JP4268730B2

JP4268730B2 - Method for producing packing material for liquid chromatography

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Publication number: JP4268730B2
Application number: JP28030699A
Authority: JP
Inventors: 和之大石; 孝之岡
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1999-09-30
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2009-05-27
Anticipated expiration: 2019-09-30
Also published as: JP2001099820A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィー（以下、ＬＣと略記する）用充填剤の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
親水性のＬＣ用充填剤を用いたＬＣは、親水性物質の測定に極めて有益な測定方法であり、現在最も汎用されている分析手法の一つである。
特にその中でもイオン交換基を有するイオン交換用充填剤は、各種イオン性物質の分離に優れている。イオン交換基としては、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、３級アミノ基や４級アミノ基などがあげられる。
親水性のＬＣ用充填剤は、無機系あるいは有機系高分子粒子に、親水性基を導入することにより得ることができる。無機系高分子としてはシリカ、セラミックス、ガラスなど；有機高分子としてはポリスチレン系高分子やアクリル系高分子などの合成高分子系、ポリアミノ酸や多糖類などの天然高分子系などがあげられる。
【０００３】
上記無機系充填剤の主流であるシリカ系充填剤は、全充填剤の中で最も汎用されている充填剤であるが、中性以上のｐＨ条件におけるシリカ自体の溶出や、残存するシラノール基による吸着などの欠点が報告されている。
また、有機高分子系の中でも天然高分子よりなる充填剤は、親水性が大きく非特異吸着が少ない優れた充填剤であるが、機械的強度に乏しいため、高流速での測定が行えず、従って測定時間が大幅に延長されるという問題がある。
一方、有機合成高分子系の充填剤は、上記欠点が少なく、簡便な方法により製造できる。
【０００４】
このような有機合成高分子からなるＬＣ用充填剤として、例えばイオン交換基含有充填剤の製造方法としては、以下の２つの方法が開示されている。
（１）架橋性粒子に、イオン交換基含有化合物を反応させる方法。
すなわち、反応性官能基を有する架橋粒子に、該反応性官能基と反応する基およびイオン交換基を有する化合物を反応させることにより、上記架橋粒子にイオン交換基を導入する方法。具体的には、例えば、特開平１−２６２４６８号公報には、架橋粒子中の水酸基にカルボキシル基含有化合物、スルホン酸基含有化合物、アミノ基含有化合物を反応させる方法が開示されている。
【０００５】
（２）イオン交換基含有単量体を、架橋性単量体と共重合する方法。
例えば特公昭６３−５９４６３号公報には、親水性基であるカルボキシル基を含有単量体５〜９０重量％、架橋性単量体１０〜９５重量％、非架橋性単量体０〜８５重量％を混合して共重合する方法が開示されている。また、特公平８−７１９７号公報には、重合開始剤を含有する疎水性架橋重合体粒子の表面に、親水性基含有単量体を重合させる方法が開示されている。
【０００６】
しかしながら上記（１）の方法で得られたＬＣ用充填剤には、以下の問題点が指摘されている。
（１）の、後処理により親水性基を導入する方法においては、親水性基を有する化合物を定量的に導入することは困難であることが一般的に知られており、単量体由来の親水性基導入に比べ、製造の再現性の点で劣る（吉廻、細矢、木全、田中：Chromatography, 16(1) 7-12 (1995) ）。従って、ＬＣ用充填剤としての分離性能や、測定値がばらつくという欠点がある。また、後処理の方法が極めて煩雑で長時間を要する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
一方上記（２）の方法による充填剤には、このような欠点は少なく、親水性基含有単量体の添加量や重合条件を制御することにより、充填剤に対して定量的に親水性基を含有させることができ、また操作も簡便である。
【０００８】
しかし、イオン交換基含有単量体などの親水性単量体は、特に水系の分散媒を用いた重合系においては、分散媒中に溶解しやすいので、より疎水性である架橋性単量体と共重合しにくい。その結果、ＬＣ用充填剤とした場合に、測定試料との十分な相互作用を及ぼす官能基が導入できず、分離性能の低下を招くことになる。
そして、十分量の官能基を導入するために、親水性単量体の添加量を増やす方法が考えられるが、増やし過ぎると重合途中で凝集物を発生し、重合体が得られないという問題がある。
本発明は、上記問題点を解決すべく考案されたものであり、その目的は、重合反応の途中で凝集反応を起こすことなく、しかもＬＣ用充填剤として十分な官能基を有するよう親水性単量体を効率よく反応させる方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、請求項１の本発明では、親水性架橋重合体よりなる液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法において、架橋性単量体及び、親水性単量体を用いて重合開始剤の存在下で重合反応を行い、該重合反応における重合率が、８９〜９４％の範囲にある段階で重合系に有機溶媒を添加し、さらに重合を継続して親水性架橋重合体を得ることを特徴とする、液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供する。
また、請求項２の本発明では、親水性架橋重合体よりなる液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法において、架橋性単量体を用いて重合開始剤の存在下で重合反応を行い、該重合反応における重合率が、８９〜９４％の範囲にある段階で、重合系に親水性単量体及び、有機溶媒を添加し、さらに重合を継続して親水性架橋重合体を得ることを特徴とする、液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供する。
また、請求項３の本発明では、請求項１又は、２記載の親水性単量体が、イオン交換基含有単量体であることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法を提供する。
【００１０】
以下、本発明の詳細を説明する。
（１）架橋性単量体
本発明に用いられる架橋性単量体としては、１分子中に２個以上のビニル基を有する単量体であって、後述する親水性単量体よりも疎水性なものが好ましい。このような架橋性単量体としては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、ジビニルナフタレン等のスチレン誘導体；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサグリコールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチルロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチルロールメタンテトラ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルの誘導体；１，３−ブタジエン、イソプレン、１，４−ヘキサジエン等の脂肪族ジエン化合物；および上記単量体の誘導体などが挙げられる。その中でも、特に（メタ）アクリレート誘導体が好ましい。これらは、２種以上が混合されて用いられてもよい。
なお、例えば上記（メタ）アクリル酸エステルとは、アクリル酸エステル、又は、メタクリル酸エステルを意味する。
【００１１】
また、架橋重合体をより親水性化し、かつ耐膨潤性を良好に保つためには、水酸基などの親水性基を含む架橋性単量体を用いてもよい。
上記架橋性単量体としては、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体が好ましく、例えば、１分子中に少なくとも１個の水酸基と２個以上のビニル基を有する架橋性単量体が挙げられる。このような単量体としては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリルロキシプロパン、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデカン−２，６，１０−トリオールおよびこれらの誘導体類が挙げられる。これらは、２種以上が混合されて用いられてもよい。
【００１２】
これらの水酸基含有の架橋性単量体の使用量は、上記全架橋性単量体に占める割合が５０重量％以下であることが好ましい。これは、５０重量％より多くなると、重合体の親水性が増大し過ぎ、重合中に凝集が発生しやすくなるためである。
【００１３】
（２）親水性単量体
親水性単量体の親水性官能基は、架橋重合体の親水性を維持し、かつ測定試料と相互作用を及ぼし合う主要素となり、重合体表面の親水性官能基と測定試料の相互作用の結果、測定試料が各成分に分離される。
このため、用いられる親水性単量体は、本発明による充填剤を適用するＬＣの分離モードによって、以下のように選択される。
【００１４】
（２−１）イオン交換クロマトグラフィー用充填剤
上記充填剤には、１分子中に１個以上のイオン交換基を含有する親水性単量体を用いるのが好ましい。このような単量体としては、下記のものが挙げられる。
【００１５】
(1) カルボキシル基含有単量体：
上記カルボキシル基含有単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸、２- （メタ）アクリロイルオキシエチルコハク酸、クロトン酸、イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、マレイン酸、フマル酸およびこれらの誘導体などが挙げられる。
(2) リン酸基含有単量体：
上記リン酸基含有単量体としては、例えば、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（2-（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（3-（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェートおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
(3) スルホン酸基含有単量体：
上記スルホン酸基含有単量体としては、例えば、スチレンスルホン酸、（メタ）アリルスルホン酸、2-（メタ）アクリルアミド-2- メチルプロパンスルホン酸、２−スルホエチル（メタ）アクリレート、（３−スルホプロピル）- イタコン酸、3-スルホプロピル（メタ）アクリル酸およびこれらの誘導体などが挙げられる。
(4) ３級アミノ基含有単量体：
上記３級アミノ基含有単量体としては、例えば、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、2-ヒドロキシ-3- ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、N,N-ジメチル（メタ）アクリルアミド、およびこれらの誘導体などが挙げられる。
(5) ４級アミノ基含有単量体：
上記４級アミノ基含有単量体としては、例えば、2-（メタ）アクロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド、2-（メタ）アクロイルオキシエチルトリエチルアンモニウムクロライド、2-ヒドロキシ-3- （メタ）アクロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライドおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
【００１６】
（２−２）ゲル浸透クロマトグラフィー用充填剤
