JP4324365B2 - Alkaline protease - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、産業用酵素、特に洗剤用酵素として有用な新規アルカリプロテアーゼ及びこれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
プロテアーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧料、浴用剤、食品改質剤、消化補助剤或いは消炎剤といった様々な用途、分野で利用され、工業用酵素の中で最も生産量が多い。中でもアルカリプロテアーゼは、洗剤用酵素として、洗浄力の向上に不可欠な一成分として重要な役割を果たしてきている。
【０００３】
現在用いられている洗剤用アルカリプロテアーゼには、バチルス属細菌由来で、ズブチリシンファミリーに属し、分子量２８ｋＤａ付近の、サビナーゼ（登録商標；ノボザイム社製）、カンナーゼ（登録商標；ノボザイム社製）、デュラザイム（登録商標；ノボザイム社製）、マキサカル（登録商標；ジェネンコア社製）、ブラップ（登録商標；ヘンケル社製）、ＫＡＰ（花王社製）（特許文献１、特許文献２、非特許文献１参照）や、同様にバチルス属細菌由来であり、分子量が４３ｋＤａ付近で、酸化剤耐性を有するアルカリプロテアーゼの一群が知られている（特許文献３参照）。
【０００４】
しかしながら、これらのアルカリプロテアーゼは、アルカリ耐性、界面活性剤耐性、酸化剤耐性、低温活性、耐熱性、洗浄性、低い基質特異性、キレート剤耐性、金属イオン耐性等において一長一短のあるものであり、また、上記アルカリプロテアーゼのように分子量が２８〜４５ｋＤａ付近のものは、製造プロセスにおいて、培養液や酵素溶液の濃縮に用いる限外濾過膜から酵素が漏出して、濃縮収率を下げるという問題があった。
【０００５】
本発明は、上記のような洗剤用アルカリプロテアーゼ或いは従来の真性ズブチリシンと比べて分子量が大きく、且つアミノ酸配列において同一性が低い新たな洗剤用アルカリプロテアーゼ並びにこれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【０００６】
【特許文献１】
特開平４−３４９８８２号公報
【特許文献２】
特表平８−５０８６４３号公報
【特許文献３】
国際公開第９９／１８２１８号パンフレット
【非特許文献１】
Guptaら Appl. Microbiol. Biotechnol. 59, 15-32, 2002
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、好アルカリ性バチルス属細菌が生産する新規なプロテアーゼをを探索すべくスクリーニングを行ったところ、分子量の大きなアルカリプロテアーゼを生産している幾つかの微生物を見出し、さらに当該微生物からアルカリプロテアーゼコードする遺伝子をクローン化し、これを用いることにより洗剤用酵素として有用なアルカリプロテアーゼを工業的に製造できることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号１〜４より選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）の各アミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、及び配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター並びに該組換えベクターを含む形質転換体を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質（以下、「アルカリプロテアーゼ」ともいう）は、（ａ）配列番号１〜４より選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）（ａ）の各アミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり、本発明の遺伝子は、当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１０】
ここで、（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１〜４の各アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてアルカリプロテアーゼ活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
尚、当該等価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[ Mutan-super Express Km キット（Takara）]等を用いて変異を導入すればよい。
【００１１】
本発明の配列番号１〜４のアミノ酸配列からなるタンパク質は、アミノ酸配列において互いに類似するプロテアーゼであり、配列番号１のアミノ酸配列と配列番号２、３及び４のアミノ酸配列とは、それぞれ９５．０％、９０．５％、８２．６％の同一性を有する。
すなわち、本発明のアルカリプロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、８０％以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼを包含するものであり、配列番号１〜４のアミノ酸配列における同一性が、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上であるものが望ましい。
【００１２】
配列番号１〜４のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼを他の公知であるアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列と比較した場合、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｆｉｌｉｓ 由来のマイナーセリンプロテアーゼ（Ｖｐｒ）と５４〜５７％の同一性を示すにすぎない。また、この他に同一性を示すようなアミノ酸配列も見当たらない。これらの結果は、本発明のアルカリプロテアーゼが新規な酵素であることを示唆するものである。
尚、ここでいう同一性の検索はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（ソフトウェア開発）のサーチホモロジ−プログラムを用いて算出できる。
【００１３】
本発明の遺伝子は、上記の通り、配列番号１〜４より選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであるが、例えば、配列番号５の第４５７番目から第２４２４番目までの塩基配列で示されるＤＮＡ、配列番号６の第４５７番目から第２４２４番目までの塩基配列で示されるＤＮＡ、配列番号７の第４５７番目から第２４２４番目までの塩基配列で示されるＤＮＡ、配列番号８の第４５４番目から第２４２１番目までの塩基配列で示されるＤＮＡが挙げられ、好ましくは、（ａ）配列番号５〜８より選ばれる塩基配列で示されるＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００１４】
ここで「ストリンジエントな条件下」とは、例えば「Molecular cloning - a Laboratory manual 2nd edition」(Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１５】
本発明のアルカリプロテアーゼは、分子量４３ｋＤａ付近の酸化剤耐性を有するアルカリプロテアーゼを生産する公知のバチルス属細菌の染色体ＤＮＡからクローニングすることにより大量に生産することができる。
すなわち、配列番号１のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼについては、例えばバチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）、配列番号２のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼについては、例えばバチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６）、配列番号３のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼについては、例えばバチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）、配列番号４のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼについては、例えばバチルス エスピーＮＣＩＭＢ１２２８９株の染色体ＤＮＡからクローニングし、適当なベクターと宿主菌を用いて大量に生産することができる。
