JP4299549B2 - 活性酸素除去酵素及びその遺伝子 - Google Patents
活性酸素除去酵素及びその遺伝子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4299549B2 JP4299549B2 JP2003016777A JP2003016777A JP4299549B2 JP 4299549 B2 JP4299549 B2 JP 4299549B2 JP 2003016777 A JP2003016777 A JP 2003016777A JP 2003016777 A JP2003016777 A JP 2003016777A JP 4299549 B2 JP4299549 B2 JP 4299549B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- rrc
- jejuni
- activity
- rbr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、活性酸素除去活性を有する酵素（活性酸素除去酵素）及びその遺伝子ＤＮＡ、並びに、活性酸素除去活性を有する酵素の食品、医薬等への利用等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カンピロバクター・ジェジュニー（C. jejuni）は、グラム陰性でらせん状の形をした微好気性（microaerophile）細菌であり、呼吸のエネルギー生成過程において酸素を末端電子受容体として必要とするが、大気中の酸素分圧下では増殖しないという性質を有している。C. jejuniは他の好気性細菌や通性嫌気性細菌よりも活性酸素に対して敏感であり、このことが微好気的な環境でのみ活発に増殖する原因となっている。
【０００３】
好気的な条件下においては、自己酸化及び光増感反応による酸素の還元、ならびに酸化的な代謝により、活性酸素が発生する。反応性の高い活性酸素は、タンパク質に障害を与え、障害を受けたタンパク質は不活化及び分解される原因となっており、細胞の代謝に多大な影響を及ぼす可能性がある。このことから、微好気性細菌が活性酸素に対して高い感受性を示す一因として、微好気代謝において重要な役割を果たすタンパク質が存在し、これが活性酸素に対して敏感に反応して不活化又は分解するのではないかと考えられている（例えば、非特許文献１参照。）。このことから、C. jejuniにおいても、活性酸素に対して高い感受性を示すタンパク質が存在すると予想されている。
【０００４】
また、細菌の酸化ストレス防御タンパク質として、スーパーオキシドレダクターゼ活性を示すルブレドキシン・オキシドレダクターゼ（Ｒｂｏ；rubredoxin oxidoreductase）や、ＮＡＤＨペルオキシダーゼ活性を示すルブレリスリン（Ｒｂｒ；rubrerythrin）等が発見されている。具体的には、Desulfovibrio vulgaris（Hildenborough）のＲｂｏ（例えば、非特許文献２参照。）、Moorella thermoaceticaのＲｂｏ（例えば、非特許文献３参照。）、Clostridium acetobutylicumのＲｂｒ（例えば、非特許文献４参照。）、Porphyromonas gingivalisのＲｂｒ（例えば、非特許文献５参照。）、M. thermoaceticaのＲｂｒ（例えば、非特許文献６参照。）、D. vulgaris（Hildenborough）のＲｂｒ（例えば、非特許文献７参照。）、ウェルシュ菌（C. perfringens）のＲｂｒ（例えば、非特許文献８参照。）等が報告されている。このように酸化ストレス防御タンパク質であるＲｂｏやＲｂｒは多種の細菌から報告されているものの、C. jejuniにおいてはこれまで報告されていなかった。
【０００５】
その他、第一セリンプロテアーゼの第一ドメイン・ハーフに相当する第一ドメイン・ハーフと、第二セリンプロテアーゼの第二ドメイン・ハーフに相当する第二ドメイン・ハーフとの、βシート構造の２つのドメイン・ハーフ（ハーフ・サイド）を含むプロテアーゼ・ドメインを有する血液ホメオスタシスに有用なキメラセリンプロテアーゼがこれまでに報告されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１１−２３５１７３号公報
【非特許文献１】
Ann. Rev. Microbiol. 40, 107-30, 1986
【非特許文献２】
J. Bacteriol. 1989, 4996-5004, 1989
【非特許文献３】
J. Bacteriol. 183, 1560-1567, 2001
【非特許文献４】
J. Bacteriol. 183, 4823-4838, 2001
【非特許文献５】
Mol. Microbiol. 44, 479-488, 2002
【非特許文献６】
J. Bacteriol. 183, 1560-1567, 2001
【非特許文献７】
Biochemistry 30, 11118-11123, 1991
【非特許文献８】
J. Bacteriol. 178, 7152-7158, 1996
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、活性酸素を速やかに除去することが可能な活性酸素除去活性を有する酵素タンパク質（活性酸素除去酵素）及びこれをコードする遺伝子ＤＮＡ、さらにはこの活性酸素除去酵素を有効成分として含む機能性食品、医薬品及び化粧品等を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、C. jejuniに外因性及び内因性酸化ストレスを与えた際に著しく減少する２７ｋＤａのタンパク質が存在し、このタンパク質がＲｂｏと相同性を示すＮ末端の最初の３２残基と、Ｒｂｒと相同性を示すＣ末端の残りの１８３残基から構成されており、Ｒｂｏ領域にはＦｅＳ４クラスター鉄結合部位のＣ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１５−Ｃ−Ｃモチーフが存在し、Ｒｂｒ領域には非硫黄でオキソ架橋した二鉄結合部位のＥ−Ｘ３０−３４−Ｅ−Ｘ２−Ｈ−Ｘｎ−Ｅ−Ｘ３０−３４−Ｅ−Ｘ２−Ｈモチーフ、及びＦｅＳ４クラスター鉄結合部位のＣ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１２−Ｃ−Ｘ２−Ｃモチーフを有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするスーパーオキシドジズムターゼ活性を有する酵素（請求項１）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つスーパーオキシドジズムターゼ活性を有することを特徴とするスーパーオキシドジズムターゼ活性を有する酵素（請求項２）に関する。
【００１０】
また本発明は、配列番号１に示される塩基配列からなり、スーパーオキシドジズムターゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ（請求項３）や、配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下である６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理でハイブリダイズし、且つスーパーオキシドジズムターゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ（請求項４）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の活性酸素除去酵素としては、スーパーオキシドレダクターゼ活性及びＮＡＤＨペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ活性酸素除去活性を有するタンパク質や、異なる酸化還元酵素活性を有するキメラタンパク質であれば特に制限されるものではなく、ここで活性酸素除去酵素とは、活性酸素除去活性を有するタンパク質を意味し、上記活性酸素除去活性とは、酸素分子が１電子還元されることにより生じるスーパーオキシドアニオンラジカル（・Ｏ２ −）、酸素分子の２個の不対電子が対をなして一方の酸素原子のπ軌道に入り、他方の軌道が空になった一重項酸素（１Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）等の活性酸素を、除去・消去する活性のことをいう。
【００１３】
上記スーパーオキシドレダクターゼ活性及びＮＡＤＨペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質における、スーパーオキシドレダクターゼ活性とは、スーパーオキシドアニオンラジカルを消去する反応［ｅ−＋・Ｏ２ −＋２Ｈ＋→Ｈ２Ｏ２］を触媒する活性をいい、ＮＡＤＨペルオキシダーゼ活性とは、Ｈ２Ｏ２を消去する反応［還元型ＮＡＤ＋Ｈ２Ｏ２＋Ｈ＋→ＮＡＤ＋＋２Ｈ２Ｏ］を触媒する活性をいう。かかるスーパーオキシドレダクターゼ活性及びＮＡＤＨペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質としては、ルブレドキシン・オキシドレダクターゼのＮ末端側領域とルブレリスリンの全領域のキメラタンパク質、好ましくはＣ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１５−Ｃ−Ｃモチーフを有するルブレドキシン・オキシドレダクターゼのＮ末端側領域と、Ｅ−Ｘ３０−３４−Ｅ−Ｘ２−Ｈ−Ｘｎ−Ｅ−Ｘ３０−３４−Ｅ−Ｘ２−Ｈモチーフ及びＣ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１２−Ｃ−Ｘ２−Ｃモチーフを有するルブレリスリンの全領域のキメラタンパク質を例示することができる。ここで、ＣはＣｙｓを、ＥはＧｌｕを、ＨはＨｉｓを、Ｘｎは任意のアミノ酸がｎ個連結していることを表している。上記３種のモチーフを局在的に有するタンパク質は、例えば、ＢＬＡＳＴ検索プログラム、ＰＡＰＩＡシステムのタンパク質構造検索プログラム等を用いて、検索することができる。
【００１４】
上記配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、C. jejuni等のカンピロバクター属に属する微生物に由来し、Ｒｒｃ（rubredoxin oxidoreductase/rubrerythrin-like protein of C.jejuni）と称され、スーパーオキシドレダクターゼ活性を示すＲｂｏのＮ末端と相同性を示すＮ末端３２残基と、ＮＡＤＨペルオキシダーゼ活性を示すＲｂｒと相同性を示すＣ末端１８３残基とからなる、２７ｋＤａのタンパク質であり、ＲｒｃのＮ末端３２残基領域と相同性を示すＲｂｏは、スーパーオキシドレダクターゼ活性を示し、反応［還元型ルブレドキシン＋スーパーオキシド＋２Ｈ＋→ルブレドキシン＋Ｈ２Ｏ２］を触媒し、一方、ＲｒｃのＣ末端１８３残基領域と相同性を示すＲｂｒは、ＮＡＤＨペルオキシダーゼ活性を示し、反応［還元型ＮＡＤ＋Ｈ２Ｏ２＋Ｈ＋→ＮＡＤ＋＋２Ｈ２Ｏ］を触媒する。
【００１５】
これら触媒活性を合わせもつと、活性酸素であるスーパーオキシドはＲｂｏによってＨ２Ｏ２となり、さらにＨ２Ｏ２はＲｂｒによって最終的にＨ２Ｏまで分解されることがわかる。ＲｂｏとＲｂｒとのキメラ酵素であるＲｒｃは、Ｒｂｏ及びＲｂｒの両方の酵素反応を触媒することができるので、スーパーオキシドをＨ２Ｏ２、Ｈ２Ｏの順に分解し、活性酸素を速やかに除去させることができる。また、このＲｒｃと同様に活性酸素除去活性を有するＲｒｃの欠失、置換等の変異体も本発明の活性酸素除去酵素に含まれる。また、上記異なる酸化還元酵素活性を有するキメラタンパク質としては、酵素分類のＥＣ２群に属するオキシドリダクターゼ、例えば、デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ヒドロペルオキシダーゼ等から選ばれる２種以上の酸化還元酵素活性を有するキメラタンパク質を例示することができる。
【００１６】
本発明の融合タンパク質としては、上述の本発明の活性酸素除去酵素と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合したものであれば特に制限されず、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した活性酸素除去酵素の精製や、活性酸素除去酵素の検出や、活性酸素除去酵素に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００１７】
また、本発明のＤＮＡとしては、上述の本発明の活性酸素除去酵素をコードする遺伝子ＤＮＡや、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなり、活性酸素除去活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ活性酸素除去活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができ、このストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ活性酸素除去活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、C. jejuni等のカンピロバクター属に属する微生物に由来するｃＤＮＡライブラリーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ活性酸素除去活性を有するものを選択することにより、取得することができる。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとしては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。
【００１８】
本発明の発現ベクターとしては、上記本発明のＤＮＡを含み、上記本発明の活性酸素除去酵素を宿主細胞内で発現させることができる発現系を有するものであればどのようなものでもよく、かかる発現系としては、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００１９】
本発明の宿主細胞としては、上記本発明の発現ベクターを含むものであればどのようなものでもよく、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができる。宿主細胞への発現ベクターの導入は、多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング(scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。
【００２０】
前記本発明の活性酸素除去酵素及び本発明のＤＮＡは、例えば、与えられたアミノ酸配列や塩基配列の配列情報に基づき、化学合成的手法や遺伝子組換え手法により作製することができる。また、カンピロバクター・ジェジュニー（C. jejuni）、カンピロバクター・コリー（C. coli）、カンピロバクター・ヒオインテスティナリア（C.hyointestinalis）、カンピロバクター・フィタス（C. fetus）等のカンピロバクター属に属する微好気性微生物のｃＤＮＡライブラリーを検索し、選定されたＤＮＡの配列情報により調製することができる。その他、ルブレドキシン・オキシドレダクターゼのＮ末端側領域とルブレリスリンの全領域のキメラタンパク質は、プロティンエンジニアリング等により作製することができる。
【００２１】
本発明のＲｒｃ等の活性酸素除去酵素を食品又は食品素材中に配合することにより、食品又は食品素材自体の酸化を防止することができる上、かかる食品又は食品素材自体を抗酸化活性を有する機能性食品とすることができる。上記食品素材又は食品としては、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
また、本発明のＲｒｃ等の活性酸素除去酵素を有効成分として配合することにより医薬品とすることができる。かかる、医薬品は、活性酸素が引き起こす様々な疾病及び症状等に有効であり、具体的には、脳腫瘍、上顎癌、上咽頭癌、肺癌、食道癌、直腸癌、大腸癌、肝臓癌、胃癌、胆嚢癌、膵臓癌、皮膚癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病等の腫瘍や、ＨＩＶ感染等のウイルス感染症、リューマチ、線維症等の炎症性疾患や、アトピー性皮膚炎や化学物質過敏症等の炎症や、多量の酸素の存在と関連している中枢神経系、虚血、非血管性胃腸障害、眼性傷害や、動脈硬化、高血圧、老人性痴呆症等を挙げることができる。このような医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら医薬品は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００２３】
そしてまた、本発明のＲｒｃ等の活性酸素除去酵素を化粧水、パック、美容液、乳液、ファンデーション等に配合することにより、化粧品とすることができる。本発明の化粧品は、Ｒｒｃ等の活性酸素除去酵素を有効成分として含んでいるので、抗酸化作用を有し、例えばシミ、そばかす、シワ等の老化現象抑制効果や美白効果などを期待することができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（材料と方法）
［菌種及び増殖の条件］
C. jejuni菌株であるヒト臨床分離株クローン９１３１は、Dr. A. Kai（東京都立衛生研究所微生物部）から供与された。該菌株を、使用するまで２５％のグリセロール・ミュラー・ヒントン（ＭＨ）培地（Difco、Becton Dickinson Microbiology Systems社製）の中で−８０℃で保存した。C. jejuniを、BBL CampyPak Plusパケット（Becton Dickinson Microbiology Systems社製）を用いて、BBL GasPakジャーの中のＭＨ寒天上に３７℃で増殖させ、その後１８〜２４時間、ＭＨ培地で継代培養した。継代培養液のうち０．３ｍｌを、１００ｍｌ容量の発酵槽（MoBiTec社製）内の３０ｍｌの新鮮なＭＨ培地に接種し、５％のＯ２、１０％のＣＯ２及び８５％のＮ２からなる微好気条件下でインキュベーションした。２４時間のインキュベーションを行なった後、得られた培養液を、以下の実験のために使用した。また鉄低濃度培地及び鉄高濃度培地は、van Vliet et al.（J. Bacteriol. 180, 5291-5298, 1998）に記載されているように、デフェロキサミン・メシレート（Desferal、Sigma Chemical Co.社製）又は硫酸第二鉄をＭＨ培地に補充して調製し、これら培地でC. jejuniを培養し、２４時間後に培地からC. jejuniを収集し、全ＲＮＡ単離に使用した。
【００２５】
［Ｈ２Ｏ２ストレスアッセイ］
C. jejuni９１３１培養液に、最終濃度０ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ及び１．０ｍＭのＨ２Ｏ２（Wako Pure Chemical Industries社製）をそれぞれ添加した。ＣＦＵ（colony forming unit）を測定するために、培養液から所定量のC. jejuniを所定の時間間隔で収集し、よく冷えたＭＨ培地で洗浄し、その後、同量の培地に再び懸濁した。次に、細菌懸濁液を１０倍に階段希釈したものを調製した後、ＭＨ寒天に載せた。次に、粗抽出液を調製するため、C. jejuniを収集してよく冷えたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、その結果として得たペレットを−８０℃で保存した。全ＲＮＡ単離のため、C. jejuniを収集してよく冷えたＰＢＳで洗浄し、その結果として得たペレットを直ちに液体窒素で凍結し、その後、使用するまで−８０℃で保存した。
【００２６】
［電気泳動分析］
−８０℃で保存したC. jejuni９１３１を解凍し、１００ｍＭのＮａＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤（Complete、Mini、Roche Molecular Biochemicals社製）を含む５０ｍＭのTris-HCｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で再び懸濁した。ビーズ・ビーター・システム（beads beater system）（FastPrep system；Qiagen及びThermo Savant社製）を用いて細胞を破壊させ、粗抽出液を調製した。タンパク質（２０μｇ）を、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でスラブゲルを用いて分離させ、その後、クーマシーブリリアントブルーで染色した。Gel Documentation System（UVP, Inc.社製）のImageStore 7500 Ver.7.21を用いて、ゲル画像を得た。タンパク質の相対的な定量化のため、ＮＩＨイメージ１．６２ソフトウェアを使用し、染色したタンパク質の染色強度を、４５ｋＤａの主要外膜タンパク質（Major Outer Membrane Protein：ＭＯＭＰ）の染色強度と相対的に定量化した。
【００２７】
［２７ｋＤａタンパク質の局在性及びＮ末端アミノ酸配列］
破壊されていない細胞を除去するため、C. jejuni９１３１の粗製抽出液を、０．４５μｍの濾過膜（MillexR-HV、Millipore Corp.社製）を用いて濾過した。次に、４℃で５分間の遠心分離を１５,０００×ｇで行った後、膜タンパク質を含む細胞残渣画分を保存した。得られた上清をさらに６０分間、１００,０００×ｇで遠心分離し、その上清を細胞質画分として保存し、また、ペレットを粗膜画分として保存した。次に、分画したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ポリ二フッ化ビニリデン膜（Bio-Rad社製）に移した２７ｋＤａタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を、エドマン分解（TaKaRa Bio Inc.社委託）により決定した。決定したアミノ酸配列を、C. jejuniＮＣＴＣ１１１６８ゲノム配列ＢＬＡＳＴ検索プログラム（version 2.0、Sequencing Genomics Projects of C. jejuni、Sanger Institute 社製[http://www.sanger.ac.uk/Projects/C_jejuni]）で検索した。
【００２８】
［２７ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列］
ISOPLANTキット（Nippon Gene社製）を用いて、C. jejuniのゲノムＤＮＡを抽出した。２７ｋＤａタンパク質遺伝子を増幅させるため、C. jejuniＮＣＴＣ１１１６８（Nature 403, 665-668, 2000）のゲノム配列における２７ｋＤａタンパク質と同じ遺伝子から、以下のＰＣＲプライマーを設計した。すなわち、同定された遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）の最初の１９ｂｐにハイブリダイズする、ＢａｍＨＩの切断部位（下線部）を含む５'−ＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＴ−３'（配列番号３）をフォワードプライマーとし、また、ＯＲＦの最後の２１ｂｐにハイブリダイズする、Ｋｐｎｌの切断部位（下線部）を含む５'−ＧＡＡＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＡＡＡＴＴＣＧＣＧＴＴＴ−３'（配列番号４）をリバースプライマーとした。ＬＡＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）を用いたＰＣＲの条件としては、９５℃で２分間、続いて、９５℃で３０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニーリング及び７２℃で１分間の伸長を２５サイクル行い、最終的に７２℃で１０分間、伸長を行った。Ｃｊ００１２ｃ遺伝子から得た期待された大きさのＰＣＲ産物（〜６５０ｂｐ）を、pGEM-Tベクター（Promega社製）を用いてクローン化した。２７ｋＤａタンパク質遺伝子を含む挿入遺伝子を、Ｔ７プロモーター及びＳＰ６プロモータープライマーで再び増幅し、ダイレクト・シークエンシング（Sawady Technology Co.社委託）を行なった。CLUSTAL Xプログラム（Nucleic Acids Res. 25, 4876-4882, 1997）及びGENETYXプログラム（Software Development社製）のそれぞれを用いて、多重アライメント解析及びアミノ酸配列の相同性について分析した。本発明者らは、２７ｋＤａタンパク質遺伝子をｒｒｃと命名した。
【００２９】
［Ｈｉｓ−タグ組換えＲｒｃの調製及び分光学的分析］
製造者の指示に従い、QIAexpress System（Qiagen社製）を用いて、６つの連続したヒスチジン（Ｈｉｓ）残基をタグ標識した組換えＲｒｃを調製した。すなわち、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎｌで消化したＰＣＲ産物を、同じ制限酵素で直線化したpQE-30ベクターと結合させた。ベクター挿入構築物であるプラスミドpRrcHで、大腸菌株Ｍ１５を形質転換した。組換えＲｒｃを発現する大腸菌Ｍ１５／pRrcHを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ（Luria-Bertani）培地に接種し、３７℃で一晩インキュベーションした。この培養物のうち２０ｍｌを、抗生物質を含む１Ｌの新鮮なＬＢ培地に接種し、インキュベーションを１時間行ない、その後、１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して組換えＲｒｃの発現を誘導した。誘導した培養物をさらに４〜５時間インキュベーションし、氷の上に置いて冷やした後、７,０００×ｇで１０分間の遠心分離により細胞を収集した。細胞をよく冷えたＰＢＳで３回洗浄し、得られたペレットを、精製するまで−８０℃で保存した。凍結したペレットを氷上で１５分間解凍し、その後、Ｈｉｓ−タグ組換えＲｒｃを、精製過程において尿素又は塩酸グアニジンで変性することのない条件下で精製した。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、組換えＲｒｃの精製を確認した。UV2550分光光度計（Shimadzu社製）を用いて、組換えＲｒｃのＵＶ−可視部吸収スペクトルを記録した。また、亜ジチオン酸ナトリウムを添加し、還元した組換えＲｒｃを調製し、これについてもＵＶ−可視部吸収スペクトルを測定した。
【００３０】
［ｒｒｃの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ］
製造者の指示に従ってＤＮａｓｅ処理を行い、SV Total RNA Isolation System（Promega社製）を使用して、全ＲＮＡをC. jejuni９１３１から単離した。全ＲＮＡの濃度及びクリュードクオリティー（crude quality）について、Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies社製）を用いてＲＮＡ６０００アッセイで測定した。製造者の指示に従い、RETROscript Kit（Ambion, Inc.社製）を用いて、全ＲＮＡのうちの４０ｎｇに対し、１０塩基からなるランダムな配列のプライマーで逆転写（ＲＴ）反応を行なった。以下のプライマーを使用してｃＤＮＡ産物を増幅した。すなわち、ｒｒｃ（ヌクレオチド位置［ｎｐ］１５６から５２３）に対しては、５'−ＴＡＣＧＡＴＴＴＡＴＴＴＧＣＴＧＡＴＧＴ−３'（配列番号５）及び５'−ＣＡＴＡＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＣＴ−３'（配列番号６）、また、ＤＮＡジャイレースＡサブユニット（ｇｙｒＡ）をコードする遺伝子（GenBank no. L04566、ｎｐ３７７から８５２）（Antimicrob. Agents Chemother. 37, 457-463, 1993）に対しては、５'−ＧＴＴＡＴＴＡＴＡＧＧＴＣＧＴＧＣＴＴＴ−３'（配列番号７）及び５'−ＣＴＡＴＧＡＧＧＴＧＧＧＡＴＧＴＴＴＧＴ−３'（配列番号８）を使用した。ｃＤＮＡに対するｇｙｒＡ遺伝子の増幅を、内部コントロールとして使用した。ｒｒｃの場合には２０サイクルであることを除いては、上述のＰＣＲ条件下で、ｒｒｃ及びｇｙｒＡ遺伝子をそれぞれ増幅するために、ｃＤＮＡの０．５μｌ及び０．２５μｌの一定量を使用した。ｒｒｃ及びｇｙｒＡの３６８ｂｐ及び４７６ｂｐのＰＣＲ産物を、それぞれアガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。
【００３１】
［好気ストレスアッセイ］
発酵槽中のC. jejuni９１３１の２４時間培養液を、５００ｍｌ容量のフラスコに移し、大気中の条件下で、１５０ｒｐｍで振盪してインキュベーションした。これらの培養物からC. jejuni９１３１を収集し、上記の通り、ＣＦＵ測定、粗製抽出物の調製及び全ＲＮＡ単離を行なった。
【００３２】
［ｒｒｃのアクセッション・ナンバー］
ｒｒｃ遺伝子のヌクレオチド配列データは、ＤＤＢＪデータベースに提出されており、アクセッション・ナンバーＡＢ０９０３１０にて、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ及びGenBankのヌクレオチド配列データベースで見ることができる。
【００３３】
［Ｒｒｃのスーパーオキシドジズムターゼ活性の測定］
組換えＲｒｃタンパク質のスーパーオキシドジズムターゼ活性は、キサンチン−キサンチン オキシダーゼ（xanthine-xanthine oxidase）によって生成されるスーパーオキシドアニオンラジカル（・Ｏ２ −）が、Ｒｒｃの添加により減少することで評価した。溶液中のスーパーオキシドアニオンラジカルはニトロブルーテトラゾリウム（nitroblue tetrazolium；ＮＢＴ）によって検出し、３０〜９０秒間のスーパーオキシドアニオンラジカルの発生率（ΔA）を算出し、タンパク質非添加群のΔAを１００％としたとき、これに対するタンパク質添加群のΔAの割合（% inhibition）で示した。
【００３４】
（結果）
［Ｈ２Ｏ２ストレスがC. jejuni９１３１の生存性及び全タンパク質に及ぼす影響］
C. jejuni９１３１の生存性は、Ｈ２Ｏ２ストレスに対して高感受性を示した（図１）。１．０又は０．５ｍＭのＨ２Ｏ２で１５分間インキュベーションすると、C. jejuniのコロニー形成能は急激に低下した。その後、１．０ｍＭのＨ２Ｏ２で処理したC. jejuniのコロニー形成能は、４時間で検出レベル以下に低下したが、０．５ｍＭのＨ２Ｏ２で処理したC. jejuniのコロニー形成能は、２〜４時間後に初期レベルまで回復した。様々な濃度で１５分間、Ｈ２Ｏ２で処理した後に、C. jejuniから全細菌タンパク質を抽出し、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、その後、クーマシーブリリアントブルーで染色した。この結果、約２７ｋＤａの分子量を持つタンパク質が、Ｈ２Ｏ２の濃度に応じて減少した（図２）。すなわち、２７ｋＤａタンパク質の消失は、Ｈ２Ｏ２で処理した後のコロニー形成能の低下を伴なった（図１）。本発明者らの実験条件下では、分子量４５ｋＤａのＭＯＭＰの細胞レベルは安定しており、Ｈ２Ｏ２の存在又は非存在による影響を受けなかった。そこで、本発明者らは、このタンパク質を内部標準として使用した。Ｈ２Ｏ２添加後に８時間インキュベーションした際の２７ｋＤａタンパク質の量の変化を、ＭＯＭＰの量に対する相対量で表した（図３）。０．５ｍＭのＨ２Ｏ２処理においては、コロニー形成能が回復したが（図１）、一度消失した２７ｋＤａタンパク質は、８時間の間には回復しなかった。
【００３５】
［２７ｋＤａタンパク質の同定］
C. jejuni９１３１の細胞成分を遠心分離して分画した。２７ｋＤａタンパク質は、１００,０００×ｇで６０分間の分画において主として見い出され、このタンパク質が細胞質タンパク質であることが示唆された（図４）。また、Ｎ末端アミノ酸の最初の１２残基の配列を決定し（ＭＲＱＹＥＴＹＫＣＱＫＣ）、C. jejuniゲノム配列ＢＬＡＳＴ検索プログラムで検索にかけた。配列は、C. jejuniＮＣＴＣ１１１６８のゲノム配列（Nature 403, 665-668, 2000）におけるＣｊ００１２ｃのＮ末端と一致した。
【００３６】
２７ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び配列決定を行なうため、Ｃｊ００１２ｃをコードするＯＲＦに基づき、ＰＣＲプライマーを設計した。配列分析を行なった結果、２７ｋＤａタンパク質をコードするＯＲＦの６４８ヌクレオチド配列が、Ｃｊ００１２ｃのそれと１００％一致すること（計算した分子量、２４,５２６Ｄａ）が明らかとなった。C. jejuniにおいて、Ｃｊ００１２ｃは遺伝子配列としてはデータベースに登録されてはいるものの、機能及び性状に関する報告はなく、２７ｋＤａタンパク質の機能は分からなかった。他の細菌種における類似したタンパク質を調査するために、２７ｋＤａタンパク質をコードするＯＲＦの２１５のアミノ酸配列を、ＤＤＢＪデータベースのＦＡＳＴＡ検索プログラムにかけた。ＦＡＳＴＡ検索プログラムにより、酸化ストレス防御タンパク質として考えられている２つの非ヘム鉄タンパク質との高い相同性が示された。アミノ酸２１５残基の２７ｋＤａタンパク質は、Ｒｂｏ（rubredoxin oxidoreductase）（別名desulfoferrodoxin）と相同性を示すＮ末端の最初の３２残基と、Ｒｂｒ（rubrerythrin）と相同性を示すＣ末端の残りの１８３残基から構成されている（図５）。最初の３２残基は、ＲｂｏのＮ末端と相同性を示した。すなわち、Desulfovibrio vulgaris（Hildenborough）Ｒｂｏに対しては６９％の同一性（J. Bacteriol. 1989, 4996-5004, 1989）、また、Moorella thermoaceticaＲｂｏに対しては５３．９％の同一性（J. Bacteriol. 183, 1560-1567, 2001）を示した。残りの１８３残基は、Ｒｂｒの全領域と相同性を示した（図５）。すなわち、Clostridium acetobutylicumＲｂｒに対しては４５．７％の同一性（J. Bacteriol. 183, 4823-4838, 2001）、Porphyromonas gingivalisＲｂｒに対しては４５．４％の同一性（Mol. Microbiol. 44, 479-488, 2002）、M. thermoaceticaＲｂｒに対しては４２．９％の同一性（J. Bacteriol. 183, 1560-1567, 2001）、D. vulgaris（Hildenborough）Ｒｂｒに対しては３９．５％の同一性（Biochemistry 30, 11118-11123, 1991）、ウェルシュ菌（C. perfringens）Ｒｂｒに対しては３８．３％の同一性（J. Bacteriol. 178, 7152-7158, 1996）を示した。
【００３７】
D. vulgarisＲｂｏのＦｅＳ４クラスター鉄結合部位のＣ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１５−Ｃ−Ｃモチーフ（J. Bacteriol. 1989, 4996-5004, 1989）は、２７ｋＤａタンパク質のＲｂｏ領域に保存されていた（Ｃｙｓ９−Ｘ２−Ｃｙｓ１２−Ｘ１５−Ｃｙｓ２８−Ｃｙｓ２９、図５）。D. vulgarisＲｂｒの、非硫黄でオキソ架橋した二鉄結合部位のＥ−Ｘ３０−３４−Ｅ−Ｘ２−Ｈ−Ｘｎ−Ｅ−Ｘ３０−３４−Ｅ−Ｘ２−Ｈモチーフ、及びＦｅＳ４クラスター鉄結合部位のＣ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１２−Ｃ−Ｘ２−Ｃモチーフ（Nat. Struct. Biol. 6, 539-546, 1996、Biochem. Biophys. Res. Commun. 181, 337-341, 1991、Biochemistry 30, 11118-11123, 1991）は、タンパク質のＲｂｒ領域に保存されていた（それぞれ、Ｇｌｕ５２−Ｘ３２−Ｇｌｕ８５−Ｘ２−Ｈｉｓ８８−Ｘ３０−Ｇｌｕ１１９−Ｘ３３−Ｇｌｕ１５３−Ｘ２−Ｈｉｓ１５６及びＣｙｓ１８３−Ｘ２−Ｃｙｓ１８６−Ｘ１２−Ｃｙｓ１９９−Ｘ２−Ｃｙｓ２０２、図５）。従って、本発明者らは、ここで２７ｋＤａタンパク質をＲｒｃ（C. jejuniのrubredoxin oxidoreductase／rubrerythrin様タンパク質（rubredoxin oxidoreductase/rubrerythrin-like protein of C. jejuni））と名付けた。
【００３８】
なお、図５中、ＤｖＲｂｏは、Desulfovibrio vulgarisのＲｂｏ配列（アクセッション・ナンバーＭ２８８４８）であり、ＭｔＲｂｏは、Moorella thermoaceticaのＲｂｏ配列（ＡＦ２０２３１６）である。また、ＣａＲｂｒは、Clostridium acetobutylicum（アクセッション・ナンバーＡＥ００７７５５）のＲｂｒ配列であり、ＣｐＲｂｒは、C. perfringensのＲｂｒ配列（Ｘ９２８４４）であり、ＤｖＲｂｒは、D. vulgarisのＲｂｒ配列（Ｕ８２３２３）であり、ＭｔＲｂｒは、M. thermoaceticaのＲｂｒ配列（アクセッション・ナンバーＡＦ２０２３１６）であり、ＰｇＲｂｒはPorphyromonas gingivalisのＲｂｒ配列（ＡＦ３３３３２３）である。また、アスタリスクは、アミノ酸残基の一致した箇所を示す。また、ボックスはD. vulgarisの鉄リガンドを示す。矢印は、ＲｒｃのＯＲＦにおけるプライマーのアニーリング部位及びプライマーの方向を示す。
【００３９】
［Ｈｉｓ−タグ組換えＲｒｃの分光学的特質］
Ｒｒｃの酸化還元活性について調べるため、本発明者らは、大腸菌で組換えタンパク質を作製した。Ｈｉｓ−タグ組換えＲｒｃを、ＩＰＴＧ誘導で大腸菌において過剰発現させ、そのタンパク質を変性させることなく精製した（図６）。組換えD. vulgarisＲｂｒは、大腸菌においては封入体を形成すると報告されているが（Biochemistry 34, 3310-3318, 1995）、本発明者らが作製した組換えＲｒｃは、可溶性タンパク質として見い出された。組換えＲｒｃのＵＶ−可視部吸収スペクトルは、７４０、４８８、３７０及び２７９ｎｍでピークを示し、５７０及び３５０ｎｍでショルダー（shoulder）を示した。一方、亜ジチオン酸塩還元型の組換えＲｒｃは、可視領域においてほとんど吸収が見られなかった（図７）。精製したＲｒｃ及びその還元型における吸収スペクトルは、Ｒｂｏ（J. Biol. Chem. 265, 21596-21602, 1990）及びＲｂｒ（Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 317-323, 1999、Biochemistry. 34, 3310-3318, 1995、Biochemistry. 27, 1636-1642, 1988）の吸収スペクトルと類似していた。
【００４０】
［Ｒｒｃの発現における鉄の濃度の影響］
カタラーゼ（ＫａｔＡ）及びアルキルヒドロペルオキシド還元酵素（ＡｈｐＣ）をコードする、C. jejuni過酸化物ストレス防御遺伝子は、鉄に反応してＰｅｒＲ（過酸化物応答レギュレーター）により抑制された（J. Bacteriol. 181, 4798-4804, 1999、J. Bacteriol. 181, 6371-6376, 1999）。C. jejuniにおけるＣｊ００１２ｃ遺伝子の上流の配列を分析した結果、この領域においてＰｅｒ ｂｏｘ（ＰｅｒＲ結合配列）相同配列が見い出された。そこで、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、転写レベルにおけるｒｒｃ発現に対する鉄の影響について調べた。Staphylococcus aureusにおいては、ハウスキーピング遺伝子ｇｙｒを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の内部コントロールとして使用することに成功した（Infect. Immun. 68, 1304-1311, 2000）。従って、本発明者らは、この遺伝子をC. jejuniのコントロールとして使用し、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによってｒｒｃ及びｇｙｒＡ転写物の内部領域、３６８及び４７６ｂｐのそれぞれを増幅した。Ｒｒｃの発現は、転写レベルで鉄の濃度に依存して誘導された（図８）。
【００４１】
［Ｈ２Ｏ２のストレス下にあるｒｒｃの転写分析］
転写レベルにおけるｒｒｃ発現に対するＨ２Ｏ２の影響を、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により調べた。ｒｒｃ転写物は、０．５ｍＭのＨ２Ｏ２で処理したC. jejuniの場合でも発現していた（図９）。一方、コロニー形成能の回復にもかかわらず、Ｒｒｃタンパク質はＨ２Ｏ２添加８時間後までは回復しなかった（図３）。これらの結果は、Ｈ２Ｏ２ストレスによるＲｒｃの減少が、転写レベルで制御されているのではないことを示唆する。それに対して、１．０ｍＭのＨ２Ｏ２で処理したC. jejuniのｒｒｃ転写物もｇｙｒＡ転写物も、４時間では検出されなかった。１．０ｍＭのＨ２Ｏ２で処理したC. jejuniの全ＲＮＡ質の変質が見られ、コロニー形成能は検出限界以下であった。これらの結果から、１．０ｍＭのＨ２Ｏ２の処理によるｒｒｃ転写物の著しい減少は、菌細胞死によることが示唆される。
【００４２】
［Ｒｒｃの発現に対する好気ストレスの影響］
C. jejuni９１３１の増殖及びＲｒｃタンパク質発現に対する好気ストレスの影響について調べた。大気中の酸素分圧下でフラスコ振盪をしてインキュベーションすることにより好気ストレスを与えた結果、C. jejuniは６時間後までは好気条件下でも生存したが、好気ストレスはその後、細胞のコロニー形成能に影響を及ぼした（図１０）。タンパク質プロフィールにより、Ｒｒｃタンパク質が、初期の３時間では著しい変化を見せなかったが、その後、コロニー形成能の低下と同時にその発現は減少したことが明らかとなった。同時に、細胞の全ＲＮＡの量が減少し、細胞が激しく破損したことを示唆した。本発明者らの分析によれば、ｒｒｃの転写レベルは、全ＲＮＡ質（quality）が低下した後まで著しく変化しなかった。
【００４３】
［Ｒｒｃのスーパーオキシドジズムターゼ活性］
組換えＲｒｃタンパク質のスーパーオキシドジズムターゼ活性の結果を図１１に示す。その結果、組換えＲｒｃタンパク質の添加（○）によって溶液中のスーパーオキシドアニオンラジカル（・Ｏ２ −）の減少が認められた。これに対して、６５℃で３０分間の熱処理により失活させた組換えＲｒｃタンパク質の添加（●）によるスーパーオキシドアニオンラジカルの減少は認められなかった。この結果から、Ｒｒｃのスーパーオキシドジズムターゼ活性が確認され、算出した活性の値は１０．９７Ｕ／ｍｇであった。この活性の値はホモロジーを示したタンパク質と同程度であった。一方、ポジティブコントロールとして用いたウシ赤血球由来のＳＯＤを添加（△）した場合、スーパーオキシドジズムターゼ活性は８６３３．４２Ｕ／ｍｇであった。これらの結果は、Ｒｒｃがウシ赤血球由来のＳＯＤと比べ約１／８００と弱いが、ホモロジーを示したタンパク質と同程度のスーパーオキシドジズムターゼ活性を持つことを示している。
【００４４】
（まとめ）
C. jejuniは、酸化ストレスに対して高い感受性を示し（Can. J. Microbiol. 25, 1-7, 1979、Can. J. Microbiol. 25, 8-16, 1979、J. Appl. Bacteriol. 59, 413-419, 1985）、その増殖及び生存のために微好気的な条件が必要であることが示唆されている。好気的な環境において、活性酸素は、代謝経路を通って細胞内で生成されると考えられているため、これら内因性の酸化ストレスは、C. jejuniにおけるいくつかのタンパク質を損傷するかも知れない。本発明者らは、内因性及び外因性の起源の両方から、C. jejuniの酸化ストレスに対する反応について調べた。また、この細菌がこれらの条件下でどのように増殖及び／又は生存するかについても調べた。まず、様々な濃度の外因性Ｈ２Ｏ２ストレスは、急激で強い毒性の結果を示し（図１）、酸化的な代謝経路を通して細胞内で発生した内因性Ｈ２Ｏ２ストレスは、より緩やかな誘導ではあったが細菌に対して著しい毒性を示した（図１０）。また、電気泳動分析により、Ｈ２Ｏ２ストレスにより、２７ｋＤａの分子量を持つタンパク質は、生存性の低下と同時かつ急激に消失したことが明らかとなった（図２）。このタンパク質の減少について、好気的な条件下で培養した際に類似性が見い出された。すなわち、好気ストレスによりC. jejuniのコロニー形成能が低下した際に、２７ｋＤａタンパク質はより緩やかではあるが減少した（図１０）。これらの結果は、C. jejuniが内因性及び外因性の起源の両方による酸化ストレスに反応し、コロニー形成能及び２７ｋＤａタンパク質の量の低下を招くことを示唆している。
【００４５】
C. jejuniは、有毒な活性酸素種を除去するため、スーパーオキシド・ジスムターゼ、カタラーゼ及びアルキル・ヒドロペルオキシド還元酵素を有しており（Microbiology. 141, 1369-1376, 1995、Infect. Immun. 62, 2687-2694, 1994、Microbiology 140, 1203-1208, 1994）、これらの酵素は、好気的な環境における生存のために重要な役割を果たすと考えられている（Infect. Immun. 68, 6337-6345, 2000、J. Bacteriol. 65, 2540-2546, 1999）。実際に、本発明者らによる好気ストレスアッセイにおいては、２、３のタンパク質が生存している間（６時間まで）に発現が誘導され、そのうちのいくつかがこれら除去酵素に類似した分子量を持っていた。しかしこれらについてはまだ同定されていない。（以下青は削除）また、C. jejuniの呼吸活性はかなり高いため（Can. J. Microbiol. 25, 1-7, 1979）、細菌が好気的な自然環境中において生存する場合、好気代謝において過剰に生成される活性酸素の連続的な酸化ストレスを受ける可能性がある。従って、好気ストレスによるコロニー形成能の低下ばかりでなく、２７ｋＤａタンパク質の減少も、これら分解酵素活性の能力を超えるであろう、過剰な内因性活性酸素の連続的な酸素ストレスが原因のようである。従って、外因性のＨ２Ｏ２ストレスの曝露により、好気的な環境における活性酸素の内因的な生産から始まる、その活性酸素に対する不定期の反応ではなく共通の反応から、２７ｋＤａタンパク質における敏感な変化をもたらした。
【００４６】
本発明者らによる外因性Ｈ２Ｏ２ストレスアッセイにおいて、コロニー形成能の著しい回復が観察された（図１）。この現象は、細菌が数時間以内に１０４倍という急速な分裂をすることができないことから、（以下青は削除）コロニー形成能の回復が、増殖適格細胞に対する１５分間のストレスを与えた後のコロニー形成能を失った細胞が急激にコロニー形成能を回復することに起因している可能性を示している。しかしながら、新たなタンパク質の同時発現を含め、回復の原因となるかも知れないタンパク質においては著しい変化が見られず、現在のところはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって検出されていない。
【００４７】
本発明者らは、C. jejuniに対する活性酸素の有害な影響は微好気的な代謝において重要な役割を果たす特定のタンパク質が活性酸素に対して敏感に反応するためであると考え、ここで同定した２７ｋＤａタンパク質がその特定のタンパク質であると仮定した。すなわち、本発明者らは、２７ｋＤａタンパク質を同定し、それがC. jejuniゲノム配列（Nature 403, 665-668, 2000）に見られるＣｊ００１２ｃと同一であることを見い出した。しかしながら、上記データベースにはＣｊ００１２ｃの機能についての情報が不足しているため、本発明者らは、２７ｋＤａタンパク質の機能について知ることができなかった。しかしながら、ゲノム分析を行なった結果、２７ｋＤａタンパク質は、他の細菌が有する２つの既知の非ヘム鉄硫黄タンパク質、すなわちＲｂｏ及びＲｂｒと相同性を示す配列を持つことがわかった（図５）。アミノ酸２１５残基の２７ｋＤａタンパク質であるＲｒｃは、２つの領域から構成されている。すなわち、Ｒｂｏと相同性を示すＮ末端３２残基、及びＲｂｒと相同性を示すＣ末端１８３残基である。従って、Ｒｒｃは、Ｒｂｏ及びＲｂｒの両タンパク質のキメラ構造を有する。Ｒｂｏ及びＲｂｒの役割は、好気的な微生物における酸化ストレス反応に関して主として研究されてきた。Desulfoarculus baarsiiから得たＲｂｏは、インビトロでスーパーオキシド還元酵素活性を示し（J. Biol. Chem. 275, 115-121, 2000）、D. vulgarisＲｂｏ又はD. baarsiiＲｂｏの過剰発現は、スーパーオキシド・ジスムターゼ欠損大腸菌の・Ｏ２ −ストレス感受性を補完した（J. Bacteriol. 183, 101-108, 2001、J. Bacteriol. 178, 6736-6742, 1996）。それに対し、D. vulgarisＲｂｒは、インビトロでＨ２Ｏ２から水への還元を触媒する、ＮＡＤＨペルオキシダーゼを示し（Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 317-323, 1999）、その過剰発現によってカタラーゼ欠損大腸菌のＨ２Ｏ２ストレス敏感性を補完した（J. Bacteriol. 183, 101-108, 2001）。近年、P. gingivalisＲｂｒの遺伝子ノックアウト株の作製により、Ｈ２Ｏ２ストレスに対するＲｂｒの防御的役割が確認された（Mol. Microbiol. 44, 479-488, 2002）。微好気性細菌において、Spirillum volutansのＨ２Ｏ２耐性変異体が、Ｒｂｒと相同性を示すタンパク質を発現した（J. Appl. Microbiol. 85, 875-882, 1998）。Ｒｒｃのアミノ酸配列には、D. vulgarisのＲｂｏ及びＲｂｒの鉄結合モチーフが保存されており、従って、これらの領域に鉄が組み込まれている可能性がある。Ｎ末端３２残基にも鉄結合モチーフが存在するため、Ｒｒｃは、Ｒｂｒ及びＲｂｏよりもモチーフを１つ多く含み、その結果、３つの推定上の鉄結合部位を持つ。分光学的分析を行なった結果、精製したＲｒｃ及びその還元型のＵＶ−可視部吸収スペクトルは、D. vulgarisＲｂｏ及びＲｂｒそれぞれのスペクトルと同様の変化を示すことが明らかとなった（Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 317-323, 1999、Biochemistry. 34, 3310-3318, 1995、Biochemistry. 27, 1636-1642, 1988、J. Biol. Chem. 265, 21596-21602, 1990）（図７）。この結果は、Ｒｒｃが鉄を含み、酸化還元反応の機能に関連することを示唆している。Ｒｂｏ及びＲｂｒのアミノ酸配列及び分光学的特質の類似性に基づき、Ｒｒｃは、これら２つの相同タンパク質が持つ２つの機能を実行する可能性が大きい。
【００４８】
ＳＯＤ及びカタラーゼなど、既知の活性酸素除去酵素の発現は、酸化ストレスに反応して誘導されることが知られている（Biochem. Pharmacol. 59, 1-6, 2000）。Ｒｒｃが、これらのような活性酸素の除去酵素であるならば、それは酸化ストレスに誘導されるか、又は少なくとも酸化ストレス下で安定することが期待されている。しかしながら、Ｒｒｃタンパク質は、Ｈ２Ｏ２の曝露下においてその発現は減少した。これらの結果は、Ｒｒｃの性状が、上記の一般的な活性酸素除去酵素の性状とは異なることを示唆している。またＲｒｃの発現は培地中の鉄によって誘導され、この発現システムはｋａｔＡ及びａｈｐＣなどの過酸化物ストレスに対する防御遺伝子のそれとは異なっていた（図８）。ｋａｔＡ及びａｈｐＣなどの過酸化物ストレスに対する防御遺伝子は、鉄の濃度の増加によって発現を抑圧されるとされている（J. Bacteriol. 181, 4798-4804, 1999、J. Bacteriol. 180, 5291-5298, 1998、J. Bacteriol. 181, 6371-6376, 1999）。
【００４９】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行なった結果、２７ｋＤａタンパク質のＨ２Ｏ２ストレスに対する敏感な反応が、転写後に調整されることが分かった（図９）。活性酸素は、ポリペプチド鎖の開裂などのタンパク質の修飾や、ヒスチジン、システイン又はチロシンなどのアミノ酸残基の酸化を誘導し、また、そのようなタンパク質の修飾がタンパク質の酵素活性の減少又は分解の原因となることが知られている（Methods Ezymol. 258, 379-393, 1995）。鉄硫黄タンパク質のいくつかは、・Ｏ２ −に感受性を示すと報告されているが（Chem. Rev. 96, 2315-2334, 1996、J. Exp. Biol. 201, 1203-1209, 1998）、Ｒｒｃに鉄硫黄クラスターのモチーフが発見された。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、有害な活性酸素を速やかに除去することができる、酸化還元酵素活性を有するタンパク質である活性酸素除去酵素及びこれをコードする遺伝子を提供することができる。また、本発明の活性酸素除去酵素を用いた機能性食品を摂取することにより、生体に有害な活性酸素を非常に簡単に除去することができる。また、本発明の活性酸素除去酵素を用いた医薬品は、生体内から有害な活性酸素を除去するので、癌等の腫瘍、炎症等の疾病の予防・治療効果が期待できる。また、本発明の活性酸素除去酵素を用いた化粧品は、活性酸素に起因する肌の老化現象を予防しうる。
【００５１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＨ培地におけるC. jejuni９１３１の増殖（３７）に対する、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）添加の影響を示す図である。図中、（○）は０ｍＭ、(●)は０．２ｍＭ、(▲)は０．５ｍＭ、（■）は１．０ｍＭのＨ２Ｏ２をそれぞれ培地に添加した場合を示す。
【図２】ＭＨ培地におけるC. jejuni９１３１のタンパク質プロフィールに対する、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の影響を示す図である。図中、矢印は、Ｈ２Ｏ２に敏感な２７ｋＤａのタンパク質を示し、矢頭は、対照としての４５ｋＤａの主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）を示す。
【図３】 C. jejuni９１３１の２７ｋＤａタンパク質の発現量に対する、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の影響を示す図である。図中、(○）は０ｍＭ、(●）は０．２ｍＭ、(▲)は０．５ｍＭ、(■)は１．０ｍＭのＨ２Ｏ２をそれぞれ培地に添加した場合を示す。
【図４】分画遠心法により分画した、C. jejuni９１３１の２７ｋＤａタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】Ａは、本発明のＲｒｃと、Ｒｂｏ及びＲｂｒとの相同性領域の組成を示す模式図であり、Ｂは、本発明ののＲｒｃ及び他の細菌種のＲｂｏ及びＲｂｒのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図６】大腸菌Ｍ１５／pRrcHにおける組換えＲｒｃの発現及び精製の結果を示す図である。
【図７】精製した組換えＲｒｃタンパク質（実線）及び還元型（点線）のＵＶ可視性吸収スペクトルを示す図である。
【図８】ＭＨ培地における、C. jejuni９１３１のｒｒｃ転写物（ＲＴ−ＰＣＲ）の発現に及ぼす鉄の影響を示す図である。
【図９】Ｈ２Ｏ２で処理したC. jejuni９１３１におけるｒｒｃ発現の半量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図１０】ＭＨ培地における、C. jejuni９１３１の増殖及びＲｒｃタンパク質発現に対する好気ストレスの及ぼす影響を示す図である。
【図１１】本発明のＲｒｃのスーパーオキシドジズムターゼ活性の測定結果を示す図である。図中、(○)は組換えＲｒｃタンパク質、（●)は熱失活組換えＲｒｃタンパク質、(△）はウシ赤血球由来のＳＯＤをそれぞれ添加した場合を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、活性酸素除去活性を有する酵素（活性酸素除去酵素）及びその遺伝子ＤＮＡ、並びに、活性酸素除去活性を有する酵素の食品、医薬等への利用等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カンピロバクター・ジェジュニー（C. jejuni）は、グラム陰性でらせん状の形をした微好気性（microaerophile）細菌であり、呼吸のエネルギー生成過程において酸素を末端電子受容体として必要とするが、大気中の酸素分圧下では増殖しないという性質を有している。C. jejuniは他の好気性細菌や通性嫌気性細菌よりも活性酸素に対して敏感であり、このことが微好気的な環境でのみ活発に増殖する原因となっている。
【０００３】
好気的な条件下においては、自己酸化及び光増感反応による酸素の還元、ならびに酸化的な代謝により、活性酸素が発生する。反応性の高い活性酸素は、タンパク質に障害を与え、障害を受けたタンパク質は不活化及び分解される原因となっており、細胞の代謝に多大な影響を及ぼす可能性がある。このことから、微好気性細菌が活性酸素に対して高い感受性を示す一因として、微好気代謝において重要な役割を果たすタンパク質が存在し、これが活性酸素に対して敏感に反応して不活化又は分解するのではないかと考えられている（例えば、非特許文献１参照。）。このことから、C. jejuniにおいても、活性酸素に対して高い感受性を示すタンパク質が存在すると予想されている。
【０００４】
また、細菌の酸化ストレス防御タンパク質として、スーパーオキシドレダクターゼ活性を示すルブレドキシン・オキシドレダクターゼ（Ｒｂｏ；rubredoxin oxidoreductase）や、ＮＡＤＨペルオキシダーゼ活性を示すルブレリスリン（Ｒｂｒ；rubrerythrin）等が発見されている。具体的には、Desulfovibrio vulgaris（Hildenborough）のＲｂｏ（例えば、非特許文献２参照。）、Moorella thermoaceticaのＲｂｏ（例えば、非特許文献３参照。）、Clostridium acetobutylicumのＲｂｒ（例えば、非特許文献４参照。）、Porphyromonas gingivalisのＲｂｒ（例えば、非特許文献５参照。）、M. thermoaceticaのＲｂｒ（例えば、非特許文献６参照。）、D. vulgaris（Hildenborough）のＲｂｒ（例えば、非特許文献７参照。）、ウェルシュ菌（C. perfringens）のＲｂｒ（例えば、非特許文献８参照。）等が報告されている。このように酸化ストレス防御タンパク質であるＲｂｏやＲｂｒは多種の細菌から報告されているものの、C. jejuniにおいてはこれまで報告されていなかった。
【０００５】
その他、第一セリンプロテアーゼの第一ドメイン・ハーフに相当する第一ドメイン・ハーフと、第二セリンプロテアーゼの第二ドメイン・ハーフに相当する第二ドメイン・ハーフとの、βシート構造の２つのドメイン・ハーフ（ハーフ・サイド）を含むプロテアーゼ・ドメインを有する血液ホメオスタシスに有用なキメラセリンプロテアーゼがこれまでに報告されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１１−２３５１７３号公報
【非特許文献１】
Ann. Rev. Microbiol. 40, 107-30, 1986
【非特許文献２】
J. Bacteriol. 1989, 4996-5004, 1989
【非特許文献３】
J. Bacteriol. 183, 1560-1567, 2001
【非特許文献４】
J. Bacteriol. 183, 4823-4838, 2001
【非特許文献５】
Mol. Microbiol. 44, 479-488, 2002
【非特許文献６】
J. Bacteriol. 183, 1560-1567, 2001
【非特許文献７】
Biochemistry 30, 11118-11123, 1991
【非特許文献８】
J. Bacteriol. 178, 7152-7158, 1996
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、活性酸素を速やかに除去することが可能な活性酸素除去活性を有する酵素タンパク質（活性酸素除去酵素）及びこれをコードする遺伝子ＤＮＡ、さらにはこの活性酸素除去酵素を有効成分として含む機能性食品、医薬品及び化粧品等を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、C. jejuniに外因性及び内因性酸化ストレスを与えた際に著しく減少する２７ｋＤａのタンパク質が存在し、このタンパク質がＲｂｏと相同性を示すＮ末端の最初の３２残基と、Ｒｂｒと相同性を示すＣ末端の残りの１８３残基から構成されており、Ｒｂｏ領域にはＦｅＳ４クラスター鉄結合部位のＣ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１５−Ｃ−Ｃモチーフが存在し、Ｒｂｒ領域には非硫黄でオキソ架橋した二鉄結合部位のＥ−Ｘ３０−３４−Ｅ−Ｘ２−Ｈ−Ｘｎ−Ｅ−Ｘ３０−３４−Ｅ−Ｘ２−Ｈモチーフ、及びＦｅＳ４クラスター鉄結合部位のＣ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１２−Ｃ−Ｘ２−Ｃモチーフを有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするスーパーオキシドジズムターゼ活性を有する酵素（請求項１）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つスーパーオキシドジズムターゼ活性を有することを特徴とするスーパーオキシドジズムターゼ活性を有する酵素（請求項２）に関する。
【００１０】
また本発明は、配列番号１に示される塩基配列からなり、スーパーオキシドジズムターゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ（請求項３）や、配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下である６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理でハイブリダイズし、且つスーパーオキシドジズムターゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ（請求項４）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の活性酸素除去酵素としては、スーパーオキシドレダクターゼ活性及びＮＡＤＨペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ活性酸素除去活性を有するタンパク質や、異なる酸化還元酵素活性を有するキメラタンパク質であれば特に制限されるものではなく、ここで活性酸素除去酵素とは、活性酸素除去活性を有するタンパク質を意味し、上記活性酸素除去活性とは、酸素分子が１電子還元されることにより生じるスーパーオキシドアニオンラジカル（・Ｏ２ −）、酸素分子の２個の不対電子が対をなして一方の酸素原子のπ軌道に入り、他方の軌道が空になった一重項酸素（１Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）等の活性酸素を、除去・消去する活性のことをいう。
【００１３】
上記スーパーオキシドレダクターゼ活性及びＮＡＤＨペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質における、スーパーオキシドレダクターゼ活性とは、スーパーオキシドアニオンラジカルを消去する反応［ｅ−＋・Ｏ２ −＋２Ｈ＋→Ｈ２Ｏ２］を触媒する活性をいい、ＮＡＤＨペルオキシダーゼ活性とは、Ｈ２Ｏ２を消去する反応［還元型ＮＡＤ＋Ｈ２Ｏ２＋Ｈ＋→ＮＡＤ＋＋２Ｈ２Ｏ］を触媒する活性をいう。かかるスーパーオキシドレダクターゼ活性及びＮＡＤＨペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質としては、ルブレドキシン・オキシドレダクターゼのＮ末端側領域とルブレリスリンの全領域のキメラタンパク質、好ましくはＣ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１５−Ｃ−Ｃモチーフを有するルブレドキシン・オキシドレダクターゼのＮ末端側領域と、Ｅ−Ｘ３０−３４−Ｅ−Ｘ２−Ｈ−Ｘｎ−Ｅ−Ｘ３０−３４−Ｅ−Ｘ２−Ｈモチーフ及びＣ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１２−Ｃ−Ｘ２−Ｃモチーフを有するルブレリスリンの全領域のキメラタンパク質を例示することができる。ここで、ＣはＣｙｓを、ＥはＧｌｕを、ＨはＨｉｓを、Ｘｎは任意のアミノ酸がｎ個連結していることを表している。上記３種のモチーフを局在的に有するタンパク質は、例えば、ＢＬＡＳＴ検索プログラム、ＰＡＰＩＡシステムのタンパク質構造検索プログラム等を用いて、検索することができる。
【００１４】
上記配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、C. jejuni等のカンピロバクター属に属する微生物に由来し、Ｒｒｃ（rubredoxin oxidoreductase/rubrerythrin-like protein of C.jejuni）と称され、スーパーオキシドレダクターゼ活性を示すＲｂｏのＮ末端と相同性を示すＮ末端３２残基と、ＮＡＤＨペルオキシダーゼ活性を示すＲｂｒと相同性を示すＣ末端１８３残基とからなる、２７ｋＤａのタンパク質であり、ＲｒｃのＮ末端３２残基領域と相同性を示すＲｂｏは、スーパーオキシドレダクターゼ活性を示し、反応［還元型ルブレドキシン＋スーパーオキシド＋２Ｈ＋→ルブレドキシン＋Ｈ２Ｏ２］を触媒し、一方、ＲｒｃのＣ末端１８３残基領域と相同性を示すＲｂｒは、ＮＡＤＨペルオキシダーゼ活性を示し、反応［還元型ＮＡＤ＋Ｈ２Ｏ２＋Ｈ＋→ＮＡＤ＋＋２Ｈ２Ｏ］を触媒する。
【００１５】
これら触媒活性を合わせもつと、活性酸素であるスーパーオキシドはＲｂｏによってＨ２Ｏ２となり、さらにＨ２Ｏ２はＲｂｒによって最終的にＨ２Ｏまで分解されることがわかる。ＲｂｏとＲｂｒとのキメラ酵素であるＲｒｃは、Ｒｂｏ及びＲｂｒの両方の酵素反応を触媒することができるので、スーパーオキシドをＨ２Ｏ２、Ｈ２Ｏの順に分解し、活性酸素を速やかに除去させることができる。また、このＲｒｃと同様に活性酸素除去活性を有するＲｒｃの欠失、置換等の変異体も本発明の活性酸素除去酵素に含まれる。また、上記異なる酸化還元酵素活性を有するキメラタンパク質としては、酵素分類のＥＣ２群に属するオキシドリダクターゼ、例えば、デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、ヒドロペルオキシダーゼ等から選ばれる２種以上の酸化還元酵素活性を有するキメラタンパク質を例示することができる。
【００１６】
本発明の融合タンパク質としては、上述の本発明の活性酸素除去酵素と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合したものであれば特に制限されず、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した活性酸素除去酵素の精製や、活性酸素除去酵素の検出や、活性酸素除去酵素に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００１７】
また、本発明のＤＮＡとしては、上述の本発明の活性酸素除去酵素をコードする遺伝子ＤＮＡや、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなり、活性酸素除去活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ活性酸素除去活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができ、このストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ活性酸素除去活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、C. jejuni等のカンピロバクター属に属する微生物に由来するｃＤＮＡライブラリーとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ活性酸素除去活性を有するものを選択することにより、取得することができる。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとしては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。
【００１８】
本発明の発現ベクターとしては、上記本発明のＤＮＡを含み、上記本発明の活性酸素除去酵素を宿主細胞内で発現させることができる発現系を有するものであればどのようなものでもよく、かかる発現系としては、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００１９】
本発明の宿主細胞としては、上記本発明の発現ベクターを含むものであればどのようなものでもよく、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真核細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞などを挙げることができる。宿主細胞への発現ベクターの導入は、多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング(scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。
【００２０】
前記本発明の活性酸素除去酵素及び本発明のＤＮＡは、例えば、与えられたアミノ酸配列や塩基配列の配列情報に基づき、化学合成的手法や遺伝子組換え手法により作製することができる。また、カンピロバクター・ジェジュニー（C. jejuni）、カンピロバクター・コリー（C. coli）、カンピロバクター・ヒオインテスティナリア（C.hyointestinalis）、カンピロバクター・フィタス（C. fetus）等のカンピロバクター属に属する微好気性微生物のｃＤＮＡライブラリーを検索し、選定されたＤＮＡの配列情報により調製することができる。その他、ルブレドキシン・オキシドレダクターゼのＮ末端側領域とルブレリスリンの全領域のキメラタンパク質は、プロティンエンジニアリング等により作製することができる。
【００２１】
本発明のＲｒｃ等の活性酸素除去酵素を食品又は食品素材中に配合することにより、食品又は食品素材自体の酸化を防止することができる上、かかる食品又は食品素材自体を抗酸化活性を有する機能性食品とすることができる。上記食品素材又は食品としては、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、チーズ、バター等の乳製品や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
また、本発明のＲｒｃ等の活性酸素除去酵素を有効成分として配合することにより医薬品とすることができる。かかる、医薬品は、活性酸素が引き起こす様々な疾病及び症状等に有効であり、具体的には、脳腫瘍、上顎癌、上咽頭癌、肺癌、食道癌、直腸癌、大腸癌、肝臓癌、胃癌、胆嚢癌、膵臓癌、皮膚癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病等の腫瘍や、ＨＩＶ感染等のウイルス感染症、リューマチ、線維症等の炎症性疾患や、アトピー性皮膚炎や化学物質過敏症等の炎症や、多量の酸素の存在と関連している中枢神経系、虚血、非血管性胃腸障害、眼性傷害や、動脈硬化、高血圧、老人性痴呆症等を挙げることができる。このような医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。またこれら医薬品は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００２３】
そしてまた、本発明のＲｒｃ等の活性酸素除去酵素を化粧水、パック、美容液、乳液、ファンデーション等に配合することにより、化粧品とすることができる。本発明の化粧品は、Ｒｒｃ等の活性酸素除去酵素を有効成分として含んでいるので、抗酸化作用を有し、例えばシミ、そばかす、シワ等の老化現象抑制効果や美白効果などを期待することができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（材料と方法）
［菌種及び増殖の条件］
C. jejuni菌株であるヒト臨床分離株クローン９１３１は、Dr. A. Kai（東京都立衛生研究所微生物部）から供与された。該菌株を、使用するまで２５％のグリセロール・ミュラー・ヒントン（ＭＨ）培地（Difco、Becton Dickinson Microbiology Systems社製）の中で−８０℃で保存した。C. jejuniを、BBL CampyPak Plusパケット（Becton Dickinson Microbiology Systems社製）を用いて、BBL GasPakジャーの中のＭＨ寒天上に３７℃で増殖させ、その後１８〜２４時間、ＭＨ培地で継代培養した。継代培養液のうち０．３ｍｌを、１００ｍｌ容量の発酵槽（MoBiTec社製）内の３０ｍｌの新鮮なＭＨ培地に接種し、５％のＯ２、１０％のＣＯ２及び８５％のＮ２からなる微好気条件下でインキュベーションした。２４時間のインキュベーションを行なった後、得られた培養液を、以下の実験のために使用した。また鉄低濃度培地及び鉄高濃度培地は、van Vliet et al.（J. Bacteriol. 180, 5291-5298, 1998）に記載されているように、デフェロキサミン・メシレート（Desferal、Sigma Chemical Co.社製）又は硫酸第二鉄をＭＨ培地に補充して調製し、これら培地でC. jejuniを培養し、２４時間後に培地からC. jejuniを収集し、全ＲＮＡ単離に使用した。
【００２５】
［Ｈ２Ｏ２ストレスアッセイ］
C. jejuni９１３１培養液に、最終濃度０ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ及び１．０ｍＭのＨ２Ｏ２（Wako Pure Chemical Industries社製）をそれぞれ添加した。ＣＦＵ（colony forming unit）を測定するために、培養液から所定量のC. jejuniを所定の時間間隔で収集し、よく冷えたＭＨ培地で洗浄し、その後、同量の培地に再び懸濁した。次に、細菌懸濁液を１０倍に階段希釈したものを調製した後、ＭＨ寒天に載せた。次に、粗抽出液を調製するため、C. jejuniを収集してよく冷えたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、その結果として得たペレットを−８０℃で保存した。全ＲＮＡ単離のため、C. jejuniを収集してよく冷えたＰＢＳで洗浄し、その結果として得たペレットを直ちに液体窒素で凍結し、その後、使用するまで−８０℃で保存した。
【００２６】
［電気泳動分析］
−８０℃で保存したC. jejuni９１３１を解凍し、１００ｍＭのＮａＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤（Complete、Mini、Roche Molecular Biochemicals社製）を含む５０ｍＭのTris-HCｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で再び懸濁した。ビーズ・ビーター・システム（beads beater system）（FastPrep system；Qiagen及びThermo Savant社製）を用いて細胞を破壊させ、粗抽出液を調製した。タンパク質（２０μｇ）を、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でスラブゲルを用いて分離させ、その後、クーマシーブリリアントブルーで染色した。Gel Documentation System（UVP, Inc.社製）のImageStore 7500 Ver.7.21を用いて、ゲル画像を得た。タンパク質の相対的な定量化のため、ＮＩＨイメージ１．６２ソフトウェアを使用し、染色したタンパク質の染色強度を、４５ｋＤａの主要外膜タンパク質（Major Outer Membrane Protein：ＭＯＭＰ）の染色強度と相対的に定量化した。
【００２７】
［２７ｋＤａタンパク質の局在性及びＮ末端アミノ酸配列］
破壊されていない細胞を除去するため、C. jejuni９１３１の粗製抽出液を、０．４５μｍの濾過膜（MillexR-HV、Millipore Corp.社製）を用いて濾過した。次に、４℃で５分間の遠心分離を１５,０００×ｇで行った後、膜タンパク質を含む細胞残渣画分を保存した。得られた上清をさらに６０分間、１００,０００×ｇで遠心分離し、その上清を細胞質画分として保存し、また、ペレットを粗膜画分として保存した。次に、分画したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ポリ二フッ化ビニリデン膜（Bio-Rad社製）に移した２７ｋＤａタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を、エドマン分解（TaKaRa Bio Inc.社委託）により決定した。決定したアミノ酸配列を、C. jejuniＮＣＴＣ１１１６８ゲノム配列ＢＬＡＳＴ検索プログラム（version 2.0、Sequencing Genomics Projects of C. jejuni、Sanger Institute 社製[http://www.sanger.ac.uk/Projects/C_jejuni]）で検索した。
【００２８】
［２７ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列］
ISOPLANTキット（Nippon Gene社製）を用いて、C. jejuniのゲノムＤＮＡを抽出した。２７ｋＤａタンパク質遺伝子を増幅させるため、C. jejuniＮＣＴＣ１１１６８（Nature 403, 665-668, 2000）のゲノム配列における２７ｋＤａタンパク質と同じ遺伝子から、以下のＰＣＲプライマーを設計した。すなわち、同定された遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）の最初の１９ｂｐにハイブリダイズする、ＢａｍＨＩの切断部位（下線部）を含む５'−ＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＴ−３'（配列番号３）をフォワードプライマーとし、また、ＯＲＦの最後の２１ｂｐにハイブリダイズする、Ｋｐｎｌの切断部位（下線部）を含む５'−ＧＡＡＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＴＡＡＣＣＣＡＡＡＡＡＴＴＣＧＣＧＴＴＴ−３'（配列番号４）をリバースプライマーとした。ＬＡＴａｑポリメラーゼ（TaKaRa社製）を用いたＰＣＲの条件としては、９５℃で２分間、続いて、９５℃で３０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニーリング及び７２℃で１分間の伸長を２５サイクル行い、最終的に７２℃で１０分間、伸長を行った。Ｃｊ００１２ｃ遺伝子から得た期待された大きさのＰＣＲ産物（〜６５０ｂｐ）を、pGEM-Tベクター（Promega社製）を用いてクローン化した。２７ｋＤａタンパク質遺伝子を含む挿入遺伝子を、Ｔ７プロモーター及びＳＰ６プロモータープライマーで再び増幅し、ダイレクト・シークエンシング（Sawady Technology Co.社委託）を行なった。CLUSTAL Xプログラム（Nucleic Acids Res. 25, 4876-4882, 1997）及びGENETYXプログラム（Software Development社製）のそれぞれを用いて、多重アライメント解析及びアミノ酸配列の相同性について分析した。本発明者らは、２７ｋＤａタンパク質遺伝子をｒｒｃと命名した。
【００２９】
［Ｈｉｓ−タグ組換えＲｒｃの調製及び分光学的分析］
製造者の指示に従い、QIAexpress System（Qiagen社製）を用いて、６つの連続したヒスチジン（Ｈｉｓ）残基をタグ標識した組換えＲｒｃを調製した。すなわち、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎｌで消化したＰＣＲ産物を、同じ制限酵素で直線化したpQE-30ベクターと結合させた。ベクター挿入構築物であるプラスミドpRrcHで、大腸菌株Ｍ１５を形質転換した。組換えＲｒｃを発現する大腸菌Ｍ１５／pRrcHを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ（Luria-Bertani）培地に接種し、３７℃で一晩インキュベーションした。この培養物のうち２０ｍｌを、抗生物質を含む１Ｌの新鮮なＬＢ培地に接種し、インキュベーションを１時間行ない、その後、１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して組換えＲｒｃの発現を誘導した。誘導した培養物をさらに４〜５時間インキュベーションし、氷の上に置いて冷やした後、７,０００×ｇで１０分間の遠心分離により細胞を収集した。細胞をよく冷えたＰＢＳで３回洗浄し、得られたペレットを、精製するまで−８０℃で保存した。凍結したペレットを氷上で１５分間解凍し、その後、Ｈｉｓ−タグ組換えＲｒｃを、精製過程において尿素又は塩酸グアニジンで変性することのない条件下で精製した。次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、組換えＲｒｃの精製を確認した。UV2550分光光度計（Shimadzu社製）を用いて、組換えＲｒｃのＵＶ−可視部吸収スペクトルを記録した。また、亜ジチオン酸ナトリウムを添加し、還元した組換えＲｒｃを調製し、これについてもＵＶ−可視部吸収スペクトルを測定した。
【００３０】
［ｒｒｃの半定量的ＲＴ−ＰＣＲ］
製造者の指示に従ってＤＮａｓｅ処理を行い、SV Total RNA Isolation System（Promega社製）を使用して、全ＲＮＡをC. jejuni９１３１から単離した。全ＲＮＡの濃度及びクリュードクオリティー（crude quality）について、Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies社製）を用いてＲＮＡ６０００アッセイで測定した。製造者の指示に従い、RETROscript Kit（Ambion, Inc.社製）を用いて、全ＲＮＡのうちの４０ｎｇに対し、１０塩基からなるランダムな配列のプライマーで逆転写（ＲＴ）反応を行なった。以下のプライマーを使用してｃＤＮＡ産物を増幅した。すなわち、ｒｒｃ（ヌクレオチド位置［ｎｐ］１５６から５２３）に対しては、５'−ＴＡＣＧＡＴＴＴＡＴＴＴＧＣＴＧＡＴＧＴ−３'（配列番号５）及び５'−ＣＡＴＡＡＴＴＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＣＴ−３'（配列番号６）、また、ＤＮＡジャイレースＡサブユニット（ｇｙｒＡ）をコードする遺伝子（GenBank no. L04566、ｎｐ３７７から８５２）（Antimicrob. Agents Chemother. 37, 457-463, 1993）に対しては、５'−ＧＴＴＡＴＴＡＴＡＧＧＴＣＧＴＧＣＴＴＴ−３'（配列番号７）及び５'−ＣＴＡＴＧＡＧＧＴＧＧＧＡＴＧＴＴＴＧＴ−３'（配列番号８）を使用した。ｃＤＮＡに対するｇｙｒＡ遺伝子の増幅を、内部コントロールとして使用した。ｒｒｃの場合には２０サイクルであることを除いては、上述のＰＣＲ条件下で、ｒｒｃ及びｇｙｒＡ遺伝子をそれぞれ増幅するために、ｃＤＮＡの０．５μｌ及び０．２５μｌの一定量を使用した。ｒｒｃ及びｇｙｒＡの３６８ｂｐ及び４７６ｂｐのＰＣＲ産物を、それぞれアガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。
【００３１】
［好気ストレスアッセイ］
発酵槽中のC. jejuni９１３１の２４時間培養液を、５００ｍｌ容量のフラスコに移し、大気中の条件下で、１５０ｒｐｍで振盪してインキュベーションした。これらの培養物からC. jejuni９１３１を収集し、上記の通り、ＣＦＵ測定、粗製抽出物の調製及び全ＲＮＡ単離を行なった。
【００３２】
［ｒｒｃのアクセッション・ナンバー］
ｒｒｃ遺伝子のヌクレオチド配列データは、ＤＤＢＪデータベースに提出されており、アクセッション・ナンバーＡＢ０９０３１０にて、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ及びGenBankのヌクレオチド配列データベースで見ることができる。
【００３３】
［Ｒｒｃのスーパーオキシドジズムターゼ活性の測定］
組換えＲｒｃタンパク質のスーパーオキシドジズムターゼ活性は、キサンチン−キサンチン オキシダーゼ（xanthine-xanthine oxidase）によって生成されるスーパーオキシドアニオンラジカル（・Ｏ２ −）が、Ｒｒｃの添加により減少することで評価した。溶液中のスーパーオキシドアニオンラジカルはニトロブルーテトラゾリウム（nitroblue tetrazolium；ＮＢＴ）によって検出し、３０〜９０秒間のスーパーオキシドアニオンラジカルの発生率（ΔA）を算出し、タンパク質非添加群のΔAを１００％としたとき、これに対するタンパク質添加群のΔAの割合（% inhibition）で示した。
【００３４】
（結果）
［Ｈ２Ｏ２ストレスがC. jejuni９１３１の生存性及び全タンパク質に及ぼす影響］
C. jejuni９１３１の生存性は、Ｈ２Ｏ２ストレスに対して高感受性を示した（図１）。１．０又は０．５ｍＭのＨ２Ｏ２で１５分間インキュベーションすると、C. jejuniのコロニー形成能は急激に低下した。その後、１．０ｍＭのＨ２Ｏ２で処理したC. jejuniのコロニー形成能は、４時間で検出レベル以下に低下したが、０．５ｍＭのＨ２Ｏ２で処理したC. jejuniのコロニー形成能は、２〜４時間後に初期レベルまで回復した。様々な濃度で１５分間、Ｈ２Ｏ２で処理した後に、C. jejuniから全細菌タンパク質を抽出し、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、その後、クーマシーブリリアントブルーで染色した。この結果、約２７ｋＤａの分子量を持つタンパク質が、Ｈ２Ｏ２の濃度に応じて減少した（図２）。すなわち、２７ｋＤａタンパク質の消失は、Ｈ２Ｏ２で処理した後のコロニー形成能の低下を伴なった（図１）。本発明者らの実験条件下では、分子量４５ｋＤａのＭＯＭＰの細胞レベルは安定しており、Ｈ２Ｏ２の存在又は非存在による影響を受けなかった。そこで、本発明者らは、このタンパク質を内部標準として使用した。Ｈ２Ｏ２添加後に８時間インキュベーションした際の２７ｋＤａタンパク質の量の変化を、ＭＯＭＰの量に対する相対量で表した（図３）。０．５ｍＭのＨ２Ｏ２処理においては、コロニー形成能が回復したが（図１）、一度消失した２７ｋＤａタンパク質は、８時間の間には回復しなかった。
【００３５】
［２７ｋＤａタンパク質の同定］
C. jejuni９１３１の細胞成分を遠心分離して分画した。２７ｋＤａタンパク質は、１００,０００×ｇで６０分間の分画において主として見い出され、このタンパク質が細胞質タンパク質であることが示唆された（図４）。また、Ｎ末端アミノ酸の最初の１２残基の配列を決定し（ＭＲＱＹＥＴＹＫＣＱＫＣ）、C. jejuniゲノム配列ＢＬＡＳＴ検索プログラムで検索にかけた。配列は、C. jejuniＮＣＴＣ１１１６８のゲノム配列（Nature 403, 665-668, 2000）におけるＣｊ００１２ｃのＮ末端と一致した。
【００３６】
２７ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び配列決定を行なうため、Ｃｊ００１２ｃをコードするＯＲＦに基づき、ＰＣＲプライマーを設計した。配列分析を行なった結果、２７ｋＤａタンパク質をコードするＯＲＦの６４８ヌクレオチド配列が、Ｃｊ００１２ｃのそれと１００％一致すること（計算した分子量、２４,５２６Ｄａ）が明らかとなった。C. jejuniにおいて、Ｃｊ００１２ｃは遺伝子配列としてはデータベースに登録されてはいるものの、機能及び性状に関する報告はなく、２７ｋＤａタンパク質の機能は分からなかった。他の細菌種における類似したタンパク質を調査するために、２７ｋＤａタンパク質をコードするＯＲＦの２１５のアミノ酸配列を、ＤＤＢＪデータベースのＦＡＳＴＡ検索プログラムにかけた。ＦＡＳＴＡ検索プログラムにより、酸化ストレス防御タンパク質として考えられている２つの非ヘム鉄タンパク質との高い相同性が示された。アミノ酸２１５残基の２７ｋＤａタンパク質は、Ｒｂｏ（rubredoxin oxidoreductase）（別名desulfoferrodoxin）と相同性を示すＮ末端の最初の３２残基と、Ｒｂｒ（rubrerythrin）と相同性を示すＣ末端の残りの１８３残基から構成されている（図５）。最初の３２残基は、ＲｂｏのＮ末端と相同性を示した。すなわち、Desulfovibrio vulgaris（Hildenborough）Ｒｂｏに対しては６９％の同一性（J. Bacteriol. 1989, 4996-5004, 1989）、また、Moorella thermoaceticaＲｂｏに対しては５３．９％の同一性（J. Bacteriol. 183, 1560-1567, 2001）を示した。残りの１８３残基は、Ｒｂｒの全領域と相同性を示した（図５）。すなわち、Clostridium acetobutylicumＲｂｒに対しては４５．７％の同一性（J. Bacteriol. 183, 4823-4838, 2001）、Porphyromonas gingivalisＲｂｒに対しては４５．４％の同一性（Mol. Microbiol. 44, 479-488, 2002）、M. thermoaceticaＲｂｒに対しては４２．９％の同一性（J. Bacteriol. 183, 1560-1567, 2001）、D. vulgaris（Hildenborough）Ｒｂｒに対しては３９．５％の同一性（Biochemistry 30, 11118-11123, 1991）、ウェルシュ菌（C. perfringens）Ｒｂｒに対しては３８．３％の同一性（J. Bacteriol. 178, 7152-7158, 1996）を示した。
【００３７】
D. vulgarisＲｂｏのＦｅＳ４クラスター鉄結合部位のＣ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１５−Ｃ−Ｃモチーフ（J. Bacteriol. 1989, 4996-5004, 1989）は、２７ｋＤａタンパク質のＲｂｏ領域に保存されていた（Ｃｙｓ９−Ｘ２−Ｃｙｓ１２−Ｘ１５−Ｃｙｓ２８−Ｃｙｓ２９、図５）。D. vulgarisＲｂｒの、非硫黄でオキソ架橋した二鉄結合部位のＥ−Ｘ３０−３４−Ｅ−Ｘ２−Ｈ−Ｘｎ−Ｅ−Ｘ３０−３４−Ｅ−Ｘ２−Ｈモチーフ、及びＦｅＳ４クラスター鉄結合部位のＣ−Ｘ２−Ｃ−Ｘ１２−Ｃ−Ｘ２−Ｃモチーフ（Nat. Struct. Biol. 6, 539-546, 1996、Biochem. Biophys. Res. Commun. 181, 337-341, 1991、Biochemistry 30, 11118-11123, 1991）は、タンパク質のＲｂｒ領域に保存されていた（それぞれ、Ｇｌｕ５２−Ｘ３２−Ｇｌｕ８５−Ｘ２−Ｈｉｓ８８−Ｘ３０−Ｇｌｕ１１９−Ｘ３３−Ｇｌｕ１５３−Ｘ２−Ｈｉｓ１５６及びＣｙｓ１８３−Ｘ２−Ｃｙｓ１８６−Ｘ１２−Ｃｙｓ１９９−Ｘ２−Ｃｙｓ２０２、図５）。従って、本発明者らは、ここで２７ｋＤａタンパク質をＲｒｃ（C. jejuniのrubredoxin oxidoreductase／rubrerythrin様タンパク質（rubredoxin oxidoreductase/rubrerythrin-like protein of C. jejuni））と名付けた。
【００３８】
なお、図５中、ＤｖＲｂｏは、Desulfovibrio vulgarisのＲｂｏ配列（アクセッション・ナンバーＭ２８８４８）であり、ＭｔＲｂｏは、Moorella thermoaceticaのＲｂｏ配列（ＡＦ２０２３１６）である。また、ＣａＲｂｒは、Clostridium acetobutylicum（アクセッション・ナンバーＡＥ００７７５５）のＲｂｒ配列であり、ＣｐＲｂｒは、C. perfringensのＲｂｒ配列（Ｘ９２８４４）であり、ＤｖＲｂｒは、D. vulgarisのＲｂｒ配列（Ｕ８２３２３）であり、ＭｔＲｂｒは、M. thermoaceticaのＲｂｒ配列（アクセッション・ナンバーＡＦ２０２３１６）であり、ＰｇＲｂｒはPorphyromonas gingivalisのＲｂｒ配列（ＡＦ３３３３２３）である。また、アスタリスクは、アミノ酸残基の一致した箇所を示す。また、ボックスはD. vulgarisの鉄リガンドを示す。矢印は、ＲｒｃのＯＲＦにおけるプライマーのアニーリング部位及びプライマーの方向を示す。
【００３９】
［Ｈｉｓ−タグ組換えＲｒｃの分光学的特質］
Ｒｒｃの酸化還元活性について調べるため、本発明者らは、大腸菌で組換えタンパク質を作製した。Ｈｉｓ−タグ組換えＲｒｃを、ＩＰＴＧ誘導で大腸菌において過剰発現させ、そのタンパク質を変性させることなく精製した（図６）。組換えD. vulgarisＲｂｒは、大腸菌においては封入体を形成すると報告されているが（Biochemistry 34, 3310-3318, 1995）、本発明者らが作製した組換えＲｒｃは、可溶性タンパク質として見い出された。組換えＲｒｃのＵＶ−可視部吸収スペクトルは、７４０、４８８、３７０及び２７９ｎｍでピークを示し、５７０及び３５０ｎｍでショルダー（shoulder）を示した。一方、亜ジチオン酸塩還元型の組換えＲｒｃは、可視領域においてほとんど吸収が見られなかった（図７）。精製したＲｒｃ及びその還元型における吸収スペクトルは、Ｒｂｏ（J. Biol. Chem. 265, 21596-21602, 1990）及びＲｂｒ（Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 317-323, 1999、Biochemistry. 34, 3310-3318, 1995、Biochemistry. 27, 1636-1642, 1988）の吸収スペクトルと類似していた。
【００４０】
［Ｒｒｃの発現における鉄の濃度の影響］
カタラーゼ（ＫａｔＡ）及びアルキルヒドロペルオキシド還元酵素（ＡｈｐＣ）をコードする、C. jejuni過酸化物ストレス防御遺伝子は、鉄に反応してＰｅｒＲ（過酸化物応答レギュレーター）により抑制された（J. Bacteriol. 181, 4798-4804, 1999、J. Bacteriol. 181, 6371-6376, 1999）。C. jejuniにおけるＣｊ００１２ｃ遺伝子の上流の配列を分析した結果、この領域においてＰｅｒ ｂｏｘ（ＰｅｒＲ結合配列）相同配列が見い出された。そこで、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により、転写レベルにおけるｒｒｃ発現に対する鉄の影響について調べた。Staphylococcus aureusにおいては、ハウスキーピング遺伝子ｇｙｒを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の内部コントロールとして使用することに成功した（Infect. Immun. 68, 1304-1311, 2000）。従って、本発明者らは、この遺伝子をC. jejuniのコントロールとして使用し、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによってｒｒｃ及びｇｙｒＡ転写物の内部領域、３６８及び４７６ｂｐのそれぞれを増幅した。Ｒｒｃの発現は、転写レベルで鉄の濃度に依存して誘導された（図８）。
【００４１】
［Ｈ２Ｏ２のストレス下にあるｒｒｃの転写分析］
転写レベルにおけるｒｒｃ発現に対するＨ２Ｏ２の影響を、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析により調べた。ｒｒｃ転写物は、０．５ｍＭのＨ２Ｏ２で処理したC. jejuniの場合でも発現していた（図９）。一方、コロニー形成能の回復にもかかわらず、Ｒｒｃタンパク質はＨ２Ｏ２添加８時間後までは回復しなかった（図３）。これらの結果は、Ｈ２Ｏ２ストレスによるＲｒｃの減少が、転写レベルで制御されているのではないことを示唆する。それに対して、１．０ｍＭのＨ２Ｏ２で処理したC. jejuniのｒｒｃ転写物もｇｙｒＡ転写物も、４時間では検出されなかった。１．０ｍＭのＨ２Ｏ２で処理したC. jejuniの全ＲＮＡ質の変質が見られ、コロニー形成能は検出限界以下であった。これらの結果から、１．０ｍＭのＨ２Ｏ２の処理によるｒｒｃ転写物の著しい減少は、菌細胞死によることが示唆される。
【００４２】
［Ｒｒｃの発現に対する好気ストレスの影響］
C. jejuni９１３１の増殖及びＲｒｃタンパク質発現に対する好気ストレスの影響について調べた。大気中の酸素分圧下でフラスコ振盪をしてインキュベーションすることにより好気ストレスを与えた結果、C. jejuniは６時間後までは好気条件下でも生存したが、好気ストレスはその後、細胞のコロニー形成能に影響を及ぼした（図１０）。タンパク質プロフィールにより、Ｒｒｃタンパク質が、初期の３時間では著しい変化を見せなかったが、その後、コロニー形成能の低下と同時にその発現は減少したことが明らかとなった。同時に、細胞の全ＲＮＡの量が減少し、細胞が激しく破損したことを示唆した。本発明者らの分析によれば、ｒｒｃの転写レベルは、全ＲＮＡ質（quality）が低下した後まで著しく変化しなかった。
【００４３】
［Ｒｒｃのスーパーオキシドジズムターゼ活性］
組換えＲｒｃタンパク質のスーパーオキシドジズムターゼ活性の結果を図１１に示す。その結果、組換えＲｒｃタンパク質の添加（○）によって溶液中のスーパーオキシドアニオンラジカル（・Ｏ２ −）の減少が認められた。これに対して、６５℃で３０分間の熱処理により失活させた組換えＲｒｃタンパク質の添加（●）によるスーパーオキシドアニオンラジカルの減少は認められなかった。この結果から、Ｒｒｃのスーパーオキシドジズムターゼ活性が確認され、算出した活性の値は１０．９７Ｕ／ｍｇであった。この活性の値はホモロジーを示したタンパク質と同程度であった。一方、ポジティブコントロールとして用いたウシ赤血球由来のＳＯＤを添加（△）した場合、スーパーオキシドジズムターゼ活性は８６３３．４２Ｕ／ｍｇであった。これらの結果は、Ｒｒｃがウシ赤血球由来のＳＯＤと比べ約１／８００と弱いが、ホモロジーを示したタンパク質と同程度のスーパーオキシドジズムターゼ活性を持つことを示している。
【００４４】
（まとめ）
C. jejuniは、酸化ストレスに対して高い感受性を示し（Can. J. Microbiol. 25, 1-7, 1979、Can. J. Microbiol. 25, 8-16, 1979、J. Appl. Bacteriol. 59, 413-419, 1985）、その増殖及び生存のために微好気的な条件が必要であることが示唆されている。好気的な環境において、活性酸素は、代謝経路を通って細胞内で生成されると考えられているため、これら内因性の酸化ストレスは、C. jejuniにおけるいくつかのタンパク質を損傷するかも知れない。本発明者らは、内因性及び外因性の起源の両方から、C. jejuniの酸化ストレスに対する反応について調べた。また、この細菌がこれらの条件下でどのように増殖及び／又は生存するかについても調べた。まず、様々な濃度の外因性Ｈ２Ｏ２ストレスは、急激で強い毒性の結果を示し（図１）、酸化的な代謝経路を通して細胞内で発生した内因性Ｈ２Ｏ２ストレスは、より緩やかな誘導ではあったが細菌に対して著しい毒性を示した（図１０）。また、電気泳動分析により、Ｈ２Ｏ２ストレスにより、２７ｋＤａの分子量を持つタンパク質は、生存性の低下と同時かつ急激に消失したことが明らかとなった（図２）。このタンパク質の減少について、好気的な条件下で培養した際に類似性が見い出された。すなわち、好気ストレスによりC. jejuniのコロニー形成能が低下した際に、２７ｋＤａタンパク質はより緩やかではあるが減少した（図１０）。これらの結果は、C. jejuniが内因性及び外因性の起源の両方による酸化ストレスに反応し、コロニー形成能及び２７ｋＤａタンパク質の量の低下を招くことを示唆している。
【００４５】
C. jejuniは、有毒な活性酸素種を除去するため、スーパーオキシド・ジスムターゼ、カタラーゼ及びアルキル・ヒドロペルオキシド還元酵素を有しており（Microbiology. 141, 1369-1376, 1995、Infect. Immun. 62, 2687-2694, 1994、Microbiology 140, 1203-1208, 1994）、これらの酵素は、好気的な環境における生存のために重要な役割を果たすと考えられている（Infect. Immun. 68, 6337-6345, 2000、J. Bacteriol. 65, 2540-2546, 1999）。実際に、本発明者らによる好気ストレスアッセイにおいては、２、３のタンパク質が生存している間（６時間まで）に発現が誘導され、そのうちのいくつかがこれら除去酵素に類似した分子量を持っていた。しかしこれらについてはまだ同定されていない。（以下青は削除）また、C. jejuniの呼吸活性はかなり高いため（Can. J. Microbiol. 25, 1-7, 1979）、細菌が好気的な自然環境中において生存する場合、好気代謝において過剰に生成される活性酸素の連続的な酸化ストレスを受ける可能性がある。従って、好気ストレスによるコロニー形成能の低下ばかりでなく、２７ｋＤａタンパク質の減少も、これら分解酵素活性の能力を超えるであろう、過剰な内因性活性酸素の連続的な酸素ストレスが原因のようである。従って、外因性のＨ２Ｏ２ストレスの曝露により、好気的な環境における活性酸素の内因的な生産から始まる、その活性酸素に対する不定期の反応ではなく共通の反応から、２７ｋＤａタンパク質における敏感な変化をもたらした。
【００４６】
本発明者らによる外因性Ｈ２Ｏ２ストレスアッセイにおいて、コロニー形成能の著しい回復が観察された（図１）。この現象は、細菌が数時間以内に１０４倍という急速な分裂をすることができないことから、（以下青は削除）コロニー形成能の回復が、増殖適格細胞に対する１５分間のストレスを与えた後のコロニー形成能を失った細胞が急激にコロニー形成能を回復することに起因している可能性を示している。しかしながら、新たなタンパク質の同時発現を含め、回復の原因となるかも知れないタンパク質においては著しい変化が見られず、現在のところはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって検出されていない。
【００４７】
本発明者らは、C. jejuniに対する活性酸素の有害な影響は微好気的な代謝において重要な役割を果たす特定のタンパク質が活性酸素に対して敏感に反応するためであると考え、ここで同定した２７ｋＤａタンパク質がその特定のタンパク質であると仮定した。すなわち、本発明者らは、２７ｋＤａタンパク質を同定し、それがC. jejuniゲノム配列（Nature 403, 665-668, 2000）に見られるＣｊ００１２ｃと同一であることを見い出した。しかしながら、上記データベースにはＣｊ００１２ｃの機能についての情報が不足しているため、本発明者らは、２７ｋＤａタンパク質の機能について知ることができなかった。しかしながら、ゲノム分析を行なった結果、２７ｋＤａタンパク質は、他の細菌が有する２つの既知の非ヘム鉄硫黄タンパク質、すなわちＲｂｏ及びＲｂｒと相同性を示す配列を持つことがわかった（図５）。アミノ酸２１５残基の２７ｋＤａタンパク質であるＲｒｃは、２つの領域から構成されている。すなわち、Ｒｂｏと相同性を示すＮ末端３２残基、及びＲｂｒと相同性を示すＣ末端１８３残基である。従って、Ｒｒｃは、Ｒｂｏ及びＲｂｒの両タンパク質のキメラ構造を有する。Ｒｂｏ及びＲｂｒの役割は、好気的な微生物における酸化ストレス反応に関して主として研究されてきた。Desulfoarculus baarsiiから得たＲｂｏは、インビトロでスーパーオキシド還元酵素活性を示し（J. Biol. Chem. 275, 115-121, 2000）、D. vulgarisＲｂｏ又はD. baarsiiＲｂｏの過剰発現は、スーパーオキシド・ジスムターゼ欠損大腸菌の・Ｏ２ −ストレス感受性を補完した（J. Bacteriol. 183, 101-108, 2001、J. Bacteriol. 178, 6736-6742, 1996）。それに対し、D. vulgarisＲｂｒは、インビトロでＨ２Ｏ２から水への還元を触媒する、ＮＡＤＨペルオキシダーゼを示し（Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 317-323, 1999）、その過剰発現によってカタラーゼ欠損大腸菌のＨ２Ｏ２ストレス敏感性を補完した（J. Bacteriol. 183, 101-108, 2001）。近年、P. gingivalisＲｂｒの遺伝子ノックアウト株の作製により、Ｈ２Ｏ２ストレスに対するＲｂｒの防御的役割が確認された（Mol. Microbiol. 44, 479-488, 2002）。微好気性細菌において、Spirillum volutansのＨ２Ｏ２耐性変異体が、Ｒｂｒと相同性を示すタンパク質を発現した（J. Appl. Microbiol. 85, 875-882, 1998）。Ｒｒｃのアミノ酸配列には、D. vulgarisのＲｂｏ及びＲｂｒの鉄結合モチーフが保存されており、従って、これらの領域に鉄が組み込まれている可能性がある。Ｎ末端３２残基にも鉄結合モチーフが存在するため、Ｒｒｃは、Ｒｂｒ及びＲｂｏよりもモチーフを１つ多く含み、その結果、３つの推定上の鉄結合部位を持つ。分光学的分析を行なった結果、精製したＲｒｃ及びその還元型のＵＶ−可視部吸収スペクトルは、D. vulgarisＲｂｏ及びＲｂｒそれぞれのスペクトルと同様の変化を示すことが明らかとなった（Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 317-323, 1999、Biochemistry. 34, 3310-3318, 1995、Biochemistry. 27, 1636-1642, 1988、J. Biol. Chem. 265, 21596-21602, 1990）（図７）。この結果は、Ｒｒｃが鉄を含み、酸化還元反応の機能に関連することを示唆している。Ｒｂｏ及びＲｂｒのアミノ酸配列及び分光学的特質の類似性に基づき、Ｒｒｃは、これら２つの相同タンパク質が持つ２つの機能を実行する可能性が大きい。
【００４８】
ＳＯＤ及びカタラーゼなど、既知の活性酸素除去酵素の発現は、酸化ストレスに反応して誘導されることが知られている（Biochem. Pharmacol. 59, 1-6, 2000）。Ｒｒｃが、これらのような活性酸素の除去酵素であるならば、それは酸化ストレスに誘導されるか、又は少なくとも酸化ストレス下で安定することが期待されている。しかしながら、Ｒｒｃタンパク質は、Ｈ２Ｏ２の曝露下においてその発現は減少した。これらの結果は、Ｒｒｃの性状が、上記の一般的な活性酸素除去酵素の性状とは異なることを示唆している。またＲｒｃの発現は培地中の鉄によって誘導され、この発現システムはｋａｔＡ及びａｈｐＣなどの過酸化物ストレスに対する防御遺伝子のそれとは異なっていた（図８）。ｋａｔＡ及びａｈｐＣなどの過酸化物ストレスに対する防御遺伝子は、鉄の濃度の増加によって発現を抑圧されるとされている（J. Bacteriol. 181, 4798-4804, 1999、J. Bacteriol. 180, 5291-5298, 1998、J. Bacteriol. 181, 6371-6376, 1999）。
【００４９】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行なった結果、２７ｋＤａタンパク質のＨ２Ｏ２ストレスに対する敏感な反応が、転写後に調整されることが分かった（図９）。活性酸素は、ポリペプチド鎖の開裂などのタンパク質の修飾や、ヒスチジン、システイン又はチロシンなどのアミノ酸残基の酸化を誘導し、また、そのようなタンパク質の修飾がタンパク質の酵素活性の減少又は分解の原因となることが知られている（Methods Ezymol. 258, 379-393, 1995）。鉄硫黄タンパク質のいくつかは、・Ｏ２ −に感受性を示すと報告されているが（Chem. Rev. 96, 2315-2334, 1996、J. Exp. Biol. 201, 1203-1209, 1998）、Ｒｒｃに鉄硫黄クラスターのモチーフが発見された。
【００５０】
【発明の効果】
本発明によれば、有害な活性酸素を速やかに除去することができる、酸化還元酵素活性を有するタンパク質である活性酸素除去酵素及びこれをコードする遺伝子を提供することができる。また、本発明の活性酸素除去酵素を用いた機能性食品を摂取することにより、生体に有害な活性酸素を非常に簡単に除去することができる。また、本発明の活性酸素除去酵素を用いた医薬品は、生体内から有害な活性酸素を除去するので、癌等の腫瘍、炎症等の疾病の予防・治療効果が期待できる。また、本発明の活性酸素除去酵素を用いた化粧品は、活性酸素に起因する肌の老化現象を予防しうる。
【００５１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＨ培地におけるC. jejuni９１３１の増殖（３７）に対する、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）添加の影響を示す図である。図中、（○）は０ｍＭ、(●)は０．２ｍＭ、(▲)は０．５ｍＭ、（■）は１．０ｍＭのＨ２Ｏ２をそれぞれ培地に添加した場合を示す。
【図２】ＭＨ培地におけるC. jejuni９１３１のタンパク質プロフィールに対する、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の影響を示す図である。図中、矢印は、Ｈ２Ｏ２に敏感な２７ｋＤａのタンパク質を示し、矢頭は、対照としての４５ｋＤａの主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）を示す。
【図３】 C. jejuni９１３１の２７ｋＤａタンパク質の発現量に対する、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の影響を示す図である。図中、(○）は０ｍＭ、(●）は０．２ｍＭ、(▲)は０．５ｍＭ、(■)は１．０ｍＭのＨ２Ｏ２をそれぞれ培地に添加した場合を示す。
【図４】分画遠心法により分画した、C. jejuni９１３１の２７ｋＤａタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】Ａは、本発明のＲｒｃと、Ｒｂｏ及びＲｂｒとの相同性領域の組成を示す模式図であり、Ｂは、本発明ののＲｒｃ及び他の細菌種のＲｂｏ及びＲｂｒのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図６】大腸菌Ｍ１５／pRrcHにおける組換えＲｒｃの発現及び精製の結果を示す図である。
【図７】精製した組換えＲｒｃタンパク質（実線）及び還元型（点線）のＵＶ可視性吸収スペクトルを示す図である。
【図８】ＭＨ培地における、C. jejuni９１３１のｒｒｃ転写物（ＲＴ−ＰＣＲ）の発現に及ぼす鉄の影響を示す図である。
【図９】Ｈ２Ｏ２で処理したC. jejuni９１３１におけるｒｒｃ発現の半量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図１０】ＭＨ培地における、C. jejuni９１３１の増殖及びＲｒｃタンパク質発現に対する好気ストレスの及ぼす影響を示す図である。
【図１１】本発明のＲｒｃのスーパーオキシドジズムターゼ活性の測定結果を示す図である。図中、(○)は組換えＲｒｃタンパク質、（●)は熱失活組換えＲｒｃタンパク質、(△）はウシ赤血球由来のＳＯＤをそれぞれ添加した場合を示す。
Claims (4)
- 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするスーパーオキシドジズムターゼ活性を有する酵素。
- 配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つスーパーオキシドジズムターゼ活性を有することを特徴とするスーパーオキシドジズムターゼ活性を有する酵素。
- 配列番号１に示される塩基配列からなり、スーパーオキシドジズムターゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
- 配列番号１に示される塩基配列の相補的配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下である６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理でハイブリダイズし、且つスーパーオキシドジズムターゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003016777A JP4299549B2 (ja) | 2003-01-24 | 2003-01-24 | 活性酸素除去酵素及びその遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003016777A JP4299549B2 (ja) | 2003-01-24 | 2003-01-24 | 活性酸素除去酵素及びその遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004222658A JP2004222658A (ja) | 2004-08-12 |
| JP4299549B2 true JP4299549B2 (ja) | 2009-07-22 |
Family
ID=32904117
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003016777A Expired - Fee Related JP4299549B2 (ja) | 2003-01-24 | 2003-01-24 | 活性酸素除去酵素及びその遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4299549B2 (ja) |
-
2003
- 2003-01-24 JP JP2003016777A patent/JP4299549B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004222658A (ja) | 2004-08-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bafana et al. | Superoxide dismutase: an industrial perspective | |
| Niebisch et al. | Purification of a Cytochromebc 1-aa 3 Supercomplex with Quinol Oxidase Activity from Corynebacterium glutamicum: IDENTIFICATION OF A FOURTH SUBUNIT OF CYTOCHROMEaa 3 OXIDASE AND MUTATIONAL ANALYSIS OF DIHEME CYTOCHROME c 1 | |
| Bursy et al. | Synthesis and uptake of the compatible solutes ectoine and 5-hydroxyectoine by Streptomyces coelicolor A3 (2) in response to salt and heat stresses | |
| Iwamoto et al. | Identification and cloning of a gene encoding tannase (tannin acylhydrolase) from Lactobacillus plantarum ATCC 14917T | |
| Santos et al. | Essential role of superoxide dismutase on the pathogenicity of Erwinia chrysanthemi strain 3937 | |
| Cheng et al. | The iron-cofactored superoxide dismutase of Edwardsiella tarda inhibits macrophage-mediated innate immune response | |
| Voyich et al. | Engagement of the pathogen survival response used by group A Streptococcus to avert destruction by innate host defense | |
| Ramya et al. | 15-Deoxyspergualin modulates Plasmodium falciparum heat shock protein function | |
| TW200950800A (en) | Use of defensins against tuberculosis | |
| Hwang et al. | Copper-and zinc-containing superoxide dismutase and its gene from Candida albicans | |
| Mermod et al. | Structure and function of CinD (YtjD) of Lactococcus lactis, a copper-induced nitroreductase involved in defense against oxidative stress | |
| Chung et al. | The siderophore repressor SreA maintains growth, hydrogen peroxide resistance, and cell wall integrity in the phytopathogenic fungus Alternaria alternata | |
| Loprasert et al. | Characterization and mutagenesis of fur gene from Burkholderia pseudomallei | |
| KR102035283B1 (ko) | 클로스트리디움 퍼프린젠스 용해능을 가진 내열성 엔도라이신 LysCPD2 | |
| Brehm et al. | A gene encoding a superoxide dismutase of the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes | |
| Rhie et al. | Manganese-containing superoxide dismutase and its gene from Candida albicans | |
| Ken et al. | Unusual stability of manganese superoxide dismutase from a new species, Tatumella ptyseos ct: its gene structure, expression, and enzyme properties | |
| Mancini et al. | A copper‐induced quinone degradation pathway provides protection against combined copper/quinone stress in L actococcus lactis IL 1403 | |
| Moore et al. | Interruption of the gpxA gene increases the sensitivity of Neisseria meningitidis to paraquat | |
| Morozov et al. | Flavin reductase contributes to pneumococcal virulence by protecting from oxidative stress and mediating adhesion and elicits protection against pneumococcal challenge | |
| Liu et al. | Cloning and heterologous expression of the manganese superoxide dismutase gene from Lactobacillus casei Lc18 | |
| Terzenbach et al. | Purification and characterization of a catalase from the nonsulfur phototrophic bacterium Rhodobacter sphaeroides ATH 2.4. 1 and its role in the oxidative stress response | |
| Tranchimand et al. | Biochemical and molecular characterization of a quercetinase from Penicillium olsonii | |
| JP4299549B2 (ja) | 活性酸素除去酵素及びその遺伝子 | |
| Kikuchi et al. | Novel stationary-phase-upregulated protein of Porphyromonas gingivalis influences production of superoxide dismutase, thiol peroxidase and thioredoxin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060113 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081007 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081205 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090108 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090305 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090406 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090417 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120424 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120424 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150424 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |