybridization of the DNA probe homologous to the GMO thus obtained and the measurement sample DNA described above was performed by heating at 100 ° C. for 10 minutes in 10 mM Tris buffer (pH 7.6) to sufficiently single-stranded DNA. Next, it was rapidly cooled to 60 ° C. and incubated for 30 minutes to form a double strand. Furthermore, the reaction solution after incubation was stored at 4 ° C. until analysis. Any apparatus may be used for the series of steps, but a commercially available PCR temperature controller (program thermal controller: manufactured by Funakoshi) is convenient.
[0036]
Sample substrate production:
Next, magnesium chloride is added to the reaction solution after incubation stored at 4 ° C. to a final concentration of 10 mM, and 50 μl of the obtained sample suspension is dropped on a clean cleaved surface of mica (mica substrate). And after leaving still at room temperature for 5 minutes, it wash | cleaned with 5 ml of sterilized water, and dried with nitrogen gas to make a measurement sample.
[0037]
Visualization and measurement of measurement samples:
The measurement sample obtained above was fixed on the sample stage of a scanning probe microscope (US, Digital Instruments, Nanoscope IIIa) and imaged (visualized) in a tapping mode optimal for soft sample measurement. . The visualization example is shown in FIG. Since the obtained visualized image has the same shape as the hybridization DNA image in step S230 of FIG. 2, it can be seen that the genetically modified DNA is located at the end of GMO soybean. If the genetically modified DNA is in the central part of the GMO soybean, the image of step S240 in FIG. 2 is obtained (an image with clusters on both ends of the DNA). It becomes a double-stranded DNA image like S250. In this way, it is possible to distinguish non-GMO from the visualized image, which is GMO, which region is genetically modified.
[0038]
(Second Embodiment)
The method for testing a genetically modified food according to the second embodiment of the present invention is compared with the method for testing a genetically modified food according to the first embodiment of the present invention. Instead of the DNA probe used in the genetically modified food inspection method according to the above, a DNA probe labeled with biotin is used, magnetic particles are bound through the biotin, and the hybridization product with the magnetic particles is collected by a magnet. The point of selective extraction is different.
[0039]
FIG. 4 is a flowchart showing details of the genetically modified food inspection method (HVM method) according to the second embodiment of the present invention. Hereinafter, only steps that differ from the method for testing a genetically modified food according to the first embodiment of the present invention will be described step by step.
[0040]
(A) First, in step S300, DNA extraction of a sample to be examined and biotinylated DNA probe that hybridizes with a target genetic recombinant are prepared. The biotinylated DNA probe is one in which biotin is labeled (labeled) at the end of the DNA probe so that it can bind to magnetic particles via biotin. As magnetic particles, magnetic particles coated with streptavidin (or avidin) that binds to biotin of a biotinylated DNA probe are used.
[0041]
(B) The mixing of the sample DNA and the biotinylated DNA probe requires that the higher order structures of the sample DNA and the DNA probe in the mixed sample are eliminated and the complementary sequences hybridize with each other. For this reason, the sample DNA and the DNA probe may be mixed before heat denaturation in step S310, or the sample DNA and the DNA probe may be mixed after heat denaturation. Therefore, in step S310, the DNA probe and the double helix duplex of the sample DNA are linked by subjecting the mixed sample of the DNA probe and the sample DNA to heat denaturation or high pH (pH> = 13). Breaking complementary base pairs, dissociates the double helix into single strands.
[0042]
(C) Next, the temperature of the mixed sample heat-denatured in step S310 is lowered, and the base sequence in the sample DNA is hybridized with the DNA probe (step S103 in FIG. 1).
[0043]
(D) Subsequently, the mixed sample obtained by the hybridization is sufficiently mixed with the magnetic particles coated with streptavidin (or avidin), and biotinylated DNA probe biotin and the magnetic particle streptavidin bind to biotin / avidin. Incubate as follows.
[0044]
(E) Only the hybridization product to which the magnetic particles are selectively bonded is extracted from the hybridization product with a magnet.
[0045]
(F) The extracted magnetic particle-bound hybridization product is immobilized on a substrate for observation with a scanning probe microscope in order to form an image with a scanning probe microscope (anchoring in step S104 in FIG. 1). To do).
[0046]
(G) Steps S320 to S350 show typical visualization images when the hybridization product immobilized on the substrate is visualized and measured using a scanning probe microscope (step S105 in FIG. 1).
[0047]
