JP4313680B2

JP4313680B2 - Benzene-utilizing Rhodococcus bacteria and plasmids prepared thereby

Info

Publication number: JP4313680B2
Application number: JP2003571450A
Authority: JP
Inventors: 純一加藤; 久夫大竹; 耕治武田; 博恒川
Original assignee: Mercian Corp
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2003-02-25
Publication date: 2009-08-12
Anticipated expiration: 2023-02-25
Also published as: WO2003072762A1; JPWO2003072762A1; AU2003211662A1

Description

技術分野
本発明は、有機溶媒、特にベンゼンに対する高度耐性及び資化性を有するロドコッカス属細菌に関する。
背景技術
微生物を用いて水に難溶性の物質を生産する場合に、生成した物質の回収の容易さ、反応平衡の移動による収量増大、毒性生成物の除去による反応阻害の回避、反応系の混合状態の改善による反応速度増大などを目的として、微生物生菌体を含む反応混合物に水と完全には混合せず相分離する有機溶媒を加えて二相系とすることが試みられている。
しかし、有機溶媒が微生物の細胞壁や膜構造に及ぼす障害のため、疎水性物質の溶解力が大きい芳香族系溶媒を用いることは、生物活性を長期間にわたり維持するという観点からは好ましくない。一方、毒性の低いパラフィン系溶媒などを使用する場合は、溶解力が不十分であったり、溶媒の除去に高温や減圧を必要とするなどの問題がある。
ところで、有機溶媒の分配係数（Ｐ）は、混じり合わない２種の溶媒系における平衡状態での物質の活動度の比として表され、物質の濃度が小さい場合は、その濃度を活動度とみなすことができる。生物反応に使用可能な有機溶媒を決定する際に、ｌｏｇＰを溶媒の極性の指標として用いると、生物反応と良好な相関が得られ、ｌｏｇＰ＜２の極性溶媒では反応性が低く、ｌｏｇＰ＝２〜４の溶媒中では反応性が中程度、ｌｏｇＰ＞４の非極性溶媒では反応性が高いことなどが知られている（Ｃ．Ｌａａｎｅ，Ｓ．Ｂｏｅｒｅｎ，ａｎｄＫ．Ｖｏｓ；ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，２５１，１９８５及びＣ．Ｌａａｎｅ，Ｓ．Ｂｏｅｒｅｎ，Ｋ．ＶｏｓａｎｄＣ．Ｖｅｅｇｅｒ；ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３０，８１，１９８７）。有機溶媒の中でも、ベンゼンは、ｌｏｇＰ＝２であり、生物反応性が低い。
有機溶媒を含む培地中で、生育することのできる菌は数多く知られている。しかしながら、ベンゼンは多くの有機溶媒の中で特に微生物に対する毒性が強く、ベンゼンに耐性を持つ、あるいは資化性を持つ菌株はそれほど多く知られていない。例えば、ベンゼン濃度が水に対する飽和濃度以下の場合に耐性や資化性を示すロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４３，２９７５−２９８１（１９９７））、ベンゼン５％（ｖ／ｖ）二相系で耐性を有するグラム陰性のフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌（ＪＦｅｒｍｅｎｔＢｉｏｅｎｇ７６，１６８−１７３（１９９３））が知られているが、これらの文献に記載の濃度以上のベンゼンを含むベンゼン−水二相系において、ベンゼンに対する耐性及び資化性を有する細菌は知られていない。特にグラム陽性菌でベンゼン濃度が水に対する飽和濃度以下の場合においても生育するものは知られていなかった。その上、グラム陰性菌は、細胞表層に外膜を有するため、水に難溶性の物質の透過は困難であり、物質生産の手段としては好ましくない。これに対して、グラム陽性菌には、細胞表層に外膜がないので、物質生産には好適である。また、有機溶媒に対して耐性だけでなく資化性を有する細菌は、他の炭素源を供給せずに有機溶媒中で増殖することができる。そのため、有機溶媒を原料とした物質生産に用いられる細菌には、使用する有機溶媒に対する耐性に加えて、資化性を有することが望ましい。従って、ベンゼン−水二相系における生物反応のためには、ベンゼン濃度が高い反応系においても、耐性及び資化性を有するグラム陽性菌が必要とされる。
そこで、本発明は、有機溶媒、特にベンゼンに対して耐性及び資化性を有するグラム陽性菌を提供することを目的とする。
さらに本発明は、本発明で提供されるロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌で複製するプラスミドベクターの構築を目的とする。
発明の開示
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、東広島市の交通量が多い道路端の土壌、下水処理施設の活性汚泥および汚濁している河川の堆積物から、以下の分離方法により、有機溶媒、特にベンゼンに対して耐性及び資化性を有する菌株（以下、「ベンゼン資化性細菌」、「ベンゼン資化性菌」という）を取得して、本発明であるベンゼンに対して資化性を示すロドコッカス属細菌を完成させた。
発明を実施するための最良の形態
［分離方法］
ベンゼンを唯一の炭素源とした培地を用いて集積培養を数回行い、ベンゼン資化性細菌を単離した。手順は下記の通りである。
１．採取した試料５ｇをスクリューキャップ付きの５０ｍｌ容バイアル瓶に入れる。さらにベンゼン１ｍｌを入れたダラム管（微小試験管）を入れてキャップをし、２８℃で１週間馴化培養を行った（図１）。
２．馴化培養後、試料１ｇを５ｍｌの滅菌した生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ水溶液）に懸濁した。その上清１ｍｌをスクリューキャップ付きバイアル瓶中の１０ｍｌのＭＭ培地に植菌し、さらにベンゼン１ｍｌを入れたダラム管（微小試験管）を入れてキャップをし、２８℃で振とう培養を行った（図１）。ＭＭ培地の組成は、Ｋ_２ＨＰＯ_４，４．３ｇ／ｌ；ＫＨ_２ＰＯ_４，３．４ｇ／ｌ；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，２．０ｇ／ｌ；ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ，０．１６ｇ／ｌ；ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ，１ｍｇ／ｌ；ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，０．６ｍｇ／ｌ；ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ，２６ｍｇ／ｌ；Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ，２ｍｇ／ｌ；ＺｎＣｌ_２，０．１ｍｇ／ｌ；ＣｏＣｌ_２，０．１ｍｇ／ｌ；ＮｉＳＯ_４，１０μｇ／ｌ；Ｎａ_２ＳｅＯ_４・１０Ｈ_２Ｏ，１０μｇ／ｌ；ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ，０．１ｍｇ／ｌである。
３．ベンゼン資化性微生物群集が増殖し、６００ｎｍ光を用いた濁度がおよそ０．５程度に到達したら、その培養液０．１ｍｌをスクリューキャップ付きバイアル瓶中の１０ｍｌのＭＭ培地に植菌し、さらにベンゼン１ｍｌを入れたダラム管（微小試験管）を入れてキャップをし、２８℃で振とう培養を行った。この操作をさらにもう１回行った。
４．３の培養液を生理食塩水で段階的に希釈し、希釈液１００μｌを２．０％寒天を含んだＭＭ寒天培地に塗布した。希釈液を塗布した寒天培地プレートをタッパーウエア等の密閉性の容器に入れた。この容器には、ベンゼンを入れたバイアル瓶を配置し、蒸気でベンゼンを供給した。数日間２８℃で培養を行った。
５．４の操作で生じた単一コロニーを取得することで、ベンゼン資化性細菌を単離した。
以上の操作の結果、道路端土壌、活性汚泥、河川堆積物から１株ずつベンゼン資化性細菌を単離した。そして、それぞれをＢ−４株、Ｂ−９株、Ｂ−１０株と命名した。
［取得したベンゼン資化性細菌の分類］
常法に従ってＢ−４、Ｂ−９及びＢ−１０株の染色体ＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡを鋳型、真正細菌の１６ＳｒＤＮＡの増幅のためのＰＣＲプライマー（６３ｆ，５’−ＣＡＧＧＣＣＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣ−３’（配列番号６）；１３８７ｒ，ＧＧＧＣＧＧＷＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＣ−３’（配列番号７））、ＥＸＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）を用い、ＤＮＡ増幅装置（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、９６００型）でそれぞれの菌株の１６ＳｒＤＮＡの一部（１．３ｋｂ）を増幅した。ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））により増幅断片をクローニングした後、ＤｙｎａｍｉｃＥＴターミネーターＤＮＡシーケンシングキット（アマシャムファルマシア）とＤＮＡシーケンサ（ＡＢＩ３１０）により部分的に塩基配列を決定した。Ｂ−４株の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列は、配列番号３、Ｂ−９株の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列は、配列番号４、Ｂ−１０株の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列は、配列番号５に示す通りであった。
得られたＤＮＡ塩基配列を用いてＤＮＡデータバンクに対して相同性（ＦＡＳＴＡ）検索を行ったところ、以下に示す通り、いずれの菌株のＤＮＡ配列もロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌の１６ＳｒＤＮＡと高い相同性を示した。尚、菌株名末尾の括弧内の番号は、ＤＮＡデータベース（ＤＤＢＪ，ＥＭＢＬ，Ｇｅｎｅｂａｎｋ）の登録番号である。
Ｂ−４株の１６ＳｒＤＮＡの相同性は、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）ＳＮＫ１０６（ＡＢ０３７１０２）に対して９７％、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）ＳＮＫ１０３（ＡＢ０３７１００）に対して９７％、ロドコッカス・ウラチスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）（Ｚ３７１３８）に対して９７％であった。
Ｂ−９株の１６ＳｒＤＮＡの相同性は、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）ＳＡＯ１０１（ＡＢ０３２５６５）に対して９９％、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）１ＣＰ（Ｙ１１８９３）に対して９９％、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）ＧＭ−２９（Ｙ１１８９２）に対して９９％であった。
Ｂ−１０株の１６ＳｒＤＮＡの相同性は、ロドコッカス・ウラチスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）（Ｚ３７１３８）に対して１００％、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）Ｍ２１３（ＡＦ０９５７１５）に対して１００％、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）ＳＡＯ１０１（ＡＢ０３２５６５）に対して１００％であった。
３株とも短桿菌、運動性：陰性、ＯＦテスト：ｏｘｉｄａｔｉｖｅ、オキシダーゼ活性：陽性、カタラーゼ活性：陽性、ゼラチン溶解活性：陰性、３０℃での増殖：陽性、３７℃での増殖：陰性であった。また、糖の資化性のパターンは表２の通りとなった。

Ｄ−ツラノースを資化し、Ｌ−ラムノースを資化できないことは、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）の特徴である。１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列もロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）と相同性が高いことから、取得した菌株Ｂ−９株及びＢ−１０株をロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）と同定し、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）Ｂ−９株及びＢ−１０株と命名した。また、Ｂ−４株の１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列は、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）との相同性が比較的高いが、Ｂ−９株及びＢ−１０株よりも相同性が低い。そのため、Ｂ−４株を、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）Ｂ−４株と命名した。
これらの菌株は、平成１４年２月２０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、それぞれロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）Ｂ−４（ＦＥＲＭＰ−１８７２７）、ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）Ｂ−９（ＦＥＲＭＰ−１８７２８）、及びロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）Ｂ−１０（ＦＥＲＭＰ−１８７２９）として原寄託され、平成１５年１月２７日にそれぞれＦＥＲＭＢＰ−８２８１、ＦＥＲＭＢＰ−８２８２及びＦＥＲＭＢＰ−８２８３として国際寄託に移管されている。
尚、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の分類によると、ある程度の有機溶媒耐性を示すことが知られているシュードモナス属細菌の多くは、バイオセーフティ・レベル２に指定されているのに対し、同コレクションに含まれているロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１７０３９、ＡＴＣＣ５１８８１、及びＡＴＣＣ５１８８２）はいずれも、バイオセーフティ・レベル１に指定されている。また、我が国の植物防疫所及び動物検疫所での輸入禁止該当品ではない。
本発明のロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）Ｂ−９株及びＢ−１０並びにロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）Ｂ−４株は、後述する実施例に示すように、ベンゼンに対して資化性を示すロドコッカス属細菌である。さらに、これら本発明のロドコッカス属細菌は、後述する実施例に示すように、ベンゼン以外に、トルエン、スチレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、プロピルベンゼン、ｎ−オクタン及びｎ−デカンに対しても資化性を示す。
本発明のロドコッカス属細菌は、ベンゼンに対して優れた耐性を示す。ベンゼン濃度が水に対する飽和濃度以上になると、多くの微生物は生育できなくなるが、本発明のロドコッカス属細菌は、その濃度をはるかに超える濃度、例えば２０％（ｖ／ｖ）においても良好に生育するという、優れたベンゼン耐性を有している。
さらに本発明のロドコッカス属細菌は、後述する実施例に示すように、他の有機溶媒に耐性を有し、そのような有機溶媒の例としては、トルエン、スチレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、プロピルベンゼン、ｎ−オクタン及びｎ−デカンを挙げることができる。
本発明のロドコッカス属細菌は、上記のように、有機溶媒、特にベンゼンに対する資化性を有し、かつベンゼンを含む種々の有機溶媒に対して耐性を示すことから、有機溶媒を原料とした物質生産等に用いることができる。
さらに本発明は、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）Ｂ−４株由来のプラスミドに関する。第１のプラスミドは、配列番号１で示される塩基配列を有し、かつ図３に示す制限酵素開裂地図で示される４４３７ｂｐのプラスミドである。第２のプラスミドは、配列番号２で示される塩基配列を有し、図４に示す制限酵素開裂地図で示される２７７４ｂｐのプラスミドである。
これらのプラスミドは、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）Ｂ−４株の培養液から、後述する実施例に示すような方法で調製することができる。これらのプラスミドは、ベンゼン等の有機溶媒に対する資化性と耐性を有するロドコッカス属細菌の形質転換に利用することができる。なお、これらのプラスミドは、クロラムフェニコール耐性、カナマイシン耐性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性等の薬剤耐性マーカーやプロモーター、マルチクローニングサイト等を導入し、物質生産等に利用しやすいものに改変することができる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
［有機溶媒の資化性］
ロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）Ｂ−９株及びＢ−１０株並びにロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）Ｂ−４株の有機溶媒の資化性について検討した。ＭＭ培地に表２に示した有機溶媒を１０％（ｖ／ｖ）添加した培地１０ｍｌを５０ｍｌのスクリューキャップ付バイアル瓶に入れ、これに植菌し、２８℃で２日間振とう培養を行い増殖をＯＤ_６００にて計測した。ＯＤ_６００は、６００ｎｍ光を用いた濁度を示し、菌体濃度の指標として用いることができる。なお、振とうはロータリーシェーカーで１２０ｒｐｍの速度で行った。結果を表２に示す。
表２に示したｌｏｇＰ_ＯＷ値は、有機溶媒の分配係数の対数値であり、以下の方法によって実験的に求めた値である。
水・オクタノール（１：１）の混合液に、検定溶媒ｍを溶解したときの水相の溶媒ｍの濃度を［ｍ］Ｗ、オクタノール中の溶媒ｍの濃度を［ｍ］Ｏとしたとき、ｌｏｇＰ_ＯＷは、以下の式から求められる。
ｌｏｇＰ_ＯＷ＝ｌｏｇ（［ｍ］Ｏ／［ｍ］Ｗ）
上記式から明らかなように、疎水性が高いほど（オクタノールに溶けやすいほど）、ｌｏｇＰ_ＯＷは高い値となり、水に溶けやすいほどｌｏｇＰ_ＯＷは低い値となる。
有機溶媒を重層した二相培養系において、有機溶媒の毒性は、ｌｏｇＰ_ＯＷ値に依存し、ｌｏｇＰ_ＯＷが低いほど毒性が高いことが実験的に示されている（Ａ．Ｉｎｏｕｅ，Ｋ．Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、Ｎａｔｕｒｅ，３３８，２６４−２６６，１９８９）。即ち、有機溶媒が毒性を発揮するためには、菌が存在する水相に溶け入ることが必要であるので、水に溶けやすく、水相に高濃度で存在できる有機溶媒ほど、有機溶媒二相培養系において、毒性が強いといえる。従って、ｌｏｇＰ_ＯＷは、異なる溶媒の毒性比較パラメーターとして用いることができる。

培養開始時のＯＤ_６００は各溶媒系においてそれぞれ０．０３であったのに対し、ベンゼン、トルエン、スチレン、ｏ−、ｍ−、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、プロピルベンゼン、ｎ−オクタン又はｎ−デカンを含む有機溶媒−水相の二相系（１０％有機溶媒が存在）の培養における取得菌株のＯＤ_６００値は、いずれも培養開始時と比べて大きく上昇した。各溶媒系には、有機溶媒以外の炭素源が存在しないため、表２に示す結果から、取得菌株は、上記有機溶媒を炭素源として使用することができ、資化性を有することがわかる。特に、ベンゼンのｌｏｇＰ_ＯＷの値は２．０と極めて低いかかわらず二相系でベンゼンを資化できるということは、取得菌株が極めて強い有機溶媒耐性能を有することを意味する。
実施例２
［ベンゼンの資化性］
ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）Ｂ−４株並びにロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ）Ｂ−９株及びＢ−１０株について、ベンゼン資化性を検討した。表３に示した濃度になるようにベンゼンを添加したＭＭ培地１０ｍｌを５０ｍｌのスクリューキャップ付バイアル瓶に入れ、これに植菌し、２８℃で２日間振とう培養を行い、増殖をＯＤ_６００にて計測した。なお、振とうはロータリーシェーカーで１２０ｒｐｍの速度で行った。結果を表３に示す。

表３から、これら菌株が、ベンゼンが高濃度で存在する場合にも、高い資化性を有することが示された。
実施例３
［グルコースを炭素源として添加した時の有機溶媒耐性］
実施例１に示した試験では、耐性はあっても資化できないために増殖しなかった可能性があるため、ＭＭ培地に炭素源としてグルコース（５ｇ／ｌ）を添加した培地に１０％（ｖ／ｖ）有機溶媒を添加した培地での増殖を調べた。結果を表４に示す。

いずれの菌株もｎ−デカン存在下での増殖は極めて良好であった。また、Ｂ−４株とＢ−９株はシクロヘキサン存在下で良好な生育を示し、これら物質に対して強い耐性を持つことが示された。ｎ−デカン及びシクロヘキサノン以外の有機溶媒は、概ね有機溶媒を炭素源とした培養の方が多少よい増殖を示した。
実施例４
［プラスミドの調製］
本発明のベンゼン資化性細菌を用いて、有機溶媒を原料とした物質変換による物質生産を行おうとするとき、本発明のベンゼン資化性細菌の物質変換能を向上させるために遺伝子操作が可能であることが望ましい。遺伝子操作を行うためには、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌で複製するプラスミドベクターの構築が必要である。もし、取得した菌株が適当な大きさ（１０ｋｂ以下）のプラスミドを保持していれば、プラスミド構築に活用することができる。そこで、取得菌株のプラスミドの検索を行った。プラスミド試料の調製方法を以下に示す。
プラスミド試料の調製法
４．５ｍｌの培養液から遠心分離で菌体を回収する。５ｍｇ／ｍｌリゾチームを含むＧＴＥ緩衝液（５０ｍＭグルコース、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＥＤＴＡ）１００μｌに菌体を懸濁し、３７℃，２時間反応させる。１％ＳＤＳ，０．２ＮＮａＯＨ水溶液２００μｌを添加し、よく混合し、氷上に５分間置く。氷冷した５ＭＣＨ_３ＣＯ_２Ｋ（ｐＨ５．２）１５０μｌ添加し、よく混合し、氷上に５分間置く。４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を新しい１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに移す。ＴＥ緩衝液で飽和したフェノール／クロロフォルム混合液（１：１，ｖ／ｖ）４５０μｌ添加し、５分間混合する。４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上層（水層）を新しい１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに移す。９９．５％エタノールを９００μｌ添加し、混合した後、１０分間氷上に置く。４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を除く。７０％エタノールで沈澱を洗浄後、１０分間風乾する。ＲＮａｓｅＡ５０μｇ／ｍｌ含むＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ）２５μｌに沈澱を溶解する。
上記の方法で調製したプラスミド試料を１％アガロースゲル電気泳動で解析したところ、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）Ｂ−４株が４４３７ｂｐと２７７４ｂｐの大きさの環状プラスミドを保持していることが明らかとなった（図２）。４４３７ｂｐの大きさの環状プラスミドの塩基配列を配列番号１に、２７７４ｂｐの大きさの環状プラスミドの塩基配列を配列番号２に示す。これら環状プラスミドの制限酵素開裂地図を常法により作成し、図３及び４に示す。
産業上の利用分野
本発明により、有機溶媒、特にベンゼンに対する資化性を有するロドコッカス属細菌が提供される。本発明のベンゼン資化性細菌は、有機溶媒を原料とした物質生産に用いることができる。更に、本発明のベンゼン資化性細菌から調製されたプラスミドを用いて、プラスミドベクターを構築することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、ベンゼン資化性菌の培養方法を示す。
図２は、ロドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）Ｂ−４株のプラスミドを１％アガロースゲル電気泳動で解析した結果を示す。
図３は、４４３７ｂｐの環状プラスミドの制限酵素開裂地図を示す。
図４は、２７７４ｂｐの環状プラスミドの制限酵素開裂地図を示す。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a Rhodococcus bacterium having a high resistance and an assimilation property to an organic solvent, particularly benzene.
BACKGROUND ART When producing a poorly water-soluble substance using microorganisms, it is easy to recover the produced substance, yield is increased by shifting reaction equilibrium, reaction inhibition is avoided by removing toxic products, For the purpose of increasing the reaction rate by improving the mixing state of the reaction system, an attempt was made to add a two-phase system by adding an organic solvent that does not completely mix with water to the reaction mixture containing viable microbial cells. ing.
However, it is not preferable to use an aromatic solvent having a high ability to dissolve hydrophobic substances from the viewpoint of maintaining biological activity for a long period of time because of the obstacle that the organic solvent has on the cell wall and membrane structure of microorganisms. On the other hand, when using a paraffinic solvent having low toxicity, there are problems such as insufficient dissolving power and necessity of high temperature or reduced pressure for removing the solvent.
By the way, the partition coefficient (P) of the organic solvent is expressed as a ratio of the activity of the substance in an equilibrium state in two solvent systems that do not mix, and when the concentration of the substance is small, the concentration is regarded as the activity. be able to. When logP is used as an indicator of the polarity of a solvent in determining an organic solvent that can be used for a biological reaction, a good correlation with the biological reaction is obtained, and the reactivity of a polar solvent with logP <2 is low, and logP = 2 It is known that the reactivity is moderate in the solvent of ˜4, and the reactivity is high in the nonpolar solvent of log P> 4 (C. Laane, S. Boeren, and K. Vos; Trends Biotechnol., 3). , 251, 1985 and C. Lanee, S. Boeren, K. Vos and C. Veeger; Biotechnology and Bioengineering, 30, 81, 1987). Among organic solvents, benzene has log P = 2 and low bioreactivity.
Many bacteria that can grow in a medium containing an organic solvent are known. However, benzene is particularly toxic to microorganisms among many organic solvents, and there are not so many strains that are resistant or assimilating to benzene. For example, Rhodococcus genus bacteria (Microbiology 143, 2975-2981 (1997)) exhibiting resistance and assimilation when the benzene concentration is below the saturation concentration with respect to water, benzene 5% (v / v) in a two-phase system A gram-negative bacterium belonging to the genus Flavobacterium (J Ferment Bioeng 76, 168-173 (1993)) is known, but benzene-water containing benzene at a concentration higher than those described in these documents. In the phase system, there are no known bacteria having resistance and utilization to benzene. In particular, Gram-positive bacteria that grow even when the benzene concentration is below the saturation concentration with respect to water have not been known. In addition, since Gram-negative bacteria have an outer membrane on the cell surface, it is difficult to permeate a substance that is sparingly soluble in water, which is not preferable as a means for producing a substance. On the other hand, Gram-positive bacteria are suitable for substance production because they have no outer membrane on the cell surface. In addition, bacteria having not only resistance to organic solvents but also assimilability can grow in organic solvents without supplying other carbon sources. Therefore, it is desirable that bacteria used for substance production using an organic solvent as a raw material have assimilability in addition to resistance to the organic solvent used. Therefore, for biological reactions in a benzene-water two-phase system, Gram-positive bacteria having resistance and assimilation are required even in a reaction system with a high benzene concentration.
Then, an object of this invention is to provide the Gram positive microbe which has tolerance and assimilation property with respect to an organic solvent, especially benzene.
Furthermore, the present invention aims to construct a plasmid vector that replicates in a Rhodococcus bacterium provided in the present invention.
DISCLOSURE OF THE INVENTION As a result of intensive studies to achieve the above object, the present inventors have found that the soil at the road edge where the traffic volume in Higashihiroshima City is high, the activated sludge and the sewage treatment facility are contaminated. The strains that are resistant and assimilated to organic solvents, especially benzene (hereinafter referred to as “benzene-assimilating bacteria” and “benzene-assimilating bacteria”) are separated from sediments of rivers by the following separation methods: Acquired and completed Rhodococcus bacteria showing assimilability to benzene according to the present invention.
Best Mode for Carrying Out the Invention [Separation Method]
Accumulation culture was performed several times using a medium containing benzene as the sole carbon source, and benzene-utilizing bacteria were isolated. The procedure is as follows.
1. 5 g of the collected sample is placed in a 50 ml vial with a screw cap. Further, a Durham tube (micro test tube) containing 1 ml of benzene was placed and capped, and conditioned culture was performed at 28 ° C. for 1 week (FIG. 1).
2. After conditioned culture, 1 g of the sample was suspended in 5 ml of sterilized physiological saline (0.9% NaCl aqueous solution). 1 ml of the supernatant was inoculated into 10 ml of MM medium in a vial with a screw cap, and a Durham tube (micro test tube) containing 1 ml of benzene was added and capped, followed by shaking culture at 28 ° C. (FIG. 1). The composition of the MM medium is as follows: K ₂ HPO ₄ , 4.3 g / l; KH ₂ PO ₄ , 3.4 g / l; (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 2.0 g / l; MgCl ₂ .6H ₂ O, 0 .16 g / l; MnCl ₂ .4H ₂ O, 1 mg / l; FeSO ₄ .7H ₂ O, 0.6 mg / l; CaCl ₂ .2H ₂ O, 26 mg / l; Na ₂ MoO ₄ .2H ₂ O, 2 mg ZnCl ₂ , 0.1 mg / l; CoCl ₂ , 0.1 mg / l; NiSO ₄ , 10 μg / l; Na ₂ SeO ₄ · 10H ₂ O, 10 μg / l; CuSO ₄ · 5H ₂ O, 0. 1 mg / l.
3. When the benzene-utilizing microbial community grows and the turbidity using 600 nm light reaches about 0.5, inoculate 0.1 ml of the culture into 10 ml of MM medium in a screw cap vial, Further, a Durham tube (micro test tube) containing 1 ml of benzene was added, capped, and cultured with shaking at 28 ° C. This operation was performed once more.
The culture solution of 4.3 was diluted stepwise with physiological saline, and 100 μl of the diluted solution was applied to an MM agar medium containing 2.0% agar. The agar plate coated with the diluted solution was placed in an airtight container such as Tupperware. A vial containing benzene was placed in this container, and benzene was supplied by steam. The culture was performed at 28 ° C. for several days.
Benzene-utilizing bacteria were isolated by obtaining a single colony generated by the operation of 5.4.
As a result of the above operation, benzene-utilizing bacteria were isolated from the road edge soil, activated sludge, and river sediment one by one. And each was named B-4 strain, B-9 strain, and B-10 strain.
[Classification of acquired benzene-utilizing bacteria]
Chromosomal DNAs of B-4, B-9 and B-10 strains are extracted according to a conventional method, and the extracted DNA is used as a template, and PCR primers (63f, 5'-CAGGCCTAACACATGCCAAGTC-3 'for amplification of authentic bacteria 16S rDNA (SEQ ID NO: 6); 1387r, GGGCGGWTGTACAAGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 7)), EX Taq DNA polymerase (Takara Shuzo), and DNA amplification apparatus (Perkin-Elmer, type 9600) of each strain. A part (1.3 kb) of 16S rDNA was amplified. After the amplified fragment was cloned using the pGEM-Teasy vector (Promega), the nucleotide sequence was partially determined using the Dynamic ET terminator DNA sequencing kit (Amersham Pharmacia) and the DNA sequencer (ABI310). The partial base sequence of 16S rDNA of B-4 strain is SEQ ID NO: 3, the partial base sequence of 16S rDNA of B-9 strain is SEQ ID NO: 4, and the partial base sequence of 16S rDNA of B-10 strain is SEQ ID NO: 5. It was as shown in.
When the homology (FASTA) search was performed on the DNA data bank using the obtained DNA base sequence, the DNA sequence of any strain was highly homologous to the 16S rDNA of the genus Rhodococcus as shown below. Showed sex. The number in parentheses at the end of the strain name is the registration number of the DNA database (DDBJ, EMBL, Genebank).
The homology of 16S rDNA of the B-4 strain was 97% for Rhodococcus opacus SNK106 (AB037102), 97% for Rhodococcus opacus SNK103 (AB037100), and Rhodococcus ladococcus 97% relative to Rhodococcus wratislaviensis (Z37138).
The homology of 16S rDNA of strain B-9 is 99% for Rhodococcus opacus SAO101 (AB032565), 99% for Rhodococcus opacus 1CP (Y11893), and Rhodococcus opacus (O11893). 99% relative to Rhodococcus opacus) GM-29 (Y11892).
B-10 strain 16S rDNA homology was 100% for Rhodococcus wratislaviensis (Z37138), 100% for Rhodococcus opacus M213 (100%, AF095715) 100% relative to Rhodococcus opacus SAO101 (AB032565).
All three strains were bacilli, motility: negative, OF test: oxidative, oxidase activity: positive, catalase activity: positive, gelatin dissolution activity: negative, growth at 30 ° C: positive, growth at 37 ° C: negative . Moreover, the utilization pattern of sugar was as shown in Table 2.

The inability to assimilate D-turanose and L-rhamnose is a characteristic of Rhodococcus opacus. Since the partial base sequence of 16S rDNA is also highly homologous to Rhodococcus opacus, the obtained strains B-9 and B-10 were identified as Rhodococcus opacus and Rhodococcus opacus ( Rhodococcus opacus) strains B-9 and B-10. Moreover, the partial base sequence of 16S rDNA of the B-4 strain has a relatively high homology with Rhodococcus opacus, but has a lower homology than the B-9 and B-10 strains. Therefore, the B-4 strain was named Rhodococcus sp. B-4 strain.
These strains were released on February 20, 2002 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (1st, 1st, 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki, Japan), respectively. Rhodococcus sp. sp.) B-4 (FERM P-18727), Rhodococcus opacus B-9 (FERM P-18728), and Rhodococcus opacus B-10 (FERM P-18729) And transferred to the International Deposit on January 27, 2003 as FERM BP-8281, FERM BP-8282 and FERM BP-8283, respectively.
According to the classification of the American Type Culture Collection, many Pseudomonas bacteria known to exhibit a certain degree of organic solvent resistance are designated as biosafety level 2. In contrast, Rhodococcus opacus (ATCC 17039, ATCC 51881, and ATCC 51882) included in the collection are all designated as biosafety level 1. In addition, it is not an import banned product at plant quarantine stations and animal quarantine stations in Japan.
The Rhodococcus opacus B-9 and B-10 strains and Rhodococcus sp. B-4 strain of the present invention have assimilability to benzene, as shown in the examples described later. Rhodococcus spp. Furthermore, these Rhodococcus bacteria of the present invention include toluene, styrene, o-xylene, m-xylene, p-xylene, ethylbenzene, propylbenzene, n-octane and n as well as benzene, as shown in the examples described later. -Also shows assimilability to decane.
The Rhodococcus bacterium of the present invention exhibits excellent resistance to benzene. When the benzene concentration exceeds the saturation concentration with respect to water, many microorganisms cannot grow, but the Rhodococcus bacterium of the present invention grows well even at a concentration far exceeding that concentration, for example, 20% (v / v). It has excellent benzene resistance.
Furthermore, the Rhodococcus bacterium of the present invention is resistant to other organic solvents as shown in the examples described later. Examples of such organic solvents include toluene, styrene, o-xylene, m-xylene, Mention may be made of p-xylene, ethylbenzene, propylbenzene, n-octane and n-decane.
The Rhodococcus bacterium of the present invention, as described above, has an assimilation property with respect to organic solvents, particularly benzene, and exhibits resistance to various organic solvents containing benzene. It can be used for production.
The present invention further relates to a plasmid derived from Rhodococcus sp. Strain B-4. The first plasmid is a 4437 bp plasmid having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and represented by the restriction enzyme cleavage map shown in FIG. The second plasmid is a 2774 bp plasmid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and shown in the restriction enzyme cleavage map shown in FIG.
These plasmids can be prepared from the culture solution of Rhodococcus sp. Strain B-4 by a method as shown in the examples described later. These plasmids can be used for transformation of Rhodococcus bacteria having assimilability and resistance to organic solvents such as benzene. These plasmids may be modified to those that are easy to use for substance production by introducing drug resistance markers such as chloramphenicol resistance, kanamycin resistance, ampicillin resistance, tetracycline resistance, promoters, multiple cloning sites, etc. it can.
Examples Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
Example 1
[Utilization of organic solvents]
The assimilation of organic solvents of Rhodococcus opacus B-9 and B-10 strains and Rhodococcus sp. B-4 strain was examined. Add 10ml (v / v) of the organic solvent shown in Table 2 to MM medium and place in a 50ml vial with a screw cap, inoculate it, and grow by shaking culture at 28 ° C for 2 days. Was measured at OD ₆₀₀ . OD ₆₀₀ indicates turbidity using 600 nm light, and can be used as an indicator of bacterial cell concentration. Shaking was performed at a speed of 120 rpm with a rotary shaker. The results are shown in Table 2.
The logP _OW values shown in Table 2 are logarithmic values of the partition coefficient of the organic solvent, and are values obtained experimentally by the following method.
When the concentration of the solvent m in the aqueous phase when the assay solvent m is dissolved in a mixed solution of water and octanol (1: 1) is [m] W, and the concentration of the solvent m in octanol is [m] O, logP _OW is obtained from the following equation.
logP _OW = log ([m] O / [m] W)
As apparent from the above equation, the higher the hydrophobicity (more soluble in octanol), logP _OW becomes a high value, logP _OW more easily dissolved in water becomes a low value.
In a two-phase culture system overlaid with an organic solvent, the toxicity of the organic solvent depends on the logP _OW value, and it has been experimentally shown that the lower the logP _{OW, the} higher the toxicity (A. Inoue, K. Horikoshi, Nature, 338, 264-266, 1989). That is, in order for an organic solvent to exhibit toxicity, it is necessary to dissolve in the aqueous phase in which bacteria are present. Therefore, an organic solvent that is more soluble in water and can be present at a higher concentration in the aqueous phase has a higher organic solvent two phase. It can be said that it is highly toxic in the culture system. Therefore, logP _OW can be used as a toxicity comparison parameter for different solvents.

