JP4321907B2

JP4321907B2 - New human immortalized hepatocyte cell line

Info

Publication number: JP4321907B2
Application number: JP12074699A
Authority: JP
Inventors: 正義難波; 憲一深谷; 知朝日; 純枝吉富
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-04-28
Filing date: 1999-04-27
Publication date: 2009-08-26
Anticipated expiration: 2019-04-27
Also published as: JP2000014390A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、（１）新規ヒト（好ましくはヒト胎児）正常細胞由来肝臓不死化細胞株、（２）該細胞株の製造方法、（３）該細胞株を用いることを特徴とする▲１▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素活性を阻害または促進するか、または▲２▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子の発現を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、（４）該スクリーニング方法を用いて得られる▲１▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素活性を阻害または促進するか、または▲２▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子の発現を阻害または促進する化合物またはその塩、および（５）該細胞株を用いた生体異物およびまたは内在性基質代謝に関与する酵素の解析方法などに関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝臓細胞は非常に多くの生理学的機能を有しているが、なかでも薬物、食品添加物、環境汚染物質などの生体異物を代謝しこれを排泄しやすい形態に変換するいわゆる生体異物の代謝に関して非常に重要な機能を果たしている。この生体異物の代謝の機能は同時に生体異物による突然変異誘発、毒性発現あるいは物質の有効性の発現をもたらす場合もあり、非常に広く研究が進められている。この様な理由から培養肝細胞は、実験動物の代替法としてばかりではなく、迅速かつ廉価にしかも正確に肝臓における代謝を検討する試験法をもたらすものばかりではなく肝臓の機能を代替するいわゆる人工肝臓作成を可能とするものと考えられてきた。
ところが、生体組織から分離したヒト正常肝細胞は継代培養が不可能である。細胞株として樹立することのできる細胞は本来の分化形質を持たない場合が多く、細胞株が本来属していた組織の機能を正確に反映するものではない場合が多い。特に肝細胞においていわゆる生体異物の代謝を行う酵素群は、初代培養においてはきわめて短時間でその活性が失われ、株化細胞でその性質を十分に保持しているものはこれまで見いだされていない（J. Dich et al., Hepatology, 8, 39-45 (1988)）。この様な観点から、生体異物の代謝能を保持しかつ培養が可能な肝細胞がこれまで広く求められてきた。ヒト肝臓の細胞株の調製はヒト腫瘍細胞の選択により行われ、たとえばHepG2(Aden et al. Nature, 282, 615-616,1979)などが知られている。しかしながら、これら細胞は、腫瘍細胞由来であり正常細胞が不死化したものではない。正常細胞を不死化するすなわち無限に増殖できるようにする方法としては例えば、SV(simian virus)40由来のT抗原遺伝子を導入などの方法が一般的に利用されている。しかしながら、肝臓の正常実質細胞の不死化、特に生体異物の代謝に関わる酵素活性、生体異物の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子の発現、生体異物の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子の発現誘導が観察できるヒト肝臓正常実質細胞由来の不死化細胞株は知られていない。また、多くの株化細胞の培養においては培地中に血清成分を必須とする。この血清成分の必要性は、血清の品質的安定性の欠如故に培養細胞の性質の安定性を著しく損ねるだけではなく、血清が非常に高価格であるため株化細胞の安定で正確でしかも廉価な使用を著しく阻害するものであった。従って、樹立された不死化細胞株が、無血清培地において、その形質を安定に保持したまま増殖可能であれば、工業的にも大きな利益をもたらすことができる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ヒト正常肝臓細胞（好ましくはヒト正常肝臓実質細胞）由来でかつ無血清完全合成培地で増殖可能でありしかもヒト肝臓の特異的な代謝機能のうち特に生体異物の代謝に関わる酵素活性や、生体異物の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子の発現が観察できる細胞株の提供および該細胞株を分離し製造することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、ヒト正常肝臓実質細胞由来でかつ無血清完全合成培地で増殖可能であり、しかもヒト肝臓の特異的な代謝機能のうち特に生体異物の代謝に関わる酵素活性や、生体異物の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子の発現が観察できる細胞株を樹立することに成功し、さらに研究を行なった結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素活性または肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子の発現能を保持するヒト正常細胞由来不死化肝臓細胞株、
（２）酵素活性がNADPH チトクロームP450還元酵素活性、グルクロシルトランスフェラーゼ活性、エトキシレゾルフィン脱アルキル化活性、ベンジロキシレゾルフィン脱アルキル化活性、ペントキシルレゾルフィン脱アルキル化活性、メトキシレゾルフィン脱アルキル化活性、フラビンモノオキシゲナーゼ活性、エポキシヒドラターゼ活性、スルフォトランスフェラーゼ活性またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ活性である上記（１）記載の細胞株、
（３）酵素がNADPH チトクロームP450還元酵素、NADPH チトクロームP450、フラビンモノオキシゲーナーゼ、エポキシヒドラターゼ、グルクロシルトランスフェラーゼ、スルフォトランスフェラーゼまたはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである上記（１）記載の細胞株、
（４）NADPH チトクロームP450がCYP1A1,CYP1A2またはCYP3Aである上記（３）記載の細胞株、
（５）細胞株がＦＥＲＭＢＰ−６３２８である上記（１）記載の細胞株、
（６）ヒト正常肝臓細胞にSV(simian virus)40由来のT抗原遺伝子を導入せしめることを特徴とする上記（１）記載の細胞株の製造法、
（７）ヒト正常肝臓細胞がヒト胎児由来の肝臓の細胞である上記（６）記載の製造法、
（８）上記（１）記載の細胞株を用いることを特徴とする▲１▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素活性を阻害または促進または▲２▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子の発現能を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（９）上記（８）記載のスクリーニング方法を用いて得られる▲１▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素活性を阻害または促進するか、または▲２▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子の発現を阻害または促進する化合物またはその塩、
（１０）上記（１）記載の細胞株を用いることを特徴とする(a) 生体異物および／または内在性基質代謝に関与する酵素、(b) 生体異物および／または内在性基質代謝経路、(c)生体異物および／または内在性基質代謝産物の化学構造、(d) 生体異物および／または内在性基質代謝酵素の阻害、(e) 生体異物および／または内在性基質代謝酵素の活性の促進、(f) 生体異物および／または内在性基質代謝による細胞毒性、(g) 生体異物および／または内在性基質代謝による遺伝毒性、(h) 生体異物および／または内在性基質代謝による発ガン性、(i) 生体異物および／または内在性基質代謝のよる変異原性、(j) 生体異物および／または内在性基質代謝による肝毒性、または(k) 肝に作用する生体異物および／または内在性基質の解析方法、および
（１１）生体異物および／または内在性基質代謝産物の調製方法などに関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本明細書中、「正常細胞」、「正常肝臓細胞」または「正常組識」とは、癌化されていない細胞または組識を意味する。
また、「生体異物の代謝」とは、例えば薬物、食品添加物、環境汚染物質などの代謝を意味し、なかでも薬物代謝などが好ましく用いられる。
用いられるヒト正常肝臓細胞（好ましくはヒト正常肝臓実質細胞）は、ヒト成人、ヒト胎児（好ましくはヒト胎児など）などの正常組織からコラーゲナーゼ潅流法という確立された方法により分離することができる。この様にして得られたいわゆる初代培養細胞の不死化は、様々な公知方法などに準じて行われる。具体的には、癌化した組織が永久的に増殖を続けることに着目し、正常細胞個々に癌遺伝子の一部を導入し、細胞を形質転換して不死化しようとする方法などがあげられる。このようにして樹立された不死化細胞株としては、例えば、ｒａｓやｃ−ｍｙｃなどの発癌遺伝子、あるいは、アデノウイルスEIA、SV(simian virus)40ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ１６）等のＤＮＡ型腫瘍ウイルスの癌遺伝子またはそれらの腫瘍抗原（Ｔ抗原）遺伝子などを動物細胞に導入し、その形質転換体を継代させたものなどがあげられる（E.Ponet et al, Proc. Natl. Acad., Sci., USA 82 8503, (1985)）。好ましくは、SV40由来のT抗原遺伝子を導入という方法またはそれに準じた方法などを用いることができる(M.Miyazakiら、Experimental Cell Research,206,27-35 (1993))。これら不死化肝臓細胞の培養（継代培養）にあたっては公知の培地［例えば、完全合成培地（無血清完全合成培地が好ましい（例えばASF104培地など）（味の素））、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Seience），１２２巻，５０１(１９５２)〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Virology），８巻，３９６(１９５９)〕，ＲＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association）１９９巻，５１９(１９６７)〕，Williams培地（日水製薬),１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），７３巻，１(１９５０)〕］などを用いた公知の培養方法などが用いられる。なかでも、完全合成培地（無血清完全合成培地（例えばASF104培地など）（味の素））などが好ましく用いられる。ｐＨは約７〜７．２であるのが好ましい。培養は通常約３７℃前後で行なわれる。
【０００７】
なかでも、本発明の不死化肝臓細胞の樹立の過程において血清を含まない完全合成培地を使用することにより、無血清完全合成培地で増殖可能な不死化肝臓細胞を得ることができる。
こうして得られた不死化肝臓細胞の中から肝臓特異的な代謝上の性質、特に生体異物の代謝にかかわる酵素活性、酵素、遺伝子発現、遺伝子発現誘導を保持したものを選択する。
肝特異的な生体異物の代謝に関わる酵素活性としては、例えば、NADPH チトクロームP450 還元酵素活性、グルクロシルトランスフェラーゼ活性、混合機能酸化反応（ＭＦＯ）活性（例えば、エトキシレゾルフィン脱アルキル化活性、ベンジロキシレゾルフィン脱アルキル化活性、ペントキシルレゾルフィン脱アルキル化活性、メトキシレゾルフィン脱アルキル化活性など）、フラビンモノオキシゲナーゼ活性、エポキシヒドラターゼ活性、スルフォトランスフェラーゼ活性またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ活性などがあげられる。なかでも、 NADPH チトクロームP450 還元酵素活性、グルクロシルトランスフェラーゼ活性、混合機能酸化反応（ＭＦＯ）活性（例えば、エトキシレゾルフィン脱アルキル化活性、ベンジロキシレゾルフィン脱アルキル化活性、ペントキシルレゾルフィン脱アルキル化活性、メトキシレゾルフィン脱アルキル化活性など）が重要であり、特に、NADPH チトクロームP450 還元酵素活性は生体異物の代謝における機能の点から最も重要な酵素活性と考えられる。
【０００８】
