JP4351752B2 - イオン交換樹脂を用いた試料加工方法 - Google Patents
イオン交換樹脂を用いた試料加工方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4351752B2 JP4351752B2 JP30959098A JP30959098A JP4351752B2 JP 4351752 B2 JP4351752 B2 JP 4351752B2 JP 30959098 A JP30959098 A JP 30959098A JP 30959098 A JP30959098 A JP 30959098A JP 4351752 B2 JP4351752 B2 JP 4351752B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- ion exchange
- exchange resin
- nucleic acid
- organism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/2525—Stabilizing or preserving
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
- Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明の分野は、広く核酸のハイブリダイゼーション及び／又は核酸の増幅に関するものである。更に詳しく述べると、本発明は、核酸のハイブリダイゼーション及び／又は核酸の増幅作業を妨害する試料中の物質を減らすことに関するものである。このような作業としては、例えば、標的核酸の存在及び／又は量を調べるための核酸プローブハイブリダイゼーション、核酸増幅法のための核酸プライマーハイブリダイゼーション、核酸伸長、ニッキング及び／又は開裂を含む酵素活性が挙げられる。本発明は更に、蛍光検出分析における感度を増加させるための、試料からの蛍光化合物の除去に関する。更に、本発明は室温での保存時間の増加を可能にする試料の安定化に関する。また、生物体の濃縮にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
鎖置換増幅（strand displacementamplification; ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（polymelase chain reaction;ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ligase chain reaction;ＬＣＲ）、核酸配列ベースでの増幅（nucleic acid sequence based amplification;ＮＡＳＢＡ）、転写介在増幅（transcription mediated amplification; ＴＭＡ）等の核酸増幅方法は、試料中には余り多くのコピーが存在しない、目的とする特定の核酸配列（標的配列）の多数のコピーを作成するのに用いられる。しかし、このような試料に通常存在する数多くの物質は、核酸の増幅プロセスを妨害する。同様にこのような物質は、標的核酸の検出のために用いられる直接核酸プローブハイブリダイゼーション反応を妨害したり、阻害したりすることがある。
【０００３】
核酸の増幅を阻害する物質の例として、血液試料に通常見られ、ＰＣＲを阻害するヘム及びヘマチン由来のポルフィリン化合物が挙げられる（Stockton Press社、Henry A. Erlich 編、1989年出版、PCR technology、33〜34ページ）。これらの阻害物質の量を減らすために、これまで浸透圧性の溶解や核及び細胞の破片のペレット化を利用する方法が使われてきた。
【０００４】
唾液の試料がＰＣＲ阻害物質を含有していることも報告されている。Ochert他、PCR Methods and Applications、3, 365-368(1994)。阻害物質は同定されていないが、この唾液試料に広汎電磁波をかけるか、又は沸騰させると、ＰＣＲ阻害物は、全体的に除去されることが判明した。
【０００５】
Frickhofen及びYoungは、J. Virol. Methods, 35, 65-72 (1991)で、血清試料を７０℃で４５秒間加熱すると、ウイルスの核酸配列のＰＣＲ増幅を改善することができると報告している。この改善は、ＰＣＲ法を阻害すると考えられているアプロチニン、ロイペプチンＰＭＳＦ及びペプスタチン等の血清酵素が熱によって不活性化されるためである理論付けられている。
また、ウイルスの核酸配列の増幅を行う前に、ＰＣＲ阻害物質を血清から除去するための方法が、Zeldis他、J. Clin. Invest., 84, 1503-1508 (1989)に示されている。これは、ウイルスを抗体被覆微粒子に吸着させ、この微粒子を洗浄し、次にＰＣＲを阻害すると思われる残りのタンパク質をプロテイナーゼＫで破壊する方法である。
【０００６】
ＰＣＲにより羊水、胎児及び新生児の血清、脳脊髄液の梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)を検出する際、ＰＣＲ阻害化合物を除去するために４つの異なった方法が試みられた。Grimprel他, J. Clin. Microbiol., 29, 1711-1718(1991)。要約すると、ＰＣＲ阻害化合物の除去のための４つの方法は次の通りである。すなわち、（１）試料を入れた試験管を熱湯浴に１０分間置き、氷冷し、遠心分離するといった煮沸方法。（２）試料を滅菌燐酸塩緩衝食塩水に加え、一連の遠心操作を行い次に得られたペレットを再懸濁して１０分間煮沸し、氷冷するといった低スピン分離方法。（３）試料を１ＭのＮａＣｌ、１ＮのＮａＯＨ及び０．１％のＳＤＳ中で１．５分間煮沸し、次に０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和し、フェノール及びクロロフォルム−イソアミルアルコールで抽出し、イロプロピルアルコールで沈殿させるといったアルカリ溶解抽出法。（４）試料を（２）で述べた低スピン分離に付し、１０分間煮沸し、次にフェノール−クロロフォルムで一回抽出して、冷無水エタノールで沈殿させるといったスピン抽出法である。著者は、用いた試料の種類によりこれらの方法の成功度が異なると報告している。
【０００７】
便を試料として用いた場合、逆転写酵素−ＰＣＲ法を阻害する可能性のある微粒子及び溶解物質のかなりの量が、ポリエチレングリコールで沈殿させることにより除去されることがわかった。 Jiang他、J. Clin. Microbiol., 30, 2529-2534(1992)。沈殿後、フェノール−クロロフォルム抽出に続いて、高塩濃度で陽イオン洗浄剤、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を用いて抽出を行った。
【０００８】
上記の方法とは別に、便の試料からＰＣＲ阻害物質を除去する方法が Wilde他、J. Clin. Microbiol., 18, 1300-1307(1990)により報告されている。ＰＣＲにより便の試料からロタウイルスの核酸を検出する前に、一連の迅速な洗浄及び溶出工程においてロタウイルスの精製を行うためにクロマトグラフィーのセルロース繊維粉末（ＣＦ１１粉末）を利用する工程を抽出工程に加えた方法である。
【０００９】
ＰＣＲを用いて尿中のサイトメガロウイルス（cytomegalocirus;ＣＭＶ）を検出する研究を行った際、尿素はＰＣＲを阻害するものであることがわかった。Khan他、J. Clin. Pathol., 44, 360-365 (1991)。この文献では、尿中の尿素のＰＣＲ阻害作用は透析又は超遠心分離等の方法により効果的に除去されることが報告されている。
【００１０】
ＣＭＶの核酸を検出する前に尿中のＰＣＲ阻害物質を除去するもう一つの方法がBuffone 他、Clin. Chem., 37, 1945-1949(1991)に報告されている。この方法はＣＭＶ生物体から核酸を放出した後に行われ、増幅用の核酸を回収する前にタンパク質と他の物質を選択的に溶出させることができるように細かいガラスビーズを用いて核酸を吸着させるものである。
【００１１】
上述の文献から明らかなように、核酸増幅の阻害に関する文献の多くはＰＣＲに関連したものである。ＰＣＲを阻害するこれらの物質が、臨床試料に共通して見出されるタンパク質性物質、ＥＤＴＡ，ヒトＤＮＡ及び鉄のような他の多くの物質と同様に、ＳＤＡ及び他の核酸増幅方法も阻害することがわかっている。
【００１２】
阻害物質を減らしたり除去したりするこれらの方法の多くは、試料加工方法論に加えてねばならない時間のかかる複雑なステップを含んでいる。更に、これらの方法は、比較的厳しい加工ステップ又は加工条件を用い、更に／又は標的核酸を他の物質から分離する必要があるので、標的核酸配列の一部をロスするという問題を抱えている。非常に少ないオリジナルの標的配列からたくさんの標的配列のコピーを作成する核酸増幅法の能力とは別に、試料中にオリジナルの標的が数多くあればある程増幅効率及び検出能力は改善される。抗酸性杆菌Bacillus（acid fast Bacillus; ＡＦＢ）、スメア陰性ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の試料など、特に検出の難しい試料の加工の場合、検出能力が大きいことが非常に重要である。
【００１３】
分子診断法に付す試料に共通しているのは、長時間にわたる試料の安定性の問題である。試料が、ある場所で採取され、例えば分子診断加工用の中央研究所のような他の場所に移される場合、試料の安定性がより重要となる。
尿の試料及び膣、頚部スワブにおいて、多くの臨床的に関連のある生物体は室温で２４時間以上にわたって完全な状態を保っていない。中央研究所への移送の間及び／又は貯蔵の間このような試料を冷凍することが必要となってくる。尿の試料及びスワブにより通常テストされ、室温で保存される試料の中で非常に不安定であることが知られている分析物は、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）である。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
核酸のハイブリダイゼーション及び／又は核酸の増幅を阻害する物質の存在に関連した問題を克服し、標的核酸配列の検出を改良するために、本発明は、試料中の細胞が溶解する前に、試料をイオン交換樹脂にさらして試料中の阻害物質の量を減らす方法を提供する。
本発明においては、あらゆる種類のイオン交換樹脂（陽イオン、陰イオン及び混合床）が有用である。試料をイオン交換樹脂にさらした後、この樹脂を試料から分離してもよい。
【００１５】
乾燥したイオン交換樹脂を用いることで、標的生物体を濃縮するというメリットが得られる。試料をイオン交換樹脂にさらすことはまた、室温での保存又は輸送に対して試料を安定化し、次に行う蛍光検出法を妨害する可能性のある蛍光物質の結合及び試料からの分離を可能にする。更に、イオン交換樹脂は、使用しやすいキット状にパッケージすることもできる。
本発明の種々の目的、利点及び新規の特徴は、次の添付の図面を参照して下記の詳細な説明を読むことにより容易に理解されるであろう。
【００１６】
【発明の実施の形態】
上述のように、本発明は、核酸を有する細胞を含んだ試料中に含まれている核酸のハイブリダイゼーション及び／又は増幅作業を妨害する又は阻害する物質の量を減らす方法に関する。この方法において、核酸を含有する細胞が試料中に残るように、試料中の細胞が溶解する前に、試料をイオン交換樹脂にさらす。その後、任意に、この細胞をイオン交換樹脂から分離してもよい。
【００１７】
上述の従来の技術の項で述べたことから明らかなように、阻害物質を除去するために行われた他の研究者による幾つかの方法は非常に複雑であったので、本発明の方法の結果は特に予期しないものであった。発明者の知るところでは、普通、核酸のハイブリダイゼーション及び／又は核酸の増幅反応に付される試料の溶解が起きる前にはイオン交換樹脂は用いることはない。
【００１８】
本発明の方法の利点の一つは、細胞から得られる標的核酸の、試料中の最終濃度を上げることができる点である。核酸増幅法においては、非常に少ない数の最初の標的から多くの標的配列のコピー（アンプリコン）を作ることができるが、できるだけ最初の標的数が多い状態で増幅法を開始できる方が有利である。濃縮は乾燥マトリックスの膨潤の結果おこる。試料中の液体が乾燥樹脂に取り込まれるか又は吸収されるが、一方細胞は樹脂中に入り込むには大きすぎる。その結果一定の数の細胞と結合している液体試料の量が減少し、それによって細胞の濃度は増加する。例えば乾燥樹脂がアンバーライトTMＭＢ−１５０（ＡｍｂｅｒｌｉｔｅTMＭＢ−１５０）の場合、その乾燥重量の５０％まで吸収する。他の方法においては、核酸ハイブリダイゼーション阻害物質の除去を細胞溶解後に行っているが、これらの方法は非常に非効率的である、なぜならそれらの方法では溶解産物中の物質から核酸を分離することになり、もとからある標的が多く回収されないからである。本発明の方法では、細胞の溶解前に阻害物質を除去するので、その後の分離は不必要で標的をより収率よく得ることができる。
【００１９】
