JP4309133B2 - ヌクレオチド配列annについての亜鉛フィンガー結合ドメイン - Google Patents
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Description
本開示は、5'−ANN−3'型のDNA配列を認識する亜鉛フィンガードメインの選択を可能にする新規ファージディスプレイライブラリーの構築を教示している。かかるドメインは単離され、それらが選択される3bp標的部位についての鋭敏な結合特異性を示した。これらの亜鉛フィンガードメインを、pM〜低nM範囲の親和力でそれらの18bp標的部位へ特異的に結合する6−フィンガータンパク質へ移植した。調節ドメインに融合されると、5つの5'−ANN−3'および1つの5'−TNN−3'ドメインを含む一人工的6−フィンガータンパク質は、亜鉛フィンガー結合部位およびTATAボックスを含む最小プロモーターの制御下でルシフェラーゼリポーター遺伝子を調節した。さらに、5'−ANN−3'および5'−GNN−3'ドメインから組立てられた6−フィンガータンパク質は、内在性erbB−2およびerbB−3遺伝子の特異的転写調節をそれぞれ示した。これらの結果は、5'−GNN−3'以外の3bp標的部位に結合するモジュール亜鉛フィンガードメインが選択され得ること、およびそれらが人工的転写因子を作製するための追加モジュールとして適切であり、それによって予め規定された亜鉛フィンガードメインから構築されたDNA結合タンパク質によりターゲッティングされ得る配列の数が大きく増加することを示す。
I 亜鉛フィンガーポリペプチド
本発明は、亜鉛フィンガータンパク質から誘導された2〜12個のヌクレオチド結合ドメインペプチドを含む単離および精製ポリペプチドを提供する。ヌクレオチド結合ドメインペプチドは、亜鉛フィンガータンパク質のαヘリックス部分から誘導される。好ましい上記ヌクレオチド結合ドメインペプチドは、配列番号7〜71または107〜112のいずれかのアミノ酸残基配列を有する。好ましくは、ペプチドは、配列番号46〜70のいずれかのアミノ酸残基配列を有する。さらに好ましくは、ペプチドは、配列番号10、11、17、19、21、23〜30、32、34〜36、42、43または45のいずれかのアミノ酸残基配列を有する。ペプチドの各々は、式5'−ANN−3'(式中、Nはいずれかのヌクレオチド(すなわち、A、C、GまたはT)である)に対応するヌクレオチド標的配列と特異的に結合するように設計され、生成されている。すなわち、この発明のポリペプチドは、ヌクレオチド配列5'−(ANN)n−3'(ただし、nは2〜12の整数である)に結合する。好ましくは、nは2〜6である。
本発明は、亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を包含する。本発明の亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドをコード化するDNA配列は、天然、切頭化および拡張されたポリペプチドを含め、幾つかの方法により入手され得る。例えば、DNAは、当業界で公知のハイブリダイゼーション手順を用いて単離され得る。これらには、(1)共有ヌクレオチド配列を検出するためのゲノムまたはcDNAライブラリーとプローブのハイブリダイゼーション、(2)共有的構造的特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング、および(3)ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による合成があるが、限定されるわけではない。本発明のRNA配列は、当業界で公知の方法により入手され得る(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel,et al.編(1989)参照)。
別の態様において、本発明は、亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドの治療有効量または亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列の治療有効量を医薬上許容される担体と組合わせて含む医薬組成物を提供する。
一態様において、本発明方法は、亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合モチーフを含むヌクレオチド配列の発現を変調(阻害または抑制)する方法であって、亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合モチーフを、モチーフに結合する亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチドの有効量と接触させる工程を含む方法を包含する。ヌクレオチド配列がプロモーターである場合、この方法では、亜鉛フィンガー‐DNA結合モチーフを含むプロモーターの転写活性化(トランスアクチベーション)を阻害する。「阻害する」の語は、例えば、亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合モチーフを含む、プロモーターへ機能し得るように結合された構造遺伝子の転写活性化レベルの抑制をいう。さらに、亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体は、構造遺伝子内またはRNA配列内のモチーフと結合し得る。
亜鉛フィンガーライブラリーの構築は、先に記載したC7タンパク質に基くものであった([Wu et al.,(1995)PNAS 92、344−348];図1)。5'−GCG−3'サブサイトを認識するフィンガー3を、フィンガー3をコーディングするプライマー(5'−GAGGAAGTTTGCCACCAGTGGCAACCTGGTGAGGCATACCAAAATC−3')(配列番号104)およびpMal特異的プライマー(5'−GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGC−3')(配列番号105)を用いるオーバーラップPCR戦略を用いて5'−GAT−3'サブサイト[Segal et al.,(1999)Proc Natl Acad Sci USA96(6)、2758−2763]に結合するドメインにより置換した。PCRオーバーラップ拡張による亜鉛フィンガーライブラリーのランダム化は、本質的には報告された通りであった[Wu et al.,(1995)PNAS 92、344−348; Segal et al.,(1999)Proc Natl Acad Sci USA96(6)、2758−2763]。ライブラリーをファージミドベクターpComb3H[Rader et al.,(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8(4)、503−508]へライゲーションした。以前に報告された要領[Barbas et al.,(1991)Methods:Companion Methods Enzymol.2(2)、119−124;Barbas et al.,(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88、7978−7982; Segal et al.,(1999)Proc Natl Acad Sci USA96(6)、2758−2763]でファージの増殖および沈澱を行った。体積500μlの亜鉛緩衝液A(ZBA:10mMのトリス、pH7.5/90mMのKCl/1mMのMgCl2/90μMのZnCl2)/0.2%BSA/5mMのDTT/1%ブロット(バイオラッド)/100μl沈澱ファージ(1013コロニー形成単位)含有二本鎖せん断ニシン精液DNA20μg中で結合反応を行わせた。ファージを、4℃で1時間非ビオチニル化競合体オリゴヌクレオチドに結合させた後、ビオチニル化標的オリゴヌクレオチドを加えた。結合は4℃で一晩続いた。1時間50μlのストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ(ダイナル;ZBA中5%のブロットにより遮断)とのインキュベーション後、ビーズを500μlのZBA/2%トウィーン20/5mMのDTTで10回、およびトウィーン不含有の緩衝液で1回洗浄した。結合ファージの溶離は、室温で30分間TBS(トリス緩衝食塩水)中25μlトリプシン(10μg/ml)でのインキュベーションにより行った。ヘアピン競合体オリゴヌクレオチドは、配列5'−GGCCGCN'N'N'ATC GAGTTTTCTCGATNNNGCGGCC−3'(配列番号106)(ただし、NNNはフィンガー‐2サブサイトオリゴヌクレオチドを表し、N'N'N'はその相補塩基を表す)(標的オリゴヌクレオチドはビオチニル化されていた)を有していた。標的オリゴヌクレオチドを、通常、最初の3ラウンドの選択では72nMで、次いで第6および最終ラウンドでは36nMおよび18nMに減らして加えた。競合体として5'−TGG−3'フィンガー‐2サブサイトオリゴヌクレオチドを用いることにより、親クローンと競合させた。標的部位を除く、15のフィンガー‐2,5'−ANN−3'サブサイトの当モル混合物、および5'−CNN−3'、5'−GNN−3'、および5'−TNN−3'型の各フィンガー‐2サブサイトの競合体混合物を、各連続的選択ラウンドで量を増加させながら加えた。通常、特異的5'−ANN−3'競合体混合物を第1ラウンドでは加えなかった。
報告された要領[Segal et al.,(1999)Proc Natl Acad Sci USA96(6)、2758−2763; Dreier et al.,(2000)J.Mol.Biol.303、489−502]でフィンガー‐2突然変異体をPCRにより構築した。PCR鋳型として、5'−TGG−3'フィンガー2および5'−GAT−3'フィンガー3を含むライブラリークローンを使用した。突然変異フィンガー2および5'−GAT−3'フィンガー3を含むPCR産物を、C7のフィンガー1との枠におけるNsiIおよびSpeI制限部位を介して修飾pMal−c2ベクター(ニューイングランド・バイオラブズ)へサブクローニングした。