上記充填剤には、１分子中に１個以上の水酸基等のイオン性親水基、又は、エポキシ基等の非イオン性親水基を含有する親水性単量体を用いるのが好ましい。このような単量体としては、例えば、エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート、2-ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、2-ヒドロキシメチル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレートおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
【００１７】
（２−３）順相クロマトグラフィー用充填剤
上記充填剤には、１分子中に少なくとも１個の１〜２級アミノ基、シアノ基、水酸基などを有する親水性単量体を用いるのが好ましい。このような単量体としては、例えば、アリルアミン、（メタ）アクリルアミド、N-メチル（メタ）アクリルアミド、N-エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリロニトリルおよびこれらの誘導体などが挙げられる。
【００１８】
上記親水性単量体は、２種以上が混合されて用いられてもよく、さらに、上記親水性単量体の及びその各種誘導体は、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、塩化物などであってもよい。
また、上記親水性単量体は、各分離モードに限定される訳ではなく、他のモードに使用したり、他のモードに挙げた単量体と混合して用いることも可能である。
【００１９】
これらの親水性単量体の使用量は、上記架橋性単量体１００重量部に対して１０〜２００重量部が好ましい。１０重量部以下では、測定試料との十分な相互作用が発揮できず、その結果分離能が低下し、２００重量部以上では、親水性が大きくなり過ぎ耐圧性・耐膨潤性が低下する。また溶離液の切り替え時などには平衡化に長時間を要し、結果測定時間が延長される。
【００２０】
上記親水性基含有単量体は、上記単量体のほかに、化学反応により親水性基に変換しうる官能基を有する単量体を用い、重合終了後に、該化学反応を行い、親水性基に変換することでも、同様の親水性基含有重合体を調製し得る。
上記、化学反応としては、公知の反応を用いることができ、例えば、加水分解反応や転移反応などが用いられる。
また、上記化学反応によって変換し得る官能基としては、例えば、加水分解反応によってイオン交換基に変換し得る、エステル基などが挙げられる。
具体的には、例えばメチルメタクリレートを単量体として用い、重合後、アルカリ性下で加温する事により、エステル結合が分解してカルボキシル基に変化されることで、カチオン交換充填剤が調製し得る。
【００２１】
（３）充填剤の重合方法
（３−１）重合開始剤
本発明における重合開始剤としては、特に限定されず、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤が用いられる。上記重合開始剤の具体的な例としては、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩；クメンハイドロパーオキサイド、ベインゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘイサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイドなどの有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２’アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリルなどのアゾ化合物などが挙げられる。
上記重合開始剤の使用量は、上記架橋性単量体１００重量部に対し、０．０５〜５重量部が好ましい。重合開始剤の使用量が０．０５重量部未満になると、重合反応が不十分となったり、重合に長時間を要することがあり、５重量部を越えると、急激な反応の進行により、凝集物が発生することがある。
【００２２】
（３−２）有機溶媒
本発明で該重合反応における重合率が、８９〜９４％の範囲で添加する有機溶媒は、用いる架橋性単量体および親水性単量体によって異なるが、親水性単量体に対して良溶媒であることが好ましく、例えば、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコール類、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル等のエーテル類、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。
【００２３】
上記有機溶媒の使用量は、上記架橋性単量体１００重量部に対し、２０〜５００重量部が好ましい。有機溶媒の使用量が２０重量部未満になると、効果がなくなり、５００重量部を越えると、重合中に凝集しやすくなる。
【００２４】
（３−３）重合反応
本発明では、上記単量体を用いて、上記重合開始剤の存在下において重合反応を行う。
本発明における重合反応は、公知の重合方法、例えば乳化重合法、懸濁重合法などにより行われる。
例えば懸濁重合法を用いる場合には、水溶性分散剤を溶解した水性分散媒に、上記重合開始剤を溶解した上記架橋性単量体および親水性単量体の混合物を分散させ、攪拌後、窒素雰囲気下で昇温することにより重合反応を行わせることができる。
また重合反応において、まず架橋性単量体のみを用いて重合開始剤の存在下で重合を行い、重合反応の途中で、親水性単量体を添加しても良い。親水性単量体の途中添加の場合、その添加時期は、架橋性単量体混合物の重合率が８９〜９４％の範囲にある段階である。但し後述する有機溶媒と同時期に添加する必要はない。
【００２５】
また、本発明のＬＣ用充填剤に用いられる重合体の重合方法として、多段階反応による微粒子の合成方法が用いられてもよい。
すなわち、あらかじめ重合された粒度分布の揃った均一粒径重合体粒子に、上記単量体、または、これらの一部が吸収されて製造されることにより、粒径がより均一化される。ここでいう均一粒径重合体粒子とは、例えば上記非架橋性単量体などの単独重合体又は共重合体からなる非架橋重合体粒子などが挙げられ、スチレン重合体、（メタ）アクリル酸メチル重合体、（メタ）アクリル酸エチル重合体などである。
【００２６】
また、上記の粒径均一重合体粒子として、上記非架橋性単量体と上記架橋性単量体との共重合体である架橋共重合体粒子（例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体）も使用できるが、この場合は、架橋性単量体の割合を全単量体の１０重量％以下として共重合して得られる低架橋重合体粒子が好ましい。
【００２７】
上記の粒径均一重合体粒子の製造方法は公知の重合方法でよく、例えば乳化重合、ソープフリー重合、分散重合、懸濁重合などが挙げられる。
上記の粒径均一重合体粒子の平均粒径は、０．１〜１０μｍが好ましく、粒径のばらつきは変動係数（ＣＶ値）（＝標準偏差÷平均粒径×１００）として１５％以下が好ましい。
【００２８】
上記の粒径均一重合体粒子を本発明方法の重合反応に用いる場合の量は、上記架橋性単量体１００重量部に対して０．５〜１００重量部が好ましい。
上記の粒径均一重合体粒子を用いる場合には、該重合体粒子に、架橋性単量体（必要に応じて、非架橋性単量体も含む）と重合開始剤を吸収させて重合を進めることが好ましい。
【００２９】
また本発明に用いられる単量体は、必要に応じて、上記架橋性単量体以外の非架橋性単量体が構成単位の一部として混合されていてもよい。
上記非架橋性単量体としては、上記親水性単量体以外の、例えば、スチレン、α- メチルスチレン、p-メチルスチレン、クロロメチルスチレンなどのスチレン誘導体類；塩化ビニルなどの脂肪族系単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ステアリン酸ビニル等のビニルエステル類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、アクリロニトリルなど（メタ）アクリル酸誘導体類が挙げられる。
【００３０】
上記非架橋性単量体の量は、上記架橋性単量体１００重量部に対して１００重量部以下が好ましい。非架橋性単量体の量が１００重量部より多くなると、膨潤、収縮などがおこりやすくなり、複数の溶離液を用いた場合などに溶離液への平衡化に長時間を要するようになるためである。
【００３１】
また本発明の製造方法による充填剤は、通常、多孔質であるが、その孔径をより大きくするために、その重合反応時に多孔質化剤が用いられて製造されてもよい。
大孔径に多孔質化された重合体を製造する場合は、多孔質化剤として単量体を溶解するが、重合体を溶解しない有機溶媒を重合反応系に添加して重合する、公知の方法を用いることができる。このような多孔質化剤としては公知のものでよく、例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン等の飽和炭化水素；イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコール等のアルコール類などが挙げられる。
【００３２】
上記多孔質化剤の使用量は、多くなると、得られる重合体の耐圧性が低下し、膨潤、収縮し易くなり、また、重合中に凝集が発生し易くなるので、上記架橋性単量体１００重量部に対して、０〜１００重量部が好ましい。
本発明方法における重合反応の温度および時間は、使用する単量体および重合開始剤の種類や量などによって異なるが、４０〜１００℃、０．３〜２４時間程度である。
【００３３】
（３−４）重合率８９〜９４％での有機溶媒、親水性単量体の添加
本発明においては、上記架橋性単量体及び、親水性単量体の混合物を用いて重合開始剤存在下で重合反応を開始し、一定時間経過後、すなわち重合率が８９〜９４％の範囲にある段階で有機溶媒を添加する。
また、本発明においては、上記架橋性単量体を用いて重合開始剤存在下で重合反応を開始し、一定時間経過後、すなわち重合率が８９〜９４％の範囲にある段階で親水性単量体及び、有機溶媒を添加する。
【００３４】
重合率が７０％以下の段階で添加すると、未反応の単量体に溶解して細孔径を必要以上に大きくしたり、重合途中で凝集物が発生する可能性が大きくなるので好ましくない。また重合率が９８％以上の段階での添加は、重合反応が進行しすぎて、これらの添加の効果が現れにくい。
ここでの重合率の算出方法は、所定の重合時間経過後重合物を取り出し、水および有機溶媒で洗浄した後乾燥して、その乾燥重量を測定し、以下の式により求めることができる。
重合率（％）＝（得られた重合物の重量／単量体仕込量）×１００
【００３５】
本発明の有機溶媒の添加方法は特に限定されず、重合系に添加分を一括して添加しても良いし、数分〜数時間かけて添加してもよい。また添加時に重合系の温度を一度室温まで下げるなど、温度を変化させてもよい。
【００３６】
上記親水性架橋重合体を得るためには、有機溶媒、親水性単量体の添加を開始した後、あるいは添加終了後、さらに重合を継続する。この重合反応の温度および時間は、使用する単量体および重合開始剤の種類や量などによって異なるが、４０〜１００℃、０．３〜５０時間程度である。有機溶媒添加前と後で、これらの条件を変更してもよい。
以上の重合工程を経て得られた重合物を、水および有機溶媒等で洗浄して乾燥することにより親水性架橋重合体が得られる。
【００３７】
（４）親水性架橋重合体をＬＣ用充填剤とする
（４−１）充填剤の粒径
上記の重合工程により得られた親水性架橋重合体を、ＬＣ用充填剤とするには、粒径および粒度分布を一定の範囲となるよう調節する。
本発明のＬＣ用充填剤の好ましい平均粒径は０．５〜１００μｍであり、さらに好ましくは１〜２０μｍである。また粒径のばらつきはＣＶ値として４０％以下が好ましい。
また、得られた親水性架橋重合体の平均粒径および粒度分布が上記の範囲を逸脱する場合には、親水性架橋重合体粒子を、必要に応じて分級することにより、上記範囲に調節する。分級方法は、乾式又は湿式の公知の方法が用いら得る。
【００３８】
（４−２）本発明方法によるＬＣ用充填剤のカラムへの充填
本発明で得られたＬＣ用充填剤は、ステンレス製などのカラムに充填されてＬＣ測定に適用される。カラムへの充填に際しては、適宜に公知の方法を用いることができるが、充填剤を溶離液として用いる溶媒などの分散媒に所定量分散し、カラム内にパッカーなどを経由して圧入する湿式法（スラリー法）が特に好ましい。
【００３９】
（４−３）測定対象物質
本発明により得られるＬＣ用充填剤は、従来のＬＣ測定の手法における各種モードに適用させ得る。主な測定対象物質としては、従来から親水性充填剤により分離されていたものの全てである。特に、カテコールアミン誘導体類、ヌクレオチド類、ペプチド類、タンパク質類、糖類、多糖類などの生体関連物質が好適である。
また本発明により得られた充填剤は、上記以外にも各種前処理用カラムや、リガンドを固定化してアフィニティクロマトグラフィー用担体とすることもできる。
【００４０】
（４−４）ＬＣ装置