本発明の方法に用いてられる試料としては、例えば、痰、血液、尿、脳脊髄液（cerebrospinal fluid;「ＣＳＦ」）試料、膣及び頚部のスワブなどの実質的にはあらゆるヒト及び動物の臨床試料、水、空気、土等の環境試料及び食品試料が挙げられる。本発明の方法に用いられる試料は、増幅法開始のための直接プローブハイブリダイゼーション、プライマーハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーション法の対象となる標的核酸配列を有する細胞を含んでいると疑われるものである。
【００２０】
上述のような試料に通常見られる、核酸ハイブリダイゼーション法を阻害する物質としては、タンパク質性物質、非標的ＤＮＡ，塩、尿素及びタンパク質分解性酵素等が挙げられる。従来技術の項で既に述べたように、これらの物質は例えば、ＳＤＡ，ＰＣＲ，ＬＣＲ，ＮＡＳＢＡ，ＴＭＡ等の核酸増幅法を阻害するものとして知られている。
本発明の方法は試料をイオン交換樹脂にさらすことを含む。この暴露を行うのは、標的核酸を放出させるための細胞の溶解前であればいつでもよい。
【００２１】
本発明の方法においては多くのイオン交換樹脂が有用である。このような有用なイオン交換樹脂としては Sigma-Aldrich社のいわゆるアンバーライトTM樹脂または同様の樹脂が挙げられる。これらイオン交換樹脂は通常、荷電官能基が結合した或いは荷電官能基を含有するポリスチレン等の重合体である。この重合体がタンパク質や酵素等の阻害物質と疎水的に結合し、荷電官能基が塩、細胞外核酸、タンパク質等の荷電阻害物質と結合する。本発明の方法において有用な他の樹脂は、例えば樹脂にさらした後に、どの程度阻害物質が除去されているか及び、標的生物体の完全性及び／又は生菌数が維持されているか等の樹脂の最適特性に対する通常のスクリーニング分析を行うことによって、合理的に予想される成功をもとに同業者によって確認されるであろう。
【００２２】
即ち、標的生物体を含有する試料を一定期間イオン交換樹脂で処理する。この試料を目的のハイブリダイゼーション／増幅試験に付す。樹脂にさらした後のハイブリダイゼーション及び／又は増幅効率がかなり増加することによって、樹脂の効能がわかるであろう。
代わりに、又は追加の操作として、試料を、特定の試料が室温で安定していると知られている時間以上にイオン交換樹脂にさらす。例えば、淋菌の尿の試料は通常室温でほんの約２４時間しか安定ではない。さらした後、特定の分析物（例えば、淋菌）がまだ生存しているかどうか調べるために、平板培養する。室温における分析物の完全性及び／又は室温での生菌数の維持という点において、樹脂処理しない場合より優れている場合、これらのイオン交換樹脂は本発明の方法において有用であろう。
【００２３】
本発明で用いられるイオン交換樹脂の濃度及び量は、本発明の方法に付される試料の種類による。通常、本発明の方法において用いられるイオン交換樹脂の量は、試料との質量比で約１：１から約１：２０の範囲であり、好ましくは約１：５から１：１５である。大部分の試料で約１：１０の比率が適当である。好適な樹脂の選択において述べたスクリーニング法をもちいることにより、同業者は試料量に対する樹脂の比率を変えて本発明と同様の結果を得ることができるであろう。
【００２４】
樹脂は試料に対して、いろいろな形状で提供される。本発明の方法において用いられる樹脂の好適な形状としては、乾燥粒状、圧縮したタブレット状、樹脂を含有する溶解性カプセル、樹脂を含有するサック等の透過性担体(permeable vehicle)、Whatman社のイオン交換セルロース紙グレードＰ８１及びSchleicher&Schuell社のＳ＆Ｓイオン交換膜等のイオン交換紙が挙げられる。これら形状の樹脂は単独で、又は他の成分とともにキットとして包装され、次の目的でもちいられる。（ａ）核酸のハイブリダイゼーション及び／又は核酸の増幅を妨害する物質を試料から除去する、（ｂ）室温での保存時間を長くするために試料を安定化する、（ｃ）蛍光検出分析法での感度を増加するために試料から蛍光化合物の除去する、及び／又は、（ｄ）試料中の生物体を濃縮する。
【００２５】
樹脂を含有する透過性担体は、樹脂と試料を接触させるための手段として好ましい。このような透過性担体はティーバッグのように働く。この担体により液体状の試料が樹脂上を流れることが可能となり、遠心分離や濾過等のステップをあらためて設けなくとも、試料から樹脂を容易に分離させることが可能となる。この透過性担体は、通常、イオン交換樹脂を含有するメッシュである。
【００２６】
このような透過性担体の一態様を図１及び２に示す。図１は、一枚のメッシュシート（１４）と、このメッシュをヒートシールする際にできたボーダー或いはこのメッシュ以外の接着性又はシール性の材料からなる場合もあるボーダー（１６）で構成される担体（１２）の正面図である。図１で示したように、この一枚のシートは担体（１２）を作るために折り曲げられている。
【００２７】
製造の際、このシートは折り曲げてから二辺をシールする。次に適量のイオン交換樹脂（１８）（図２参照）を担体の上部開口部から加える。イオン交換樹脂を加えた後、担体の上部にひだを作って、シールする。これにより、図２の断面側面図に示したような担体ができる。
このような担体のメッシュ（１４）として好適な材料は、ポリプロピレン及びナイロンであるが、これらに限定されない。接着性又はシール性のボーダー（１６）としても同様の材料が好適である。
【００２８】
樹脂を試料と接触させると、核酸のハイブリダイゼーション及び／又は増幅を阻害する物質は、この樹脂に付着する。イオン交換樹脂と阻害物質の結合は、基本的には樹脂の陽イオンと陰イオンが阻害物質と交換することによる。無害の陽イオンと陰イオンが試料に放出され、阻害物質が樹脂に結合する。これら阻害物質は、核酸のハイブリダイゼーション及び／又は増幅作業をはじめる前に試料から除去される。
【００２９】
樹脂と試料を接触させる時間は、試料の種類、試料に対する樹脂の比率、試料中の阻害物質の濃度及び種類によって異なる。樹脂は試料と接触すると直ちに活性を示すが、本発明の方法における樹脂と試料の接触時間は約１５分から約４日間である。
この接触後、任意に、樹脂と試料を分離してもよい。上述のように、この分離はいろいろな方法で行うことができ、例えば、遠心分離、濾過等の他、もし透過性担体又はイオン交換紙を用いているならば、マトリックス（つまり透過性担体又はイオン交換紙）を試料から物理的に除去するか又は処理した試料を単にピペット操作により除去することもできる。
【００３０】
ハイブリダイゼーション又は増幅に用いる試料中の標的核酸を調製するために現在さまざまな方法が用いられている。例えば、マイコバクテリアの核酸配列を増幅するために加工される痰の試料は、通常、ＮＡＬＣ／ＮａＯＨ法に付される。同様に、他の臨床試料は他の良く知られた標準的な方法に付され、例えば血液、尿等の大量の試料の場合は遠心分離される。本発明の方法はこれらの標準的な方法を行う前に、或いはその方法の一部として、又はその後に用いられる。
【００３１】
イオン交換樹脂と試料との接触は、核酸のハイブリダイゼーション及び／又は増幅を阻害する物質を除去するための方法に用いられるだけでなく、これによって試料が安定化し、室温での輸送も可能となり、また、試料の濃縮にも利用される。このような輸送のための安定化に役立つ樹脂の量は、核酸のハイブリダイゼーション及び／又は増幅阻害物質の除去と大体同じである。輸送のための安定化、試料の濃縮、蛍光物質の除去そして核酸阻害物質の除去、これら全てはイオン交換樹脂を試料と接触させることにより起こるものである。このように、本発明は輸送等の目的のために室温での試料の安定化をはかり、同時に、試料を濃縮して、蛍光化合物を核酸のハイブリダイゼーション及び／又は増幅阻害物質と結合させて次に試料から除去することにより、分子診断分析のために試料の加工又は準備をはじめる人にとって非常に有効な方法を提供するものである。
【００３２】
次の実施例は、本明細書で述べた発明の特定の態様を示したものである。同業者には明らかであろうが、本発明の範囲内で考えられた種々の変更及び修正は可能である。
【００３３】
【実施例】
＜例１＞
混合床イオン交換樹脂は、尿及びスワブ試料から既知の増幅阻止物質及びバックグラウンド蛍光化合物を除去する
本例の目的は、混合床イオン交換樹脂（アンバーライトTMＭＢ−１５０）が尿の試料及びスワブ試料から非特異的ＤＮＡを除去するかどうか調べることである。更に蛍光検知システムのバックグラウンドを増加し、システムの感度を弱める可能性のある蛍光化合物が除去されるかどうか調べるために、処理及び非処理試料の蛍光計測を行った。
【００３４】
材料
試料加工試薬
Ｂ−ＤＥ−Ｚスワブで得た膣スワブ試料
尿試料
試料緩衝液
アンバーライトTMＭＢ−１５０（シグマ社）
ＢＤポリプロピレン分配管
ｓｓＤＮＡ分析試薬
オリグリーン染料（分子プローブ）
ＴＥ緩衝液
【００３５】
手順
４ｍｌの試料緩衝液に８個の膣スワブ試料を絞り出し、得られた溶液をボルテックスした。アンバーライトTMＭＢ−１５０を０．４グラム含有する２本のＢＤ分配管に、試料を１ｍｌづつ小分けした。ＢＤ分配管中の溶液をボルテックスし、室温で３０分間保持した。３０分後、得られた溶液をセパレート管に移した。アンバーライトＭＢ−１５０を０．４グラム含有するＢＤ分配管二本に、１ｍｌの尿を分けた。得られた溶液をボルテックスして、室温で３０分間保持した。３０分後、得られた溶液をボルテックスし、次にセパレート管に移した。
【００３６】
ヒト胎盤ＤＮＡの標準液１０００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．２５ｎｇ／ｍｌ及び０ｎｇ／ｍｌを、ＴＥ緩衝液で調製した。アンバーライトTMＭＢ−１５０で処理した試料及び非処理の尿及びスワブ試料を１：１０及び１：１００にＴＥ緩衝液で希釈した。試料を５分間熱湯浴に置き、ＤＮＡ鎖を変性させた。製造者の説明書に従ってOligreen染料をＴＥで１：２００に希釈した。等量の試料及び希釈Oligreen染料をプラスチックキュベットで合わせ、蛍光励起波長４８０及び放出波長５２０を用いて、試料を調べた。非処理の試料のバックグラウンド蛍光測定値を４８０励起及び５２０放出波長を用いて測定し、得られたバックグラウンドをｓｓＤＮＡ測定値からひいた。非処理の試料と比較するために同様に、処理試料でバックグラウンド蛍光測定を同様に行い、バックグラウンド蛍光物質が除去されているかどうか調べた。
結果
結果は、標準曲線の直線部となるｓｓＤＮＡ値を用いて次の表に示した。
【００３７】
【表１】
【００３８】
考察
この例のデータによると、混合床イオン交換樹脂はスワブ試料、尿試料双方からバックグラウンド蛍光化合物を除去している。この結果は蛍光分析検出システムにおいては、バックグラウンド蛍光値が高いと感度の要求に強い影響を及ぼすので、この結果は有利である。
更に、これらのデータは、混合床イオン交換樹脂は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）の既知の増幅阻害物質である非標的ＤＮＡを除去することを示している。
【００３９】
＜例２＞
直接尿加工法
本発明の目的は、本発明が尿加工において、従来の遠心分離ステップ及び洗浄ステップを用いなくてもよいかどうか調べるために行われた。
【００４０】
材料
試料加工試薬
アンバーライトTMＭＢ−１５０（シグマ社）
消泡剤
スペクトラ／メッシュR ポリプロピレンフィルター、７５μｍ
尿試料
２×クラミジア試料緩衝液
１×試料加工緩衝液
クラミジア標品
【００４１】
分析試薬
［オリゴヌクレオチド装置（Oligonukuleotide Device;ＯＤ）］乾燥した各ウェルに、ＳＤＡ増幅プライマー、ＳＤＡバンパープライマー、ＳＤＡ蛍光検出プローブ、ｄＵＴＰ及び緩衝液を入れたマイクロタイタープレート、
［酵素装置（Enzyme Device;ＥＮＤ）］乾燥した各ウェルに、制限酵素（ＢｓｏＢｌ）、ポリメラーゼ（Ｂｓｔ）、ｄＣｓＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及び緩衝液を入れたマイクロタイタープレート（オリゴヌクレオチド装置及び酵素装置については、同時継続中の米国特許出願番号（Becton Dickinson書類番号P-4025）にもっと完全に記されており、参照することによって、本明細書の一部とする）
【００４２】
手順
４つの尿試料に１０００／ｍｌクラミジア因子を加えた。１．２５％の消泡剤を１０μｌ含有する４本のＢＤ分配管に、０．３ｇのアンバーライトTMＭＢ−１５０ を入れた。アンバーライトTMＭＢ−１５０を含有するＢＤ分配管に各尿試料を１ｍｌ加え、試料を室温で３０分間保持した。得られた溶液を７５ｕｍプロピレンメッシュを通して試験管に入れた。等量の試料と２×濃縮試料緩衝液を試料を入れた試験管に入れ、この試験管を３０分間、１０５℃の加熱ブロックにおいた。
尿試料を４ｍｌ試験管にとり、この試験管を３０分間２０００ｇで遠心分離した。上清をデカントし、試料緩衝液を３ｍｌ試験管に加えた。各試験管を３０分間、１０５℃の加熱ブロックにおいた。
【００４３】
試験管の試料を少量（１５０μｌまで）ＯＤの各ウェルにいれ、このウェルをカバーして、室温で２０分間おいた。カバーをとり、つぎにＥＮＤを５２℃で１０分間あらかじめ暖めておきながら、７５℃で１０分間インキュベートした。
１０分のインキュベーションの後、ＯＤ各ウエルから１００μｌづつＥＮＤの該当するウェルに（ピペットで）移した。ＥＮＤを接着性カバーで密閉し、１９９７年９月１５日出願の同時継続中の米国特許出願番号（Becton Dickinson書類番号P-4067、本引例は、引用することにより具体的に本明細書の一部とする）で述べた蛍光測定装置にいれた（これ以外の標準マイクロタイタープレート蛍光測定装置も使用できる）。
ＥＮＤのウェルからの蛍光信号を６０分間モニターした。密閉したＥＮＤは研究室の環境がアンプリコンで汚染されないように密閉バッグのなかに廃棄した。
【００４４】
結果
結果は、面積として下記の表に示した。面積は、その時間の蛍光信号の曲線の積分である。
【００４５】
【表２】
【００４６】
考察
この表のデータによると、本発明の方法を用いることによって、尿の試料加工から遠心分離ステップ及び洗浄ステップを省くことができる。
【００４７】
＜例３＞
淋菌を加えた陰性臨床試料を用いた増幅阻害物質除去のための混合床イオン交換樹脂
本例の目的は、混合床イオン交換樹脂（アンバーライトTMＭＢ−１５０）が、対照と比較して、増幅阻害物質を除去し、特定の標的信号の回収を改善したかどうか調べることにある。
【００４８】
材料
試料加工試薬
尿試料
淋菌標品
試料緩衝液
アンバーライトTMＭＢ−１５０（シグマ社）
増幅試薬
［ＯＤ］（例２で述べたものと同様のもので、クラミジアより淋菌に特異性のあるＳＤＡ増幅プライマー、ＳＤＡバンパープライマー、ＳＤＡ蛍光検知プローブ）
［ＥＮＤ］
【００４９】
手順
３０個の臨床尿試料に、１０００／ｍｌの淋菌粒子形成単位を加えた。０．１２ｇのアンバーライトＭＢ−１５０を含む１５ｍｌのコニカルチューブに各試料を６ｍｌ移し、ボルテックスして、室温で１６時間保存した。対照として、直接遠心分離管に各尿試料を４ｍｌを入れてこの試料を４℃で１６時間保存した。
室温で１６時間保存した後、アンバーライトを含有する試料をボルテックスし、得られた液体を４ｍｌ、遠心分離管にいれた。アンバーライトで処理した試料とアンバーライトＭＢ−１５０なしに４℃で保存した試料を３０分間２０００ｇで遠心分離した。得られた上清を各管からデカントし、試料希釈液を各管に３ｍｌ加えた。この管を１０５℃の加熱ブロックに３０分間入れた。
例２と同様にして、得られた試料を増幅し、結果を得た。
【００５０】
結果
３個の増幅／検知複製の平均の面積を用いて結果を次の表に示した。表の最下部の値は全ての試料の平均である。
【００５１】
【表３】
【００５２】
考察
尿の試料を加工する対照の方法と比較して、混合床イオン交換樹脂で尿の試料を処理した場合の方が面積が大きいが（Ｐ値＝２．３６Ｅ−９の等しい変数を用いたＴ試験結果による）、この事は、増幅阻止物質がシステムから除去され、特定の増幅がより効率的に行われることを示している。
【００５３】
＜例４＞
尿中の淋菌の室温安定性を示す比較例
本例の目的は尿中の淋菌の室温での安定性を評価するために行われた。
材料
試料加工試薬
試料希釈液
淋菌ストック
［尿］男性の尿プール
【００５４】
増幅試薬
例３と同様のＯＤ
例３と同様のＥＮＤ
【００５５】
手順
淋菌を健常な男性の尿プールに加え最終反応濃度を各反応ごとに、０、１０及び１００粒子となるようにした。希釈液を２５℃で保存した。各希釈液を４ｍｌづつ試料試験管に移し、０時間、１日、２日及び４日の時点で加工した。試料は全て次のように加工した。２０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清をデカントし、ペレットを２ｍｌの試料希釈液で再度懸濁し、１００℃で３０分間加熱した。試料を増幅し例２と同様にして結果を得た。
結果
結果は次の表に平均面積として示した。
【００５６】
【表４】
【００５７】
考察
淋菌は室温で尿中に1日以上保存すると不安定である。
【００５８】
＜例５＞
室温での淋菌及びトラコーマクラミジアを安定化するための添加物のスクリーニング
本例の目的は、室温に2日間おいた尿中の淋菌及びトラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）を安定化するための添加物をスクリーニングするためである。
【００５９】
材料
試料加工試薬
尿プール
試料緩衝液
ケモスタット試験管（マイクロシュア社）
硼酸／蟻酸塩
ＰｒｏＣｌｉｎ ３００
アンバーライトTMＭＢ−１５０（シグマ社）
増幅試薬
例３と同様の淋菌ＯＤ
例３と同様の淋菌ＥＮＤ
例２と同様のトラコーマクラミジアＯＤ
例２と同様のトラコーマクラミジアＥＮＤ
【００６０】
手順
３個の尿プールに、クラミジア株ＬＧＶ−ＩＩを１ｍｌあたり７５０個加え、これら３個のプールの内２個に淋菌を１ｍｌあたり７５０粒子形成単位加えた。三番目の尿プールは淋菌に対して陽性であったので、添加しなかった。各尿プールを４ｍｌづつ、４本の試験管にそれぞれ移し、０時間、４℃で４０時間、２４℃で４０時間、４℃で９６時間経過後試験管を３０分間２０００ｇで遠心した。上清をデカントし、試料緩衝液を３ｍｌ、各試験管に加えた。試験管を１０５℃で３０分間加熱ブロックに移した。
【００６１】
各プールを１０ｍｌづつ、ケムスタット管に移した。次に材料を一プール２本の試験管に１本当たり４ｍｌづつ入れた。２４℃で０時間及び４０時間経過後、２０００×ｇで３０分間遠心した。上清をデカントし、試料緩衝液を３ｍｌ、各試験管に加えた。試験管を１０５℃で３０分間加熱ブロックに移した。
各プールから５ｍｌづつ１プールにつき２本の硼酸／蟻酸塩の試験管に移した。各硼酸／蟻酸塩の試験管から４ｍｌを試験管に移した。２４℃で０時間及び４０時間後、試験管を２０００ｇで３０分間遠心した。上清をデカントし、試料緩衝液を３ｍｌ各試験管に加えた。試験管を１０５℃で３０分間加熱ブロックに移した。
【００６２】
各プールから９ｍｌを２．７μｌのＰｒｏＣｌｉｎ３００を含有する１５ｍｌの遠心分離用試験管に移し、各プールから４ｍｌを２本の試験管に移した。２４℃で０時間及び４０時間後、試験管を２０００ｇで３０分間した。得られた上清をデカントし、試料緩衝液を３ｍｌ各試験管に加えた。試験管を１０５℃で３０分間加熱ブロックに移した。
【００６３】
０．７２グラムのアンバーライトTMＭＢ−１５０を含有する二本の１５ｍｌの遠心分離用試験管に各プールから５．５ｍｌづつ移した。試料をアンバーライトに加えてから１０分後、得られた溶液４ｍｌを試験管に移した。各プールを含有する残りの１５ｍｌの遠心分離用試験管を２４℃で４０時間保存した。得られた溶液を４ｍｌづつ試験管に移し、試験管を２０００ｇで３０分間遠心した。得られた上清をデカントし、試料緩衝液を３ｍｌ各試験管に加えた。試験管を１０５℃で３０分間加熱ブロックにおいた。
試料を増幅し、例２と同様の方法で結果を得た。
【００６４】
結果
結果は３個の増幅複製の平均として、下の表に示した。
【００６５】
【表５】
【００６６】
【表６】
【００６７】
【表７】
【００６８】
【表８】
【００６９】
考察
０．１３ｇ／ｍｌの混合床イオン交換樹脂（アンバーライトTMＭＢ−１５０）を加えると、既知の添加量の淋菌を含むプール１及び２で室温で４０時間まで尿中安定性を示す。最初から淋菌に非常に陽性であったプール３は全ての保存条件で陽性であり、そのことは、淋菌の濃度が非常に高いと、特異的な信号が維持されることを示している。ケムスタット、硼酸／蟻酸塩、ＰｒｏＣｌｉｎを添加した場合は室温での淋菌の安定性は全く或いは殆どなかった。
アンバーライトTMＭＢ−１５０は両方の阻害物質除去に有効で、クラミジアＬＧＶ−ＩＩの安定にもすぐれていた。
【００７０】
＜例６＞
尿を混合床イオン交換樹脂で処理することにより、菌を添加した陰性臨床試料を４日間安定にする。
本例の目的は、各臨床試料に添加した淋菌及びトラコーマクラミジアが混合床イオン交換樹脂（アンバーライト）により室温で４日間安定化することができるかどうか調べることにあった。
【００７１】
材料
試料加工試薬
陰性尿試料
試料緩衝液
アンバーライトＭＢ−１５０（シグマ社）
淋菌標品
トラコーマクラミジア標品
【００７２】
増幅試薬
例３と同様の淋菌ＯＤ
例３と同様の淋菌ＥＮＤ
例２と同様のトラコーマクラミジアＯＤ
例２と同様のトラコーマクラミジアＥＮＤ
【００７３】
手順
３０個の尿試料に淋菌を８００／ｍｌ、トラコーマクラミジアを８００／ｍｌを加えた。更に、各試料から尿７ｍｌを０．４７ｇのアンバーライトＭＢ−１５０を含有する１５ｍｌのコニカルチューブに移し、各試料からの尿７ｍｌを１．４ｇのアンバーライトＭ−１５０を含有する１５ｍｌのコニカルチューブに移した。これらの試験管をすぐにボルテックスした。０．４７ｇのアンバーライトＭ−１５０を含有する溶液を試験管１本あたり４ｍｌ遠心用試験管に移した。試験管を２０００ｇで３０分間遠心した。得られた上清を試験管からデカントし、試料希釈液を各試験管に２ｍｌづついれた。試験管を１１０℃の加熱ブロックに３０分間おいた。試験管を−２０℃に４日間保存した。
１．４ｇのアンバーライトＭＢ−１５０を含有する溶液は室温で４日間保存し、次にこの溶液を遠心分離用試験管に１本当たり４ｍｌ移した。試験管を２０００ｇで３０分間遠心した。得られた上清を試験管からデカントし、試料希釈液を各試験管に２ｍｌづつ入れた。試験管を１１０℃の加熱ブロックに３０分間おいた。
得られた試料を増幅し、例２と同様の方法で結果を得た。
【００７４】
結果
結果は次の表に示した。
【００７５】
【表９】
【００７６】
考察
混合床イオン交換樹脂（アンバーライトＭＢ−１５０）にさらすことにより、各臨床尿試料の標的生物体の完全性が室温で４日間保持される。
【００７７】
＜例７＞
フリーのイオン交換樹脂と透過担体に担持させたイオン交換樹脂との比較
本例の目的は、イオン交換樹脂を、自由に試料に接触させる場合と透過性担体に担持させた場合とで、試料からの重量オスモル濃度の減少において更に、試料から抽出した核酸の増幅において、等しい機能が発揮されるかどうかを調べることである。
【００７８】
材料
試料加工試薬
スペクトラR／メッシュポリプロピレンフィルター７５μＭ
アメリカンインターナショナル電気加熱シーラー
プレシジョンシステム社 ＯｓｍｅｔｔｅＡ重量オスモル濃度測定装置
アンバーライトＭ−１５０（シグマ社）
ＶＷＲ ４ｏｚ． 標品収集容器
１５ｍｌのファルコンコニカルチューブ
トラコーマクラミジア／淋菌試料希釈液
１０個の陰性尿プール、それぞれ別の臨床試料からなる。
【００７９】
増幅及び分析試薬
例２と同様のトラコーマクラミジアＯＤ
例２と同様のトラコーマクラミジアＥＮＤ
例３と同様の淋菌ＯＤ
例３と同様の淋菌ＥＮＤ
【００８０】
手順
実験にあたってアンバーライトＭＢ−１５０イオン交換樹脂を蒸留水で２回洗浄し真空乾燥した。次にこの樹脂を平らな表面に広げて、一晩３７℃のインキュベーターで乾燥させた。乾燥した樹脂を２．４ｇとり、８角形のヒートシールしたポリプロピレンメッシュポーチにいれた。イオン交換樹脂への試料の暴露を最大限になるようにして１０個のポーチを作った。標品収集容器の底にこのポーチを平らにおけるようにサイズを小さくするなど変更を加えてもよいし、また試料を吸収することによる樹脂の膨張も考慮にいれる。ポーチをぞれぞれ１０個の標品収集容器に入れた。乾燥した樹脂を０．８４ｇづつ２０個のファルコン１５ｍｌコニカルチューブにおいた。
【００８１】
３５ｍｌの尿のプールを１０個作成した。各尿のプールに１ｍｌあたり淋菌８００粒子、トラコーマクラミジア基本小体を８００個加えた。無処理の尿プールの重量オスモル濃度基準を得た。次にイオン交換樹脂を透過性担体にいれて置いた標品収集容器に各尿プール２０ｍｌを入れた。尿プールの残りの１４ｍｌをフリーのイオン交換樹脂を含有する２本のファルコン１５ｍｌコニカルチューブにわけた。管のうちの１本をそのままにして、もう１本を７ｍｌの尿プールをコニカルチューブにわける際ボルテックスした。
イオン交換樹脂で２時間処理した後、処理尿プールの重量オスモル濃度を測定した。各処理尿４ｍｌを次に２０００ｇで３０分間遠心した。得られた上清をデカントし、トラコーマクラミジア／淋菌試料希釈液を試験管１本あたり２ｍｌ各ペレットに加えた。ペレットを次に５秒間ボルテックスし、再度懸濁した。３０分間１１０℃の加熱ブロックで試験管を加熱した後、試料を全て増幅し、結果を例２と同様にして得た。
【００８２】
結果
重量オスモル濃度の測定及びトラコーマクラミジア及び淋菌の面積として結果を次の表に示した。
【００８３】
【表１０】
【００８４】
【表１１】
【００８５】
【表１２】
【００８６】
考察
イオン交換樹脂、フリーに試料と接触できる場合も、透過性担体中にある場合も、重量オスモル濃度の減少及び増幅という点では等しい機能を示している。
無処理のプールとポーチにいれた樹脂（ｐ値＝４．４２Ｅ−０．５）で処理した同じプールでは重量オスモル濃度にかなりの違いが観察された。しかし、ポーチに入れた樹脂と、インキュベーション前にボルテックスしたフリー樹脂（ｐ値＝０．０６、凍結試料故に変数は同じではない場合）又はインキュベーション前にボルテックスしていないフリー樹脂（ｐ値＝０．２５）との間にはたいした違いはない。更に、凍結樹脂をポーチに入れた樹脂とインキュベーション前にボルテックスしたフリーの樹脂（ｐ値＝０．１９、等しい変数とした場合）との比較から除いた場合、違いはもっと少ない。試料から塩を機能的に除去するための最低条件は単に物理的な接触である。
【００８７】
トラコーマクラミジアの面積単位において、ポーチに入れた樹脂対インキュベーション前にボルテックスしたフリーの樹脂（ｐ値＝０．２５）又はインキュベーション前にボルテックスしなかったフリーの樹脂（ｐ値＝０．４６）との間に大きな違いはみられない。淋菌の面積単位においても同様のことが観察された。ポーチに入れた樹脂対インキュベーション前にボルテックスさせたフリー樹脂（ｐ値＝０．７３）又はインキュベーション前にボルテックスしなかったフリーの樹脂（ｐ値＝０．３９）との間に統計的な違いは見つからなかった。
【００８８】
＜例８＞
分子診断法によるテストのための透過性担体に入れたイオン交換樹脂による試料の安定化
本例の目的は、標的生物体の核酸の鎖置換増幅（ＳＤＡ）による次のテストを行う際に、この生物体が透過性担体に入れたイオン交換樹脂によって安定化されているかどうかについて調べることであった。
