JP4309037B2 - Sewing type intercalator with redox activity - Google Patents

Description

【０００６】
上記の導電性縫い込み型インターカレータは、ナフタレンジイミド環状基をコア（中央核部分）とし、その両端部に鎖状のリンカー部分を有し、そして、リンカー部分の先端体部には酸化還元活性を持ち、共役系を有する導電性フェロセン分子が付いている。
【０００７】
電極上のプローブ分子に相補性を有する試料ＤＮＡ断片の検出では、電極に電位を印加して得られる電流量は、プローブ分子、ＤＮＡ断片試料、測定緩衝液の塩濃度等の条件によって若干変動するが、上記の導電性縫い込み型インターカレータを使用した場合には、流れる電流量は、約４５０乃至約６２０ｍＶの範囲にある電位を印加した場合にピーク値を示すため、通常、そのピーク電流値を与える約４５０ｍＶより高い電位を印加することによって行なわれる。
【０００８】
上記のピーク電流が発生する電位範囲の約４５０乃至約６２０ｍＶは比較的高い値であるため、そのような電位を電極に与える測定装置の製造は、製造コスト面で不利になる。また、電極表面に静電結合などの比較的弱い結合状態で固定されたプローブ分子は、高い電位の付与によって電極表面から離脱しやすくなるため、検出対象となるＤＮＡ断片試料の検出感度や検出精度の低下が問題となる。特に、プローブ分子を有する電極を、一旦結合したＤＮＡ断片試料とインターカレータとを離脱させたのち、同様の操作に繰り返し用いる場合には、検出感度や検出精度の低下が発生しやすい。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヌクレオチド誘導体あるいはその類縁体が電極表面に固定されたＤＮＡチップを用い、ＤＮＡ断片試料などのポリヌクレオチド試料もしくはオリゴヌクレオチド試料を導電性縫い込み型インターカレータを利用して電気化学的に検出する操作の実施に於いて、相対的に低い電位の使用によっても高い検出感度や検出精度での検出操作を可能にする導電性縫い込み型インターカレータとして有用な化合物を提供することを主な課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記式（１）で表わされる化合物にある。
【００１１】
【化５】

【００１２】
［ただし、Ｒはアルキレン−イミノ−アルキレン基であり、Ｑはアルキレン基であり、Ｅは置換基を有していてもよいフェロセニル基であり、ＺおよびＺ ^１ は、それぞれ、水素原子、ハロゲン原子あるいは炭素原子数が１乃至６のアルキル基である。］
【００１３】
上記式（１）において、式中の二つのＥ、二つのＱ、そして二つのＲが、それぞれ、互いに同一の基であることが好ましい。
【００１４】
Ｒに含まれるイミノは、炭素原子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が２乃至４のアシル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基および炭素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラルキル基からなる群より選ばれる基で置換されていてもよい。Ｒに含まれるイミノは、メチル基で置換されていることが好ましい。Ｑは、炭素原子数が１乃至６のアルキレン基であることが好ましい。
【００１５】
Ｅは、フェロセニル基であるか、下記（Ｆ１）〜（Ｆ３）からなる群より選ばれる置換基を有しているフェロセニル基であることが好ましい。
【００１６】
【化６】

【００２０】
本発明はまた、前記式（１）で表わされる化合物からなる酸化還元活性を有する縫い込み型インターカレータにもある。この縫い込み型インターカレータは、特にオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料の分析のための電気化学的分析法に有利に用いられる。
【００２１】
本発明の縫い込み型インターカレータは、下記のオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料の分析のための電気化学的分析法に特に有利に用いられる。
（１）電極基板の表面に備えられた一群のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなるプローブ分子と、該プローブ分子と相補的な関係にあるオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料とを水性媒体と縫い込み型インターカレータの存在下でハイブリダイズさせて、該縫い込み型インターカレータが挿入された、該プローブ分子とオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料とのらせん構造体などの複合体を形成させる工程、そして上記電極基板に電位を付与し、これにより発生する電流を検知する工程を含むオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料の分析方法。
【００２２】
（２）電極基板の表面に備えられた一群のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなるプローブ分子と、該プローブ分子と相補的な関係にあるオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料とを水性媒体の存在下でハイブリダイズさせ、次いで縫い込み型インターカレータを接触させることにより、該縫い込み型インターカレータが挿入された、該プローブ分子とオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料とのらせん構造体などの複合体を形成させる工程、そして上記電極基板に電位を付与し、これにより発生する電流を検知する工程を含むオリゴヌクレオチド試料もしくはポリヌクレオチド試料の分析方法。
【００２３】
上記の分析方法に於いて、本発明の縫い込み型インターカレータを用いると、電極基板付与する電位として、１００乃至４００ｍＶの範囲内の相対的に低い電位が利用できる。
【００２４】
なお、本発明の縫い込み型インターカレータは、一群のヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体からなるプローブ分子が備えられた電極基板と組合わせた分析キットとして利用することもできる。上記の、ヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体の代表例としては、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、もしくはペプチド核酸を挙げることができる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明の発明者は、公知の導電性縫い込み型インターカレータを用いてのＤＮＡ断片試料の電気化学的検出操作において必要となる高い電位は、酸化還元活性を持ち、共役系を有する導電性フェロセン分子などの導電性基の共役系が、アミド結合部分などのπ結合系にまで拡大した共役系を形成するため、導電性基における移動性電子密度が低下することに関連があるという推定のもとに、導電性基の共役系をリンカー部分にまで拡大させないことにより、検出操作において必要な電位の低下が実現できるのではないかと期待して、そのような化学構造の化合物を合成し、その化合物を導電性縫い込み型インターカレータと使用して、ＤＮＡ断片試料の電気化学的検出操作を実施したところ、その期待通りの低電圧（低電圧）で電流検出が可能になった。
本発明は、上記の新規な知見に基づいて完成されたものである。
【００２６】
本発明において導電性縫い込み型インターカレータとして有利に用いられる化合物は、下記式（１）で表わされる化合物である。
【００２７】
【化７】
Ｅ_a−Ｌ_a−Ｘ−Ｌ_b−Ｅ_b −− （１）
【００２８】
本発明において導電性縫い込み型インターカレータとして特に有利に用いられる化合物は、下記式（２）で表わされる化合物である。
【００２９】
【化８】
Ｅ_a−Ｌ_1a−Ｌ_2a−Ｘ−Ｌ_2b−Ｌ_1b−Ｅ_b −− （２）
【００３０】
式（１）および式（２）において、Ｘは、置換基を有していてもよい二価の環状基を表す。二価の環状基としては、平面性を有する環状基であることが好ましく、二つの窒素原子に結合手を有するナフタレンジイミド基、２位と６位、もしくは１位と５位（好ましくは２位と６位）とに結合手を有するアントラセン基、アントラセン基と同じ位置に結合手を有するアントラキノン基、２位と６位とに結合手を有するフルオレン基、２位と６位とに結合手を有するビフェニレン基、２位と７位とに結合手を有するフェナントレン基、および２位と７位とに結合手を有するピレン基からなる群より選ばれる環状基であることが好ましく、二つの窒素原子に結合手を有するナフタレンジイミド基であることが特に好ましい。置換基としては、水素原子、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）、あるいは炭素原子数１乃至６のアルキル基であることが好ましいが、水素原子であることが好ましい。炭素原子数１乃至６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、もしくはｎ−プロピル基であることが好ましい。
【００３１】
前記式（１）において、Ｌ_aおよびＬ_bは、互いに独立に、それぞれがＥ_aおよびＥ_bの共役系が延長される共役系を形成することのない連結基であって、少なくとも一方の連結基が、本化合物に水溶性を付与する部位を有する連結基もしくは水溶性を付与する部位に変換し得る部位を有する連結基である。ここで、「水溶性を付与する部位に変換し得る部位」とは、たとえば、メチル基を置換基として有するイミノ基のように、硫酸などの酸と接触した場合に、硫酸塩部位に変換され、水溶性を示すように変化する部位を有する。勿論、「本化合物に水溶性を付与する部位」に塩部分のような荷電部分を持っていてもよい。
【００３２】
Ｌ_aおよびＬ_bは、互いに独立に、Ｅ_aおよびＥ_bに隣接する側に、置換基を有していてもよい炭化水素基（前記式（２）のＬ_1aとＬ_1bに相当する基）を有し、一方、Ｘに隣接する側に炭素元素以外の元素を含む連結基（前記式（２）のＬ_2aとＬ_2bに相当する基）とからなる連結基であることが好ましい。従って、Ｌ_aおよびＬ_bは、それぞれ、前記式（２）の−Ｌ_1a−Ｌ_2a−、そして−Ｌ_2b−Ｌ_1b−に該当する連結基であることが望ましい。ここで、Ｌ_1aとＬ_1bは、互いに独立に、置換基を有していてもよい炭素原子数が１乃至６のアルキレン基あるいは置換基を有していてもよい炭素原子数が２乃至６のアルケニレン基であることが好ましく、一方、Ｌ_2aとＬ_2bとは、互いに独立に、Ｎ、Ｏ、もしくはＳを含む連結基であることが望ましい。
【００３３】
Ｌ_1aおよびＬ_1bの置換基としては、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、カルボキシル基、アミノ基、シアノ基、ニトロ基、ホルミル基、ホルミルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃至６のアルキルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のハロゲン化アルキル基、炭素原子数が５乃至７のシクロアルキルアミノ基、炭素原子数が２乃至１２のジアルキルアミノ基、炭素原子数が６乃至１２のアリール基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至１８のアラルキル基、１乃至６のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至１８のアラルキルアミノ基、炭素原子数が２乃至７のアルカノイル基、炭素原子数が２乃至７のアルカノイルアミノ基、炭素原子数が３乃至１０のＮ−アルカノイル−Ｎ−アルキルアミノ基、アミノカルボニル基、炭素原子数が２乃至７のアルコキシカルボニル基、Ｓ、ＮおよびＯからなる群より選ばれるヘテロ原子を１乃至４個含む炭素原子数２乃至１０の複素環基、並びに置換基として炭素原子数１乃至６のアルキル基、炭素原子数１乃至６のアルコキシ基、もしくはハロゲン原子を１乃至５個有していてもよい環構成炭素原子数の数が６乃至１２のアリール基からなる群より選ばれる原子もしくは基である。置換基の数は、炭素原子数が１乃至６のアルキレン基では、１乃至１２個であることが好ましく、１乃至３個であることが特に好ましい。炭素原子数が２乃至６のアルケニレン基については、その数は１乃至１０個であることが好ましく、１乃至３個であることが特に好ましい。
【００３４】
Ｌ_2aとＬ_2bとは、互いに独立に、それぞれ、置換基を有していてもよい、アミド結合基、エステル結合基、エーテル結合基、チオエーテル結合基、ジイミド結合基、チオジイミド結合基、チオアミド結合基、イミノ結合基、カルボニル結合基、チオカルボニル結合基および１，４−ピペラジニル基からなる群より選ばれる基を一個もしくは複数個含む連結基であることが好ましく、特に好ましいのはアミド基（−ＮＨＣＯ−基、もしくは−ＣＯＮＨ−基）である。
【００３５】
Ｌ_2aとＬ_2bの置換基の例としては、炭素原子数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が２乃至４のアシル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基および炭素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラルキル基からなる群より選ばれる基で置換されていてもよい。炭素原子数が１乃至３のアルキル基としては、メチル基もしくはエチル基であることが好ましく、メチル基であることが特に好ましい。炭素原子数が２乃至４のアシル基としては、アセチル基であることが好ましい。炭素原子数が６乃至２０のアリール基としては、フェニル基もしくはナフチル基であることが好ましく、フェニル基であることが特に好ましい。炭素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラルキル基としては、ベンジル基であることが好ましい。
【００３６】
Ｌ_2aとＬ_2bがイミノ結合基である場合、その置換基としては、メチル基であることが特に好ましい。従って、Ｌ_2aとＬ_2bは、それぞれ独立に、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基、１，４−ジ（ｎ−プロピレニル）−ピペラジニル基であることがさらに好ましく、Ｎ−メチル−ジ（ｎ−プロピレニル）イミノ基であることが特に好ましい。
【００３７】
Ｅ_aおよびＥ_bは、酸化還元活性を有し、これによって導電性を付与する基であり、互いに独立に、置換基を有していてもよい、一つ以上の結合手を持つメタロセン、２，２’−ビピリジン錯体、シクロブタジエン錯体、シクロペンタジエニル錯体、１，１０−フェナントロリン錯体、トリフェニルホスフィン錯体、カテコールアミン、あるいはビオローゲンなどであることが好ましい。置換基を有していてもよい一つの結合手を持つフェロセンであることが特に好ましい。Ｅ_aおよびＥ_bは互いに同一の基であることが好ましい。次に、置換基を有するフェロセンの具体例を示す。置換基の位置は、シクロペンタジエニル基の何れの位置であってもよい。
【００３８】
【化９】

【００３９】
本発明の縫い込み型インターカレータとして有利に用いることのできる化合物は、例えば、公知のジアミン化合物を原料として、公知の方法（特開平９−２８８０８０号公報）に準じる製造方法によって簡便に製造することができる。
【００４０】
また、本発明の化合物は、公知のジアミン化合物を出発物質とする下記の式で代表される合成ルートによっても安価に、かつ収率良く製造することができる。
【００４１】
【化１０】

【００４２】
上記合成ルートは、反応＜ａ＞、＜ｂ＞、および＜ｃ＞からなる。公知のジアミン化合物を二種類以上使用し、ナフタレンジイミド構造（コア）に対して互いに異なるリンカー部分を縮合させてもよいが、本合成ルートでは、代表的な製造方法を示すこととする。
【００４３】
以下、それぞれの反応について分説する。
【００４４】
上記合成ルートの（４）の化合物：Ａ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ₂は、（５）で表わされる公知のジアミンから、公知の方法（Green T.W.,Wuts.P.G.M,Protective Groups in Organic Synthesis(2nd Edition,Wiley,New York,1991,315-345,349-358）に準じる方法を利用して合成することができる。
【００４５】
Ａは、炭素原子数が２乃至５のアシル基、炭素原子数が２乃至５のアルコキシカルボニル基、および置換基を有していてもよいベンゾイル基もしくはベンジルオキシカルボニル基からなる群より選ばれる基であることが好ましく、アセチル基、ｔ−ブチルカルボニル基（ピバロイル基）、ｔ−ブトキシカルボニル基、もしくは置換基を有していてもよいベンジルオキシカルボニル基であることが特に好ましい。ベンゾイル基もしくはベンジルオキシカルボニル基が有していてもよい置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、および炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基からなる群より選ばれる原子もしくは基を挙げることができる。置換基の数は、１乃至５個であることが好ましく、１個であることが特に好ましい。
【００４６】
（４）の保護アミンは、一般的には、ジアミン化合物（５）に、Ａに対応する酸ハライド、もしくはＡに対応する酸無水物を反応させることによって得ることができる。Ａに対応する酸ハライド、もしくはＡに対応する酸無水物としては、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ（ＯＢｔ）基、スクシンイミジルオキシ（ＯＳｕ）基、３−チアゾリジン−２−チオン基等を脱離基として有する反応試薬であることが好ましい。このような試薬としては、３−ベンジルオキシカルボニル−１，３−チアゾリジン−２−チオンを用いることが特に好ましい。上記反応試薬に対して、ジアミン（５）を過剰量加えることが好ましく、その割合は、３乃至１０倍モルの範囲にあることが特に好ましい。
【００４７】
反応は、有機塩基もしくは無機塩基を用いて行なってもよい。有機塩基としては、ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等を挙げることができる。無機塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等を挙げることができる。塩基の添加量の割合は、酸ハライド等の反応試薬に対して、０．１倍乃至大過剰モルの範囲にあることが好ましく、１乃至１０倍モルの範囲にあることが特に好ましい。
【００４８】
反応は、溶媒中にて実施することが好ましいが、無溶媒で実施することもできる。溶媒としては、原料もしくは生成物の全部あるいは一部を溶解することができ、かつ、反応に実質的に不活性の溶媒であれば何れの溶媒であってもよい。具体的には、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、エチレングリコール等）、アミド類（例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等）、ニトリル類（例えば、アセトニトリル、ｎ−ブチロニトリル）、エーテル類（例えば、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等）、ジメチルスルホキシド、スルホランおよび水を挙げることができる。これらの溶媒を二種類以上混合して用いてもよい。反応は、冷却下でも加熱下でも行うことができるが、その温度は、−５０乃至１５０℃の範囲にあることが好ましく、−１０乃至１００℃の範囲にあることがさらに好ましく、０乃至５０℃の範囲にあることが特に好ましい。
【００４９】
（３）の化合物：Ａ−ＮＨ−Ｒ−ＮＨＣＯ−Ｑ−Ｅは、（４）の保護アミン化合物と、ＭＯ₂Ｃ−Ｑ−Ｅ、あるいはＭ¹ＯＣ−Ｑ−Ｅとを縮合させることによって製造することができる（反応＜ａ＞）。Ｍは、水素原子、アルカリ金属原子（ナトリウム原子、カリウム原子等）、あるいは窒素原子に結合手を有するイミド基を表す。窒素原子に結合手を有するイミド基としては、スクシンイミド基、フタルイミド基、グルタルイミド基等を挙げることができる。Ｍ¹は、活性基を表し、ハロゲン原子、−ＳＯ₂Ｃｌ基、あるいは後述する縮合剤との反応中間体の該当する基であることが好ましい。
【００５０】
反応＜ａ＞は、アミノ基とカルボン酸基との縮合反応である。縮合反応は、Larock R.C.,Comprehensive Organic Transformations(VCH,New York,1989,972-976)に記載されている方法により行うことができる。縮合反応は、縮合剤を用いて行うことが好ましい。縮合剤としては、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等を用いることが好ましい。反応は、溶媒の存在下で行うことが好ましい。溶媒としては、原料もしくは生成物の全部あるいは一部を溶解することができ、かつ、反応に実質的に不活性の溶媒であれば何れの溶媒であってもよい。具体的には、前述の反応＜ａ＞で示した有機溶媒に加え、ハロゲン系溶媒（ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等）、およびエステル類（酢酸エステル等）を挙げることができる。これらの有機溶媒を混合して用いてもよく、水、あるいは水とこれらの有機溶媒との混合溶媒も好ましく用いることができる。この反応では、（４）の化合物に対して、例えば、（６）のカルボン酸を過剰量加えることが好ましく、その割合は１乃至２倍モルの範囲にあることが好ましい。また、（４）の化合物に対しては、Ｍ¹ＯＣ−Ｑ−Ｅの化合物を、過剰量加えることが好ましく、その割合は、１乃至３倍モルの範囲にあることが好ましい。
【００５１】
縮合剤として、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等を用いる場合には、更に、酸性の添加剤もしくは塩基性の添加剤を用いることができる。酸性の添加剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドキシベンゾトリアゾール、もしくは３，４−ジヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジンを用いることが好ましい。塩基性の添加剤としては、第三アミン、例えば、トリエチルアミン、ピリジン、もしくは４−ジメチルアミノピリジンを用いることが好ましい。添加剤の添加量は、縮合剤に対して、０．１倍乃至大過剰モルの範囲にあることが好ましく、１乃至３倍モルの範囲にあることが特に好ましい。反応は、冷却下でも加熱下でも行うことができるが、その温度は、−５０乃至１５０℃の範囲にあることが好ましく、−１０乃至１００℃の範囲にあることがさらに好ましく、０乃至５０℃の範囲にあることが特に好ましい。
【００５２】
反応＜ｂ＞は、アミノ基の脱保護反応である。保護基Ａにより脱保護の条件を決定する。一般的には、Protective Groups in Organic Synthesisに記載されている条件を用いることができる。その中でも、ヨードトリメチルシランを用いる方法が特に好ましい。この反応は、溶媒中にて実施することが好ましいが、無溶媒で実施することもできる。溶媒としては、原料もしくは生成物の全部あるいは一部を溶解することができ、かつ、反応に実質的に不活性の溶媒であれば何れの溶媒であってもよい。具体的には、ハロゲン系溶媒（例えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン等）、ニトリル類（例えば、アセトニトリル、ｎ−ブチロニトリル等）、エーテル類（テトラヒドロフラン、ジオキサン等）、芳香族系溶媒（トルエン、ベンゼン等）、およびこれらの混合溶媒を挙げることができる。この反応では、（３）の化合物に対してヨードトリメチルシランを過剰量加えることが好ましく、その割合は１乃至１０倍モルの範囲にあることが好ましい。反応は、冷却下でも加熱下でも行うことができるが、その温度は、−５０乃至１５０℃の範囲にあることが好ましく、−１０乃至１００℃の範囲にあることがさらに好ましく、０乃至５０℃の範囲にあることが特に好ましい。
【００５３】
反応＜ｃ＞は、コア部分に相当するナフタレンジイミド構造（７）に、（２）の化合物を側鎖として脱水縮合させ、（１）の化合物を得る反応である。コア部分に相当するナフタレンジイミドの原料としては、一般的に、１，４，５，８−ナフタレン四カルボン酸二無水物を用いることが好ましい。反応は、原料もしくは生成物の全部あるいは一部を溶解することができ、かつ、反応に実質的に不活性の溶媒であることを条件に、前述の反応＜ａ＞、＜ｂ＞および＜ｃ＞で示した有機溶媒あるいはこれらの混合溶媒を用いることができる。反応では、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物に対して、（２）の化合物を２当量以上加えることが好ましい。使用する溶媒によっては、（２）の化合物の量は２当量以下であってもよい。反応は、冷却下でも加熱下でも行うことが、０℃乃至使用溶媒の沸点の温度範囲にて行なうことが特に好ましい。
【００５４】
次に、本発明の縫い込み型インターカレータを用いてＤＮＡ断片試料などの核酸断片試料（ポリヌクレオチド試料あるいはオリゴヌクレオチド試料）を検出する方法について説明する。
【００５５】
本発明の核酸断片試料の検出方法は、下記の工程を含む。
（１）電極表面にヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体であるプローブ分子を固定した電気化学分析素子に、核酸断片試料が溶解もしくは分散している水性液を、前記記載の本発明の縫い込み型インターカレータの存在下に接触させて、プローブ分子に対して相補性を有する核酸断片試料とを結合させ、二本鎖複合体を形成させると共に、該複合体に縫い込み型インターカレータを挿入させる工程を実施する。ここで、電気化学分析素子とは、基板表面に区画された、導電性を付与された一つまたは複数の領域のそれぞれにプローブがその一端で固定された構造を代表とする分析素子をいう。そして、（２）電気化学分析素子の導電性部分、好ましくは電極に電位を印加し、分析素子の電極と対極との間を、縫い込み型インターカレータを介して流れる電流量を測定する工程を実施する。なお、（１）の工程において、先にプローブ分子と核酸断片試料との複合体を形成し、ついで縫い込み型インターカレータに接触させて、複合体にインターカレータを挿入することもできる。
【００５６】
基板表面上に区画された一つまたは複数の領域とは、導電性を持たない基板上に配置された領域をいう。領域が複数個である場合には、それらは互いに接しないように、かつ規則的に配置されていることが好ましい。基板表面に区画された一つまたは複数の領域は、プローブ分子の固定および導電性の付与のため、その表面が予め処理されている。金、炭素、グラシーカーボン等で処理されていることが好ましく、金で蒸着処理されていることが特に好ましい。基板表面上に区画された一つまたは複数の領域には、金、炭素等で表面処理をする前に、電荷を有する親水性の高分子物質等からなる層や架橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設けることによって、表面処理後の領域の凹凸を軽減することができる。従って、基板表面に区画された、導電性を付与された一つまたは複数の領域とは、表面処理がなされた導電性を有する領域である。
【００５７】
基板としては、電気絶縁性の疎水性担体、あるいは電気絶縁性の低親水性の担体であることが好ましい。また、その表面が凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用いることができる。基板の材質としては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質などを挙げることができる。多孔質物質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にあることが好ましく、２乃至５００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。基板の材質は、上記記載の各種ポリマー、ガラスもしくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるものである。基板の厚さは、特に限定されないが、板状である場合には、１００乃至１００００μｍの範囲にあることが好ましい。
【００５８】
導電性を有する一つまたは複数の領域が備えられた基板としては、文献（Sosnowski,R.G. et al.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,1119-1123(1997))に記載のシリコンチップのような、基板表面に電極を一つまたは複数配置したものも好ましく用いることができる。電極としては、金属、合金、金属酸化物、半導体等を挙げることができる。電極の他には、導線であってもよく、プリント配線基板のように、電極や導線が基板上の印刷されてなるものであってもよい。
【００５９】
プローブ分子の固定方法としては、公知の方法を用いることができる。基板表面に区画された一つまたは複数の領域が金で蒸着処理されている場合には、オリゴヌクレオチドなどのプローブ分子の５’もしくは３’末端にメルカプト基を導入し、金とイオウとの配位結合を介して、オリゴヌクレオチドを当該領域に固定する。オリゴヌクレオチドにメルカプト基を導入する方法は、文献(M.Maeda et al., Chem.Lett.,1805~1808(1994)およびB.A.Connolly,Nucleic Acids Res.,13,4484(1985))に記載されている。基板表面に区画された一つまたは複数の領域がグラシーカーボンで塗布処理されている場合には、そのグラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、該領域にカルボン酸基が導入されるため、オリゴヌクレオチドは、アミド結合により該領域に固定される。実際の固定化方法については、文献(K.M.Millan et al.,Analytical Chemistry,65,2317~2323(1993))に詳細が記載されている。
【００６０】
プローブ分子とし用いるオリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドは、ＤＮＡ断片およびＲＮＡ断片、あるいは合成されたオリゴヌクレオチドおよび合成されたポリヌクレオチドの何れも用いることができる。本発明に従う検出方法では、基板上の領域に固定されるプローブ分子が塩基配列既知のオリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドであってもよく、あるいは検知対象の核酸断片試料がプローブ分子であってもよい。以下、基板上の領域に固定するプローブ分子が塩基配列が既知のオリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドである場合を例にして説明する。
【００６１】
プローブ分子として用いられるヌクレオチド誘導体もしくはその類縁体（例えば、ＰＮＡ）は、目的によって二通りに分けることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチドは、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデータベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する。ＰＣＲ法によって増幅しないものも好ましく使用することができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用することが好ましい。塩基配列の分析の場合には、４_n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用することが好ましい。プローブ分子の塩基配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列が決定されていることが好ましい。プローブ分子は、２乃至５０量体であることが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ましい。
【００６２】
プローブ分子の固定は、プローブ分子が溶解あるいは分散された水性液を基板上の領域に点着して行うことが好ましい。点着後、所定の温度（好ましくは、室温）でそのまま数時間放置するとプローブ分子の一端が基板上の領域に固定される。点着後、必要に応じてインキュベーションを行ってもよい。点着の条件は、使用する基板の種類、大きさ等によって異なる。点着は、マニュアル操作によっても行うことができるが、ＤＮＡチップ作製装置に装備されたスポッタ装置を用いて行うことも好ましい。即ち、基板表面に区画された複数の領域に、スポッタ装置を用いてプローブ分子の水性液をスポットすることも好ましい。
【００６３】
上記の工程によって作製された電気化学分析素子の寿命は、プローブ分子としてｃＤＮＡが固定されたｃＤＮＡ電気化学分析素子で数週間、合成オリゴヌクレオチドが固定されてなる電気化学分析素子ではさらに長期間である。これらの電気化学分析素子は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する、核酸断片試料とのハイブリダーゼーションである。
【００６４】
試料核酸断片としては、その配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用いることが好ましい。
試料核酸断片は、遺伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離することが好ましい。試料がゲノムならば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤血球を除く任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応によりｃＤＮＡとすることが好ましい。一回のハイブリダイゼーションに必要なｍＲＮＡ量としては、測定条件によって異なるが、数μｇ以下を用いることが好ましい。電気化学分析素子上のプローブ分子がオリゴヌクレオチドである場合には、核酸断片試料は低分子化しておくことが望ましい。
【００６５】
ハイブリダイゼーションは、核酸断片試料が溶解あるいは分散した水性液を、電気化学分析素子上に点着することによって通常実施する。ハイブリダイゼーションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして０．５乃至２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、蒸留水、緩衝液、またはそれらと界面活性剤との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の核酸断片試料を除去することが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。
【００６６】
ハイブリダイゼーションは、本発明の縫い込み型インターカレータの存在下にて行なうことができる。本発明の酸化還元活性を有する縫い込み型インターカレータは、一般的に、電気化学分析素子上のプローブ分子と核酸断片試料とで形成されるハイブリッドＤＮＡ（電気化学分析素子上のプローブ分子およびハイブリダイゼーションに供される核酸断片試料の種類を問わず、形成される二本鎖核酸断片を「ハイブリッドＤＮＡ」と呼ぶ）に高い特異性で結合するため、電極に電位を印加することにより、電極と対極との間で、インターカレータを介して流れる電流量を測定することによって、相補性を有する核酸断片試料を検出することができる。本発明のインターカレータを用いて核酸断片試料の検知操作を行なう場合には、印加する電位は１００乃至４００ｍＶの範囲にあることが好ましく、２００乃至４００ｍＶの範囲にあることが特に好ましい。本発明のインターカレータが挿入されたハイブリッドＤＮＡは、一般的に、従来の代表的なインターカレータを用いた場合と異なり、印加した電位が上記の範囲にある場合に、ピーク電流値を示すからである。
【００６７】
本発明の縫い込み型インターカレータは、部分相補性を示す核酸断片試料を検出する方法にも使用することができる。部分相補性を示す核酸断片とは、プローブ分子Ａに対して相補性を有する核酸断片試料をＢとしたときに、核酸断片試料Ｂと塩基配列が部分的に同一性（即ち、部分的に非同一性）を示す核酸断片試料であって、通常、ミスマッチ試料との表現で表わされる。このような部分相補性を示す核酸断片試料としては、核酸断片試料Ｂに対して塩基欠損、塩基挿入等の塩基配列の変化を有する核酸断片試料を挙げることができる。部分相補性核酸断片の検出方法は、特に遺伝子診断分野での未知の異常遺伝子の探索・同定に重要な手法である。
【００６８】
本発明の縫い込み型インターカレータを用いて、部分相補性を示す核酸断片試料を検出する方法は、下記の工程を含む。
（１）基板表面に区画された一つまたは複数の領域のそれぞれにプローブ分子がその一端で固定されてなる電気化学分析素子に、部分相補性を示す核酸断片試料（ミスマッチ試料）が溶解あるいは分散していると推定される水性液を接触させ、本発明の縫い込み型インターカレータの存在下にて、分析素子に電位を印加することにより、該分析素子と対極との間をインターカレータを介して流れる電流量を測定する工程；
（２）電気化学分析素子に固定されているプローブ分子と完全な相補性を有する核酸断片試料（フルマッチ試料）を用いて（１）と同じ操作を行うことによって電流量を測定する工程；そして、
（３）工程（１）と工程（２）のそれぞれで測定された電流量を比較することによって、工程（１）で用いた核酸断片試料が、工程（２）で用いた相補性核酸断片に対して部分相補性の核酸断片（ミスマッチ試料）であるか否かを検出する工程である。
【００６９】
上記のミスマッチ試料の検出方法で使用するプローブ分子、電気化学分析素子、印加電位、および検出原理については、前記記載の相補性を有する核酸断片試料の検出方法の記載と同様である。本発明の検出方法では、電気化学分析素子上に固定されているプローブ分子が部分相補性核酸断片であっても、あるいは水性液中に含まれる核酸断片試料が部分相補性核酸断片試料であってもよい。
【００７０】
上記の工程（１）および工程（２）でそれぞれ得られる電流値間には有意な差を生じるため、部分相補性核酸断片とのハイブリッドＤＮＡ（ここでは、ミスマッチ構造のハイブリッドＤＮＡ）を容易に検出することができ、このことは、部分相補性核酸断片を容易に検出することができることを示す。
【００７１】
本発明の核酸断片試料の検出キットは、電気化学分析素子、および本発明の縫い込み型インターカレータとを組み合わせてなり、遺伝子分野等の研究に携わる使用者によって特に有効に使用される。
【００７２】
【実施例】
［製造例１］
Ｎ，Ｎ’−ビス（７−フェロセン酢酸アミド−４−メチル−４−アザヘプチル）ナフタレンジイミドの製造
【００７３】
【化１１】

【００７４】
（１）Ｎ−１−ベンジロキシカルボニル−１，７−ジアミノ−４−メチル−アザヘプタンの製造
ジ（３−アミノプロピル）−Ｎ−メチルアミン（７３．０ｇ、５００ミリモル）をジクロロメタン（４００ｍＬ）に溶解し、ここに、３−ベンジロキシカルボニル−１，３−チアゾリジン−２−チオン（Synthesis,1990,27）（１２．８ｇ、５０ミリモル）のジクロロメタン（１００ｍＬ）溶液を滴下し、室温にて３時間攪拌した。次いで、生成した沈殿を濾別し、濾液に酢酸エチルと水とを加えて、酢酸エチルで二度抽出した。酢酸エチル層を水および飽和食塩水で洗浄後、１規定塩酸水溶液で二度抽出し、得られた水層を酢酸エチルで洗浄した。水層を冷却しながら、ここに、６規定水酸化ナトリウム水溶液を加えて、ｐＨを９乃至１０に調整し、酢酸エチルにて抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、溶媒を留去し、標題化合物を黄色油状物として得た（９．４ｇ、収率６６％）。
【００７５】
¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ：
１．５８〜１．７２（４Ｈ，ｍ）
２．２０（３Ｈ，ｓ）
２．３５〜２．４５（４Ｈ，ｍ）
２．６４（２Ｈ，ｔ）
３．２３〜３．３２（２Ｈ，ｍ）
５．１５（２Ｈ，ｓ）
７．２２〜７．４５（５Ｈ，ｍ）
ＭＳ：ＦＡＢ ２８０（Ｍ⁺＋１）（マトリックス：ｍ−ニトロベンゼン）
【００７６】
（２）Ｎ−１−ベンジロキシカルボニル−１−アミノ−７−フェロセン酢酸アミド−４−メチル−４−アザヘプタンの製造
上記（１）で得られたＮ−１−ベンジロキシカルボニル−１，７−ジアミノ−４−メチル−アザヘプタン（３．０ｇ、１１ミリモル）をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解し、ここに、フェロセン酢酸（２．７ｇ、１１ミリモル）、ピリジン（２ｍＬ）およびエチルＮ，Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（２．３ｇ、１２ミリモル）を加え、室温で３時間攪拌した。反応溶液に、塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで二度抽出し、酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、溶媒を留去した。得られた褐色油状物をアルミナカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：クロロホルム／メタノール＝２０／１）に付し、得られた結晶をヘキサン−酢酸エチルの混合溶媒で洗浄し、標題化合物をオレンジ色の結晶として得た（２．６ｇ、収率９１％）。
【００７７】
¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ：
１．５０〜１．７２（４Ｈ，ｍ）
２．０８（３Ｈ，ｓ）
２．２０〜２．３３（４Ｈ，ｍ）
３．１５〜３．３０（４Ｈ，ｍ）
３．３４（２Ｈ，ｓ）
４．１５（５Ｈ，ｓ）
４．１６（４Ｈ，ｓ）
５．１５（２Ｈ，ｓ）
５．５４（１Ｈ，ｂｓ）
６．４４（１Ｈ，ｂｓ）
７．３２〜７．４８（５Ｈ，ｍ）
【００７８】
（３）１−アミノ−７−フェロセン酢酸アミド−４−メチル−４−アザヘプタンの製造
上記（２）で得られたＮ−１−ベンジロキシカルボニル−１−アミノ−７−フェロセン酢酸アミド−４−メチル−４−アザヘプタン（１．６ｇ、３．０ミリモル）をアセトニトリル（３０ｍＬ）に溶解し、室温で攪拌しながら、ここに、ヨウ化トリメチルシラン（１．２５ｍＬ、８．８ミリモル）を滴下した。５分後、反応溶液に１規定塩酸水溶液と酢酸エチルとを加え、１規定塩酸水溶液にて三度抽出し、水層を酢酸エチルで洗浄した。氷冷した水層に、２規定水酸化カリウム水溶液を加えてｐＨ１０とし、クロロホルムにて二度抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄後、溶媒を留去し、標題化合物を褐色結晶として得た（１．０ｇ、収率７０％）。
【００７９】
¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ：
１．４８〜１．６２（４Ｈ，ｍ）
２．０９（３Ｈ，ｓ）
２．２５〜２．３５（４Ｈ，ｍ）
２．７１（２Ｈ，ｔ）
３．２２〜３．３３（２Ｈ，ｍ）
３．３５（２Ｈ，ｓ）
４．１０〜４．２１（９Ｈ，ｍ）
６．７５（１Ｈ，ｂｓ）
【００８０】
（４）Ｎ，Ｎ’−ビス（７−フェロセン酢酸アミド−４−メチル−４−アザヘプチル）ナフタレンジイミドの製造
上記（３）で得られた１−アミノ−７−フェロセン酢酸アミド−４−メチル−４−アザヘプタン（０．９５ｇ、２．５ミリモル）をテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶解し、室温で攪拌しながら、ここに、１，４，５，８−テトラカルボン酸ナフタレン二無水物（０．３ｇ、１．１ミリモル）を加えたのち７時間環流した。反応溶液を濾過した後、クロロホルムにて洗浄し、合わせた有機層から溶媒を留去して得られた残渣をアルミナクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール＝１５：１）に付し、得られた結晶を酢酸エチルで洗浄し、標題化合物を褐色結晶として得た（０．３２ｇ、収率３０％）。
【００８１】
¹Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ：
１．５６〜１．７０（８Ｈ，ｍ）
１．７８〜１．９２（４Ｈ，ｍ）
２．１２（６Ｈ，ｓ）
２．３３〜２．４６（８Ｈ，ｍ）
３．３０〜３．４２（４Ｈ，ｍ）
３．３６（４Ｈ，ｓ）
４．１３（１０Ｈ，ｓ）
４．２０（８Ｈ，ｓ）
６．８５（２Ｈ，ｂｓ）
８．８０（４Ｈ，ｓ）
ＭＳ：ＦＡＢ ９７５（Ｍ＋Ｈ）（マトリックス：ｍ−ニトロベンゼン）
【００８２】
［実施例１］ハイブリッドＤＮＡの検出
（１）電気化学分析素子の作製
面積が２．２５ｍｍ²の金電極に、５’末端にメルカプトヘキシル基を有する１００ピコモル／１μＬのチミンの２０量体（ｄＴ₂₀）の水溶液（２μＬ）を滴下し、室温で１時間放置して電気化学分析素子を作製した。ｄＴ₂₀の調製、および固定化については、特開平９−２８８０８０号公報に記載の方法に従って行った。
（２）試料ＤＮＡ断片の調製
試料ＤＮＡ断片として、アデニンの２０量体（ｄＡ₂₀）を上記公報に記載の方法に従って調製した。
【００８３】
（３）ハイブリッドＤＮＡの検出
（１）で作製した電気化学分析素子の表面に、（２）で得たｄＡ₂₀（７０ピコモル）を含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）溶液の２μＬを滴下し、２５℃で２０分インキュベートした。インキュベート後、分析素子表面を０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）にて洗浄し、未反応のｄＡ₂₀を除去した。次いで、製造例１で得られた縫い込み型インターカレータ（５０μＭ）を含む０．１Ｍ塩化カリウム−０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）の混合溶液中に、洗浄後の分析素子を浸積し、デファレンシャルパルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）を、パルス振幅５０ｍＶ、パルス幅５０ｍＳ、印加電圧１００乃至７００ｍＶの範囲およびスキャン速度１００ｍＶ／秒の条件にて測定した。応答電位２６０ｍＶにおける電流量を求めた。また、試料ＤＮＡ断片ｄＡ₂₀を滴下しない以外は上記と同様の操作を行って得られた電流量を基本値とし、上記測定によって得られた電流量の基本値からの変化量（％）を求めたところ、３６％であった。
【００８４】
［比較例１］
縫い込み型インターカレータとして、前記特開平９−２８８０８０号公報に記載されている公知の代表的なインターカレータを用い、応答電位４６０ｍＶにおける電流量を求める以外は実施例１と同様にして、電流量の変化量を求めたところ、３８％であった。
【００８５】
実施例１および比較例１の結果より、本発明の縫い込み型インターカレータを使用した場合には、従来の代表的な縫い込み型インターカレータと使用した場合に比べて、約２００ｍＶ低い電圧において、ほぼ同等の応答電流を得ることができることが分かる。また、試料ＤＮＡ断片とのハイブリッドＤＮＡの検出において、本発明の縫い込み型インターカレータを使用した場合に示す応答電流の変化率は、公知の縫い込み型インターカレータと使用した場合に示す応答電流の変化率とほぼ同じであることが分かる。
【００８６】
［実施例２］ミスマッチ構造のハイブリッドＤＮＡの検出
（１）電気化学分析素子の作製
ｄＴ₁₉Ｇ₁を用いる以外は、実施例１の（１）と同様にして、電気化学分析素子を作製した。
（２）ミスマッチ構造のハイブリッドＤＮＡの検出
電気化学分析素子として、実施例１の（１）で作製した電気化学分析素子、および上記（１）の分析素子をそれぞれ用いる以外は実施例１と同様の操作を行って、印加電圧２００乃至４００ｍＶの範囲でＤＰＶを測定し、２６０ｍＶでの電流量の変化率を求めたところ、それぞれ、３６％、２０％であった。
【００８７】
実施例２の結果から、ｄＴ₁₉Ｇ₁を固定して作製された電気化学分析素子に、試料ＤＮＡ断片ｄ₂₀Ａを接触させて得られるハイブリッドＤＮＡは、ミスマッチ構造のハイブリッドＤＮＡであり、本発明の新規縫い込み型インターカレータを用いて、２６０ｍＶという低電圧の印加によって、フルマッチ構造のハイブリッドＤＮＡとミスマッチ構造のハイブリッドＤＮＡとの応答電流の差を求めることができることが分かる。
【００８８】
従って、電気化学分析素子上のプローブ分子と、このプローブ分子と完全な相補性を有する塩基配列（フルマッチ）を持つＤＮＡ断片試料とで形成されるハイブリッドＤＮＡの応答電流の値が予め明らかとなっている場合に、本発明の新規縫い込み型インターカレータの使用および２６０ｍＶの印加電圧の条件下において、試料ＤＮＡ断片が、電気化学分析素子上のＤＮＡ断片と完全な相補性を有する塩基配列を持つものであることが容易に確認できることがわかる。
【００８９】
【発明の効果】
本発明の酸化還元活性を持つ縫い込み型インターカレータは、新規な導電性縫い込み型インターカレータであって、一般に、入手容易な試薬より簡便に合成することができるものである。核酸断片試料の検出において、本発明のインターカレータを用いた場合、従来の代表的なインターカレータを用いた場合より、低い印加電位にてピーク電流値を与えるため、本発明のインターカレータを使用することによって、電気化学分析素子の再利用回数を増加させ、検出精度や再現性を向上させることもできる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to sewing that is electrochemically active when electrochemically detecting a polynucleotide sample or an oligonucleotide sample such as a nucleic acid fragment complementary to a probe molecule such as a nucleotide derivative or its analog immobilized on a substrate. The present invention relates to a compound that can be advantageously used as a built-in intercalator.
[0002]
[Prior art]
Southern hybridization is a typical method for detecting nucleic acid having a specific sequence in gene expression monitoring, nucleic acid sequence determination, gene mutation analysis, gene polymorphism analysis, etc. in the fields of biology and medicine. The hybridization method is used. Conventionally known methods such as the Southern hybridization method usually use RI (radiolabel) as a label. However, in the Southern hybridization method, a method using fluorescence instead of RI is also known.
[0003]
In recent years, a detection tool (generally called a DNA chip or a DNA array) in which a polynucleotide sample or oligonucleotide sample such as a DNA fragment is immobilized on a substrate surface with a nucleotide derivative complementary to the DNA fragment or an analog thereof. ), And using its complementarity, a technique for analyzing the base sequence and the like after being immobilized on a substrate by hybridization has been developed and used for the purpose of determining the base sequence of genes, etc. . In this detection method using a DNA chip (or DNA array), a means for detecting a DNA fragment immobilized on a substrate by hybridization with a fluorescent label attached to the DNA fragment is used. Although the method using fluorescence as a labeling means has a drawback that it is difficult to introduce a fluorescent substance of a certain level or more as a label due to internal quenching of fluorescence, a DNA fragment sample with an extremely small amount of attomole level It is said that this method is effective in that it can be analyzed.
[0004]
On the other hand, Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-288080 discloses a method using a conductive substance as a labeling means. According to this method, a nucleotide derivative probe molecule such as a nucleic acid fragment is electrostatically immobilized on the electrode surface, and a DNA fragment sample that is complementary to the nucleotide derivative is represented by the following formula having redox activity. When a conductive threaded intercalator labeled with ferrocenecarboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester is contacted, a complex such as a helical structure is formed by hybridization between the probe molecule and the DNA fragment sample. Since a conductive intercalator is inserted inside the body, when a potential is applied to the electrode, a current flows between the counter electrode provided separately and the electrode via the conductive intercalator. Can detect the formation of a complex such as a hybrid helical structure.
[0005]
[Formula 4]

[0006]
The above conductive threaded intercalator has a naphthalene diimide cyclic group as a core (central core portion), has a chain-like linker portion at both ends thereof, and a redox activity at the tip portion of the linker portion. A conductive ferrocene molecule having a conjugated system is attached.
[0007]
In the detection of sample DNA fragments that are complementary to the probe molecules on the electrode, the amount of current obtained by applying a potential to the electrode varies slightly depending on conditions such as the salt concentration of the probe molecule, DNA fragment sample, and measurement buffer. However, when the above-described conductive threaded intercalator is used, the amount of current flowing shows a peak value when a potential in the range of about 450 to about 620 mV is applied. Is applied by applying a potential higher than about 450 mV.
[0008]
Since about 450 to about 620 mV of the potential range in which the peak current is generated is a relatively high value, the manufacture of a measuring device that applies such a potential to the electrode is disadvantageous in terms of manufacturing cost. In addition, probe molecules immobilized on the electrode surface in a relatively weak binding state such as electrostatic bonding are easily detached from the electrode surface when a high potential is applied, so that the detection sensitivity and accuracy of the DNA fragment sample to be detected are detected. This is a problem. In particular, when an electrode having a probe molecule is repeatedly used for the same operation after the DNA fragment sample and the intercalator once bound are removed, the detection sensitivity and the detection accuracy are likely to decrease.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention uses a DNA chip in which a nucleotide derivative or its analog is immobilized on the surface of an electrode, and electrochemically converts a polynucleotide sample such as a DNA fragment sample or an oligonucleotide sample using a conductive threaded intercalator. In carrying out the detection operation, the main object is to provide a compound useful as a conductive threaded intercalator that enables detection operation with high detection sensitivity and detection accuracy even by using a relatively low potential. Let it be an issue.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present invention resides in a compound represented by the following formula (1).
[0011]
[Chemical formula 5]

[0012]
[However,R is an alkylene-imino-alkylene group, Q is an alkylene group, E is an optionally substituted ferrocenyl group, Z and Z ¹ Are each a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.]
[0013]
  In the above formula (1),Two E, two Q, and two R in the formulaAre preferably the same groups..
[0014]
  The imino contained in R is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an acyl group having 2 to 4 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, and an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms. And may be substituted with a group selected from the group consisting of aralkyl groups having 7 to 23 carbon atoms. The imino contained in R is preferably substituted with a methyl group. Q is preferably an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms..
[0015]
  E is preferably a ferrocenyl group or a ferrocenyl group having a substituent selected from the group consisting of the following (F1) to (F3).
[0016]
[Chemical 6]

[0020]
  The present invention also provides,in frontNotation (1)soThere are also stitched intercalators having redox activity consisting of the compounds represented. This threaded intercalator is advantageously used in electrochemical analysis methods, particularly for the analysis of oligonucleotide samples or polynucleotide samples.
[0021]
The threaded intercalator of the present invention is particularly advantageously used in the following electrochemical analysis method for analysis of oligonucleotide samples or polynucleotide samples.
(1) A probe molecule comprising a group of nucleotide derivatives or analogs thereof provided on the surface of an electrode substrate, and an oligonucleotide sample or polynucleotide sample complementary to the probe molecule and stitched with an aqueous medium A step of hybridizing in the presence of an intercalator to form a complex such as a helical structure of the probe molecule and an oligonucleotide sample or a polynucleotide sample into which the stitched intercalator is inserted, and the electrode An oligonucleotide sample or polynucleotide sample analysis method comprising a step of applying a potential to a substrate and detecting a current generated thereby.
[0022]
(2) A probe molecule comprising a group of nucleotide derivatives or its analogs provided on the surface of the electrode substrate, and an oligonucleotide sample or polynucleotide sample complementary to the probe molecule in the presence of an aqueous medium Hybridization and then contact with a threaded intercalator to form a complex such as a helical structure of the probe molecule and oligonucleotide sample or polynucleotide sample into which the threaded intercalator is inserted A method for analyzing an oligonucleotide sample or a polynucleotide sample, comprising a step and a step of applying a potential to the electrode substrate and detecting a current generated thereby.
[0023]
In the above analysis method, when the sewing intercalator of the present invention is used, a relatively low potential within the range of 100 to 400 mV can be used as the potential applied to the electrode substrate.
[0024]
The stitched intercalator of the present invention can also be used as an analysis kit in combination with an electrode substrate provided with a group of nucleotide derivatives or probe molecules composed of analogs thereof. Representative examples of the nucleotide derivatives or analogs thereof include oligonucleotides, polynucleotides, or peptide nucleic acids.
[0025]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The inventor of the present invention believes that a high potential required in the electrochemical detection operation of a DNA fragment sample using a known conductive threaded intercalator has a conductive ferrocene having redox activity and a conjugated system. It is estimated that the conjugated system of conductive groups such as molecules forms a conjugated system that extends to π-bonded systems such as amide bonds, which is related to the decrease in the mobile electron density in the conductive groups. In addition, with the expectation that the potential reduction required in the detection operation can be realized by not extending the conjugated system of the conductive group to the linker portion, a compound having such a chemical structure was synthesized, When the compound was used as a conductive threaded intercalator and an electrochemical detection operation was performed on a DNA fragment sample, current detection was possible at the expected low voltage (low voltage). I became.
The present invention has been completed based on the above novel findings.
[0026]
In the present invention, a compound that is advantageously used as a conductive threaded intercalator is a compound represented by the following formula (1).
[0027]
[Chemical 7]
E_a-L_a-XL_b-E_b   -(1)
[0028]
In the present invention, a compound that is particularly advantageously used as the conductive threaded intercalator is a compound represented by the following formula (2).
[0029]
[Chemical 8]
E_a-L_1a-L_2a-XL_2b-L_1b-E_b   -(2)
[0030]
In Formula (1) and Formula (2), X represents a divalent cyclic group which may have a substituent. The divalent cyclic group is preferably a planar cyclic group, a naphthalene diimide group having a bond on two nitrogen atoms, 2-position and 6-position, or 1-position and 5-position (preferably 2-position). Anthracene group having a bond at the same position as the anthracene group, a fluorene group having a bond at the 2nd and 6th positions, and a bond at the 2nd and 6th positions. It is preferably a cyclic group selected from the group consisting of a biphenylene group having, a phenanthrene group having a bond at the 2-position and the 7-position, and a pyrene group having a bond at the 2-position and the 7-position, and two nitrogen atoms Particularly preferred is a naphthalene diimide group having a bond in The substituent is preferably a hydrogen atom, a halogen atom (F, Cl, Br, etc.), or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, but is preferably a hydrogen atom. The alkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferably a methyl group, an ethyl group, or an n-propyl group.
[0031]
In the formula (1), L_aAnd L_bAre independent of each other_aAnd E_bA linking group that does not form a conjugated system in which the conjugated system is extended, and at least one of the linking groups is converted into a linking group having a site that imparts water solubility to the compound or a site that imparts water solubility. It is a linking group having a possible site. Here, the “site that can be converted to a site that imparts water solubility” is converted to a sulfate site when it comes into contact with an acid such as sulfuric acid, such as an imino group having a methyl group as a substituent. , Having a site that changes to show water solubility. Of course, the “site that imparts water solubility to the present compound” may have a charged moiety such as a salt moiety.
[0032]
L_aAnd L_bAre independent of each other, E_aAnd E_bThe hydrocarbon group which may have a substituent on the side adjacent to (L in the above formula (2)_1aAnd L_1bOn the other hand, a linking group containing an element other than a carbon element on the side adjacent to X (L in the above formula (2))._2aAnd L_2bA linking group consisting of a group corresponding to Therefore, L_aAnd L_bRespectively, -L in the formula (2)_1a-L_2a-And -L_2b-L_1bA linking group corresponding to-is desirable. Where L_1aAnd L_1bAre preferably independently an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms which may have a substituent or an alkenylene group having 2 to 6 carbon atoms which may have a substituent. On the other hand, L_2aAnd L_2bIs preferably a linking group containing N, O, or S, independently of each other.
[0033]
L_1aAnd L_1bAs the substituents, there are a hydroxyl group, a halogen atom, a carboxyl group, an amino group, a cyano group, a nitro group, a formyl group, a formylamino group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Alkylamino group, halogenated alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, cycloalkylamino group having 5 to 7 carbon atoms, dialkylamino group having 2 to 12 carbon atoms, 6 to 12 carbon atoms An aryl group, an aralkyl group having 7 to 18 carbon atoms having an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aralkylamino group having 7 to 18 carbon atoms having an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and the number of carbon atoms An alkanoyl group having 2 to 7 carbon atoms, an alkanoylamino group having 2 to 7 carbon atoms, an N-alkanoyl-N-alkylamino group having 3 to 10 carbon atoms, an As a noncarbonyl group, an alkoxycarbonyl group having 2 to 7 carbon atoms, a heterocyclic group having 2 to 10 carbon atoms containing 1 to 4 heteroatoms selected from the group consisting of S, N and O, and a substituent. It consists of an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, or an aryl group having 6 to 12 ring carbon atoms which may have 1 to 5 halogen atoms. An atom or group selected from the group. The number of substituents is preferably 1 to 12 and particularly preferably 1 to 3 for an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms. The alkenylene group having 2 to 6 carbon atoms is preferably 1 to 10 and particularly preferably 1 to 3.
[0034]
L_2aAnd L_2bAnd independently of one another, each may have a substituent, an amide bond group, an ester bond group, an ether bond group, a thioether bond group, a diimide bond group, a thiodiimide bond group, a thioamide bond group, an imino bond group , A linking group containing one or more groups selected from the group consisting of a carbonyl bond group, a thiocarbonyl bond group and a 1,4-piperazinyl group, particularly preferably an amide group (-NHCO- group, or -CONH- group).
[0035]
L_2aAnd L_2bExamples of the substituent include: an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an acyl group having 2 to 4 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, and an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms. It may be substituted with a group selected from the group consisting of aralkyl groups having 7 to 23 carbon atoms. The alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is preferably a methyl group or an ethyl group, and particularly preferably a methyl group. The acyl group having 2 to 4 carbon atoms is preferably an acetyl group. The aryl group having 6 to 20 carbon atoms is preferably a phenyl group or a naphthyl group, and particularly preferably a phenyl group. The aralkyl group having 7 to 23 carbon atoms and having an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is preferably a benzyl group.
[0036]
L_2aAnd L_2bWhen is an imino linking group, the substituent is particularly preferably a methyl group. Therefore, L_2aAnd L_2bAre each independently more preferably an N-methyl-di (n-propylenyl) imino group or a 1,4-di (n-propylenyl) -piperazinyl group, and N-methyl-di (n-propylenyl) imino. Particularly preferred is a group.
[0037]
E_aAnd E_bIs a group having redox activity, thereby imparting conductivity, and independently of each other, may have a substituent, metallocene having one or more bonds, 2,2′-bipyridine A complex, a cyclobutadiene complex, a cyclopentadienyl complex, a 1,10-phenanthroline complex, a triphenylphosphine complex, a catecholamine, a viologen, or the like is preferable. Ferrocene having one bond which may have a substituent is particularly preferable. E_aAnd E_bAre preferably the same groups. Next, specific examples of ferrocene having a substituent are shown. The position of the substituent may be any position of the cyclopentadienyl group.
[0038]
[Chemical 9]

