JP4203191B2

JP4203191B2 - Packing for liquid chromatography

Info

Publication number: JP4203191B2
Application number: JP28030499A
Authority: JP
Inventors: 孝之岡; 和之大石
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1999-09-30
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2019-09-30
Also published as: JP2001099819A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフィー用充填剤、更に詳しくはカチオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カチオン交換基としてカルボキシル基やスルホン酸基を有する充填剤（カチオン交換基含有充填剤）を用いた液体クロマトグラフィー分析法は、糖化ヘモグロビン類の分析をはじめとして、各種生体関連物質の分析等に極めて有用な方法である。
【０００３】
有機合成高分子からなるカチオン交換基含有充填剤の従来の製造方法としては、以下の２つの方法が開示されている。
（１）架橋性粒子に、カチオン交換基含有化合物を反応させる方法。
すなわち、反応性官能基を有する無機系又は有機系粒子に、該反応性官能基と反応する基及びカチオン交換基を有する化合物を反応させることにより、上記無機系又は有機系粒子に、カチオン交換基を導入する方法。具体的には、例えば、特開平１−２６２４６８号公報には、粒子中のエポキシ基にカルボキシル基含有化合物又はスルホン酸基含有化合物を反応させる方法が開示されている。
【０００４】
（２）カルボキシル基含有単量体を、架橋性単量体と重合する方法。
例えば、特公昭６３−５９４６３号公報には、カルボキシル基含有単量体５〜９０重量％、架橋性単量体１０〜９５重量％、非架橋性単量体０〜８５重量％を混合して重合する方法が開示されている。また、特公平８−７１９７号公報には、重合開始剤を含有する疎水性架橋重合体粒子の表面に、カチオン交換基含有単量体を重合させる方法が開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記（１）、（２）の方法で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤には、以下の問題点が残っている。
上記（１）の方法による充填剤：
後処理によりカチオン交換基を導入する方法においては、カチオン交換基を有する化合物を定量的に導入することは困難であることが一般的に知られており、単量体由来のカチオン交換基導入に比べ、製造の再現性の点で劣る（吉廻、細矢、木全、田中：Chromatography,16(1)7-12(1995)）。従って、液体クロマトグラフィー用充填剤としての分離性能がばらつくという欠点がある。また後処理の方法が極めて煩雑で長時間を要する。
【０００６】
上記（２）の方法による充填剤：
カルボキシル基含有単量体の添加量や重合条件を制御することにより、充填剤に対して定量的にカルボキシル基を含有させることができ、また操作も簡便であるが、カルボキシル基を有する充填剤は、使用できるｐＨが約５．５以上と限定されるため、低ｐＨ溶離液での分析が行えないという欠点がある。また、スルホン酸基含有単量体を用いて、スルホン酸基を有する液体クロマトグラフィー用充填剤を調製した例は開示されていない。
従って従来のスルホン酸基含有充填剤は上記（１）の方法による充填剤のみであるが、該充填剤は吸着能が強く、測定条件によっては、試料中の妨害物質の非特異吸着を起こし、その結果カラムの寿命が短いという欠点がある。
【０００７】
一方、溶出位置が近接するピークを含む短時間分析などの場合、特に溶出条件の変更だけでは分離できない場合などでは、充填剤の選択が重要である。しかし従来のカルボキシル基含有充填剤とスルホン酸基含有充填剤とでは、カチオン交換能があまりにも違いすぎ、充填剤の微調整は困難であった。
【０００８】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、液クロ充填剤としての性能のバラツキが少なく、広範囲のｐＨで使用でき、カラム寿命の十分な液体クロマトグラフィー用充填剤を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、請求項１の本発明（以下、本発明１という）では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）および架橋性単量体（Ｃ）を構成単位とする重合体からなることを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。
また、請求項２の本発明（以下、本発明２という）では、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）が、一般式（１）；Ｒ¹（ＣＨ₂ＯＣＯＣＲ²＝ＣＨ₂）₂（式中Ｒ¹は、直鎖部の炭素原子数が１〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているアルキレン基、もしくは、直鎖部の炭素原子数と酸素原子数の和が２〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているオキサアルキレン基を表す。式中Ｒ²は、水素原子又は、メチル基を表す。）で表されることを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。
また、請求項３の本発明（以下、本発明３という）では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）１０〜２００重量部、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）５〜１００重量部、および架橋性単量体（Ｃ）１００重量部を重合してなる請求項１又は、２記載の液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。
【００１０】
以下、本発明の詳細を説明する。
（１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ））
本発明における上記１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）としては、例えば、１分子中に１個以上のスルホン酸基と１個以上のビニル基を有する単量体が挙げられる。このような単量体としては、例えば、スチレンスルホン酸、（メタ）アリルスルホン酸、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、（３−スルホプロピル）−イタコン酸、３−スルホプロピル（メタ）アクリル酸、およびこれらの誘導体や塩類などが挙げられる。単量体（Ａ）としては、分子中にベンゼン骨格を有さない単量体がより好ましい。ベンゼン骨格は、特に生体関連物質の分析等では、タンパク質など試料中の物質の非特異吸着を誘発するので好ましくない。
【００１１】
上記単量体（Ａ）の量は、少なくなると得られる重合体のカチオン交換容量が小さすぎて、被測定物質との十分なカチオン交換反応が行われにくくなり、多くなると得られる重合体の親水性が大きくなりすぎて、重合中に凝集が発生しやすくなるので、重合時において架橋性単量体（Ｃ）１００重量部に対して１０〜２００重量部添加することが好ましい。
【００１２】
（１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ））
本発明における１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）としては、一般式（１）；Ｒ¹（ＣＨ₂ＯＣＯＣＲ²＝ＣＨ₂）₂で表されるものが用いられる。上記一般式中Ｒ¹は、直鎖部の炭素原子数が１〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているアルキレン基、もしくは、直鎖部の炭素原子数と酸素原子数の和が２〜１０の整数であって、水素原子が１個以上の水酸基で置換されているオキサアルキレン基を表す。式中Ｒ²は、水素原子及び、メチル基を表す。
上記アルキレン基は、直鎖パラフィン炭化水素の両端の炭素原子から水素原子各１個を除いた２価の基（一般式；−Ｃ_nＨ_2n−）を示す。
また、上記オキサアルキレン基は、上記アルキレン基の少なくとも一つのメチレン基（−ＣＨ₂−）をエーテル基（−Ｏ−）に置換したものを示す。
【００１３】
上記一般式（１）で表されるものとして、例えば、１分子中に１個以上の水酸基と２個以上のビニル基を有する単量体が挙げられ、このような単量体としては、例えば、２−ヒドロキシ−１，３−ジ（メタ）アクリルロキシプロパン、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１０−ジ（メタ）アクリロキシ−５−メチル−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール、１，１１−ジ（メタ）アクリロキシ−４，８−ジオキサウンデカン−２，６，１０−トリオールなどが挙げられる。
【００１４】
上記単量体（Ｂ）の量は、少なくなると試料中の生体成分（タンパク質など）の非特異吸着を抑制する効果が十分に得られにくくなり、多くなると、重合体の親水性が増大し、重合中に凝集が発生しやすくなるため、重合時において架橋性重合体（Ｃ）１００重量部に対して、５〜１００重量部添加することが好ましい。
【００１５】
（架橋性単量体（Ｃ））
本発明における架橋性単量体（Ｃ）は、上記（Ｂ）以外の、１分子中にビニル基を２個以上有する単量体を言い、イオン交換基を有さないか又は有していても微量である単量体であって、単量体（Ａ）及び単量体（Ｂ）よりも疎水性であるものが好ましい。
このような、架橋性単量体（Ｃ）としては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、ジビニルナフタレン等のスチレン誘導体；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，３−ブチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサングリコールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルの誘導体；１，３−ブタジエン、イソプレン、１，４−ヘキサンジエン等の脂肪族ジエン化合物；及び上記単量体の誘導体などが挙げられる。これらは２種以上が混合されて用いられてもよい。
【００１６】
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤に用いられる重合体には、必要に応じて、上記単量体（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）以外の非架橋性単量体（Ｄ）が構成単位の一部として混合されていてもよい。
上記非架橋性単量体（Ｄ）としては、例えば、スチレン、α- メチルスチレン、p-メチルスチレン、クロロメチルスチレンなどのスチレン誘導体類；塩化ビニルなどの脂肪族系単量体；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ステアリン酸ビニル等のビニルエステル類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、メタクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の（メタ）アクリル酸エステル類；（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、アクリロニトリルなど（メタ）アクリル酸誘導体類が挙げられる。
【００１７】
上記非架橋性単量体（Ｄ）の量は、上記単量体（Ｂ）と（Ｃ）をあわせて１００重量部に対して１００重量部以下であることが好ましい。上記非架橋性単量体（Ｄ）の量が１００重量部より多くなると重合体粒子内の空隙が大きくなるため、膨潤、収縮などがおこりやすくなり、複数の溶離液を用いた場合などに溶離液への平衡化に長時間を要するようになるためである。
【００１８】
（充填剤の重合方法）
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤に用いられる重合体の重合は、公知の重合方法が用いられ、例えば、懸濁重合、乳化重合、分散重合などにより製造され得る。
さらに、例えば、上記単量体（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を混合し、これに重合開始剤を所定量添加した後、分散媒中に添加して昇温し重合する方法が挙げられる。また上記単量体（Ｂ）及び（Ｃ）を用いて架橋性重合体粒子を調製した後、該重合体粒子に重合開始剤を含浸させた後、上記単量体（Ａ）を分散場媒中に添加して重合する方法も挙げられる。
【００１９】
さらに、本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤に用いられる重合体の重合方法として、多段階反応による微粒子の合成方法が用いられてもよい。
すなわち、あらかじめ重合された粒度分布の揃った重合体粒子（Ｅ）に、上記単量体（Ａ）〜（Ｄ）、または、これらの一部が吸収されて製造されることにより、粒径がより均一化される。
【００２０】
上記重合体粒子（Ｅ）とは、粒度分布の揃った重合体粒子のことを指し、例えば、上記非架橋性単量体（Ｄ）などの単独重合体又は共重合体からなる非架橋重合体粒子が挙げられ、例えば、スチレン重合体、（メタ）アクリル酸メチル重合体、（メタ）アクリル酸エチル重合体などが挙げられる。また、上記重合体粒子（Ｅ）として、上記非架橋性単量体（Ｄ）と上記架橋性単量体（Ｂ）あるいは（Ｃ）との共重合体である架橋共重合体粒子（例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体）も使用できるが、この場合は、架橋性単量体（Ｂ）あるいは（Ｃ）の割合を１０重量％以下として共重合して得られる低架橋重合体粒子が好ましい。
【００２１】
上記重合体粒子（Ｅ）の製造方法は、公知の重合方法でよく、例えば乳化重合、ソープフリー重合、分散重合、懸濁重合などが挙げられる。
【００２２】
上記重合体粒子（Ｅ）の平均粒径は、０．１〜１０μｍが好ましく、粒径のばらつきは変動係数（ＣＶ）（＝標準偏差÷平均粒径×１００）として４０％以下が好ましい。
【００２３】
上記重合体粒子（Ｅ）の量は、上記架橋性単量体（Ｂ）と（Ｃ）あわせて１００重量部に対して０．５〜１００重量部が好ましい。
【００２４】
上記の重合体粒子（Ｅ）を用いる場合には、架橋性単量体（Ｂ）及び（Ｃ）（必要に応じて、非架橋性単量体（Ｄ）も含む）と重合開始剤を、重合体粒子（Ｅ）に吸収させて重合を進めることが好ましい。
【００２５】
本発明の重合開始剤としては、特に限定されず、水溶性又は油溶性の公知のラジカル重合開始剤が用いられる。上記重合開始剤の具体的な例としては、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩；クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、ｏ−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイドなどの有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリルなどのアゾ化合物などが挙げられる。
【００２６】
上記重合開始剤の使用量は、上記架橋性単量体（Ｂ）と（Ｃ）あわせて１００重量部に対し、０．０５〜５重量部が好ましい。重合開始剤の使用量が０．０５重量部未満になると、重合反応が不十分となったり、重合に長時間を要することがあり、５重量部を越えると、急激な反応の進行により、凝集物が発生することがある。この重合開始剤は、上記単量体に溶解して用いてもよい。
【００２７】
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤に用いられる重合体は、その製造時に多孔質化剤が用いられて製造されることにより、多孔質化されていてもよい。
多孔質化された重合体を製造する場合は、多孔質化剤として単量体を溶解するが、重合体を溶解しない有機溶媒を重合反応系に添加して重合すればよい。このような多孔質化剤としては公知のものでよく、例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン等の飽和炭化水素；イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、オクチルアルコール等のアルコール類などが挙げられる。
上記多孔質化剤の使用量は、多くなると、得られる重合体の耐圧性が低下し、膨潤、収縮し易くなり、また、重合中に凝集が発生し易くなるので、上記架橋性単量体（Ｂ）と（Ｃ）あわせて１００重量部に対して、１００重量部以下が好ましい。
【００２８】
（本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の粒径）
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の平均粒径は０．５〜１００μｍが好ましく、粒径のばらつきは変動係数（ＣＶ）（＝標準偏差÷平均粒径×１００）として１５％以下が好ましい。このような、本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、重合によって得られた重合体粒子を、必要に応じて分級することにより得られる。分級には、乾式又は湿式など公知の方法が用いられ得る。
【００２９】
（本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤の使用）
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤は、ステンレス製などのカラムに充填されてカチオン交換液体クロマトグラフィーなどに用いられる。カラムへの充填に際しては、適宜の方法を用いることができるが、充填剤を溶離液として用いる溶媒などの分散媒に所定量分散し、カラム内にパッカーなどを経由して圧入する湿式法（スラリー法）が特に好ましい。
【００３０】
本発明の液体クロマトグラフィー用充填剤を用いて分離測定する際の測定対象物質としては、従来からカチオン交換液体クロマトグラフィー又はイオンクロマトグラフィーで分離されていたものの全てである。特に、カテコールアミン誘導体類、ヌクレオチド類、ペプチド類、タンパク質類などの生体関連物質が好適である。
【００３１】
本発明の充填剤を適用できる液体クロマトグラフは公知のものでよく、例えば、送液ポンプ、試料導入装置、カラム、検出器などから構成される。また、これらに他の付属品（恒温槽や溶離液の脱気装置など）が適宜付属されてもよい。
【００３２】
本発明の充填剤を用いた液体クロマトグラフィー分析には、公知の溶離液が用いられる。例えば、以下の物質などを含む各種緩衝液などが挙げられる。リン酸、硝酸、塩酸、過塩素酸などの無機酸及びその塩；酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸及びその塩又はハロゲン化物；水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基性物質。また、例えば、アセトン、アセトニトリル、ジオキサン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒も使用可能であり、また、水若しくは上記緩衝液と有機溶媒の混合物も使用可能である。
【００３３】
（作用）
本発明１では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）および架橋性単量体（Ｃ）を構成単位とする重合体からなり、該スルホン酸基は、スルホン酸基を１個以上含む単量体に由来するものであり、従来法の後処理によるスルホン酸基の導入方法により得られた充填剤と異なり、液体クロマトグラフィー用充填剤としての性能にバラツキが少なく、広範囲のｐＨで使用できる。さらに１分子中に水酸基を１個以上含む単量体を構成単位に有しているため、タンパク質などの非特異吸着が少なくなるため、従来の充填剤を充填したカラムに比較してカラム寿命が長くなる。
また、本発明２では、上記一般式（１）で表される１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）を用いるので、さらに、液体クロマトグラフィー用充填剤としての性能にバラツキが少なく、タンパク質などの非特異吸着が少なくなるため、充填剤を充填したカラムに比較してカラム寿命が長くなる。
また、本発明３では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）１０〜２００重量部、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）５〜１００重量部、および架橋性単量体（Ｃ）１００重量部を重合してなるので、このように単量体を一定の比率で添加して重合させることにより、充填剤のイオン交換能の微調整が可能となり、従来分離しにくかった物質、又は従来分離に長時間かかっていた物質を、短時間で簡便な溶出条件により、高精度に分離できる。
【００３４】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示す。
（実施例１）
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（単量体（Ｂ）：新中村化学社製）２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）２００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００３５】
（実施例２）
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（単量体（Ｂ）：新中村化学社製）５０ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）４００ｇを用いた以外は、実施例１と同様重合を行った。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００３６】
（実施例３）
１，１０−ジメタクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール（単量体（Ｂ）：共栄社化学社製）１００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）３００ｇにベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤）１．５ｇを混合して溶解し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で１時間重合した。
重合後、反応系を３０℃に冷却した後、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇを添加して３０℃で１時間撹拌した後、８０℃で３時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００３７】
（実施例４）
アリルスルホン酸（単量体（Ａ）：キシダ化学社製）１００ｇ、１，１０−ジメタクリロキシ−４，７−ジオキサデカン−２，９−ジオール（単量体（Ｂ）：共栄社化学社製）１００ｇ、ジビニルベンゼン（単量体（Ｃ）：キシダ化学社製）３００ｇ、スチレン（非架橋性単量体（Ｄ））２００ｇ、トルエン（多孔質化剤）１００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド１．５ｇを混合し、２．５リットルの６重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００３８】
（比較例１）スルホン酸基を後処理により導入して得られた充填剤の例：
２−ヒドロキシエチルメタクリレート２００ｇ、エチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）４０ｇ、メチルメタクリレート（和光純薬社製）１５ｇ及びtert−ブチルパーピバレート（重合開始剤：和光純薬社製）５ｇの混合溶液を硫酸ナトリウム２０ｇを溶解した２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、６０℃で１２時間重合した。重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの粒子を得た。
この粒子１００ｇを１００ｍｌの２０重量％水酸化ナトリウム水溶液に分散し、エピクロルヒドリン４０ｇを添加し、室温で４時間反応させた。
さらに得られた粒子１００ｇを１００ｍｌの２０重量％硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、８０℃で２０時間反応させた。得られた粒子を洗浄し、充填剤を得た。
【００３９】
（比較例２）単量体（Ｂ）を含有しないスルホン酸基含有充填剤の例：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）４００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００４０】
（比較例３）単量体（Ｂ）含有量が少ないスルホン酸基含有充填剤の例：
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（単量体（Ａ）：東京化成工業社製）２００ｇ、２−ヒドロキシ−１，３−ジメタクリロキシプロパン（単量体（Ｂ）：新中村化学社製）２０ｇ、ジエチレングリコールジメタクリレート（単量体（Ｃ）：新中村化学社製）４００ｇ及びベンゾイルパーオキサイド（重合開始剤：和光純薬社製）１．５ｇを混合し、２．５リットルの４重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に分散させた。窒素雰囲気下で撹拌しながら昇温し、８０℃で８時間重合した。
重合後、洗浄し分級して平均粒径５μｍの充填剤を得た。
【００４１】
（性能評価）
実施例及び比較例で得られた充填剤について、以下のようにして性能評価をした。
（１）液体クロマトグラフィー用カラムの製造：
充填剤０．７ｇを採取し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）３０ｍｌに分散し、５分間超音波処理した後、よく撹拌した。全量をステンレス製空カラム（４．６φ×３５ｍｍ）を接続したパッカー（梅谷精機社製）に注入した。パッカーに送液ポンプ（サヌキ工業社製）を接続し、圧力２００ｋｇ／ｃｍ2 で定圧充填して、液体クロマトグラフィー用カラムを製造した。
【００４２】
（２）タンパク質混合物の測定：
実施例１、２及び比較例１で得られた充填剤を各々充填したカラムを用いて、タンパク質標準物質の混合物を測定した。
（測定条件）
システム：送液ポンプ：ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラ：ＡＳＵ−４２０（積水化学社製）
検出器：ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：下記溶離液Ａ１００％から溶離液Ｂ１００％へのリニアグラディエント法で溶出した。
溶離液Ａ：１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．７）
溶離液Ｂ：溶離液Ａ＋５００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ５．７）
流速：１．５ｍｌ／分
検出波長：２５４ｎｍ
試料注入量：１０μｌ
【００４３】
（測定試料）
ミオグロビン、α−キモトリプシノーゲン、リボヌクレアーゼＡ、リゾチーム（以上、いずれもＳｉｇｍａ社製）の混合物
【００４４】
（測定結果）
実施例１で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムを図１、比較例１で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムを図２に示す（なお、実施例４で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムは図１と同様であった）。
図中、ピーク１はミオグロビン、ピーク２はα−キモトリプシノーゲン、ピーク３はリボヌクレアーゼＡ、ピーク４はリゾチームを示す。
図１は、図２に比べて短時間測定にもかかわらず、各ピークの分離がよいことがわかる。
【００４５】
（３）ヒト血液中のヘモグロビン類の測定
実施例２、３及び比較例１で得られた充填剤を各々充填したカラムを用いて、糖尿病診断の指標となる、ヒト血液中の糖化ヘモグロビン（Ｈｂ）類を含むＨｂ類の測定を行った。
【００４６】
（測定条件）
システム：上記（２）タンパク質混合物の測定に用いたシステムと同様。
溶離液：リン酸塩及び過塩素酸塩を含む２種類の緩衝液によるステップグラディエント法で溶出した。安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）の保持時間が適当となるように、溶離液Ｃの塩濃度及びｐＨを適宜調整した。
溶離液Ｃ：塩濃度を１５〜１００ｍＭ、ｐＨ５．６〜６．０の間で調節した。
溶離液Ｄ：塩濃度３００ｍＭ、ｐＨ７．２とした。
流速：１．５ｍｌ／分
検出波長：４１５ｎｍ
【００４７】
（測定試料）
健常人血を採血し、抗血液凝固剤として、フッ化ナトリウム１０ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。これにグルコースを５００ｍｇ／ｄｌとなるように添加し、３７℃で５時間反応させ、次いで、溶血試薬（界面活性剤として０．１重量％ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ−１００）（東京化成社製）のリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０））で溶血し、１５０倍に希釈して測定試料とした。
【００４８】
（測定結果）
実施例２、３で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムを図３、４、比較例１で得られた充填剤を用いた場合のクロマトグラムを図５に示す。
図中は、ピーク５はヘモグロビンＡ１ａ及びｂ（ＨｂＡ１ａ及びｂ）；ピーク６はヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）；ピーク７は不安定型ＨｂＡ１ｃ；ピーク８は安定型ＨｂＡ１ｃ；ピーク９はヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０）を示す。
ＨｂＦ（ピーク６）及び糖尿病診断の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃピーク（ピーク８）の良好な定量性が確保されるためには、ＨｂＦ、不安定型ＨｂＡ１ｃ、安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０の順に溶出される必要があるが、図３及び４ではこの順序通りに各ピークが溶出し、しかも短時間の測定にもかかわらず、各ピークの分離がよいことがわかる。図５では各ピークの分離が、測定時間が長いにもかかわらず悪く、検出されないピークもあった。
【００４９】
（４）充填剤のロット間差の評価：
本発明のスルホン酸基を有する充填剤（実施例３）及び後処理によりスルホン酸基を導入する従来法による充填剤（比較例１）のロット間差を以下のようにして確認した。
各々３０回重合して、得られた充填剤３０ロット間の性能のバラツキをみた。
上記評価（３）のヒト血液中のヘモグロビン類の測定を、それぞれの充填剤の各３０ロットについて行い、ピーク８の安定型ＨｂＡ１ｃの保持時間を調べた。なお、溶離液Ｃは、ピーク８の保持時間が約２分となるよう各充填剤毎に調製した。
【００５０】
（測定結果）
スルホン酸基を有する充填剤（実施例３）の平均保持時間は、２．２分であり、標準偏差は０．１５分であり、変動計数（ＣＶ（％）＝標準偏差÷平均保持時間×１００）は、６．８２％であった。
一方、従来法による充填剤（比較例１）の平均保持時間は、２．２分であり、標準偏差は０．９１分であり、変動計数（ＣＶ（％）＝標準偏差÷平均保持時間×１００）は、
４１．１％であった。
以上より、本発明の充填剤は、製造再現性に優れていることが判った。
【００５１】
（５）カラムの寿命の評価：
実施例２、３及び比較例２、３の充填剤を充填したカラムを用いて、上記評価（３）のヒト血液中のヘモグロビン類の測定を繰り返し行い、以下の式で示されるピーク８の安定型ＨｂＡ１ｃの面積値の変化を調べた。
ピーク８の面積値（％）＝（ピーク８の面積）÷（全ピークの面積）×１００
【００５２】
（測定結果）
測定結果を図６に示した。図６において、横軸は繰り返し測定の回数であり、縦軸は各回の安定型ＨｂＡ１ｃの面積値を、初回測定値を１００とした相対百分率で示した値（％）である。
図６より、実施例２及び３の充填剤は、３０００回測定後も良好な測定値を示しているが、一方、比較例２及び３の充填剤では、測定回数が増えると測定値が低下し、正確な測定ができなくなってくることが判る。
【００５３】
【発明の効果】
本発明１では、１分子中にスルホン酸基を１個以上含む単量体（Ａ）、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）および架橋性単量体（Ｃ）を構成単位とする重合体からなるため、液体クロマトグラフィー用充填剤としての性能にバラツキが少なく、広範囲のｐＨで使用でき、従来の充填剤を充填したカラムに比較してカラム寿命が長くなる。
また、本発明２では、上記一般式（１）で表される１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）を用いるので、さらに、従来の充填剤を充填したカラムに比較してカラム寿命が長くなる。
また、本発明３では、１分子中に水酸基を１個以上含む架橋性単量体（Ｂ）が、上記重合体１００重量部に対して、５〜５０重量部であるので、従来分離しにくかった物質、又は従来分離に長時間かかっていた物質を、短時間で簡便な溶出条件により、高精度に分離できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１により得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図２】比較例１により得られた充填剤を用いて、タンパク質混合物の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図３】実施例２により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図４】実施例３により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図５】比較例１により得られた充填剤を用いて、Ｈｂ類の測定を行った際に得られたクロマトグラムを示す図。
【図６】カラム寿命の評価の結果を示すグラフであり、横軸は繰り返し測定の回数であり、縦軸は各回の安定型ＨｂＡ１ｃの面積値を、初回測定値を１００とした相対百分率で示した値（％）である。
【符号の説明】
１ミオグロビンのピーク
２ α−キモトリプシノーゲンのピーク
３リボヌクレアーゼＡのピーク
４リゾチームのピーク
５ＨｂＡ１ａ及びｂのピーク
６ＨｂＦのピーク
７不安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
８安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
９ＨｂＡ０のピーク[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a packing material for liquid chromatography, and more particularly to a packing material for cation exchange liquid chromatography.
[0002]
[Prior art]
Liquid chromatography analysis using a filler having a carboxyl group or a sulfonic acid group as a cation exchange group (cation exchange group-containing filler) is extremely useful for the analysis of various biological substances including glycated hemoglobins. This is a useful method.
[0003]
The following two methods have been disclosed as conventional methods for producing a cation exchange group-containing filler comprising an organic synthetic polymer.
(1) A method in which a crosslinkable particle is reacted with a cation exchange group-containing compound.
That is, by reacting a compound having a reactive functional group and a compound having a cation exchange group with an inorganic or organic particle having a reactive functional group, the inorganic or organic particle has a cation exchange group. How to introduce. Specifically, for example, JP-A-1-262468 discloses a method of reacting a carboxyl group-containing compound or a sulfonic acid group-containing compound with an epoxy group in particles.
[0004]
(2) A method of polymerizing a carboxyl group-containing monomer with a crosslinkable monomer.
For example, in Japanese Patent Publication No. 63-59463, 5 to 90% by weight of a carboxyl group-containing monomer, 10 to 95% by weight of a crosslinkable monomer, and 0 to 85% by weight of a non-crosslinkable monomer are mixed. A method of polymerizing is disclosed. Japanese Patent Publication No. 8-7197 discloses a method of polymerizing a cation exchange group-containing monomer on the surface of a hydrophobic crosslinked polymer particle containing a polymerization initiator.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The following problems remain in the packing material for liquid chromatography obtained by the methods (1) and (2).
Filler by the method of (1) above:
In the method of introducing a cation exchange group by post-treatment, it is generally known that it is difficult to quantitatively introduce a compound having a cation exchange group. Compared with the reproducibility of production, Yoshimaki, Hosoya, Kizen, Tanaka: Chromatography, 16 (1) 7-12 (1995)). Therefore, there is a drawback that the separation performance as a packing material for liquid chromatography varies. Further, the post-treatment method is extremely complicated and takes a long time.
[0006]
Filler by the method of (2) above:
By controlling the addition amount of the carboxyl group-containing monomer and the polymerization conditions, it is possible to quantitatively contain the carboxyl group with respect to the filler and the operation is simple. Since the usable pH is limited to about 5.5 or more, there is a drawback that analysis with a low pH eluent cannot be performed. Moreover, the example which prepared the filler for liquid chromatography which has a sulfonic acid group using the sulfonic acid group containing monomer is not indicated.
Therefore, the conventional sulfonic acid group-containing filler is only the filler by the method of (1) above, but the filler has a strong adsorption ability and, depending on the measurement conditions, causes nonspecific adsorption of interfering substances in the sample, As a result, there is a disadvantage that the lifetime of the column is short.
[0007]
On the other hand, in the case of short-time analysis including peaks where the elution positions are close, especially when the separation cannot be performed only by changing the elution conditions, selection of the filler is important. However, the conventional carboxyl group-containing fillers and sulfonic acid group-containing fillers have too different cation exchange capacities, making fine adjustment of the filler difficult.
[0008]
The present invention has been made in view of the above problems, and its purpose is that there is little variation in performance as a liquid chromatographic packing material, and it can be used in a wide range of pH, and has a sufficient column lifetime. Is to provide.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, according to the present invention of claim 1 (hereinafter referred to as the present invention 1), a monomer (A) containing one or more sulfonic acid groups in one molecule has 1 hydroxyl group in one molecule. There is provided a filler for liquid chromatography characterized by comprising a polymer having as a structural unit a crosslinkable monomer (B) containing at least one and a crosslinkable monomer (C).
In the present invention of claim 2 (hereinafter referred to as the present invention 2), the crosslinkable monomer (B) having one or more hydroxyl groups in one molecule is represented by the general formula (1); R ¹ (CH ₂ OCOCR ² = CH ₂ ) ₂ (wherein R ¹ is an integer of 1 to 10 carbon atoms in the straight chain portion, and a hydrogen atom is substituted with one or more hydroxyl groups, or a straight chain The sum of the number of carbon atoms and the number of oxygen atoms in the part represents an oxaalkylene group in which a hydrogen atom is substituted with one or more hydroxyl groups, wherein R ² represents a hydrogen atom or It represents a methyl group.) The liquid chromatography filler according to claim 1 is provided.
In the present invention of claim 3 (hereinafter referred to as present invention 3), 10 to 200 parts by weight of monomer (A) containing one or more sulfonic acid groups in one molecule, one hydroxyl group in one molecule The filler for liquid chromatography according to claim 1 or 2, wherein 5 to 100 parts by weight of the crosslinkable monomer (B) and 100 parts by weight of the crosslinkable monomer (C) are polymerized. .
[0010]
Details of the present invention will be described below.
(Monomer (A) containing one or more sulfonic acid groups in one molecule)
Examples of the monomer (A) having one or more sulfonic acid groups in one molecule in the present invention include a monomer having one or more sulfonic acid groups and one or more vinyl groups in one molecule. Is mentioned. Examples of such monomers include styrene sulfonic acid , (meth) allyl sulfonic acid, 2- (meth) acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid, (3-sulfopropyl) -itaconic acid, and 3-sulfopropyl. (Meth) acrylic acid, and derivatives and salts thereof can be mentioned. As the monomer (A), a monomer having no benzene skeleton in the molecule is more preferable. The benzene skeleton is not preferable because it induces non-specific adsorption of a substance in a sample such as a protein particularly in analysis of a biological substance.
[0011]
When the amount of the monomer (A) decreases, the cation exchange capacity of the polymer obtained is too small, and it becomes difficult to perform sufficient cation exchange reaction with the substance to be measured. Therefore, it is preferable to add 10 to 200 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the crosslinkable monomer (C) at the time of polymerization.
[0012]
(Crosslinkable monomer (B) containing one or more hydroxyl groups in one molecule)
As the crosslinkable monomer (B) having one or more hydroxyl groups in one molecule in the present invention, those represented by the general formula (1); R ¹ (CH ₂ OCOCR ² = CH ₂ ) ₂ are used. . In the above general formula, R ¹ is an integer having 1 to 10 carbon atoms in the straight chain portion, and an alkylene group in which a hydrogen atom is substituted with one or more hydroxyl groups, or the number of carbon atoms in the straight chain portion And the sum of the number of oxygen atoms is an integer of 2 to 10, and represents an oxaalkylene group in which a hydrogen atom is substituted with one or more hydroxyl groups. In the formula, R ² represents a hydrogen atom or a methyl group.
The alkylene group is a divalent group (general formula: —C _n H _2n —) obtained by removing one hydrogen atom from each carbon atom at both ends of a linear paraffin hydrocarbon.
The oxaalkylene group is a group obtained by substituting at least one methylene group (—CH ₂ —) of the alkylene group with an ether group (—O—).
[0013]
As what is represented by the said General formula (1), the monomer which has 1 or more hydroxyl groups and 2 or more vinyl groups in 1 molecule is mentioned, for example, As such a monomer, for example, 2-hydroxy-1,3-di (meth) acryloxypropane, 1,10-di (meth) acryloxy-4,7-dioxadecane-2,9-diol, 1,10-di (meth) acryloxy-5 -Methyl-4,7-dioxadecane-2,9-diol, 1,11-di (meth) acryloxy-4,8-dioxaundecane-2,6,10-triol and the like.
[0014]
If the amount of the monomer (B) decreases, it becomes difficult to sufficiently obtain the effect of suppressing non-specific adsorption of biological components (proteins and the like) in the sample. If the amount increases, the hydrophilicity of the polymer increases. Since aggregation easily occurs during the polymerization, it is preferable to add 5 to 100 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the crosslinkable polymer (C) during the polymerization.
[0015]
(Crosslinkable monomer (C))
The crosslinkable monomer (C) in the present invention refers to a monomer having two or more vinyl groups in one molecule other than the above (B), and has or does not have an ion exchange group. Is also a trace amount of monomer, and is more hydrophobic than monomer (A) and monomer (B).
Examples of such a crosslinkable monomer (C) include styrene derivatives such as divinylbenzene, divinyltoluene, divinylxylene, divinylethylbenzene, and divinylnaphthalene; ethylene glycol di (meth) acrylate, polyethylene glycol di (meth) Acrylate, 1,3-butylene glycol di (meth) acrylate, 1,6-hexane glycol di (meth) acrylate, neopentyl glycol di (meth) acrylate, polypropylene glycol di (meth) acrylate, trimethylolethane tri (meth) Acrylate, trimethylolpropane tri (meth) acrylate, tetramethylolpropane tri (meth) acrylate, tetramethylolmethane tri (meth) acrylate, tetramethylolmethanetetra Derivatives of (meth) acrylic acid esters of meth) acrylate; 1,3-butadiene, isoprene, aliphatic diene compounds such as 1,4-hexane-diene; and derivatives and the monomer. Two or more of these may be used as a mixture.
[0016]
The polymer used for the filler for liquid chromatography of the present invention comprises a non-crosslinkable monomer (D) other than the monomers (A), (B), and (C) as necessary. It may be mixed as part of the unit.
Examples of the non-crosslinkable monomer (D) include styrene derivatives such as styrene, α-methylstyrene, p-methylstyrene, chloromethylstyrene; aliphatic monomers such as vinyl chloride; vinyl acetate, Vinyl esters such as vinyl propionate and vinyl stearate; methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, butyl methacrylate, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate and the like ( (Meth) acrylic acid derivatives; (meth) acrylic acid derivatives such as (meth) acrylamide, N-isopropylacrylamide, acrylonitrile and the like.
[0017]
The amount of the non-crosslinkable monomer (D) is preferably 100 parts by weight or less based on 100 parts by weight of the monomers (B) and (C). When the amount of the non-crosslinkable monomer (D) is more than 100 parts by weight, the voids in the polymer particles become large, so that swelling and shrinkage are likely to occur, and elution occurs when a plurality of eluents are used. This is because it takes a long time to equilibrate to the liquid.
[0018]
(Polymer polymerization method)
For the polymerization of the polymer used for the filler for liquid chromatography of the present invention, a known polymerization method is used, and for example, it can be produced by suspension polymerization, emulsion polymerization, dispersion polymerization or the like.