肝特異的な生体異物の代謝に関わる酵素としては、例えば、 NADPH チトクロームP450 還元酵素、NADPHチトクロームP450、フラビンモノオキシゲーナーゼ、エポキシヒドラターゼ、グルクロシルトランスフェラーゼ、スルフォトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどが含まれる。これらのなかでNADPHチトクロームP450はその分布および生体異物の代謝における機能の点から最も重要な酵素群である。NADPHチトクロームP450は、多数の酵素タンパクの総称でありヒト肝臓で生体異物の代謝に関わる個々のNADPHチトクロームP450としては、CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A（具体的には、CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7など）, CYP2D6などが知られており、なかでも本発明の不死化肝細胞株には、CYP1A1, CYP1A2, CYP3Aなどが好ましく用いられる。また、 NADPHチトクロームP450の機能的な側面からの総称して混合機能酸化反応(MFO)とも総称されることがあり、エトキシレゾルフィン脱アルキル化活性、ベンジロキシレゾルフィン脱アルキル化活性、ペントキシルレゾルフィン脱アルキル化活性、およびメトキシレゾルフィン脱アルキル化活性などとして検知される。またさらに、 NADPHチトクロームP450タンパクのMFO機能発現には、NADPH チトクロームP450還元酵素の存在が必須であり本酵素も生体異物の代謝酵素に分類することができる。
また、多くの生体異物の代謝酵素は、ある一定の条件下で誘導を受けることが知られている。この例としては、CYP1A1, CYP1A2発現に対するベンズピレン、ベンズアントラセン、３-メチルコランスレン、ダイオキシンなどのいわゆる多環性芳香族化合物の効果、CYP2B（例えば、CYP2B6など）誘導に対するフェノバルビタール、フェノバルビトンの効果、CYP3A誘導に対するリファンピシン、デキサメタゾン、フェニトイン、フェニルブタゾンの効果などがよく知られている（C.G.ギブソンら、新版生体異物の代謝学講談社、1995年）。
本発明のヒト正常細胞由来不死化肝臓細胞株は、▲１▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素活性または▲２▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子の発現能を保持しているために、肝臓の生体異物の代謝異常に係る疾患（例えば、肝機能不全症など）に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のヒト正常細胞由来不死化肝臓細胞株に試験化合物を接触させ、▲１▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素活性または▲２▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子の発現の変化を観察・測定することを特徴とする▲１▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素活性を阻害または促進するか、または▲２▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子の発現を阻害または促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法などを提供する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
【０００９】
具体的には、本発明のヒト正常細胞由来不死化肝臓細胞株を、試験化合物で処理し、無処理の対照ヒト由来不死化肝臓細胞株と比較し、該ヒト由来不死化肝臓細胞株の▲１▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素活性、または▲２▼肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子の発現の変化などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、肝臓の生体異物の代謝異常に係る疾患（例えば、肝機能不全症など）に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例アルカリ金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、公知の製造法またはそれに準じた方法で製造することができる。このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、肝機能不全症の治療目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、肝機能不全症の治療目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００１０】
上記の製剤の剤形としての具体例としては、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、カプセル剤（マイクロカプセルを含む）、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、注射剤、吸入剤、軟膏などが用いられる。これらの製剤は常法（例えば日本薬局方記載の方法など）に従って調製される。
該製剤において、上記のスクリーニング方法で得られた化合物またはその塩の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常製剤全体に対して０．０１ないし１００重量％、好ましくは０．１ないし５０重量％、さらに好ましくは０．５ないし２０重量％程度である。
具体的には、錠剤の製造法は、医薬品をそのまま、賦形剤、結合剤、崩壊剤もしくはそのほかの適当な添加剤を加えて均等に混和したものを、適当な方法で顆粒とした後、滑沢剤などを加え、圧縮成型するかまたは、医薬品をそのまま、または賦形剤、結合剤、崩壊剤もしくはそのほかの適当な添加剤を加えて均等に混和したものを、直接圧縮成型して製するか、またはあらかじめ製した顆粒をそのまま、もしくは適当な添加剤を加えて均等に混合した後、圧縮成型しても製造することもできる。また、本剤は、必要に応じて着色剤、矯味剤などを加えることができる。さらに、本剤は、適当なコーティング剤で剤皮を施すこともできる。
注射剤の製造法は、医薬品の一定量を、水性溶剤の場合は注射用水、生理食塩水、リンゲル液など、非水性溶剤の場合は通常植物油などに溶解、懸濁もしくは乳化して一定量とするか、または医薬品の一定量をとり注射用の容器に密封して製することができる。
経口用製剤担体としては、例えばデンプン、マンニット、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどの製剤分野において常用されている物質が用いられる。注射用担体としては、例えば蒸留水、生理食塩水、グルコース溶液、輸液剤などが用いられる。その他、製剤一般に用いられる添加剤を適宜添加することもできる。
【００１１】
さらに本発明は、上記のヒト正常細胞由来不死化肝臓細胞株を用いることを特徴とする(a) 生体異物およびまたは内在性基質代謝に関与する酵素の解析方法、(b) 生体異物およびまたは内在性基質代謝経路の解析方法、(c)生体異物およびまたは内在性基質代謝産物の化学構造の解析方法、(d) 生体異物およびまたは内在性基質代謝産物の調製方法、(e) 生体異物およびまたは内在性基質代謝酵素の阻害の解析方法、(f) 生体異物およびまたは内在性基質代謝酵素の活性の促進の解析方法、(g) 生体異物およびまたは内在性基質代謝による細胞毒性の発現の解析方法、(h) 生体異物およびまたは内在性基質代謝による遺伝毒性の発現の解析方法、(i) 生体異物およびまたは内在性基質代謝による発ガン性発現の解析方法、(j) 生体異物およびまたは内在性基質代謝のよる変異原性の解析方法、(k) 生体異物およびまたは内在性基質代謝に肝毒性発現の解析方法または(l) 肝に作用する生体異物およびまたは内在性基質の解析方法などに関する。以下に上記(a)〜(l)記載の各方法について説明する。
【００１２】
(a) 生体異物および／または内在性基質代謝に関与する酵素の解析方法：
たとえば、被検物質のヒト正常細胞由来不死化肝臓細胞への暴露による生体異物およびまたは内在性基質の構造の変化を解析することにより生体異物および／または内在性基質代謝に関与する酵素の解析が可能である(J.L. .Napoli ほか Methods in Enzymology vol. 206 pp.491-501 Ed. by M.R. WatermanほかAcademic Press 1991、H. K. Kroemer ほか Methods in Enzymology vol. 272 pp.99-198 Ed. by M.R. WatermanほかAcademic Press 1996)。具体的には、被検物質のヒト正常細胞由来不死化肝臓細胞への暴露による生体異物および／または内在性基質の構造の変化を各種酵素の阻害・拮抗物質あるいは各種酵素の中和抗体により解析することによる生体異物および／または内在性基質代謝に関与する酵素の同定、被検物質の細胞への暴露による生体異物およびまたは内在性基質の構造の変化を解析することによる酵素反応機構の解析、基質特異性の解析などをあげることができる。
被検物質としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
(b) 生体異物および／または内在性基質代謝経路の解析方法：
たとえば、被検物質のヒト正常細胞由来不死化肝臓細胞への暴露による生体異物および／または内在性基質の構造の変化を解析することにより生体異物および／または内在性基質代謝経路の解析が可能である(J.L. Napoli ほか Methods in Enzymology vol. 206 pp.491-501 Ed. by M.R. WatermanほかAcademic Press 1991、H. K. Kroemer ほか Methods in Enzymology vol. 272 pp.99-198 Ed. by M.R. WatermanほかAcademic Press 1996)。
被検物質としては、上記と同様のものなどが用いられる。
(c)生体異物および／または内在性基質代謝産物の化学構造の解析方法：
たとえば、被検物質の細胞への暴露により生じた生体異物および／または内在性基質の構造の変化を解析することにより生体異物および／または内在性基質代謝産物の化学構造の解析が可能である(J. L. Napoli ほか Methods in Enzymology vol. 206 pp.491-501 Ed. by M.R. WatermanほかAcademic Press 1991、H. K. Kroemer ほか Methods in Enzymology vol. 272 pp.99-198 Ed. by M.R. WatermanほかAcademic Press 1996)。
被検物質としては、上記と同様のものなどが用いられる。
【００１３】
(d) 生体異物および／または内在性基質代謝産物の調製方法：
たとえば、被検物質を細胞に暴露せしめた結果生じた生体異物およびまたは内在性基質の変換物質（いわゆる代謝産物）を採取し適切な方法で精製分離することにより生体異物および／または内在性基質代謝産物の調製が可能である(J.L. Napoli ほか Methods in Enzymology vol. 206 pp.491-501 Ed. by M.R. WatermanほかAcademic Press 1991)。
被検物質としては、上記と同様のものなどが用いられる。
(e) 生体異物および／または内在性基質代謝酵素の阻害の解析方法
たとえば、被検物質を細胞へ暴露することにより生体異物および／または内在性基質代謝酵素の活性の阻害の解析が可能である(J.L. Napoli ほか Methods in Enzymology vol. 206 pp.491-501 Ed. by M.R. WatermanほかAcademic Press 1991)。具体的には、チトクロームP450酵素活性の阻害、タンパク量の減少、mRNAの減少などにより検出することが可能である。検出方法としては、各種P450に対応する酵素活性の測定、各種P450蛋白質に対応するウエスタンブロティング、各種P450 mRNAに対応するノザンハイブリダイゼーションあるいはRT-PCR法など公知の手法を使用することができる。
被検物質としては、上記と同様のものなどが用いられる。
(f) 生体異物および／または内在性基質代謝酵素の活性の促進の解析方法：
たとえば、被検物質を細胞へ暴露し、生体異物および／または内在性基質代謝酵素活性の上昇、酵素量の増加または酵素をコードする遺伝子の転写量の上昇などを検出することにより生体異物および／または内在性基質代謝酵素の活性の促進の解析が可能である(J. Rueff ほかMutation Research 353(1996) 151-176)。具体的には、チトクロームP450酵素活性の上昇、タンパク量の増加、mRNAの増加を検出することで可能である。検出方法としては、各種P450に対応する酵素活性の測定、各種P450蛋白質に対応するウエスタンブロティング、各種P450 mRNAに対応するノザンハイブリダイゼーションあるいはRT-PCR法など公知の手法を使用することができる。
被検物質としては、上記と同様のものなどが用いられる。
【００１４】
(g) 生体異物および／または内在性基質代謝による細胞毒性の解析方法：
たとえば、被検物質の細胞への暴露により生体異物および／または内在性基質代謝による細胞毒性の解析が可能である。具体的には、被検物質の暴露による細胞の形態の変化、生細胞数の変動、細胞内酵素の漏出、細胞表層構造の変化あるいは細胞内酵素の変動などを観察することにより解析される(D. Wu ほか Journal of Biological Chemistry, 271, (1996) 23914-23919)。