【００８９】
材料
試料加工試薬
例７と同じ
増幅及び分析試薬
例７と同じ
【００９０】
手順
イオン交換樹脂での処理日数を５日及び７日にした以外は例７と同様にして、フリーイオン交換樹脂で処理した尿プール及び透過性担体に入ったイオン交換樹脂で処理した尿プールの重量オスモル濃度を計測した。尿プールは分析の前に５日間及び７日間それぞれ室温で保存した。
透過性担体に入ったイオン交換樹脂で処理した尿プールをＳＤＡで５日及び７日後テストした。各時点で４ｍｌの処理尿プールを２０００ｇで３０分間分離した。得られた上清をデカントし、トラコーマクラミジア／淋菌試料希釈液を各試験管に２ｍづつペレットに加えた。ペレットを次に５秒間ボルテックスさせて、再懸濁させた。１１０℃の加熱ブロックで３０分間試験管を加熱した後、試料を全て増幅させて、結果を例２と同様にして得た。
【００９１】
結果
結果は、重量オスモル濃度記録及びトラコーマクラミジア及び淋菌面積として表に示した。
【００９２】
【表１３】
【００９３】
【表１４】
【００９４】
【表１５】
【００９５】
考察
フリーのイオン交換樹脂及び透過性担体に入ったイオン交換樹脂で２時間、５日及び７日処理した後、測定した重量オスモル濃度によると、非処理の尿から重量オスモル濃度はかなり連続した減少を示している。この時間枠では（２時間対５日：ｐ値＝０．１７；２時間対７日：ｐ値＝０．１８）統計的な違いはみられなかった。このことは、イオン交換樹脂が期間中試料に作用し、標的核酸の安定化が起こっていると考えられる。
透過性担体にいれたイオン交換樹脂で２時間、５日間、７日間処理した尿プールから抽出したトラコーマクラミジア及び淋菌の核酸の増幅及び検出を比較したところ、経時的変化による信号の著しい統計的減少は見られなかった。例４では、２４時間以上室温で保存した尿試料では淋菌は不安定であった。ここでは、透過性担体にいれたイオン交換樹脂は７日までは生物体の安定化をもたらし、生物体核酸の次の鎖置換増幅よるテストを可能にした。
本発明をある程度特定して述べたが、同業者にとって明らかな変更は、本発明の範囲から逸脱しない限りしてもかまわない。本発明の種々の特徴は次のクレームに述べる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、試料をイオン交換樹脂に暴露するためのキット又は手段の正面図である。
【図２】図２は、図1のキット又は手段の断面側面図である。
【発明の属する技術分野】
本発明の分野は、広く核酸のハイブリダイゼーション及び／又は核酸の増幅に関するものである。更に詳しく述べると、本発明は、核酸のハイブリダイゼーション及び／又は核酸の増幅作業を妨害する試料中の物質を減らすことに関するものである。このような作業としては、例えば、標的核酸の存在及び／又は量を調べるための核酸プローブハイブリダイゼーション、核酸増幅法のための核酸プライマーハイブリダイゼーション、核酸伸長、ニッキング及び／又は開裂を含む酵素活性が挙げられる。本発明は更に、蛍光検出分析における感度を増加させるための、試料からの蛍光化合物の除去に関する。更に、本発明は室温での保存時間の増加を可能にする試料の安定化に関する。また、生物体の濃縮にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
鎖置換増幅（strand displacementamplification; ＳＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（polymelase chain reaction;ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ligase chain reaction;ＬＣＲ）、核酸配列ベースでの増幅（nucleic acid sequence based amplification;ＮＡＳＢＡ）、転写介在増幅（transcription mediated amplification; ＴＭＡ）等の核酸増幅方法は、試料中には余り多くのコピーが存在しない、目的とする特定の核酸配列（標的配列）の多数のコピーを作成するのに用いられる。しかし、このような試料に通常存在する数多くの物質は、核酸の増幅プロセスを妨害する。同様にこのような物質は、標的核酸の検出のために用いられる直接核酸プローブハイブリダイゼーション反応を妨害したり、阻害したりすることがある。
【０００３】
核酸の増幅を阻害する物質の例として、血液試料に通常見られ、ＰＣＲを阻害するヘム及びヘマチン由来のポルフィリン化合物が挙げられる（Stockton Press社、Henry A. Erlich 編、1989年出版、PCR technology、33〜34ページ）。これらの阻害物質の量を減らすために、これまで浸透圧性の溶解や核及び細胞の破片のペレット化を利用する方法が使われてきた。
【０００４】
唾液の試料がＰＣＲ阻害物質を含有していることも報告されている。Ochert他、PCR Methods and Applications、3, 365-368(1994)。阻害物質は同定されていないが、この唾液試料に広汎電磁波をかけるか、又は沸騰させると、ＰＣＲ阻害物は、全体的に除去されることが判明した。
【０００５】
Frickhofen及びYoungは、J. Virol. Methods, 35, 65-72 (1991)で、血清試料を７０℃で４５秒間加熱すると、ウイルスの核酸配列のＰＣＲ増幅を改善することができると報告している。この改善は、ＰＣＲ法を阻害すると考えられているアプロチニン、ロイペプチンＰＭＳＦ及びペプスタチン等の血清酵素が熱によって不活性化されるためである理論付けられている。
また、ウイルスの核酸配列の増幅を行う前に、ＰＣＲ阻害物質を血清から除去するための方法が、Zeldis他、J. Clin. Invest., 84, 1503-1508 (1989)に示されている。これは、ウイルスを抗体被覆微粒子に吸着させ、この微粒子を洗浄し、次にＰＣＲを阻害すると思われる残りのタンパク質をプロテイナーゼＫで破壊する方法である。
【０００６】
ＰＣＲにより羊水、胎児及び新生児の血清、脳脊髄液の梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)を検出する際、ＰＣＲ阻害化合物を除去するために４つの異なった方法が試みられた。Grimprel他, J. Clin. Microbiol., 29, 1711-1718(1991)。要約すると、ＰＣＲ阻害化合物の除去のための４つの方法は次の通りである。すなわち、（１）試料を入れた試験管を熱湯浴に１０分間置き、氷冷し、遠心分離するといった煮沸方法。（２）試料を滅菌燐酸塩緩衝食塩水に加え、一連の遠心操作を行い次に得られたペレットを再懸濁して１０分間煮沸し、氷冷するといった低スピン分離方法。（３）試料を１ＭのＮａＣｌ、１ＮのＮａＯＨ及び０．１％のＳＤＳ中で１．５分間煮沸し、次に０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和し、フェノール及びクロロフォルム−イソアミルアルコールで抽出し、イロプロピルアルコールで沈殿させるといったアルカリ溶解抽出法。（４）試料を（２）で述べた低スピン分離に付し、１０分間煮沸し、次にフェノール−クロロフォルムで一回抽出して、冷無水エタノールで沈殿させるといったスピン抽出法である。著者は、用いた試料の種類によりこれらの方法の成功度が異なると報告している。
【０００７】
便を試料として用いた場合、逆転写酵素−ＰＣＲ法を阻害する可能性のある微粒子及び溶解物質のかなりの量が、ポリエチレングリコールで沈殿させることにより除去されることがわかった。 Jiang他、J. Clin. Microbiol., 30, 2529-2534(1992)。沈殿後、フェノール−クロロフォルム抽出に続いて、高塩濃度で陽イオン洗浄剤、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を用いて抽出を行った。
【０００８】
上記の方法とは別に、便の試料からＰＣＲ阻害物質を除去する方法が Wilde他、J. Clin. Microbiol., 18, 1300-1307(1990)により報告されている。ＰＣＲにより便の試料からロタウイルスの核酸を検出する前に、一連の迅速な洗浄及び溶出工程においてロタウイルスの精製を行うためにクロマトグラフィーのセルロース繊維粉末（ＣＦ１１粉末）を利用する工程を抽出工程に加えた方法である。
【０００９】
ＰＣＲを用いて尿中のサイトメガロウイルス（cytomegalocirus;ＣＭＶ）を検出する研究を行った際、尿素はＰＣＲを阻害するものであることがわかった。Khan他、J. Clin. Pathol., 44, 360-365 (1991)。この文献では、尿中の尿素のＰＣＲ阻害作用は透析又は超遠心分離等の方法により効果的に除去されることが報告されている。
【００１０】
ＣＭＶの核酸を検出する前に尿中のＰＣＲ阻害物質を除去するもう一つの方法がBuffone 他、Clin. Chem., 37, 1945-1949(1991)に報告されている。この方法はＣＭＶ生物体から核酸を放出した後に行われ、増幅用の核酸を回収する前にタンパク質と他の物質を選択的に溶出させることができるように細かいガラスビーズを用いて核酸を吸着させるものである。
【００１１】
上述の文献から明らかなように、核酸増幅の阻害に関する文献の多くはＰＣＲに関連したものである。ＰＣＲを阻害するこれらの物質が、臨床試料に共通して見出されるタンパク質性物質、ＥＤＴＡ，ヒトＤＮＡ及び鉄のような他の多くの物質と同様に、ＳＤＡ及び他の核酸増幅方法も阻害することがわかっている。
【００１２】
阻害物質を減らしたり除去したりするこれらの方法の多くは、試料加工方法論に加えてねばならない時間のかかる複雑なステップを含んでいる。更に、これらの方法は、比較的厳しい加工ステップ又は加工条件を用い、更に／又は標的核酸を他の物質から分離する必要があるので、標的核酸配列の一部をロスするという問題を抱えている。非常に少ないオリジナルの標的配列からたくさんの標的配列のコピーを作成する核酸増幅法の能力とは別に、試料中にオリジナルの標的が数多くあればある程増幅効率及び検出能力は改善される。抗酸性杆菌Bacillus（acid fast Bacillus; ＡＦＢ）、スメア陰性ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の試料など、特に検出の難しい試料の加工の場合、検出能力が大きいことが非常に重要である。
【００１３】
分子診断法に付す試料に共通しているのは、長時間にわたる試料の安定性の問題である。試料が、ある場所で採取され、例えば分子診断加工用の中央研究所のような他の場所に移される場合、試料の安定性がより重要となる。
尿の試料及び膣、頚部スワブにおいて、多くの臨床的に関連のある生物体は室温で２４時間以上にわたって完全な状態を保っていない。中央研究所への移送の間及び／又は貯蔵の間このような試料を冷凍することが必要となってくる。尿の試料及びスワブにより通常テストされ、室温で保存される試料の中で非常に不安定であることが知られている分析物は、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）である。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
核酸のハイブリダイゼーション及び／又は核酸の増幅を阻害する物質の存在に関連した問題を克服し、標的核酸配列の検出を改良するために、本発明は、試料中の細胞が溶解する前に、試料をイオン交換樹脂にさらして試料中の阻害物質の量を減らす方法を提供する。
本発明においては、あらゆる種類のイオン交換樹脂（陽イオン、陰イオン及び混合床）が有用である。試料をイオン交換樹脂にさらした後、この樹脂を試料から分離してもよい。
【００１５】
乾燥したイオン交換樹脂を用いることで、標的生物体を濃縮するというメリットが得られる。試料をイオン交換樹脂にさらすことはまた、室温での保存又は輸送に対して試料を安定化し、次に行う蛍光検出法を妨害する可能性のある蛍光物質の結合及び試料からの分離を可能にする。更に、イオン交換樹脂は、使用しやすいキット状にパッケージすることもできる。
本発明の種々の目的、利点及び新規の特徴は、次の添付の図面を参照して下記の詳細な説明を読むことにより容易に理解されるであろう。
【００１６】
【発明の実施の形態】
上述のように、本発明は、核酸を有する細胞を含んだ試料中に含まれている核酸のハイブリダイゼーション及び／又は増幅作業を妨害する又は阻害する物質の量を減らす方法に関する。この方法において、核酸を含有する細胞が試料中に残るように、試料中の細胞が溶解する前に、試料をイオン交換樹脂にさらす。その後、任意に、この細胞をイオン交換樹脂から分離してもよい。
【００１７】
上述の従来の技術の項で述べたことから明らかなように、阻害物質を除去するために行われた他の研究者による幾つかの方法は非常に複雑であったので、本発明の方法の結果は特に予期しないものであった。発明者の知るところでは、普通、核酸のハイブリダイゼーション及び／又は核酸の増幅反応に付される試料の溶解が起きる前にはイオン交換樹脂は用いることはない。
【００１８】
本発明の方法の利点の一つは、細胞から得られる標的核酸の、試料中の最終濃度を上げることができる点である。核酸増幅法においては、非常に少ない数の最初の標的から多くの標的配列のコピー（アンプリコン）を作ることができるが、できるだけ最初の標的数が多い状態で増幅法を開始できる方が有利である。濃縮は乾燥マトリックスの膨潤の結果おこる。試料中の液体が乾燥樹脂に取り込まれるか又は吸収されるが、一方細胞は樹脂中に入り込むには大きすぎる。その結果一定の数の細胞と結合している液体試料の量が減少し、それによって細胞の濃度は増加する。例えば乾燥樹脂がアンバーライトTMＭＢ−１５０（ＡｍｂｅｒｌｉｔｅTMＭＢ−１５０）の場合、その乾燥重量の５０％まで吸収する。他の方法においては、核酸ハイブリダイゼーション阻害物質の除去を細胞溶解後に行っているが、これらの方法は非常に非効率的である、なぜならそれらの方法では溶解産物中の物質から核酸を分離することになり、もとからある標的が多く回収されないからである。本発明の方法では、細胞の溶解前に阻害物質を除去するので、その後の分離は不必要で標的をより収率よく得ることができる。
【００１９】
本発明の方法に用いてられる試料としては、例えば、痰、血液、尿、脳脊髄液（cerebrospinal fluid;「ＣＳＦ」）試料、膣及び頚部のスワブなどの実質的にはあらゆるヒト及び動物の臨床試料、水、空気、土等の環境試料及び食品試料が挙げられる。本発明の方法に用いられる試料は、増幅法開始のための直接プローブハイブリダイゼーション、プライマーハイブリダイゼーション等のハイブリダイゼーション法の対象となる標的核酸配列を有する細胞を含んでいると疑われるものである。
【００２０】
上述のような試料に通常見られる、核酸ハイブリダイゼーション法を阻害する物質としては、タンパク質性物質、非標的ＤＮＡ，塩、尿素及びタンパク質分解性酵素等が挙げられる。従来技術の項で既に述べたように、これらの物質は例えば、ＳＤＡ，ＰＣＲ，ＬＣＲ，ＮＡＳＢＡ，ＴＭＡ等の核酸増幅法を阻害するものとして知られている。
本発明の方法は試料をイオン交換樹脂にさらすことを含む。この暴露を行うのは、標的核酸を放出させるための細胞の溶解前であればいつでもよい。
【００２１】
本発明の方法においては多くのイオン交換樹脂が有用である。このような有用なイオン交換樹脂としては Sigma-Aldrich社のいわゆるアンバーライトTM樹脂または同様の樹脂が挙げられる。これらイオン交換樹脂は通常、荷電官能基が結合した或いは荷電官能基を含有するポリスチレン等の重合体である。この重合体がタンパク質や酵素等の阻害物質と疎水的に結合し、荷電官能基が塩、細胞外核酸、タンパク質等の荷電阻害物質と結合する。本発明の方法において有用な他の樹脂は、例えば樹脂にさらした後に、どの程度阻害物質が除去されているか及び、標的生物体の完全性及び／又は生菌数が維持されているか等の樹脂の最適特性に対する通常のスクリーニング分析を行うことによって、合理的に予想される成功をもとに同業者によって確認されるであろう。
【００２２】
即ち、標的生物体を含有する試料を一定期間イオン交換樹脂で処理する。この試料を目的のハイブリダイゼーション／増幅試験に付す。樹脂にさらした後のハイブリダイゼーション及び／又は増幅効率がかなり増加することによって、樹脂の効能がわかるであろう。
代わりに、又は追加の操作として、試料を、特定の試料が室温で安定していると知られている時間以上にイオン交換樹脂にさらす。例えば、淋菌の尿の試料は通常室温でほんの約２４時間しか安定ではない。さらした後、特定の分析物（例えば、淋菌）がまだ生存しているかどうか調べるために、平板培養する。室温における分析物の完全性及び／又は室温での生菌数の維持という点において、樹脂処理しない場合より優れている場合、これらのイオン交換樹脂は本発明の方法において有用であろう。
【００２３】
本発明で用いられるイオン交換樹脂の濃度及び量は、本発明の方法に付される試料の種類による。通常、本発明の方法において用いられるイオン交換樹脂の量は、試料との質量比で約１：１から約１：２０の範囲であり、好ましくは約１：５から１：１５である。大部分の試料で約１：１０の比率が適当である。好適な樹脂の選択において述べたスクリーニング法をもちいることにより、同業者は試料量に対する樹脂の比率を変えて本発明と同様の結果を得ることができるであろう。
【００２４】
樹脂は試料に対して、いろいろな形状で提供される。本発明の方法において用いられる樹脂の好適な形状としては、乾燥粒状、圧縮したタブレット状、樹脂を含有する溶解性カプセル、樹脂を含有するサック等の透過性担体(permeable vehicle)、Whatman社のイオン交換セルロース紙グレードＰ８１及びSchleicher&Schuell社のＳ＆Ｓイオン交換膜等のイオン交換紙が挙げられる。これら形状の樹脂は単独で、又は他の成分とともにキットとして包装され、次の目的でもちいられる。（ａ）核酸のハイブリダイゼーション及び／又は核酸の増幅を妨害する物質を試料から除去する、（ｂ）室温での保存時間を長くするために試料を安定化する、（ｃ）蛍光検出分析法での感度を増加するために試料から蛍光化合物の除去する、及び／又は、（ｄ）試料中の生物体を濃縮する。
【００２５】
樹脂を含有する透過性担体は、樹脂と試料を接触させるための手段として好ましい。このような透過性担体はティーバッグのように働く。この担体により液体状の試料が樹脂上を流れることが可能となり、遠心分離や濾過等のステップをあらためて設けなくとも、試料から樹脂を容易に分離させることが可能となる。この透過性担体は、通常、イオン交換樹脂を含有するメッシュである。
【００２６】
このような透過性担体の一態様を図１及び２に示す。図１は、一枚のメッシュシート（１４）と、このメッシュをヒートシールする際にできたボーダー或いはこのメッシュ以外の接着性又はシール性の材料からなる場合もあるボーダー（１６）で構成される担体（１２）の正面図である。図１で示したように、この一枚のシートは担体（１２）を作るために折り曲げられている。
【００２７】
製造の際、このシートは折り曲げてから二辺をシールする。次に適量のイオン交換樹脂（１８）（図２参照）を担体の上部開口部から加える。イオン交換樹脂を加えた後、担体の上部にひだを作って、シールする。これにより、図２の断面側面図に示したような担体ができる。
このような担体のメッシュ（１４）として好適な材料は、ポリプロピレン及びナイロンであるが、これらに限定されない。接着性又はシール性のボーダー（１６）としても同様の材料が好適である。
【００２８】
樹脂を試料と接触させると、核酸のハイブリダイゼーション及び／又は増幅を阻害する物質は、この樹脂に付着する。イオン交換樹脂と阻害物質の結合は、基本的には樹脂の陽イオンと陰イオンが阻害物質と交換することによる。無害の陽イオンと陰イオンが試料に放出され、阻害物質が樹脂に結合する。これら阻害物質は、核酸のハイブリダイゼーション及び／又は増幅作業をはじめる前に試料から除去される。
【００２９】
樹脂と試料を接触させる時間は、試料の種類、試料に対する樹脂の比率、試料中の阻害物質の濃度及び種類によって異なる。樹脂は試料と接触すると直ちに活性を示すが、本発明の方法における樹脂と試料の接触時間は約１５分から約４日間である。
この接触後、任意に、樹脂と試料を分離してもよい。上述のように、この分離はいろいろな方法で行うことができ、例えば、遠心分離、濾過等の他、もし透過性担体又はイオン交換紙を用いているならば、マトリックス（つまり透過性担体又はイオン交換紙）を試料から物理的に除去するか又は処理した試料を単にピペット操作により除去することもできる。
【００３０】
ハイブリダイゼーション又は増幅に用いる試料中の標的核酸を調製するために現在さまざまな方法が用いられている。例えば、マイコバクテリアの核酸配列を増幅するために加工される痰の試料は、通常、ＮＡＬＣ／ＮａＯＨ法に付される。同様に、他の臨床試料は他の良く知られた標準的な方法に付され、例えば血液、尿等の大量の試料の場合は遠心分離される。本発明の方法はこれらの標準的な方法を行う前に、或いはその方法の一部として、又はその後に用いられる。
【００３１】
イオン交換樹脂と試料との接触は、核酸のハイブリダイゼーション及び／又は増幅を阻害する物質を除去するための方法に用いられるだけでなく、これによって試料が安定化し、室温での輸送も可能となり、また、試料の濃縮にも利用される。このような輸送のための安定化に役立つ樹脂の量は、核酸のハイブリダイゼーション及び／又は増幅阻害物質の除去と大体同じである。輸送のための安定化、試料の濃縮、蛍光物質の除去そして核酸阻害物質の除去、これら全てはイオン交換樹脂を試料と接触させることにより起こるものである。このように、本発明は輸送等の目的のために室温での試料の安定化をはかり、同時に、試料を濃縮して、蛍光化合物を核酸のハイブリダイゼーション及び／又は増幅阻害物質と結合させて次に試料から除去することにより、分子診断分析のために試料の加工又は準備をはじめる人にとって非常に有効な方法を提供するものである。
【００３２】
次の実施例は、本明細書で述べた発明の特定の態様を示したものである。同業者には明らかであろうが、本発明の範囲内で考えられた種々の変更及び修正は可能である。
【００３３】
【実施例】
＜例１＞
混合床イオン交換樹脂は、尿及びスワブ試料から既知の増幅阻止物質及びバックグラウンド蛍光化合物を除去する
本例の目的は、混合床イオン交換樹脂（アンバーライトTMＭＢ−１５０）が尿の試料及びスワブ試料から非特異的ＤＮＡを除去するかどうか調べることである。更に蛍光検知システムのバックグラウンドを増加し、システムの感度を弱める可能性のある蛍光化合物が除去されるかどうか調べるために、処理及び非処理試料の蛍光計測を行った。
【００３４】
材料
試料加工試薬
Ｂ−ＤＥ−Ｚスワブで得た膣スワブ試料
尿試料
試料緩衝液
アンバーライトTMＭＢ−１５０（シグマ社）
ＢＤポリプロピレン分配管
ｓｓＤＮＡ分析試薬
オリグリーン染料（分子プローブ）
ＴＥ緩衝液
【００３５】
手順
４ｍｌの試料緩衝液に８個の膣スワブ試料を絞り出し、得られた溶液をボルテックスした。アンバーライトTMＭＢ−１５０を０．４グラム含有する２本のＢＤ分配管に、試料を１ｍｌづつ小分けした。ＢＤ分配管中の溶液をボルテックスし、室温で３０分間保持した。３０分後、得られた溶液をセパレート管に移した。アンバーライトＭＢ−１５０を０．４グラム含有するＢＤ分配管二本に、１ｍｌの尿を分けた。得られた溶液をボルテックスして、室温で３０分間保持した。３０分後、得られた溶液をボルテックスし、次にセパレート管に移した。
【００３６】
ヒト胎盤ＤＮＡの標準液１０００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．２５ｎｇ／ｍｌ及び０ｎｇ／ｍｌを、ＴＥ緩衝液で調製した。アンバーライトTMＭＢ−１５０で処理した試料及び非処理の尿及びスワブ試料を１：１０及び１：１００にＴＥ緩衝液で希釈した。試料を５分間熱湯浴に置き、ＤＮＡ鎖を変性させた。製造者の説明書に従ってOligreen染料をＴＥで１：２００に希釈した。等量の試料及び希釈Oligreen染料をプラスチックキュベットで合わせ、蛍光励起波長４８０及び放出波長５２０を用いて、試料を調べた。非処理の試料のバックグラウンド蛍光測定値を４８０励起及び５２０放出波長を用いて測定し、得られたバックグラウンドをｓｓＤＮＡ測定値からひいた。非処理の試料と比較するために同様に、処理試料でバックグラウンド蛍光測定を同様に行い、バックグラウンド蛍光物質が除去されているかどうか調べた。
結果
結果は、標準曲線の直線部となるｓｓＤＮＡ値を用いて次の表に示した。
【００３７】
【表１】
考察
この例のデータによると、混合床イオン交換樹脂はスワブ試料、尿試料双方からバックグラウンド蛍光化合物を除去している。この結果は蛍光分析検出システムにおいては、バックグラウンド蛍光値が高いと感度の要求に強い影響を及ぼすので、この結果は有利である。
更に、これらのデータは、混合床イオン交換樹脂は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）の既知の増幅阻害物質である非標的ＤＮＡを除去することを示している。
【００３９】
＜例２＞
直接尿加工法
本発明の目的は、本発明が尿加工において、従来の遠心分離ステップ及び洗浄ステップを用いなくてもよいかどうか調べるために行われた。
【００４０】
材料
試料加工試薬
アンバーライトTMＭＢ−１５０（シグマ社）
消泡剤
スペクトラ／メッシュR ポリプロピレンフィルター、７５μｍ
尿試料
２×クラミジア試料緩衝液
１×試料加工緩衝液
クラミジア標品
【００４１】
分析試薬
［オリゴヌクレオチド装置（Oligonukuleotide Device;ＯＤ）］乾燥した各ウェルに、ＳＤＡ増幅プライマー、ＳＤＡバンパープライマー、ＳＤＡ蛍光検出プローブ、ｄＵＴＰ及び緩衝液を入れたマイクロタイタープレート、
［酵素装置（Enzyme Device;ＥＮＤ）］乾燥した各ウェルに、制限酵素（ＢｓｏＢｌ）、ポリメラーゼ（Ｂｓｔ）、ｄＣｓＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及び緩衝液を入れたマイクロタイタープレート（オリゴヌクレオチド装置及び酵素装置については、同時継続中の米国特許出願番号（Becton Dickinson書類番号P-4025）にもっと完全に記されており、参照することによって、本明細書の一部とする）
【００４２】
手順
４つの尿試料に１０００／ｍｌクラミジア因子を加えた。１．２５％の消泡剤を１０μｌ含有する４本のＢＤ分配管に、０．３ｇのアンバーライトTMＭＢ−１５０ を入れた。アンバーライトTMＭＢ−１５０を含有するＢＤ分配管に各尿試料を１ｍｌ加え、試料を室温で３０分間保持した。得られた溶液を７５ｕｍプロピレンメッシュを通して試験管に入れた。等量の試料と２×濃縮試料緩衝液を試料を入れた試験管に入れ、この試験管を３０分間、１０５℃の加熱ブロックにおいた。
尿試料を４ｍｌ試験管にとり、この試験管を３０分間２０００ｇで遠心分離した。上清をデカントし、試料緩衝液を３ｍｌ試験管に加えた。各試験管を３０分間、１０５℃の加熱ブロックにおいた。
【００４３】
試験管の試料を少量（１５０μｌまで）ＯＤの各ウェルにいれ、このウェルをカバーして、室温で２０分間おいた。カバーをとり、つぎにＥＮＤを５２℃で１０分間あらかじめ暖めておきながら、７５℃で１０分間インキュベートした。
１０分のインキュベーションの後、ＯＤ各ウエルから１００μｌづつＥＮＤの該当するウェルに（ピペットで）移した。ＥＮＤを接着性カバーで密閉し、１９９７年９月１５日出願の同時継続中の米国特許出願番号（Becton Dickinson書類番号P-4067、本引例は、引用することにより具体的に本明細書の一部とする）で述べた蛍光測定装置にいれた（これ以外の標準マイクロタイタープレート蛍光測定装置も使用できる）。
ＥＮＤのウェルからの蛍光信号を６０分間モニターした。密閉したＥＮＤは研究室の環境がアンプリコンで汚染されないように密閉バッグのなかに廃棄した。
【００４４】
結果
結果は、面積として下記の表に示した。面積は、その時間の蛍光信号の曲線の積分である。
【００４５】
【表２】
考察
この表のデータによると、本発明の方法を用いることによって、尿の試料加工から遠心分離ステップ及び洗浄ステップを省くことができる。
【００４７】
＜例３＞
淋菌を加えた陰性臨床試料を用いた増幅阻害物質除去のための混合床イオン交換樹脂
本例の目的は、混合床イオン交換樹脂（アンバーライトTMＭＢ−１５０）が、対照と比較して、増幅阻害物質を除去し、特定の標的信号の回収を改善したかどうか調べることにある。
【００４８】
材料
試料加工試薬
尿試料
淋菌標品
試料緩衝液
アンバーライトTMＭＢ−１５０（シグマ社）
増幅試薬
［ＯＤ］（例２で述べたものと同様のもので、クラミジアより淋菌に特異性のあるＳＤＡ増幅プライマー、ＳＤＡバンパープライマー、ＳＤＡ蛍光検知プローブ）
［ＥＮＤ］
【００４９】
手順
３０個の臨床尿試料に、１０００／ｍｌの淋菌粒子形成単位を加えた。０．１２ｇのアンバーライトＭＢ−１５０を含む１５ｍｌのコニカルチューブに各試料を６ｍｌ移し、ボルテックスして、室温で１６時間保存した。対照として、直接遠心分離管に各尿試料を４ｍｌを入れてこの試料を４℃で１６時間保存した。
室温で１６時間保存した後、アンバーライトを含有する試料をボルテックスし、得られた液体を４ｍｌ、遠心分離管にいれた。アンバーライトで処理した試料とアンバーライトＭＢ−１５０なしに４℃で保存した試料を３０分間２０００ｇで遠心分離した。得られた上清を各管からデカントし、試料希釈液を各管に３ｍｌ加えた。この管を１０５℃の加熱ブロックに３０分間入れた。
例２と同様にして、得られた試料を増幅し、結果を得た。
【００５０】
結果
３個の増幅／検知複製の平均の面積を用いて結果を次の表に示した。表の最下部の値は全ての試料の平均である。
【００５１】
【表３】
考察
尿の試料を加工する対照の方法と比較して、混合床イオン交換樹脂で尿の試料を処理した場合の方が面積が大きいが（Ｐ値＝２．３６Ｅ−９の等しい変数を用いたＴ試験結果による）、この事は、増幅阻止物質がシステムから除去され、特定の増幅がより効率的に行われることを示している。
【００５３】
＜例４＞
尿中の淋菌の室温安定性を示す比較例
本例の目的は尿中の淋菌の室温での安定性を評価するために行われた。
材料
試料加工試薬
試料希釈液
淋菌ストック
［尿］男性の尿プール
【００５４】
増幅試薬
例３と同様のＯＤ
例３と同様のＥＮＤ
【００５５】
手順
淋菌を健常な男性の尿プールに加え最終反応濃度を各反応ごとに、０、１０及び１００粒子となるようにした。希釈液を２５℃で保存した。各希釈液を４ｍｌづつ試料試験管に移し、０時間、１日、２日及び４日の時点で加工した。試料は全て次のように加工した。２０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清をデカントし、ペレットを２ｍｌの試料希釈液で再度懸濁し、１００℃で３０分間加熱した。試料を増幅し例２と同様にして結果を得た。
結果
結果は次の表に平均面積として示した。
【００５６】
【表４】
考察
淋菌は室温で尿中に1日以上保存すると不安定である。
【００５８】
＜例５＞
室温での淋菌及びトラコーマクラミジアを安定化するための添加物のスクリーニング
本例の目的は、室温に2日間おいた尿中の淋菌及びトラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）を安定化するための添加物をスクリーニングするためである。
【００５９】
材料
試料加工試薬
尿プール
試料緩衝液
ケモスタット試験管（マイクロシュア社）
硼酸／蟻酸塩
ＰｒｏＣｌｉｎ ３００
アンバーライトTMＭＢ−１５０（シグマ社）
増幅試薬
例３と同様の淋菌ＯＤ
例３と同様の淋菌ＥＮＤ
例２と同様のトラコーマクラミジアＯＤ
例２と同様のトラコーマクラミジアＥＮＤ
【００６０】
手順
３個の尿プールに、クラミジア株ＬＧＶ−ＩＩを１ｍｌあたり７５０個加え、これら３個のプールの内２個に淋菌を１ｍｌあたり７５０粒子形成単位加えた。三番目の尿プールは淋菌に対して陽性であったので、添加しなかった。各尿プールを４ｍｌづつ、４本の試験管にそれぞれ移し、０時間、４℃で４０時間、２４℃で４０時間、４℃で９６時間経過後試験管を３０分間２０００ｇで遠心した。上清をデカントし、試料緩衝液を３ｍｌ、各試験管に加えた。試験管を１０５℃で３０分間加熱ブロックに移した。
【００６１】
各プールを１０ｍｌづつ、ケムスタット管に移した。次に材料を一プール２本の試験管に１本当たり４ｍｌづつ入れた。２４℃で０時間及び４０時間経過後、２０００×ｇで３０分間遠心した。上清をデカントし、試料緩衝液を３ｍｌ、各試験管に加えた。試験管を１０５℃で３０分間加熱ブロックに移した。
各プールから５ｍｌづつ１プールにつき２本の硼酸／蟻酸塩の試験管に移した。各硼酸／蟻酸塩の試験管から４ｍｌを試験管に移した。２４℃で０時間及び４０時間後、試験管を２０００ｇで３０分間遠心した。上清をデカントし、試料緩衝液を３ｍｌ各試験管に加えた。試験管を１０５℃で３０分間加熱ブロックに移した。
【００６２】
各プールから９ｍｌを２．７μｌのＰｒｏＣｌｉｎ３００を含有する１５ｍｌの遠心分離用試験管に移し、各プールから４ｍｌを２本の試験管に移した。２４℃で０時間及び４０時間後、試験管を２０００ｇで３０分間した。得られた上清をデカントし、試料緩衝液を３ｍｌ各試験管に加えた。試験管を１０５℃で３０分間加熱ブロックに移した。
【００６３】
０．７２グラムのアンバーライトTMＭＢ−１５０を含有する二本の１５ｍｌの遠心分離用試験管に各プールから５．５ｍｌづつ移した。試料をアンバーライトに加えてから１０分後、得られた溶液４ｍｌを試験管に移した。各プールを含有する残りの１５ｍｌの遠心分離用試験管を２４℃で４０時間保存した。得られた溶液を４ｍｌづつ試験管に移し、試験管を２０００ｇで３０分間遠心した。得られた上清をデカントし、試料緩衝液を３ｍｌ各試験管に加えた。試験管を１０５℃で３０分間加熱ブロックにおいた。
試料を増幅し、例２と同様の方法で結果を得た。
【００６４】
結果
結果は３個の増幅複製の平均として、下の表に示した。
【００６５】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
考察
０．１３ｇ／ｍｌの混合床イオン交換樹脂（アンバーライトTMＭＢ−１５０）を加えると、既知の添加量の淋菌を含むプール１及び２で室温で４０時間まで尿中安定性を示す。最初から淋菌に非常に陽性であったプール３は全ての保存条件で陽性であり、そのことは、淋菌の濃度が非常に高いと、特異的な信号が維持されることを示している。ケムスタット、硼酸／蟻酸塩、ＰｒｏＣｌｉｎを添加した場合は室温での淋菌の安定性は全く或いは殆どなかった。
アンバーライトTMＭＢ−１５０は両方の阻害物質除去に有効で、クラミジアＬＧＶ−ＩＩの安定にもすぐれていた。
【００７０】
＜例６＞
尿を混合床イオン交換樹脂で処理することにより、菌を添加した陰性臨床試料を４日間安定にする。
本例の目的は、各臨床試料に添加した淋菌及びトラコーマクラミジアが混合床イオン交換樹脂（アンバーライト）により室温で４日間安定化することができるかどうか調べることにあった。
【００７１】
材料
試料加工試薬
陰性尿試料
試料緩衝液
アンバーライトＭＢ−１５０（シグマ社）
淋菌標品
トラコーマクラミジア標品
【００７２】
増幅試薬
例３と同様の淋菌ＯＤ
例３と同様の淋菌ＥＮＤ
例２と同様のトラコーマクラミジアＯＤ
例２と同様のトラコーマクラミジアＥＮＤ
【００７３】
手順
３０個の尿試料に淋菌を８００／ｍｌ、トラコーマクラミジアを８００／ｍｌを加えた。更に、各試料から尿７ｍｌを０．４７ｇのアンバーライトＭＢ−１５０を含有する１５ｍｌのコニカルチューブに移し、各試料からの尿７ｍｌを１．４ｇのアンバーライトＭ−１５０を含有する１５ｍｌのコニカルチューブに移した。これらの試験管をすぐにボルテックスした。０．４７ｇのアンバーライトＭ−１５０を含有する溶液を試験管１本あたり４ｍｌ遠心用試験管に移した。試験管を２０００ｇで３０分間遠心した。得られた上清を試験管からデカントし、試料希釈液を各試験管に２ｍｌづついれた。試験管を１１０℃の加熱ブロックに３０分間おいた。試験管を−２０℃に４日間保存した。
１．４ｇのアンバーライトＭＢ−１５０を含有する溶液は室温で４日間保存し、次にこの溶液を遠心分離用試験管に１本当たり４ｍｌ移した。試験管を２０００ｇで３０分間遠心した。得られた上清を試験管からデカントし、試料希釈液を各試験管に２ｍｌづつ入れた。試験管を１１０℃の加熱ブロックに３０分間おいた。
得られた試料を増幅し、例２と同様の方法で結果を得た。
【００７４】
結果
結果は次の表に示した。
【００７５】
【表９】
考察
混合床イオン交換樹脂（アンバーライトＭＢ−１５０）にさらすことにより、各臨床尿試料の標的生物体の完全性が室温で４日間保持される。
【００７７】
＜例７＞
フリーのイオン交換樹脂と透過担体に担持させたイオン交換樹脂との比較
本例の目的は、イオン交換樹脂を、自由に試料に接触させる場合と透過性担体に担持させた場合とで、試料からの重量オスモル濃度の減少において更に、試料から抽出した核酸の増幅において、等しい機能が発揮されるかどうかを調べることである。
【００７８】
材料
試料加工試薬
スペクトラR／メッシュポリプロピレンフィルター７５μＭ
アメリカンインターナショナル電気加熱シーラー
プレシジョンシステム社 ＯｓｍｅｔｔｅＡ重量オスモル濃度測定装置
アンバーライトＭ−１５０（シグマ社）
ＶＷＲ ４ｏｚ． 標品収集容器
１５ｍｌのファルコンコニカルチューブ
トラコーマクラミジア／淋菌試料希釈液
１０個の陰性尿プール、それぞれ別の臨床試料からなる。
【００７９】
増幅及び分析試薬
例２と同様のトラコーマクラミジアＯＤ
例２と同様のトラコーマクラミジアＥＮＤ
例３と同様の淋菌ＯＤ
例３と同様の淋菌ＥＮＤ
【００８０】
手順
実験にあたってアンバーライトＭＢ−１５０イオン交換樹脂を蒸留水で２回洗浄し真空乾燥した。次にこの樹脂を平らな表面に広げて、一晩３７℃のインキュベーターで乾燥させた。乾燥した樹脂を２．４ｇとり、８角形のヒートシールしたポリプロピレンメッシュポーチにいれた。イオン交換樹脂への試料の暴露を最大限になるようにして１０個のポーチを作った。標品収集容器の底にこのポーチを平らにおけるようにサイズを小さくするなど変更を加えてもよいし、また試料を吸収することによる樹脂の膨張も考慮にいれる。ポーチをぞれぞれ１０個の標品収集容器に入れた。乾燥した樹脂を０．８４ｇづつ２０個のファルコン１５ｍｌコニカルチューブにおいた。
【００８１】
３５ｍｌの尿のプールを１０個作成した。各尿のプールに１ｍｌあたり淋菌８００粒子、トラコーマクラミジア基本小体を８００個加えた。無処理の尿プールの重量オスモル濃度基準を得た。次にイオン交換樹脂を透過性担体にいれて置いた標品収集容器に各尿プール２０ｍｌを入れた。尿プールの残りの１４ｍｌをフリーのイオン交換樹脂を含有する２本のファルコン１５ｍｌコニカルチューブにわけた。管のうちの１本をそのままにして、もう１本を７ｍｌの尿プールをコニカルチューブにわける際ボルテックスした。
イオン交換樹脂で２時間処理した後、処理尿プールの重量オスモル濃度を測定した。各処理尿４ｍｌを次に２０００ｇで３０分間遠心した。得られた上清をデカントし、トラコーマクラミジア／淋菌試料希釈液を試験管１本あたり２ｍｌ各ペレットに加えた。ペレットを次に５秒間ボルテックスし、再度懸濁した。３０分間１１０℃の加熱ブロックで試験管を加熱した後、試料を全て増幅し、結果を例２と同様にして得た。
【００８２】
結果
重量オスモル濃度の測定及びトラコーマクラミジア及び淋菌の面積として結果を次の表に示した。
【００８３】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
考察
イオン交換樹脂、フリーに試料と接触できる場合も、透過性担体中にある場合も、重量オスモル濃度の減少及び増幅という点では等しい機能を示している。
無処理のプールとポーチにいれた樹脂（ｐ値＝４．４２Ｅ−０．５）で処理した同じプールでは重量オスモル濃度にかなりの違いが観察された。しかし、ポーチに入れた樹脂と、インキュベーション前にボルテックスしたフリー樹脂（ｐ値＝０．０６、凍結試料故に変数は同じではない場合）又はインキュベーション前にボルテックスしていないフリー樹脂（ｐ値＝０．２５）との間にはたいした違いはない。更に、凍結樹脂をポーチに入れた樹脂とインキュベーション前にボルテックスしたフリーの樹脂（ｐ値＝０．１９、等しい変数とした場合）との比較から除いた場合、違いはもっと少ない。試料から塩を機能的に除去するための最低条件は単に物理的な接触である。
