JP4324817B2 - 糖転移酵素の活性測定用基質およびその活性測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖転移酵素、特にガラクトース転移酵素活性において、基質として使用する新規な基質および該基質を利用する糖転移酵素活性測定法ならびにその測定用試薬に関する。さらに詳細には、より優れた信号体雑音比および高感度、簡便性を有する糖転移酵素活性測定用基質、該基質を使用する測定法ならびにその測定用試薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
グルコース転移酵素、ガラクトース転移酵素、アセチルガラクトース転移酵素、アセチルグルコサミン転移酵素、アセチルノイラミン酸転移酵素、フコース転移酵素などの糖転移酵素は、糖を含む糖化合物の糖残基に特定の糖ヌクレオチドを供与体として糖残基を転移する作用を有する酵素であり、多くの糖複合体（Glyococonjugate)の糖部分の生合成に関与している。近年、細胞由来の多くの糖転移酵素がヒト、ブタ、ウサギや微生物などから分離されている。
【０００３】
特に、β１，４ガラクトース転移酵素は１種類しか存在しないと考えられてきたが、従来から知られているβ１，４−ガラクトース転移酵素Ｉの他に、遺伝子の塩基配列、アミノ酸配列、臓器発現が異なるβ１，４−ガラクトース転移酵素II，III ，IVが見出されている。マウスの泌乳期で１，４−ガラクトース転移酵素ＩとIVの発現量の挙動が異なることが知られている。また、成人の脳においても４種の酵素のｍＲＮＡの発現量に関して１，４−ガラクトース転移酵素IVのｍＲＮＡは存在するが、他の３種類の酵素のｍＲＮＡは検出されていない。マウスの個体発生過程に脳でのｍＲＮＡに発現の仕方は異なり、神経組織形成に関与していると言われている。
【０００４】
また、受精において精子の頭部前端にある小体（アクロソーム）の反応が受精の最初のステップで、精子が卵の透明帯を認識し進入する。次に、精子は卵の原形質膜に到着すると、透明帯が変性し他の精子の進入を防ぐ。そして、精子の原形質膜が卵のそれと融合して核が卵に入る。この際、β１，４−ガラクトース転移酵素が重要な役割を果たしていると考えられている。
【０００５】
このようにβ１，４−ガラクトース転移酵素は生体内において重要な役割を果たしているものと考えられるが、微量の酵素活性を簡便で迅速に測定することは容易でないことから、ノーザンブロッテイングなどによりｍＲＮＡの発現を確認している程度である。
【０００６】
これまで、β１，４−ガラクトース転移酵素の活性測定には該酵素から生成される反応生成物質の分離法、例えばイオンクロマトグラフィや高速液体クロマトグラフィにより得た糖授与体や糖供与体をアイソトープ或いは蛍光物資などで標識して行われてきた。また該酵素によるガラクトース転移反応において糖供与体であるウリジン−５’−二燐酸ガラクトースから生成するウリジン−５’−二燐酸をピルビン酸キナーゼ（pyruvate kinase)及び乳酸脱水酵素(lactate dehydrogenase）を用いて下記式のように反応させる。β−ＮＡＤＨからＮＡＤへの反応を波長３４０μｍの吸収を追うことにより単位時間当たりのガラクトース転移量を求め酵素活性を測定する方法がある。
【０００７】
【化１】
【０００８】
しかしながら、これらの方法は供与体である基質としてアイソトープ標識された糖ヌクレオチドは人体に危険であり、また通常長時間を要する欠点がある。他方糖受与体としてピリジルアミノ化された糖鎖（Biochemical., 第９５巻, 第１９７〜２０３頁，1984）、ＡＮＴＳ（8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid ) 、ＡＭＡＣ（2-aminoacridone ）などの１級アミノ基と２個のスルフォン酸基をもつ蛍光色素で標識された糖鎖(J.Biochm., 第２７０巻，第７０５〜７１３頁，1990）を用いる。
【０００９】
しかし、これらの標識した糖基質で酵素活性を測定する場合、供与体基質、受容体基質のいずれにおいても酵素反応で生成した物資を高速液体クロマトグラフィで分離して生成量を測定する必要がある。したがって、通常の多くの酵素活性測定のように直接反応液の生成物ｔを機器によって測定できないため非常に操作が煩雑で時間がかかるのが現状である。また、上記に示した反応で生成するＵＤＰを酵素的に測定する方法があるが、感度の点で問題がある。
【００１０】
蛍光標識した糖鎖を用いて酵素活性を測定する方法として、測定共鳴エネルギー移動法を用いる方法が開発されている。この方法は二重蛍光プローブを有する基質誘導体を作製し、蛍光エネルギー移動法という活性評価方法の有効性を利用することにより、酵素活性を測定する方法である。蛍光エネルギー移動法という活性評価方法の有効性とは、それぞれエネルギー供与体蛍光団、受容体蛍光団間の共鳴移動法による蛍光特性の消失性フィールドを利用することにより、Ｓ／Ｎ感度の向上を図ろうするものである。本発明者らは、特開平９−１７３０９６号公報において、既にこの原理を利用した糖転移酵素の活性測定方法を報告している。
【００１１】
しかしながら，これまでに具体的な例としては、Gal β１→4GlcNAc に蛍光物質を結合したオリゴ糖誘導体によりα２，６−シアリルトランスフェラーゼを測定することが示されているが、他の糖転移酵素の活性測定に有効で適切な蛍光標識された基質は報告されていない。特に、β１，４−ガラクトース転移酵素の酵素活性は適切な蛍光標識した糖供与体が合成できないため、蛍光エネルギー移動法に基づいた測定は不可能であった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的の一つは、ガラクトース転移酵素の活性測定に使用する蛍光標識糖受容体および蛍光標識糖供与体を提供することである。また、他の目的は、これらの基質を用いることにより、高感度で簡便にしてかつ短時間にガラクトース転移酵素活性を測定する方法並びにその測定用試薬提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述したように、糖転移酵素、特にガラクトース転移酵素を測定する上での問題点を解決するため、種々鋭意検討した結果、ガラクトース転移酵素活性測定に用いる新規な蛍光標識糖受容体基質および蛍光標識糖供与体基質の合成に成功した。そして、これらの基質を用いてガラクトース転移酵素反応により生成する２種の蛍光団（すなわち、供与体蛍光団および受容体蛍光団）を有する化合物の蛍光団間の共鳴移動による蛍光特性の変化を利用することにより、上記問題点を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）糖受容体である３−〔Ｎ−（５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル）アミノ〕プロピル２−アセトアミド３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドと、糖供与体であるウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−ｄ−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩を基質として糖転移反応をα−ラクトアルブミン存在下で行い、ナフチル基を励起させ、該励起により放出される蛍光波長によりダンシル基を励起させ、その蛍光強度を測定することを特徴とするβ１，４−ガラクトース転移酵素の糖転移酵素活性測定方法。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の基本的な原理は、共鳴エネルギー移動法をガラクトース転移酵素活性測定に応用することにある。つまり、ガラクトース転移酵素反応により蛍光物質を結合する糖供与体と異なる蛍光物質を結合する糖受容体から生成した反応生成物において、２種の蛍光物質を適当な光線で励起させ、該励起により放出される蛍光波長により他方の蛍光強度を測定することにより、糖転移酵素活性を測定するものである。
【００１６】
本発明における糖受容体とは、アセチルグルコサミンの還元末端にスペーサーを介して蛍光物質を結合させた糖誘導体（図１）もしくはスペーサーを介してアセチルグルコサミンを側鎖に持ち、かつ同様にスペーサーを介して蛍光物質を側鎖にもつアクリルアミドコポリマー（図２）であり、すなわち、糖供与体から放射された波長より励起される放射波長を有するエネルギーを受容する蛍光団基をもつ糖（例えば、ガラクトース）を受容する糖誘導体をいう。また、エネルギー供与と受容の相対関係は、糖受容体および糖供与体が逆であっても良い。
【００１７】
糖誘導体としては、例えば、糖が末端糖鎖がアセチルグルコサミンをスペーサーを介して蛍光物質を結合させた誘導体や（図１）、あるいはスペーサーを介してアセチルグルコサミンを側鎖に持ち、かつスペーサーを介して蛍光物質を側鎖にもつアクリルアミドコポリマーである（図２）。
【００１８】
このような糖受容体としては、下記に示される３−〔Ｎ−（５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル）アミノ〕プロピル２−アセトアミド−３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドなどが例示される。
【００１９】
【化２】
【００２０】
また、下記に示されるアクリルアミド、３−（Ｎ−アクリロイルアミノ）プロピル２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドおよびＮ−〔５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル〕−β−アラニンアリルアミドを反応させて合成されるアクリルアミドコポリマーなどが例示される。
【００２１】
【化３】
【００２２】
また、本発明における糖転移酵素反応の糖供与体とは、糖ヌクレオチド(sugarnucleotide）の糖質の第６位に蛍光物質を結合した糖ヌクレオチド誘導体である（図２）。すなわち、蛍光団をもつ糖転移酵素（例えば、ガラクトース転移酵素）特有の基質となる糖ヌクレオチド誘導体をいう。
【００２３】
糖ヌクレオチド誘導体としては、例えば、ウリジン−５’−〔６−フルオレセイニルチオウレイイド）デオキシ−６−ｄ−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェート（ＵＤＰ−（６−fluoresceinyl ）−Ｇａｌ）などがあり、。フルオレセイニル（fluoresceinyl ）基は、ダンシル（dansyl）基、ナフチル（naphtyl ）基、ピレニル（pyrenyl ）基などで代用される。
【００２４】
このような蛍光標識されたウリジンデオキシガラクトピラノシルジホスフェート（ＵＤＰ−ガラクトース）の例として、下記構造式を有するウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−ｄ−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩が挙げられる。
【００２５】
【化４】
【００２６】
本発明における糖受容体である糖誘導体に結合する蛍光物質Ｆ２の蛍光団基としては、ナフチル基、ピレニル基、ダンシル基、フルオレスカミン基などが挙げられる。
【００２７】