【００１６】
本発明の遺伝子は、上述したアルカリプロテアーゼ産生菌、例えばBacillus属に属する微生物、好ましくはバチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）、ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６）、ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）、ＮＣＩＭＢ１２２８９株等から、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いることよりクローニングすることができる。
【００１７】
本発明遺伝子を用いてアルカリプロテアーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記アルカリプロテアーゼ遺伝子（例えば、配列番号５〜８の塩基配列で示されるＤＮＡ）を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリプロテアーゼを採取すればよい。
培養は微生物が資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００１８】
かくして得られた培養物中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００１９】
本発明のアルカリプロテアーゼの特徴としては、次のような性質が好ましい。すなわち、分子量７２，０００±２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、合成基質（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ）を用いた場合、最適反応ｐＨを１０−１１付近（炭酸緩衝液）、最適温度を４５℃付近に有し、耐熱性は４５℃付近まで安定（ｐＨ１０、１５分間の処理）である。
【００２０】
【実施例】
実施例１ バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のアルカリプロテアーゼＦＴの精製
バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株を６．０％（ｗ／ｖ） ポリペプトンＳ（日本製薬）、０．１％ 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、０．１％ＫＨ2ＰＯ4、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５．０％マルトース、１．５％ Ｎａ2ＣＯ3から成る培地に接種し、３０℃で３日間振盪培養を行った。菌体を遠心分離により除去し上清を得た後、氷冷下にて８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し塩析を行った。生じた沈殿を遠心分離により集め、５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（緩衝液Ａ：ｐＨ７．５）に溶解した後、同緩衝液にて一晩透析を行った。透析内液を、あらかじめ、緩衝液Ａにて平衡化しておいたＤＥＡＥ トヨパール ６５０Ｃ（東ソー：２．５×１２ｃｍ）に添着した。次に０．５Ｍ 塩化ナトリウムまでの濃度勾配法により吸着タンパク質の溶出を行い、０．２５Ｍの塩化ナトリウム濃度付近にプロテアーゼ活性を示す画分を得た。この画分を集め、緩衝液Ａにて透析後、同緩衝液にて平衡化しておいたＳＰ トヨパール ５５０Ｃ（東ソー：２．５×１２ｃｍ）に添着した。次いで０．５Ｍ 塩化ナトリウムまでの濃度勾配法により吸着タンパク質の溶出を行い、０．３５Ｍの塩化ナトリウム濃度付近にプロテアーゼ活性を示す画分を得た。この画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法により分析した結果、アルカリプロテアーゼＦＴは分子量７２，０００±２，０００の均一なタンパク質バンドとして検出された。
【００２１】
実施例２ アルカリプロテアーゼＦＴのＮ末アミノ酸配列の決定
実施例１において精製されたアルカリプロテアーゼ溶液をメタノールで処理したＰｒｏｓｏｒｂ ｆｉｌｔｅｒ（アプライドバイオシステム）に吸着させ、プロテインシーケエンサー（４７６Ａ型：アプライドバイオシステム）によりＮ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＩＩｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙの２０残基のアミノ酸配列が得られた。
【００２２】
実施例３ アルカリプロテアーゼＦＴ遺伝子のクローニング
バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株をＬＢに０．０５％炭酸ナトリウムを添加した培地に接種し、３０℃で適当な時間振盪培養を行い菌体を集めた。斎藤と三浦の方法（Biochim. Biophys. Acata, 72, 619-629, 1963）に準じ菌体からゲノムＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで部分分解を行った。ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｔａｋａｒａ）中のＥｃｏＲＩカセットに上記部分分解断片を連結させ、実施例２で決定したＮ末アミノ酸配列をもとに合成したプライマーＡ（配列番号９）とキット付属のプライマーＣ１を用いてＰＣＲを行った。反応は、カセットを連結したＤＮＡ断片（１．０〜５０ｎｇ）を鋳型とし１０〜２０ｐｍｏｌの各プライマーを用い（５０μＬ反応系）、９４℃１分間の熱変性後、９４℃３０秒、４５℃２分間、７２℃１分間を１サイクルとし３０サイクル行った。得られた増幅ＤＮＡ断片をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（ロシュ）にて精製し、１００倍希釈したもの１μＬを鋳型に１０〜２０ｐｍｏｌのＮ末アミノ酸配列をもとに合成したプライマーＢ（配列番号１０）とキット付属のプライマーＣ２を添加し（５０μＬ反応系）、上記条件と同様にＰＣＲを行った。増幅した約８６０ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列はＢｉｇＤｙｅTM Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（アプライドバイオシステム）及び３７７ＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステム）を用いて決定した。得られた塩基配列を基に上流及び下流方向の塩基配列決定に適したプライマーを合成し、先に調製したＥｃｏＲＩカセットを鋳型にＰＣＲを行い全塩基配列決定した。
決定した配列を基に構造遺伝子上流の推定プロモーター領域から終始コドン下流のインバーティッドリピート配列を含む領域を増幅するためにプライマーＣ（配列番号１１）及びプライマーＤ（配列番号１２）を合成した。バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株のゲノムＤＮＡ（０．１〜１．０ｎｇ）を鋳型とし１０〜２０ｐｍｏｌのプライマーＣ及びＤを用いてＰＣＲを行った。反応は９４℃で３分間の熱変性後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３分間を１サイクルとし３０サイクル行った。得られたＰＣＲ増幅断片を精製し、ＴａＫａＲａ ＢＫＬ キット（Ｔａｋａｒａ）にて末端平滑化とリン酸化を行った後、ＳｍａＩ及びアルカリフォスファターゼ（ロシュ）処理を行ったプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）に結合し、組換えプラスミドｐＨＹＦＴを調製した。
【００２３】
実施例４ バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５株由来のアルカリプロテアーゼＳＦ遺伝子のクローニング
バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５株から実施例３と同様にゲノムＤＮＡを調製した。これを鋳型としてアルカリプロテアーゼＳＦをコードする遺伝子の推定プロモーター領域の配列を利用し合成したプライマーＥ（配列番号１３）及び終始コドン下流の配列を利用し合成したプライマーＦ（配列番号１４:５'末端にはＰｓｔＩリンカーを付与）を添加し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプロテアーゼ遺伝子領域を増幅した。反応は９４℃で２分間熱変性後、９６℃２０秒、５２℃３０秒、７２℃５分を１サイクルとして３０サイクルを行った。得られたＰＣＲ増幅断片を精製し、プライマーＥ、Ｆ及び塩基配列決定の過程で得られた情報を基に構築したプライマーを用いて塩基配列を決定した。さらに精製増幅断片をＰｓｔＩにて処理し、同様