被検物質としては、上記と同様のものなどが用いられる。
(h) 生体異物および／または内在性基質代謝による遺伝毒性の解析方法：
たとえば、被検物質を細胞に暴露し、細胞を染色体異常試験、小核試験などに付すことより生体異物および／または内在性基質代謝による遺伝毒性の解析が可能である。またさらに、被検物質を細胞に暴露したのち、細胞により変化した被検物質を適切な評価系で評価することにより染色体異常試験、小核試験、復帰突然変異試験などに付すことにより解析が可能である(J. Rueff ほかMutation Research 353(1996) 151-176, M. E. McManus ほか Methods in Enzymology vol. 206 pp.501-508 Ed. by M.R. WatermanほかAcademic Press 1991))。
被検物質としては、上記と同様のものなどが用いられる。
(i) 生体異物および／または内在性基質代謝による発ガン性の解析方法：
たとえば、被検物質を細胞に暴露し、細胞を染色体異常試験、DNAの修飾などに付すことにより生体異物および／または内在性基質代謝による発ガン性の解析が可能である。またさらに、被検物質を細胞に暴露したのち、細胞により変化した被検物質を適切な化学物質による発ガン評価系で評価することにより解析が可能である(J. Rueff ほかMutation Research 353(1996) 151-176, K. Kawajiri ほかCytochromes P450 metabolic and toxicological aspects pp77-98 ed. by C. Ioannides CRC press (1996))。
被検物質としては、上記と同様のものなどが用いられる。
(j) 生体異物および／または内在性基質代謝のよる変異原性の解析方法：
たとえば、被検物質を細胞に暴露し、細胞を染色体異常試験、小核試験などに付すことにより生体異物および／または内在性基質代謝のよる変異原性の解析が可能である。またさらに、被検物質を細胞に暴露したのち、細胞により変化した被検物質を適切な評価系で評価することにより染色体異常試験、小核試験、復帰突然変異試験などに付すことにより解析が可能である(J. Rueff ほかMutation Research 353(1996) 151-176)。
被検物質としては、上記と同様のものなどが用いられる。
(k) 生体異物および／または内在性基質代謝による肝毒性の解析方法：
たとえば、被検物質を細胞に暴露し、細胞毒性の発現を観察することにより、あるいは、被検物質を細胞に暴露したのち、細胞により変化した被検物質を他の肝細胞、肝切片、摘出肝または、実験動物へ投与しそれによる細胞、組織、生体の変化を観察することにより生体異物および／または内在性基質代謝による肝毒性を解析することが可能である。
被検物質としては、上記と同様のものなどが用いられる。
(l) 肝に作用する生体異物および／または内在性基質の解析方法：
たとえば、被検物質の細胞への暴露による細胞の変化の発現を観察することにより、あるいは、被検物質を細胞に暴露したのち、細胞により変化した被検物質を他の肝細胞、肝切片、摘出肝または、実験動物へ投与しそれによる細胞、組織、生体の変化を観察することにより肝への作用の発現を解析することが可能である。
被検物質としては、上記と同様のものなどが用いられる。
【００１５】
本明細書において、塩基などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commision on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。
Ａ：アデニン
Ｔ：チミン
Ｇ：グアニン
Ｃ：シトシン
【００１６】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
後述の実施例３において行われたＲＴ−ＰＣＴ法においてＣＹＰ１Ａ１に対して用いられた合成プライマー塩基配列を示す。
〔配列番号：２〕
後述の実施例３において行われたＲＴ−ＰＣＴ法においてＣＹＰ１Ａ１に対して用いられた合成プライマー塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
後述の実施例３において行われたＲＴ−ＰＣＴ法においてＣＹＰ１Ａ２に対して用いられた合成プライマー塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
後述の実施例３において行われたＲＴ−ＰＣＴ法においてＣＹＰ１Ａ２に対して用いられた合成プライマー塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
後述の実施例３において行われたＲＴ−ＰＣＴ法においてＣＹＰ３Ａに対して用いられた合成プライマー塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
後述の実施例３において行われたＲＴ−ＰＣＴ法においてＣＹＰ３Ａに対して用いられた合成プライマー塩基配列を示す。
【００１７】
後述の実施例１で得られたＯＵＭＳ−２９株は、平成１０年４月２１日から通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−６３２８として、平成１０年４月２１日から財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ５０４８７として寄託されている。
【００１８】
【実施例】
以下本発明の実施例について詳細に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。また、個々の遺伝子操作の手法は特に断りのない限りサムブルーク(Sambrook)らのマニュアル（(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）による一般的手法をもちいた。
【００１９】
【実施例１】
肝細胞株の樹立
SV 40 T抗原遺伝子の導入による不死化細胞の樹立は確立された手法に従い実施した(M.Miyazakiほか、Experimental Cell Research, 206,27-35 (1993))。２１週令ヒト死亡胎児より肝臓を摘出し、公知のコラーゲナーゼ潅流法により肝実質細胞の初代細胞を分離した。この細胞を10％牛胎児血清を添加したWilliams培地（日水製薬)にまき培養した。培養24時間後にリポフェクション法でSV40 T抗原遺伝子の導入を行った。SV40T抗原遺伝子の導入にはプラスミドpSV3Neo（P.J. Southern and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341）を用いた。リポフェクション及びそれ以降は一貫して培養培地として無血清完全合成培地(ASF104、味の素）用いた。トランスフェクション後３日目に継代培養を実施して肝細胞の増殖を促進するとともに最終濃度100μg/mlのG418(ギブコ(GIBCO Laboratoyies))を添加し、さらに２日間培養しネオマイシン耐性細胞を選択した。その後３０日間の培養により明瞭なG418耐性を示すクローンを得OUMS-29と命名した。このクローンはさらに３００代に亘りASF104培地中で増殖を続けたため、不死化したものと考えられた。
【００２０】
【実施例２】
OUMS-29株の薬物代謝酵素活性の測定
５ないし７日間ASF104培地で培養しコンフルエントに達したOUMS-29細胞を集め0.1Mリン酸緩衝液(pH7.6)中に懸濁し超音波発生装置で破砕しこれを酵素源として以下の酵素活性の測定に供した。
【００２１】
(1)チトクロームP450還元酵素活性
測定はBiological Pharmacology,37,4111-4116,1988記載の方法を基本に測定した。すなわちチトクロームC(和光純薬）を基質としてNADPH（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）およびOUMS-29由来の酵素源を存在させチトクロームＣの還元に基づきチトクロームP450還元酵素活性を測定した。その結果、蛋白質１ミリグラム・１分あたり1ナノモルのチトクロームCを還元する活性を1ユニットとしてOUMS-29株に由来する酵素源は８ユニットの酵素活性を示した。
【００２２】
(2)グルクロシルトランスフェラーゼ活性
測定はBiologicalPharmacology,37,4111-4116,1988記載の方法を基本に測定した。すなわち
1-ナフトール（シグマ）を基質としてUDP-グルクロン酸（シグマ）およびOUMS-29由来の酵素源を共存させ1-ナフトールグルクロニドの生成量を測定した。その結果、蛋白質１ミリグラム・１分あたり1ピコモルの1-ナフトールグルクロニドを生成する活性を1ユニットとしてOUMS-29株に由来する酵素源は１９６ユニットの酵素活性を示した。
【００２３】
(3)混合機能酸化反応(MFO)活性
測定はBiologicalPharmacology,42,1307-1313,1991記載の方法を基本に測定した。すなわち
エトキシレゾルフィン（シグマ）、ペントキシレゾルフィン（シグマ）、ベンジロキシレゾルフィン（シグマ）及びメトキシレゾルフィン（シグマ）を基質としてNADPHおよびOUMS-29由来の酵素源を共存させ各々の基質の脱アルキル化により生じる生成物の量を測定した。その結果、蛋白質１ミリグラム・１分あたり1ピコモルの生成物を生じる活性を1ユニットとしてOUMS-29株に由来する酵素源はエトキシレゾルフィンを基質としたとき0.25ユニット、ペントキシレゾルフィンを基質としたとき0.47ユニット、ベンジロキシレゾルフィンを基質としたと0.38ユニット、メトキシレゾルフィンを基質としたとき0.32ユニットの酵素活性をおのおの示した。
【００２４】
【実施例３】
チトクロームP450遺伝子の発現
OUMS-29株におけるチトクロームP450の発現は異なるチトクロームP450に特異的なＤＮＡプライマーを用いて公知のRT-PCR法によりmRNA量のレベルを検討することにより解析することができる。これらのプライマーはジーンバンク(Gene Bank)のデータベースから入手可能である各々のチトクロムP450の配列から調製できる。GeneBank における受け入れ番号はおのおのCYP1A1はK03191、CYP1A2はM55053、CYP2E1はJ02625、CYP3A4はJ04449、CYP3A5はJ04813、CYP3A7はD00408である。個々のプライマーは、CYP1A1に対しては、5'-ATGCTTTTCCCAATCTCCATGTGC および5'-TTCAGGTCCTTGAAGGCATTCAGG。CYP1A2に対しては、5'-GGAAGAACCCGCACCTGGCACTGTおよび5'-AAACAGCATCATCTTCTCACTCAA。CYP3Aに対しては、5'-ATGGCTCTCATCCCAGACTTGおよび5'-GGAAAGACTGTTATTGAGAGAを各々用いた。
RT-PCR法におけるアニーリング温度は、 CYP1A1が55℃、 CYP1A2が65℃、CYP3Aが55℃、 CYP2E1が65℃、サイクル数は28〜36サイクルという条件下で行われた。
OUMS-29株を５ないし７日間培養しコンフルエントに達した細胞を集めこれよりRNAイージー(RNAeasy)キット（キアゲン(Quiagen))を用いてRNAを抽出した。このRNAと、先に決定した各チトクロームP450に特異的なプライマーをワンステップPCRキット（宝酒造）によりmRNAからの逆転写およびPCR反応を行い、ついでアガロースゲルで分離し、臭化エチジウム存在下で紫外線で可視化する。その結果を図１に示す。おのおのCYP1A1に予測される763bp、CYP1A2に予測される1180bp、CYP3Aに予測される680bp付近のシグナルが検出され対応する遺伝子のOUMS-29株における発現が確認された。
【００２５】
【実施例４】
チトクロームP450遺伝子の発現の誘導
５ないし７日間培養しコンフルエントに達したOUMS-29細胞に最終濃度0〜10000ｎＭの３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）（図２）、0〜50000ｎＭのベンズピレン（ＢＰ）（図３）、0〜25ｍＭのフェノバルビトン（ＰＢ）（図４）あるいは、0〜1000ｎＭのデキサメタゾン（ＤＥＸ）（図５）を添加しさらに1日間培養した。培養後細胞を分離しこれより先に示した方法を用いてRNAを抽出しRT-PCR反応を実施した。
RT-PCR法におけるアニーリング温度は、 CYP1A1が55℃、 CYP1A2が65℃、CYP3Aが55℃、サイクル数は28〜36サイクルという条件下で行われた。
また、コントロールとして用いられるベータアクチンのサイクル数は、15サイクルであった。
この時あらゆる組織で同程度に発現しているベータアクチン（beta actin）のmRNA量を基準にして各サンプルの総mRNA量を補正するためアクチンコンペティティブRT-PCRキット（宝酒造）を用いた。結果を図２〜図５に示す。CYP1A1の発現は３−メチルコランスレン、ベンズピレン、フェノバルビトンの添加により、CYP1A2の発現は、３−メチルコランスレン、ベンズピレンの添加により、CYP3Aの発現はデキサメタゾンの添加により増強され、OUMS-29株にはチトクロムP450をコードする遺伝子の発現能が存在することが確認された。
【００２６】
【発明の効果】
本発明のヒト正常細胞由来不死化肝臓細胞株、即ち、肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素活性または肝臓の生体異物の代謝に関わる酵素をコードする遺伝子の発現能を保持するヒト由来不死化肝臓細胞株は、例えば、肝機能不全症などの予防・治療効果を有する化合物またはその塩のスクリーニングのために有用である。
【００２７】
【配列表】

