JP4311936B2

JP4311936B2 - Laser scanning microscope

Info

Publication number: JP4311936B2
Application number: JP2002381490A
Authority: JP
Inventors: 竜男中田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2002-12-27
Filing date: 2002-12-27
Publication date: 2009-08-12
Anticipated expiration: 2022-12-27
Also published as: JP2004212600A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、蛍光色素や蛍光タンパクで識別された試料に励起光を照射して、試料からの蛍光を検出するレーザ走査型顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来、この種の共焦点顕微鏡として、試料から取得した光についてスペクトルごとの輝度をとって、波長ごとのスペクトルデータを検出するようにしたものが知られている。
【０００３】
このような光のスペクトルデータを検出する方法として、特許文献１に開示されるように、蛍光物体から放射される蛍光光をミラーを介して光のスペクトル分解のためのプリズムに入射する。そして、ミラーを回転させてプリズムに入射する光の角度を変化させて、プリズムによりスペクトル分解された光線と検出器の間の相対的位置を変化させることにより、スペクトル分解された波長ごとの光を検出するようにしたものがある。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００２−１２２７８７号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、特許文献１に開示されるように、光のスペクトル分解のためのプリズムを用いた場合、プリズムの分散の波長依存性により、図１１に示す波長と分光の振れ角度の関係で表わされる分光特性は、波長が長くなるほど振れが鈍くなる非線型を呈するようになる。このため、プリズムによりスペクトル分解された光線と検出器の間の相対的位置を単純に変化させただけでは、波長の変化に伴う分光の振れ角度の変化に対応することが難しく、正確な分光測定ができないという問題を生じる。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、正確で安定した分光測定を行うことができるレーザ走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、レーザ光源からの光を走査手段と対物レンズを介して標本に照射して得られる光を検出するレーザ走査型顕微鏡において、前記標本から得られる光をスペクトル分解する分散素子と、前記分散素子により生成されたスペクトル列から所望の波長範囲を選択する手段と、前記波長範囲を選択する手段より選択された波長範囲を検出する光検出器とを備え、前記波長範囲を選択する手段は、前記光検出器で検出する光の波長中心を調整する波長中心選択手段と、前記光検出器で検出する光の波長幅を調整する波長幅選択手段とを個別に有し、前記分散素子は、グレーティングまたは透過型直視分散素子であり、前記光検出器から得た出力値を前記波長中心選択手段により選択された前記光の波長中心に基づいて波長に対する出力特性がフラットになるように補正する補正手段を備えたことを特徴としている。
【００１１】
請求項２記載の発明は、請求項１に記載の発明において、前記波長中心選択手段は、前記分散素子または該分散素子を出射した光を前記波長幅選択手段に向けて偏向させる反射部材を回転させる手段であることを特徴としている。
請求項３記載の発明は、請求項２に記載の発明において、前記補正手段は、前記波長中心選択手段の回転角度を検出する手段を備え、前記光検出器から得た出力値を前記検出された回転角度に基づいて補正することを特徴としている。
【００１２】
請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか一記載の発明において、前記分散素子は、反射グレーティングであることを特徴としている。
【００１３】
請求項５記載の発明は、請求項４に記載の発明において、前記反射グレーティングは、平面回折格子または凹面回折格子であることを特徴としている。
請求項６記載の発明は、レーザ光源からの光を走査手段と対物レンズを介して標本に照射して得られる光を検出するレーザ走査型顕微鏡において、前記標本から得られる光をスペクトル分解するプリズムと、前記プリズムにより生成されたスペクトル列から所望の波長範囲を選択する手段と、前記波長範囲を選択する手段より選択された波長範囲を検出する光検出器とを備え、前記波長範囲を選択する手段は、前記光検出器で検出する光の波長中心を調整する波長中心選択手段と、前記光検出器で検出する光の波長幅を調整する波長幅選択手段とを個別に有し、前記波長幅選択手段における単位波長幅あたりの開度を前記波長中心選択手段により選択される前記光の波長中心に基づいて補正する補正手段とを備えたことを特徴としている。
【００１５】
請求項７記載の発明は、請求項６に記載の発明において、前記プリズムから出射した光を前記光検出器に向けて偏向させる反射部材をさらに備え、前記波長中心選択手段は、前記反射部材を回転させる手段であることを特徴としている。
請求項８記載の発明は、請求項６に記載の発明において、前記波長中心選択手段は、前記波長幅選択手段の開口部を前記検出器に対して前記スペクトル列の方向に移動させる手段であり、前記補正手段は、前記波長幅選択手段における単位波長幅あたりの開度を前記波長幅選択手段の開口部の移動量に基づいて補正することを特徴としている。
【００１７】
請求項９記載の発明は、請求項７に記載の発明において、前記補正手段は、前記反射部材の角度を検出する手段を備え、前記波長幅選択手段における単位波長幅あたりの開度を検出された角度に基づいて補正することを特徴としている。
請求項１０記載の発明は、請求項１乃至９のいずれか一記載の発明において、レーザ走査は、ポイントスキャン型であることを特徴としている。
請求項１１記載の発明は、請求項１乃至９のいずれか一記載の発明において、ピンホールまたはスリットが多数形成されたディスクを用いてレーザ走査を行うことを特徴としている。
請求項１２記載の発明は、請求項１乃至９のいずれか一記載の発明において、前記波長幅選択手段は、前記光検出器で検出する光の波長幅を調整する可変開口であることを特徴としている。
【００２２】
請求項１３記載の発明は、請求項１乃至１２のいずれか一記載の発明において、前記標本から得られる光を所定の波長で分割する波長分割手段を、前記分散素子の手前側に配置したことを特徴としている。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
【００２６】
（第１の実施の形態）
第１の実施の形態は、分散素子として反射回折格子を用い、この反射回折格子を回動させることにより検出する波長帯域の中心を選択するようにしたものである。さらに、本実施の形態では、反射回折格子の回折効率の波長依存性を考慮した輝度値補正も行うようにしているが、この輝度値の補正を省略したものも本発明に含まれる。
【００２７】
図１は、本発明が適用されるレーザ走査顕微鏡の概略構成を示している。
【００２８】
図において、１はレーザ光源で、このレーザ光源１から出力されるコヒーレント光の光路上には、ビーム径可変機構部２と走査光学ユニット３が配置されている。ビーム径可変機構部２は、コヒーレント光の光束径を可変するものである。走査光学ユニット３は、走査ミラー３ａ、３ｂを有し、これら走査ミラー３ａ、３ｂにより光束径を可変されたコヒーレント光を偏向するようにしている。
【００２９】
走査光学ユニット３により偏向された光の光路には、リレーレンズ４、ミラー５が配置されている。また、ミラー５の反射光路には、結像レンズ６および対物レンズ７が配置されている。
【００３０】
ミラー５で反射し結像レンズ６を通ったコヒーレント光は、対物レンズ７の瞳上で結像し、ステージ９に載置された標本８上に照射する。この場合、結像レンズ６により対物レンズ７の瞳に結像された光は、ビーム径可変機構部２で可変された光束径で標本８の断面８ａ上に集光される。
【００３１】
なお、標本８の断面８ａ上に照射される光は、走査ミラー３ａ、３ｂの動きにより断面８ａ上の所定の範囲で走査させたり、停止させてスポット的に照射させてもよく、さらには、走査ミラー３ａ、３ｂを瞬間的にスキップ動作させることで、瞬時に任意の位置にスポット的に照射させてもよい。
【００３２】
標本８は、光が照射されると、蛍光指示薬が励起され、蛍光を発するようになっている。
【００３３】
標本８から発せられた蛍光は、先の光路と逆方向に、対物レンズ７、結像レンズ６、ミラー５、リレーレンズ４、走査光学ユニット３を通ってダイクロイックミラー１０に入射する。このダイクロイックミラー１０は、ビーム径可変機構部２と走査光学ユニット３との間の光路に配置されており、ビーム径可変機構部２から入射するコヒーレント光を透過し、走査光学ユニット３より入射する蛍光を反射するような特性を有している。
【００３４】
ダイクロイックミラー１０で９０度曲げられた反射光路には、測光フィルタ１１および第１の検出部１２が配置されている。
【００３５】
測光フィルタ１１は、標本８から発せられた蛍光の波長のみを透過するものである。第１の検出部１２は、結像レンズ１３、共焦点ピンホール１４および光検出手段として光電変換素子１５を有している。測光フィルタ１１より出た蛍光は、結像レンズ１３を通って共焦点ピンホール１４面で結像する。また、共焦点ピンホール１４を通過した蛍光は、光電変換素子１５で検出される。
【００３６】
一方、レーザ光源１としてＩＲパルスレーザを使用した場合、２光子吸収による蛍光画像を取得することができる。
【００３７】
この場合、結像レンズ６と対物レンズ７との間の光路には、ダイクロイックミラー１６が配置されている。このダイクロイックミラー１６は、ミラー５から入射するＩＲパルスレーザ光を透過し、対物レンズ７より入射する可視蛍光を反射するような短波長反射の特性を有している。
【００３８】
ダイクロイックミラー１６で９０度曲げられた反射光路には、第２の検出部１７が配置されている。この場合、第２の検出部１７は、論理的に共焦点ピンホールは不要となる。
【００３９】
第２の検出部１７は、ダイクロイックミラー１６からの反射光路に沿って結像レンズ１８、ピンホール１９、コリメートレンズ２０および分散素子として反射グレーティングの平面回折格子２１が配置されている。
【００４０】
この場合、ダイクロイックミラー１６で反射した蛍光は、結像レンズ１８を通ってピンホール１９面で結像する。ピンホール１９を通った蛍光は、コリメートレンズ２０で平行光になって平面回折格子２１に入射する。
【００４１】
平面回折格子２１は、入射光を分光して波長ごとに異なる角度に光束を反射するもので、その反射効率は、中心波長（λ０）をピークとして、その両側の効率が低下するような波長特性、つまり、分光された光の強度が波長によって変動するような波長特性を有している。
【００４２】
平面回折格子２１には、駆動手段としてモータ２２が設けられている。このモータ２２は、平面回折格子２１を図示矢印方向に回転させるもので、平面回折格子２１で分光された光のうち、所望する光の波長中心を選択するための波長中心選択手段を平面回折格子２１とともに構成している。
【００４３】
モータ２２には、エンコーダ２３が接続されている。このエンコーダ２３は、平面回折格子２１の回転角度に相当する信号を出力するものである。
【００４４】
平面回折格子２１の反射光路には、集光レンズ２４、スリット２５および光検出手器して光電変換素子２６が配置されている。
【００４５】
集光レンズ２４は、平面回折格子２１の回転角度に応じて選択された波長中心の光をスリット２５面に集光するものである。スリット２５は、集光レンズ２４により集光された波長中心の光のみを選択する。ここで、平面回折格子２１での分光特性、つまり、分光された光の波長に対する分光の振れ角度の関係は、ほぼリニアになるので、スリット２５のスリット幅は一定でよい。光電変換素子２６は、スリット２５を通過した波長の光の輝度（強度）を検出し、輝度に応じた電気信号を出力する。
【００４６】
この場合、光電変換素子２６による検出信号の強度と平面回折格子２１の回転角度の関係は、図２に示すようになり、上述した図１１に示す波長特性に準じたものになっている。
【００４７】
光電変換素子２６には、信号補正手段として、補正処理部２７が接続されている。補正処理部２７には、波長検出手段として、制御部２８が接続されている。
【００４８】
制御部２８には、エンコーダ２３より平面回折格子２１の回転角度に相当する信号が入力される。制御部２８は、この信号に相当する平面回折格子２１の回転角度から選択される光の波長中心を検出し、図２に示すように光電変換素子２６の検出信号の強度がピーク値付近の一定値Ｃになるための補正値Ｈを求める。この場合、制御部２８は、平面回折格子２１の回転角度と補正値Ｈの関係を予め記憶したテーブルを用意しておき、このテーブルを用いて平面回折格子２１の回転角度から直接補正値Ｈを求めるようにしてもよい。
【００４９】
制御部２８の補正値Ｈは、補正処理部２７に送られる。補正処理部２７は、補正値Ｈを用いて光電変換素子２６の検出信号を嵩上げするような電気的な処理、例えば検出信号に対する増幅率を可変して、最終的に波長に対する出力特性がフラットになるような補正を行う。
【００５０】
次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。
【００５１】
まず、通常の共焦点観察を説明する。この場合、レーザ光源１からコヒーレント光が出射すると、この光は、ビーム径可変機構部２で光束径を可変され走査光学ユニット３に入射する。走査光学ユニット３に入射した光は、走査ミラー３ａ、３ｂにより偏向される。
【００５２】
走査光学ユニット３で偏向された光は、リレーレンズ４、ミラー５を通って結像レンズ６に入射する。結像レンズ６を通った光は、対物レンズ７の瞳上で結像し、ステージ９に載置された標本８上に照射する。この場合、結像レンズ６により対物レンズ７の瞳に結像された光は、ビーム径可変機構部２で可変された光束径で標本８の断面８ａ上に集光される。
【００５３】
標本８から発せられた蛍光は、先の光路と逆方向に、対物レンズ７、結像レンズ６、ミラー５、リレーレンズ４、走査光学ユニット３を通ってダイクロイックミラー１０に入射する。
【００５４】
ダイクロイックミラー１０で９０度曲げられた蛍光は、測光フィルタ１１に入射する。測光フィルタ１１では、標本８から発せられた蛍光の波長のみが透過し、結像レンズ１３を通って共焦点ピンホール１４面で結像する。そして、共焦点ピンホール１４を貫いた蛍光は、光電変換素子１５に入射する。光電変換素子１５は、入手した蛍光の輝度を検出し、これを電気信号に変換して共焦点データとして出力する。
【００５５】
次に、標本８からの蛍光について波長ごとのスペクトルデータを検出して分光測定を行う場合を説明する。
【００５６】
この場合、レーザ光源１としてＩＲパルスレーザが使用される。また、結像レンズ６と対物レンズ７との間の光路に、ダイクロイックミラー１６が配置される。
【００５７】
レーザ光源１からＩＲパルスレーザ光が出射すると、上述したと同様にして、走査光学ユニット３で偏向された光は、リレーレンズ４、ミラー５を通って結像レンズ６に入射する。結像レンズ６を通った光は、対物レンズ７の瞳上で結像し、ステージ９に載置された標本８上に照射する。
【００５８】
標本８から発せられた蛍光は、対物レンズ７を通ってダイクロイックミラー１６に入射する。
【００５９】
ダイクロイックミラー１６で９０度曲げられた蛍光は、結像レンズ１８を通ってピンホール１９面で結像する。ピンホール１９を通った蛍光は、コリメートレンズ２０で平行光になって平面回折格子２１に入射する。
【００６０】
平面回折格子２１に入射した蛍光は、波長ごとに異なる角度に反射される。この状態で、モータ２２により平面回折格子２１を図示矢印方向に回転すると、平面回折格子２１の回転角度に応じて各波長中心の光が集光レンズ２４を通ってスリット２５面に集光される。
【００６１】
スリット２５は、集光レンズ２４により集光された波長の光のみを通過させる。そして、スリット２５を通過した波長の光は、光電変換素子２６で検出され、輝度に応じた電気的な検出信号として出力される。
【００６２】
一方、平面回折格子２１が回転すると、エンコーダ２３は、平面回折格子２１の回転角度に相当する信号を出力する。この信号は、制御部２８に入力される。
【００６３】
制御部２８は、この信号に相当する平面回折格子２１の回転角度からスリット２５を通過される光の波長中心を検出し、図２に示すように光電変換素子２６の検出信号の強度がピーク値付近の一定値Ｃになるための補正値Ｈを求める。
【００６４】
制御部２８の補正値Ｈは、補正処理部２７に送られる。補正処理部２７は、補正値Ｈを用いて光電変換素子２６の検出信号を嵩上げ（増幅率の可変）するような電気的な処理を行う。
【００６５】
これにより、平面回折格子２１の回転角度に応じて選択される各波長中心の光に対する光電変換素子２６からの検出信号について、それぞれ求められた補正値Ｈを用いて嵩上げ（増幅）するような電気的な処理を施すことで、最終的に分光された光の強度が波長に関わらず、ほぼ一定な波長特性を得られるような補正が行われることとなる。
【００６６】
このような第１の実施の形態によれば、反射回折格子を回動させることで、検出器に導く光の波長中心を選択すると共に、スリット幅を調整することで検出される波長幅を選択することができる。波長の中心と幅をそれぞれ個別に調整することができるので、正確で安定した分光測定が可能になる。しかも、回折格子の回折効率を考慮した補正を行うようにすれば、平面回折格子２１の回転角度に応じた各波長中心に対する出力特性をフラットにできるので、光電変換素子２６の検出信号がピークを呈する中心波長付近での分光測定は勿論、中心波長から離れた波長域についても、常に正確で安定した分光測定を行うことができる。
【００６７】
なお、上述した第１の実施の形態では、反射グレーティングとして平面回折格子２１を用いたが、例えば、図１と同一部分には同符号を付した図３に示すように凹面回折格子３１を用いることもできる。この場合、結像レンズ１８とピンホール１９を通った光は、凹面回折格子３１に直接入射する。凹面回折格子３１は、入射光の波長ごとに異なる角度に光束を反射するもので、図示矢印方向に回転可能に設けられ、この回転角度に応じた波長の光束を直接スリット２５面に集光するようにしている。
【００６８】
このようにしても、第１の実施の形態で述べたと同様にして、凹面回折格子３１の回転角度に相当する信号を出力するエンコーダ２３、凹面回折格子３１の回転角度からスリット２５で選択される光束の波長を検出して補正値Ｈを求める制御部２８、制御部２８の補正値Ｈを用いて光電変換素子２６の検出信号を嵩上げする電気的な処理を行う補正処理部２７をそれぞれ設けることにより、凹面回折格子３１の回転角度に応じた各波長に対する出力特性をフラットにできるという効果を期待でき、さらに、凹面回折格子３１を用いことにより、コリメートレンズ２０と集光レンズ２４を省略できることで、構成の簡素化も期待できる。
【００６９】
また、上述した第１の実施の形態では、第２の検出部１７に、平面回折格子２１（凹面回折格子３１）を配置して、標本８からの蛍光について分光測定を行う場合を述べたが、第１の検出部１２側に平面回折格子２１（凹面回折格子３１）を配置して、分光測定を行うような構成も容易に得ることができる。
【００７０】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。
【００７１】
図４は、第２の実施の形態の要部の概略構成を示している。この場合、図４は、図１で述べたレーザ走査顕微鏡の第２の検出部１７の概略構成のみを示すもので、その他の構成については、図１と同様なので、ここでは省略している。
【００７２】
この場合、図１に示す結像レンズ６と対物レンズ７との間の光路に配置されたダイクロイックミラー１６の反射光路には、図４に示すように結像レンズ４１、ピンホール４２、コリメートレンズ４３および分光手段として透過プリズム４４が配置されている。ここでは、ダイクロイックミラー１６で反射した蛍光は、結像レンズ４１を通ってピンホール４２面で結像する。ピンホール４２を通った蛍光は、コリメートレンズ４３で平行光になって分光手段としてのプリズム４４に入射する。
【００７３】
プリズム４４は、光のスペクトル分解を行うもので、波長と分光の振れ角度の関係で表わされる分光特性は、プリズムの透過率の波長依存性により、図１１に示すように非線型（波長が長いほど振れが鈍くなる。）を呈している。つまり、例えば、青色の波長域λｂの振れ角度Ｔｂに対して赤色の波長域λｒの振れ角度Ｔｒは、著しく小さいものとなっている。
【００７４】
プリズム４４の透過光路には、集光レンズ４５、波長中心選択手段としてのミラー４６が配置され、ミラー４６の反射光路には、可変スリットとしてのスリット４７および光検出手段として光電変換素子４８が配置されている。
【００７５】
集光レンズ４５は、プリズム４４によりスペクトル分解された波長中心の光をミラー４６を介してスリット４７面に集光するものである。
【００７６】
ミラー４６には、駆動手段としてモータ４９が設けられている。このモータ４９は、ミラー４６を図示矢印方向に回転させるものである。モータ４９には、エンコーダ５０が接続されている。このエンコーダ５０は、ミラー４６の回転角度に相当する信号を出力するものである。そして、ミラー４６は、モータ４９による回転される角度に応じてプリズム４４によりスペクトル分解された光のうち、所望する波長中心の光をスリット４７面上に照射させるようになっている。
【００７７】
スリット４７は、光電変換素子４８の光検出部の前面に配置されていて、ミラー４６の回転角度に応じてスリット幅が調整され、プリズム４４でスペクトル分解された光のうち、選択された波長中心の光のみを通過させるようになっている。この場合、スリット４７は、図５に示すようにスリット中心４７ａに対してスリット片４７ｂ、４７ｃが図示矢印Ｓ１、Ｓ２の方向、つまり光の波長帯域方向に移動自在に設けられ、スリット幅を調整できるようになっている。
【００７８】
エンコーダ５０には、波長検出手段として制御部５１が接続されている。
【００７９】
制御部５１には、エンコーダ５０よりミラー４６の回転角度に相当する信号が入力される。制御部５１は、この信号に相当するミラー４６の回転角度からスリット４７に入射される光の波長中心を検出し、この検出された波長中心からプリズム４４でスペクトル分解された波長に対応する振れ角度を求める。この場合、制御部５１は、ミラー４６の回転角度と振れ角度の関係を予め記憶したテーブルを用意しておき、このテーブルを用いてミラー４６の回転角度から直接振れ角度を求めるようにしてもよい。
【００８０】
制御部５１には、スリット幅調整手段としてスリット駆動部５２が接続されている。スリット駆動部５２は、図５に示すスリット４７のスリット片４７ｂ、４７ｃを図示矢印Ｓ１、Ｓ２方向へ駆動するもので、制御部５１より与えられる振れ角度に応じてスリット幅を調整するようになっている。
【００８１】
光電変換素子４８は、スリット４７で選択された波長の光の輝度を検出し、輝度に応じた電気信号を出力する。
【００８２】
次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。
【００８３】
この場合も標本８からの蛍光について波長ごとのスペクトルデータを検出して分光測定を行う場合を説明する。
【００８４】
この場合、レーザ光源１としてＩＲパルスレーザが使用される。また、結像レンズ６と対物レンズ７との間の光路に、ダイクロイックミラー１６が配置される。
【００８５】
レーザ光源１からＩＲパルスレーザ光が出射すると、上述したと同様にして、走査光学ユニット３で偏向された光は、リレーレンズ４、ミラー５を通って結像レンズ６に入射する。結像レンズ６を通った光は、対物レンズ７の瞳上で結像し、ステージ９に載置された標本８上に照射する。
【００８６】
標本８から発せられた蛍光は、対物レンズ７を通ってダイクロイックミラー１６に入射する。
【００８７】
ダイクロイックミラー１６で９０度曲げられた蛍光は、結像レンズ４１を通ってピンホール４２面で結像する。ピンホール４２を通った蛍光は、コリメートレンズ４３で平行光になってプリズム４４に入射する。
【００８８】
プリズム４４に入射した蛍光は、スペクトル分解され、波長ごとに異なる角度に曲げられる。そして、プリズム４４でスペクトル分解された光束は、集光レンズ４５を通り、ミラー４６で反射し、スリット４７面で集光される。
【００８９】
この状態で、モータ４９によりミラー４６を図示矢印方向に回転すると、ミラー４６の回転角度により、スペクトル分解された各波長中心の光が順にスリット４７面に集光される。一方、ミラー４６が回転すると、エンコーダ５０は、ミラー４６の回転角度に相当する信号を出力する。この信号は、制御部５１に入力される。
【００９０】
制御部５１は、この信号に相当するミラー４６の回転角度からスリット４７面に集光される光束の波長中心を検出し、この検出された波長からプリズム４４でスペクトル分解された波長に対応する振れ角度を求める。
【００９１】
制御部５１で求められた振れ角度は、スリット駆動部５２に送られる。スリット駆動部５２は、制御部５１より与えられる振れ角度に応じて、図５に示すスリット４７のスリット片４７ｂ、４７ｃを図示矢印Ｓ１、Ｓ２方向へ駆動し、スリット幅を調整する。
【００９２】
スリット４７を通った波長の光は、光電変換素子４８で検出され、輝度に応じた電気的な検出信号として出力される。
【００９３】
これにより、分光特性が非線形なプリズム４４によりスペクトル分解された被測定光を角度可変のミラー４６を介してスリット４７に導く際に、ミラー４６の回転角度の検出値により、例えば図１１に示す青色の波長域λｂの振れ角度Ｔｂに対してはスリット幅を狭め、赤色の波長域λｒの振れ角度Ｔｒに対してはスリット幅を広げるようなスリット調整を行うことにより、結果的にスリット４７を通過する光の波長帯域幅を常に一定にすることができる。
【００９４】
従って、このようにすれば、ミラー４６を回動させることで光電変換素子４８に導く光の波長中心を選択すると共に、スリット４７の幅を調整することで検出される波長幅を選択することができる。波長の中心と幅をそれぞれ個別に調整することができるので、正確で安定した分光測定が可能になる。しかもプリズム４４の分散の波長依存性（すなわち、波長に対する分光の振れ角度の非線型性）を考慮してスリット幅を調整するので、検出する波長帯域に関わらず正確な波長幅で検出を行うことができる。
【００９５】
なお、第２の実施の形態では、ミラー４６の回転角度の検出値により、スリット４７のスリット片４７ｂ、４７ｃを左右方向へ駆動してスリット幅を調整するようにしたが、例えばミラー４６を固定し、スリット４７全体を図示矢印Ｓ３方向へ直線移動させることで、プリズム４４でスペクトル分解された各波長中心の光を順にスリット４７面に集光させるようにすることもできる。この場合は、スリット４７の移動量に応じてスリット片４７ｂ、４７ｃを図示矢印Ｓ１、Ｓ２方向へ駆動してスリット幅を調整する。
【００９６】
（第３の実施の形態）
次に、本発明の第３の実施の形態を説明する。
【００９７】
図６は、第３の実施の形態の要部の概略構成を示している。この場合、図６は、図１で述べたレーザ走査顕微鏡の第２の検出部１７の概略構成のみを示すもので、その他の構成については、図１と同様なので、ここでは省略している。
【００９８】
この場合、図１に示す結像レンズ６と対物レンズ７との間の光路に配置されたダイクロイックミラー１６の反射光路には、図６に示すように結像レンズ６１、ピンホール６２、コリメートレンズ６３および分光手段としてプリズムグレーティングプリズム（以下、ＰＧＰと略称する。）６４が配置されている。ここでは、ダイクロイックミラー１６で反射した蛍光は、結像レンズ６１を通ってピンホール６２面で結像する。ピンホール６２を通った蛍光は、コリメートレンズ６３で平行光になってＰＧＰ６４に入射する。
【００９９】
ＰＧＰ６４は、光のスペクトル分解を行うもので、例えば、図７に示すように２層構造をしたグレーティング６４ａの両側をプリズム６４ｂ、６４ｃで挟み込んだ構成からなっている。また、ＰＧＰ６４は、光の波長に対する振れ角度の関係で表わされる分光特性を図８に示すようにリニアに設計することができ、青色側の波長域の振れ角度と赤色側の波長域の振れ角度をほぼ同じにすることができる。また、分光された光の強度が波長に関わらずほぼ一定な波長特性をも得られるようになっている。ちなみに、このようなＰＧＰ６４の詳細は、例えば、特開平９−１２７３２１号公報や特開平９−１２７３２２号公報に開示されている。
【０１００】
ＰＧＰ６４の透過光路には、波長選択手段として、ミラー６５が配置され、ミラー６５の反射光路には、集光レンズ６６、スリット６７および光検出手段として光電変換素子６８が配置されている。
【０１０１】
ミラー６５には、図示しない駆動手段により図示矢印方向に回転可能になっている。集光レンズ６６は、ミラー６５の回転角度に応じて各波長中心の光をスリット６７面に集光するものである。スリット６７は、集光レンズ６６により集光された波長の光束のみを通過させる。ここで、ＰＧＰ６４の分光特性は、リニアなので、スリット６７の幅は一定でよく、この状態で、光電変換素子７８は、スリット６７を通った波長中心の光の輝度（強度）を検出し、輝度に応じた電気信号を出力する。
【０１０２】
従って、このようにしても、ミラー６５を回動させることで光電変換素子６８に導く光の波長中心を選択すると共に、スリット６７の幅を調整することで検出される波長幅を選択することができる。波長の中心と幅をそれぞれ個別に調整することができるので、正確で安定した分光測定が可能になる。しかも、分光された光の強度が波長に関わらずほぼ一定な波長特性と、分光された光の波長に対する分光の振れ角度の関係がほぼリニアな分光特性を有するＰＧＰ６４を用いることにより、ミラー６５を回転角度を可変させて所望する光の波長中心を選択するだけで、正確な分光を行うことができるとともに、光電変換素子６８で検出される光の輝度値も正確なものとなり、常に、正確で安定した分光測定を行うことができる。
【０１０３】
（第４の実施の形態）
次に、本発明の第４の実施の形態を説明する。
【０１０４】
図９は、第４の実施の形態の要部の概略構成を示している。この場合、図９は、図１で述べたレーザ走査顕微鏡の第２の検出部１７の概略構成のみを示すもので、その他の構成については、図１と同様なので、ここでは省略している。
【０１０５】
この場合、図１に示す結像レンズ６と対物レンズ７との間の光路に配置されたダイクロイックミラー１６の反射光路には、図６に示すように結像レンズ７１、ピンホール７２、コリメートレンズ７３および分光手段として透過グリズム７４が配置されている。ここでは、ダイクロイックミラー１６で反射した蛍光は、結像レンズ７１を通ってピンホール７２面で結像する。ピンホール７２を通った蛍光は、コリメートレンズ７３で平行光になって分光手段としてのグリズム７４に入射する。
【０１０６】
グリズム７４は、光のスペクトル分解を行うもので、例えば、図１０に示すようにグレーティング７４ａの片側にプリズム７４ｂを接合した構成からなっている。この場合、グリズム７４は、波長と分光の振れ角度の関係で表わされる分光特性を図８でに示すようにリニアになるように設計することができ、青色側の波長域の振れ角度と赤色側の波長域の振れ角度をほぼ同じにすることができる。しかし、透過率の波長特性は、中心波長をピークとして、その両側の効率が低下するような特性、つまり、分光された光の強度が波長によって変動するような特性を有している。
【０１０７】
グリズム７４の透過光路には、波長選択手段としてミラー７５が配置され、ミラー７５の反射光路には、集光レンズ７６、スリット７７および光検出手段として光電変換素子７８が配置されている。
【０１０８】
ミラー７５には、駆動手段としてモータ７９が設けられている。このモータ７９は、ミラー７５を図示矢印方向に回転させるものである。
【０１０９】
モータ７９には、エンコーダ８０が接続されている。このエンコーダ８０は、ミラー７５の回転角度に相当する信号を出力するものである。
【０１１０】
集光レンズ７６は、ミラー７５の回転角度に応じて波長中心ごとの光をスリット７７面に集光するものである。スリット７７は、集光レンズ７６により集光された波長の光束のみを通過させる。ここで、グリズム７４の分光特性は、ほぼリニアなので、スリット７７のスリット幅は一定でよい。光電変換素子７８は、スリット７７で選択された波長の光の輝度（強度）を検出し、輝度に応じた電気信号を出力する。
【０１１１】
光電変換素子７８には、信号補正手段としての補正処理部８２が接続されている。補正処理部８２には、波長検出手段としての制御部８１が接続されている。
【０１１２】
制御部８１には、エンコーダ８０よりミラー７５の回転角度に相当する信号が入力される。制御部８１は、この信号に相当するミラー７５の回転角度から集光レンズ７６を通ってスリット７７で選択される光の波長中心を検出し、光電変換素子７８の検出信号の強度がピーク値付近の一定値になるための補正値を求める。この場合、制御部８１は、ミラー７５の回転角度と補正値の関係を予め記憶したテーブルを用意しておき、このテーブルを用いてミラー７５の回転角度から直接補正値を求めるようにしてもよい。
【０１１３】
制御部８１の補正値は、補正処理部８２に送られる。補正処理部８２は、補正値を用いて光電変換素子７８の検出信号を嵩上げする電気的な処理、例えば検出信号に対する増幅率を可変して、最終的に波長に対する出力特性がフラットになるような補正を行う。
【０１１４】
従って、このようにしてもグリズム７４を用いた場合も、ミラー７５を回動させることで光電変換素子７８に導く光の波長中心を選択すると共に、スリット７７の幅を調整することで検出される波長幅を選択することができる。波長の中心と幅をそれぞれ個別に調整することができるので、正確で安定した分光測定が可能になる。しかも、ミラー７５の回転角度に応じた各波長中心に対する出力特性をフラットにできるので、光電変換素子７８の検出信号がピークを呈する中心波長付近での分光測定は勿論、中心波長から離れた波長域についても正確で安定した分光測定を行うことができる。
【０１１５】
なお、上述した実施の形態では、図１で述べたレーザ走査顕微鏡の第２の検出部１７に分光測定を行う手段を設けた例を述べたが、図１で述べたレーザ走査顕微鏡の第１の検出部１２側に、第１乃至第４の実施の形態で述べたような分光測定手段を設けるようにすることもできる。
【０１１６】
また、このような第１の検出部１２に対して、図１に示すようにダイクロイックミラー１０と測光フィルタ１１との間の光路にダイクロイックミラー９１を挿入し、このダイクロイックミラー９１の反射光路に偏光板９２を介して第３の検出部９３を接続するようにしてもよい。この場合、第３の検出部９３には、第１乃至第４の実施の形態で述べたような分光測定手段が設け、また、偏光板９２によりｓ偏光とｐ偏光に分離することにより、これらｓ偏光とｐ偏光についても分光測定により波長解析を行うことができる。なお、これらダイクロイックミラー９１および偏光板９２は、ターレット式や水平移動可能な駆動手段により光路に対して挿脱可能に設けるようにしてもよい。
【０１１７】
さらに、図１の補正処理部２７、図９の補正処理部８２は、光電変換素子からの検出信号を電気的に補正するのではなく、検出信号をＡ／Ｄ変換した後の画像生成を行う過程において、ソフトウェアによって各画素の輝度値に係数を乗じて補正するといったものにしてもよい。
【０１１８】
その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した第１の実施の形態および第２の実施の形態では、ディスクに透過部、遮光部が縞上に形成されたものを用いたが、透過部分がピンホール状の形状をしたディスクを使用してもよい。
【０１１９】
さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。
【０１２０】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、正確で安定した分光測定を行うことができるレーザ走査型顕微鏡を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態が適用されるレーザ走査顕微鏡の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態の光電変換素子による検出信号の強度と回折格子の回転角度の関係を示す図。
【図３】第１の実施の形態の変形例の要部の概略構成を示す図。
【図４】本発明の第２の実施の形態の要部の概略構成を示す図。
【図５】第２の実施の形態に用いられるスリットの概略構成を示す図。
【図６】本発明の第３の実施の形態の要部の概略構成を示す図。
【図７】第３の実施の形態に用いられるＰＧＰの概略構成を示す図。
【図８】第３の実施の形態に用いられるＰＧＰの分光特性を示す図。
【図９】本発明の第４の実施の形態の要部の概略構成を示す図。
【図１０】第４の実施の形態に用いられるグリズムの概略構成を示す図。
【図１１】一般的なプリズムの分光特性を示す図。
【符号の説明】
１…レーザ光源
２…ビーム径可変機構部
３…走査光学ユニット
３ａ．３ｂ…走査ミラー
４…リレーレンズ
５…ミラー
６…結像レンズ
７…対物レンズ
８…標本
８ａ…断面
９…ステージ
１０…ダイクロイックミラー
１１…測光フィルタ
１２…第１の検出部
１３…結像レンズ
１４…共焦点ピンホール
１５…光電変換素子
１６…ダイクロイックミラー
１７…第２の検出部
１８…結像レンズ
１９…ピンホール
２０…コリメートレンズ
２１…平面回折格子
２２…モータ
２３…エンコーダ
２４…集光レンズ
２５…スリット
２６…光電変換素子
２７…信号処理部
２８…制御部
３１…凹面回折格子
４１…結像レンズ
４２…ピンホール
４３…コリメートレンズ
４４…プリズム
４５…集光レンズ
４６…ミラー
４７…スリット
４７ａ…スリット中心
４７ｂ．４７ｃ…スリット片
４８…光電変換素子
４９…モータ
５０…エンコーダ
５１…制御部
５２…スリット駆動部
６１…結像レンズ
６２…ピンホール
６３…コリメートレンズ
６４…ＰＧＰ
６４ａ…グレーティング
６４ｂ．６４ｃ…プリズム
６５…ミラー
６６…集光レンズ
６７…スリット
６８…光電変換素子
７１…結像レンズ
７２…ピンホール
７３…コリメートレンズ
７４…グリズム
７４ａ…グレーティング
７４ｂ…プリズム
７５…ミラー
７６…集光レンズ
７７…スリット
７８…光電変換素子
７９…モータ
８０…エンコーダ
８１…制御部
８２…補正処理部
９１…ダイクロイックミラー
９２…偏光板
９３…第３の検出部[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a laser scanning microscope for detecting fluorescence from a sample by irradiating a sample identified by a fluorescent dye or fluorescent protein with excitation light, for example.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, a confocal microscope of this type is known that detects the spectral data for each wavelength by taking the luminance for each spectrum of the light acquired from the sample.
[0003]
As a method for detecting such spectral data of light, as disclosed in Patent Document 1, fluorescent light emitted from a fluorescent object is incident on a prism for spectral decomposition of light through a mirror. Then, by rotating the mirror and changing the angle of the light incident on the prism, the relative position between the light beam spectrally resolved by the prism and the detector is changed, so that the light for each spectrally resolved wavelength is changed. There is something to be detected.
[0004]
[Patent Document 1]
JP 2002-122787 A
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
However, as disclosed in Patent Document 1, when a prism for spectral decomposition of light is used, the spectrum represented by the relationship between the wavelength shown in FIG. The characteristic exhibits a non-linear shape in which the vibration becomes dull as the wavelength becomes longer. For this reason, simply changing the relative position between the light beam spectrally resolved by the prism and the detector makes it difficult to cope with changes in the spectral deflection angle associated with changes in wavelength. The problem that can not be.
[0006]
The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a laser scanning microscope capable of performing accurate and stable spectroscopic measurement.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
  According to the first aspect of the present invention, in a laser scanning microscope for detecting light obtained by irradiating a sample with light from a laser light source via a scanning means and an objective lens, dispersion for spectrally decomposing light obtained from the sample An element, a means for selecting a desired wavelength range from the spectrum sequence generated by the dispersion element, and a photodetector for detecting the wavelength range selected by the means for selecting the wavelength range, The selecting means has wavelength center selecting means for adjusting the wavelength center of the light detected by the photodetector and wavelength width selecting means for adjusting the wavelength width of the light detected by the photodetector.The dispersion element is a grating or a transmissive direct-view dispersion element, and the output value with respect to the wavelength is flat based on the output value obtained from the photodetector based on the wavelength center of the light selected by the wavelength center selection means. With correction means to correctIt is characterized by that.
[0011]
  Claim2The described invention is claimed.1In the described invention, the wavelength center selection means includes the dispersion element.Or a reflection member for deflecting the light emitted from the dispersion element toward the wavelength width selection meansIt is a means to rotate.
According to a third aspect of the present invention, in the invention of the second aspect, the correction means includes means for detecting a rotation angle of the wavelength center selection means, and the output value obtained from the photodetector is detected. The correction is based on the rotation angle.
[0012]
  Claim4The described invention is claimed.Any one of 1 to 3In the described invention, the dispersive element is a reflective grating.
[0013]
  Claim5The described invention is claimed.4In the described invention, the reflection grating is a planar diffraction grating or a concave diffraction grating.
According to a sixth aspect of the present invention, there is provided a laser scanning microscope for detecting light obtained by irradiating a specimen with light from a laser light source via a scanning means and an objective lens, and a prism for spectrally decomposing light obtained from the specimen. And a means for selecting a desired wavelength range from the spectrum sequence generated by the prism, and a photodetector for detecting the wavelength range selected by the means for selecting the wavelength range, wherein the wavelength range is selected. The means individually includes wavelength center selection means for adjusting the wavelength center of light detected by the photodetector, and wavelength width selection means for adjusting the wavelength width of light detected by the photodetector, and the wavelength And correcting means for correcting the opening per unit wavelength width in the width selecting means based on the wavelength center of the light selected by the wavelength center selecting means.
[0015]
  Claim7The described invention is claimed.6In the described invention,prismFurther, a reflection member for deflecting light emitted from the light detector toward the photodetector is further provided, and the wavelength center selection means is means for rotating the reflection member.
  The invention according to claim 8 is the invention according to claim 6, wherein the wavelength center selection means is means for moving the opening of the wavelength width selection means in the direction of the spectrum row with respect to the detector. The correction means corrects the opening per unit wavelength width in the wavelength width selection means based on the amount of movement of the opening of the wavelength width selection means.
[0017]
  Claim9The described invention is claimed.7In the described invention,The correction means includesMeans for detecting the angle of the reflecting memberWithThe opening per unit wavelength width in the wavelength width selection meanswas detectedCorrect based on angleThatIt is characterized by.
According to a tenth aspect of the present invention, in the invention according to any one of the first to ninth aspects, the laser scanning is a point scan type.
An eleventh aspect of the invention is characterized in that in the invention of any one of the first to ninth aspects, laser scanning is performed using a disk on which a large number of pinholes or slits are formed.
According to a twelfth aspect of the present invention, in the invention according to any one of the first to ninth aspects, the wavelength width selection means is a variable aperture that adjusts a wavelength width of light detected by the photodetector. It is said.
[0022]
  Claim13The invention described in claims 1 toAny one of 12In the described invention, a wavelength division unit that divides light obtained from the sample by a predetermined wavelength is arranged on the front side of the dispersion element.
[0025]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
[0026]
(First embodiment)
In the first embodiment, a reflection diffraction grating is used as a dispersion element, and the center of a wavelength band to be detected is selected by rotating the reflection diffraction grating. Further, in the present embodiment, the luminance value correction is performed in consideration of the wavelength dependence of the diffraction efficiency of the reflection diffraction grating, but the present invention also includes the correction of the luminance value.
[0027]
FIG. 1 shows a schematic configuration of a laser scanning microscope to which the present invention is applied.
[0028]
In the figure, reference numeral 1 denotes a laser light source. On the optical path of coherent light output from the laser light source 1, a beam diameter variable mechanism unit 2 and a scanning optical unit 3 are arranged. The beam diameter varying mechanism 2 varies the beam diameter of coherent light. The scanning optical unit 3 includes scanning mirrors 3a and 3b, and deflects coherent light whose beam diameter is changed by the scanning mirrors 3a and 3b.
[0029]
A relay lens 4 and a mirror 5 are disposed in the optical path of the light deflected by the scanning optical unit 3. In addition, an imaging lens 6 and an objective lens 7 are disposed in the reflected light path of the mirror 5.
[0030]
The coherent light reflected by the mirror 5 and passing through the imaging lens 6 forms an image on the pupil of the objective lens 7 and irradiates the sample 8 placed on the stage 9. In this case, the light imaged on the pupil of the objective lens 7 by the imaging lens 6 is condensed on the cross section 8 a of the sample 8 with the light beam diameter varied by the beam diameter variable mechanism unit 2.
[0031]
The light irradiated on the cross section 8a of the specimen 8 may be scanned within a predetermined range on the cross section 8a by the movement of the scanning mirrors 3a and 3b, or may be stopped and irradiated in a spot manner. The scanning mirrors 3a and 3b may be instantaneously skipped so that an arbitrary position is instantaneously irradiated with a spot.
[0032]
When the specimen 8 is irradiated with light, the fluorescent indicator is excited and emits fluorescence.
[0033]
The fluorescence emitted from the specimen 8 enters the dichroic mirror 10 through the objective lens 7, the imaging lens 6, the mirror 5, the relay lens 4, and the scanning optical unit 3 in the direction opposite to the previous optical path. The dichroic mirror 10 is disposed in the optical path between the beam diameter variable mechanism section 2 and the scanning optical unit 3, transmits the coherent light incident from the beam diameter variable mechanism section 2, and enters from the scanning optical unit 3. It has the property of reflecting fluorescence.
[0034]
A photometric filter 11 and a first detection unit 12 are disposed in the reflected light path bent 90 degrees by the dichroic mirror 10.
[0035]
The photometric filter 11 transmits only the wavelength of the fluorescence emitted from the sample 8. The first detection unit 12 includes an imaging lens 13, a confocal pinhole 14, and a photoelectric conversion element 15 as light detection means. The fluorescence emitted from the photometric filter 11 passes through the imaging lens 13 and forms an image on the confocal pinhole 14 surface. The fluorescence that has passed through the confocal pinhole 14 is detected by the photoelectric conversion element 15.
[0036]
On the other hand, when an IR pulse laser is used as the laser light source 1, a fluorescence image by two-photon absorption can be acquired.
[0037]
In this case, a dichroic mirror 16 is disposed in the optical path between the imaging lens 6 and the objective lens 7. The dichroic mirror 16 has a short wavelength reflection characteristic that transmits the IR pulse laser beam incident from the mirror 5 and reflects visible fluorescence incident from the objective lens 7.
[0038]
A second detector 17 is disposed in the reflected light path bent 90 degrees by the dichroic mirror 16. In this case, the second detection unit 17 does not need a confocal pinhole logically.
[0039]
In the second detection unit 17, an imaging lens 18, a pinhole 19, a collimating lens 20, and a planar diffraction grating 21 of a reflection grating as a dispersion element are arranged along a reflection optical path from the dichroic mirror 16.
[0040]
In this case, the fluorescence reflected by the dichroic mirror 16 passes through the imaging lens 18 and forms an image on the surface of the pinhole 19. The fluorescence that has passed through the pinhole 19 is converted into parallel light by the collimator lens 20 and enters the plane diffraction grating 21.
[0041]
  The plane diffraction grating 21 separates incident light and reflects the light flux at different angles for each wavelength, and its reflection efficiency is,DuringIt has a wavelength characteristic in which the efficiency at both sides thereof decreases with the central wavelength (λ0) as a peak, that is, a wavelength characteristic in which the intensity of the dispersed light varies depending on the wavelength.
[0042]
The planar diffraction grating 21 is provided with a motor 22 as driving means. The motor 22 rotates the planar diffraction grating 21 in the direction of the arrow shown in the figure, and the wavelength center selecting means for selecting the desired wavelength center of the light split by the planar diffraction grating 21 is a planar diffraction grating. 21 together.
[0043]
An encoder 23 is connected to the motor 22. The encoder 23 outputs a signal corresponding to the rotation angle of the planar diffraction grating 21.
[0044]
A condensing lens 24, a slit 25, and a photoelectric conversion element 26 serving as a light detector are arranged in the reflection optical path of the planar diffraction grating 21.
[0045]
The condensing lens 24 condenses light having a wavelength center selected according to the rotation angle of the planar diffraction grating 21 on the surface of the slit 25. The slit 25 selects only the light having the wavelength center collected by the condenser lens 24. Here, the spectral characteristics of the planar diffraction grating 21, that is, the relationship of the spectral deflection angle with respect to the wavelength of the dispersed light is substantially linear, so the slit width of the slit 25 may be constant. The photoelectric conversion element 26 detects the luminance (intensity) of light having a wavelength that has passed through the slit 25 and outputs an electrical signal corresponding to the luminance.
[0046]
In this case, the relationship between the intensity of the detection signal from the photoelectric conversion element 26 and the rotation angle of the planar diffraction grating 21 is as shown in FIG. 2 and conforms to the wavelength characteristics shown in FIG.
[0047]
A correction processing unit 27 is connected to the photoelectric conversion element 26 as signal correction means. A control unit 28 is connected to the correction processing unit 27 as wavelength detection means.
[0048]
A signal corresponding to the rotation angle of the planar diffraction grating 21 is input from the encoder 23 to the control unit 28. The control unit 28 detects the wavelength center of the light selected from the rotation angle of the planar diffraction grating 21 corresponding to this signal, and the intensity of the detection signal of the photoelectric conversion element 26 is constant around the peak value as shown in FIG. A correction value H for obtaining the value C is obtained. In this case, the control unit 28 prepares a table in which the relationship between the rotation angle of the planar diffraction grating 21 and the correction value H is stored in advance, and the correction value H is directly calculated from the rotation angle of the planar diffraction grating 21 using this table. You may make it ask.
[0049]
The correction value H of the control unit 28 is sent to the correction processing unit 27. The correction processing unit 27 uses the correction value H to increase the detection signal of the photoelectric conversion element 26, for example, by changing the amplification factor for the detection signal, and finally the output characteristics with respect to the wavelength become flat. Correct as follows.
[0050]
Next, the operation of the embodiment configured as described above will be described.
[0051]
First, normal confocal observation will be described. In this case, when coherent light is emitted from the laser light source 1, the light beam diameter is changed by the beam diameter variable mechanism unit 2 and enters the scanning optical unit 3. The light incident on the scanning optical unit 3 is deflected by the scanning mirrors 3a and 3b.
[0052]
The light deflected by the scanning optical unit 3 enters the imaging lens 6 through the relay lens 4 and the mirror 5. The light passing through the imaging lens 6 forms an image on the pupil of the objective lens 7 and irradiates the specimen 8 placed on the stage 9. In this case, the light imaged on the pupil of the objective lens 7 by the imaging lens 6 is condensed on the cross section 8 a of the sample 8 with the light beam diameter varied by the beam diameter variable mechanism unit 2.
[0053]
The fluorescence emitted from the specimen 8 enters the dichroic mirror 10 through the objective lens 7, the imaging lens 6, the mirror 5, the relay lens 4, and the scanning optical unit 3 in the direction opposite to the previous optical path.
[0054]
The fluorescence bent 90 degrees by the dichroic mirror 10 enters the photometric filter 11. In the photometric filter 11, only the wavelength of the fluorescence emitted from the specimen 8 is transmitted and passes through the imaging lens 13 and forms an image on the surface of the confocal pinhole 14. Then, the fluorescence passing through the confocal pinhole 14 enters the photoelectric conversion element 15. The photoelectric conversion element 15 detects the luminance of the obtained fluorescence, converts it into an electric signal, and outputs it as confocal data.
[0055]
Next, a description will be given of a case where spectral data for each wavelength of fluorescence from the specimen 8 is detected and spectroscopic measurement is performed.
[0056]
In this case, an IR pulse laser is used as the laser light source 1. A dichroic mirror 16 is disposed in the optical path between the imaging lens 6 and the objective lens 7.
[0057]
When the IR pulse laser beam is emitted from the laser light source 1, the light deflected by the scanning optical unit 3 enters the imaging lens 6 through the relay lens 4 and the mirror 5 in the same manner as described above. The light passing through the imaging lens 6 forms an image on the pupil of the objective lens 7 and irradiates the specimen 8 placed on the stage 9.
[0058]
The fluorescence emitted from the specimen 8 passes through the objective lens 7 and enters the dichroic mirror 16.
[0059]
The fluorescence bent 90 degrees by the dichroic mirror 16 passes through the imaging lens 18 and forms an image on the surface of the pinhole 19. The fluorescence that has passed through the pinhole 19 is converted into parallel light by the collimator lens 20 and enters the plane diffraction grating 21.
[0060]
The fluorescence incident on the planar diffraction grating 21 is reflected at different angles for each wavelength. In this state, when the planar diffraction grating 21 is rotated in the direction indicated by the arrow by the motor 22, light at each wavelength center is condensed on the surface of the slit 25 through the condenser lens 24 according to the rotation angle of the planar diffraction grating 21. .
[0061]
The slit 25 allows only light having a wavelength collected by the condenser lens 24 to pass therethrough. And the light of the wavelength which passed the slit 25 is detected by the photoelectric conversion element 26, and is output as an electrical detection signal according to a brightness | luminance.
[0062]
On the other hand, when the planar diffraction grating 21 rotates, the encoder 23 outputs a signal corresponding to the rotation angle of the planar diffraction grating 21. This signal is input to the control unit 28.
[0063]
The control unit 28 detects the wavelength center of the light passing through the slit 25 from the rotation angle of the planar diffraction grating 21 corresponding to this signal, and the intensity of the detection signal of the photoelectric conversion element 26 has a peak value as shown in FIG. A correction value H for obtaining a constant value C in the vicinity is obtained.
[0064]
The correction value H of the control unit 28 is sent to the correction processing unit 27. The correction processing unit 27 performs electrical processing such as using the correction value H to increase the detection signal of the photoelectric conversion element 26 (variation of the amplification factor).
[0065]
As a result, the detection signal from the photoelectric conversion element 26 with respect to the light of each wavelength center selected according to the rotation angle of the planar diffraction grating 21 is increased (amplified) using the obtained correction value H. By performing such a process, correction is performed so that the wavelength of the finally dispersed light is almost constant regardless of the wavelength.
[0066]
    According to the first embodiment as described above, the wavelength center of the light guided to the detector is selected by rotating the reflection diffraction grating, and the wavelength width detected by adjusting the slit width is selected. can do. Since the center and width of the wavelength can be individually adjusted, accurate and stable spectroscopic measurement is possible. Moreover, diffraction of the diffraction gratingefficiencyIf the correction is performed in consideration of the above, the output characteristic for each wavelength center according to the rotation angle of the planar diffraction grating 21 can be flattened, so that the spectrum near the center wavelength where the detection signal of the photoelectric conversion element 26 exhibits a peak is obtained. Of course, accurate and stable spectroscopic measurement can always be performed in a wavelength region far from the center wavelength.
[0067]
In the first embodiment described above, the planar diffraction grating 21 is used as the reflection grating. However, for example, a concave diffraction grating 31 is used as shown in FIG. You can also In this case, the light passing through the imaging lens 18 and the pinhole 19 is directly incident on the concave diffraction grating 31. The concave diffraction grating 31 reflects the light beam at different angles depending on the wavelength of the incident light, and is provided so as to be rotatable in the direction of the arrow in the figure. I am doing so.
[0068]
Even in this case, in the same manner as described in the first embodiment, the encoder 23 that outputs a signal corresponding to the rotation angle of the concave diffraction grating 31 and the slit 25 are selected from the rotation angle of the concave diffraction grating 31. A control unit 28 that detects the wavelength of the light beam and obtains a correction value H, and a correction processing unit 27 that performs electrical processing for raising the detection signal of the photoelectric conversion element 26 using the correction value H of the control unit 28 are provided. Therefore, it is possible to expect the effect that the output characteristics for each wavelength according to the rotation angle of the concave diffraction grating 31 can be flattened. Further, by using the concave diffraction grating 31, the collimating lens 20 and the condenser lens 24 can be omitted. Also, simplification of the configuration can be expected.
[0069]
In the first embodiment described above, a case has been described in which the planar diffraction grating 21 (concave diffraction grating 31) is arranged in the second detection unit 17 and spectroscopic measurement is performed on the fluorescence from the specimen 8. Further, a configuration in which the planar diffraction grating 21 (concave diffraction grating 31) is arranged on the first detection unit 12 side and the spectroscopic measurement is performed can be easily obtained.
[0070]
(Second Embodiment)
Next, a second embodiment of the present invention will be described.
[0071]
FIG. 4 shows a schematic configuration of a main part of the second embodiment. In this case, FIG. 4 shows only a schematic configuration of the second detection unit 17 of the laser scanning microscope described in FIG. 1, and the other configuration is the same as that in FIG.
[0072]
In this case, the reflection optical path of the dichroic mirror 16 disposed in the optical path between the imaging lens 6 and the objective lens 7 shown in FIG. 1 includes the imaging lens 41, the pinhole 42, and the collimating lens as shown in FIG. 43 and a transmission prism 44 as a spectroscopic means are arranged. Here, the fluorescence reflected by the dichroic mirror 16 passes through the imaging lens 41 and forms an image on the surface of the pinhole 42. The fluorescence that has passed through the pinhole 42 is converted into parallel light by the collimating lens 43 and is incident on a prism 44 as a spectroscopic means.
[0073]
  The prism 44 performs spectral decomposition of light, and the spectral characteristic represented by the relationship between the wavelength and the spectral deflection angle depends on the wavelength dependency of the transmittance of the prism.FIG.As shown in Fig. 2, it exhibits a non-linear type (the longer the wavelength, the less the vibration becomes). That is, for example, the shake angle Tr of the red wavelength region λr is significantly smaller than the shake angle Tb of the blue wavelength region λb.
[0074]
A condensing lens 45 and a mirror 46 as a wavelength center selection unit are disposed in the transmission optical path of the prism 44, and a slit 47 as a variable slit and a photoelectric conversion element 48 as a light detection unit are disposed in the reflection optical path of the mirror 46. Has been.
[0075]
The condensing lens 45 condenses the light having the wavelength center spectrally resolved by the prism 44 on the surface of the slit 47 via the mirror 46.
[0076]
The mirror 46 is provided with a motor 49 as drive means. The motor 49 rotates the mirror 46 in the direction indicated by the arrow. An encoder 50 is connected to the motor 49. The encoder 50 outputs a signal corresponding to the rotation angle of the mirror 46. The mirror 46 irradiates the surface of the slit 47 with light having a desired wavelength center out of the light spectrally resolved by the prism 44 according to the angle rotated by the motor 49.
[0077]
The slit 47 is disposed in front of the light detection unit of the photoelectric conversion element 48, the slit width is adjusted according to the rotation angle of the mirror 46, and the wavelength center selected from the light spectrally resolved by the prism 44 Only the light of is allowed to pass through. In this case, as shown in FIG. 5, the slit 47 has slit pieces 47b and 47c that are movable in the directions of the arrows S1 and S2, that is, in the wavelength direction of the light, with respect to the slit center 47a, and adjust the slit width. It can be done.
[0078]
A controller 51 is connected to the encoder 50 as wavelength detecting means.
[0079]
A signal corresponding to the rotation angle of the mirror 46 is input from the encoder 50 to the control unit 51. The control unit 51 detects the wavelength center of the light incident on the slit 47 from the rotation angle of the mirror 46 corresponding to this signal, and the deflection angle corresponding to the wavelength spectrally resolved by the prism 44 from the detected wavelength center. Ask for. In this case, the control unit 51 may prepare a table in which the relationship between the rotation angle and the swing angle of the mirror 46 is stored in advance, and obtain the swing angle directly from the rotation angle of the mirror 46 using this table. .
[0080]
A slit driving unit 52 is connected to the control unit 51 as slit width adjusting means. The slit drive unit 52 drives the slit pieces 47b and 47c of the slit 47 shown in FIG. 5 in the directions indicated by the arrows S1 and S2, and adjusts the slit width according to the deflection angle given by the control unit 51. ing.
[0081]
The photoelectric conversion element 48 detects the luminance of the light having the wavelength selected by the slit 47 and outputs an electric signal corresponding to the luminance.
[0082]
Next, the operation of the embodiment configured as described above will be described.
[0083]
In this case as well, a case where spectral data for each wavelength of the fluorescence from the specimen 8 is detected and spectroscopic measurement is performed will be described.
[0084]
In this case, an IR pulse laser is used as the laser light source 1. A dichroic mirror 16 is disposed in the optical path between the imaging lens 6 and the objective lens 7.
[0085]
When the IR pulse laser beam is emitted from the laser light source 1, the light deflected by the scanning optical unit 3 enters the imaging lens 6 through the relay lens 4 and the mirror 5 in the same manner as described above. The light passing through the imaging lens 6 forms an image on the pupil of the objective lens 7 and irradiates the specimen 8 placed on the stage 9.
[0086]
The fluorescence emitted from the specimen 8 passes through the objective lens 7 and enters the dichroic mirror 16.
[0087]