に処理したプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫに組込みｐＨＹＳＦを作製した。
【００２４】
実施例５ バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６０株由来のアルカリプロテアーゼＳＺ遺伝子のクローニング
バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株のゲノムＤＮＡを実施例３と同様に調製した後、これを鋳型としプライマーＧ及びＨ（配列番号１５及び１６）を用いてＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）によりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃１分３０秒間を１サイクルとし３０サイクル行った。その結果、約１ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。ＰＣＲ産物を精製し、プライマーＧ及びＨを用いて塩基配列の解析を行った。次にインバースＰＣＲにより全構造遺伝子の塩基配列を決定した。即ち、ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ或いはＢｇｌIIにより３７℃にて完全分解した後、７０℃で１５分間処理し制限酵素を熱失活させた。その後、反応液と等量のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ キット ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を加え、１６℃で１昼夜ライゲーション反応を行い、インバースＰＣＲ用の鋳型を調製した。約１ｋｂの部分遺伝子配列からプライマーＩ及びＪ（配列番号１７及び１８）を合成し、得られたインバースＰＣＲ用の鋳型を用いてＬａＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）によりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃４分間を１サイクルとし３０サイクル行った。その結果、ＥｃｏＲI分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約２．２ｋｂのＤＮＡ増幅断片、又、ＢｇｌII分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約２ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。得られたＰＣＲ産物を精製し、プライマーＩ及びＪを用いて塩基配列の解析を行った。その結果、３２９３ｂｐの塩基配列が決定され、プロモーター領域からターミネーター領域を含む遺伝子領域を増幅出来るプライマーＫ及びＬ（配列番号１９及び２０）を合成した。その際にプライマーＫの５’末端にはＳａｌＩリンカーをプライマーＬの５’末端側にＸｂａＩリンカーを付与した。
ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株のゲノムＤＮＡを鋳型としプライマーＫ及びＬを用いてＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃３分間を１サイクルとし、３０サイクル行った。その結果、約２．８ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。ＰＣＲ産物を精製し、得られた約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ、ＸｂａＩにより処理し、同様に処理したプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫを混合した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）により、ライゲーション反応を行い、ｐＨＹＳＺを作製した。
【００２５】
実施例６ バチルス エスピー ＮＣＩＭＢ１２２８９株由来のアルカリプロテアーゼＮＶ遺伝子のクローニング
前記、バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株、バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株、バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５株由来のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子間の同一性検索の結果からプライマーＭ及びＮ（配列番号２１及び２２）を合成した。バチルス エスピーＮＣＩＭＢ１２２８９株のゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマーＭ及びＮを用いてＥｘＴａｑによりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃２分間を１サイクルとし３０サイクル行った。ＰＣＲ産物を精製し、プライマーＭ及びＮを用いて約２ｋｂのＤＮＡ増幅断片の塩基配列解析を行った。次いで実施例５と同様にインバースＰＣＲによりプロモーター、ターミネーター領域を含めた全構造遺伝子の塩基配列を決定した。即ち、ＮＣＩＭＢ１２２８９株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ或いはＰｓｔＩにより３７℃にて完全分解した後、７０℃で１５分間処理し制限酵素を熱失活させた。その後、１６℃で１昼夜セルフライゲーション反応を行い、インバースＰＣＲ用の鋳型を調製した。合成したプライマーＯ、Ｐ及びＱ（配列番号２３−２５）を用い、ＬａＴａｑによりＰＣＲを行った。ＥｃｏＲＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡ及びＢｇｌＩＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡに対してはプライマーＯ及びＱをＰｓｔＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡに対してはプライマーＰ及びＱを用いた。反応条件は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃４分間を１サイクルとし３０サイクル行った。その結果、ＥｃｏＲＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約２ｋｂのＤＮＡ増幅断片、ＢｇｌＩＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約３ｋｂのＤＮＡ増幅断片、又、ＰｓｔＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約３ｋｂのＤＮＡ増幅断片がそれぞれ認められた。得られたＰＣＲ産物を精製し、プライマーＯ及びＱを用いて塩基配列の解析を行った。次いで実施例５と同様に合成したプライマーＲ及びＳ（配列番号２６及び２７）とＮＣＩＭＢ１２２８９株のゲノムＤＮＡを鋳型にしＰＣＲを行い、最終的にｐＨＹＮＶを作製した。
【００２６】
実施例７ アルカリプロテアーゼの組換え生産
ｐＨＹＦＴ、ｐＨＹＳＦ、ｐＨＹＳＺ及びｐＨＹＮＶを用いて、ＫＳＭ−９８６５株の変異株（分子量２８ｋＤａ、７２ｋＤａの２種類のアルカリプロテアーゼ遺伝子を破壊した株）をエレクトロポレーション法で形質転換処理した。スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地（０．０５％炭酸ナトリウム並びに１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む）に塗沫し、スキムミルク溶解斑の有無からプロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選抜した。得られた各形質転換体を５ｍLの種母培地[６．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．１％酵母エキス、１．０％マルトース、０．０２％硫酸マグネシウム７水和物、０．１％リン酸２水素カリウム、０．３％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン]に植菌し、３０℃で１６時間振盪培養を行った。この種母培養液を３０ｍLの主培地[８％ポリペプトンＳ、０．３％酵母エキス、１０％マルトース、０．０４％硫酸マグネシウム７水和物、０．２％リン酸２水素カリウム、１．５％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン]に１％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃で３日間振盪培養を行った。
【００２７】
実施例８ 組換えアルカリプロテアーゼの精製
実施例７で得られたＫＰ４３株由来の組換えプロテアーゼＦＴを含む培養液８０ｍＬを０．２Ｍ塩化カリウム含有の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたＳｕｐｅｒＱトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー：２．５×１４ｃｍ）へ添着した。同緩衝液で非吸着タンパク質を溶出させた後、０．２〜０．４Ｍ塩化カリウムまでの濃度勾配法により吸着タンパク質の溶出を行った。その結果、０．３Ｍ塩化カリウム付近にプロテアーゼ活性を含む画分が溶出された。この画分に０．７５Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、予め０．７５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたフェニルトヨパールカラム（東ソー：２．５×８ｃｍ）に添着させた。同緩衝液にて非吸着タンパク質を溶出させた後、０．７５Ｍ〜硫酸アンモニウム無添加までの濃度勾配法により吸着タンパク質の溶出を行った。その結果、０．２５Ｍ以下の硫酸アンモニウム付近にプロテアーゼ活性を示す画分を得た。この画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、分子量約７２０００のほぼ均一なタンパク質バンドを検出した。上記の精製法によりＫＰ４３株由来の組換えプロテアーゼは、活性収率８４％、約４倍に精製され、比活性１０２Ｕ／ｍｇであった。実施例７で得られたいずれの培養液からも同様の操作により各精製プロテアーゼを得ることができた。
【００２８】
実施例９ 組換えアルカリプロテアーゼの酵素学的性質
実施例８で得られた精製アルカリプロテアーゼの活性を測定する場合は合成基質法により行った。即ち、０．２５ｍＬの０．１Ｍ緩衝液、０．０２５ｍＬの５０ｍＭＡＡＰＬ（N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide）、０．２ｍＬの脱イオン水からなる反応液を３０℃で５分間、恒温した後、適当に希釈した酵素液を０．０２５ｍＬ添加し、反応を開始した。３０℃で１０分間恒温した後、２ｍＬの５％(w/v)クエン酸を添加し、反応を停止した。次いで反応中に生成されたｐ−ニトロアニリンの４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素１単位（Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏＬのｐ−ニトロアニリンを生成する量とした。
【００２９】
（１）最適反応ｐＨ
ｐＨ４−１２．５の各緩衝液中にて酵素反応を行った結果、いずれの酵素もｐＨ１０．５の炭酸緩衝液において最も高い分解活性を示した。
【００３０】
（２）最適温度
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）中、５〜６０℃の範囲で酵素反応を行った結果、いずれの酵素も４０〜４５℃において最も高い分解活性を示した。また、反応液に２ｍＭ塩化カルシウムを添加しても最大活性を与える反応温度は変化せず、活性化も殆ど起こらないことが特徴であった。
【００３１】
（３）耐熱性
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）中、２０〜５５℃の範囲で各酵素を１５分間恒温した。その後、氷冷し酵素反応を行った結果、いずれの酵素も４０℃までは安定であった。また、５ｍＭ塩化カルシウムを添加し、恒温処理した場合においても同様な結果であった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明のアルカリプロテアーゼは、最適温度が中低温域にあることから洗剤用酵素として有用であり、且つ従来のズブチリシンとは異なり分子量が大きいことから、製造プロセスにおいて、培養液や酵素溶液の濃縮に用いる限外濾過膜から酵素が漏出することによって濃縮収率が低下することがない。
【００３３】
【配列表】
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel alkaline protease useful as an industrial enzyme, particularly a detergent enzyme, and a gene encoding the same.
[0002]
[Prior art and problems to be solved by the invention]
Proteases are used in various applications and fields such as detergents for clothes, cosmetics, bath preparations, food modifiers, digestive aids or anti-inflammatory agents, and are the most produced of industrial enzymes. There are many. Among them, alkaline protease has been playing an important role as a detergent enzyme, as an essential component for improving detergency.
[0003]
Currently used alkaline proteases for detergents are derived from Bacillus bacteria, belong to the subtilisin family, and have a molecular weight of about 28 kDa, sabinase (registered trademark; manufactured by Novozyme), cannase (registered trademark; manufactured by Novozyme), Durazyme (registered trademark; manufactured by Novozyme), Maxacar (registered trademark; manufactured by Genencor), Blap (registered trademark; manufactured by Henkel), KAP (manufactured by Kao) (see Patent Document 1, Patent Document 2, and Non-Patent Document 1) ) And a group of alkaline proteases derived from Bacillus bacteria and having a molecular weight of about 43 kDa and having oxidant resistance (see Patent Document 3).
[0004]
However, these alkaline proteases have advantages and disadvantages in alkali resistance, surfactant resistance, oxidant resistance, low-temperature activity, heat resistance, detergency, low substrate specificity, chelating agent resistance, metal ion resistance, etc. In addition, the alkaline protease having a molecular weight of about 28 to 45 kDa has a problem in that the enzyme leaks from the ultrafiltration membrane used for the concentration of the culture solution or the enzyme solution in the production process, thereby reducing the concentration yield. there were.
[0005]
It is an object of the present invention to provide a novel alkaline detergent for detergents and a gene encoding the same , which have a molecular weight higher than that of the detergent alkaline protease as described above or conventional intrinsic subtilisin and low in amino acid sequence identity. And
[0006]
[Patent Document 1]
JP-A-4-349882 [Patent Document 2]
JP-T-8-508643 Publication [Patent Document 3]
International Publication No. 99/18218 Pamphlet [Non-Patent Document 1]
Gupta et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59, 15-32, 2002
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors conducted screening to search for novel proteases produced by alkalophilic Bacillus bacteria. As a result, they found several microorganisms producing alkaline protease having a large molecular weight. It was found that an alkaline protease useful as a detergent enzyme can be industrially produced by cloning a gene encoding a protease and using it.
[0008]
That is, the present invention provides the following protein (a) or (b):
(A) a protein comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4,
(B) A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in each amino acid sequence of (a) and having alkaline protease activity, and 80% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 The present invention provides a protein having the above identity and having alkaline protease activity, a gene encoding the protein, a recombinant vector containing the gene, and a transformant containing the recombinant vector.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The protein of the present invention (hereinafter also referred to as “alkaline protease”) is (a) a protein comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4, and (b) one or more of each amino acid sequence of (a) A protein comprising an amino acid sequence in which amino acids are deleted, substituted or added, and having an alkaline protease activity, or a protein having 80% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having an alkaline protease activity The gene of the present invention is DNA encoding the protein.
[0010]
Here, in the amino acid sequence of (a), the amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added means an amino acid sequence equivalent to each amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1-4. Or an amino acid sequence in which several, preferably 1 to 10 amino acids have been deleted, substituted or added, and still retain alkaline protease activity. Addition of the amino acids.
The base sequence encoding the equivalent amino acid sequence can be prepared using a known method such as site-directed mutagenesis. For example, a mutation may be introduced using a mutation introduction kit [Mutan-super Express Km kit (Takara)] using site-directed mutagenesis.
[0011]
The protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 4 of the present invention is a protease similar in amino acid sequence, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 2, 3 and 4 are each 95.0 %, 90.5%, 82.6% identity .
That is, the alkaline protease of the present invention includes an alkaline protease having an identity of 80% or more when the corresponding sequence in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is appropriately aligned. It is desirable that the identity in the sequence is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more.
[0012]
When the alkaline protease consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4 is compared with the amino acid sequences of other known alkaline proteases, it shows only 54-57 % identity with the minor serine protease (Vpr) derived from Bacillus subfilis. Absent. In addition, no amino acid sequence showing identity is found. These results suggest that the alkaline protease of the present invention is a novel enzyme.
The identity search mentioned here can be calculated using a search homology program of GENETYX-WIN (software development).
[0013]
As described above, the gene of the present invention is a protein comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4, a protein comprising an amino acid sequence equivalent to the amino acid sequence, or an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with 80% or more identity And encoding a protein having alkaline protease activity. For example, DNA represented by the nucleotide sequence from the 457th position to the 2424th position of SEQ ID NO: 5, the 457th position from the 457th position of SEQ ID NO: 6 DNA represented by the nucleotide sequence from the 2424th position, DNA represented by the nucleotide sequence from the 457th position to the 2424th position of the SEQ ID NO: 7, and DNA represented by the nucleotide sequence from the 454th position to the 2421st position of the SEQ ID NO: 8 Preferably, (a) DNA represented by a base sequence selected from SEQ ID NOs: 5 to 8, or (b) A DNA which hybridizes with the DNA under stringent conditions comprising the nucleotide sequence of a), and includes a DNA encoding a protein having alkaline protease activity.
[0014]
Here, the “stringent conditions” include, for example, the conditions described in “Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition” (Sambrook et al., 1989). For example, in a solution containing 6 × SSC (composition of 1 × SSC: 0.15M sodium chloride, 0.015M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhart and 100 mg / mL herring sperm DNA A condition for hybridization with a probe at 65 ° C. for 8 to 16 hours is mentioned.
[0015]
The alkaline protease of the present invention can be produced in large quantities by cloning from the chromosomal DNA of a known Bacillus bacterium that produces an alkaline protease having an oxidant resistance with a molecular weight of around 43 kDa.
That is, for the alkaline protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, for example, Bacillus sp. KSM-KP43 strain (FERM BP-6532), for the alkaline protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, Bacillus sp. KSM-9865 strain ( FERM P-18586), an alkaline protease comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, for example, Bacillus sp. KSM-KP9860 strain (FERM BP-6534), and an alkaline protease comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, for example, Bacillus sp. NCIMB12289 It can be cloned from the chromosomal DNA of the strain and produced in large quantities using an appropriate vector and host fungus.
[0016]
The gene of the present invention comprises the above-mentioned alkaline protease-producing bacteria, for example, microorganisms belonging to the genus Bacillus , preferably Bacillus sp. KSM-KP43 strain (FERM BP-6532), KSM-9865 strain (FERM P-18666), KSM-KP9860 strain. (FERM BP-6534), NCIMB12289 strain and the like can be cloned by using, for example, a shotgun method or a PCR method.
[0017]
In order to produce an alkaline protease using the gene of the present invention, the alkaline protease gene (for example, the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5 to 8) is added to any vector suitable for expressing the gene in the target host. DNA) is transformed, the host is transformed with the recombinant vector, the resulting transformant is cultured, and alkaline protease is collected from the culture solution.
The culture may be carried out by inoculating a medium containing a carbon source, a nitrogen source and other essential nutrients that can be assimilated by the microorganism, and following a conventional method.
[0018]
Collection and purification of alkaline protease from the thus obtained culture can be performed according to a general method. That is, the cells can be removed from the culture by centrifugation or filtration, and the target enzyme can be concentrated from the obtained culture supernatant by conventional means. The enzyme solution or dry powder thus obtained can be used as it is, but can be further crystallized or granulated by a known method.
