JP4334719B2

JP4334719B2 - Method for preparing cryoprotectant

Info

Publication number: JP4334719B2
Application number: JP2000059444A
Authority: JP
Inventors: 斉小幡; 秀久河原; 和弘山出; 啓悟小村; 昌二金子; 紀子坂本
Original assignee: 学校法人関西大学
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-03-03
Publication date: 2009-09-30
Anticipated expiration: 2020-03-03
Also published as: JP2001139599A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、代謝系酵素などのタンパク質の凍結変性を防止することができる凍結保護物質の調製方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質や細胞、微生物、あるいは動物臓器等を長期間にわたって保存するためには、これらを凍結する手段が採られている。しかしながら、一般に、タンパク質を凍結させるとその高次構造が変化すること（以下、この変化を「凍結変性」と記載する）が知られており、凍結変性が起こるとそのタンパク質は失活し、融解後に本来の機能を回復できない。
【０００３】
従来、このようなタンパク質の凍結変性を防止する方策としては、グルコース、ショ糖、トレハロース、ソルビトールなどの糖類や、グリセリンや、アルブミンなどを添加することが知られており、これらを添加することにより、凍結時にタンパク質の凍結変性を防止し、融解後にそのタンパク質の本来の機能を回復させることができる。このため、これらの物質の溶液は、例えば、血液、臓器、酵素などの保存液として用いられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、糖類、グリセリン、アルブミンなどの添加によって凍結変性防止効果を得るためには、これらの物質を非常に高い濃度で添加しなければならない。例えば、糖類の場合には、濃度10〜30％となる程度に添加する必要がある。そして、糖類などを高濃度で添加した溶液は、タンパク質の代謝機能を維持させることが困難であるため、保護したタンパク質を好適に使用するためには、融解させた後にその糖類を透析などをして取り除かなければならないという欠点がある。
【０００５】
また、凍結変性を防止する物質としてジメチルスルホキシドも用いられているが、ジメチルスルホキシドはタンパク質や細胞の代謝に対して毒性を有することが知られており、好ましくはない。
【０００６】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、従来の凍結保護物質に代わるものとして、比較的低濃度で使用することができ、代謝系酵素などのタンパク質の凍結変性を簡便かつ確実に防止することができる凍結保護物質を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するものとして、以下の（１）〜（９）の発明を提供する。
（１）パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）を、２０〜４０℃で前培養した後、５℃〜１８℃、１０〜９６時間低温培養し、低温培養後の菌体内の物質を、硫酸アンモニウムで塩析し、硫酸アンモニウムでの塩析後の画分を、第４級アンモニウム基を有する陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて活性画分を溶出させ、溶出された活性画分を吸着クロマトグラフィーにかけてさらに活性画分を溶出させ、溶出された活性画分をゲルろ過クロマトグラフィーにかけてさらに活性画分を溶出させ、溶出された活性画分を疎水性クロマトグラフィーにかけてさらに活性画分を溶出させ、溶出された活性画分を分取して、分子量２９０００Ｄａ（ゲル濾過クロマトグラフィーによる測定、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定）の単量体からなる凍結保護物質を精製することにより得られる凍結保護物質を、０．０１〜１μｇ／ｍｌの濃度に調製することを特徴とする凍結保護物質の調製方法。
（２）前記発明（１）において、塩析を、飽和度６０〜８０％の硫酸アンモニウムによって行う凍結保護物質の調製方法。
（３）前記発明（１）又は（２）において、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製工程においてリン酸カリウム緩衝液と塩化ナトリウムにより、塩化ナトリウムの濃度勾配溶出法で活性画分を溶出させる凍結保護物質の調製方法。
（４）前記発明（１）乃至（３）のいずれかにおいて、吸着クロマトグラフィーによる精製工程においてリン酸カリウム緩衝液の濃度勾配溶出法で活性画分を溶出させる凍結保護物質の調製方法。
（５）前記発明（１）乃至（４）のいずれかにおいて、ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製工程において塩化ナトリウムを含むリン酸カリウム緩衝液で溶出させる凍結保護物質の調製方法。
（６）前記発明（１）乃至（５）のいずれかにおいて、疎水性クロマトグラフィーによる精製工程においてリン酸カリウム緩衝液と硫酸アンモニウムにより、硫酸アンモニウムの濃度勾配溶出法で活性画分を溶出させる凍結保護物質の調製方法。
【０００９】
以下、これらの発明について、発明の実施形態を詳しく説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
発明（１）及び（２）の凍結保護物質は、Erwinia herbicola（新菌株名 Pantoea agglomeransとも言う)が低温ストレス下において産生する物質（タンパク質分子）である。Pantoea agglomeransは、低温環境下の土壌または水中から単離された微生物である。
【００１１】
Erwinia herbicola（新菌株名 Pantoea agglomeransとも言う)は氷核細菌であって、財団法人発酵研究所に保存されており、そのカタログから容易に入手できる（例えば、Erwinia herbicola IFO12686等）。