【００２８】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例３で行われたRT-PCR法の結果を示す（電気泳動図）。
図中、Marker２，５，６はおのおのＤＮＡ分子量マーカー（ニッポンジーン製）を示す。
【図２】実施例４で行われた３−メチルコランスレン（３−ＭＣ）を添加後のRT-PCR法の結果を示す。
【図３】実施例４で行われたベンズピレン（ＢＰ）を添加後のRT-PCR法の結果を示す。
【図４】実施例４で行われたフェノバルビトン（ＰＢ）を添加後のRT-PCR法の結果を示す。
【図５】実施例４で行われたデキサメタゾン（ＤＥＸ）を添加後のRT-PCR法の結果を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention includes (1) a novel human (preferably human fetal) normal cell-derived liver immortalized cell line, (2) a method for producing the cell line, and (3) using the cell line. (2) a method for screening a compound or a salt thereof that inhibits or promotes an enzyme activity involved in the metabolism of xenobiotics in the liver, or (2) inhibits or promotes expression of a gene encoding an enzyme involved in the metabolism of xenobiotics in the liver; 4) Inhibiting or promoting the enzyme activity involved in the metabolism of xenobiotic liver obtained using the screening method, or (2) Expression of a gene encoding an enzyme involved in the metabolism of xenobiotic liver. The present invention relates to a compound or a salt thereof that inhibits or promotes, and (5) a method for analyzing an enzyme involved in xenobiotic and / or endogenous substrate metabolism using the cell line.
[0002]
[Prior art]
Liver cells have a great number of physiological functions, but in particular, metabolize xenobiotics such as drugs, food additives, and environmental pollutants and convert them into forms that are easy to excrete. It plays a very important function. The function of metabolism of xenobiotics may lead to mutagenesis by the xenobiotics, manifestation of toxicity, or manifestation of substance effectiveness, and is being studied very widely. For these reasons, cultured hepatocytes are not only a substitute for experimental animals, but also provide a test method for examining metabolism in the liver quickly, inexpensively and accurately, so-called artificial livers that substitute for the function of the liver. It has been considered that it can be created.
However, normal human hepatocytes isolated from living tissue cannot be subcultured. Cells that can be established as a cell line often do not have the original differentiation trait and often do not accurately reflect the function of the tissue to which the cell line originally belonged. In particular, enzymes that metabolize so-called xenobiotics in hepatocytes lose their activity in a very short period of time in primary culture, and no established cell line has been found that retains their properties sufficiently. (J. Dich et al., Hepatology, 8, 39-45 (1988)). From this point of view, hepatocytes that retain the ability to metabolize xenobiotics and can be cultured have been widely demanded. Human liver cell lines are prepared by selecting human tumor cells, for example, HepG2 (Aden et al. Nature, 282, 615-616, 1979) is known. However, these cells are derived from tumor cells, and normal cells are not immortalized. As a method for immortalizing normal cells, that is, allowing them to proliferate indefinitely, for example, methods such as introducing a T antigen gene derived from SV (simian virus) 40 are generally used. However, immortalization of normal parenchymal cells in the liver, especially enzyme activity involved in xenobiotic metabolism, expression of genes encoding enzymes involved in xenobiotic metabolism, expression induction of genes encoding enzymes involved in xenobiotic metabolism There is no known immortalized cell line derived from normal human liver parenchymal cells. In the culture of many cell lines, serum components are essential in the medium. The need for this serum component not only significantly impairs the stability of cultured cell properties due to the lack of quality stability of the serum, but also makes the cell line stable, accurate and inexpensive due to the very high price of serum. Use was significantly inhibited. Therefore, if the established immortalized cell line can be grown in a serum-free medium while maintaining its character stably, it can provide a great industrial advantage.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is derived from human normal liver cells (preferably human normal liver parenchymal cells) and can be grown in a serum-free complete synthetic medium, and is particularly involved in the metabolism of xenobiotics among the specific metabolic functions of human liver. It is to provide a cell line in which the enzyme activity and the expression of a gene encoding an enzyme involved in xenobiotic metabolism can be observed, and to isolate and produce the cell line.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
In light of the above problems, the present inventors have conducted extensive research, and as a result, can be grown in human normal liver parenchymal cells and in a serum-free complete synthetic medium, and among the specific metabolic functions of human liver, We succeeded in establishing a cell line that can observe the enzyme activity involved in xenobiotic metabolism and the expression of the gene encoding the enzyme involved in xenobiotic metabolism. As a result of further research, the present invention was completed. It was.
[0005]
That is, the present invention
(1) a human normal cell-derived immortalized liver cell line that retains the enzyme activity involved in the metabolism of liver xenobiotics or the gene encoding the enzyme involved in the metabolism of liver xenobiotics,
(2) Enzymatic activity is NADPH cytochrome P450 reductase activity, glucurosyltransferase activity, ethoxyresorufin dealkylation activity, benzyloxyresorufin dealkylation activity, pentoxyl resorufin dealkylation activity, methoxyresorufin dealkylation activity Cell line according to the above (1), which has acetylation activity, flavin monooxygenase activity, epoxy hydratase activity, sulfotransferase activity or glutathione S-transferase activity,
(3) the cell line according to (1) above, wherein the enzyme is NADPH cytochrome P450 reductase, NADPH cytochrome P450, flavin monooxygenase, epoxy hydratase, glucurosyltransferase, sulfotransferase or glutathione S-transferase,
(4) The cell line according to (3) above, wherein NADPH cytochrome P450 is CYP1A1, CYP1A2 or CYP3A,
(5) The cell line according to (1) above, wherein the cell line is FERM BP-6328,
(6) A method for producing a cell line according to (1) above, wherein a T (antigen gene) derived from SV (simian virus) 40 is introduced into normal human liver cells,
(7) The production method according to the above (6), wherein the human normal liver cells are human embryonic liver cells,
(8) The cell line described in (1) above is used, (1) inhibits or promotes the enzyme activity involved in xenobiotic metabolism in the liver, or (2) encodes an enzyme involved in xenobiotic metabolism in the liver A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits or promotes the expression ability of the gene
(9) Inhibiting or promoting enzyme activity related to metabolism of xenobiotics in liver obtained by using the screening method described in (8) above, or (2) Enzymes involved in metabolism of xenobiotics in liver A compound or salt thereof that inhibits or promotes the expression of the encoded gene,
(10) (a) an enzyme involved in xenobiotic and / or endogenous substrate metabolism, (b) xenobiotic and / or endogenous substrate metabolic pathway, wherein the cell line described in (1) above is used, c) chemical structure of xenobiotics and / or endogenous substrate metabolites, (d) inhibition of xenobiotics and / or endogenous substrate metabolizing enzymes, (e) promotion of activities of xenobiotics and / or endogenous substrate metabolizing enzymes, (f) cytotoxicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism, (g) genotoxicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism, (h) carcinogenicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism, ( i) mutagenicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism, (j) hepatotoxicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism, or (k) xenobiotics and / or endogenous substrates acting on the liver Analysis method, and
(11) It relates to a method for preparing xenobiotics and / or endogenous substrate metabolites.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present specification, “normal cell”, “normal liver cell” or “normal tissue” means a cell or tissue that is not cancerous.
Further, “metabolism of xenobiotic” means metabolism of drugs, food additives, environmental pollutants, etc., among which drug metabolism is preferably used.
The human normal liver cells used (preferably human normal liver parenchymal cells) can be isolated from normal tissues such as human adults and human fetuses (preferably human fetuses) by an established method called collagenase perfusion. Immortalization of the so-called primary cultured cells obtained in this manner is performed according to various known methods. Specifically, focusing on the fact that cancerous tissues continue to proliferate permanently, methods such as introducing a part of the oncogene into normal cells and transforming the cells to immortalize can be mentioned. . Examples of immortalized cell lines established in this manner include oncogenes such as ras and c-myc, or DNA-type tumors such as adenovirus EIA, SV (simian virus) 40 virus, and human papilloma virus (HPV16). Examples include those obtained by introducing viral oncogenes or their tumor antigen (T antigen) genes into animal cells, and substituting the transformants (E. Ponet et al, Proc. Natl. Acad., Sci., USA 82 8503, (1985)). Preferably, a method of introducing an SV40-derived T antigen gene or a method based thereon can be used (M. Miyazaki et al., Experimental Cell Research, 206, 27-35 (1993)). In the culture (subculture) of these immortalized liver cells, a known medium [for example, a complete synthetic medium (a serum-free complete synthetic medium (for example, ASF104 medium etc.) (Ajinomoto Co., Inc.), Ajinomoto)), about 5 to 20% fetal bovine MEM medium with serum [Seience, 122, 501 (1952)], DMEM medium (Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical・ The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Williams medium (Nissui Pharmaceutical), 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine (Proceeding) of the Society for the Biological Medicine), 73, 1 (1950)]] and the like. That. Of these, a complete synthetic medium (serum-free complete synthetic medium (such as ASF104 medium) (Ajinomoto)) and the like are preferably used. The pH is preferably about 7 to 7.2. The culture is usually performed at about 37 ° C.