(G-1) In step S320, when the sample DNA is GMO, the DNA introduced by genetic recombination is located at the DNA end of GMO, and the biotinylated DNA of magnetic particle binding at the DNA end This is the case when the probe is hybridized. A single strand complementary to the base pair at the DNA end of GMO hybridized with the biotinylated DNA probe bound to the magnetic particle is released, and the Y-shape of the DNA end at step S220 in FIG. A visualized image with an added shape is obtained.
[0048]
(G-2) In step S330, the same as step S320, but when there are several base sequences that do not hybridize with the biotinylated DNA probe bound to the magnetic particle at the DNA end of GMO, they are complemented. This is the case. When attention is paid to the shape of the terminal DNA, a visualized image is obtained by adding the shape of the magnetic particle to the spherical shape in step S230 in FIG.
[0049]
(G-3) In step S340, when the sample DNA is GMO, the DNA introduced by genetic recombination is located in the middle of the GMO DNA, and magnetic particle-bound biotin is located in the middle of the DNA. This is the case when the immobilized DNA probe is hybridized. GMO DNA specifically hybridized with a biotinylated DNA probe bound to magnetic particles has a hybridized double-stranded part and a non-hybridized single-stranded part. Since this single-stranded portion has a spherical structure peculiar to a single strand, the shape of the sample DNA hybridized with the biotinylated DNA probe bound with magnetic particles is the same as the hybridized linear portion in step S240 in FIG. A visualized image in which the shape of the magnetic particles is added to the shape of the spherical portion that has not been hybridized is obtained.
[0050]
(G-4) When the sample DNA is nonGMO, the shape of the single-stranded biotinylated DNA probe bound to the magnetic particles that did not hybridize shows a visualization image that is entirely spherical.
[0051]
Examples according to the second embodiment of the present invention will be described below.
[0052]
In order to further increase the sensitivity of the HVM method, as shown in FIG. 4, the ends of the DNA probe were labeled with biotin to bind the magnetic particles, and the hybridization product with the magnetic particles was picked up by a magnet. 5 and 6 are schematic diagrams of images obtained by labeling the ends of the DNA probe with biotin and binding the magnetic particles for visualization.
[0053]
According to the above examples, according to the genetically modified food inspection method (HVM method) according to the present invention, since it is not necessary to amplify DNA by PCR,
1) It is unnecessary to check for contamination between samples and PCR inhibitors.
[0054]
2) It is also used for processed foods, soy sauce, and soybeans that have been broken down shortly. In principle, all GMOs can be inspected.
[0055]
3) The detection limit is equivalent to that of the PCR method and is inexpensive.
[0056]
4) The HVM method has fewer steps and shorter inspection time than the conventional method.
[0057]
The following effects were obtained.
[0058]
【The invention's effect】
According to the food inspection method of the present invention, the length and shape can be measured by visualizing each DNA using the technique of visualization / measurement.
[0059]
Therefore, according to the food inspection method of the present invention, it is possible to inspect a micro structure such as whether or not it is a genetically modified food from a raw material to a processed product with high sensitivity and in a short time.
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram illustrating the principle of the present invention.
FIG. 2 is a flowchart showing details of the method for inspecting recombinant food according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 3 is an example of visualizing GMO using the recombinant food testing method according to the first embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a flowchart showing details of a method for testing recombinant food according to the second embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a schematic diagram of an image in which GMO is visualized using the recombinant food inspection method according to the second embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a schematic diagram of an image in which GMO is visualized using the recombinant food inspection method according to the second embodiment of the present invention.

Claims (2)

Crushing a sample of food to be inspected;
Extracting DNA from the crushed sample;
Hybridizing the extracted DNA with a double-stranded DNA probe that specifically hybridizes to the DNA of the recombinant;
Anchoring the product obtained by the hybridization to a substrate;
Visualizing the product on the substrate using a scanning probe microscope;
And determining that the end of the DNA is genetically modified when the visualized product is Y-shaped. The hybridization step includes:
Hybridizing the extracted DNA with a biotinylated probe that specifically hybridizes to the DNA of the recombinant and binds to magnetic particles;
The method for inspecting food according to claim 1, further comprising the step of binding magnetic particles to the biotinylated probe and extracting a hybridization product with the magnetic particles with a magnet.

Images