本発明により得られる充填剤が充填されたカラムを適用できるＬＣ装置は公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料導入装置、カラム、検出器などから構成され得る。また、これらに他の付属品（恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００４１】
（４−５）溶離液
本発明の充填剤を用いたＬＣ分析には、公知の溶離液が用いられ得る。例えば、以下の物質などを含む各種緩衝液などが挙げられる。リン酸、硝酸、塩酸、過塩素酸などの無機酸及びその塩類；酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸及びその塩類又はハロゲン化物類；水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基性物質。また、例えば、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、ジクロロメタン、メタノール、エタノール、ヘキサンなどの有機溶媒も使用可能であり、また、水若しくは上記緩衝液と有機溶媒の混合物も使用可能である。さらに公知の溶離液に添加される各種の化合物を添加することもできる。
【００４２】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示す。
（実施例１）
（カチオン交換用充填剤）
１，１０−ジメタクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール（架橋性単量体：共栄社化学社製）１００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体：新中村化学社製）３００ｇにベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤）１．５ｇを混合して溶解し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で１時間重合反応を行った（この時点での重合率は９３％であった）。重合後、反応系を３０℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（親水性単量体：東京化成工業社製）の５０％水溶液４００ｇおよびメタノール４００ｇを添加して３０℃で１時間撹拌した後、再び８０℃で１時間重合を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径６μｍの充填剤を得た。
【００４３】
（性能評価）
実施例１で得られた充填剤について、以下のように性能を評価した。
（１）ＬＣ用カラムの製造：
充填剤０．７ｇを採取し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍＬに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ²で定圧充填して、ＬＣ用カラムを製造した。
【００４４】
（２）タンパク質混合物の測定
実施例１で得られた充填剤を充填したカラムを用いて、タンパク質標準物質の混合物を測定した。

【００４５】
（測定試料）
ミオグロビン（図１のピーク１）、α−キモトリプシノーゲン（ピーク２）、リボヌクレアーゼＡ（ピーク３）、リゾチーム（ピーク４）（以上、いずれもＳｉｇｍａ社製）の混合物
【００４６】
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図１に示す。
各ピークが短時間で良好に分離されていることがわかる。
【００４７】
（３）ヒト血液中のヘモグロビン類の測定
実施例１で得られた充填剤を充填したカラムを用いて、糖尿病診断の指標となる、ヒト血液中のヘモグロビン（Ｈｂ）類を含むＨｂ類の測定を行った。
（測定条件）
システム：上記（２）タンパク質混合物の測定に用いたシステムと同様。
溶離液：リン酸塩及び過塩素酸塩を含む３種類の緩衝液によるステップグラディエント法で溶出した。
溶離液Ｃ：５０ｍＭ過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｄ：７０ｍＭ過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
溶離液Ｅ：２５０ｍＭ過塩素酸を含有する２０ｍＭコハク酸−２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
流速：１．５ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
【００４８】
（測定試料の調製）
健常人血を採血し、抗血液凝固剤として、フッ化ナトリウム１０ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。これに以下の処理を行い、ａ）糖負荷血試料；ｂ）カルバミル化Ｈｂ（ＣＨｂ）含有試料；ｃ）アセチル化Ｈｂ（ＡＨｂ）含有試料を調製した。
ａ）グルコースを５００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で５時間反応させ、次いで、溶血試薬（０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料ａ）とした。
ｂ）ＣＨｂ含有試料：健常人血１０ｍＬに、０．３％のシアン酸ナトリウムの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、３７℃で３時間反応させて、測定試料ｂ）とした。
ｃ）ＡＨｂ含有試料：健常人血１０ｍＬに、０．３％のアセトアルデヒドの生理食塩水溶液１ｍＬを添加し、室温で３時間反応させて、測定試料ｃ）とした。
【００４９】
（測定結果）
試料ａ）を測定した結果、得られたクロマトグラムを図２−ａ）に示す。
図２−ａ）中の各ピークは、ヘモグロビンＡ１ａ及びｂ（ＨｂＡ１ａ及びｂ：ピーク１１）；ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ：ピーク１２）；不安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１３）；安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１４）；ヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０：ピーク１５）を示す。
ＨｂＦ（ピーク１２）及び糖尿病診断の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃピーク（ピーク１４）の良好な定量性が確保されるためには、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０の順に溶出される必要があるが、図２−ａ）ではこの順序通りに各ピークが溶出し、高濃度の不安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１３）を、安定型ＨｂＡ１ｃから良好に、しかも短時間に分離できた。
試料ｂ）およびｃ）を測定した結果を、それぞれ図２−ｂ）およびｃ）に示す。図２−ｂ）およびｃ）中において、各ピークはＣＨｂ（ピーク１６）；ＡＨｂ（ピーク１７）を示す。いずれのピークも安定型ＨｂＡ１ｃから良好に分離された。
【００５０】
（４）重合ロット間差の評価：
実施例１の重合条件において、重合ロット毎の性能差を以下のようにして確認した。
上記と同様の重合条件にて３０回（３０ロット）重合を行い、得られた充填剤３０ロット間の性能のバラツキをみた。上記（３）のヒト血液中のヘモグロビン類の測定を、それぞれのロットについて行い、安定型ＨｂＡ１ｃ（ピーク１４）の保持時間を調べた。
３０ロットの平均保持時間は、０．９分、標準偏差は０．０８分であり、ＣＶ値（％）＝８．９％であり、実施例１の製造方法は、製造再現性に優れていることが判った。
【００５１】
（実施例２）
（アニオン交換用充填剤）
ジエチルアミノエチルメタクリレート（親水性単量体：和光純薬社製）２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体：新中村化学社製）４００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：キシダ化学社製）１．５ｇを混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で重合反応を行った。２時間後（重合率９０％）、メタノール１００ｇを反応系に添加してさらに８０℃で３時間重合反応を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径６μｍの充填剤を得た。
【００５２】
（タンパク質混合物の測定）
実施例２で得られた充填剤を実施例１と同様に充填したカラムを用いて、タンパク質標準物質の混合物を測定した。

【００５３】
（測定試料）
ミオグロビン（ピーク１）、α−キモトリプシノーゲン（ピーク２）、リゾチーム（ピーク４）（以上、いずれもＳｉｇｍａ社製）の混合物
【００５４】
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図３に示す。
各ピークが短時間で良好に分離されていることがわかる。
【００５５】
（実施例３）
（ＧＰＣ用充填剤）
２−ヒドロキシエチルメタクリレート（親水性単量体：和光純薬社製）１００ｇ、メチルメタクリレート（非架橋性単量体：和光純薬社製）１００ｇ、テトラエチレングリコールジメタクリレート３００ｇ、トルエン（多孔質化剤）４００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合し、２．５リットルの６重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で重合反応を行った。１．５時間後（重合率８９％）、エタノール１５０ｇを反応系に添加し、さらに８０℃で２時間重合反応を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径６μｍの充填剤を得た。
【００５６】
（ポリエチレングリコール類の測定）
実施例３で得られた充填剤を実施例１と同様に充填したカラムを用いて、糖類混合物を測定した。

（測定試料）
各分子量を有するポリエチレングリコール（以上、いずれも和光純薬社製）
【００５７】
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図４に示す。
図中のピークは、分子量２００〜７５００のポリエチレングリコール（ピーク３１〜３７）；エチレングリコール（ピーク３８）を示す。
各ピークが短時間で良好に分離されていることがわかる。
【００５８】
（実施例４）
（順相クロマトグラフィー）
１，１０−ジメタクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール（架橋性単量体：共栄社化学社製）１００ｇ、メチルメタクリレート１００ｇ、テトラエチレングリコールジメタクリレート（架橋性単量体：新中村化学社製）３００ｇにベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤）１．５ｇを混合して溶解し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で１時間重合反応を行った（重合率９４％）。重合後、反応系を３０℃に冷却した後、アクリルアミド（親水性単量体：和光純薬社製）の２００ｇおよびメタノール３００ｇを添加して３０℃で１時間撹拌した後、再び８０℃で１時間重合を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径６μｍの充填剤を得た。
【００５９】
（糖類混合物の測定）
実施例４で得られた充填剤を実施例１と同様に充填したカラムを用いて、糖類混合物を測定した。
（測定条件）
システム：実施例３に同じ
溶離液：アセトニトリル：水＝７５：２５の混合液
流速：１．２ｍｌ／分
試料注入：１０μｍ
【００６０】
（測定試料）
フルクトース（ピーク４１）、グルコース（ピーク４２）、シュークロース（ピーク４３）、マルトース（ピーク４４）（以上、いずれも和光純薬社製）の混合物
（測定結果）
得られたクロマトグラムを図５に示す。
各ピークが短時間で良好に分離されていることがわかる。
【００６１】
（比較例１）
（実施例１において、有機溶媒を添加しなかった例）
実施例１において、メタノールを用いなかった以外は、同様に操作を行い、平均粒径６μｍの充填剤を得た。