[0019]
As the characteristics of the alkaline protease of the present invention, the following properties are preferable. That is, when a molecular weight of 72,000 ± 2,000 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) and a synthetic substrate (Ala-Ala-Pro-Leu-pNA) are used, the optimum reaction pH is around 10-11 (carbonate buffer). Liquid), the optimum temperature is around 45 ° C., and the heat resistance is stable up to around 45 ° C. (treatment at pH 10, 15 minutes).
[0020]
【Example】
Example 1 Purification of alkaline protease FT derived from Bacillus sp. KSM-KP43 strain Bacillus sp. KSM-KP43 strain was 6.0% (w / v) Polypeptone S (Nippon Pharmaceutical), 0.1% yeast extract (Difco), 0 .1% KH 2 PO 4 , 0.02% MgSO 4 .7H 2 O, 5.0% maltose, 1.5% Na 2 CO 3 medium was inoculated and shake-cultured at 30 ° C. for 3 days . The cells were removed by centrifugation, and a supernatant was obtained. Then, ammonium sulfate was added and salted out to achieve 80% saturation under ice cooling. The resulting precipitate was collected by centrifugation, dissolved in 10 mM Tris hydrochloride buffer solution (buffer A: pH 7.5) containing 5 mM calcium chloride, and dialyzed overnight in the same buffer solution. The dialyzed internal solution was attached to DEAE Toyopearl 650C (Tosoh: 2.5 × 12 cm) that had been equilibrated with buffer A in advance. Next, the adsorbed protein was eluted by a concentration gradient method up to 0.5 M sodium chloride to obtain a fraction showing protease activity in the vicinity of a sodium chloride concentration of 0.25 M. This fraction was collected, dialyzed with buffer A, and attached to SP Toyopearl 550C (Tosoh: 2.5 × 12 cm) equilibrated with the same buffer. Subsequently, the adsorbed protein was eluted by a concentration gradient method up to 0.5 M sodium chloride, and a fraction showing protease activity in the vicinity of a sodium chloride concentration of 0.35 M was obtained. As a result of analyzing this fraction by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), alkaline protease FT was detected as a uniform protein band having a molecular weight of 72,000 ± 2,000.
[0021]
Example 2 Determination of N-terminal amino acid sequence of alkaline protease FT The alkaline protease solution purified in Example 1 was adsorbed to a Prosorb filter (Applied Biosystem) treated with methanol, and a protein sequencer (476A type: Applied Biosystem) Was used to determine the N-terminal amino acid sequence. As a result, the amino acid sequence of 20 residues of Met-Phe-Asp-Ser-Ala-Pro-Phe-IIe-Gly-Ala-Asn-Asp-Ala-Trp-Asp-Leu-Gly-Phe-Asp-Gly is Obtained.
[0022]
Example 3 Cloning of Alkaline Protease FT Gene Bacillus SP KSM-KP43 strain was inoculated into a medium in which 0.05% sodium carbonate was added to LB, and cultured at 30 ° C. for an appropriate period of time to collect the cells. Genomic DNA was prepared from the cells according to the method of Saito and Miura (Biochim. Biophys. Acata, 72, 619-629, 1963), and partially digested with Eco RI. The above partially degraded fragment was ligated to the Eco RI cassette in the LA PCR in vitro cloning kit (Takara), synthesized with the primer A (SEQ ID NO: 9) based on the N-terminal amino acid sequence determined in Example 2, and the kit PCR was performed using primer C1. The reaction was performed by heat denaturation at 94 ° C. for 1 minute, and then at 94 ° C. for 30 seconds and at 45 ° C. 2 using 10 to 20 pmol of each primer (50 μL reaction system) using a DNA fragment (1.0 to 50 ng) linked to the cassette as a template. For 30 minutes at 72 ° C. for 1 minute. The obtained amplified DNA fragment was purified with a High Pure PCR Product Purification kit (Roche) and diluted 100-fold with 1 μL of the template as primer B (SEQ ID NO: 10) based on 10 to 20 pmol of N-terminal amino acid sequence. ) And the primer C2 attached to the kit (50 μL reaction system), and PCR was performed in the same manner as above. The base sequence of the amplified DNA fragment of about 860 bp was determined using a BigDye ™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystem) and a 377 DNA sequencer (Applied Biosystem). Based on the obtained base sequence, primers suitable for base sequence determination in the upstream and downstream directions were synthesized, and PCR was performed using the Eco RI cassette prepared previously as a template to determine the entire base sequence.
Based on the determined sequence, primer C (SEQ ID NO: 11) and primer D (SEQ ID NO: 12) were synthesized in order to amplify a region including an inverted repeat sequence downstream of the termination codon from a putative promoter region upstream of the structural gene. PCR was carried out using 10 to 20 pmol of primers C and D using the Bacillus sp. KSM-KP43 strain genomic DNA (0.1 to 1.0 ng) as a template. The reaction was performed by heat denaturation at 94 ° C. for 3 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 3 minutes. The resulting PCR amplified fragment was purified, subjected to terminal blunting and phosphorylation with TaKaRa BKL kit (Takara), and then bound to plasmid pHY300PLK (Takara) treated with Sma I and alkaline phosphatase (Roche). A recombinant plasmid pHYFT was prepared.
[0023]
Example 4 Cloning of Alkaline Protease SF Gene Derived from Bacillus sp. KSM-9865 Strain Genomic DNA was prepared from Bacillus sp. KSM-9865 strain in the same manner as in Example 3. Using this as a template, primer E (SEQ ID NO: 13) synthesized using the sequence of the putative promoter region of the gene encoding alkaline protease SF and primer F (SEQ ID NO: 14: 5 ′ end) synthesized using the sequence downstream of the stop codon Was added with Pst I linker), and the protease gene region was amplified using Pyrobest DNA Polymerase (Takara). The reaction was heat-denatured at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of 96 ° C. for 20 seconds, 52 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 5 minutes. The obtained PCR amplified fragment was purified, and the base sequence was determined using primers E and F and a primer constructed based on the information obtained in the process of determining the base sequence. Further, the purified amplified fragment was treated with Pst I, and incorporated into the similarly treated plasmid pHY300PLK to prepare pHYSF.
[0024]
Example 5 Cloning of Alkaline Protease SZ Gene Derived from Bacillus sp. KSM-9860 Strain Genomic DNA of Bacillus sp. KSM-KP9860 strain was prepared in the same manner as in Example 3, and then used as a template for primers G and H (SEQ ID NO: 15 and PCR was performed with ExTaq (Takara) using 16). The reaction was performed at 94 ° C. for 2 minutes after denaturing the template DNA, followed by 30 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 50 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute and 30 seconds. As a result, a DNA amplified fragment of about 1 kb was observed. The PCR product was purified and the nucleotide sequence was analyzed using primers G and H. Next, the base sequence of all structural genes was determined by inverse PCR. That is, the genomic DNA of KSM-KP9860 strain was completely decomposed at 37 ° C. with restriction enzymes Eco RI or Bgl II, and then treated at 70 ° C. for 15 minutes to inactivate the restriction enzymes. Thereafter, an equivalent amount of DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara) was added, and a ligation reaction was performed at 16 ° C. for 1 day to prepare a template for inverse PCR. Primers I and J (SEQ ID NOs: 17 and 18) were synthesized from the partial gene sequence of about 1 kb, and PCR was performed with LaTaq (Takara) using the obtained inverse PCR template. The reaction was performed by denaturing the template DNA at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 50 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 4 minutes. As a result, about 2.2 kb of DNA amplified fragment by PCR using the self-ligated DNA of Eco RI degradation product as a template, and about 2 kb of DNA amplified fragment by PCR using self-ligation DNA of Bgl II degradation product as a template Was recognized. The obtained PCR product was purified, and the nucleotide sequence was analyzed using primers I and J. As a result, a base sequence of 3293 bp was determined, and primers K and L (SEQ ID NOs: 19 and 20) capable of amplifying a gene region including a terminator region from the promoter region were synthesized. At that time, a Sal I linker was added to the 5 ′ end of the primer K, and an Xba I linker was added to the 5 ′ end of the primer L.
PCR was performed by Pyrobest DNA Polymerase using primers K and L using genomic DNA of KSM-KP9860 strain as a template. The reaction was carried out for 30 cycles after denaturing the template DNA at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 1 cycle of 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 3 minutes. As a result, a DNA amplified fragment of about 2.8 kb was observed. The PCR product was purified, the obtained DNA fragment of about 2.8 kb was treated with Sal I and Xba I, mixed with similarly treated plasmid pHY300PLK, and then ligated with Ligation High (Toyobo), pHYSZ was prepared.
[0025]
Example 6 Cloning of the alkaline protease NV gene derived from Bacillus sp. NCIMB12289 strain the Bacillus sp KSM-KP43 strain, Bacillus sp KSM-KP9860 strain, identity between the gene encoding the alkaline protease from Bacillus sp. KSM-9865 strain search From these results, primers M and N (SEQ ID NOs: 21 and 22) were synthesized. PCR was performed by ExTaq using primers M and N using the genomic DNA of Bacillus sp NCIMB12289 as a template. The reaction was performed by denaturing the template DNA at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 2 minutes. The PCR product was purified, and the base sequence analysis of the amplified DNA fragment of about 2 kb was performed using primers M and N. Next, the base sequence of all structural genes including the promoter and terminator regions was determined by inverse PCR as in Example 5. Specifically, the genomic DNA of NCIMB12289 strain was completely decomposed at 37 ° C. with restriction enzymes Eco RI, Bgl II or Pst I, and then treated at 70 ° C. for 15 minutes to inactivate the restriction enzymes. Thereafter, self-ligation reaction was performed at 16 ° C. for one day to prepare a template for inverse PCR. PCR was performed with LaTaq using the synthesized primers O, P, and Q (SEQ ID NOs: 23-25). Primers O and Q were used for self-ligation DNA of Eco RI degradation product and self-ligation DNA of Bgl II degradation product, and primers P and Q were used for self-ligation DNA of Pst I degradation product. The reaction conditions were that denaturation of the template DNA at 94 ° C. for 2 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 4 minutes. As a result, by PCR using Eco RI degradation product self-ligation DNA as a template, about 2 kb DNA amplification fragment, by PCR using Bgl II degradation product self-ligation DNA as template, about 3 kb DNA amplification fragment, or Pst About 3 kb amplified DNA fragments were observed by PCR using the I-lysed self-ligated DNA as a template. The obtained PCR product was purified, and the base sequence was analyzed using primers O and Q. Subsequently, PCR was performed using primers R and S (SEQ ID NOs: 26 and 27) synthesized in the same manner as in Example 5 and genomic DNA of NCIMB12289 strain as a template, and finally pHYNV was prepared.