[0007]
In particular, immortalized liver cells that can be grown in a serum-free complete synthetic medium can be obtained by using a completely synthetic medium that does not contain serum in the process of establishing the immortalized liver cells of the present invention.
From the thus obtained immortalized liver cells, those that retain the liver-specific metabolic properties, particularly the enzyme activity, enzyme, gene expression, and gene expression induction involved in xenobiotic metabolism are selected.
Examples of enzyme activities involved in liver-specific xenobiotic metabolism include NADPH cytochrome P450 reductase activity, glucurosyltransferase activity, mixed function oxidation reaction (MFO) activity (eg, ethoxyresorufin dealkylation activity, benzil Roxyresorufin dealkylation activity, pentoxyl resorufin dealkylation activity, methoxyresorufin dealkylation activity, etc.), flavin monooxygenase activity, epoxy hydratase activity, sulfotransferase activity or glutathione S-transferase activity It is done. Among them, NADPH cytochrome P450 reductase activity, glucurosyltransferase activity, mixed function oxidation reaction (MFO) activity (eg, ethoxyresorufin dealkylation activity, benzyloxyresorufin dealkylation activity, pentoxyl resorufin dealkylation activity) In particular, NADPH cytochrome P450 reductase activity is considered to be the most important enzyme activity in terms of its function in xenobiotic metabolism.
[0008]
Examples of enzymes involved in liver-specific xenobiotic metabolism include NADPH cytochrome P450 reductase, NADPH cytochrome P450, flavin monooxygenase, epoxy hydratase, glucurosyltransferase, sulfotransferase, glutathione S-transferase, etc. Is included. Among these, NADPH cytochrome P450 is the most important enzyme group in terms of its distribution and function in xenobiotic metabolism. NADPH cytochrome P450 is a collective term for many enzyme proteins. Individual NADPH cytochrome P450s involved in xenobiotic metabolism in human liver include CYP1A1, CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, and CYP3A (specifically, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, etc.), CYP2D6, etc. are known. Among them, CYP1A1, CYP1A2, CYP3A, etc. are preferably used for the immortalized hepatic cell line of the present invention. In addition, from the functional aspect of NADPH cytochrome P450, it is sometimes collectively referred to as mixed function oxidation reaction (MFO), and ethoxyresorufin dealkylation activity, benzyloxyresorufin dealkylation activity, pentoxyl reso Detected as ruffin dealkylation activity, methoxyresorufin dealkylation activity, and the like. Furthermore, the presence of NADPH cytochrome P450 reductase is essential for the expression of MFO function of NADPH cytochrome P450 protein, and this enzyme can also be classified as a xenobiotic metabolic enzyme.
In addition, it is known that many xenobiotic metabolic enzymes are induced under certain conditions. Examples of this include the effects of so-called polycyclic aromatic compounds such as benzpyrene, benzanthracene, 3-methylcholanthrene, dioxin on CYP1A1, CYP1A2 expression, phenobarbital, phenobarbitone on CYP2B (eg, CYP2B6) induction, etc. The effects of rifampicin, dexamethasone, phenytoin and phenylbutazone on CYP3A induction are well known (CG Gibson et al., New Edition of Xenobiotic Metabolism, Kodansha, 1995).
The human normal cell-derived immortalized liver cell line of the present invention retains (1) the enzyme activity involved in xenobiotic metabolism in the liver or (2) the ability to express a gene encoding an enzyme involved in xenobiotic metabolism in the liver. Therefore, it can be used for screening for a compound having a therapeutic / prophylactic effect for diseases related to abnormal metabolism of xenobiotics in the liver (for example, liver dysfunction).
That is, the present invention involves contacting a test compound with the human normal cell-derived immortalized liver cell line of the present invention, and (1) enzyme activity related to liver xenobiotic metabolism or (2) liver xenobiotic metabolism. (1) Inhibiting or promoting the enzyme activity involved in xenobiotic metabolism in the liver, or (2) In metabolizing xenobiotics in the liver A screening method for a compound or a salt thereof that inhibits or promotes the expression of a gene encoding the enzyme concerned is provided.
Examples of the test compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These compounds are novel compounds. It may be a known compound.
[0009]
Specifically, the human normal cell-derived immortalized liver cell line of the present invention is treated with a test compound, and compared with an untreated control human-derived immortalized liver cell line, 1) Test the therapeutic / preventive effects of the test compound using changes in the enzyme activity involved in xenobiotic metabolism in the liver or (2) changes in the expression of genes encoding enzymes involved in xenobiotic metabolism in the liver as indicators. be able to.
The compound obtained by using the screening method of the present invention is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is used for the treatment / prevention of diseases related to abnormal metabolism of liver xenobiotics (for example, liver dysfunction). Since it has an effect, it can be used as a medicine such as a safe and low-toxic therapeutic / preventive agent for the disease. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used as well.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids), bases (eg, alkali metals) and the like. In particular, physiologically acceptable acid addition salts are preferred. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
A medicament containing the compound obtained by the screening method or a salt thereof can be produced by a known production method or a method analogous thereto. Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, dogs, monkeys, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when the compound is administered orally for the purpose of treating liver dysfunction, it is generally used for adults (body weight 60 kg). As) is administered at about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc. For example, for the purpose of treating liver dysfunction, the compound is usually administered in the form of an injection (60 kg). The compound is administered at about 0.01 to 30 mg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg by intravenous injection per day. It is. In the case of other animals, an amount converted per 60 kg can be administered.
[0010]
Specific examples of dosage forms of the above preparations include tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, capsules (including microcapsules), granules, fine granules, powders, syrups, and emulsions. Suspensions, injections, inhalants, ointments and the like are used. These preparations are prepared according to conventional methods (for example, methods described in the Japanese Pharmacopoeia).
In the preparation, the content of the compound obtained by the above screening method or a salt thereof varies depending on the form of the preparation, but is usually 0.01 to 100% by weight, preferably 0.1 to 50%, based on the whole preparation. % By weight, more preferably about 0.5 to 20% by weight.
Specifically, the tablet production method is as follows: a pharmaceutical product as it is, and an excipient, a binder, a disintegrant or other suitable additive added and mixed evenly into granules by an appropriate method; Add a lubricant, etc., and compress or mold it, or directly compress and mold the drug as it is, or evenly mixed with excipients, binders, disintegrants or other appropriate additives. Alternatively, the granule prepared in advance can be produced as it is, or after adding an appropriate additive and mixing uniformly, and then compression molding. Moreover, this agent can add a coloring agent, a corrigent, etc. as needed. Furthermore, the agent can be coated with an appropriate coating agent.
Injectables are prepared in a certain amount by dissolving, suspending or emulsifying a certain amount of pharmaceuticals in water for injection, physiological saline, Ringer's solution, etc. in the case of aqueous solvents, and usually in vegetable oil in the case of non-aqueous solvents. Alternatively, a certain amount of medicine can be taken and sealed in an injection container.
As the oral pharmaceutical carrier, for example, substances commonly used in the pharmaceutical field such as starch, mannitol, crystalline cellulose, sodium carboxymethyl cellulose and the like are used. As the carrier for injection, for example, distilled water, physiological saline, glucose solution, infusion agent and the like are used. In addition, additives generally used for preparations can be appropriately added.