また、本発明における糖供与体である糖ヌクレオチドに結合する蛍光物質Ｆ１の蛍光団基としては，ナフチル基、ピレニル基、ダンシル基、フルオレスカミン基などが挙げられる。
【００２８】
本発明において、糖受容体の蛍光物質Ｆ２がダンシル基である場合、糖供与体の蛍光物質Ｆ１はナフチル基であることが好ましい。
【００２９】
本発明の基質の製造方法は、例えば、蛍光物質Ｆ２がダンシル基、蛍光物質Ｆ１がナフチル基である場合には、糖受容体としてＮ−アセチルグルコサミンの還元末端にスペーサーを介してアミノ基を導入し、これをダンシル基を有する蛍光物質を反応させて目的物を得、糖供与体としてはガラクトースの第６位にナフチル基を導入し、目的物質である上記ウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−ｄ−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩を得ることができる。
【００３０】
本発明における糖転移酵素を測定する方法とは、上記糖供与体および糖受容体に糖転移酵素を作用させ、生成した２種の異なる蛍光物質を有する化合物のいずれか一方の蛍光物質を紫外線で励起させ、該励起により放出される蛍光波長より、他方の蛍光強度を測定する糖転移酵素活性を測定するものである。その転移酵素反応条件は酵素の反応至適条件に従う。
【００３１】
蛍光物質を励起する条件および蛍光測定法は、例えば、Luminescence spectrometer LS50B(Perkin Elmer社製）にて、励起波長２８０ｎｍ、蛍光度測定を３１０〜６００ｎｍまで行う。蛍光度の測定は５０ｎｍＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中、３７℃、Scanspeed ５００ｎｍ／分、Slit size ５ｎｍで行う。糖転移反応は、例えば、上記緩衝液４．２ｍｌにβ１，４−ガラクトース転移酵素０．０５単位、糖供与体１０ｎｍｏｌ、糖受容体３００ｎｍｏｌ、及びα-lactosamineを含む反応液で行う。糖供与体と受容体の比は１：１０〜１：１００が望ましいが、特にこの範囲に限定されるものでない。
【００３２】
本発明の糖転移酵素活性測定用試薬組成物の態様としては、例えば、上記糖供与体および上記糖受容体、緩衝液ならびに酵素活性賦活剤を含むものが挙げられる。該緩衝液としては、糖転移酵素の反応に際して使用できるものであれば特に制限されるものではない。
【００３３】
共鳴エネルギー移動の現象は、２０世紀はじめPerrinにより観察されたが、Forster は１９４０年代後半に共鳴エネルギー移動により分子間相互作用を述べる理論を提唱し、発色酸の距離と発色団の光学的性質に関係づける移動速度式を導いた（Sinanoglu, O., Ed.，Modern Quantum Chemistry 第９３〜１３７頁）。
【００３４】
上記方法は改良され分子間平均距離は、共鳴エネルギー移動の測定により信頼するデータが得られるようになっている。通常、エネルギー移動の測定は、蛍光の検出を基本としているので、高感度を確保できる利点がある。エネルギー供与体と受容体間のForster 距離は、基本的には、(a) エネルギー供与体量子収量、(b) エネルギー供与体の蛍光放射スペクトラム、(c) エネルギー受容体の分子間吸光係数で測定出来るが、蛍光物質の溶液状況などを考慮する必要がある。
【００３５】
本発明では、糖転移酵素は糖供与体である糖ヌクレオチドから糖受容体に転移する酵素であるので、二つの適切な蛍光物質をこれらの両基質に酵素活性の阻害を起こすことなく標識すれば、酵素反応の途中の変化前後で両蛍光団物質の距離の変化に伴う蛍光放射の変化で酵素活性を測定できる。すなわち、蛍光エネルギー移動対はエネルギー供与体分子とエネルギー受容体分子からなり、該エネルギー供与体分子は第１放射波長を有し、そして該エネルギー受容体分子は第１放射波長により励起されることが出来、かつ第１放射波長と区別して検出可能な第２放射波長を有する蛍光発色基を有し、さらにこれらの糖供与体、糖受容体が酵素転移酵素反応を阻害しないものである。
【００３６】
本発明の原理および目的から、最も好ましい条件下では、上記の糖供与体および糖受容体を使用し、酵素反応が進行すれば、蛍光団をもつ糖が受容体に転移され蛍光エネルギー移動対のエネルギー供与分子およびエネルギー受容体分子は同一分子上に近接し、これによりForster の原理によるエネルギー移動を起こすことが出来る。また、蛍光団をもつ糖が受容体に転移され生成物の物性により転移された蛍光物質の強度が反応に進行するにつれて有意に変化することが観察されることがあるので、第１励起蛍光団の強度を直接モニターすることにより酵素活性を測定することが出来るものである。
【００３７】
上記のようにこれらの酵素反応液を励起し、特定的にはエネルギー供与蛍光団をその励起波長で励起し、そして受容体の放射波長を測定することにより、あるいは転移された供与体の蛍光強度を測定することにより試料中の酵素活性を定性的にあるいは定量的に測定することが出来る。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
【００３９】
実施例１
１．蛍光物質標識糖受容体の合成
中間体（Ｉ）の合成
Ｄ−グルコサミン塩酸塩１５６．６ｇ（０．７３ｍｏｌ）をピリジン５００ｍｌ中に懸濁し、トリエチルアミン１０２ｍｌ（０．７３ｍｏｌ）を加え塩酸塩を中和させた後、無水酢酸５００ｍｌ（約１．１ｍｏｌ）を加え一晩攪拌させた。溶液が透明になっているのを確認した後、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィ）で反応の終了を確認し、濃縮した。残渣にクロロホルム約０．５ｍｌを加え溶解させた後、脱イオン水、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、セライト濾過し濃縮後、残渣をエタノールに溶解し再結晶させた。結晶を濾過し、減圧下で乾燥させた。エタノール溶液は濃縮し、再度エタノールに溶解し再結晶させた。以上のようにして、２−アセトアミド−１，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノースを収量２５６ｇ、収率９０％で得た。
【００４０】
次に、この２−アセトアミド−１，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース５．０ｇ（１３ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン５０ｍｌに溶解し、６０℃でＴＭＳＯＴｆ（トリメチルシリルトリフルオロメタンスルフォネート）２．６ｍｌ（１３ｍｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認し、トリエチルアミン５．４ｍｌ（３８ｍｍｏｌ）を加え、ＴＭＳＯＴｆをクエンチした。その後、一度溶媒を完全に留去し、ジクロロメタン５０ｍｌに再度溶解した。
【００４１】
この溶液に３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロパノール８．０ｇ（３８ｍｍｏｌ）を加え、さらにＣＳＡ（（±）−しょうのう−１０−スルホン酸）を少量ずつｐＨが２〜３になるまで加え、７０℃で還流しながら４時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認し、反応液を室温まで冷し、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、セライト濾過し濃縮した。最後に残渣をシリカゲルクロマトグラフィで精製して（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝５０：１）、３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロピル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドを収量２．８ｇ、収量４０％で得た。
【００４２】
【化５】
【００４３】
３−〔Ｎ−（５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル）アミノ〕プロピル２−アセトアミド３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成
上記中間体（Ｉ）３００ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）をドライメタノール８ｍｌに溶解しナトリウムメトキシド１０ｍｇを加え、室温で一晩攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認し、イオン交換樹脂（ダウエックスＨ+ 型）で中和した。イオン交換樹脂を綿栓濾過で取り除き、濃縮する。
【００４４】
次に、残渣をメタノール８ｍｌに溶解し、Ｐｄ／Ｃ（パラジウム炭素）１００ｍｇを加え、水素雰囲気下室温で１時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認した後、セライト濾過して、さらに濃縮した。そして、残渣をドライメタノール５ｍｌに溶解し、トリエチルアミン９３μｌ（０．６７ｍｍｏｌ）ダンシルクロライド１５０ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）を加え、０℃で４時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認し、濃縮した。最後に、セファデックスＧ−１０（ファルマシアバイオテク製）を用いてゲル濾過（展開溶媒は脱イオン水）により精製した。収量２６７ｍｇ、収率１００％であった。
【００４５】
ＮＭＲ分析値（プロトンＮＭＲ）
H-1:4.10ppm （d,1H,J1,2 ＝8.8 Hz）
H-2:3.45ppm （t,1H,J2,3 ＝10.3Hz）
H-3:3.33ppm （t,1H,J3,4 ＝8.8Hz ）
H-5:3.56ppm （m,1H,J4,5 ＝11.0Hz，J5,6a ＝0.0Hz ，J5,6b ＝5.1Hz ）
3.21-3.28ppm（m,2H,H-4,H-6b ）
1.65ppm （s,3H,Ac ）
2.68ppm （s,6H,Dan's Me×２）
2.68-3.56ppm（m,6H, CH2 ×３）
7.21ppm （d,1H, NH）
7.49-8.33ppm（d ×３，dd×１，6H，Naph）
【００４６】
実施例２
２．蛍光物質標識糖受容体の合成
中間体（II）の合成
２−アセトアミド−１，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース５０ｇ（０．１３ｍｏｌ）をドライクロロホルム３００ｍｌに溶解し、０℃で無水酢酸５ｍｌ、３０％臭化水素−酢酸１１５ｍｌ（０．４５ｍｏｌ）を加え、徐々に室温に戻しながら２時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認したら、反応溶液を０℃に冷し、ピリジン６０ｍｌ（０．６４ｍｏｌ）を加え、徐々に室温に戻しながらさらに一晩攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認後、反応液を脱イオン水、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、セライト濾過し、濃縮した。
【００４７】
次に、残渣を１，２−ジクロロエタン２００ｍｌに溶解し、この溶液に３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロパノール１３．４ｇ（６４ｍｍｏｌ）を加え、さらにＣＳＡ（（±）−しょうのう−１０−スルホン酸）を少量ずつｐＨが２〜３になるまで加え、７０℃で還流しながら一晩攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認し、反応液を室温まで冷し、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、セライト濾過して濃縮した。最後に、残渣をシリカゲルクロマトグラフィで精製（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝５０：１）し、さらにエタノールで再結晶させ、３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロピル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドを収量１６．０ｇ、収率４６％で合成した。
【００４８】
【化６】
【００４９】
次に、３−（Ｎ−アクリロイルアミノ）プロピル２−アセトアミド−３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド１．９ｇ（３．５ｍｍｏｌ）をメタノール２０ｍｌに溶解し、Ｐｄ／Ｃ（パラジウム炭素）２００ｍｇを加え、水素雰囲気下室温で１時間攪拌した。ＴＬＣにより反応の終了を確認後、セライト濾過した後、さらに濃縮した。残渣をＴＨＦ（テトラヒドロフラン）６０ｍｌ−メタノール２５ｍｌの混合溶媒に溶解させ、０℃でトリエチルアミン０．５９ｍｌ（４．２ｍｍｏｌ）、アクリロイルクロライド０．３４ｍｌ（４．２ｍｍｏｌ）を加え、徐々に室温に戻しながら、２時間攪拌した。この際、ｐＨが酸性側に偏らないように少量ずつトリエチルアミンを加えた。
【００５０】
ＴＬＣにより反応の進行が良くないことが確認されたので、さらにアクリロイルクロライド０．５０ｍｌ（４．９ｍｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認した後、濃縮し、残渣をクロロホルムに溶解させ、重曹水と食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、セライト濾過を行い、さらに濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィで精製（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝３０：１）し、３−（Ｎ−アクリロイルアミノ）プロピル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドを、収量４９１ｍｇ、収率３１％で得た。
【００５１】
次に、３−（Ｎ−アクリロイルアミノ）プロピル２−アセトアミド−３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド４９１ｍｇ（１．０７ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍｌに溶解し、ナトリウムメトキシド１０ｍｇを加え、一晩攪拌した。そして、ＴＬＣで反応の終了を確認した後、イオン交換樹脂（ダウエックスＨ+ 型）で中和した。最後に、イオン交換樹脂を綿栓濾過で取り除き、濃縮し、収率１００％で３−（Ｎ−アクリロイルアミノ）プロピル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドを得た。
【００５２】
中間体（III ）の合成
上記に合成したＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−β−アラニン５．０ｇ（２６．４ｍｍｏｌ）とアリルアミン２．０ｍｌ（２６．７ｍｍｏｌ）をエタノール−ベンゼン（１：１）５０ｍｌ溶解し、ＥＥＤＱ（１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン）７．２ｇ（２９．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認した後、さらに濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィで精製（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝５０：１）し、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−β−アラニンアリルアミドを収量５．５ｇ、収率９２％で得た。
【００５３】
Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−β−アラニンアリルアミド５．５ｇを４Ｎ塩化水素ジオキサン溶液１５０ｍｌに溶解し、室温で一晩攪拌する。ＴＬＣにより反応の終了を確認した後、さらに濃縮し、エタノールで再結晶させた。収量３．０ｇ、収率８１％でβ−アラニンアクリルアミド塩酸塩を得た。
【００５４】
上記で合成したＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−β−アラニン塩酸塩１１４．６ｍｇ（０．７４ｍｍｏｌ）をドライメタノール５ｍｌに溶解し、０℃でトリエチルアミン０．２４ｍｌ（１．７２ｍｍｏｌ）とダンシルクロライド２００ｍｇ（０．７４ｍｍｏｌ）を加え、４時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィで精製（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝５０：１）し、Ｎ−〔５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル〕−β−アラニンアクリルアミドを収量１３３ｍｇ、収率５１％で合成した。
【００５５】
【化７】
【００５６】
アクリルアミドコポリマーの合成
３−（Ｎ−アクリロイルアミノ）プロピル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド１０．０ｍｇ（０．０３０ｍｍｏｌ）、微少量のメタノールに溶解したＮ−〔５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル〕−β−アラニンアクリルアミド１．０４ｍｇ（０．００３０ｍｍｏｌ）、アクリルアミド２１．３ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）を脱イオン水に溶解し、減圧下超音波をかけながら脱気した。さらに、脱気したメタノールを溶液が透明になるまで加え、ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルエチレンジアミン）２．００μｌ（０．０１３ｍｍｏｌ）とＡＰＳ（ペルオキソ二硫酸アンモニウム）１．２２ｍｇ（５．３ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下で一晩攪拌した。反応液をそのままゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）に供して精製し、アクリルアミドコポリマー１９．６ｍｇを、収率６１％で得た。
【００５７】
ＮＭＲ分析値（プロトンＮＭＲ）
H-1:4.41ppm （d,1H）
H-6a:3.35ppm（s,1H）
3.45-3.66ppm（m,3h,H-2,H-3,H-4）
3.82ppm （m,2H,H-5,H-6b ）
1.95ppm （s,3H,Ac ）
1.55-2.33ppm（m,CH2,CH）
7.61-8.42ppm（m,Naph）
【００５８】
積分値より、グルコサミン残基：アクリルアミド残基：ダンシル残基＝７．４７：９２．３７：０．１６と算出された。
【００５９】
13ＣＮＭＲ
C-1 101.97ppm
C-2 56.40ppm
C-3 74.61ppm
C-4 70.78ppm
C-5 76.82ppm
C-6 61.61ppm
35.27-37.04ppm（CH2 ）
42.21-42.99ppm（CH）
180.28ppm （CO）
【００６０】
実施例３
１．蛍光物質標識糖供与体の合成
中間体（IV）の合成
ガラクトース５００ｇをピリジン１．５ｍｌ／無水酢酸１．５ｍｌの混合溶媒に懸濁させ、一晩攪拌した。溶液が透明になっていることを確認した後、ＴＬＣで反応の終了を確認し、濃縮した。残渣にクロロホルム約１．５ｍｌを加え溶解させた後、脱イオン水、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、セライト濾過し濃縮後、残渣をエタノールに溶解し再結晶させた。結晶を濾過し、減圧下で乾燥させた。エタノール溶液は濃縮しそのまま保存した。収量１．０８ｋｇ、収率１００％で、１，２，３，４，６−ヘキサ−ｏ−アセチル−Ｄ−カラクトピラノースを得た。
【００６１】
次に、１，２，３，４，６−ヘキサ−ｏ−アセチル−Ｄ−カラクトピラノース１２．６ｇ（３２．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１３０ｍｌに溶解し、ベンジルアミン５．３０ｍｌ（４８．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌する。ＴＬＣで反応の終了を確認し、反応液を約３０ｍｌまで濃縮した。残渣にクロロホルム約１００ｍｌを加え、再び３０ｍｌまで濃縮した。残渣にクロロホルム約３００ｍｌを加え、１Ｎ塩酸、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、セライト濾過し、さらに濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィで精製（展開溶媒 トルエン：酢酸エチル＝５：１〜２：１）し、収率１００％で２，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチル−Ｄ−カラクトピラノースを得た。
【００６２】
次に、亜リン酸ジベンジル１．２９ｇ（４．９ｍｍｏｌ）をトルエン２０ｍｌに溶解し、Ｎ−クロロコハク酸イミド０．６６ｇ（４．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌する。ＴＬＣで反応の終了を確認した後、グラスフィルターで濾過し、濃縮した。残渣と２，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチル−Ｄ−カラクトピラノース０．５７ｇ（１．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ２０ｍｌに溶解し、７０℃で１．６Ｍ ｎ−ブチルリチウムヘキサン溶液１．０ｍｌ（１．６ｍｍｏｌ）を加えた。約２時間かけて徐々に反応溶液を４０℃まで上げ、ＴＬＣで反応の終了を確認した。反応液をクロロホルム約１００ｍｌで希釈し、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、セライト濾過し濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィで精製（展開溶媒 トルエン：酢酸エチル＝５：１）し、ジフェニル−２，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチル−α−Ｄ−カラクトピラノシルホスフェートを、収量０．５３ｇ、収率５０％で得た。