The fluorescence bent 90 degrees by the dichroic mirror 16 passes through the imaging lens 41 and forms an image on the surface of the pinhole 42. The fluorescence that has passed through the pinhole 42 becomes parallel light by the collimating lens 43 and enters the prism 44.
[0088]
The fluorescence incident on the prism 44 is spectrally resolved and bent at different angles for each wavelength. Then, the light beam spectrally resolved by the prism 44 passes through the condenser lens 45, is reflected by the mirror 46, and is condensed on the surface of the slit 47.
[0089]
In this state, when the mirror 46 is rotated by the motor 49 in the direction of the arrow shown in the figure, the light at each wavelength center subjected to spectral decomposition is sequentially collected on the surface of the slit 47 according to the rotation angle of the mirror 46. On the other hand, when the mirror 46 rotates, the encoder 50 outputs a signal corresponding to the rotation angle of the mirror 46. This signal is input to the control unit 51.
[0090]
The control unit 51 detects the wavelength center of the light beam condensed on the surface of the slit 47 from the rotation angle of the mirror 46 corresponding to this signal, and the vibration corresponding to the wavelength spectrally resolved by the prism 44 from the detected wavelength. Find the angle.
[0091]
The deflection angle obtained by the control unit 51 is sent to the slit driving unit 52. The slit drive unit 52 adjusts the slit width by driving the slit pieces 47b and 47c of the slit 47 shown in FIG. 5 in the directions indicated by the arrows S1 and S2 in accordance with the deflection angle given from the control unit 51.
[0092]
Light having a wavelength that has passed through the slit 47 is detected by the photoelectric conversion element 48 and is output as an electrical detection signal corresponding to the luminance.
[0093]
  Thereby, when the light to be measured spectrally resolved by the prism 44 having a nonlinear spectral characteristic is guided to the slit 47 via the angle-variable mirror 46, the detected value of the rotation angle of the mirror 46 is used, for example,FIG.The slit width is narrowed with respect to the deflection angle Tb in the blue wavelength range λb shown in FIG. 5 and the slit width is increased with respect to the deflection angle Tr in the red wavelength range λr, resulting in a slit. The wavelength bandwidth of the light passing through 47 can always be constant.
[0094]
Accordingly, by doing this, the wavelength center of the light guided to the photoelectric conversion element 48 can be selected by rotating the mirror 46, and the detected wavelength width can be selected by adjusting the width of the slit 47. it can. Since the center and width of the wavelength can be individually adjusted, accurate and stable spectroscopic measurement is possible. In addition, the slit width is adjusted in consideration of the wavelength dependence of the dispersion of the prism 44 (that is, the nonlinearity of the spectral deflection angle with respect to the wavelength), so that detection is performed with an accurate wavelength width regardless of the wavelength band to be detected. Can do.
[0095]
In the second embodiment, the slit width is adjusted by driving the slit pieces 47b and 47c of the slit 47 in the left-right direction based on the detected value of the rotation angle of the mirror 46. For example, the mirror 46 is fixed. Then, by moving the entire slit 47 linearly in the direction of the arrow S3 in the figure, it is also possible to condense the light of each wavelength center spectrally resolved by the prism 44 onto the surface of the slit 47 in order. In this case, the slit pieces 47b and 47c are driven in the directions of the arrows S1 and S2 in accordance with the amount of movement of the slit 47 to adjust the slit width.
[0096]
(Third embodiment)
Next, a third embodiment of the present invention will be described.
[0097]
FIG. 6 shows a schematic configuration of the main part of the third embodiment. In this case, FIG. 6 shows only a schematic configuration of the second detection unit 17 of the laser scanning microscope described in FIG. 1, and the other configuration is the same as that in FIG.
[0098]
In this case, the reflection optical path of the dichroic mirror 16 disposed in the optical path between the imaging lens 6 and the objective lens 7 shown in FIG. 1 includes the imaging lens 61, the pinhole 62, and the collimating lens as shown in FIG. 63 and a prism grating prism (hereinafter abbreviated as PGP) 64 are disposed as the spectroscopic means. Here, the fluorescence reflected by the dichroic mirror 16 passes through the imaging lens 61 and forms an image on the surface of the pinhole 62. The fluorescence that has passed through the pinhole 62 becomes parallel light by the collimator lens 63 and enters the PGP 64.
[0099]
The PGP 64 performs spectral decomposition of light. For example, as shown in FIG. 7, the PGP 64 has a structure in which both sides of a grating 64a having a two-layer structure are sandwiched between prisms 64b and 64c. Further, the PGP 64 can linearly design the spectral characteristics expressed by the relationship of the shake angle with respect to the light wavelength as shown in FIG. 8, and the shake angle in the blue wavelength range and the shake angle in the red wavelength range can be designed. Can be made almost the same. Further, it is possible to obtain a wavelength characteristic in which the intensity of the dispersed light is almost constant regardless of the wavelength. Incidentally, details of such PGP 64 are disclosed in, for example, Japanese Patent Laid-Open Nos. 9-127321 and 9-127322.
[0100]
A mirror 65 is disposed as a wavelength selection unit in the transmission optical path of the PGP 64, and a condenser lens 66, a slit 67 and a photoelectric conversion element 68 are disposed as a light detection unit in the reflection optical path of the mirror 65.
[0101]
The mirror 65 can be rotated in the direction of the arrow shown by driving means (not shown). The condensing lens 66 condenses light of each wavelength center on the surface of the slit 67 according to the rotation angle of the mirror 65. The slit 67 allows only a light beam having a wavelength collected by the condenser lens 66 to pass therethrough. Here, since the spectral characteristic of the PGP 64 is linear, the width of the slit 67 may be constant. In this state, the photoelectric conversion element 78 detects the luminance (intensity) of the light at the wavelength center that has passed through the slit 67, and the luminance. The electric signal according to is output.
[0102]
Therefore, even in this case, it is possible to select the wavelength center of the light guided to the photoelectric conversion element 68 by rotating the mirror 65 and to select the detected wavelength width by adjusting the width of the slit 67. it can. Since the center and width of the wavelength can be individually adjusted, accurate and stable spectroscopic measurement is possible. In addition, by using the PGP 64 having a wavelength characteristic in which the intensity of the dispersed light is substantially constant regardless of the wavelength and a spectral characteristic in which the relationship of the spectral deflection angle with respect to the wavelength of the dispersed light is substantially linear, By simply changing the rotation angle and selecting the desired wavelength center of the light, accurate spectroscopy can be performed, and the luminance value of the light detected by the photoelectric conversion element 68 is also accurate, which is always accurate. Stable spectroscopic measurement can be performed.
[0103]
(Fourth embodiment)
Next, a fourth embodiment of the present invention will be described.
[0104]
FIG. 9 shows a schematic configuration of a main part of the fourth embodiment. In this case, FIG. 9 shows only the schematic configuration of the second detection unit 17 of the laser scanning microscope described in FIG. 1, and the other configurations are the same as those in FIG.
[0105]
In this case, the reflected light path of the dichroic mirror 16 disposed in the optical path between the imaging lens 6 and the objective lens 7 shown in FIG. 1 includes the imaging lens 71, the pinhole 72, and the collimating lens as shown in FIG. 73 and a transmission grism 74 as a spectroscopic means are arranged. Here, the fluorescence reflected by the dichroic mirror 16 passes through the imaging lens 71 and forms an image on the surface of the pinhole 72. The fluorescence that has passed through the pinhole 72 is converted into parallel light by the collimating lens 73 and is incident on the grism 74 as the spectroscopic means.
[0106]
  The grism 74 performs spectral decomposition of light. For example, as shown in FIG. 10, the grism 74 has a configuration in which a prism 74b is joined to one side of the grating 74a. In this case, the grism 74 can be designed so that the spectral characteristic represented by the relationship between the wavelength and the spectral deflection angle is linear as shown in FIG. Can be made substantially the same in the wavelength range. However, the wavelength characteristic of transmittance is,DuringIt has a characteristic that the efficiency on both sides of the central wavelength decreases, that is, the intensity of the dispersed light varies depending on the wavelength.
[0107]
In the transmitted light path of the grism 74, a mirror 75 is disposed as a wavelength selecting means, and in the reflected light path of the mirror 75, a condenser lens 76, a slit 77 and a photoelectric conversion element 78 are disposed as light detecting means.
[0108]
The mirror 75 is provided with a motor 79 as drive means. The motor 79 rotates the mirror 75 in the direction indicated by the arrow.
[0109]
An encoder 80 is connected to the motor 79. The encoder 80 outputs a signal corresponding to the rotation angle of the mirror 75.
[0110]
The condensing lens 76 condenses the light for each wavelength center on the surface of the slit 77 according to the rotation angle of the mirror 75. The slit 77 allows only a light beam having a wavelength collected by the condenser lens 76 to pass therethrough. Here, since the spectral characteristic of the grism 74 is substantially linear, the slit width of the slit 77 may be constant. The photoelectric conversion element 78 detects the luminance (intensity) of the light having the wavelength selected by the slit 77 and outputs an electrical signal corresponding to the luminance.
[0111]
The photoelectric conversion element 78 is connected to a correction processing unit 82 as signal correction means. The correction processing unit 82 is connected to a control unit 81 serving as a wavelength detection unit.
[0112]
A signal corresponding to the rotation angle of the mirror 75 is input from the encoder 80 to the control unit 81. The control unit 81 detects the wavelength center of the light selected by the slit 77 through the condenser lens 76 from the rotation angle of the mirror 75 corresponding to this signal, and the intensity of the detection signal of the photoelectric conversion element 78 is near the peak value. A correction value for obtaining a constant value is obtained. In this case, the control unit 81 may prepare a table in which the relationship between the rotation angle of the mirror 75 and the correction value is stored in advance, and obtain the correction value directly from the rotation angle of the mirror 75 using this table. .
[0113]
The correction value of the control unit 81 is sent to the correction processing unit 82. The correction processing unit 82 uses the correction value to increase the detection signal of the photoelectric conversion element 78, for example, by changing the amplification factor for the detection signal so that the output characteristic with respect to the wavelength finally becomes flat. Make corrections.
[0114]
Accordingly, even when the grism 74 is used in this way, the center of the wavelength of the light guided to the photoelectric conversion element 78 is selected by rotating the mirror 75 and the width of the slit 77 is adjusted. The wavelength width can be selected. Since the center and width of the wavelength can be individually adjusted, accurate and stable spectroscopic measurement is possible. In addition, since the output characteristic for each wavelength center according to the rotation angle of the mirror 75 can be flattened, the spectral measurement near the center wavelength where the detection signal of the photoelectric conversion element 78 exhibits a peak is of course, and the wavelength range away from the center wavelength. Also, accurate and stable spectroscopic measurement can be performed.
[0115]
In the above-described embodiment, an example in which means for performing spectroscopic measurement is provided in the second detection unit 17 of the laser scanning microscope described in FIG. 1 is described. However, the first of the laser scanning microscope described in FIG. The spectroscopic measurement means as described in the first to fourth embodiments may be provided on the detection unit 12 side.
[0116]
Further, as shown in FIG. 1, a dichroic mirror 91 is inserted into the optical path between the dichroic mirror 10 and the photometric filter 11 with respect to the first detection unit 12 as described above, and the reflected light path of the dichroic mirror 91 is polarized. The third detection unit 93 may be connected via the plate 92. In this case, the third detector 93 is provided with the spectroscopic measurement means as described in the first to fourth embodiments, and is separated into s-polarized light and p-polarized light by the polarizing plate 92. Wavelength analysis can also be performed by spectroscopic measurement for s-polarized light and p-polarized light. The dichroic mirror 91 and the polarizing plate 92 may be provided so as to be detachable with respect to the optical path by a turret type or horizontally movable driving means.
[0117]
Further, the correction processing unit 27 in FIG. 1 and the correction processing unit 82 in FIG. 9 do not electrically correct the detection signal from the photoelectric conversion element, but generate an image after A / D converting the detection signal. In the process, the luminance value of each pixel may be corrected by a coefficient by software.
[0118]
In addition, this invention is not limited to the said embodiment, In the implementation stage, it can change variously in the range which does not change the summary. For example, in the first embodiment and the second embodiment described above, a disk in which a transmission part and a light-shielding part are formed on stripes is used. However, a disk in which the transmission part has a pinhole shape. May be used.
[0119]
Furthermore, the above embodiments include inventions at various stages, and various inventions can be extracted by appropriately combining a plurality of disclosed constituent elements. For example, even if some constituent requirements are deleted from all the constituent requirements shown in the embodiment, the problem described in the column of the problem to be solved by the invention can be solved, and is described in the column of the effect of the invention. If the above effect is obtained, a configuration from which this configuration requirement is deleted can be extracted as an invention.
[0120]
【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, a laser scanning microscope capable of performing accurate and stable spectroscopic measurement can be provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of a laser scanning microscope to which a first embodiment of the present invention is applied.
FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the intensity of a detection signal obtained by the photoelectric conversion element according to the first embodiment and the rotation angle of the diffraction grating.
FIG. 3 is a diagram showing a schematic configuration of a main part of a modified example of the first embodiment.
FIG. 4 is a diagram showing a schematic configuration of a main part of a second embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a diagram showing a schematic configuration of a slit used in the second embodiment.
FIG. 6 is a diagram showing a schematic configuration of a main part of a third embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a diagram showing a schematic configuration of a PGP used in a third embodiment.
FIG. 8 is a graph showing the spectral characteristics of PGP used in the third embodiment.
FIG. 9 is a diagram showing a schematic configuration of a main part of a fourth embodiment of the present invention.
FIG. 10 is a diagram showing a schematic configuration of a grism used in a fourth embodiment.
FIG. 11 is a diagram showing spectral characteristics of a general prism.
[Explanation of symbols]
1 ... Laser light source
2 ... Beam diameter variable mechanism
3 Scanning optical unit
3a. 3b Scanning mirror
4 ... Relay lens
5 ... Mirror
6 ... Imaging lens
7 ... Objective lens
8 ... Sample
8a ... Cross section
9 ... Stage
10 ... Dichroic mirror
11 ... Photometric filter
12 ... 1st detection part
13 ... Imaging lens
14 ... Confocal pinhole
15 ... Photoelectric conversion element
16 ... Dichroic mirror
17 ... 2nd detection part
18 ... Imaging lens
19 ... pinhole
20 ... Collimating lens
21 ... Planar diffraction grating
22 ... Motor
23 ... Encoder
24 ... Condensing lens
25 ... Slit
26: photoelectric conversion element
27. Signal processor
28: Control unit
31 ... Concave diffraction grating
41 ... imaging lens
42 ... pinhole
43 ... Collimating lens
44 ... Prism
45 ... Condensing lens
46 ... Mirror
47 ... Slit
47a ... Slit center
47b. 47c ... Slit piece
48. Photoelectric conversion element
49 ... Motor
50 ... Encoder
51. Control unit
52 ... Slit drive unit
61 ... Imaging lens
62 ... pinhole
63 ... Collimating lens
64 ... PGP
64a ... Grating
64b. 64c ... Prism
65 ... Mirror
66 ... Condensing lens
67 ... Slit
68. Photoelectric conversion element
71: Imaging lens
72 ... pinhole
73 ... Collimating lens
74 ... Grism
74a ... Grating
74b ... Prism
75 ... Mirror
76 ... Condensing lens
77 ... Slit
78. Photoelectric conversion element
79 ... Motor
80 ... Encoder
81 ... Control unit
82 ... Correction processing section
91 ... Dichroic mirror
92 ... Polarizing plate
93. Third detection unit

Claims

In a laser scanning microscope for detecting light obtained by irradiating a specimen with light from a laser light source via a scanning means and an objective lens,
A dispersive element for spectrally decomposing light obtained from the specimen;
Means for selecting a desired wavelength range from the spectral sequence generated by the dispersive element;
A photodetector for detecting the wavelength range selected by the means for selecting the wavelength range;
The means for selecting the wavelength range includes wavelength center selection means for adjusting the wavelength center of light detected by the photodetector and wavelength width selection means for adjusting the wavelength width of light detected by the photodetector. possess the said dispersive element is a grating or transmissive direct dispersion element, the output characteristic with respect to wavelength based on the output value obtained from the photodetector to the center wavelength of the light selected by the wavelength center selection means A laser scanning microscope characterized by comprising correction means for correcting the flatness of the laser.

2. The laser scanning according to claim 1, wherein the wavelength center selection unit is a unit that rotates the dispersion element or a reflection member that deflects light emitted from the dispersion element toward the wavelength width selection unit. Type microscope.

The correction means includes means for detecting a rotation angle of the wavelength center selection means ,
The laser scanning microscope according to claim 2, wherein the benzalkonium be corrected based on the output value obtained from the photodetector to the detected rotation angle.

The dispersing element is a laser scanning microscope according to any one of claims 1 to 3, characterized in that a reflective grating.

The laser scanning microscope according to claim 4, wherein the reflection grating is a planar diffraction grating or a concave diffraction grating.

In a laser scanning microscope for detecting light obtained by irradiating a specimen with light from a laser light source via a scanning means and an objective lens,
  A prism for spectrally decomposing light obtained from the specimen;
  Means for selecting a desired wavelength range from the spectral sequence generated by the prism;
  A photodetector for detecting the wavelength range selected by the means for selecting the wavelength range;
  The means for selecting the wavelength range includes wavelength center selection means for adjusting the wavelength center of light detected by the photodetector and wavelength width selection means for adjusting the wavelength width of light detected by the photodetector. And a correction means for correcting an opening per unit wavelength width in the wavelength width selection means based on the wavelength center of the light selected by the wavelength center selection means. Type microscope.

The laser according to claim 6, further comprising a reflecting member that deflects light emitted from the prism toward the photodetector, wherein the wavelength center selecting unit is a unit that rotates the reflecting member. Scanning microscope.

The wavelength center selection unit is a unit that moves the aperture of the wavelength width selection unit with respect to the detector in the direction of the spectrum row, and the correction unit is a unit of the wavelength width selection unit. The laser scanning microscope according to claim 6, wherein the opening is corrected based on a moving amount of the opening of the wavelength width selecting unit.

The correction means includes means for detecting the angle of the reflecting member ,
The laser scanning microscope according to claim 7, characterized that you corrected based on the opening degree per unit wavelength width of the detected angle in the wavelength range selection means.

The laser scanning microscope according to any one of claims 1 to 9 , wherein the laser scanning is a point scanning type.

Pinholes or laser scanning microscope according to any one of claims 1 to 9 slit and feature to make a laser scanning using multiple forming disk.

The wavelength width selection means, a laser scanning microscope according to any one of claims 1 to 9, characterized in that a variable aperture for adjusting the wavelength width of the light detected by the light detector.

The laser scanning microscope according to any one of claims 1 to 12 , wherein wavelength division means for dividing light obtained from the specimen by a predetermined wavelength is disposed on the front side of the dispersion element.