トランスフェクションおよびルシフェラーゼ検定法
ヒーラ細胞を、培養飽和密度の40〜60%で使用した。細胞を、24ウェルプレートにおいて160ngのリポータープラスミド(pGL3−プロモーター構築物)および40ngのエフェクタープラスミド(pcDNA3における亜鉛フィンガー‐エフェクタードメイン融合体)によりトランスフェクションした。トランスフェクションの48時間後に細胞抽出物を調製し、MicroLumat LB96Pルミノメーター(EG & バーソルド、ガイザーズバーグ、メリーランド)においてルシフェラーゼ検定試薬(プロメガ)により測定した。
報告された要領[Beerli et al.,(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97(4)、1495−1500;Beerli et al.,(2000)J.Biol.Chem.275(42)、32617−32627]でこれらの検定法を遂行した。一次抗体として、ErbB−1特異的mAb EGFR(サンタクルス)、ErbB−2特異的mAb FSP77(Nancy E.Hynesから寄贈;Harwewrth et al.,1992)およびErbB−3特異的mAb SGP1(オンコジーン・リサーチ・プロダクツ)を使用した。蛍光標識ロバF(ab')2抗マウスIgGを二次抗体として使用した(ジャクソン・イムノ‐リサーチ)。
インサイトII(モレキュラー・シミュレーションズ、インコーポレイテッド)を用いてコンピューターモデルを作成した。モデルは、Zif268−DNA(PDB受託1AAY)およびQGSR−GCAC(配列番号107)(1A1H)の共結晶構造の座標に基いていた。これらの構造は、エネルギー最小限化されておらず、提示されてはいても可能な相互作用を示唆しているに過ぎない。重原子間の距離が3(+/−0.3)オングストロームであり、重原子および水素により形成される角度が1200またはそれより大きいとき、水素結合は信頼できそうであるとみなされた。信頼できそうであるファンデルワールス相互作用は、4(+/−0.3)オングストロームのメチル基炭素原子間の距離を必要とした。
Claims (17)
- 2〜12個のCys 2 −His 2 亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ペプチドを含む合成ポリペプチドであって、該合成ポリペプチドが配列5'−(ANN)n−3'(式中、各NはA、C、GまたはTであり、nは2〜6である)を含む選択されたDNA配列に結合することができ、結合ペプチドの少なくとも1個が配列番号7〜70および109のいずれかの配列を有する合成ポリペプチド。
- 少なくとも1個のヌクレオチド結合ペプチドが配列番号7〜70および109のいずれかの配列を有する、請求項1記載の合成ポリペプチド。
- 2〜6個のCys 2 −His 2 亜鉛フィンガー‐ヌクレオチド結合ペプチドを含む、請求項1記載の合成ポリペプチド。
- ヌクレオチド結合ペプチドの各々が異なるDNA配列に結合する、請求項1記載の合成ポリペプチド。
- ペプチドが配列5'−(ANN)n−3'(式中、各NはA、C、GまたはTであり、nは2〜6である)を含む選択されたDNA配列に結合することができる、請求項3記載の合成ポリペプチド。
- さらに1個またはそれ以上の転写調節因子に機能し得るように結合された、請求項1記載の合成ポリペプチド。
- ヌクレオチド結合ペプチドの各々が、配列番号46〜70のいずれかの配列を含む、請求項1記載の合成ポリペプチド。
- ヌクレオチド結合ペプチドの各々が、配列番号7〜45のいずれかの配列を含む、請求項1記載の合成ポリペプチド。
- ヌクレオチド結合ペプチドの各々が、配列番号10、11、17、19、21、23〜30、32、34〜36、42、43または45のいずれかの配列を含む、請求項1記載の合成ポリペプチド。
- ヌクレオチド結合ペプチドの各々が、配列番号46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58または59のいずれかの配列を含む、請求項1記載のポリペプチド。
- 請求項1記載のポリペプチドをコード化する単離および精製されたポリヌクレオチド。
- 請求項11記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 配列(5'−ANN)n−3'(式中、nは2〜12の整数である)を含む選択されたDNA配列の発現調節方法であって、請求項1記載のポリペプチドの有効量にDNA配列を暴露する工程を含む方法。
- 配列5'−(ANN)n−3'が、DNA配列の転写領域に存在する、請求項13記載の方法。
- 配列5'−(ANN)n−3'が、DNA配列のプロモーター領域に存在する、請求項13記載の方法。
- 配列5'−(ANN)n−3'が、発現された配列標識内に存在する、請求項13記載の方法。
- ポリペプチドが、1個またはそれ以上の転写調節因子に機能し得るように結合されている、請求項13記載の方法。
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