【００６３】
次に、ジフェニル−２，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチル−α−Ｄ−カラクトピラノシルホスフェート０．３０ｍｇ（０．４９ｍｍｏｌ）をメタノール５ｍｌに溶解し、Ｐｄ／Ｃ（パラジウム炭素）１００ｍｇを加え、水素雰囲気下室温で１時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認後、セライト濾過した後、さらに濃縮した。残渣をトリエチルアミン：メタノール：脱イオン水＝１．５ｍｌ：１０ｍｌ：４．６ｍｌの混合溶媒に溶解して、室温で１時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認した後、濃縮し、α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェート−ジ−ｎ−ブチルアンモニウム塩を収率１００％で合成した。
【００６４】
【化８】
【００６５】
中間体（Ｖ）の合成
中間体（IV）１１７ｍｇ（０．２５３ｍｍｏｌ）、カタラーゼ１ｍｇ及びガラクトースオキシデース２０ｍｇを０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍｌに溶解して、３０分振とうした。続いて、α−ナフチルアミン７０．９ｍｇ（０．５１ｍｍｏｌ）、アセトニトリル６ｍｌを加え、３０分振とうした。次に、α−ナフチルアミンが全て溶けるまでアセトニトリルを加え、さらに１時間振とうした。水素化シアノホウ素ナトリウム１６．４ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）を加え、５分間振とうし、脱イオン水１００ｍｌで希釈し、ジエチルエーテル、トルエンで洗浄した。水層を凍結乾燥し、結晶をセファデックスＧ−１０によるゲル濾過（展開溶媒 脱イオン水）を行うことにより精製した。さらに、陽イオン交換樹脂（ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８，ピリジニウムイオン型）カラム（直径０．５ｃｍ×長さ５．０ｃｍ）に通した後、ｎ−ブチルアミンを１４．７μｌ（６２μｍｏｌ）加えて濃縮し、ピリジンで３回共沸させ、６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェートを、収量２１ｍｇ、収率１５．３％で得た。
【００６６】
【化９】
【００６７】
ウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩の合成
ウリジン−５’−モノホスホモルホリデート−４−モルホリン−Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキシアミジン塩３４ｍｇ（５０μｍｏｌ）をピリジンで３回共沸させた。残渣と６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェ−ト−ジ−ｎ−ブチルアンモニウム塩２１ｍｇ（３９μｍｏｌ）をピリジン約５ｍｌに溶解させて、濃縮を行い、再度ピリジン３ｍｌに溶解し、一晩攪拌した。脱イオン水約５０ｍｌで希釈し、ジエチルエーテルで洗浄し、水層を凍結乾燥した。結晶を陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−セファセル、炭酸水素イオン型）を用いて精製（展開溶媒 ０．０５〜０．５Ｍ 炭酸水素アンモニウム水溶液）し、さらにセファデックスＧ−１０を用いて精製した。最後に、陽イオン交換樹脂（ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８，Ｎａ+ 型）を通し、濾液を凍結乾燥し、ウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−α−ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩を収量９．５ｍｇ、収率３３．６％で得た。
【００６８】
ＮＭＲ分析値
H-1':5.47ppm（d,1H,J1,P ＝8.0Hz,J1,2＝0.0Hz ）
H-4':4.99ppm（s,1H,J3,4 ＝0.0Hz,J4,5＝0.0Hz ）
3.73-4.77ppm（m,11H,H-2',H-3',H=5',H-6a',H-6b',H-1,H-2,H-3,H-4,H-5a,H-5b）
5.57-5.83ppm（m,2H,uridine）
6.98ppm （d,1H, NH-Naph ）
7.33-7.93ppm（m,8H,uridine）
【００６９】
中間体（IV）１０７ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）、カタラーゼ１ｍｇ及びガラクトースオキシデース１０ｍｇを０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍｌに溶解し、３０分振とうした。続いて、１−ナフチルメチルアミン６８μｌ（０．４６ｍｍｏｌ）、アセトニトリル６ｍｌを加え、３０分振とうした。次に、１−ナフチルメチルアミンが全て溶けるまでアセトニトリルを加え、さらに１時間振とうした。水素化シアノホウ素ナトリウム１５ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）を加え、５分間振とうし、脱イオン水１００ｍｌで希釈し、ジエチルエーテル、トルエンで洗浄した。水層を凍結乾燥し、結晶をセファデックスＧ−１０を用いたゲル濾過（展開溶媒 脱イオン水）により精製した。さらに、陽イオン交換樹脂（ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８，ピリジニウムイオン型）カラム（直径０．５ｃｍ×長さ５．０ｃｍ）に通した後、ｎ−ブチルアミンを１４．７μｌ（６２μｍｏｌ）加えて濃縮し、ピリジンで３回共沸させ、下記６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチルメチル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェートを、収量５５ｍｇ、収率４６％で得た。
【００７０】
【化１０】
【００７１】
ウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチルメチル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェート−ジナトリウム塩の合成
ウリジン−５’−モノホスホモルホリデート−４−モルホリン−Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキシアミジン塩２０ｍｇ（３７μｍｏｌ）をピリジンで３回共沸させた。残渣と６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチルメチル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェート−ジ−ｎ−ブチルアンモニウム塩１６ｍｇ（２９μｍｏｌ）をピリジン約５ｍｌに溶解させ、濃縮し、再度ピリジン３ｍｌに溶解し、一晩攪拌した。約５０ｍｌの脱イオン水で希釈し、ジエチルエーテルで洗浄し、水層を凍結乾燥した。結晶を陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−セファセル、炭酸水素イオン型）で２回精製し（展開溶媒 ０．０５〜０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液）、さらにセファデックスＧ−１０で２回精製した。最後に、陽イオン交換樹脂（ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８，Ｎａ+ 型）を通し、濾液を凍結乾燥し、ウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチルメチル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩を得た。
【００７２】
H-1': 5.55ppm （d,1H,J1,P ＝8.0Hz,J1,2＝0.0Hz ）
H-3': 4.26ppm （dd,1H ）
H-4': 5.08ppm （d,1H,J3,4 ＝2.9Hz,J4,5＝0.0Hz ）
H-5': 3.78ppm （m,1H）
4.06-4.13ppm（m,6H,H-2',H-6a',H-6b',リボース）
3.51ppm,4.72ppm （eachs,3H, リボース）
5.63-5.66ppm（m,2H，uridine ）
7.46-8.02ppm（m,8H，Naph，uridine ）
【００７３】
実施例４
糖供与体であるウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−ｄ−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩２．３８μＭおよび糖受容体である３−〔Ｎ−（５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル）アミノ〕プロピル２−アセトアミド３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドを７１．４２μＭおよびα−ラクトアルブミン９．５２μｇ／ｍｌおよびβ１，４−ガラクト−ス転移酵素０．０５単位からなる反応液４．２ｍｌ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液；ｐＨ７．０）の条件で３７℃にて作用させ、反応液を経時的に蛍光物質を励起させ蛍光強度を測定した。
【００７４】
該蛍光物質を励起する条件および蛍光強度の測定については、Luminescence spectorphotometer LS50B（Perkin Elmer社製）にて励起させ、蛍光測定は３１０〜５７０ｎｍまで行った。図３のように、ナフチル基は４３０ｎｍで放射されその結果ダンシル基が励起され放射蛍光が５３０ｎｍで検出された。また、ナフチル基による４３０ｎｍの蛍光強度の変化が観察された。
【００７５】
【発明の効果】
上述したように、本発明における基質を用いた測定方法においては、非特異性バックグラウンドはＳ／Ｎ比を低下させるが、適切な緩衝剤および試薬および蛍光物質の組合せを選択することにより減少あるいは排除することが出来る。さらに、本発明の測定方法によると、ガラクトース転移酵素の生産物を高速液体クロマトグラフィなどで分離することなく酵素活性を高感度で測定することができるので、簡単にしてかつ短時間で測定できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の糖受容体誘導体の模式図を示す。
【図２】本発明の糖供与体誘導体の模式図を示す。
【図３】ガラクトース転移酵素反応液における蛍光スペクトラムを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、糖転移酵素、特にガラクトース転移酵素活性において、基質として使用する新規な基質および該基質を利用する糖転移酵素活性測定法ならびにその測定用試薬に関する。さらに詳細には、より優れた信号体雑音比および高感度、簡便性を有する糖転移酵素活性測定用基質、該基質を使用する測定法ならびにその測定用試薬組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