【００１５】
この発明における凍結保護物質は、前記のとおりの微生物が菌体内に産生するタンパク質であって（Pantoea agglomerans由来のものは分子量約29,000Da）、少量で各種タンパク質、特に、乳酸デヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、ムタロターゼなどの代謝系酵素の凍結変性を防止する効果を有する。
【００１６】
なお、この出願の発明者らは、氷核活性物質の製法（特開平２−７６５９５号公報）を既に出願しているが、この氷核活性物質は氷結晶となる物質であり、菌体外に分泌されるものであって、この発明における凍結保護物質とは全く異なるものである。
【００１７】
この発明における凍結保護物質は、発明（１）、（２）の方法により調製することができる。すなわち、発明（１）、（２）の調製方法は、前記の微生物を３０℃以下の低温で培養することにより凍結保護物質の発現を誘導させ、その培養物中から凍結保護物質を取得することを特徴とする。
【００１８】
微生物を培養するための培地は公知のものを適宜選択すれば良く、例えば、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン、大豆粉末、トウモロコシ粉末、カゼイン、セリン、アラニン、グリシン、ロイシン、リジン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸などが窒素源として用いられ、これに、ビタミンＢ1、ビタミンＢ2、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチンなどのビタミン成分や、ショ糖、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素アンモニウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、グルコース、フルクトース、マルトース、澱粉などを適宜選択して調製することができる。これらの中でも、酵母エキス、アラニン、セリンを窒素源として含有し、硫酸カリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム７水和物を無機塩類として含有し、ショ糖を炭素源として含有する培地が好ましい。
【００１９】
また、培地のｐＨは通常６〜８程度に調整することが好ましい。ｐＨ値がこの範囲から大きく外れると、微生物の生育が低下すると共に凍結保護物質の凍結保護活性も低下する。
【００２０】
微生物を培養する条件は、例えば、通常、20℃〜40℃、好ましくは25℃〜35℃で、８時間〜24時間、好ましくは12時間程度培養した後、低温ショックをかけた状態で低温培養する。低温培養は、温度条件として０℃〜30℃、好ましくは５℃〜18℃、さらに好ましくは10℃〜15℃、培養時間として10時間〜96時間、好ましくは24〜72時間の範囲で行うことができる。
【００２１】
より好ましい培養条件は、約30℃、12時間程度で培養した後、菌体を15分以内のうちに約12℃まで急冷し、約12℃下で48時間程度で低温培養する。この条件によって最も効率よく、かつ保護活性の高い凍結保護物質が生産される。
【００２２】
この発明における凍結保護物質は、上記条件で培養した後、公知の分離操作を組み合わせることによって菌体内から単離精製することができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２３】
例えば、具体的には、低温培養後の菌体を超音波処理やダイノミル等で破砕し、遠心分離によって不溶物を取り除き、その上清を飽和度40〜90％、好ましくは飽和度40〜80％、より好ましくは飽和度60〜80％の硫酸アンモニウムによって塩析することにより、目的とする凍結保護物質が含まれた画分が沈殿する。
【００２４】
上記塩析によって得られた画分を凍結保護物質として用いてもよいが、さらに必要に応じて、この画分を各種のクロマトグラフィー処理で精製してもよい。
例えば、第４級アンモニウム基を有する陰イオン交換クロマトグラフィーに、所定速度（例えば、流速2.0 ml／分）で目的とする凍結保護物質を含む画分を負荷し、0.2〜0.4mol／ｌ（モル／リットル）の塩化ナトリウムで溶出させることにより、部分精製された凍結保護物質を得ることができる。
【００２５】
この発明（１）、（２）の調製方法は、菌体を利用するものであるため、大型設備、広い敷地、エネルギーなどを必要とせず、工業的製造に適するものである。
【００２７】
なお、発明(1)および(2)の凍結保護物質は、耐熱性を有しているため、熱処理による簡易精製が可能であることの他に、加熱殺菌が可能であるという利点を有している。生物材料の場合には、無菌状態であることや、プロテアーゼ、ＤＮＡ分解酵素等を含まないこが要求されるためである。
【００２８】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、これらの発明は以下の例によって限定されるものではない。なお、以下の実施例において、得られた凍結保護物質の凍結保護活性はC. Linらの方法（C.Lin and M.F.Thomashow; Biochemical and Biophysical Research Communications, 183, 1103-1108, 1992）に従って測定した。すなわち、低温感受性酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ溶液（150μg/ml）0.02 mlと試料（1,000μg/ml）0.08 mlを混合し、プログラムフリーザーを用いて毎分1℃の速度で温度を下げて-20℃で24時間凍結させた後、同じ速度で融解した。その溶液60μlに80 mMトリス-塩酸緩衝液（pH7.5）、100 mM塩化カリウム、2 mMピルビン酸、0.3 mM NADHからなる反応液3 mlを添加した後、分光光度計を用いて波長340 nmにおける吸光度の1分間の減少量（ΔA）を測定し、以下に示す計算式に基づいて、その試料の凍結保護活性を百分率で表した。なお、試料のかわりに緩衝液を添加したものの酵素活性を測定し、それぞれ凍結前後のブランクとした。
【００２９】
【式１】

【００３０】
すなわち、活性100％とは、凍結後の乳酸デヒドロゲナーゼ活性が凍結前の活性に保たれている状態であり、逆に活性0％とは、凍結後の活性が、凍結後のブランクの活性と同じ状態まで低下した状態を表す。
【００３１】
【実施例】
実施例１：菌体の培養
50ml三角フラスコ中に市販のTrypticasa Soy Broth（TSB培地、pH7.0、Becton Dickinson and Company製）を10 ml入れ121℃で20分間殺菌して冷却した後、そこに菌株としてPantoea agglomeransを一白金耳分植菌し、18℃、24時間振とう培養し前培養液とした。次いで、500 ml三角フラスコ中に、市販の酵母エキス30g、ＤＬ-セリン2 g、ＤＬ-アラニン2 g、硫酸カリウム8.6 g、塩化カリウム1.4 g、硫酸マグネシウム7水和物1.4 g、ショ糖10 gを1000 mlの蒸留水に溶解させた培地を100 ml入れ、121℃で20分間殺菌して冷却した後、これに前培養液を1 ml（1.0×10⁸細胞）植菌し、30℃、12時間培養した。その後、低温培養として、12℃に冷却し、さらに48時間培養した。培養終了後、この培養液を超音波破砕器（19.9 KHz）で破砕し、さらに遠心分離機にて50,000rpmで遠心分離して膜成分などを除去した。この上澄み液にストレプトマイシン硫酸塩を添加して核酸成分を沈澱させ、遠心分離で除去した。さらに、この上澄み液を10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で透析し、遠心分離に付し、その上澄み液を取り出して無細胞抽出液を得た。
実施例２：凍結保護物質の精製
１．硫酸アンモニウム60〜80％処理
実施例１で得られた無細胞抽出液に、硫酸アンモニウムを60％飽和になるように添加し、析出した沈殿物を遠心分離により除き、得られた上清に再度硫酸アンモニウムを80％飽和になるように添加し、遠心分離により沈殿物を得た。
２．スーパーQトヨパールによる精製
沈殿物を、第4級アンモニウム基を有する陰イオン交換クロマトグラフィー（カラム：2.6 cm×20 cm）にかけ、10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）とNaClにより、1 Ｍ NaClの濃度勾配溶出法で溶出させて得られた活性画分を集めた。
３．ヒドロキシアパタイトによる精製
活性画分を吸着クロマトグラフィー（カラム：1.6 cm×20 cm）にかけ、10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）から500 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）への濃度勾配溶出法で溶出させて得られた活性画分を集めた。
４．スーパーロース12による精製
活性画分をゲルろ過クロマトグラフィー（カラム：1.6 cm×60 cm）にかけ、0.15 M NaClを含む10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で溶出させて得られた活性画分を集めた。
５．フェニルトヨパールによる精製
最後に、活性画分を疎水性クロマトグラフィー（カラム：0.32 cm×5 cm）にかけ、10 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）と硫酸アンモニウムにより、55％硫酸アンモニウムの濃度勾配溶出法で溶出させて得られた活性画分を分取して精製凍結保護物質を得た。
【００３２】
なお、実施例１とこの実施例２に準じた方法でその他低温微生物の凍結保護物質を調製し、30℃で培養した場合と、さらに低温培養した場合の凍結保護活性を前記C. Linらの方法で測定した。結果は表１に示したとおりである。この表１から明らかなように、30℃で培養した後、さらに低温培養（12℃）することによって、凍結保護活性が高まることが確認された。
【００３３】
また、実施例２に示す１〜５のステップにおける試料の総タンパク質量、凍結保護活性は、表２に示したとおりであった。
【００３４】
【表１】

【００３５】
【表２】

【００３６】
実施例３：凍結保護物質の分子量測定
実施例２で精製した凍結保護物質をスーパーロース12を担体に用いたゲルろ過クロマトグラフィーにかけ、検量線から分子量を求めた。結果は図１-Aに示したとおりであり、得られた凍結保護物質の分子量は約29,000Daであった。また、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果（図１-B）から推定される分子量も約29,000Daであったことから、この凍結保護物質は、分子量29,000Daの単量体であることが確認された。
実施例４：他の凍結保護材との保護活性の比較
実施例２で精製した凍結保護物質を各濃度（0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000 μg/ml）に調製し、C.Linらの凍結保護活性の測定方法に準じて酵素の残存活性を測定した。なお、他の凍結保護材と比較するため、牛血清アルブミン（BSA）およびショ糖についても同様に凍結保護効果を調べた。
【００３７】
結果は図２に示したとおりである。この図２から明らかなように、凍結保護活性を持つことで知られるBSAで、0.1μg/ml、スクロースで10μg/mlで、活性が消失するのに対して、この発明の凍結保護物質は0.001μg/mlでも凍結保護活性を維持していた。また、BSAより10⁵倍も低い濃度で100％の凍結保護活性を示したことから、極少量での使用が可能であることが判明した。
実施例５：酵素試薬の安定化
実施例２で精製した凍結保護物質を用いて、低温感受性酵素として知られる乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）、NAD⁺依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（iCDH）、NADP⁺依存型イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（riCDH）の安定化を実施した。乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）に対する残存活性確認は、C. Linらの測定方法に準じて行った。また、その他の酵素の残存活性確認についても、それぞれの酵素活性測定に適した反応液を使用し、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の測定方法に準じて行った。
【００３８】
結果は表３に示したとおりである。この表３から明らかなように、上記酵素試薬に対して、1 ng/mlの濃度のこの発明の凍結保護物質を添加することで、高い保護活性があり、少量でも酵素試薬の安定化に十分有効であることが判明した。
【００３９】
以上のことから、この発明の凍結保護物質は、試薬以外にも酵素やタンパク質を含む診断薬・医薬品等の凍結保存時の安定性向上に有効であることが確認された。
【００４０】
【表３】

【００４１】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、比較的低濃度の添加量で代謝系酵素などのタンパク質の凍結変性を防止することのできる、微生物由来の凍結保護物質が提供される。また、この凍結保護物質を用いることによって、タンパク質や細胞、臓器、微生物等の生物材料を安定に凍結保存する方法や、生理活性等を維持した状態で安定に凍結保存されたタンパク質や各種の生物材料が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａはこの発明の凍結保護物質（○）のゲルろ過クロマトグラフィーによる分子量を示したグラフであり、ＢはSDS-PAGEによる電気泳動像である。
【図２】各種凍結保護物質の各濃度における凍結保護活性を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The invention of this application relates to a method for preparing a cryoprotectant capable of preventing freeze denaturation of proteins such as metabolic enzymes.
[0002]
[Prior art]
In order to preserve proteins, cells, microorganisms, animal organs and the like for a long period of time, means for freezing them has been adopted. However, it is generally known that when a protein is frozen, its higher-order structure changes (hereinafter, this change is referred to as “freeze denaturation”). When freeze denaturation occurs, the protein is deactivated and thawed. The original function cannot be recovered later.
[0003]
Conventionally, it has been known to add sugars such as glucose, sucrose, trehalose, and sorbitol, glycerin, albumin, and the like as a measure for preventing freeze denaturation of such proteins. In addition, freezing denaturation of a protein can be prevented during freezing, and the original function of the protein can be restored after thawing. For this reason, solutions of these substances are used as storage solutions for blood, organs, enzymes, and the like.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, in order to obtain the effect of preventing freezing denaturation by adding saccharides, glycerin, albumin, etc., these substances must be added at a very high concentration. For example, in the case of saccharides, it is necessary to add to a level of 10 to 30%. In addition, since it is difficult to maintain the metabolic function of a protein in a solution containing saccharides or the like at a high concentration, in order to use the protected protein appropriately, the saccharide is dialyzed after being melted. Has the disadvantage of having to be removed.
[0005]
Further, dimethyl sulfoxide is also used as a substance that prevents freezing denaturation, but dimethyl sulfoxide is known to be toxic to protein and cell metabolism and is not preferred.
[0006]
The invention of this application has been made in view of the circumstances as described above, and can be used at a relatively low concentration as an alternative to a conventional cryoprotectant, and freezes proteins such as metabolic enzymes. It is an object to provide a cryoprotectant capable of easily and reliably preventing denaturation.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
This application provides the following inventions (1) to (9) to solve the above problems.
(1) Pantoea agglomerans (Pantoea agglomerans) is pre-cultured at 20 to 40 ° C. and then cultured at 5 ° C. to 18 ° C. for 10 to 96 hours at low temperature. The fraction after salting out with ammonium sulfate is subjected to anion exchange chromatography having a quaternary ammonium group to elute the active fraction, and the eluted active fraction is subjected to adsorption chromatography to further elute the active fraction. The eluted active fraction is subjected to gel filtration chromatography to further elute the active fraction, the eluted active fraction is subjected to hydrophobic chromatography to further elute the active fraction, and the eluted active fraction is separated. Molecular weight 29000 Da (measured by gel filtration chromatography and by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis). A method for preparing a cryoprotectant, which comprises preparing a cryoprotectant obtained by purifying a cryoprotectant comprising the monomer of (1) at a concentration of 0.01 to 1 μg / ml.
(2) Oite the invention (1), the salting-out process for the preparation of a cryoprotectant performed by saturation 60-80% ammonium sulfate.
(3) In the above invention (1) or (2) , a cryoprotectant that elutes an active fraction by a concentration gradient elution method of sodium chloride with potassium phosphate buffer and sodium chloride in a purification step by anion exchange chromatography Preparation method.
(4) The method for preparing a cryoprotectant according to any one of the inventions (1) to (3) , wherein the active fraction is eluted by a concentration gradient elution method of potassium phosphate buffer in the purification step by adsorption chromatography.
(5) The method for preparing a cryoprotectant according to any one of the inventions (1) to (4) , wherein the elution is performed with a potassium phosphate buffer containing sodium chloride in a purification step by gel filtration chromatography.
(6) The cryoprotectant according to any one of the inventions (1) to (5) , wherein the active fraction is eluted by a concentration gradient elution method of ammonium sulfate with potassium phosphate buffer and ammonium sulfate in the purification step by hydrophobic chromatography. Preparation method.
[0009]
In the following, embodiments of the invention will be described in detail.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The cryoprotective substances of the inventions (1) and (2) are substances (protein molecules) produced by Erwinia herbicola (also referred to as new strain name Pantoea agglomerans) under low temperature stress. Pantoea agglomerans is, Ru microorganisms der isolated from the soil or in water of a low-temperature environment.
[0011]
Erwinia herbicola (intends words with new strains name Pantoea agglomerans) is an ice nucleating bacteria, are stored in the Institute for Fermentation, readily available from the catalog (for example, such as Erwinia herbicola IFO12686).
[0015]
The cryoprotectant in the present invention is a protein produced by the microorganism as described above (Pantoea agglomerans-derived protein has a molecular weight of about 29,000 Da), and a small amount of various proteins, particularly lactate dehydrogenase, enolase, isocitrate It has the effect of preventing freeze denaturation of metabolic enzymes such as dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, maleate dehydrogenase, and mutarotase.
[0016]
The inventors of this application have already applied for a method for producing an ice nucleus active substance (Japanese Patent Laid-Open No. 2-76595), but this ice nucleus active substance is a substance that becomes ice crystals and is outside the cell. be those that are secreted by, it is completely different from the cryoprotectant in this invention.
[0017]
The cryoprotectant in this invention can be prepared by the methods of inventions (1) and (2) . That is, in the preparation methods of the inventions (1) and (2) , the expression of the cryoprotectant is induced by culturing the microorganism at a low temperature of 30 ° C. or less, and the cryoprotectant is obtained from the culture. It is characterized by.
[0018]
A medium for cultivating microorganisms may be appropriately selected from known ones, such as yeast extract, meat extract, malt extract, peptone, soybean powder, corn powder, casein, serine, alanine, glycine, leucine, lysine, threonine. , Tyrosine, glutamic acid, etc. are used as nitrogen sources, and vitamins such as vitamin B1, vitamin B2, folic acid, nicotinic acid, pantothenic acid, biotin, sucrose, magnesium sulfate, potassium sulfate, potassium chloride, ammonium sulfate, It can be prepared by appropriately selecting potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, ammonium dihydrogen phosphate, citric acid, sodium citrate, glucose, fructose, maltose, starch and the like. Among these, a medium containing yeast extract, alanine, and serine as nitrogen sources, potassium sulfate, potassium chloride, magnesium sulfate heptahydrate as inorganic salts, and sucrose as a carbon source is preferable.
[0019]
Moreover, it is preferable to adjust pH of a culture medium normally to about 6-8. When the pH value deviates greatly from this range, the growth of microorganisms is reduced and the cryoprotective activity of the cryoprotectant is also reduced.
[0020]
The conditions for culturing the microorganism are, for example, usually 20 ° C. to 40 ° C., preferably 25 ° C. to 35 ° C., cultured for 8 hours to 24 hours, preferably about 12 hours, and then subjected to low temperature shock in a state of low temperature shock. To do. The low temperature culture is performed at a temperature condition of 0 ° C. to 30 ° C., preferably 5 ° C. to 18 ° C., more preferably 10 ° C. to 15 ° C., and a culture time of 10 hours to 96 hours, preferably 24 to 72 hours. Can do.
[0021]
More preferably, after culturing at about 30 ° C. for about 12 hours, the cells are rapidly cooled to about 12 ° C. within 15 minutes and cultured at about 12 ° C. for about 48 hours at low temperature. This condition produces the most efficient and highly protective cryoprotective substance.
[0022]
Cryoprotectant in this invention, after incubation under the conditions described above, can be isolated and purified from the bacterial cells by combining known separation operations. For example, treatment with denaturing agents and surfactants such as urea, sonication, enzyme digestion, salting out and solvent precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing, Examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, and reverse phase chromatography.
[0023]
For example, specifically, the cells after low-temperature culture are disrupted by ultrasonic treatment, dynomill or the like, insoluble materials are removed by centrifugation, and the supernatant is saturated at 40 to 90%, preferably at saturation of 40 to 80. %, More preferably 60% to 80% saturated ammonium sulfate precipitates out the fraction containing the desired cryoprotectant.
[0024]
The fraction obtained by the salting out may be used as a cryoprotective substance, but this fraction may be further purified by various chromatographic treatments as necessary.
For example, an anion exchange chromatography having a quaternary ammonium group is loaded with a fraction containing a desired cryoprotectant at a predetermined rate (for example, a flow rate of 2.0 ml / min), and 0.2 to 0.4 mol / l (moles). Elution with sodium chloride / liter) provides a partially purified cryoprotectant.
[0025]
The present invention (1), process for the preparation of (2) are the be shall take advantage of bacterial cells, large-scale facilities, large site, without the need for such energy, Ru der those suitable for industrial production.
[0027]
Since the cryoprotective substances of the inventions (1) and (2) have heat resistance, they have the advantage that they can be heat-sterilized in addition to being easily purified by heat treatment. Yes. This is because in the case of biological materials, it is required to be in a sterile state and not to contain proteases, DNA degrading enzymes and the like.
[0028]
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to examples, but these inventions are not limited to the following examples. In the following Examples, the cryoprotective activity of the obtained cryoprotectant was measured according to the method of C. Lin et al. (C. Lin and MF Thomashow; Biochemical and Biophysical Research Communications, 183, 1103-1108, 1992). That is, 0.02 ml of lactate dehydrogenase solution (150 μg / ml), which is a low-temperature sensitive enzyme, and 0.08 ml of sample (1,000 μg / ml) are mixed, and the temperature is lowered at a rate of 1 ° C. per minute using a program freezer. And then thawed at the same rate. After adding 3 ml of a reaction solution consisting of 80 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 100 mM potassium chloride, 2 mM pyruvic acid, 0.3 mM NADH to 60 μl of the solution, the wavelength was 340 nm using a spectrophotometer. The amount of decrease in absorbance at 1 minute (ΔA) was measured, and the cryoprotective activity of the sample was expressed as a percentage based on the calculation formula shown below. In addition, the enzyme activity of what added the buffer instead of the sample was measured, and it was set as the blank before and behind freezing, respectively.
[0029]
[Formula 1]

[0030]
That is, 100% activity is a state in which the lactate dehydrogenase activity after freezing is maintained at the activity before freezing. Conversely, 0% activity is the same as the activity of the blank after freezing. It represents the state that has been reduced to the state.
[0031]
【Example】
Example 1: Cell culture
10 ml of commercially available Trypticasa Soy Broth (TSB medium, pH 7.0, manufactured by Becton Dickinson and Company) was placed in a 50 ml Erlenmeyer flask and sterilized at 121 ° C. for 20 minutes and cooled. Then, Pantoea agglomerans was used as a strain. The cells were inoculated and cultured with shaking at 18 ° C. for 24 hours to obtain a preculture solution. Next, in a 500 ml Erlenmeyer flask, 30 g of commercially available yeast extract, DL-serine 2 g, DL-alanine 2 g, potassium sulfate 8.6 g, potassium chloride 1.4 g, magnesium sulfate heptahydrate 1.4 g, sucrose 10 g 100 ml of the medium dissolved in 1000 ml of distilled water, sterilized at 121 ° C for 20 minutes and cooled, then inoculated with 1 ml (1.0 × 10 ⁸ cells) of the precultured solution, 30 ° C, Cultured for 12 hours. Thereafter, as a low-temperature culture, it was cooled to 12 ° C. and further cultured for 48 hours. After completion of the culture, this culture solution was crushed with an ultrasonic crusher (19.9 KHz), and further centrifuged at 50,000 rpm with a centrifuge to remove membrane components and the like. Streptomycin sulfate was added to the supernatant to precipitate the nucleic acid component and removed by centrifugation. Further, the supernatant was dialyzed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), centrifuged, and the supernatant was taken out to obtain a cell-free extract.
Example 2: Purification of cryoprotectant Ammonium sulfate 60-80% treatment To the cell-free extract obtained in Example 1, ammonium sulfate was added so as to be 60% saturated, the deposited precipitate was removed by centrifugation, and ammonium sulfate was again added to the resulting supernatant. It added so that it might become 80% saturation, and the precipitate was obtained by centrifugation.
2. The purified precipitate by Super Q Toyopearl was subjected to anion exchange chromatography (column: 2.6 cm × 20 cm) having a quaternary ammonium group, and 1 M with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) and NaCl. The active fractions obtained by elution with a NaCl gradient elution method were collected.
3. The purified active fraction by hydroxyapatite was subjected to adsorption chromatography (column: 1.6 cm x 20 cm), and the concentration from 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) to 500 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) Active fractions obtained by elution by the gradient elution method were collected.
4). Active fraction obtained by subjecting the purified active fraction with Superose 12 to gel filtration chromatography (column: 1.6 cm x 60 cm) and eluting with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15 M NaCl Collected minutes.
5. At the end of purification with phenyltoyopearl, the active fraction was subjected to hydrophobic chromatography (column: 0.32 cm x 5 cm), and 55% ammonium sulfate gradient elution was performed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) and ammonium sulfate. The active fraction obtained by elution was collected to obtain a purified cryoprotectant.
[0032]
It should be noted that cryoprotective substances for other cryogenic microorganisms prepared by the method according to Example 1 and Example 2 were cultured at 30 ° C. and further cryopreserved when cryopreserved by C. Lin et al. Measured by the method. The results are as shown in Table 1. As is apparent from Table 1, it was confirmed that the cryoprotective activity was increased by culturing at 30 ° C. and then further culturing at a low temperature (12 ° C.).
[0033]
Further, the total protein amount and cryoprotective activity of the samples in steps 1 to 5 shown in Example 2 were as shown in Table 2.
[0034]
[Table 1]