【００８７】
トラコーマクラミジアの面積単位において、ポーチに入れた樹脂対インキュベーション前にボルテックスしたフリーの樹脂（ｐ値＝０．２５）又はインキュベーション前にボルテックスしなかったフリーの樹脂（ｐ値＝０．４６）との間に大きな違いはみられない。淋菌の面積単位においても同様のことが観察された。ポーチに入れた樹脂対インキュベーション前にボルテックスさせたフリー樹脂（ｐ値＝０．７３）又はインキュベーション前にボルテックスしなかったフリーの樹脂（ｐ値＝０．３９）との間に統計的な違いは見つからなかった。
【００８８】
＜例８＞
分子診断法によるテストのための透過性担体に入れたイオン交換樹脂による試料の安定化
本例の目的は、標的生物体の核酸の鎖置換増幅（ＳＤＡ）による次のテストを行う際に、この生物体が透過性担体に入れたイオン交換樹脂によって安定化されているかどうかについて調べることであった。
【００８９】
材料
試料加工試薬
例７と同じ
増幅及び分析試薬
例７と同じ
【００９０】
手順
イオン交換樹脂での処理日数を５日及び７日にした以外は例７と同様にして、フリーイオン交換樹脂で処理した尿プール及び透過性担体に入ったイオン交換樹脂で処理した尿プールの重量オスモル濃度を計測した。尿プールは分析の前に５日間及び７日間それぞれ室温で保存した。
透過性担体に入ったイオン交換樹脂で処理した尿プールをＳＤＡで５日及び７日後テストした。各時点で４ｍｌの処理尿プールを２０００ｇで３０分間分離した。得られた上清をデカントし、トラコーマクラミジア／淋菌試料希釈液を各試験管に２ｍづつペレットに加えた。ペレットを次に５秒間ボルテックスさせて、再懸濁させた。１１０℃の加熱ブロックで３０分間試験管を加熱した後、試料を全て増幅させて、結果を例２と同様にして得た。
【００９１】
結果
結果は、重量オスモル濃度記録及びトラコーマクラミジア及び淋菌面積として表に示した。
【００９２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
考察
フリーのイオン交換樹脂及び透過性担体に入ったイオン交換樹脂で２時間、５日及び７日処理した後、測定した重量オスモル濃度によると、非処理の尿から重量オスモル濃度はかなり連続した減少を示している。この時間枠では（２時間対５日：ｐ値＝０．１７；２時間対７日：ｐ値＝０．１８）統計的な違いはみられなかった。このことは、イオン交換樹脂が期間中試料に作用し、標的核酸の安定化が起こっていると考えられる。
透過性担体にいれたイオン交換樹脂で２時間、５日間、７日間処理した尿プールから抽出したトラコーマクラミジア及び淋菌の核酸の増幅及び検出を比較したところ、経時的変化による信号の著しい統計的減少は見られなかった。例４では、２４時間以上室温で保存した尿試料では淋菌は不安定であった。ここでは、透過性担体にいれたイオン交換樹脂は７日までは生物体の安定化をもたらし、生物体核酸の次の鎖置換増幅よるテストを可能にした。
本発明をある程度特定して述べたが、同業者にとって明らかな変更は、本発明の範囲から逸脱しない限りしてもかまわない。本発明の種々の特徴は次のクレームに述べる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、試料をイオン交換樹脂に暴露するためのキット又は手段の正面図である。
【図２】図２は、図1のキット又は手段の断面側面図である。
Claims (11)
- 生物体を含有する試料を、試料中の生物体が溶解する前に精製するためのキットであって、試料をさらしたとき前記試料中に存在する核酸ハイブリダイゼーション及び／又は核酸増幅を阻害する物質が付着するのに十分な量の混合床イオン交換樹脂を含んでなり、それによって前記試料中に存在する核酸ハイブリダイゼーション及び／又は核酸増幅を阻害する物質を試料から除去する、試料精製キット。
- 生物体を含有する試料を精製するためのキットであって、試料中の生物を、室温で少なくとも２４時間は損傷をうけない状態及び／又は生存している状態に維持するのに十分な量の混合床イオン交換樹脂を含んでなり、それによって試料を安定化して分子診断法に付すことを可能とする、試料精製キット。
- 生物体を含有する試料を、試料中の生物体が溶解する前に精製するためのキットであって、試料をさらしたとき試料中に存在する蛍光検知信号を阻害する可能性のある蛍光物質が付着するのに十分な量の混合床イオン交換樹脂を含んでなり、それによって前記蛍光物質を試料から除去する、試料精製キット。
- 生物体を含有する試料を精製するためのキットであって、試料をさらしたとき前記試料の重量オスモル濃度を減少させるのに十分な量の混合床イオン交換樹脂を含んでなり、それによって試料中の生物体が濃縮される、試料精製キット。
- 前記混合床イオン交換樹脂が、前記混合床イオン交換樹脂に前記試料をさらした後、前記試料から分離可能であるような形状である請求項１〜４のいずれか一に記載のキット。
- 前記混合床イオン交換樹脂が透過性担体に収められている、請求項１〜４のいずれか一に記載のキット。
- 前記混合床イオン交換樹脂がアンバーライトＴＭＭＢ−１５０である、請求項１〜４のいずれか一に記載のキット。
- 生物体を含有する試料を、試料中の生物体が溶解する前に混合床イオン交換樹脂にさらすステップを含む試料精製方法であって、核酸ハイブリダイゼーション及び／又は核酸増幅を阻害する物質の量を試料から減らす試料精製方法。
- 生物体を含有する試料を混合床イオン交換樹脂にさらすステップを含む試料精製方法であって、試料を安定化して分子診断法に付すことを可能とする試料精製方法。
- 生物体を含有する試料を、試料中の生物体が溶解する前に混合床イオン交換樹脂にさらすステップを含む試料精製方法であって、試料中に存在する蛍光検知信号を阻害する可能性のある蛍光物質を除去する試料精製方法。
- 生物体を含有する試料を混合床イオン交換樹脂にさらすステップを含む試料精製方法であって、それによって試料中の生物体が濃縮される試料精製方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/963,934 US6241980B1 (en) | 1997-11-04 | 1997-11-04 | Sample processing method using ion exchange resin |
| US08/963934 | 1997-11-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11235171A JPH11235171A (ja) | 1999-08-31 |
| JP4351752B2 true JP4351752B2 (ja) | 2009-10-28 |
Family
ID=25507919
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30959098A Expired - Fee Related JP4351752B2 (ja) | 1997-11-04 | 1998-10-30 | イオン交換樹脂を用いた試料加工方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6241980B1 (ja) |
| EP (2) | EP1291055B1 (ja) |
| JP (1) | JP4351752B2 (ja) |
| AU (1) | AU744687B2 (ja) |
| CA (1) | CA2246961C (ja) |
| DE (1) | DE69841482D1 (ja) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1410001A4 (en) * | 2000-10-25 | 2006-05-31 | Michael M Miller | MULTI-LAYERED ANALYTICAL ELEMENT AND METHOD OF DETERMINING ANALYTES IN FLUIDS CONTAINING INTERFERING SUBSTANCES |
| US6833238B2 (en) | 2002-01-04 | 2004-12-21 | Applera Corporation | Petal-array support for use with microplates |
| US6897027B2 (en) * | 2002-03-27 | 2005-05-24 | Decode Genetics Ehf. | Method for desalting nucleic acids |
| US20040016702A1 (en) * | 2002-07-26 | 2004-01-29 | Applera Corporation | Device and method for purification of nucleic acids |
| US20040137419A1 (en) * | 2003-01-15 | 2004-07-15 | V.I. Technologies, Inc. | Methods for removing microbicidal compounds from compositions |
| US20050130177A1 (en) | 2003-12-12 | 2005-06-16 | 3M Innovative Properties Company | Variable valve apparatus and methods |
| US20050142570A1 (en) * | 2003-12-24 | 2005-06-30 | 3M Innovative Properties Company | Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and sedimenting reagent |
| US20050142571A1 (en) * | 2003-12-24 | 2005-06-30 | 3M Innovative Properties Company | Methods for nucleic acid isolation and kits using solid phase material |
| US7727710B2 (en) * | 2003-12-24 | 2010-06-01 | 3M Innovative Properties Company | Materials, methods, and kits for reducing nonspecific binding of molecules to a surface |
| US7939249B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-05-10 | 3M Innovative Properties Company | Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step |
| US20050196856A1 (en) * | 2004-02-18 | 2005-09-08 | Applera Corporation | Polyelectrolyte-coated size-exclusion ion-exchange particles |
| US20060160122A1 (en) * | 2004-02-18 | 2006-07-20 | Applera Corporation | Polyelectrolyte-coated size-exclusion ion-exchange particles |
| US20050181378A1 (en) * | 2004-02-18 | 2005-08-18 | Applera Corporation | Polyelectrolyte-coated size-exclusion ion-exchange particles |
| US9464310B2 (en) * | 2005-02-10 | 2016-10-11 | Medical Diagnostic Laboratories, Llc | Integrated method for collection and maintenance of detectability of a plurality of microbiological agents in a single clinical sample and for handling a plurality of samples for reporting a sum of diagnostic results for each sample |
| JP5006607B2 (ja) * | 2006-09-19 | 2012-08-22 | 栄研化学株式会社 | 核酸増幅反応における阻害を回避する方法 |
| EP2283362A1 (en) * | 2008-05-20 | 2011-02-16 | Cantimer Incorporated | Methods, systems and devices for analyzing a biological fluid sample following ion exchange |
| US9551694B2 (en) * | 2008-10-15 | 2017-01-24 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Micro titre plate |