グルコース転移酵素、ガラクトース転移酵素、アセチルガラクトース転移酵素、アセチルグルコサミン転移酵素、アセチルノイラミン酸転移酵素、フコース転移酵素などの糖転移酵素は、糖を含む糖化合物の糖残基に特定の糖ヌクレオチドを供与体として糖残基を転移する作用を有する酵素であり、多くの糖複合体（Glyococonjugate)の糖部分の生合成に関与している。近年、細胞由来の多くの糖転移酵素がヒト、ブタ、ウサギや微生物などから分離されている。
【０００３】
特に、β１，４ガラクトース転移酵素は１種類しか存在しないと考えられてきたが、従来から知られているβ１，４−ガラクトース転移酵素Ｉの他に、遺伝子の塩基配列、アミノ酸配列、臓器発現が異なるβ１，４−ガラクトース転移酵素II，III ，IVが見出されている。マウスの泌乳期で１，４−ガラクトース転移酵素ＩとIVの発現量の挙動が異なることが知られている。また、成人の脳においても４種の酵素のｍＲＮＡの発現量に関して１，４−ガラクトース転移酵素IVのｍＲＮＡは存在するが、他の３種類の酵素のｍＲＮＡは検出されていない。マウスの個体発生過程に脳でのｍＲＮＡに発現の仕方は異なり、神経組織形成に関与していると言われている。
【０００４】
また、受精において精子の頭部前端にある小体（アクロソーム）の反応が受精の最初のステップで、精子が卵の透明帯を認識し進入する。次に、精子は卵の原形質膜に到着すると、透明帯が変性し他の精子の進入を防ぐ。そして、精子の原形質膜が卵のそれと融合して核が卵に入る。この際、β１，４−ガラクトース転移酵素が重要な役割を果たしていると考えられている。
【０００５】
このようにβ１，４−ガラクトース転移酵素は生体内において重要な役割を果たしているものと考えられるが、微量の酵素活性を簡便で迅速に測定することは容易でないことから、ノーザンブロッテイングなどによりｍＲＮＡの発現を確認している程度である。
【０００６】
これまで、β１，４−ガラクトース転移酵素の活性測定には該酵素から生成される反応生成物質の分離法、例えばイオンクロマトグラフィや高速液体クロマトグラフィにより得た糖授与体や糖供与体をアイソトープ或いは蛍光物資などで標識して行われてきた。また該酵素によるガラクトース転移反応において糖供与体であるウリジン−５’−二燐酸ガラクトースから生成するウリジン−５’−二燐酸をピルビン酸キナーゼ（pyruvate kinase)及び乳酸脱水酵素(lactate dehydrogenase）を用いて下記式のように反応させる。β−ＮＡＤＨからＮＡＤへの反応を波長３４０μｍの吸収を追うことにより単位時間当たりのガラクトース転移量を求め酵素活性を測定する方法がある。
【０００７】
【化１】
しかしながら、これらの方法は供与体である基質としてアイソトープ標識された糖ヌクレオチドは人体に危険であり、また通常長時間を要する欠点がある。他方糖受与体としてピリジルアミノ化された糖鎖（Biochemical., 第９５巻, 第１９７〜２０３頁，1984）、ＡＮＴＳ（8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid ) 、ＡＭＡＣ（2-aminoacridone ）などの１級アミノ基と２個のスルフォン酸基をもつ蛍光色素で標識された糖鎖(J.Biochm., 第２７０巻，第７０５〜７１３頁，1990）を用いる。
【０００９】
しかし、これらの標識した糖基質で酵素活性を測定する場合、供与体基質、受容体基質のいずれにおいても酵素反応で生成した物資を高速液体クロマトグラフィで分離して生成量を測定する必要がある。したがって、通常の多くの酵素活性測定のように直接反応液の生成物ｔを機器によって測定できないため非常に操作が煩雑で時間がかかるのが現状である。また、上記に示した反応で生成するＵＤＰを酵素的に測定する方法があるが、感度の点で問題がある。
【００１０】
蛍光標識した糖鎖を用いて酵素活性を測定する方法として、測定共鳴エネルギー移動法を用いる方法が開発されている。この方法は二重蛍光プローブを有する基質誘導体を作製し、蛍光エネルギー移動法という活性評価方法の有効性を利用することにより、酵素活性を測定する方法である。蛍光エネルギー移動法という活性評価方法の有効性とは、それぞれエネルギー供与体蛍光団、受容体蛍光団間の共鳴移動法による蛍光特性の消失性フィールドを利用することにより、Ｓ／Ｎ感度の向上を図ろうするものである。本発明者らは、特開平９−１７３０９６号公報において、既にこの原理を利用した糖転移酵素の活性測定方法を報告している。
【００１１】
しかしながら，これまでに具体的な例としては、Gal β１→4GlcNAc に蛍光物質を結合したオリゴ糖誘導体によりα２，６−シアリルトランスフェラーゼを測定することが示されているが、他の糖転移酵素の活性測定に有効で適切な蛍光標識された基質は報告されていない。特に、β１，４−ガラクトース転移酵素の酵素活性は適切な蛍光標識した糖供与体が合成できないため、蛍光エネルギー移動法に基づいた測定は不可能であった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的の一つは、ガラクトース転移酵素の活性測定に使用する蛍光標識糖受容体および蛍光標識糖供与体を提供することである。また、他の目的は、これらの基質を用いることにより、高感度で簡便にしてかつ短時間にガラクトース転移酵素活性を測定する方法並びにその測定用試薬提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述したように、糖転移酵素、特にガラクトース転移酵素を測定する上での問題点を解決するため、種々鋭意検討した結果、ガラクトース転移酵素活性測定に用いる新規な蛍光標識糖受容体基質および蛍光標識糖供与体基質の合成に成功した。そして、これらの基質を用いてガラクトース転移酵素反応により生成する２種の蛍光団（すなわち、供与体蛍光団および受容体蛍光団）を有する化合物の蛍光団間の共鳴移動による蛍光特性の変化を利用することにより、上記問題点を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）糖受容体である３−〔Ｎ−（５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル）アミノ〕プロピル２−アセトアミド３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドと、糖供与体であるウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−ｄ−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩を基質として糖転移反応をα−ラクトアルブミン存在下で行い、ナフチル基を励起させ、該励起により放出される蛍光波長によりダンシル基を励起させ、その蛍光強度を測定することを特徴とするβ１，４−ガラクトース転移酵素の糖転移酵素活性測定方法。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の基本的な原理は、共鳴エネルギー移動法をガラクトース転移酵素活性測定に応用することにある。つまり、ガラクトース転移酵素反応により蛍光物質を結合する糖供与体と異なる蛍光物質を結合する糖受容体から生成した反応生成物において、２種の蛍光物質を適当な光線で励起させ、該励起により放出される蛍光波長により他方の蛍光強度を測定することにより、糖転移酵素活性を測定するものである。
【００１６】
本発明における糖受容体とは、アセチルグルコサミンの還元末端にスペーサーを介して蛍光物質を結合させた糖誘導体（図１）もしくはスペーサーを介してアセチルグルコサミンを側鎖に持ち、かつ同様にスペーサーを介して蛍光物質を側鎖にもつアクリルアミドコポリマー（図２）であり、すなわち、糖供与体から放射された波長より励起される放射波長を有するエネルギーを受容する蛍光団基をもつ糖（例えば、ガラクトース）を受容する糖誘導体をいう。また、エネルギー供与と受容の相対関係は、糖受容体および糖供与体が逆であっても良い。
【００１７】
糖誘導体としては、例えば、糖が末端糖鎖がアセチルグルコサミンをスペーサーを介して蛍光物質を結合させた誘導体や（図１）、あるいはスペーサーを介してアセチルグルコサミンを側鎖に持ち、かつスペーサーを介して蛍光物質を側鎖にもつアクリルアミドコポリマーである（図２）。
【００１８】
このような糖受容体としては、下記に示される３−〔Ｎ−（５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル）アミノ〕プロピル２−アセトアミド−３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドなどが例示される。
【００１９】
【化２】
また、下記に示されるアクリルアミド、３−（Ｎ−アクリロイルアミノ）プロピル２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドおよびＮ−〔５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル〕−β−アラニンアリルアミドを反応させて合成されるアクリルアミドコポリマーなどが例示される。
【００２１】
【化３】
また、本発明における糖転移酵素反応の糖供与体とは、糖ヌクレオチド(sugarnucleotide）の糖質の第６位に蛍光物質を結合した糖ヌクレオチド誘導体である（図２）。すなわち、蛍光団をもつ糖転移酵素（例えば、ガラクトース転移酵素）特有の基質となる糖ヌクレオチド誘導体をいう。
【００２３】
糖ヌクレオチド誘導体としては、例えば、ウリジン−５’−〔６−フルオレセイニルチオウレイイド）デオキシ−６−ｄ−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェート（ＵＤＰ−（６−fluoresceinyl ）−Ｇａｌ）などがあり、。フルオレセイニル（fluoresceinyl ）基は、ダンシル（dansyl）基、ナフチル（naphtyl ）基、ピレニル（pyrenyl ）基などで代用される。
【００２４】
このような蛍光標識されたウリジンデオキシガラクトピラノシルジホスフェート（ＵＤＰ−ガラクトース）の例として、下記構造式を有するウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−ｄ−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩が挙げられる。
【００２５】
【化４】
本発明における糖受容体である糖誘導体に結合する蛍光物質Ｆ２の蛍光団基としては、ナフチル基、ピレニル基、ダンシル基、フルオレスカミン基などが挙げられる。
【００２７】
また、本発明における糖供与体である糖ヌクレオチドに結合する蛍光物質Ｆ１の蛍光団基としては，ナフチル基、ピレニル基、ダンシル基、フルオレスカミン基などが挙げられる。
【００２８】
本発明において、糖受容体の蛍光物質Ｆ２がダンシル基である場合、糖供与体の蛍光物質Ｆ１はナフチル基であることが好ましい。
【００２９】