Further, for example, there is a method in which the monomers (A), (B) and (C) are mixed, a predetermined amount of a polymerization initiator is added thereto, and then added to a dispersion medium to be heated and polymerized. It is done. Moreover, after preparing crosslinkable polymer particles using the monomers (B) and (C), the polymer particles are impregnated with a polymerization initiator, and then the monomer (A) is dispersed in a dispersion field medium. There is also a method of polymerizing by adding to the inside.
[0019]
Furthermore, as a method for polymerizing a polymer used in the filler for liquid chromatography of the present invention, a method for synthesizing fine particles by a multistage reaction may be used.
That is, the above-mentioned monomers (A) to (D) or a part of these are absorbed into the polymer particles (E) having a uniform particle size distribution that has been polymerized in advance, thereby producing a particle size. More uniform.
[0020]
The polymer particles (E) refer to polymer particles having a uniform particle size distribution, for example, a non-crosslinked polymer comprising a homopolymer or a copolymer such as the non-crosslinkable monomer (D). Examples thereof include styrene polymer, methyl (meth) acrylate polymer, ethyl (meth) acrylate polymer, and the like. Further, as the polymer particles (E), crosslinked copolymer particles (for example, a copolymer of the non-crosslinkable monomer (D) and the crosslinkable monomer (B) or (C)) (for example, Styrene-divinylbenzene copolymer) can also be used, but in this case, low cross-linked polymer particles obtained by copolymerization with the proportion of the cross-linkable monomer (B) or (C) being 10% by weight or less are preferred. .
[0021]
The production method of the polymer particles (E) may be a known polymerization method, and examples thereof include emulsion polymerization, soap-free polymerization, dispersion polymerization, and suspension polymerization.
[0022]
The average particle size of the polymer particles (E) is preferably 0.1 to 10 μm, and the variation in particle size is preferably 40% or less as a coefficient of variation (CV) (= standard deviation ÷ average particle size × 100).
[0023]
The amount of the polymer particles (E) is preferably 0.5 to 100 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the crosslinkable monomers (B) and (C).
[0024]
When the above polymer particles (E) are used, the crosslinkable monomers (B) and (C) (including the non-crosslinkable monomer (D), if necessary) and the polymerization initiator, It is preferable to proceed to the polymerization by absorbing the polymer particles (E).
[0025]
The polymerization initiator of the present invention is not particularly limited, and a known water-soluble or oil-soluble radical polymerization initiator is used. Specific examples of the polymerization initiator include persulfates such as potassium persulfate, sodium persulfate, and ammonium persulfate; cumene hydroperoxide, benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, octanoyl peroxide, o-chlorobenzoyl Peroxide, acetyl peroxide, t-butyl hydroperoxide, t-butyl peroxyacetate, t-butyl peroxyisobutyrate, 3,5,5-trimethylhexanoyl peroxide, t-butylperoxy-2- Organic peroxides such as ethyl hexanoate and di-t-butyl peroxide; 2,2′-azobisisobutyronitrile, 2,2′-azobis (2,4-dimethylvaleronitrile), 4,4 '-Azobis (4-cyanopentanoic acid), 2,2'-azo Examples thereof include azo compounds such as bis (2-methylbutyronitrile) and azobiscyclohexanecarbonitrile.
[0026]
The amount of the polymerization initiator used is preferably 0.05 to 5 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the crosslinkable monomers (B) and (C). When the amount of the polymerization initiator used is less than 0.05 parts by weight, the polymerization reaction may be insufficient, or the polymerization may take a long time. Things may be generated. This polymerization initiator may be used by dissolving in the above monomer.
[0027]
The polymer used for the filler for liquid chromatography of the present invention may be made porous by using a porosifying agent at the time of production.
When producing a porous polymer, the monomer is dissolved as a porosifying agent, but an organic solvent that does not dissolve the polymer may be added to the polymerization reaction system for polymerization. Such a porosifying agent may be a known one, for example, aromatic hydrocarbons such as toluene, xylene, diethylbenzene and dodecylbenzene; saturated hydrocarbons such as hexane, heptane, octane and decane; isoamyl alcohol and hexyl. Examples include alcohols such as alcohol and octyl alcohol.
When the amount of the porosifying agent used is increased, the pressure resistance of the resulting polymer is lowered, and the polymer is liable to swell and shrink, and moreover, aggregation is likely to occur during the polymerization. 100 parts by weight or less is preferable based on 100 parts by weight of (B) and (C).
[0028]
(Particle size of the packing material for liquid chromatography of the present invention)
The average particle size of the packing material for liquid chromatography of the present invention is preferably 0.5 to 100 μm, and the variation in particle size is preferably 15% or less as a coefficient of variation (CV) (= standard deviation ÷ average particle size × 100). Such a filler for liquid chromatography of the present invention can be obtained by classifying the polymer particles obtained by polymerization as necessary. For classification, a known method such as dry or wet may be used.
[0029]
(Use of the packing material for liquid chromatography of the present invention)
The packing material for liquid chromatography of the present invention is packed in a column made of stainless steel and used for cation exchange liquid chromatography. An appropriate method can be used for filling the column. A wet method (slurry) in which a predetermined amount is dispersed in a dispersion medium such as a solvent used as an eluent, and the column is press-fitted into the column via a packer or the like. Method) is particularly preferred.
[0030]
The substances to be measured for separation and measurement using the packing material for liquid chromatography of the present invention are all those conventionally separated by cation exchange liquid chromatography or ion chromatography. In particular, biologically relevant substances such as catecholamine derivatives, nucleotides, peptides, and proteins are suitable.
[0031]
The liquid chromatograph to which the filler of the present invention can be applied may be a known one, and includes, for example, a liquid feed pump, a sample introduction device, a column, a detector and the like. In addition, other accessories (such as a thermostatic bath or an eluent degassing device) may be attached as appropriate.
[0032]
A known eluent is used for liquid chromatography analysis using the filler of the present invention. Examples thereof include various buffer solutions containing the following substances. Inorganic acids such as phosphoric acid, nitric acid, hydrochloric acid, perchloric acid and their salts; organic acids such as acetic acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, citric acid and their salts or halides; such as sodium hydroxide and potassium hydroxide Basic substance. Further, for example, organic solvents such as acetone, acetonitrile, dioxane, methanol, and ethanol can be used, and water or a mixture of the above buffer solution and an organic solvent can also be used.
[0033]
(Work)
In the present invention 1, a monomer (A) containing one or more sulfonic acid groups in one molecule, a crosslinkable monomer (B) containing one or more hydroxyl groups in one molecule and a crosslinkable monomer (C ), And the sulfonic acid group is derived from a monomer containing one or more sulfonic acid groups, and is obtained by a conventional method of introducing a sulfonic acid group by post-treatment. Unlike conventional packing materials, there is little variation in performance as a packing material for liquid chromatography, and it can be used in a wide range of pH. Furthermore, since it has a monomer containing one or more hydroxyl groups in one molecule, non-specific adsorption of proteins and the like is reduced, so the column life is longer than that of a column packed with a conventional packing material. become longer.
Moreover, in this invention 2, since the crosslinkable monomer (B) which contains one or more hydroxyl groups in one molecule represented by the general formula (1) is used, the performance as a filler for liquid chromatography is further improved. Therefore, the column life is longer than that of a column packed with a packing material.
Moreover, in this invention 3, 10-200 weight part of monomers (A) which contain 1 or more of a sulfonic acid group in 1 molecule, crosslinkable monomer (B) 5 which contains 1 or more of hydroxyl groups in 1 molecule Since 100 parts by weight and 100 parts by weight of the crosslinkable monomer (C) are polymerized, by adding and polymerizing the monomer at a certain ratio in this way, the ion exchange capacity of the filler can be increased. Fine adjustment is possible, and substances that have been difficult to separate in the past or substances that have taken a long time in the conventional separation can be separated with high accuracy by simple elution conditions in a short time.
[0034]
【Example】
Examples of the present invention are shown below.
(Example 1)
200 g of 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid (monomer (A): manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 2-hydroxy-1,3-dimethacryloxypropane (monomer (B): Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) 200 g), 200 g of diethylene glycol dimethacrylate (monomer (C): manufactured by Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) and 1.5 g of benzoyl peroxide (polymerization initiator: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) are mixed. It was dispersed in an aqueous solution of weight% polyvinyl alcohol (manufactured by Nippon Synthetic Chemical). The temperature was raised with stirring in a nitrogen atmosphere, and polymerization was carried out at 80 ° C. for 8 hours.
After polymerization, it was washed and classified to obtain a filler having an average particle size of 5 μm.
[0035]
(Example 2)
200 g of 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid (monomer (A): manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 2-hydroxy-1,3-dimethacryloxypropane (monomer (B): Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) Polymerization was carried out in the same manner as in Example 1 except that 50 g of diethylene glycol dimethacrylate (monomer (C): Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) 400 g was used.
After polymerization, it was washed and classified to obtain a filler having an average particle size of 5 μm.
[0036]
(Example 3)
1,10-dimethacryloxy-4,7-dioxadecane-2,9-diol (monomer (B): manufactured by Kyoeisha Chemical Co., Ltd.) 100 g, triethylene glycol dimethacrylate (monomer (C): manufactured by Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) ) 1.5 g of benzoyl peroxide (polymerization initiator) was mixed with 300 g and dissolved, and dispersed in 2.5 liters of a 4 wt% polyvinyl alcohol aqueous solution. The temperature was raised with stirring under a nitrogen atmosphere, and polymerization was carried out at 80 ° C. for 1 hour.
After the polymerization, the reaction system was cooled to 30 ° C., 200 g of 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid (monomer (A): manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was added, and the mixture was stirred at 30 ° C. for 1 hour. And polymerized at 80 ° C. for 3 hours.
After polymerization, it was washed and classified to obtain a filler having an average particle size of 5 μm.
[0037]
Example 4
100 g of allylsulfonic acid (monomer (A): manufactured by Kishida Chemical Co.), 100 g of 1,10-dimethacryloxy-4,7-dioxadecane-2,9-diol (monomer (B): manufactured by Kyoeisha Chemical Co., Ltd.) 300 g of divinylbenzene (monomer (C): manufactured by Kishida Chemical Co., Ltd.), 200 g of styrene (non-crosslinkable monomer (D)), 100 g of toluene (porosifying agent) and 1.5 g of benzoyl peroxide are mixed, The resultant was dispersed in 2.5 liters of an aqueous solution of 6% by weight polyvinyl alcohol (manufactured by Nippon Synthetic Chemical). The temperature was raised with stirring in a nitrogen atmosphere, and polymerization was carried out at 80 ° C. for 8 hours.
After polymerization, it was washed and classified to obtain a filler having an average particle size of 5 μm.
[0038]
(Comparative Example 1) Examples of fillers obtained by introducing sulfonic acid groups by post-treatment:
200 g of 2-hydroxyethyl methacrylate, 40 g of ethylene glycol dimethacrylate (manufactured by Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.), 15 g of methyl methacrylate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 5 g of tert-butyl perpivalate (polymerization initiator: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) The mixed solution was dispersed in 2.5 liters of a 4 wt% polyvinyl alcohol aqueous solution in which 20 g of sodium sulfate was dissolved. The temperature was raised with stirring under a nitrogen atmosphere, and polymerization was carried out at 60 ° C. for 12 hours. After polymerization, it was washed and classified to obtain particles having an average particle size of 5 μm.
100 g of these particles were dispersed in 100 ml of a 20 wt% sodium hydroxide aqueous solution, 40 g of epichlorohydrin was added, and the mixture was reacted at room temperature for 4 hours.
Further, 100 g of the obtained particles were dispersed in 100 ml of 20 wt% sodium sulfate aqueous solution and reacted at 80 ° C. for 20 hours. The obtained particles were washed to obtain a filler.
[0039]
(Comparative Example 2) Example of sulfonic acid group-containing filler not containing monomer (B):
200 g of 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid (monomer (A): manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 400 g of diethylene glycol dimethacrylate (monomer (C): manufactured by Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) and benzoyl peroxide (polymerization) 1.5 g of initiator (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was mixed and dispersed in 2.5 liters of an aqueous solution of 4% by weight polyvinyl alcohol (manufactured by Nippon Synthetic Chemical). The temperature was raised with stirring in a nitrogen atmosphere, and polymerization was carried out at 80 ° C. for 8 hours.
After polymerization, it was washed and classified to obtain a filler having an average particle size of 5 μm.
[0040]
(Comparative Example 3) Example of sulfonic acid group-containing filler having a low monomer (B) content:
200 g of 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid (monomer (A): manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 2-hydroxy-1,3-dimethacryloxypropane (monomer (B): Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) 20 g), 400 g of diethylene glycol dimethacrylate (monomer (C): manufactured by Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) and 1.5 g of benzoyl peroxide (polymerization initiator: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) are mixed. It was dispersed in an aqueous solution of weight% polyvinyl alcohol (manufactured by Nippon Synthetic Chemical). The temperature was raised with stirring in a nitrogen atmosphere, and polymerization was carried out at 80 ° C. for 8 hours.
After polymerization, it was washed and classified to obtain a filler having an average particle size of 5 μm.
[0041]
(Performance evaluation)
About the filler obtained by the Example and the comparative example, performance evaluation was performed as follows.
(1) Manufacture of column for liquid chromatography:
0.7 g of filler was collected, dispersed in 30 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 6.0), subjected to ultrasonic treatment for 5 minutes, and then well stirred. The entire amount was injected into a packer (Umeya Seiki Co., Ltd.) connected with a stainless steel empty column (4.6φ × 35 mm). A liquid feed pump (manufactured by Sanuki Kogyo Co., Ltd.) was connected to the packer and packed at a constant pressure of 200 kg / cm @ 2 to produce a liquid chromatography column.
[0042]
(2) Measurement of protein mixture:
A mixture of protein standards was measured using the columns packed with the packing materials obtained in Examples 1 and 2 and Comparative Example 1, respectively.
(Measurement condition)
System: Liquid feed pump: LC-9A (manufactured by Shimadzu Corporation)
Autosampler: ASU-420 (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.)
Detector: SPD-6AV (manufactured by Shimadzu Corporation)
Eluent: Eluted by a linear gradient method from eluent A100% to eluent B100%.
Eluent A: 100 mM phosphate buffer (pH 5.7)
Eluent B: Eluent A + 500 mM NaCl (pH 5.7)
Flow rate: 1.5 ml / min Detection wavelength: 254 nm
Sample injection volume: 10 μl
[0043]
(Measurement sample)
Mixture of myoglobin, α-chymotrypsinogen, ribonuclease A, lysozyme (all of which are manufactured by Sigma)
(Measurement result)
The chromatogram when using the filler obtained in Example 1 is shown in FIG. 1, and the chromatogram when using the filler obtained in Comparative Example 1 is shown in FIG. 2 (in addition, obtained in Example 4). The chromatogram when the filler was used was the same as in FIG.
In the figure, peak 1 represents myoglobin, peak 2 represents α-chymotrypsinogen, peak 3 represents ribonuclease A, and peak 4 represents lysozyme.
FIG. 1 shows that the separation of each peak is better in spite of the short time measurement compared to FIG.
[0045]
(3) Measurement of hemoglobins in human blood Using the columns filled with the packing materials obtained in Examples 2 and 3 and Comparative Example 1, respectively, glycated hemoglobin (Hb ) And Hb were measured.
[0046]
(Measurement condition)
System: (2) Same as the system used for the measurement of the protein mixture.
Eluent: Eluted by a step gradient method using two types of buffers including phosphate and perchlorate. The salt concentration and pH of the eluent C were appropriately adjusted so that the retention time of stable hemoglobin A1c (stable HbA1c) was appropriate.
Eluent C: Salt concentration was adjusted between 15-100 mM, pH 5.6-6.0.
Eluent D: Salt concentration 300 mM, pH 7.2.
Flow rate: 1.5 ml / min Detection wavelength: 415 nm
[0047]
(Measurement sample)
Healthy human blood was collected and added as an anticoagulant to a concentration of 10 mg / ml sodium fluoride. Glucose was added to this so that it might become 500 mg / dl, and it was made to react at 37 degreeC for 5 hours, and then a hemolysis reagent (0.1 weight% polyethyleneglycol mono-4-octylphenyl ether (Triton X-100 as a surfactant) was added. ) (Manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., phosphate buffer solution (pH 7.0)) and diluted 150 times to obtain a measurement sample.
[0048]
(Measurement result)
FIGS. 3 and 4 show chromatograms when the fillers obtained in Examples 2 and 3 are used, and FIG. 5 shows chromatograms when the fillers obtained in Comparative Example 1 are used.
In the figure, peak 5 represents hemoglobin A1a and b (HbA1a and b); peak 6 represents hemoglobin F (HbF); peak 7 represents unstable HbA1c; peak 8 represents stable HbA1c; peak 9 represents hemoglobin A0 (HbA0). .
In order to ensure good quantification of HbF (peak 6) and stable HbA1c peak (peak 8), which is an index for diabetes diagnosis, it is necessary to elute HbF, unstable HbA1c, stable HbA1c, and HbA0 in this order. However, in FIGS. 3 and 4, it can be seen that the peaks are eluted in this order, and that the peaks are well separated despite the short-time measurement. In FIG. 5, the separation of each peak was bad despite the long measurement time, and some peaks were not detected.
[0049]
(4) Evaluation of difference between filler lots:
The difference between lots of the filler having a sulfonic acid group of the present invention (Example 3) and the filler by a conventional method in which a sulfonic acid group was introduced by post-treatment (Comparative Example 1) were confirmed as follows.
Polymerization was performed 30 times, and the performance variation among 30 lots of the obtained fillers was observed.
Measurement of hemoglobin in human blood in the above evaluation (3) was carried out for each 30 lots of each filler, and the retention time of stable HbA1c at peak 8 was examined. The eluent C was prepared for each filler so that the retention time of peak 8 was about 2 minutes.
[0050]
(Measurement result)
The average retention time of the filler having a sulfonic acid group (Example 3) is 2.2 minutes, the standard deviation is 0.15 minutes, and the variation count (CV (%) = standard deviation ÷ average retention time × 100) was 6.82%.
On the other hand, the average retention time of the filler according to the conventional method (Comparative Example 1) is 2.2 minutes, the standard deviation is 0.91 minutes, and the variation count (CV (%) = standard deviation ÷ average retention time × 100)
It was 41.1%.
From the above, it was found that the filler of the present invention is excellent in production reproducibility.
[0051]
(5) Evaluation of column life:
Using the columns packed with the packing materials of Examples 2 and 3 and Comparative Examples 2 and 3, the measurement of hemoglobin in human blood in the above evaluation (3) was repeated, and the stability of peak 8 represented by the following formula was confirmed. The change in the area value of the type HbA1c was examined.
Area value of peak 8 (%) = (area of peak 8) ÷ (area of all peaks) × 100
[0052]
(Measurement result)
The measurement results are shown in FIG. In FIG. 6, the horizontal axis represents the number of repeated measurements, and the vertical axis represents the value (%) of the area value of the stable HbA1c at each time, expressed as a relative percentage with the initial measurement value being 100.
From FIG. 6, the fillers of Examples 2 and 3 show good measured values even after 3000 measurements, while the measured values of the fillers of Comparative Examples 2 and 3 decrease as the number of measurements increases. It turns out that accurate measurement is no longer possible.
[0053]
【The invention's effect】
In the present invention 1, a monomer (A) containing one or more sulfonic acid groups in one molecule, a crosslinkable monomer (B) containing one or more hydroxyl groups in one molecule and a crosslinkable monomer (C ) As a structural unit, there is little variation in the performance as a packing material for liquid chromatography, it can be used in a wide range of pH, and the column life is longer than a column packed with a conventional packing material. .
In the second aspect of the invention, since the crosslinkable monomer (B) containing one or more hydroxyl groups in one molecule represented by the general formula (1) is used, a column packed with a conventional packing is further used. In comparison, the column life is increased.
Further, in the present invention 3, since the crosslinkable monomer (B) having one or more hydroxyl groups in one molecule is 5 to 50 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the polymer, it is difficult to separate conventionally. Substances that have taken a long time for separation can be separated with high accuracy by simple elution conditions in a short time.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a chromatogram obtained when a protein mixture is measured using the filler obtained in Example 1. FIG.
FIG. 2 is a diagram showing a chromatogram obtained when a protein mixture was measured using the filler obtained in Comparative Example 1.
3 is a diagram showing a chromatogram obtained when Hb was measured using the filler obtained in Example 2. FIG.
FIG. 4 is a diagram showing a chromatogram obtained when Hb was measured using the filler obtained in Example 3.
5 is a diagram showing a chromatogram obtained when measuring Hb using the filler obtained in Comparative Example 1. FIG.
FIG. 6 is a graph showing the results of column life evaluation, where the horizontal axis represents the number of repeated measurements, and the vertical axis represents the area value of stable HbA1c each time, expressed as a relative percentage with the initial measurement value being 100. Value (%).
[Explanation of symbols]
1 Peak of myoglobin 2 Peak of α-chymotrypsinogen 3 Peak of ribonuclease A 4 Peak of lysozyme 5 Peak of HbA1a and b 6 Peak of HbF 7 Peak of unstable HbA1c 8 Peak of stable HbA1c 9 Peak of HbA0

Claims

10 to 200 parts by weight of monomer (A) containing one or more sulfonic acid groups in one molecule 5 to 100 parts by weight of crosslinkable monomer (B) containing one or more hydroxyl groups in one molecule and crosslinkability Monomer (C) A filler for liquid chromatography, comprising a polymer having 100 parts by weight as a structural unit.

The crosslinkable monomer (B) containing one or more hydroxyl groups in one molecule is represented by the general formula (1);
R ¹ (CH ₂ OCOCR ² = CH ₂ ) ₂ (1)
(In the formula, R ¹ is an integer having 1 to 10 carbon atoms in the straight chain portion, and an alkylene group in which a hydrogen atom is substituted with one or more hydroxyl groups, or the number of carbon atoms in the straight chain portion) The sum of the number of oxygen atoms is an integer of 2 to 10 and represents an oxaalkylene group in which a hydrogen atom is substituted with one or more hydroxyl groups, wherein R ² represents a hydrogen atom or a methyl group. The filler for liquid chromatography according to claim 1, wherein