[0011]
Furthermore, the present invention is characterized by using the above-mentioned human normal cell-derived immortalized liver cell line (a) a method for analyzing xenobiotics and / or enzymes involved in endogenous substrate metabolism, (b) xenobiotics and / or endogenous (C) Xenobiotic and / or endogenous substrate metabolite chemical structure analysis method, (d) Xenobiotic and / or endogenous substrate metabolite preparation method, (e) Xenobiotic and / or Analysis method of inhibition of endogenous substrate metabolizing enzyme, (f) Analysis method of promotion of activity of xenobiotic and / or endogenous substrate metabolizing enzyme, (g) Analysis method of expression of cytotoxicity by xenobiotic and / or endogenous substrate metabolism , (H) Analysis method of genotoxicity due to xenobiotic and / or endogenous substrate metabolism, (i) Analysis method of carcinogenic expression due to xenobiotic and / or endogenous substrate metabolism, (j) Xenobiotic and / or endogenous Base The method of analysis mutagenicity by metabolic relates etc. (k) analyzing method or (l) Analysis method of xenobiotics and or endogenous substrates acts on liver liver toxicity in xenobiotics and or endogenous substrates metabolism. Each method described in the above (a) to (l) will be described below.
[0012]
(a) Methods for analyzing xenobiotics and / or enzymes involved in endogenous substrate metabolism:
For example, analysis of xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism by analyzing changes in the structure of xenobiotics and / or endogenous substrates due to exposure of test substances to human normal cell-derived immortalized liver cells (JL Napoli et al. Methods in Enzymology vol. 206 pp.491-501 Ed. By MR Waterman et al. Academic Press 1991, HK Kroemer et al. Methods in Enzymology vol. 272 pp.99-198 Ed. By MR Waterman et al. Academic Press 1996). Specifically, changes in the structure of xenobiotics and / or endogenous substrates due to exposure of test substances to human normal cell-derived immortalized liver cells are analyzed with inhibitors / antagonists of various enzymes or neutralizing antibodies of various enzymes Identifying enzymes involved in xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism, analyzing enzyme reaction mechanisms by analyzing changes in the structure of xenobiotics and / or endogenous substrates due to exposure of test substances to cells, Examples include analysis of substrate specificity.
Examples of the test substance include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, etc. These compounds are novel compounds. It may be a known compound.
(b) Xenobiotic and / or endogenous substrate metabolic pathway analysis method:
For example, xenobiotics and / or endogenous substrate metabolic pathways can be analyzed by analyzing changes in the structure of xenobiotics and / or endogenous substrates due to exposure of test substances to immortalized liver cells derived from human normal cells. Yes (JL Napoli et al. Methods in Enzymology vol. 206 pp.491-501 Ed. By MR Waterman et al. Academic Press 1991, HK Kroemer et al. Methods in Enzymology vol. 272 pp.99-198 Ed. By MR Waterman et al. Academic Press 1996) .
As the test substance, those similar to the above are used.
(c) Method for analyzing the chemical structure of xenobiotics and / or endogenous substrate metabolites:
For example, it is possible to analyze the chemical structure of xenobiotics and / or endogenous substrate metabolites by analyzing changes in the structure of xenobiotics and / or endogenous substrates caused by exposure of test substances to cells ( JL Napoli et al. Methods in Enzymology vol. 206 pp.491-501 Ed. By MR Waterman et al. Academic Press 1991, HK Kroemer et al. Methods in Enzymology vol. 272 pp.99-198 Ed. By MR Waterman et al. Academic Press 1996).
As the test substance, those similar to the above are used.
[0013]
(d) Preparation of xenobiotics and / or endogenous substrate metabolites:
For example, xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism by collecting xenobiotics and / or endogenous substrate conversion substances (so-called metabolites) resulting from exposure of test substances to cells and purifying and separating them by an appropriate method. Products can be prepared (JL Napoli et al. Methods in Enzymology vol. 206 pp.491-501 Ed. By MR Waterman et al. Academic Press 1991).
As the test substance, those similar to the above are used.
(e) Method for analyzing xenobiotic and / or endogenous substrate metabolic enzyme inhibition
For example, it is possible to analyze the inhibition of the activity of xenobiotics and / or endogenous substrate metabolic enzymes by exposing test substances to cells (JL Napoli et al. Methods in Enzymology vol. 206 pp.491-501 Ed. By MR Waterman et al. Academic Press 1991). Specifically, it can be detected by inhibiting cytochrome P450 enzyme activity, decreasing the amount of protein, decreasing mRNA, and the like. As a detection method, known methods such as measurement of enzyme activities corresponding to various P450s, Western blotting corresponding to various P450 proteins, Northern hybridization corresponding to various P450 mRNAs, or RT-PCR methods can be used.
As the test substance, those similar to the above are used.
(f) Analytical method for promoting the activity of xenobiotics and / or endogenous substrate metabolizing enzymes:
For example, by exposing a test substance to cells and detecting an increase in the activity of xenobiotics and / or endogenous substrate metabolizing enzymes, an increase in the amount of the enzyme, or an increase in the amount of transcription of the gene encoding the enzyme, Alternatively, it is possible to analyze the promotion of the activity of endogenous substrate metabolizing enzymes (J. Rueff et al. Mutation Research 353 (1996) 151-176). Specifically, it is possible by detecting an increase in cytochrome P450 enzyme activity, an increase in protein amount, and an increase in mRNA. As a detection method, known methods such as measurement of enzyme activities corresponding to various P450s, Western blotting corresponding to various P450 proteins, Northern hybridization corresponding to various P450 mRNAs, or RT-PCR methods can be used.
As the test substance, those similar to the above are used.
[0014]
(g) Method for analyzing cytotoxicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism:
For example, it is possible to analyze cytotoxicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism by exposing a test substance to cells. Specifically, it is analyzed by observing changes in cell morphology, changes in the number of living cells, leakage of intracellular enzymes, changes in cell surface structure, or changes in intracellular enzymes due to exposure to the test substance ( D. Wu et al. Journal of Biological Chemistry, 271, (1996) 23914-23919).
As the test substance, those similar to the above are used.
(h) Methods for analyzing genotoxicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism:
For example, genotoxicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism can be analyzed by exposing test substances to cells and subjecting the cells to chromosomal aberration tests, micronucleus tests, and the like. Furthermore, after the test substance is exposed to cells, analysis can be performed by subjecting the test substance changed by the cells to a chromosome abnormality test, micronucleus test, reverse mutation test, etc. by evaluating with an appropriate evaluation system (J. Rueff et al. Mutation Research 353 (1996) 151-176, ME McManus et al. Methods in Enzymology vol. 206 pp.501-508 Ed. By MR Waterman et al. Academic Press 1991)).
As the test substance, those similar to the above are used.
(i) Analysis method of carcinogenicity by xenobiotic and / or endogenous substrate metabolism:
For example, carcinogenicity analysis by xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism can be performed by exposing a test substance to cells and subjecting the cells to a chromosomal aberration test, DNA modification, and the like. Furthermore, after the test substance is exposed to the cells, analysis can be performed by evaluating the test substance changed by the cells with a carcinogenesis evaluation system using an appropriate chemical substance (J. Rueff et al. Mutation Research 353 (1996). 151-176, K. Kawajiri et al. Cytochromes P450 metabolic and toxicological aspects pp77-98 ed. By C. Ioannides CRC press (1996)).
As the test substance, those similar to the above are used.
(j) Methods for analyzing mutagenicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism:
For example, it is possible to analyze mutagenicity by xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism by exposing a test substance to cells and subjecting the cells to a chromosomal aberration test, a micronucleus test, or the like. Furthermore, after the test substance is exposed to cells, analysis can be performed by subjecting the test substance changed by the cells to a chromosome abnormality test, micronucleus test, reverse mutation test, etc. by evaluating with an appropriate evaluation system (J. Rueff et al. Mutation Research 353 (1996) 151-176).
As the test substance, those similar to the above are used.
(k) Method for analyzing hepatotoxicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism:
For example, by exposing a test substance to a cell and observing the expression of cytotoxicity, or after exposing the test substance to a cell, the test substance changed by the cell is extracted from other hepatocytes, liver slices, and the like. It is possible to analyze hepatotoxicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism by observing changes in cells, tissues, and living bodies due to administration to the liver or experimental animals.
As the test substance, those similar to the above are used.
(l) Methods for analyzing xenobiotics and / or endogenous substrates that act on the liver:
For example, by observing the expression of cell changes due to exposure of the test substance to the cells, or after exposing the test substance to the cells, the test substance changed by the cells can be changed to other hepatocytes, liver sections, It is possible to analyze the expression of the action on the liver by administering it to the isolated liver or experimental animals and observing the changes in cells, tissues, and living bodies.
As the test substance, those similar to the above are used.
[0015]
In this specification, when a base or the like is indicated by an abbreviation, it is based on an abbreviation by IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature or a common abbreviation in the field, and examples thereof are described below.
A: Adenine
T: Thymine
G: Guanine
C: cytosine
[0016]
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1]
The synthetic primer base sequence used for CYP1A1 in the RT-PCT method performed in Example 3 described later is shown.
[SEQ ID NO: 2]
The synthetic primer base sequence used for CYP1A1 in the RT-PCT method performed in Example 3 described later is shown.
[SEQ ID NO: 3]
The synthetic primer base sequence used for CYP1A2 in the RT-PCT method performed in Example 3 described later is shown.
[SEQ ID NO: 4]
The synthetic primer base sequence used for CYP1A2 in the RT-PCT method performed in Example 3 described later is shown.
[SEQ ID NO: 5]
The synthetic primer base sequence used for CYP3A in the RT-PCT method performed in Example 3 described later is shown.
[SEQ ID NO: 6]
The synthetic primer base sequence used for CYP3A in the RT-PCT method performed in Example 3 described later is shown.
[0017]
The OUMS-29 strain obtained in Example 1 to be described later was deposited with the deposit number FERM BP-6328 at the Institute of Biotechnology, National Institute of Industrial Science and Technology (NIBH) from April 21, 1998. Since April 21, it has been deposited with the Foundation Fermentation Research Institute (IFO) as deposit number IFO 50487.
[0018]
【Example】
Examples of the present invention will be described in detail below, but the present invention is not limited thereto. In addition, unless otherwise specified, the individual gene manipulation techniques used were general techniques according to Sambrook et al.'S manual (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[0019]
[Example 1]
Establishment of hepatocyte cell line
Establishment of immortalized cells by introduction of the SV 40 T antigen gene was performed according to established techniques (M. Miyazaki et al., Experimental Cell Research, 206, 27-35 (1993)). The liver was extracted from a 21-week-old human dead fetus, and primary cells of hepatocytes were separated by a known collagenase perfusion method. The cells were seeded and cultured in Williams medium (Nissui Pharmaceutical) supplemented with 10% fetal bovine serum. The SV40 T antigen gene was introduced by lipofection after 24 hours of culture. The plasmid pSV3Neo (PJ Southern and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341) was used for introduction of the SV40T antigen gene. For lipofection and beyond, serum-free complete synthetic medium (ASF104, Ajinomoto) was used as the culture medium. On day 3 after transfection, subculture was performed to promote hepatocyte proliferation and G418 (GIBCO Laboratoyies) at a final concentration of 100 μg / ml was added, and further cultured for 2 days to select neomycin-resistant cells. did. After that, a clone showing clear G418 resistance was obtained by culturing for 30 days and named OUMS-29. This clone was considered immortalized because it continued to grow in ASF104 medium for an additional 300 generations.
[0020]
[Example 2]
Measurement of drug metabolizing enzyme activity of OUMS-29 strain
OUMS-29 cells that have been cultured in ASF104 medium for 5 to 7 days and have reached confluence are collected, suspended in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.6), disrupted with an ultrasonic generator, and used as the enzyme source for the following enzyme activities: We used for measurement.
[0021]
(1) Cytochrome P450 reductase activity
Measurement was based on the method described in Biological Pharmacology, 37, 4111-4116, 1988. That is, cytochrome C (Wako Pure Chemical Industries) was used as a substrate, and NADPH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) and an enzyme source derived from OUMS-29 were present, and cytochrome P450 reductase activity was measured based on the reduction of cytochrome C. As a result, the enzyme source derived from the OUMS-29 strain showed an enzyme activity of 8 units, with the activity of reducing 1 nanomole of cytochrome C per minute of protein as 1 unit.
[0022]
(2) Glucurosyltransferase activity
The measurement was based on the method described in BiologicalPharmacology, 37, 4111-4116, 1988. Ie
Using 1-naphthol (sigma) as a substrate, UDP-glucuronic acid (sigma) and an enzyme source derived from OUMS-29 coexisted, and the amount of 1-naphthol glucuronide produced was measured. As a result, the enzyme source derived from the strain OUMS-29 showed 196 units of enzyme activity, with 1 unit of activity for producing 1 millimol of 1-naphthol glucuronide per milligram of protein per minute.
[0023]
(3) Mixed function oxidation reaction (MFO) activity
The measurement was based on the method described in BiologicalPharmacology, 42, 1307-1313, 1991. Ie
Deoxyalkylation of each substrate using ethoxyresorufin (Sigma), pentoxyresorufin (Sigma), benzyloxyresorufin (Sigma) and methoxyresorufin (Sigma) in the presence of NADPH and OUMS-29-derived enzyme sources The amount of product produced by the conversion was measured. As a result, the enzyme source derived from the OUMS-29 strain was 0.25 units when ethoxyresorufin was used as the substrate, and the activity to produce 1 picomole of product per milligram of protein per minute as 1 unit, and pentoxyresorufin as the substrate. The enzyme activity was 0.47 units, 0.38 units when benzyloxyresorufin was used as the substrate, and 0.32 units when methoxyresorufin was used as the substrate.
[0024]
[Example 3]
Expression of cytochrome P450 gene
Expression of cytochrome P450 in the OUMS-29 strain can be analyzed by examining the level of mRNA level by a known RT-PCR method using DNA primers specific for different cytochrome P450s. These primers can be prepared from each cytochrome P450 sequence available from the Gene Bank database. The acceptance numbers in GeneBank are K03191 for CYP1A1, M55053 for CYP1A2, J02625 for CYP2E1, J04449 for CYP3A4, J04813 for CYP3A5, and D00408 for CYP3A7. Individual primers are 5'-ATGCTTTTCCCAATCTCCATGTGC and 5'-TTCAGGTCCTTGAAGGCATTCAGG for CYP1A1. For CYP1A2, 5'-GGAAGAACCCGCACCTGGCACTGT and 5'-AAACAGCATCATCTTCTCACTCAA. For CYP3A, 5′-ATGGCTCTCATCCCAGACTTG and 5′-GGAAAGACTGTTATTGAGAGA were used, respectively.
The annealing temperature in RT-PCR was 55 ° C. for CYP1A1, 65 ° C. for CYP1A2, 55 ° C. for CYP3A, 65 ° C. for CYP2E1, and 28-36 cycles.
The OUMS-29 strain was cultured for 5 to 7 days, and confluent cells were collected, and RNA was extracted therefrom using an RNAeasy kit (Qiagen). This RNA and primers specific for each cytochrome P450 determined in advance were subjected to reverse transcription and PCR reaction from mRNA using a one-step PCR kit (Takara Shuzo), followed by separation on an agarose gel and UV irradiation in the presence of ethidium bromide. Visualize with. The result is shown in FIG. Signals around 763 bp predicted for CYP1A1, 1180 bp predicted for CYP1A2, and 680 bp predicted for CYP3A were detected, confirming the expression of the corresponding gene in the OUMS-29 strain.
[0025]
[Example 4]
Induction of cytochrome P450 gene expression
OUMS-29 cells cultured for 5 to 7 days and reaching confluence were subjected to a final concentration of 0-10000 nM 3-methylcholanthrene (3-MC) (FIG. 2), 0-50000 nM benzpyrene (BP) (FIG. 3), ˜25 mM phenobarbitone (PB) (FIG. 4) or 0-1000 nM dexamethasone (DEX) (FIG. 5) was added, and the cells were further cultured for 1 day. After culture, cells were isolated, RNA was extracted using the method described earlier, and RT-PCR reaction was performed.
The annealing temperature in the RT-PCR method was as follows: CYP1A1 was 55 ° C., CYP1A2 was 65 ° C., CYP3A was 55 ° C., and the number of cycles was 28 to 36 cycles.
The number of cycles of beta actin used as a control was 15 cycles.
At this time, an actin-competitive RT-PCR kit (Takara Shuzo) was used to correct the total mRNA amount of each sample based on the amount of beta actin mRNA expressed at the same level in all tissues. The results are shown in FIGS. CYP1A1 expression is enhanced by the addition of 3-methylcholanthrene, benzpyrene, and phenobarbitone, CYP1A2 expression is enhanced by the addition of 3-methylcholanthrene, benzpyrene, and CYP3A expression is enhanced by the addition of dexamethasone. Was confirmed to have the ability to express a gene encoding cytochrome P450.
[0026]
【The invention's effect】
Human normal cell-derived immortalized liver cell line of the present invention, that is, a human-derived immortalized liver that retains the enzyme activity involved in the metabolism of liver xenobiotic or the gene encoding the enzyme involved in the metabolism of liver xenobiotic The cell line is useful for screening a compound having a preventive / therapeutic effect such as liver dysfunction or a salt thereof.
[0027]
[Sequence Listing]

[0028]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of RT-PCR performed in Example 3 (electrophoresis diagram).
In the figure,

Markers

2, 5, and 6 indicate DNA molecular weight markers (manufactured by Nippon Gene).
FIG. 2 shows the results of RT-PCR method after addition of 3-methylcholanthrene (3-MC) performed in Example 4.
FIG. 3 shows the results of RT-PCR method after addition of benzpyrene (BP) performed in Example 4.
FIG. 4 shows the results of RT-PCR method after addition of phenobarbitone (PB) performed in Example 4.
FIG. 5 shows the results of RT-PCR performed after the addition of dexamethasone (DEX) performed in Example 4.

Claims

A normal human cell-derived immortalized liver cell line that retains the enzyme activity involved in the metabolism of liver xenobiotics or the gene encoding the enzyme involved in the metabolism of liver xenobiotics, wherein the enzyme is CYP1A1, CYP1A2 and A normal human cell-derived immortalized liver cell line that is CYP3A.

The cell line according to claim 1, wherein the genes encoding CYP1A1, CYP1A2 and CYP3A are expressed simultaneously.

The cell line according to claim 1, wherein the cell line is FERM BP-6328.

The method for producing a cell line according to claim 1, wherein a T (antigen gene) derived from SV (simian virus) 40 is introduced into normal human liver cells.

The method according to claim 4, wherein the normal human liver cells are human embryonic liver cells.

The cell line according to claim 1 is used. (1) Inhibition or promotion of enzyme activity related to xenobiotic metabolism in liver or (2) Expression of a gene encoding an enzyme related to xenobiotic metabolism in liver Screening method for a compound or a salt thereof that inhibits or promotes.

A cell line according to claim 1 is used, (a) an enzyme involved in xenobiotic and / or endogenous substrate metabolism, (b) xenobiotic and / or endogenous substrate metabolic pathway, (c) xenobiotic And / or chemical structure of endogenous substrate metabolites, (d) inhibition of xenobiotics and / or endogenous substrate metabolizing enzymes, (e) promotion of activities of xenobiotics and / or endogenous substrate metabolizing enzymes, (f) living organisms Cytotoxicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism, (g) genotoxicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism, (h) carcinogenicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism, (i) xenobiotics And / or mutagenicity due to endogenous substrate metabolism, (j) hepatotoxicity due to xenobiotics and / or endogenous substrate metabolism, or (k) methods for analyzing xenobiotics and / or endogenous substrates acting on the liver.

A method for preparing a xenobiotic and / or endogenous substrate metabolite, wherein the cell line according to claim 1 is used.