The OD ₆₀₀ at the start of the culture was 0.03 in each solvent system, whereas benzene, toluene, styrene, o-, m-, p-xylene, ethylbenzene, propylbenzene, n-octane or n-decane. The OD ₆₀₀ values of the obtained strains in the culture of a two-phase system (containing 10% organic solvent) of an organic solvent-water phase containing all increased significantly compared to the start of the culture. Since there is no carbon source other than the organic solvent in each solvent system, the results shown in Table 2 indicate that the obtained strain can use the organic solvent as a carbon source and has assimilability. In particular, the fact that benzene can be assimilated in a two-phase system despite the extremely low logP _OW value of benzene means that the obtained strain has extremely strong organic solvent resistance.
Example 2
[Utilization of benzene]
The benzene assimilation property was examined for Rhodococcus sp. B-4 strain and Rhodococcus opacus B-9 and B-10 strains. Place 10 ml of MM medium supplemented with benzene to the concentration shown in Table 3 into a 50 ml vial with a screw cap, inoculate it, shake culture at 28 ° C. for 2 days, and grow to OD ₆₀₀ . Measured. Shaking was performed at a speed of 120 rpm with a rotary shaker. The results are shown in Table 3.

From Table 3, it was shown that these strains have high utilization even when benzene is present at a high concentration.
Example 3
[Tolerance of organic solvents when glucose is added as a carbon source]
In the test shown in Example 1, since there was a possibility that it was not able to assimilate even though it was resistant, it did not grow. Therefore, 10% (v / V) Growth in a medium supplemented with an organic solvent was examined. The results are shown in Table 4.

All strains grew very well in the presence of n-decane. In addition, B-4 and B-9 strains showed good growth in the presence of cyclohexane, indicating strong resistance to these substances. Organic solvents other than n-decane and cyclohexanone showed somewhat better growth when cultured using an organic solvent as a carbon source.
Example 4
[Preparation of plasmid]
When using the benzene-assimilating bacterium of the present invention to produce a substance by substance conversion using an organic solvent as a raw material, genetic manipulation is possible to improve the substance-transforming ability of the benzene-assimilating bacterium of the present invention. It is desirable that In order to carry out genetic manipulation, it is necessary to construct a plasmid vector that replicates in bacteria belonging to the genus Rhodococcus. If the obtained strain holds a plasmid of an appropriate size (10 kb or less), it can be used for plasmid construction. Therefore, the plasmid of the acquired strain was searched. A method for preparing a plasmid sample is shown below.
Preparation method of plasmid sample Cells are collected from a 4.5 ml culture by centrifugation. The cells are suspended in 100 μl of GTE buffer (50 mM glucose, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA) containing 5 mg / ml lysozyme and reacted at 37 ° C. for 2 hours. Add 200 μl of 1% SDS, 0.2N aqueous NaOH, mix well, and place on ice for 5 minutes. Add 150 μl of ice-cold 5M CH ₃ CO ₂ K (pH 5.2), mix well, and place on ice for 5 minutes. After centrifugation at 15000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., the supernatant is transferred to a new 1.5 ml microcentrifuge tube. Add 450 μl of phenol / chloroform mixture (1: 1, v / v) saturated with TE buffer and mix for 5 minutes. After centrifugation at 15000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., the upper layer (aqueous layer) is transferred to a new 1.5 ml microcentrifuge tube. Add 900 μl of 99.5% ethanol, mix and place on ice for 10 minutes. After centrifugation at 15000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., the supernatant is removed. Wash the precipitate with 70% ethanol and air dry for 10 minutes. Dissolve the precipitate in 25 μl of TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA) containing 50 μg / ml of RNaseA.
When the plasmid sample prepared by the above method was analyzed by 1% agarose gel electrophoresis, it was found that Rhodococcus sp. B-4 strains retained circular plasmids of 4437 bp and 2774 bp in size. (Fig. 2). The base sequence of a circular plasmid having a size of 4437 bp is shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence of a circular plasmid having a size of 2774 bp is shown in SEQ ID NO: 2. Restriction enzyme cleavage maps of these circular plasmids were prepared by a conventional method and are shown in FIGS.
Industrial application field According to the present invention, a Rhodococcus bacterium having an assimilability to an organic solvent, particularly benzene, is provided. The benzene-assimilating bacterium of the present invention can be used for substance production using an organic solvent as a raw material. Furthermore, a plasmid vector can be constructed using a plasmid prepared from the benzene-utilizing bacterium of the present invention.
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a method for culturing benzene-utilizing bacteria.
FIG. 2 shows the result of analyzing the plasmid of Rhodococcus sp. Strain B-4 by 1% agarose gel electrophoresis.
FIG. 3 shows a restriction enzyme cleavage map of a 4437 bp circular plasmid.
FIG. 4 shows a restriction enzyme cleavage map of a 2774 bp circular plasmid.

Claims

Rhodococcus genus bacteria that show assimilability to benzene in the presence of benzene at a concentration of 10% (v / v) or more , which are Rhodococcus sp. B-4 strain (deposit number FERM BP-8281), Rhodococcus opacus Bacteria which are B-9 strain (deposit number FERM BP-8282) or Rhodococcus opacus B-10 strain (deposit number FERM BP-8283) .

Rhodococcus spp. Strain B-4 (deposition number FERM BP-8281), Rhodococcus opacus B-, which is resistant to benzene in the presence of benzene at a concentration of 10% (v / v) or higher. Bacteria that are 9 strains (deposit number FERM BP-8282) or Rhodococcus opacus B-10 strain (deposit number FERM BP-8283) .

A plasmid having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.

A plasmid having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.