実施例１と同様にタンパク質混合物の測定を行った結果を図６に示す。また実施例１と同様にヘモグロビン類の測定を行った結果を図７に示す。親水性単量体の重合率が低いため十分な保持力が得られず、各ピークが分離しなかった。この低分離能は、溶離液の溶出力を弱めて、各ピークを図１あるいは図２と同様の保持時間に溶出させた場合でも解消されなかった。
【００６２】
（比較例２）
（親水性単量体の添加量を増やした例）
比較例１において、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸の５０％水溶液４００ｇを用いた代わりに、同水溶液を８００ｇ用いた以外は、同様に操作を行った。
比較例１において、親水性単量体の重合率が低かったため、親水性単量体の添加量を増やして重合反応を行ったところ、重合の途中で凝集物が発生し、生成物を得ることができなかった。
【００６３】
【発明の効果】
本発明は、上記構成よりなるので、重合反応の途中で凝集反応を起こすことがないため、製造時の歩留まりの低下がなくなるだけでなく、しかもＬＣ用充填剤として十分な官能基を有するよう親水性単量体を効率よく反応できるため、均一な性能を持つ充填剤微粒子を得られる。
また、重合反応が一連の操作で完了するため、従来の後処理によるイオン交換基導入方法と比べ操作が簡便なだけでなく、導入率の制御も容易であり、良好な再現性が得られる。
さらに必要なイオン交換基を充填剤表面に均一にかつ十分に導入することができるため、何れのＬＣ測定のモードにおいても適度な保持力が得られ、分離性能に優れている。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１により得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図２】実施例１により得られた充填剤を用いて、ヘモグロビン類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】実施例２により得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】実施例３により得られた充填剤を用いて、ポリエチレングリコール類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図５】実施例４により得られた充填剤を用いて、単糖類混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図６】実施例１により得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図７】比較例１により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【符号の説明】
１ミオグロビンのピーク
２ α−キモトリプシノーゲンのピーク
３リボヌクレアーゼＡのピーク
４リゾチームのピーク
１１ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク
１２ＨｂＦのピーク
１３不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
１４安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
１５ＨｂＡ０のピーク
１６ＣＨｂのピーク
１７ＡＨｂのピーク
３１〜３７ポリエチレングリコールのピーク
３８エチレングリコールのピーク
４１フルクトースのピーク
４２グルコースのピーク
４３シュークロースのピーク
４４マルトースのピーク[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a filler for liquid chromatography (hereinafter abbreviated as LC).
[0002]
[Prior art]
LC using a hydrophilic LC filler is a very useful measurement method for measuring hydrophilic substances, and is one of the most widely used analytical methods at present.
In particular, an ion exchange filler having an ion exchange group is excellent in separating various ionic substances. Examples of the ion exchange group include a carboxyl group, a sulfonic acid group, a phosphoric acid group, a tertiary amino group, and a quaternary amino group.
The hydrophilic LC filler can be obtained by introducing a hydrophilic group into inorganic or organic polymer particles. Examples of inorganic polymers include silica, ceramics, and glass; examples of organic polymers include synthetic polymers such as polystyrene polymers and acrylic polymers, and natural polymers such as polyamino acids and polysaccharides.
[0003]
Silica-based fillers, which are the mainstream of the above-mentioned inorganic fillers, are the most widely used fillers among all fillers, but they are due to elution of silica itself under neutral pH conditions or residual silanol groups. Disadvantages such as adsorption have been reported.
In addition, among organic polymers, fillers made of natural polymers are excellent fillers with high hydrophilicity and low non-specific adsorption, but due to their poor mechanical strength, they cannot be measured at high flow rates. Therefore, there is a problem that the measurement time is greatly extended.
On the other hand, the organic synthetic polymer filler has few the above-mentioned drawbacks and can be produced by a simple method.
[0004]
As LC fillers composed of such organic synthetic polymers, for example, the following two methods are disclosed as methods for producing ion-exchange group-containing fillers.
(1) A method in which an ion-exchange group-containing compound is reacted with crosslinkable particles.
That is, a method of introducing an ion exchange group into the crosslinked particle by reacting a crosslinked functional particle having a reactive functional group with a compound having a reactive functional group and a compound having an ion exchange group. Specifically, for example, JP-A-1-262468 discloses a method in which a hydroxyl group in a crosslinked particle is reacted with a carboxyl group-containing compound, a sulfonic acid group-containing compound, and an amino group-containing compound.
[0005]
(2) A method of copolymerizing an ion exchange group-containing monomer with a crosslinkable monomer.
For example, Japanese Examined Patent Publication No. 63-59463 discloses a carboxyl group which is a hydrophilic group, 5 to 90% by weight of a monomer, 10 to 95% by weight of a crosslinkable monomer, and 0 to 85% by weight of a non-crosslinkable monomer. % Is a method of copolymerization. Japanese Patent Publication No. 8-7197 discloses a method of polymerizing a hydrophilic group-containing monomer on the surface of a hydrophobic crosslinked polymer particle containing a polymerization initiator.
[0006]
However, the following problems have been pointed out in the LC filler obtained by the method (1).
In the method (1) of introducing a hydrophilic group by post-treatment, it is generally known that it is difficult to quantitatively introduce a compound having a hydrophilic group. Compared to the introduction of hydrophilic groups, the reproducibility of production is inferior (Yoshimu, Hosoya, Kizen, Tanaka: Chromatography, 16 (1) 7-12 (1995)). Accordingly, there are disadvantages in that the separation performance as an LC filler and the measured values vary. Further, the post-processing method is extremely complicated and requires a long time.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
On the other hand, the filler obtained by the above method (2) has few such disadvantages. By controlling the addition amount of the hydrophilic group-containing monomer and the polymerization conditions, the hydrophilic group can be quantitatively compared with the filler. Can be contained, and the operation is also simple.
[0008]
However, hydrophilic monomers such as ion exchange group-containing monomers are more hydrophobic, especially in a polymerization system using an aqueous dispersion medium. Difficult to copolymerize with. As a result, when an LC filler is used, a functional group that exerts sufficient interaction with the measurement sample cannot be introduced, leading to a decrease in separation performance.
And, in order to introduce a sufficient amount of functional groups, a method of increasing the amount of hydrophilic monomer added can be considered, but if it is excessively increased, an agglomerate is generated in the middle of polymerization, and a polymer cannot be obtained. is there.
The present invention has been devised to solve the above-mentioned problems, and the object of the present invention is not to cause an agglomeration reaction during the polymerization reaction and to have a hydrophilic simple substance so as to have a sufficient functional group as a filler for LC. It is to provide a method for reacting a monomer efficiently.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, according to the present invention of claim 1, in the method for producing a filler for liquid chromatography comprising a hydrophilic cross-linked polymer, polymerization is performed using a cross-linkable monomer and a hydrophilic monomer. Performing the polymerization reaction in the presence of an initiator, the polymerization rate in the polymerization reaction, 89-94 An organic solvent is added to the polymerization system at a stage in the range of%, and further, the polymerization is continued to obtain a hydrophilic crosslinked polymer, and a method for producing a filler for liquid chromatography is provided.
According to the present invention of claim 2, in the method for producing a filler for liquid chromatography comprising a hydrophilic cross-linked polymer, a polymerization reaction is carried out in the presence of a polymerization initiator using a cross-linkable monomer, The polymerization rate in the reaction is 89-94 % Of a filler for liquid chromatography, characterized in that a hydrophilic monomer and an organic solvent are added to the polymerization system at a stage in the range of%, and the polymerization is further continued to obtain a hydrophilic crosslinked polymer. A manufacturing method is provided.
The present invention of claim 3 provides a method for producing a packing material for liquid chromatography, wherein the hydrophilic monomer of

claim

1 or 2 is an ion exchange group-containing monomer. To do.
[0010]
Details of the present invention will be described below.
(1) Crosslinkable monomer
The crosslinkable monomer used in the present invention is preferably a monomer having two or more vinyl groups in one molecule, which is more hydrophobic than the hydrophilic monomer described later. Examples of such a crosslinkable monomer include styrene derivatives such as divinylbenzene, divinyltoluene, divinylxylene, divinylethylbenzene, and divinylnaphthalene; ethylene glycol di (meth) acrylate, polyethylene glycol di (meth) acrylate, 1, 3-butylene glycol di (meth) acrylate, 1,6-hexaglycol di (meth) acrylate, neopentyl glycol di (meth) acrylate, propylene glycol di (meth) acrylate, polypropylene glycol di (meth) acrylate, trimethylolethane Tri (meth) acrylate, trimethylolpropane tri (meth) acrylate, tetramethylolpropane tri (meth) acrylate, tetramethylol methanetri (meth) acrylate And derivatives of (meth) acrylic esters such as tetramethyllol methanetetra (meth) acrylate; aliphatic diene compounds such as 1,3-butadiene, isoprene and 1,4-hexadiene; and derivatives of the above monomers Etc. Among these, (meth) acrylate derivatives are particularly preferable. Two or more of these may be mixed and used.
For example, the (meth) acrylic acid ester means an acrylic acid ester or a methacrylic acid ester.
[0011]
Moreover, in order to make the crosslinked polymer more hydrophilic and keep good swelling resistance, a crosslinkable monomer containing a hydrophilic group such as a hydroxyl group may be used.
The crosslinkable monomer is preferably a crosslinkable monomer having one or more hydroxyl groups in one molecule. For example, a crosslinkable monomer having at least one hydroxyl group and two or more vinyl groups in one molecule. A monomer is mentioned. Examples of such monomers include 2-hydroxy-1,3-di (meth) acryloxypropane, 1,10-di (meth) acryloxy-4,7-dioxadecane-2,9-diol, , 10-di (meth) acryloxy-5-methyl-4,7-dioxadecane-2,9-diol, 1,11-di (meth) acryloxy-4,8-dioxaundecane-2,6,10-triol And derivatives thereof. Two or more of these may be mixed and used.
[0012]
The amount of these hydroxyl group-containing crosslinking monomers used is preferably 50% by weight or less based on the total crosslinking monomer. This is because when the amount exceeds 50% by weight, the hydrophilicity of the polymer is excessively increased and aggregation tends to occur during the polymerization.
[0013]
(2) hydrophilic monomer
The hydrophilic functional group of the hydrophilic monomer is the main element that maintains the hydrophilicity of the cross-linked polymer and interacts with the measurement sample, and the interaction between the hydrophilic functional group on the polymer surface and the measurement sample. As a result, the measurement sample is separated into each component.
For this reason, the hydrophilic monomer used is selected as follows according to the separation mode of the LC to which the filler according to the present invention is applied.
[0014]
(2-1) Filler for ion exchange chromatography
It is preferable to use a hydrophilic monomer containing one or more ion exchange groups in one molecule for the filler. Examples of such monomers include the following.
[0015]
(1) Carboxyl group-containing monomer:
Examples of the carboxyl group-containing monomer include (meth) acrylic acid, 2- (meth) acryloyloxyethyl succinic acid, crotonic acid, itaconic acid, citraconic acid, mesaconic acid, maleic acid, fumaric acid, and derivatives thereof. Etc.
(2) Phosphate group-containing monomer:
Examples of the phosphoric acid group-containing monomer include ((meth) acryloyloxyethyl) acid phosphate, (2- (meth) acryloyloxyethyl) acid phosphate, (3- (meth) acryloyloxypropyl) acid phosphate, and These derivatives are exemplified.
(3) Sulfonic acid group-containing monomer:
Examples of the sulfonic acid group-containing monomer include styrene sulfonic acid, (meth) allyl sulfonic acid, 2- (meth) acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid, 2-sulfoethyl (meth) acrylate, (3-sulfo Propyl) -itaconic acid, 3-sulfopropyl (meth) acrylic acid and derivatives thereof.
(4) Tertiary amino group-containing monomer:
Examples of the tertiary amino group-containing monomer include dimethylaminoethyl (meth) acrylate, diethylaminoethyl (meth) acrylate, 2-hydroxy-3-dimethylaminopropyl (meth) acrylate, N, N-dimethyl (meth) ) Acrylamide and derivatives thereof.
(5) Quaternary amino group-containing monomer:
Examples of the quaternary amino group-containing monomer include 2- (meth) acryloyloxyethyltrimethylammonium chloride, 2- (meth) acryloyloxyethyltriethylammonium chloride, 2-hydroxy-3- (meth) acrylic. And yloxypropyltrimethylammonium chloride and derivatives thereof.
[0016]
(2-2) Filler for gel permeation chromatography
As the filler, it is preferable to use a hydrophilic monomer containing one or more ionic hydrophilic groups such as a hydroxyl group or a nonionic hydrophilic group such as an epoxy group in one molecule. Examples of such monomers include ethylene glycol mono (meth) acrylate, propylene glycol mono (meth) acrylate, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, 2-hydroxymethyl (meth) acrylate, and glycidyl (meth) acrylate. And derivatives thereof.
[0017]
(2-3) Packing agent for normal phase chromatography
As the filler, it is preferable to use a hydrophilic monomer having at least one primary or secondary amino group, cyano group, hydroxyl group or the like in one molecule. Examples of such monomers include allylamine, (meth) acrylamide, N-methyl (meth) acrylamide, N-ethyl (meth) acrylamide, N-isopropyl (meth) acrylamide, (meth) acrylonitrile, and derivatives thereof. Etc.
[0018]
Two or more hydrophilic monomers may be used as a mixture, and the hydrophilic monomers and various derivatives thereof are salts such as sodium salts and potassium salts, chlorides and the like. May be.
Moreover, the said hydrophilic monomer is not necessarily limited to each isolation | separation mode, It can also be used for another mode, and can be mixed with the monomer quoted in the other mode.
[0019]
The amount of these hydrophilic monomers used is preferably 10 to 200 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the crosslinkable monomer. When the amount is 10 parts by weight or less, sufficient interaction with the measurement sample cannot be exhibited, and as a result, the separation performance is lowered. When the amount is 200 parts by weight or more, the hydrophilicity becomes too high and the pressure resistance and swelling resistance are lowered. Also, when switching the eluent, it takes a long time for equilibration, and the measurement time is extended.
[0020]
In addition to the monomer, the hydrophilic group-containing monomer is a monomer having a functional group that can be converted into a hydrophilic group by a chemical reaction. A similar hydrophilic group-containing polymer can also be prepared by converting to a group.
As the chemical reaction, a known reaction can be used. For example, a hydrolysis reaction or a transfer reaction is used.
Moreover, as a functional group which can be converted by the said chemical reaction, the ester group etc. which can be converted into an ion exchange group by a hydrolysis reaction are mentioned, for example.
Specifically, for example, by using methyl methacrylate as a monomer and heating under alkalinity after polymerization, an ester bond is decomposed and converted into a carboxyl group, whereby a cation exchange filler can be prepared. .
[0021]
(3) Filler polymerization method
(3-1) Polymerization initiator
The polymerization initiator in the present invention is not particularly limited, and a known water-soluble or oil-soluble radical polymerization initiator is used. Specific examples of the polymerization initiator include persulfates such as potassium persulfate, sodium persulfate, and ammonium persulfate; cumene hydroperoxide, bainzoyl peroxide, lauroyl peroxide, octanoyl peroxide, o-chloro Benzoyl peroxide, acetyl peroxide, t-butyl hydroperoxide, t-butyl peroxyacetate, t-butyl peroxyisobutyrate, 3,5,5-trimethylhexanoyl peroxide, t-butylperoxy-2 Organic peroxides such as ethyl heisanoate and di-t-butyl peroxide; 2,2′-azobisisobutyronitrile, 2,2′-azobis (2,4-dimethylvaleronitrile), 4, 4'-azobis (4-cyanopentanoic acid), 2,2'a Bis (2-methylbutyronitrile), and the like azo compounds such as azo-bis-cyclohexane carbonitrile.
The amount of the polymerization initiator used is preferably 0.05 to 5 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the crosslinkable monomer. When the amount of the polymerization initiator used is less than 0.05 parts by weight, the polymerization reaction may be insufficient, or the polymerization may take a long time. Things may be generated.
[0022]
(3-2) Organic solvent
In the present invention, the polymerization rate in the polymerization reaction is 89-94 %, The organic solvent to be added varies depending on the crosslinkable monomer and the hydrophilic monomer used, but is preferably a good solvent for the hydrophilic monomer, such as methanol, ethanol, propanol, etc. Alcohols, aromatic hydrocarbons such as toluene and xylene, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, ethers such as dimethyl ether and diethyl ether, and dimethylformamide.
[0023]
The amount of the organic solvent used is preferably 20 to 500 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the crosslinkable monomer. When the amount of the organic solvent used is less than 20 parts by weight, the effect is lost, and when it exceeds 500 parts by weight, aggregation tends to occur during the polymerization.
[0024]
(3-3) Polymerization reaction
In the present invention, a polymerization reaction is performed using the monomer in the presence of the polymerization initiator.
The polymerization reaction in the present invention is performed by a known polymerization method such as an emulsion polymerization method or a suspension polymerization method.
For example, when the suspension polymerization method is used, a mixture of the crosslinkable monomer and the hydrophilic monomer in which the polymerization initiator is dissolved is dispersed in an aqueous dispersion medium in which the water-soluble dispersant is dissolved, and after stirring The polymerization reaction can be carried out by raising the temperature in a nitrogen atmosphere.
In the polymerization reaction, first, polymerization may be performed using only a crosslinkable monomer in the presence of a polymerization initiator, and a hydrophilic monomer may be added during the polymerization reaction. In the case of the intermediate addition of the hydrophilic monomer, the addition time is determined by the polymerization rate of the crosslinkable monomer mixture. 89-94 % Is in the range of%. However, it is not necessary to add at the same time as the organic solvent described later.
[0025]
In addition, as a method for polymerizing the polymer used in the LC filler of the present invention, a method for synthesizing fine particles by a multistage reaction may be used.
That is, the above-mentioned monomer or a part thereof is absorbed into the uniform particle size polymer particles having a uniform particle size distribution that has been polymerized in advance, whereby the particle size is made more uniform. The uniform particle size polymer particles referred to here include, for example, non-crosslinked polymer particles made of a homopolymer or copolymer such as the non-crosslinkable monomer, and the like, such as styrene polymer, (meth) acrylic acid. Examples thereof include a methyl polymer and an ethyl (meth) acrylate polymer.
[0026]
Moreover, as said uniform particle size particle | grains, the cross-linked copolymer particle (for example, styrene-divinylbenzene copolymer) which is a copolymer of the said non-crosslinkable monomer and the said crosslinkable monomer is also used. In this case, low cross-linked polymer particles obtained by copolymerization with the proportion of the cross-linkable monomer being 10% by weight or less of the total monomers are preferred.
[0027]
The production method of the above uniform particle size polymer particles may be a known polymerization method, and examples thereof include emulsion polymerization, soap-free polymerization, dispersion polymerization, and suspension polymerization.
The average particle size of the above uniform particle size polymer particles is preferably 0.1 to 10 μm, and the variation in particle size is preferably 15% or less as a coefficient of variation (CV value) (= standard deviation ÷ average particle size × 100). .
[0028]
The amount of the polymer particles having a uniform particle size used in the polymerization reaction of the method of the present invention is preferably 0.5 to 100 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the crosslinkable monomer.
In the case of using the above uniform particle size polymer particles, the polymer particles are polymerized by absorbing a crosslinkable monomer (including a non-crosslinkable monomer if necessary) and a polymerization initiator. It is preferable to proceed.
[0029]
Moreover, the monomer used for this invention may mix the non-crosslinkable monomer other than the said crosslinkable monomer as a part of structural unit as needed.
Examples of the non-crosslinkable monomer include those other than the hydrophilic monomer, for example, styrene derivatives such as styrene, α-methylstyrene, p-methylstyrene, chloromethylstyrene, and aliphatic single monomers such as vinyl chloride. Mer; vinyl esters such as vinyl acetate, vinyl propionate, vinyl stearate; methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, propyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, butyl methacrylate (Meth) acrylic acid esters such as 2-hydroxyethyl (meth) acrylate; (meth) acrylic acid derivatives such as (meth) acrylamide and acrylonitrile.
[0030]
The amount of the non-crosslinkable monomer is preferably 100 parts by weight or less with respect to 100 parts by weight of the crosslinkable monomer. If the amount of the non-crosslinkable monomer exceeds 100 parts by weight, swelling and shrinkage are likely to occur, and it takes a long time to equilibrate to the eluent when using a plurality of eluents. It is.
[0031]
The filler according to the production method of the present invention is usually porous, but may be produced using a porosifying agent during the polymerization reaction in order to increase the pore size.
In the case of producing a polymer having a large pore size, a known method in which a monomer is dissolved as a porosifying agent, but an organic solvent that does not dissolve the polymer is added to the polymerization reaction system for polymerization. Can be used. Such a porosifying agent may be a known one, for example, aromatic hydrocarbons such as toluene, xylene, diethylbenzene and dodecylbenzene; saturated hydrocarbons such as hexane, heptane, octane and decane; isoamyl alcohol and hexyl. Examples include alcohols such as alcohol and octyl alcohol.
[0032]
When the amount of the porosifying agent used is increased, the pressure resistance of the resulting polymer is lowered, and the polymer is liable to swell and shrink, and moreover, aggregation is likely to occur during the polymerization. 0-100 weight part is preferable with respect to 100 weight part.
The temperature and time of the polymerization reaction in the method of the present invention vary depending on the monomer used and the type and amount of the polymerization initiator, but are about 40 to 100 ° C. and about 0.3 to 24 hours.
[0033]
(3-4) Polymerization rate 89-94 % Addition of organic solvent, hydrophilic monomer
In the present invention, a polymerization reaction is started in the presence of a polymerization initiator using a mixture of the crosslinkable monomer and the hydrophilic monomer, and after a certain period of time, that is, the polymerization rate is 89-94 The organic solvent is added at a stage in the range of%.
Further, in the present invention, the cross-linking monomer is used to start a polymerization reaction in the presence of a polymerization initiator, and after a certain period of time, that is, the polymerization rate is 89-94 %, The hydrophilic monomer and the organic solvent are added.
[0034]
If it is added at a stage where the polymerization rate is 70% or less, it is not preferable because it dissolves in an unreacted monomer to increase the pore size more than necessary, or the possibility that aggregates are generated during the polymerization increases. In addition, when the polymerization rate is 98% or more, the polymerization reaction proceeds too much, and the effects of these additions are unlikely to appear.
The method for calculating the polymerization rate here can be obtained from the following equation by taking out the polymer after a predetermined polymerization time has elapsed, washing it with water and an organic solvent, drying it, measuring its dry weight.
Polymerization rate (%) = (weight of polymer obtained / monomer charge amount) × 100
[0035]
The addition method of the organic solvent of the present invention is not particularly limited, and the addition may be added all at once to the polymerization system, or may be added over several minutes to several hours. Further, the temperature may be changed such that the temperature of the polymerization system is once lowered to room temperature during the addition.
[0036]
In order to obtain the hydrophilic crosslinked polymer, the polymerization is further continued after the addition of the organic solvent and the hydrophilic monomer is started or after the addition is completed. The temperature and time of this polymerization reaction vary depending on the monomer used and the type and amount of the polymerization initiator, but are about 40 to 100 ° C. and about 0.3 to 50 hours. These conditions may be changed before and after the addition of the organic solvent.
The polymer obtained through the above polymerization step is washed with water and an organic solvent and dried to obtain a hydrophilic crosslinked polymer.
[0037]
(4) Use hydrophilic crosslinked polymer as filler for LC
(4-1) Particle size of filler
In order to use the hydrophilic cross-linked polymer obtained by the above polymerization step as a filler for LC, the particle size and particle size distribution are adjusted to be in a certain range.
The average particle diameter of the LC filler of the present invention is preferably 0.5 to 100 μm, more preferably 1 to 20 μm. The variation in particle size is preferably 40% or less as the CV value.
Moreover, when the average particle diameter and particle size distribution of the obtained hydrophilic crosslinked polymer deviate from the above range, the hydrophilic crosslinked polymer particles are adjusted to the above range by classification as necessary. . As the classification method, a known method such as a dry method or a wet method can be used.
[0038]
(4-2) Packing the LC packing material into the column by the method of the present invention
The LC packing material obtained in the present invention is packed in a column made of stainless steel and applied to LC measurement. A well-known method can be appropriately used for filling the column, but a wet method in which a predetermined amount is dispersed in a dispersion medium such as a solvent used as an eluent, and the column is press-fitted into the column via a packer or the like. (Slurry method) is particularly preferred.
[0039]
(4-3) Substances to be measured
The LC filler obtained by the present invention can be applied to various modes in the conventional LC measurement technique. The main substances to be measured are all those conventionally separated by a hydrophilic filler. In particular, biologically relevant substances such as catecholamine derivatives, nucleotides, peptides, proteins, saccharides and polysaccharides are suitable.
In addition to the above, the packing material obtained by the present invention can be used as a support for affinity chromatography by immobilizing various pretreatment columns and ligands.
[0040]
(4-4) LC device
The LC device to which the column filled with the packing material obtained by the present invention can be applied may be a known one, and may be composed of, for example, a liquid feed pump, a sample introduction device, a column, a detector, and the like. In addition, other accessories (such as a thermostatic bath or an eluent degassing device) may be attached as appropriate.
[0041]
(4-5) Eluent
A known eluent can be used for LC analysis using the filler of the present invention. Examples thereof include various buffer solutions containing the following substances. Inorganic acids such as phosphoric acid, nitric acid, hydrochloric acid, perchloric acid and salts thereof; Organic acids such as acetic acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, citric acid and salts or halides thereof; sodium hydroxide, potassium hydroxide, etc. Basic substance. In addition, for example, organic solvents such as acetone, acetonitrile, dioxane, dichloromethane, methanol, ethanol, and hexane can be used, and water or a mixture of the above buffer solution and an organic solvent can also be used. Furthermore, various compounds added to known eluents can also be added.
[0042]
【Example】
Examples of the present invention are shown below.
Example 1
(Cation exchange filler)
1,10-dimethacryloxy-4,7-dioxadecane-2,9-diol (crosslinkable monomer: manufactured by Kyoeisha Chemical Co., Ltd.) 100 g, triethylene glycol dimethacrylate (crosslinkable monomer: manufactured by Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) 300 g And 1.5 g of benzoyl peroxide (polymerization initiator) were mixed and dissolved, and dispersed in 2.5 liters of a 4 wt% polyvinyl alcohol aqueous solution. The temperature was raised with stirring under a nitrogen atmosphere, and a polymerization reaction was carried out at 80 ° C. for 1 hour (the polymerization rate at this point was 93%). After the polymerization, the reaction system was cooled to 30 ° C., and 400 g of 50% aqueous solution of 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid (hydrophilic monomer: manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and 400 g of methanol were added to the mixture at 30 ° C. The mixture was stirred at 80 ° C. for 1 hour and then polymerized again for 1 hour.
After polymerization, it was washed and classified to obtain a filler having an average particle size of 6 μm.
[0043]
(Performance evaluation)
About the filler obtained in Example 1, performance was evaluated as follows.
(1) Manufacture of LC column:
0.7 g of filler was collected, dispersed in 30 mL of 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), sonicated for 5 minutes, and then well stirred. The entire amount was injected into a packer (Umeya Seiki Co., Ltd.) connected with a stainless steel empty column (4.6φ × 35 mm). A liquid feed pump (manufactured by Sanuki Industry Co., Ltd.) is connected to the packer, and the pressure is 200 kg / cm. ² The LC column was manufactured by packing at a constant pressure.
[0044]
(2) Measurement of protein mixture
Using the column packed with the packing material obtained in Example 1, a mixture of protein standards was measured.

[0045]
(Measurement sample)
A mixture of myoglobin (peak 1 in FIG. 1), α-chymotrypsinogen (peak 2), ribonuclease A (peak 3), lysozyme (peak 4) (all of which are manufactured by Sigma)
[0046]
(Measurement result)
The obtained chromatogram is shown in FIG.
It can be seen that each peak is well separated in a short time.
[0047]
(3) Measurement of hemoglobins in human blood
Using the column packed with the packing material obtained in Example 1, Hb containing hemoglobin (Hb) in human blood, which is an index for diabetes diagnosis, was measured.
(Measurement condition)
System: (2) Same as the system used for the measurement of the protein mixture.
Eluent: Eluted by a step gradient method using three types of buffers including phosphate and perchlorate.
Eluent C: 20 mM succinic acid-20 mM phosphate buffer (pH 5.3) containing 50 mM perchloric acid
Eluent D: 20 mM succinic acid-20 mM phosphate buffer (pH 5.3) containing 70 mM perchloric acid
Eluent E: 20 mM succinic acid-20 mM phosphate buffer (pH 8.0) containing 250 mM perchloric acid
Flow rate: 1.5mL / min
Detection wavelength: 415 nm
[0048]
(Preparation of measurement sample)
Healthy human blood was collected and added as an anticoagulant to a concentration of 10 mg / ml sodium fluoride. This was subjected to the following treatments to prepare a) a glucose-loaded blood sample; b) a carbamylated Hb (CHb) -containing sample; c) an acetylated Hb (AHb) -containing sample.
a) Glucose was added to 500 mg / dL, reacted at 37 ° C. for 5 hours, and then a hemolytic reagent (0.1 wt% polyethylene glycol mono-4-octylphenyl ether (Triton X-100) (Tokyo Kasei) Hemolysis was performed with a phosphate buffer solution (pH 7.0)), and the sample was diluted 150 times to obtain a measurement sample a).
b) CHb-containing sample: 1 mL of a 0.3% sodium cyanate physiological saline solution was added to 10 mL of healthy human blood and reacted at 37 ° C. for 3 hours to obtain a measurement sample b).
c) AHb-containing sample: 1 mL of a physiological saline solution of 0.3% acetaldehyde was added to 10 mL of healthy human blood and allowed to react at room temperature for 3 hours to obtain a measurement sample c).
[0049]
(Measurement result)
As a result of measuring sample a), the resulting chromatogram is shown in FIG.
Each peak in FIG. 2-a) shows hemoglobin A1a and b (HbA1a and b: peak 11); hemoglobin F (HbF: peak 12); unstable HbA1c (peak 13); stable HbA1c (peak 14); hemoglobin A0 (HbA0: peak 15) is shown.
In order to ensure good quantitativeness of HbF (peak 12) and stable HbA1c peak (peak 14), which is an index for diagnosis of diabetes, it is necessary to elute HbF, unstable HbA1c, stable HbA1c, and HbA0 in this order. However, in FIG. 2A, each peak was eluted in this order, and the high concentration unstable HbA1c (peak 13) could be separated from the stable HbA1c well in a short time.
The results of measuring samples b) and c) are shown in FIGS. 2-b) and c), respectively. In FIGS. 2-b) and c), each peak represents CHb (peak 16); AHb (peak 17). All peaks were well separated from the stable HbA1c.
[0050]
(4) Evaluation of difference between polymerization lots:
Under the polymerization conditions of Example 1, the performance difference for each polymerization lot was confirmed as follows.
Polymerization was carried out 30 times (30 lots) under the same polymerization conditions as described above, and variations in performance among the 30 fillers obtained were observed. The measurement of hemoglobins in human blood (3) above was performed for each lot, and the retention time of stable HbA1c (peak 14) was examined.
The average holding time of 30 lots is 0.9 minutes, the standard deviation is 0.08 minutes, and the CV value (%) is 8.9%. The manufacturing method of Example 1 is excellent in manufacturing reproducibility. I found out.
[0051]
(Example 2)
(Filler for anion exchange)
200 g of diethylaminoethyl methacrylate (hydrophilic monomer: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 400 g of diethylene glycol dimethacrylate (crosslinkable monomer: Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) and benzoyl peroxide (polymerization initiator: manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.) 1 0.5 g was mixed and dispersed in 2.5 liters of an aqueous solution of 4% by weight polyvinyl alcohol (manufactured by Nippon Synthetic Chemical). The temperature was raised with stirring under a nitrogen atmosphere, and a polymerization reaction was carried out at 80 ° C. After 2 hours (polymerization rate 90%), 100 g of methanol was added to the reaction system, and the polymerization reaction was further performed at 80 ° C. for 3 hours.
After polymerization, it was washed and classified to obtain a filler having an average particle size of 6 μm.
[0052]
(Measurement of protein mixture)
A mixture of protein standards was measured using a column packed with the packing material obtained in Example 2 in the same manner as in Example 1.

[0053]
(Measurement sample)
A mixture of myoglobin (Peak 1), α-chymotrypsinogen (Peak 2), lysozyme (Peak 4) (all of which are manufactured by Sigma)
[0054]
(Measurement result)
The obtained chromatogram is shown in FIG.
It can be seen that each peak is well separated in a short time.
[0055]
(Example 3)
(GPC filler)
2-hydroxyethyl methacrylate (hydrophilic monomer: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 g, methyl methacrylate (non-crosslinkable monomer: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 100 g, tetraethylene glycol dimethacrylate 300 g, toluene (porous) Agent) 400 g and benzoyl peroxide 1.5 g were mixed and dispersed in 2.5 liters of an aqueous solution of 6% by weight polyvinyl alcohol (manufactured by Nippon Synthetic Chemical). The temperature was raised with stirring under a nitrogen atmosphere, and a polymerization reaction was carried out at 80 ° C. After 1.5 hours (a polymerization rate of 89%), 150 g of ethanol was added to the reaction system, and a polymerization reaction was further performed at 80 ° C. for 2 hours.
After polymerization, it was washed and classified to obtain a filler having an average particle size of 6 μm.
[0056]
(Measurement of polyethylene glycols)
The saccharide mixture was measured using a column packed with the filler obtained in Example 3 in the same manner as in Example 1.

(Measurement sample)
Polyethylene glycol having each molecular weight (all are manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
[0057]
(Measurement result)
The obtained chromatogram is shown in FIG.
The peaks in the figure indicate polyethylene glycol (peaks 31 to 37) having a molecular weight of 200 to 7500; ethylene glycol (peak 38).
It can be seen that each peak is well separated in a short time.
[0058]
(Example 4)
(Normal phase chromatography)
1,10-dimethacryloxy-4,7-dioxadecane-2,9-diol (crosslinkable monomer: manufactured by Kyoeisha Chemical Co., Ltd.) 100 g, methyl methacrylate 100 g, tetraethylene glycol dimethacrylate (crosslinkable monomer: Shin-Nakamura Chemical) 300 g) was mixed with 1.5 g of benzoyl peroxide (polymerization initiator) and dissolved, and dispersed in 2.5 liters of a 4% by weight aqueous polyvinyl alcohol solution. The temperature was raised while stirring in a nitrogen atmosphere, and a polymerization reaction was carried out at 80 ° C. for 1 hour (polymerization rate 94%). After the polymerization, the reaction system was cooled to 30 ° C., 200 g of acrylamide (hydrophilic monomer: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 300 g of methanol were added, and the mixture was stirred at 30 ° C. for 1 hour. Time polymerization was performed.
After polymerization, it was washed and classified to obtain a filler having an average particle size of 6 μm.
[0059]
(Measurement of sugar mixture)
The saccharide mixture was measured using a column packed with the filler obtained in Example 4 in the same manner as in Example 1.
(Measurement condition)
System: Same as Example 3
Eluent: A mixture of acetonitrile: water = 75: 25
Flow rate: 1.2ml / min
Sample injection: 10 μm
[0060]
(Measurement sample)
A mixture of fructose (peak 41), glucose (peak 42), sucrose (peak 43), maltose (peak 44) (all of which are manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
(Measurement result)
The obtained chromatogram is shown in FIG.
It can be seen that each peak is well separated in a short time.
[0061]
(Comparative Example 1)
(Example in which no organic solvent was added in Example 1)
In Example 1, except that methanol was not used, the same operation was performed to obtain a filler having an average particle size of 6 μm.
The results of measuring the protein mixture as in Example 1 are shown in FIG. Moreover, the result of having measured hemoglobin similarly to Example 1 is shown in FIG. Since the polymerization rate of the hydrophilic monomer was low, sufficient holding power was not obtained, and each peak was not separated. This low resolution was not eliminated even when the elution capacity of the eluent was weakened and each peak was eluted at the same retention time as in FIG. 1 or FIG.
[0062]
(Comparative Example 2)
(Example of increasing the amount of hydrophilic monomer added)
In Comparative Example 1, the same operation was performed except that 800 g of the aqueous solution was used instead of 400 g of the 50% aqueous solution of 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid.
In Comparative Example 1, since the polymerization rate of the hydrophilic monomer was low, the polymerization reaction was performed by increasing the addition amount of the hydrophilic monomer. I could not.
[0063]
【The invention's effect】
Since the present invention is constituted as described above, it does not cause an agglomeration reaction in the middle of the polymerization reaction, so that not only a decrease in yield during production is eliminated, but also hydrophilic so as to have sufficient functional groups as a filler for LC. Since the reactive monomer can be reacted efficiently, filler fine particles having uniform performance can be obtained.
Further, since the polymerization reaction is completed by a series of operations, not only the operation is simpler than the conventional ion exchange group introduction method by post-treatment, but also the introduction rate is easily controlled, and good reproducibility can be obtained.
Furthermore, since necessary ion exchange groups can be uniformly and sufficiently introduced onto the surface of the filler, an appropriate holding force can be obtained in any LC measurement mode, and the separation performance is excellent.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a chromatogram obtained when a protein mixture is measured using the filler obtained in Example 1. FIG.
FIG. 2 is a diagram showing a chromatogram obtained when hemoglobins are measured using the filler obtained in Example 1.
FIG. 3 is a diagram showing a chromatogram obtained when a protein mixture was measured using the filler obtained in Example 2.
4 is a diagram showing a chromatogram obtained when polyethylene glycols were measured using the filler obtained in Example 3. FIG.
FIG. 5 is a diagram showing a chromatogram obtained when a monosaccharide mixture was measured using the filler obtained in Example 4.
6 is a diagram showing a chromatogram obtained when a protein mixture was measured using the filler obtained in Example 1. FIG.
7 is a diagram showing a chromatogram obtained when Hb was measured using the filler obtained in Comparative Example 1. FIG.
[Explanation of symbols]
1 Myoglobin peak
2 Peak of α-chymotrypsinogen
3 Ribonuclease A peak
4 The peak of lysozyme
11 HbA1a and b peaks
12 HbF peak
13 Peak of unstable HbA1c
14 Stable HbA1c peak
15 HbA0 peak
16 CHb peak
17 AHb peak
31-37 Polyethylene glycol peak
38 Peak of ethylene glycol
41 Fructose peak
42 glucose peak
43 Peak of Sucrose
44 Maltose Peak

Claims

In the method for producing a filler for liquid chromatography comprising a hydrophilic cross-linked polymer, a polymerization reaction is carried out in an aqueous dispersion medium using a cross-linkable monomer and a hydrophilic monomer in the presence of a polymerization initiator. An organic solvent is added to the polymerization system at a stage where the polymerization rate in the polymerization reaction is in the range of 89 to 94 %,
Furthermore, polymerization is continued and the hydrophilic crosslinked polymer is obtained, The manufacturing method of the filler for liquid chromatography characterized by the above-mentioned.

In the method for producing a filler for liquid chromatography comprising a hydrophilic cross-linked polymer, a polymerization reaction is performed in the presence of a polymerization initiator using a cross-linkable monomer in an aqueous dispersion medium, and the polymerization rate in the polymerization reaction Is in the range of 89 to 94 %, a hydrophilic monomer and an organic solvent are added to the polymerization system,
Furthermore, polymerization is continued and the hydrophilic crosslinked polymer is obtained, The manufacturing method of the filler for liquid chromatography characterized by the above-mentioned.

The method for producing a filler for liquid chromatography according to claim 1 or 2, wherein the hydrophilic monomer is an ion exchange group-containing monomer.