| US20100273822A1 (en) * | 2009-04-22 | 2010-10-28 | William Wayne Howard | Immediate release compositions and methods for delivering drug formulations using strong acid ion exchange resins |
| US8506797B2 (en) * | 2011-04-10 | 2013-08-13 | Therapeutic Proteins International, LLC | Downstream bioprocessing device |
| US8852435B2 (en) * | 2011-11-29 | 2014-10-07 | Therapeutics Proteins International, LLC | Purification and separation treatment assembly (PASTA) for biological products |
| US9933341B2 (en) | 2012-04-05 | 2018-04-03 | Becton, Dickinson And Company | Sample preparation for flow cytometry |
| GB201214193D0 (en) * | 2012-08-08 | 2012-09-19 | Ge Healthcare Uk Ltd | Polymerase chain reaction method for amplifying nucleic acid |
| CN105189774A (zh) * | 2013-03-13 | 2015-12-23 | 贝克顿·迪金森公司 | 改进复合基质中微生物的分析的方法 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS53137887A (en) * | 1977-05-09 | 1978-12-01 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | Ion exchanging components |
| JPS5512141A (en) * | 1978-07-13 | 1980-01-28 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | Manufacturing of ion exchange membrane |
| US4537911A (en) * | 1984-01-13 | 1985-08-27 | The Dow Chemical Company | Interface beads for mixed-bed ion exchange resins |
| US4971760A (en) * | 1986-03-10 | 1990-11-20 | University Of Southern California | Novel method for disinfecting red blood cells, blood platelets, blood plasma, and optical corneas and sclerae |
| ES2025556T3 (es) * | 1986-12-01 | 1992-04-01 | Molecular Biosystems, Inc. | Metodo del ensayo de hibridacion para detectar una secuencia diana polinucleotidica especifica. |
| US4935342A (en) * | 1986-12-01 | 1990-06-19 | Syngene, Inc. | Method of isolating and purifying nucleic acids from biological samples |
| US4997932A (en) | 1989-11-13 | 1991-03-05 | Boehringer Mannheim Corporation | Method and kit for purifying nucleic acids |
| FR2664702B1 (fr) * | 1990-07-13 | 1993-08-06 | Cis Bio Int | Procede de reduction d'interferences dans un dosage par fluorescence. |
| US5284940A (en) | 1990-11-14 | 1994-02-08 | Hri Research, Inc. | Preparation for nucleic acid samples |
| US5278289A (en) * | 1991-11-12 | 1994-01-11 | Johnson Alan J | Antihemophilic factor stabilization |
| CA2121659C (en) | 1993-05-11 | 2000-11-28 | Michael C. Little | Sample processing method for mycobacteria |
| US5506103A (en) * | 1993-11-16 | 1996-04-09 | Hybridon, Inc. | Method for detecting charged oligonucleotides in biological fluids |
| US5654141A (en) * | 1994-11-18 | 1997-08-05 | Thomas Jefferson University | Amplification based detection of bacterial infection |
| US5660984A (en) | 1994-12-09 | 1997-08-26 | Davis; Thomas E. | DNA isolating apparatus comprising a non-porous DNA binding, anion exchange resin and methods of use thereof |
| AU4586096A (en) | 1995-03-10 | 1996-09-19 | Becton Dickinson & Company | Sample processing method for whole blood |
| DE19530132C2 (de) | 1995-08-16 | 1998-07-16 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur Reinigung, Stabilisierung oder Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien |
| US5620869A (en) | 1995-09-28 | 1997-04-15 | Becton, Dickinson And Company | Methods for reducing inhibition of nucleic acid amplification reactions |
| WO1998012351A1 (de) | 1996-09-19 | 1998-03-26 | Roth W Kurt | Verfahren zur reinigung und gegebenenfalls analyse von nukleinsäuren aus biologischen proben |
-
1997
- 1997-11-04 US US08/963,934 patent/US6241980B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-09-10 CA CA002246961A patent/CA2246961C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-10-28 AU AU89578/98A patent/AU744687B2/en not_active Ceased
- 1998-10-30 JP JP30959098A patent/JP4351752B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-03 EP EP02025484A patent/EP1291055B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-03 EP EP98120806A patent/EP0915171A3/en not_active Withdrawn
- 1998-11-03 DE DE69841482T patent/DE69841482D1/de not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-06-09 US US09/328,575 patent/US6265224B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU8957898A (en) | 1999-05-27 |
| EP1291055A2 (en) | 2003-03-12 |
| CA2246961C (en) | 2009-01-06 |
| EP0915171A3 (en) | 2000-03-22 |
| US6241980B1 (en) | 2001-06-05 |
| DE69841482D1 (de) | 2010-03-18 |
| EP1291055A3 (en) | 2004-01-07 |
| AU744687B2 (en) | 2002-02-28 |
| JPH11235171A (ja) | 1999-08-31 |
| CA2246961A1 (en) | 1999-05-04 |
| US6265224B1 (en) | 2001-07-24 |
| EP0915171A2 (en) | 1999-05-12 |
| EP1291055B1 (en) | 2010-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4351752B2 (ja) | イオン交換樹脂を用いた試料加工方法 | |
| US20220170008A1 (en) | Polynucleotide capture materials, and systems using same | |
| US20100009351A1 (en) | Polynucleotide Capture Materials, and Method of Using Same | |
| WO2000062023A1 (en) | Fta-coated media for use as a molecular diagnostic tool | |
| WO2010005444A1 (en) | Polynucleotide capture materials, and methods of using same | |
| AU2020202825B2 (en) | Polynucleotide capture materials, and methods of using same | |
| AU2023282224A1 (en) | Polynucleotide capture materials, and methods of using same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060929 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20061228 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070109 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070329 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070626 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070926 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20071001 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090206 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090501 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090710 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090727 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120731 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120731 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130731 Year of fee payment: 4 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |