JP4303097B2 - 基質制御膜を導入した固定化酵素膜 - Google Patents

Description

本発明は、臨床、食品、生化学的研究分野などにおいて広範囲に利用できる固定化酵素膜に関するものである。

従来型の固定化酵素膜は、試料側相、酵素固定化相、下地電極側相から構成されている。試料側相は、目的分子を通過させ、それより大きな分子量の化合物類を通過させない性質を持つ。酵素固定化相は、目的分子と酵素反応させる酵素が固定化された相である。下地電極（酸素電極、過酸化水素電極、アンモニア電極類）側相は、酵素反応後の生成分子、たとえば酸素、過酸化水素、アンモニアなどを通過させ、酵素反応前の基質分子類を通過させない性質を持つ。固定化酵素膜は通常、この３相の組み合わせからなり、３枚以上の膜を接着（一体化）させたり、それぞれ２相を一体化させて残りの膜を重ね合わせた本質的には１〜２枚程度の膜という形で利用される。

上記したような従来型の固定化酵素膜では、妨害物質の影響を少なくするために下地電極側相薄膜の孔径を小さくする必要がある。そのため、酵素反応による生成物（実際に電極で測定対象となる酵素反応後の分子）も下地電極に移動しにくくなり、生成物が電極と反応する量は、実際に酵素反応で得られた量よりも少なくなる。また、生成物の移動速度が制限されないように酵素固定化相の酵素量を減らしたときは、目的分子の量が多くなるに連れ酵素反応が飽和し、よって生成物自体の量も飽和してしまう。すなわち、酵素の量を増加させると下地電極側相の生成物移動速度が飽和し、逆に酵素の量を減少させると、今度は酵素固定化相の酵素反応が飽和し、直線性が頭打ちになる。このため従来型の固定化酵素膜では、定量測定可能な測定レンジを広げることが困難であった。

本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、固定化酵素膜自体の変更なしに、当該膜の直線性を向上させ、定量測定可能な測定レンジを拡大するための方法を提供することを目的とする。

このような本発明の目的は、固定化酵素膜の試料側相に、目的分子さえも通過させにくくする性質を付加すること、すなわち目的分子の量を制御（目的分子が固定化酵素相に進入する速度を目的分子の濃度に依存させるように調節）することによって達成された（試料側相は通常、上記したように、目的分子を通過させ、それ以上の分子量を持つ化合物類を通過させないという性質のみを有している）。

すなわち本発明は、試料側相に基質制御の性質を付加して基質制御膜とし、基質制御膜を固定化酵素膜に利用することにより、従来型では実現が難しかった直線性の延長、すなわち定量測定が可能な測定レンジを拡大することを可能にする。

固定化酵素膜に基質制御膜を組みこむことにより、測定対象となる基質の量を調節することが可能になる。このため、調節された基質の量が濃度に依存し、しかも酵素反応が飽和しにくくなるため、直線性を延ばし、定量測定可能な測定レンジを広げることができる。すなわち高濃度の試料も測定可能となる。

基質制御膜に用いる高分子化合物には、ポリカーボネートなどの機械的強度の高い膜を用いる。なお孔径が目的分子よりやや大きい程度になるように調節する。

基質制御膜は自製してもよいが、孔径0.05μｍの市販ポリカーボネート膜を元に孔径を調節し、目的物を得るのが、最も簡便である。

はじめに使用した原料および器材を記す（代表例）。

ポリカーボネート膜 ミリポア製 0.05μｍフィルター 型番VMTP04700

モノアセチルセルロース コダック製 型番117-3251

酢酸メチル 特級

その他に器材として、ガラス板、弗素樹脂シール、平型ピンセット、ビーカー、シャーレ、可変ピペット、ハトメ抜き（6mm、9mm）などを用いた。

作製法

1.φ86mmのシャーレ１枚およびφ60mmのシャーレ２枚用意する。φ60mmのシャーレの１枚には外側の底に小さく切った弗素樹脂シールを4カ所貼り付けておく。

2.φ60mmの弗素樹脂シールを貼ったシャーレの底にポリカーボネート膜の光沢のない面を上にしてのせ、そのままシャーレを裏返しφ8.6のシャーレの内側におく（φ86mmのシャーレの内側にφ60mmのシャーレが底を下向きにして入り、２枚のシャーレの底と底の間にポリカーボネート膜が挟まっている状態にする）。

3.酢酸メチル4mLをφ8.6のシャーレ内に入れ、２枚のシャーレの底と底の間に挟まっているポリカーボネート膜が一様に酢酸メチルに浸るようにし、５秒後にφ60mmの弗素樹脂シールを貼ったシャーレおよびポリカーボネート膜を取り出す。

4.余分な酢酸メチルを拭き取るため、３枚重ねの工業用ワイパーを２つ折りにしたものを酢酸メチルに浸ったポリカーボネート膜にかぶせ、弗素樹脂シールを貼っていないφ60mmのシャーレの底で５秒間押す。

註 余分な酢酸メチルを拭き取る作業は素早く行うこと。また、押す側のシャーレは真上にすっと持ち上げるように注意すること。

5.乾燥後、9mmのハトメ抜きでくり貫く。

註 9mmのハトメ抜きは、この先の実験に用いる過酸化水素電極プローブに合わせたもの。使用する機材によって、くり貫く大きさを替える必要がある。

6.モノアセチルセルロース100mgを酢酸メチル10mLに溶解する。

7.ガラス板に弗素樹脂シールを貼り、その上にモノアセチルセルロースの酢酸メチル溶液9μＬを滴下し、くり貫いておいたポリカーボネート膜の光沢のない面を上にして溶液の上にゆっくりとのせ、下面一面に溶液を延ばす。

註 その際、溶液が上面にまわり込まないように注意する。

8.余分なモノアセチルセルロースの酢酸メチル溶液を拭き取るために、３枚重ねの工業用ワイパーを２つ折りにしたものをかぶせ、弗素樹脂シールを貼っていないφ60mmのシャーレの底で５秒間押す。

註 余分な酢酸メチルを拭き取る作業は素早く行うこと。また、押す側のシャーレは真上にすっと持ち上げるように注意すること。

9.溶液が乾いたことを確認し、もう一度弗素樹脂シールを貼ったガラス板にモノアセチルセルロースの酢酸メチル溶液9μＬを滴下し、同様の操作を繰り返す。

註 モノアセチルセルロースの濃度や上記操作の繰り返し回数を調節することによって、目的分子の大きさに合わせて孔径を変えることができる。

10.この膜を6mmのハトメ抜きでくり貫き、基質制御膜として試料側相に利用する。

図１に示した構成の測定装置に実施例の基質制御膜を導入した固定化酵素膜を装着し、直線性、選択性の実験を行った。

使用試薬

測定用緩衝液（リン酸緩衝液） リン酸水素二ナトリウム 6.65g、リン酸二水素ナトリウム二水和物 2.48g、EDTA-2K 0.66g、安息香酸ナトリウム 1.00g、塩化ナトリウム 3.00g、を、純水１Ｌに溶解した。pH7.2。

測定用校正液１（グルコース濃度100mg/dL） α-D-グルコース 500mgを、測定用緩衝液500mLに溶解した。

測定用校正液２（グルコース濃度300mg/dL）α-D-グルコース 1.50gを、測定用緩衝液500mLに溶解した。

試料用緩衝液（リン酸緩衝液）α-D-グルコース 1.00gを、測定用緩衝液100mLに溶解し、1000mg/dLのα-D-グルコース溶液を調製した。その後、α-D-グルコース濃度が0、50、100、200、300、500、1000mg/dLになるように測定用緩衝液で希釈した。

基質制御膜を導入した固定化酵素膜の作製

図２に基質制御膜を導入した固定化酵素膜の構成を示す。

実験法

直線性

実施例の基質制御膜を組み込んだ固定化酵素膜および、基質制御膜を組み込んでいない固定化酵素膜を用い、測定用校正液および試料用緩衝液の電流値を測定した（n=3）。校正液の電流値から直線の補正式を求め、各試料の測定値を算出した
。

結果

直線性実験の結果を、表１および図３に示した。

表１

図３

上記のように、固定化酵素膜に基質制御膜を組みこむことにより、定量測定可能な測定レンジを広げることができる。すなわち高濃度の試料も測定可能となるため、同一構成の固定化酵素膜を、臨床、食品、生化学など、広い研究分野で利用することが可能になる。

本発明の酵素固定化法を用いた固定化酵素膜を使用する際に用いた測定装置の構成を示す図である。 本発明の基質制御膜を導入した固定化酵素膜の構成を示す図である。 実施例の基質制御膜を組み込んだ固定化酵素膜および、基質制御膜を組み込んでいない固定化酵素膜を用いて測定した結果を示すグラフである。

符号の説明

１・・・固定化酵素膜
２・・・下地電極（過酸化水素電極など）
３・・・測定用緩衝液、または測定用校正液、試料用緩衝液の流路
４・・・校正液または試料溶液の測定部位
５・・・外部電源
６・・・電流計
７・・・記録計
８・・・ゴム
９・・・接着剤または両面テープ
１０・・・基質制御膜
１１・・・固定化酵素膜
１２・・・薄膜
１３・・・電極保護膜

Claims (1)

1. アセチルセルロースを用いてポリカーボネートを主成分とする高分子化合物よりなる膜の孔径の調節を行うことによって測定対象とする基質の量を制御する役割を持たせた独立の膜であるところの基質制御膜が導入されていることを特徴とする固定化酵素膜。

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