[0039]
The compound that can be advantageously used as the stitched intercalator of the present invention is, for example, easily produced by a production method according to a known method (Japanese Patent Laid-Open No. 9-288080) using a known diamine compound as a raw material. Can do.
[0040]
In addition, the compound of the present invention can be produced at a low cost and in a high yield by a synthetic route represented by the following formula using a known diamine compound as a starting material.
[0041]
[Chemical Formula 10]

[0042]
The synthetic route consists of reactions <a>, <b>, and <c>. Two or more kinds of known diamine compounds may be used to condense different linker moieties with respect to the naphthalenediimide structure (core). In this synthesis route, a typical production method will be shown.
[0043]
Hereinafter, each reaction will be described.
[0044]
Compound (4) of the above synthetic route: A-NH-R-NH₂Is a method according to a known method (Green TW, Wuts. PGM, Protective Groups in Organic Synthesis (2nd Edition, Wiley, New York, 1991, 315-345, 349-358) from a known diamine represented by (5). Can be synthesized.
[0045]
A is a group selected from the group consisting of an acyl group having 2 to 5 carbon atoms, an alkoxycarbonyl group having 2 to 5 carbon atoms, and a benzoyl group or benzyloxycarbonyl group which may have a substituent. It is preferable that it is an acetyl group, a t-butylcarbonyl group (pivaloyl group), a t-butoxycarbonyl group, or a benzyloxycarbonyl group which may have a substituent. Examples of the substituent that the benzoyl group or benzyloxycarbonyl group may have include a halogen atom, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms. The atom or group chosen from more can be mentioned. The number of substituents is preferably 1 to 5, and particularly preferably 1.
[0046]
The protected amine of (4) can be generally obtained by reacting the diamine compound (5) with an acid halide corresponding to A or an acid anhydride corresponding to A. Examples of the acid halide corresponding to A or the acid anhydride corresponding to A include benzotriazol-1-yl-oxy (OBt) group, succinimidyloxy (OSu) group, 3-thiazolidine-2-thione group, etc. It is preferable that it is a reaction reagent which has as a leaving group. As such a reagent, it is particularly preferable to use 3-benzyloxycarbonyl-1,3-thiazolidine-2-thione. It is preferable to add an excessive amount of diamine (5) to the reaction reagent, and the ratio is particularly preferably in the range of 3 to 10 times mol.
[0047]
The reaction may be performed using an organic base or an inorganic base. Examples of the organic base include pyridine, triethylamine, diisopropylethylamine and the like. Examples of the inorganic base include sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, sodium carbonate, potassium carbonate and the like. The ratio of the addition amount of the base is preferably in the range of 0.1 to large molar excess, particularly preferably in the range of 1 to 10 molar, with respect to the reaction reagent such as acid halide.
[0048]
The reaction is preferably carried out in a solvent, but can also be carried out without solvent. The solvent may be any solvent as long as it can dissolve all or part of the raw material or product and is substantially inert to the reaction. Specifically, alcohols (eg, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, ethylene glycol, etc.), amides (eg, dimethylformamide, dimethylacetamide, acetamide, N-methylpyrrolidone, etc.), nitriles (eg, acetonitrile, n -Butyronitrile), ethers (for example, ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monoethyl ether, tetrahydrofuran, dioxane, etc.), dimethyl sulfoxide, sulfolane and water. Two or more of these solvents may be mixed and used. The reaction can be carried out under cooling or under heating, but the temperature is preferably in the range of −50 to 150 ° C., more preferably in the range of −10 to 100 ° C., and 0 to 50 ° C. It is especially preferable that it is in the range.
[0049]
Compound (3): A-NH-R-NHCO-Q-E is a compound of (4) protected amine compound, MO₂CQE or M¹It can be produced by condensing OC-Q-E (reaction <a>). M represents a hydrogen atom, an alkali metal atom (sodium atom, potassium atom, etc.), or an imide group having a bond to a nitrogen atom. Examples of the imide group having a bond at the nitrogen atom include a succinimide group, a phthalimide group, and a glutarimide group. M¹Represents an active group, a halogen atom, -SO₂A Cl group or a group corresponding to a reaction intermediate with a condensing agent described later is preferable.
[0050]
Reaction <a> is a condensation reaction between an amino group and a carboxylic acid group. The condensation reaction can be carried out by the method described in Larock R.C., Comprehensive Organic Transformations (VCH, New York, 1989, 972-976). The condensation reaction is preferably performed using a condensing agent. As the condensing agent, it is preferable to use 1,3-dicyclohexylcarbodiimide, 1-ethyl-3- (3'-dimethylaminopropyl) carbodiimide, or the like. The reaction is preferably performed in the presence of a solvent. The solvent may be any solvent as long as it can dissolve all or part of the raw material or product and is substantially inert to the reaction. Specific examples include halogen solvents (dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane and the like), and esters (acetic acid esters and the like) in addition to the organic solvent shown in the above reaction <a>. These organic solvents may be mixed and used, and water or a mixed solvent of water and these organic solvents can also be preferably used. In this reaction, for example, an excessive amount of the carboxylic acid (6) is preferably added to the compound (4), and the ratio is preferably in the range of 1 to 2 moles. In addition, for the compound of (4), M¹It is preferable to add an excessive amount of the OC-Q-E compound, and the ratio is preferably in the range of 1 to 3 moles.
[0051]
When 1,3-dicyclohexylcarbodiimide, 1-ethyl-3- (3′-dimethylaminopropyl) carbodiimide or the like is used as the condensing agent, an acidic additive or a basic additive can be further used. . As the acidic additive, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxybenzotriazole, or 3,4-dihydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine is preferably used. As basic additives, tertiary amines such as triethylamine, pyridine, or 4-dimethylaminopyridine are preferably used. The addition amount of the additive is preferably in the range of 0.1 times to large excess moles, and particularly preferably in the range of 1 to 3 times moles with respect to the condensing agent. The reaction can be carried out under cooling or under heating, but the temperature is preferably in the range of −50 to 150 ° C., more preferably in the range of −10 to 100 ° C., and 0 to 50 ° C. It is especially preferable that it is in the range.
[0052]
Reaction <b> is an amino group deprotection reaction. The deprotection conditions are determined by the protecting group A. In general, the conditions described in Protective Groups in Organic Synthesis can be used. Among these, the method using iodotrimethylsilane is particularly preferable. This reaction is preferably carried out in a solvent, but can also be carried out without a solvent. The solvent may be any solvent as long as it can dissolve all or part of the raw material or product and is substantially inert to the reaction. Specifically, halogen solvents (eg, dichloromethane, dichloroethane, etc.), nitriles (eg, acetonitrile, n-butyronitrile, etc.), ethers (tetrahydrofuran, dioxane, etc.), aromatic solvents (toluene, benzene, etc.), And a mixed solvent thereof. In this reaction, it is preferable to add an excess amount of iodotrimethylsilane to the compound (3), and the ratio is preferably in the range of 1 to 10 times mol. The reaction can be carried out under cooling or under heating, but the temperature is preferably in the range of −50 to 150 ° C., more preferably in the range of −10 to 100 ° C., and 0 to 50 ° C. It is especially preferable that it is in the range.
[0053]
Reaction <c> is a reaction in which the naphthalenediimide structure (7) corresponding to the core portion is subjected to dehydration condensation using the compound (2) as a side chain to obtain the compound (1). In general, 1,4,5,8-naphthalene tetracarboxylic dianhydride is preferably used as a raw material of naphthalene diimide corresponding to the core portion. The reaction can dissolve all or part of the raw material or product, and is a solvent substantially inert to the reaction, provided that the above-described reactions <a>, <b> and <c The organic solvent indicated by> or a mixed solvent thereof can be used. In the reaction, it is preferable to add 2 equivalents or more of the compound (2) to 1,4,5,8-naphthalenetetracarboxylic dianhydride. Depending on the solvent used, the amount of the compound (2) may be 2 equivalents or less. The reaction is preferably carried out under cooling or heating, particularly preferably in the temperature range from 0 ° C. to the boiling point of the solvent used.
[0054]
Next, a method for detecting a nucleic acid fragment sample (polynucleotide sample or oligonucleotide sample) such as a DNA fragment sample using the threaded intercalator of the present invention will be described.
[0055]
The method for detecting a nucleic acid fragment sample of the present invention includes the following steps.
(1) An aqueous liquid in which a nucleic acid fragment sample is dissolved or dispersed in an electrochemical analysis element having a nucleotide derivative or its analog probe molecule immobilized on the electrode surface is used as the above-described stitched intercalator of the present invention. To form a double-stranded complex and to insert a threaded intercalator into the complex, by contacting with a nucleic acid fragment sample complementary to the probe molecule. To do. Here, the electrochemical analysis element refers to an analysis element represented by a structure in which a probe is fixed at one end of each of one or a plurality of regions provided with conductivity, which are partitioned on the surface of a substrate. And (2) applying a potential to the conductive portion of the electrochemical analysis element, preferably the electrode, and measuring the amount of current flowing between the electrode of the analytical element and the counter electrode via the stitched intercalator. carry out. In the step (1), the intercalator can be inserted into the complex by first forming a complex of the probe molecule and the nucleic acid fragment sample, and then bringing the complex into contact with the sewing intercalator.
[0056]
One or a plurality of regions partitioned on the surface of the substrate refers to a region disposed on the substrate having no conductivity. When there are a plurality of regions, it is preferable that they are arranged regularly so as not to contact each other. One or a plurality of regions defined on the surface of the substrate is pretreated for fixing probe molecules and imparting conductivity. It is preferably treated with gold, carbon, glassy carbon or the like, and particularly preferably deposited with gold. One or more regions partitioned on the substrate surface are provided with a layer made of a hydrophilic high-molecular substance having a charge or a layer made of a crosslinking agent before the surface treatment with gold, carbon, or the like. Also good. By providing such a layer, unevenness in the region after the surface treatment can be reduced. Accordingly, the one or more regions provided with conductivity, which are partitioned on the surface of the substrate, are regions having conductivity subjected to surface treatment.
[0057]
The substrate is preferably an electrically insulating hydrophobic carrier or an electrically insulating low hydrophilic carrier. Moreover, even if the surface has an unevenness | corrugation and a low planarity, it can use preferably. Materials of the substrate include glass, cement, ceramics such as ceramics or new ceramics, polyethylene terephthalate, cellulose acetate, bisphenol A polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate and other polymers, silicon, activated carbon, porous glass, porous ceramics, Examples thereof include porous materials such as porous silicon, porous activated carbon, woven and knitted fabric, nonwoven fabric, filter paper, short fiber, and membrane filter. The pore size of the porous material is preferably in the range of 2 to 1000 nm, and particularly preferably in the range of 2 to 500 nm. The material of the substrate is particularly preferably the above-mentioned various polymers, glass or silicon. This is due to the ease of surface treatment and the ease of analysis by electrochemical methods. The thickness of the substrate is not particularly limited, but when it is plate-shaped, it is preferably in the range of 100 to 10,000 μm.
[0058]
As a substrate provided with one or a plurality of regions having conductivity, silicon described in the literature (Sosnowski, RG et al .: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1119-1123 (1997)) is used. Those having one or more electrodes arranged on the substrate surface, such as a chip, can also be preferably used. Examples of the electrode include metals, alloys, metal oxides, and semiconductors. In addition to the electrodes, conductive wires may be used, and electrodes and conductive wires may be printed on the substrate like a printed wiring board.
[0059]
As a method for fixing the probe molecule, a known method can be used. When one or a plurality of regions partitioned on the substrate surface are vapor-deposited with gold, a mercapto group is introduced at the 5 ′ or 3 ′ end of a probe molecule such as an oligonucleotide to distribute gold and sulfur. The oligonucleotide is immobilized on the region via a coordinate bond. Methods for introducing mercapto groups into oligonucleotides are described in the literature (M. Maeda et al., Chem. Lett., 1805-1808 (1994) and BAConnolly, Nucleic Acids Res., 13,4484 (1985)). ing. When one or a plurality of regions partitioned on the substrate surface are coated with glassy carbon, carboxylic acid groups are introduced into the regions by oxidizing the glassy carbon with potassium permanganate. Therefore, the oligonucleotide is fixed to the region by an amide bond. The actual immobilization method is described in detail in the literature (K.M. Millan et al., Analytical Chemistry, 65, 2317-2323 (1993)).
[0060]
As the oligonucleotide or polynucleotide used as the probe molecule, any of a DNA fragment and an RNA fragment, a synthesized oligonucleotide and a synthesized polynucleotide can be used. In the detection method according to the present invention, the probe molecule immobilized on the region on the substrate may be an oligonucleotide or polynucleotide having a known base sequence, or the nucleic acid fragment sample to be detected may be a probe molecule. Hereinafter, the case where the probe molecule immobilized on the region on the substrate is an oligonucleotide or polynucleotide having a known base sequence will be described as an example.
[0061]
Nucleotide derivatives or their analogs (eg, PNA) used as probe molecules can be divided into two types depending on the purpose. In order to examine gene expression, it is preferable to use cDNA, a part of cDNA, or a polynucleotide such as EST. The functions of these polynucleotides may be unknown, but they are generally amplified by PCR using a cDNA library, genomic library or whole genome as a template based on sequences registered in a database. To prepare. Those not amplified by the PCR method can also be preferably used. In order to examine gene mutations and polymorphisms, it is preferable to synthesize various oligonucleotides corresponding to mutations and polymorphisms based on known standard sequences and use them. 4 for base sequence analysis_nIt is preferable to use a synthesized oligonucleotide (n is the length of the base). The base sequence of the probe molecule is preferably determined in advance by a general base sequence determination method. The probe molecule is preferably a 2 to 50 mer, particularly preferably a 10 to 25 mer.
[0062]
The probe molecules are preferably immobilized by spotting an aqueous liquid in which the probe molecules are dissolved or dispersed in a region on the substrate. After spotting, if the sample is left for several hours at a predetermined temperature (preferably room temperature), one end of the probe molecule is fixed to the region on the substrate. After spotting, incubation may be performed as necessary. The conditions for spotting vary depending on the type and size of the substrate used. Although spotting can be performed by manual operation, it is also preferable to perform spotting using a spotter device provided in the DNA chip manufacturing apparatus. That is, it is also preferable to spot an aqueous solution of probe molecules on a plurality of regions partitioned on the substrate surface using a spotter device.
[0063]
The lifetime of the electrochemical analysis element produced by the above process is several weeks for a cDNA electrochemical analysis element in which cDNA is immobilized as a probe molecule, and is longer for an electrochemical analysis element in which a synthetic oligonucleotide is immobilized. . These electrochemical analysis elements are used for gene expression monitoring, nucleotide sequence determination, mutation analysis, polymorphism analysis, and the like. The detection principle is hybridization with a nucleic acid fragment sample, which will be described later.
[0064]
As the sample nucleic acid fragment, it is preferable to use a DNA fragment sample or an RNA fragment sample whose sequence and function are unknown.
The sample nucleic acid fragment is preferably isolated from a eukaryotic cell or tissue sample for the purpose of examining gene expression. If the sample is a genome, it is preferably isolated from any tissue sample except red blood cells. Arbitrary tissues other than red blood cells are preferably peripheral blood lymphocytes, skin, hair, semen and the like. If the sample is mRNA, it is preferably extracted from a tissue sample in which the mRNA is expressed. The mRNA is preferably converted to cDNA by reverse transcription reaction. The amount of mRNA required for one hybridization depends on the measurement conditions, but it is preferable to use several μg or less. When the probe molecule on the electrochemical analysis element is an oligonucleotide, it is desirable that the nucleic acid fragment sample has a low molecular weight.
[0065]
Hybridization is usually performed by spotting an aqueous solution in which a nucleic acid fragment sample is dissolved or dispersed on an electrochemical analysis element. Hybridization is preferably carried out in the temperature range of room temperature to 70 ° C. and in the range of 0.5 to 20 hours. After completion of hybridization, it is preferable to remove unreacted nucleic acid fragment samples by washing with distilled water, buffer solution, or a mixed solution of them with a surfactant. As the surfactant, sodium dodecyl sulfate (SDS) is preferably used. As the buffer solution, a citrate buffer solution, a phosphate buffer solution, a borate buffer solution, a Tris buffer solution, a Good buffer solution, and the like can be used, and it is particularly preferable to use a citrate buffer solution.
[0066]
Hybridization can be performed in the presence of the threaded intercalator of the present invention. The threaded intercalator having redox activity according to the present invention is generally a hybrid DNA formed by a probe molecule on an electrochemical analysis element and a nucleic acid fragment sample (probe molecules and hybridization on the electrochemical analysis element). Regardless of the type of nucleic acid fragment sample to be used, the formed double-stranded nucleic acid fragment is referred to as “hybrid DNA” with high specificity. By measuring the amount of current flowing through the intercalator, a nucleic acid fragment sample having complementarity can be detected. When the nucleic acid fragment sample is detected using the intercalator of the present invention, the applied potential is preferably in the range of 100 to 400 mV, and particularly preferably in the range of 200 to 400 mV. The hybrid DNA into which the intercalator of the present invention is inserted generally shows a peak current value when the applied potential is in the above range, unlike the case of using a conventional typical intercalator. is there.
[0067]
The threaded intercalator of the present invention can also be used in a method for detecting a nucleic acid fragment sample exhibiting partial complementarity. A nucleic acid fragment exhibiting partial complementarity means that when a nucleic acid fragment sample having complementarity to the probe molecule A is B, the nucleotide sequence is partially identical to the nucleic acid fragment sample B (that is, partially non-specific) Nucleic acid fragment sample exhibiting (identity), and is usually expressed in terms of a mismatched sample. Examples of the nucleic acid fragment sample exhibiting such partial complementarity include a nucleic acid fragment sample having a base sequence change such as base deletion or base insertion relative to the nucleic acid fragment sample B. The method for detecting a partially complementary nucleic acid fragment is an important technique for searching and identifying an unknown abnormal gene, particularly in the field of genetic diagnosis.
[0068]
The method for detecting a nucleic acid fragment sample exhibiting partial complementarity using the stitched intercalator of the present invention includes the following steps.
(1) A nucleic acid fragment sample (mismatch sample) showing partial complementarity is dissolved or dispersed in an electrochemical analysis element in which a probe molecule is fixed at one end of each of one or a plurality of regions partitioned on the substrate surface. An aqueous liquid that is presumed to be in contact, and by applying a potential to the analytical element in the presence of the stitched intercalator of the present invention, the intercalator is interposed between the analytical element and the counter electrode. Measuring the amount of flowing current;
(2) a step of measuring the amount of current by performing the same operation as in (1) using a nucleic acid fragment sample (full match sample) having complete complementarity with the probe molecule fixed to the electrochemical analysis element; and
(3) By comparing the amount of current measured in each of steps (1) and (2), the nucleic acid fragment sample used in step (1) becomes the complementary nucleic acid fragment used in step (2). This is a step of detecting whether or not the nucleic acid fragment is partially complementary (mismatch sample).
[0069]
The probe molecule, electrochemical analysis element, applied potential, and detection principle used in the mismatch sample detection method are the same as those described in the method for detecting a complementary nucleic acid fragment sample. In the detection method of the present invention, even if the probe molecule immobilized on the electrochemical analysis element is a partially complementary nucleic acid fragment, or the nucleic acid fragment sample contained in the aqueous solution is a partially complementary nucleic acid fragment sample. Also good.
[0070]
Since a significant difference is generated between the current values obtained in the above steps (1) and (2), hybrid DNA with a partially complementary nucleic acid fragment (here, hybrid DNA having a mismatch structure) can be easily detected. This indicates that a partially complementary nucleic acid fragment can be easily detected.
[0071]
The nucleic acid fragment sample detection kit of the present invention is combined with the electrochemical analysis element and the threaded intercalator of the present invention, and is used particularly effectively by a user engaged in research in the genetic field or the like.
[0072]
【Example】
[Production Example 1]
Preparation of N, N'-bis (7-ferroceneacetamide-4-methyl-4-azaheptyl) naphthalenediimide
[0073]
Embedded image

[0074]
(1) Production of N-1-benzyloxycarbonyl-1,7-diamino-4-methyl-azaheptane
Di (3-aminopropyl) -N-methylamine (73.0 g, 500 mmol) was dissolved in dichloromethane (400 mL), where 3-benzyloxycarbonyl-1,3-thiazolidine-2-thione (Synthesis, 1990, 27) (12.8 g, 50 mmol) in dichloromethane (100 mL) was added dropwise and stirred at room temperature for 3 hours. Next, the produced precipitate was separated by filtration, ethyl acetate and water were added to the filtrate, and the mixture was extracted twice with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with water and saturated brine, extracted twice with 1N aqueous hydrochloric acid, and the resulting aqueous layer was washed with ethyl acetate. While cooling the aqueous layer, a 6N aqueous sodium hydroxide solution was added thereto to adjust the pH to 9 to 10, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was evaporated to give the title compound as a yellow oil (9.4 g, yield 66%).
[0075]
¹H-NMR (300 MHz, CDCl_Three) Δ:
1.58 to 1.72 (4H, m)
2.20 (3H, s)
2.35 to 2.45 (4H, m)
2.64 (2H, t)
3.23 to 3.32 (2H, m)
5.15 (2H, s)
7.22 to 7.45 (5H, m)
MS: FAB 280 (M⁺+1) (Matrix: m-nitrobenzene)
[0076]
(2) Production of N-1-benzyloxycarbonyl-1-amino-7-ferroceneacetamide-4-methyl-4-azaheptane
N-1-Benzyloxycarbonyl-1,7-diamino-4-methyl-azaheptane (3.0 g, 11 mmol) obtained in (1) above was dissolved in dichloromethane (30 mL), and ferroceneacetic acid ( 2.7 g, 11 mmol), pyridine (2 mL) and ethyl N, N′-dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride (2.3 g, 12 mmol) were added and stirred at room temperature for 3 hours. To the reaction solution was added an aqueous ammonium chloride solution, and the mixture was extracted twice with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with saturated brine, and the solvent was evaporated. The obtained brown oil was subjected to alumina column chromatography (elution solvent: chloroform / methanol = 20/1), and the obtained crystals were washed with a mixed solvent of hexane-ethyl acetate to give the title compound as orange crystals. (2.6 g, yield 91%).
[0077]
¹H-NMR (300 MHz, CDCl_Three) Δ:
1.50 to 1.72 (4H, m)
2.08 (3H, s)
2.20 to 2.33 (4H, m)
3.15-3.30 (4H, m)
3.34 (2H, s)
4.15 (5H, s)
4.16 (4H, s)
5.15 (2H, s)
5.54 (1H, bs)
6.44 (1H, bs)
7.32-7.48 (5H, m)
[0078]
(3) Production of 1-amino-7-ferroceneacetamide-4-methyl-4-azaheptane
N-1-benzyloxycarbonyl-1-amino-7-ferroceneacetamide-4-methyl-4-azaheptane (1.6 g, 3.0 mmol) obtained in (2) above was dissolved in acetonitrile (30 mL). Then, trimethylsilane iodide (1.25 mL, 8.8 mmol) was added dropwise thereto while stirring at room temperature. After 5 minutes, 1N aqueous hydrochloric acid and ethyl acetate were added to the reaction solution, and the mixture was extracted three times with 1N aqueous hydrochloric acid, and the aqueous layer was washed with ethyl acetate. A 2N aqueous potassium hydroxide solution was added to the ice-cooled aqueous layer to adjust the pH to 10, followed by extraction twice with chloroform. The organic layer was washed with saturated brine, and the solvent was evaporated to give the title compound as brown crystals (1.0 g, yield 70%).
[0079]
¹H-NMR (300 MHz, CDCl_Three) Δ:
1.48 to 1.62 (4H, m)
2.09 (3H, s)
2.25 to 2.35 (4H, m)
2.71 (2H, t)
3.22 to 3.33 (2H, m)
3.35 (2H, s)
4.10 to 4.21 (9H, m)
6.75 (1H, bs)
[0080]
(4) Production of N, N'-bis (7-ferroceneacetamide-4-methyl-4-azaheptyl) naphthalenediimide
1-Amino-7-ferroceneacetamide-4-methyl-4-azaheptane (0.95 g, 2.5 mmol) obtained in (3) above was dissolved in tetrahydrofuran (50 mL) and stirred at room temperature. To this was added 1,4,5,8-tetracarboxylic acid naphthalene dianhydride (0.3 g, 1.1 mmol) and then refluxed for 7 hours. The reaction solution was filtered, washed with chloroform, the solvent was distilled off from the combined organic layers, and the resulting residue was subjected to alumina chromatography (elution solvent; chloroform: methanol = 15: 1) to obtain The crystals were washed with ethyl acetate to give the title compound as brown crystals (0.32 g, yield 30%).
[0081]
¹H-NMR (300 MHz, CDCl_Three) Δ:
1.56-1.70 (8H, m)
1.78 to 1.92 (4H, m)
2.12 (6H, s)
2.33-2.46 (8H, m)
3.30 to 3.42 (4H, m)
3.36 (4H, s)
4.13 (10H, s)
4.20 (8H, s)
6.85 (2H, bs)
8.80 (4H, s)
MS: FAB 975 (M + H) (matrix: m-nitrobenzene)
[0082]
[Example 1] Detection of hybrid DNA
(1) Production of electrochemical analysis element
Area 2.25mm²100 picomoles / 1 μL thymine 20-mer (dT) having a mercaptohexyl group at the 5 ′ end₂₀) Was added dropwise and allowed to stand at room temperature for 1 hour to produce an electrochemical analysis element. dT₂₀The preparation and immobilization were performed according to the method described in JP-A-9-288080.
(2) Preparation of sample DNA fragment
As a sample DNA fragment, adenine 20-mer (dA₂₀) Was prepared according to the method described in the above publication.
[0083]
(3) Detection of hybrid DNA
On the surface of the electrochemical analysis device prepared in (1), dA obtained in (2)₂₀2 μL of a 10 mM Tris buffer (pH 7.5) solution containing (70 pmol) was added dropwise and incubated at 25 ° C. for 20 minutes. After incubation, the analytical element surface was washed with 0.1 M sodium dihydrogen phosphate-disodium hydrogen phosphate aqueous solution (pH 7.0), and unreacted dA₂₀Was removed. Next, the washed analytical element is immersed in a mixed solution of 0.1 M potassium chloride-0.1 M acetate buffer (pH 5.6) containing the stitched intercalator (50 μM) obtained in Production Example 1. Differential pulse voltammetry (DPV) was measured under conditions of a pulse amplitude of 50 mV, a pulse width of 50 mS, an applied voltage range of 100 to 700 mV, and a scan speed of 100 mV / sec. The amount of current at a response potential of 260 mV was determined. Sample DNA fragment dA₂₀The amount of change (%) from the basic value of the amount of current obtained by the above measurement was determined to be 36% using the amount of current obtained by performing the same operation as above except that no dripping was performed. It was.
[0084]
[Comparative Example 1]
As the stitching type intercalator, a known representative intercalator described in JP-A-9-288080 is used, and the current amount is obtained in the same manner as in Example 1 except that the current amount at a response potential of 460 mV is obtained. The amount of change was determined to be 38%.
[0085]
From the results of Example 1 and Comparative Example 1, when the stitched intercalator of the present invention was used, at a voltage about 200 mV lower than when used with a conventional typical stitched intercalator, It can be seen that an approximately equivalent response current can be obtained. In addition, in the detection of hybrid DNA with a sample DNA fragment, the rate of change of the response current shown when using the stitched intercalator of the present invention is the response current shown when using a known stitched intercalator. It can be seen that the rate of change is almost the same.
[0086]
[Example 2] Detection of mismatched hybrid DNA
(1) Production of electrochemical analysis element
dT₁₉G₁An electrochemical analysis element was produced in the same manner as (1) of Example 1 except that was used.
(2) Detection of mismatched hybrid DNA
The same operation as in Example 1 was carried out except that the electrochemical analysis element prepared in (1) of Example 1 and the analysis element of (1) above were used as the electrochemical analysis element, and the applied voltage was 200 to 400 mV. When the DPV was measured in the range of and the change rate of the current amount at 260 mV was determined, they were 36% and 20%, respectively.
[0087]
From the results of Example 2, dT₁₉G₁The sample DNA fragment d on the electrochemical analysis element produced by fixing₂₀A hybrid DNA obtained by contacting A is a hybrid DNA having a mismatch structure, and a hybrid DNA having a mismatch structure and a hybrid DNA having a mismatch structure are applied by applying a low voltage of 260 mV using the novel threading intercalator of the present invention. It can be seen that the difference in response current with DNA can be determined.
[0088]
Therefore, the value of the response current of the hybrid DNA formed by the probe molecule on the electrochemical analysis element and the DNA fragment sample having a base sequence (full match) having complete complementarity with this probe molecule becomes clear in advance. The sample DNA fragment has a base sequence having complete complementarity with the DNA fragment on the electrochemical analysis element under the conditions of use of the new threaded intercalator of the present invention and an applied voltage of 260 mV It can be seen that it can be easily confirmed.
[0089]
【The invention's effect】
The sewn intercalator having oxidation-reduction activity of the present invention is a novel conductive sewn intercalator, and can generally be synthesized simply from readily available reagents. When detecting the nucleic acid fragment sample, when the intercalator of the present invention is used, the peak current value is given at a lower applied potential than when a conventional representative intercalator is used. Therefore, the intercalator of the present invention is used. As a result, the number of times the electrochemical analysis element is reused can be increased, and the detection accuracy and reproducibility can be improved.

Claims (15)

Compound represented by the following formula (1):

[ Wherein R is an alkylene-imino-alkylene group, Q is an alkylene group, E is a ferrocenyl group which may have a substituent, and Z and Z ¹ are a hydrogen atom and a halogen atom, respectively. Alternatively, it is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. ] The compound according to claim 1 , wherein two E, two Q, and two R in the formula are each the same group. The imino contained in R is an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an acyl group having 2 to 4 carbon atoms, an aryl group having 6 to 20 carbon atoms, and an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms. The compound according to claim 1, which is substituted with a group selected from the group consisting of aralkyl groups having 7 to 23 carbon atoms . The compound according to claim 3, wherein the imino contained in R is substituted with a methyl group . The compound according to claim 1, wherein Q is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms . The compound according to claim 1, wherein E is a ferrocenyl group . The compound according to claim 1 , wherein E is a ferrocenyl group having a substituent selected from the group consisting of the following (F1) to (F3) .

The compound according to claim 1 , wherein Z and Z ¹ are each a hydrogen atom . Sewing type intercalator having redox activity represented by the following formula (1):

[Wherein R is an alkylene-imino-alkylene group, Q is an alkylene group, E is a ferrocenyl group which may have a substituent, and Z and Z ¹ Are each a hydrogen atom, a halogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. ] The threaded intercalator according to claim 9, which is used in an electrochemical analysis method for analyzing an oligonucleotide sample or a polynucleotide sample . The probe molecule comprising a group of nucleotide derivatives or analogs thereof provided on the surface of the electrode substrate, and an oligonucleotide sample or polynucleotide sample in a complementary relationship with the probe molecule, and an aqueous medium, Hybridizing in the presence of a threaded intercalator to form a complex of the probe molecule and an oligonucleotide sample or polynucleotide sample into which the threaded intercalator has been inserted, and the electrode substrate A method for analyzing an oligonucleotide sample or a polynucleotide sample, comprising a step of applying a potential and detecting a current generated thereby . A probe molecule comprising a group of nucleotide derivatives or its analogs provided on the surface of an electrode substrate is hybridized with an oligonucleotide sample or polynucleotide sample in a complementary relationship with the probe molecule in the presence of an aqueous medium. Then, a step of forming a complex of the probe molecule and the oligonucleotide sample or the polynucleotide sample into which the threaded intercalator is inserted by contacting the threaded intercalator according to claim 9; A method for analyzing an oligonucleotide sample or a polynucleotide sample, comprising a step of applying a potential to the electrode substrate and detecting a current generated thereby . The analysis method according to claim 11 or 12, wherein the potential applied to the electrode substrate is a potential within a range of 100 to 400 mV . An analysis kit for analyzing an oligonucleotide sample or a polynucleotide sample comprising an electrode substrate provided with a probe molecule comprising a group of nucleotide derivatives or analogs thereof, and the threaded intercalator according to claim 9 . The analysis kit according to claim 14, wherein the nucleotide derivative or an analog thereof is an oligonucleotide, a polynucleotide, or a peptide nucleic acid .