[0035]
[Table 2]

[0036]
Example 3: Measurement of molecular weight of cryoprotectant substance The cryoprotectant substance purified in Example 2 was subjected to gel filtration chromatography using Superose 12 as a carrier, and the molecular weight was determined from a calibration curve. The result is as shown in FIG. 1-A, and the molecular weight of the obtained cryoprotectant was about 29,000 Da. The molecular weight estimated from the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (Figure 1-B) was also about 29,000 Da, confirming that this cryoprotectant is a monomer with a molecular weight of 29,000 Da. It was done.
Example 4: Comparison of protective activity with other cryoprotective materials The cryoprotectant purified in Example 2 was prepared at various concentrations (0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000 μg / ml) and C Residual activity of the enzyme was measured according to the method for measuring cryoprotective activity of Lin et al. For comparison with other cryoprotective materials, the cryoprotective effect of bovine serum albumin (BSA) and sucrose was also examined.
[0037]
The results are as shown in FIG. As is clear from FIG. 2, BSA known to have cryoprotective activity loses its activity at 0.1 μg / ml and sucrose at 10 μg / ml, whereas the cryoprotectant of the present invention has 0.001 The cryoprotective activity was maintained even at μg / ml. In addition, it showed 100% cryoprotective activity at a concentration 10 ⁵ times lower than that of BSA, which revealed that it can be used in a very small amount.
Example 5: Stabilization of enzyme reagent Using the cryoprotectant purified in Example 2, lactate dehydrogenase (LDH), alcohol dehydrogenase (ADH), and NAD ⁺ -dependent isocitrate dehydrogenase (iCDH) known as low-temperature sensitive enzymes Stabilization of NADP ⁺ dependent isocitrate dehydrogenase (riCDH) was performed. The residual activity against lactate dehydrogenase (LDH) was confirmed according to the measurement method of C. Lin et al. Further, the remaining activity of other enzymes was also confirmed according to the method for measuring lactate dehydrogenase (LDH) using a reaction solution suitable for each enzyme activity measurement.
[0038]
The results are as shown in Table 3. As apparent from Table 3, the addition of the cryoprotective substance of the present invention having a concentration of 1 ng / ml to the enzyme reagent provides high protective activity, and even a small amount is sufficient for stabilizing the enzyme reagent. It turned out to be effective.
[0039]
From the above, it was confirmed that the cryoprotectant of the present invention is effective in improving the stability during cryopreservation of diagnostic agents and pharmaceuticals containing enzymes and proteins in addition to reagents.
[0040]
[Table 3]

[0041]
【The invention's effect】
As described in detail above, the invention of this application provides a microorganism-derived cryoprotectant capable of preventing freeze-denaturation of proteins such as metabolic enzymes with a relatively low concentration. In addition, by using this cryoprotectant, it is possible to stably cryopreserve biological materials such as proteins, cells, organs, and microorganisms, and to stably preserve cryopreserved proteins and various organisms while maintaining their physiological activity. Material is provided.
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a graph showing the molecular weight of a cryoprotectant (◯) of the present invention by gel filtration chromatography, and B is an electrophoretic image by SDS-PAGE.
FIG. 2 is a graph showing cryoprotective activity at various concentrations of various cryoprotectants.

Claims

Pantoea agglomerans a (Pantoea agglomerans), was pre-cultured at 20 to 40 ° C., 5 ° C. ~ 18 ° C., and cold culture from 10 to 96 hours, the bacterial body material after cold culture, was salted out with ammonium sulfate, ammonium sulfate The fraction after salting-out in the solution is subjected to anion exchange chromatography having a quaternary ammonium group to elute the active fraction, and the eluted active fraction is subjected to adsorption chromatography to further elute the active fraction. The active fraction is subjected to gel filtration chromatography to further elute the active fraction, the eluted active fraction is subjected to hydrophobic chromatography to further elute the active fraction, and the eluted active fraction is fractionated. , Molecular weight 29000 Da (measurement by gel filtration chromatography and measurement by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) A cryoprotectant obtained by purifying the cryoprotectant consisting of the monomer (1) to a concentration of 0.01 to 1 μg / ml.

Salting, process for the preparation of cryoprotectant according to claim 1, wherein performing the saturation 60-80% ammonium sulfate.

The method for preparing a cryoprotectant according to claim 1 or 2 , wherein, in the purification step by anion exchange chromatography, the active fraction is eluted with a potassium phosphate buffer and sodium chloride by a gradient elution method of sodium chloride.

In the purification step by adsorption chromatography process for the preparation of cryoprotectant according to any one of claims 1 to 3 to elute an active fraction with a gradient elution of potassium phosphate buffer.

In the purification step by gel filtration chromatography, process for the preparation of cryoprotectant according to any one of claims 1 to 4, eluting with potassium phosphate buffer containing sodium chloride.

In the purification step by hydrophobicity chromatography, potassium buffer solution and ammonium sulfate phosphate, method for preparing a cryoprotectant according to any one of claims 1 to 5 to elute an active fraction with a gradient elution of ammonium sulfate.