[0026]
Example 7 Recombinant production of alkaline protease Using pHYFT, pHYSF, pHYSZ and pHYNV, a mutant strain of KSM-9865 strain (a strain in which two alkaline protease genes having molecular weights of 28 kDa and 72 kDa were disrupted) was electroporated. Transformation treatment was performed. Skim milk-containing alkaline LB agar medium (containing 0.05% sodium carbonate and 15 ppm tetracycline) was smeared, and a transformant having a protease gene introduced was selected based on the presence or absence of skim milk dissolution spots. Each obtained transformant was treated with 5 mL of seed medium [6.0% (w / v) polypeptone S, 0.1% yeast extract, 1.0% maltose, 0.02% magnesium sulfate heptahydrate, 0.1% potassium dihydrogen phosphate, 0.3% anhydrous sodium carbonate, 30 ppm tetracycline] was inoculated, and cultured with shaking at 30 ° C. for 16 hours. This seed culture was added to 30 mL of the main medium [8% polypeptone S, 0.3% yeast extract, 10% maltose, 0.04% magnesium sulfate heptahydrate, 0.2% potassium dihydrogen phosphate, 1. 5% anhydrous sodium carbonate, 30 ppm tetracycline] was inoculated with 1% (v / v) and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days.
[0027]
Example 8 Purification of recombinant alkaline protease Equilibrate 80 mL of the culture solution containing recombinant protease FT derived from KP43 strain obtained in Example 7 with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.2 M potassium chloride. It was attached to a SuperQ Toyopearl 650M column (Tosoh: 2.5 × 14 cm). After the non-adsorbed protein was eluted with the same buffer, the adsorbed protein was eluted by a concentration gradient method from 0.2 to 0.4 M potassium chloride. As a result, a fraction containing protease activity was eluted in the vicinity of 0.3 M potassium chloride. Ammonium sulfate was added to this fraction to 0.75 M, and a phenyl Toyopearl column (Tosoh: 2.5) was equilibrated in advance with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.75 M ammonium sulfate. × 8 cm). After the non-adsorbed protein was eluted with the same buffer, the adsorbed protein was eluted by a concentration gradient method from 0.75 M to no addition of ammonium sulfate. As a result, a fraction showing protease activity in the vicinity of ammonium sulfate of 0.25 M or less was obtained. As a result of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of this fraction, a substantially uniform protein band having a molecular weight of about 72000 was detected. The recombinant protease derived from the KP43 strain was purified by the above purification method to an activity yield of 84%, about 4 times, and had a specific activity of 102 U / mg. Each purified protease could be obtained from any culture solution obtained in Example 7 by the same operation.
[0028]
Example 9 Enzymatic Properties of Recombinant Alkaline Protease The activity of the purified alkaline protease obtained in Example 8 was measured by the synthetic substrate method. That is, a reaction solution consisting of 0.25 mL of 0.1 M buffer, 0.025 mL of 50 mM AAPL ( N- succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu- p- nitroanilide), and 0.2 mL of deionized water at 30 ° C. After incubating for 5 minutes, 0.025 mL of an appropriately diluted enzyme solution was added to initiate the reaction. After incubating at 30 ° C. for 10 minutes, 2 mL of 5% (w / v) citric acid was added to stop the reaction. Next, the absorbance at 420 nm of p -nitroaniline produced during the reaction was measured. One unit of enzyme (U) was defined as the amount that produced 1 μmol of p -nitroaniline per minute under the above reaction conditions.
[0029]
(1) Optimum reaction pH
As a result of carrying out the enzyme reaction in each buffer solution at pH 4 to 12.5, all the enzymes showed the highest degradation activity in the carbonate buffer solution at pH 10.5.
[0030]
(2) As a result of performing enzyme reaction in the range of 5-60 degreeC in optimal temperature 50mM borate buffer solution (pH 10), all the enzymes showed the highest decomposition activity in 40-45 degreeC. Further, even when 2 mM calcium chloride was added to the reaction solution, the reaction temperature giving the maximum activity did not change, and activation was hardly caused.
[0031]
(3) Each enzyme was incubated at a temperature of 20 to 55 ° C. for 15 minutes in a thermostable 50 mM borate buffer (pH 10). Thereafter, the enzyme reaction was carried out with ice cooling, and as a result, all the enzymes were stable up to 40 ° C. The same result was obtained when 5 mM calcium chloride was added and subjected to a constant temperature treatment.
[0032]
【The invention's effect】
The alkaline protease of the present invention is useful as an enzyme for detergents because the optimum temperature is in the middle to low temperature range, and unlike conventional subtilisins, it has a large molecular weight. The concentration yield does not decrease due to leakage of the enzyme from the ultrafiltration membrane used.
[0033]
[Sequence Listing]
Claims (9)
（ａ）配列番号１〜４より選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）の各アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。The following protein (a) or (b):
(A) a protein comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 4,
(B) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in each amino acid sequence of (a) and having alkaline protease activity.
（ａ）配列番号５〜８より選ばれる塩基配列で示されるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の各塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。Alkaline protease gene comprising the following DNA (a) or (b):
(A) DNA represented by a base sequence selected from SEQ ID NOs: 5 to 8,
(B) A DNA that hybridizes with a DNA comprising each base sequence of (a) under stringent conditions and encodes a protein having alkaline protease activity.
（１）分子量７２，０００±２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、(1) Molecular weight 72,000 ± 2,000 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis),
（２）合成基質（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ）を用いた場合、以下の性質を示す(2) When a synthetic substrate (Ala-Ala-Pro-Leu-pNA) is used, the following properties are exhibited.
最適反応ｐＨ： １０〜１１Optimum reaction pH: 10-11
最適温度： ４０〜４５℃（ｐＨ１０、１５分間の処理）Optimal temperature: 40 to 45 ° C. (pH 10, treatment for 15 minutes)
耐熱性： ４０℃まで安定（ｐＨ１０、１５分間の処理）、Heat resistance: stable up to 40 ° C (pH 10, treatment for 15 minutes),
及びas well as
（３）２ｍＭカルシウム存在下及び非存在下で当該最適温度及び耐熱性を有する。(3) It has the optimum temperature and heat resistance in the presence and absence of 2 mM calcium.
Priority Applications (1)
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