本発明の基質の製造方法は、例えば、蛍光物質Ｆ２がダンシル基、蛍光物質Ｆ１がナフチル基である場合には、糖受容体としてＮ−アセチルグルコサミンの還元末端にスペーサーを介してアミノ基を導入し、これをダンシル基を有する蛍光物質を反応させて目的物を得、糖供与体としてはガラクトースの第６位にナフチル基を導入し、目的物質である上記ウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−ｄ−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩を得ることができる。
【００３０】
本発明における糖転移酵素を測定する方法とは、上記糖供与体および糖受容体に糖転移酵素を作用させ、生成した２種の異なる蛍光物質を有する化合物のいずれか一方の蛍光物質を紫外線で励起させ、該励起により放出される蛍光波長より、他方の蛍光強度を測定する糖転移酵素活性を測定するものである。その転移酵素反応条件は酵素の反応至適条件に従う。
【００３１】
蛍光物質を励起する条件および蛍光測定法は、例えば、Luminescence spectrometer LS50B(Perkin Elmer社製）にて、励起波長２８０ｎｍ、蛍光度測定を３１０〜６００ｎｍまで行う。蛍光度の測定は５０ｎｍＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中、３７℃、Scanspeed ５００ｎｍ／分、Slit size ５ｎｍで行う。糖転移反応は、例えば、上記緩衝液４．２ｍｌにβ１，４−ガラクトース転移酵素０．０５単位、糖供与体１０ｎｍｏｌ、糖受容体３００ｎｍｏｌ、及びα-lactosamineを含む反応液で行う。糖供与体と受容体の比は１：１０〜１：１００が望ましいが、特にこの範囲に限定されるものでない。
【００３２】
本発明の糖転移酵素活性測定用試薬組成物の態様としては、例えば、上記糖供与体および上記糖受容体、緩衝液ならびに酵素活性賦活剤を含むものが挙げられる。該緩衝液としては、糖転移酵素の反応に際して使用できるものであれば特に制限されるものではない。
【００３３】
共鳴エネルギー移動の現象は、２０世紀はじめPerrinにより観察されたが、Forster は１９４０年代後半に共鳴エネルギー移動により分子間相互作用を述べる理論を提唱し、発色酸の距離と発色団の光学的性質に関係づける移動速度式を導いた（Sinanoglu, O., Ed.，Modern Quantum Chemistry 第９３〜１３７頁）。
【００３４】
上記方法は改良され分子間平均距離は、共鳴エネルギー移動の測定により信頼するデータが得られるようになっている。通常、エネルギー移動の測定は、蛍光の検出を基本としているので、高感度を確保できる利点がある。エネルギー供与体と受容体間のForster 距離は、基本的には、(a) エネルギー供与体量子収量、(b) エネルギー供与体の蛍光放射スペクトラム、(c) エネルギー受容体の分子間吸光係数で測定出来るが、蛍光物質の溶液状況などを考慮する必要がある。
【００３５】
本発明では、糖転移酵素は糖供与体である糖ヌクレオチドから糖受容体に転移する酵素であるので、二つの適切な蛍光物質をこれらの両基質に酵素活性の阻害を起こすことなく標識すれば、酵素反応の途中の変化前後で両蛍光団物質の距離の変化に伴う蛍光放射の変化で酵素活性を測定できる。すなわち、蛍光エネルギー移動対はエネルギー供与体分子とエネルギー受容体分子からなり、該エネルギー供与体分子は第１放射波長を有し、そして該エネルギー受容体分子は第１放射波長により励起されることが出来、かつ第１放射波長と区別して検出可能な第２放射波長を有する蛍光発色基を有し、さらにこれらの糖供与体、糖受容体が酵素転移酵素反応を阻害しないものである。
【００３６】
本発明の原理および目的から、最も好ましい条件下では、上記の糖供与体および糖受容体を使用し、酵素反応が進行すれば、蛍光団をもつ糖が受容体に転移され蛍光エネルギー移動対のエネルギー供与分子およびエネルギー受容体分子は同一分子上に近接し、これによりForster の原理によるエネルギー移動を起こすことが出来る。また、蛍光団をもつ糖が受容体に転移され生成物の物性により転移された蛍光物質の強度が反応に進行するにつれて有意に変化することが観察されることがあるので、第１励起蛍光団の強度を直接モニターすることにより酵素活性を測定することが出来るものである。
【００３７】
上記のようにこれらの酵素反応液を励起し、特定的にはエネルギー供与蛍光団をその励起波長で励起し、そして受容体の放射波長を測定することにより、あるいは転移された供与体の蛍光強度を測定することにより試料中の酵素活性を定性的にあるいは定量的に測定することが出来る。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
【００３９】
実施例１
１．蛍光物質標識糖受容体の合成
中間体（Ｉ）の合成
Ｄ−グルコサミン塩酸塩１５６．６ｇ（０．７３ｍｏｌ）をピリジン５００ｍｌ中に懸濁し、トリエチルアミン１０２ｍｌ（０．７３ｍｏｌ）を加え塩酸塩を中和させた後、無水酢酸５００ｍｌ（約１．１ｍｏｌ）を加え一晩攪拌させた。溶液が透明になっているのを確認した後、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィ）で反応の終了を確認し、濃縮した。残渣にクロロホルム約０．５ｍｌを加え溶解させた後、脱イオン水、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、セライト濾過し濃縮後、残渣をエタノールに溶解し再結晶させた。結晶を濾過し、減圧下で乾燥させた。エタノール溶液は濃縮し、再度エタノールに溶解し再結晶させた。以上のようにして、２−アセトアミド−１，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノースを収量２５６ｇ、収率９０％で得た。
【００４０】
次に、この２−アセトアミド−１，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース５．０ｇ（１３ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン５０ｍｌに溶解し、６０℃でＴＭＳＯＴｆ（トリメチルシリルトリフルオロメタンスルフォネート）２．６ｍｌ（１３ｍｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認し、トリエチルアミン５．４ｍｌ（３８ｍｍｏｌ）を加え、ＴＭＳＯＴｆをクエンチした。その後、一度溶媒を完全に留去し、ジクロロメタン５０ｍｌに再度溶解した。
【００４１】
この溶液に３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロパノール８．０ｇ（３８ｍｍｏｌ）を加え、さらにＣＳＡ（（±）−しょうのう−１０−スルホン酸）を少量ずつｐＨが２〜３になるまで加え、７０℃で還流しながら４時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認し、反応液を室温まで冷し、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、セライト濾過し濃縮した。最後に残渣をシリカゲルクロマトグラフィで精製して（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝５０：１）、３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロピル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドを収量２．８ｇ、収量４０％で得た。
【００４２】
【化５】
３−〔Ｎ−（５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル）アミノ〕プロピル２−アセトアミド３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成
上記中間体（Ｉ）３００ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）をドライメタノール８ｍｌに溶解しナトリウムメトキシド１０ｍｇを加え、室温で一晩攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認し、イオン交換樹脂（ダウエックスＨ+ 型）で中和した。イオン交換樹脂を綿栓濾過で取り除き、濃縮する。
【００４４】
次に、残渣をメタノール８ｍｌに溶解し、Ｐｄ／Ｃ（パラジウム炭素）１００ｍｇを加え、水素雰囲気下室温で１時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認した後、セライト濾過して、さらに濃縮した。そして、残渣をドライメタノール５ｍｌに溶解し、トリエチルアミン９３μｌ（０．６７ｍｍｏｌ）ダンシルクロライド１５０ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）を加え、０℃で４時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認し、濃縮した。最後に、セファデックスＧ−１０（ファルマシアバイオテク製）を用いてゲル濾過（展開溶媒は脱イオン水）により精製した。収量２６７ｍｇ、収率１００％であった。
【００４５】
ＮＭＲ分析値（プロトンＮＭＲ）
H-1:4.10ppm （d,1H,J1,2 ＝8.8 Hz）
H-2:3.45ppm （t,1H,J2,3 ＝10.3Hz）
H-3:3.33ppm （t,1H,J3,4 ＝8.8Hz ）
H-5:3.56ppm （m,1H,J4,5 ＝11.0Hz，J5,6a ＝0.0Hz ，J5,6b ＝5.1Hz ）
3.21-3.28ppm（m,2H,H-4,H-6b ）
1.65ppm （s,3H,Ac ）
2.68ppm （s,6H,Dan's Me×２）
2.68-3.56ppm（m,6H, CH2 ×３）
7.21ppm （d,1H, NH）
7.49-8.33ppm（d ×３，dd×１，6H，Naph）
【００４６】
実施例２
２．蛍光物質標識糖受容体の合成
中間体（II）の合成
２−アセトアミド−１，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノース５０ｇ（０．１３ｍｏｌ）をドライクロロホルム３００ｍｌに溶解し、０℃で無水酢酸５ｍｌ、３０％臭化水素−酢酸１１５ｍｌ（０．４５ｍｏｌ）を加え、徐々に室温に戻しながら２時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認したら、反応溶液を０℃に冷し、ピリジン６０ｍｌ（０．６４ｍｏｌ）を加え、徐々に室温に戻しながらさらに一晩攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認後、反応液を脱イオン水、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、セライト濾過し、濃縮した。
【００４７】
次に、残渣を１，２−ジクロロエタン２００ｍｌに溶解し、この溶液に３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロパノール１３．４ｇ（６４ｍｍｏｌ）を加え、さらにＣＳＡ（（±）−しょうのう−１０−スルホン酸）を少量ずつｐＨが２〜３になるまで加え、７０℃で還流しながら一晩攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認し、反応液を室温まで冷し、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、セライト濾過して濃縮した。最後に、残渣をシリカゲルクロマトグラフィで精製（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝５０：１）し、さらにエタノールで再結晶させ、３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノ）プロピル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドを収量１６．０ｇ、収率４６％で合成した。
【００４８】
【化６】
次に、３−（Ｎ−アクリロイルアミノ）プロピル２−アセトアミド−３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド１．９ｇ（３．５ｍｍｏｌ）をメタノール２０ｍｌに溶解し、Ｐｄ／Ｃ（パラジウム炭素）２００ｍｇを加え、水素雰囲気下室温で１時間攪拌した。ＴＬＣにより反応の終了を確認後、セライト濾過した後、さらに濃縮した。残渣をＴＨＦ（テトラヒドロフラン）６０ｍｌ−メタノール２５ｍｌの混合溶媒に溶解させ、０℃でトリエチルアミン０．５９ｍｌ（４．２ｍｍｏｌ）、アクリロイルクロライド０．３４ｍｌ（４．２ｍｍｏｌ）を加え、徐々に室温に戻しながら、２時間攪拌した。この際、ｐＨが酸性側に偏らないように少量ずつトリエチルアミンを加えた。
【００５０】
ＴＬＣにより反応の進行が良くないことが確認されたので、さらにアクリロイルクロライド０．５０ｍｌ（４．９ｍｍｏｌ）を加え、２時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認した後、濃縮し、残渣をクロロホルムに溶解させ、重曹水と食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、セライト濾過を行い、さらに濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィで精製（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝３０：１）し、３−（Ｎ−アクリロイルアミノ）プロピル−２−アセトアミド−３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドを、収量４９１ｍｇ、収率３１％で得た。
【００５１】
次に、３−（Ｎ−アクリロイルアミノ）プロピル２−アセトアミド−３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド４９１ｍｇ（１．０７ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍｌに溶解し、ナトリウムメトキシド１０ｍｇを加え、一晩攪拌した。そして、ＴＬＣで反応の終了を確認した後、イオン交換樹脂（ダウエックスＨ+ 型）で中和した。最後に、イオン交換樹脂を綿栓濾過で取り除き、濃縮し、収率１００％で３−（Ｎ−アクリロイルアミノ）プロピル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドを得た。
【００５２】
中間体（III ）の合成
上記に合成したＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−β−アラニン５．０ｇ（２６．４ｍｍｏｌ）とアリルアミン２．０ｍｌ（２６．７ｍｍｏｌ）をエタノール−ベンゼン（１：１）５０ｍｌ溶解し、ＥＥＤＱ（１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン）７．２ｇ（２９．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認した後、さらに濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィで精製（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝５０：１）し、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−β−アラニンアリルアミドを収量５．５ｇ、収率９２％で得た。
【００５３】
Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−β−アラニンアリルアミド５．５ｇを４Ｎ塩化水素ジオキサン溶液１５０ｍｌに溶解し、室温で一晩攪拌する。ＴＬＣにより反応の終了を確認した後、さらに濃縮し、エタノールで再結晶させた。収量３．０ｇ、収率８１％でβ−アラニンアクリルアミド塩酸塩を得た。
【００５４】
上記で合成したＮ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−β−アラニン塩酸塩１１４．６ｍｇ（０．７４ｍｍｏｌ）をドライメタノール５ｍｌに溶解し、０℃でトリエチルアミン０．２４ｍｌ（１．７２ｍｍｏｌ）とダンシルクロライド２００ｍｇ（０．７４ｍｍｏｌ）を加え、４時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィで精製（展開溶媒 クロロホルム：メタノール＝５０：１）し、Ｎ−〔５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル〕−β−アラニンアクリルアミドを収量１３３ｍｇ、収率５１％で合成した。
【００５５】
【化７】
アクリルアミドコポリマーの合成
３−（Ｎ−アクリロイルアミノ）プロピル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド１０．０ｍｇ（０．０３０ｍｍｏｌ）、微少量のメタノールに溶解したＮ−〔５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル〕−β−アラニンアクリルアミド１．０４ｍｇ（０．００３０ｍｍｏｌ）、アクリルアミド２１．３ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）を脱イオン水に溶解し、減圧下超音波をかけながら脱気した。さらに、脱気したメタノールを溶液が透明になるまで加え、ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルエチレンジアミン）２．００μｌ（０．０１３ｍｍｏｌ）とＡＰＳ（ペルオキソ二硫酸アンモニウム）１．２２ｍｇ（５．３ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下で一晩攪拌した。反応液をそのままゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）に供して精製し、アクリルアミドコポリマー１９．６ｍｇを、収率６１％で得た。
【００５７】
ＮＭＲ分析値（プロトンＮＭＲ）
H-1:4.41ppm （d,1H）
H-6a:3.35ppm（s,1H）
3.45-3.66ppm（m,3h,H-2,H-3,H-4）
3.82ppm （m,2H,H-5,H-6b ）
1.95ppm （s,3H,Ac ）
1.55-2.33ppm（m,CH2,CH）
7.61-8.42ppm（m,Naph）
【００５８】
積分値より、グルコサミン残基：アクリルアミド残基：ダンシル残基＝７．４７：９２．３７：０．１６と算出された。
【００５９】
13ＣＮＭＲ
C-1 101.97ppm
C-2 56.40ppm
C-3 74.61ppm
C-4 70.78ppm
C-5 76.82ppm
C-6 61.61ppm
35.27-37.04ppm（CH2 ）
42.21-42.99ppm（CH）
180.28ppm （CO）
【００６０】
実施例３
１．蛍光物質標識糖供与体の合成
中間体（IV）の合成
ガラクトース５００ｇをピリジン１．５ｍｌ／無水酢酸１．５ｍｌの混合溶媒に懸濁させ、一晩攪拌した。溶液が透明になっていることを確認した後、ＴＬＣで反応の終了を確認し、濃縮した。残渣にクロロホルム約１．５ｍｌを加え溶解させた後、脱イオン水、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、セライト濾過し濃縮後、残渣をエタノールに溶解し再結晶させた。結晶を濾過し、減圧下で乾燥させた。エタノール溶液は濃縮しそのまま保存した。収量１．０８ｋｇ、収率１００％で、１，２，３，４，６−ヘキサ−ｏ−アセチル−Ｄ−カラクトピラノースを得た。
【００６１】
次に、１，２，３，４，６−ヘキサ−ｏ−アセチル−Ｄ−カラクトピラノース１２．６ｇ（３２．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１３０ｍｌに溶解し、ベンジルアミン５．３０ｍｌ（４８．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌する。ＴＬＣで反応の終了を確認し、反応液を約３０ｍｌまで濃縮した。残渣にクロロホルム約１００ｍｌを加え、再び３０ｍｌまで濃縮した。残渣にクロロホルム約３００ｍｌを加え、１Ｎ塩酸、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、セライト濾過し、さらに濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィで精製（展開溶媒 トルエン：酢酸エチル＝５：１〜２：１）し、収率１００％で２，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチル−Ｄ−カラクトピラノースを得た。
【００６２】
次に、亜リン酸ジベンジル１．２９ｇ（４．９ｍｍｏｌ）をトルエン２０ｍｌに溶解し、Ｎ−クロロコハク酸イミド０．６６ｇ（４．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌する。ＴＬＣで反応の終了を確認した後、グラスフィルターで濾過し、濃縮した。残渣と２，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチル−Ｄ−カラクトピラノース０．５７ｇ（１．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ２０ｍｌに溶解し、７０℃で１．６Ｍ ｎ−ブチルリチウムヘキサン溶液１．０ｍｌ（１．６ｍｍｏｌ）を加えた。約２時間かけて徐々に反応溶液を４０℃まで上げ、ＴＬＣで反応の終了を確認した。反応液をクロロホルム約１００ｍｌで希釈し、重曹水、食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた後、セライト濾過し濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィで精製（展開溶媒 トルエン：酢酸エチル＝５：１）し、ジフェニル−２，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチル−α−Ｄ−カラクトピラノシルホスフェートを、収量０．５３ｇ、収率５０％で得た。
【００６３】
次に、ジフェニル−２，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチル−α−Ｄ−カラクトピラノシルホスフェート０．３０ｍｇ（０．４９ｍｍｏｌ）をメタノール５ｍｌに溶解し、Ｐｄ／Ｃ（パラジウム炭素）１００ｍｇを加え、水素雰囲気下室温で１時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認後、セライト濾過した後、さらに濃縮した。残渣をトリエチルアミン：メタノール：脱イオン水＝１．５ｍｌ：１０ｍｌ：４．６ｍｌの混合溶媒に溶解して、室温で１時間攪拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認した後、濃縮し、α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェート−ジ−ｎ−ブチルアンモニウム塩を収率１００％で合成した。
【００６４】
【化８】
中間体（Ｖ）の合成
中間体（IV）１１７ｍｇ（０．２５３ｍｍｏｌ）、カタラーゼ１ｍｇ及びガラクトースオキシデース２０ｍｇを０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍｌに溶解して、３０分振とうした。続いて、α−ナフチルアミン７０．９ｍｇ（０．５１ｍｍｏｌ）、アセトニトリル６ｍｌを加え、３０分振とうした。次に、α−ナフチルアミンが全て溶けるまでアセトニトリルを加え、さらに１時間振とうした。水素化シアノホウ素ナトリウム１６．４ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）を加え、５分間振とうし、脱イオン水１００ｍｌで希釈し、ジエチルエーテル、トルエンで洗浄した。水層を凍結乾燥し、結晶をセファデックスＧ−１０によるゲル濾過（展開溶媒 脱イオン水）を行うことにより精製した。さらに、陽イオン交換樹脂（ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８，ピリジニウムイオン型）カラム（直径０．５ｃｍ×長さ５．０ｃｍ）に通した後、ｎ−ブチルアミンを１４．７μｌ（６２μｍｏｌ）加えて濃縮し、ピリジンで３回共沸させ、６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェートを、収量２１ｍｇ、収率１５．３％で得た。
【００６６】
【化９】
ウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩の合成
ウリジン−５’−モノホスホモルホリデート−４−モルホリン−Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキシアミジン塩３４ｍｇ（５０μｍｏｌ）をピリジンで３回共沸させた。残渣と６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェ−ト−ジ−ｎ−ブチルアンモニウム塩２１ｍｇ（３９μｍｏｌ）をピリジン約５ｍｌに溶解させて、濃縮を行い、再度ピリジン３ｍｌに溶解し、一晩攪拌した。脱イオン水約５０ｍｌで希釈し、ジエチルエーテルで洗浄し、水層を凍結乾燥した。結晶を陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−セファセル、炭酸水素イオン型）を用いて精製（展開溶媒 ０．０５〜０．５Ｍ 炭酸水素アンモニウム水溶液）し、さらにセファデックスＧ−１０を用いて精製した。最後に、陽イオン交換樹脂（ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８，Ｎａ+ 型）を通し、濾液を凍結乾燥し、ウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−α−ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩を収量９．５ｍｇ、収率３３．６％で得た。
【００６８】
ＮＭＲ分析値
H-1':5.47ppm（d,1H,J1,P ＝8.0Hz,J1,2＝0.0Hz ）
H-4':4.99ppm（s,1H,J3,4 ＝0.0Hz,J4,5＝0.0Hz ）
3.73-4.77ppm（m,11H,H-2',H-3',H=5',H-6a',H-6b',H-1,H-2,H-3,H-4,H-5a,H-5b）
5.57-5.83ppm（m,2H,uridine）
6.98ppm （d,1H, NH-Naph ）
7.33-7.93ppm（m,8H,uridine）
【００６９】
中間体（IV）１０７ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）、カタラーゼ１ｍｇ及びガラクトースオキシデース１０ｍｇを０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍｌに溶解し、３０分振とうした。続いて、１−ナフチルメチルアミン６８μｌ（０．４６ｍｍｏｌ）、アセトニトリル６ｍｌを加え、３０分振とうした。次に、１−ナフチルメチルアミンが全て溶けるまでアセトニトリルを加え、さらに１時間振とうした。水素化シアノホウ素ナトリウム１５ｍｇ（０．２３ｍｍｏｌ）を加え、５分間振とうし、脱イオン水１００ｍｌで希釈し、ジエチルエーテル、トルエンで洗浄した。水層を凍結乾燥し、結晶をセファデックスＧ−１０を用いたゲル濾過（展開溶媒 脱イオン水）により精製した。さらに、陽イオン交換樹脂（ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８，ピリジニウムイオン型）カラム（直径０．５ｃｍ×長さ５．０ｃｍ）に通した後、ｎ−ブチルアミンを１４．７μｌ（６２μｍｏｌ）加えて濃縮し、ピリジンで３回共沸させ、下記６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチルメチル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェートを、収量５５ｍｇ、収率４６％で得た。
【００７０】
【化１０】
ウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチルメチル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェート−ジナトリウム塩の合成
ウリジン−５’−モノホスホモルホリデート−４−モルホリン−Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキシアミジン塩２０ｍｇ（３７μｍｏｌ）をピリジンで３回共沸させた。残渣と６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチルメチル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシルホスフェート−ジ−ｎ−ブチルアンモニウム塩１６ｍｇ（２９μｍｏｌ）をピリジン約５ｍｌに溶解させ、濃縮し、再度ピリジン３ｍｌに溶解し、一晩攪拌した。約５０ｍｌの脱イオン水で希釈し、ジエチルエーテルで洗浄し、水層を凍結乾燥した。結晶を陰イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ−セファセル、炭酸水素イオン型）で２回精製し（展開溶媒 ０．０５〜０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液）、さらにセファデックスＧ−１０で２回精製した。最後に、陽イオン交換樹脂（ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８，Ｎａ+ 型）を通し、濾液を凍結乾燥し、ウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチルメチル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩を得た。
【００７２】
H-1': 5.55ppm （d,1H,J1,P ＝8.0Hz,J1,2＝0.0Hz ）
H-3': 4.26ppm （dd,1H ）
H-4': 5.08ppm （d,1H,J3,4 ＝2.9Hz,J4,5＝0.0Hz ）
H-5': 3.78ppm （m,1H）
4.06-4.13ppm（m,6H,H-2',H-6a',H-6b',リボース）
3.51ppm,4.72ppm （eachs,3H, リボース）
5.63-5.66ppm（m,2H，uridine ）
7.46-8.02ppm（m,8H，Naph，uridine ）
【００７３】
実施例４
糖供与体であるウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−ｄ−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩２．３８μＭおよび糖受容体である３−〔Ｎ−（５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル）アミノ〕プロピル２−アセトアミド３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドを７１．４２μＭおよびα−ラクトアルブミン９．５２μｇ／ｍｌおよびβ１，４−ガラクト−ス転移酵素０．０５単位からなる反応液４．２ｍｌ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液；ｐＨ７．０）の条件で３７℃にて作用させ、反応液を経時的に蛍光物質を励起させ蛍光強度を測定した。
【００７４】
該蛍光物質を励起する条件および蛍光強度の測定については、Luminescence spectorphotometer LS50B（Perkin Elmer社製）にて励起させ、蛍光測定は３１０〜５７０ｎｍまで行った。図３のように、ナフチル基は４３０ｎｍで放射されその結果ダンシル基が励起され放射蛍光が５３０ｎｍで検出された。また、ナフチル基による４３０ｎｍの蛍光強度の変化が観察された。
【００７５】
【発明の効果】
上述したように、本発明における基質を用いた測定方法においては、非特異性バックグラウンドはＳ／Ｎ比を低下させるが、適切な緩衝剤および試薬および蛍光物質の組合せを選択することにより減少あるいは排除することが出来る。さらに、本発明の測定方法によると、ガラクトース転移酵素の生産物を高速液体クロマトグラフィなどで分離することなく酵素活性を高感度で測定することができるので、簡単にしてかつ短時間で測定できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の糖受容体誘導体の模式図を示す。
【図２】本発明の糖供与体誘導体の模式図を示す。
【図３】ガラクトース転移酵素反応液における蛍光スペクトラムを示す。
Claims (1)
- 糖受容体である３−〔Ｎ−（５−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニル）アミノ〕プロピル２−アセトアミド３，４，６−トリ−ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドと、糖供与体であるウリジン−５’−〔６−デオキシ−６−Ｎ−（１−ナフチル）−ｄ−Ｄ−ガラクトピラノシル〕ジホスフェートジナトリウム塩を基質として糖転移反応をα−ラクトアルブミン存在下で行い、ナフチル基を励起させ、該励起により放出される蛍光波長によりダンシル基を励起させ、その蛍光強度を測定することを特徴とするβ１，４−ガラクトース転移酵素の糖転移酵素活性測定方法。
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