JP4264183B2 - 核酸の検出方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
この発明は、DNAやRNAなどの核酸を検出する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
DNAやRNAなどの核酸(NA)を検出する従来の手法として螢光法がある。この螢光法は、スライドガラスの表面に数百〜数万種類のプローブ核酸(固相プローブ)を固定して設け、このプローブ核酸に螢光物質で標識処理したターゲット核酸(液相プローブ)を試料として供給して、相補的な核酸どうしをハイブリダイズ(対合)させ、ハイブリダイズしなかったターゲット核酸を流し去り、プローブ核酸とターゲット核酸とがハイブリダイズして生成された複合体の螢光を、螢光レーザ顕微鏡やCCDカメラからなる光学系およびこれに接続されたコンピュータなどを備えた装置を用いて検出して、その場所を特定するというものである。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記螢光法においては、発生する螢光の強度が微弱であり、その光を検出することが困難であるため、螢光レーザ顕微鏡として大がかりかつ高価なものを用いる必要があるとともに、検出信号の飽和によって定量性が低下するといった問題がある。
【0004】
この発明は、上述の事柄に留意してなされたもので、その目的は、DNAやRNAなどの核酸を高感度かつ迅速にしかも安価な構成によって測定することができる核酸の検出方法を提供することである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、この発明の核酸の検出方法は、複数のプローブ核酸を固定した樹脂製メンブレンを二次元pH分布測定装置のセンサ面上に載置し、単鎖状のターゲット核酸を試料としてメンブレン上に供給して、プローブ核酸とターゲット核酸とをハイブリダイズさせ、そのとき生ずるプローブ核酸とターゲット核酸との複合体を基質と反応して水素イオンを増加または減少させる酵素によって標識処理し、この標識処理した複合体に前記基質を加えて、前記酵素と前記基質とによって反応を起こさせ、この反応によって増加または減少する水素イオンを前記センサ面によって検出するようにしている(請求項1)。
【0006】
上記核酸の検出方法においては、複数のプローブ核酸を樹脂製メンブレン上における位置とセンサ面における載置位置とを対応させておく。そして、センサ面上において酵素、好ましくは酸化還元酵素と基質とによって反応を起こさせ、この反応によって増加または減少する水素イオンを、二次元pH分布測定装置のセンサ面によって検出するようにしているので、どの位置のプローブ核酸においてpHが変化したかを把握することができ、これにより、ターゲット核酸を検出することができる。
【0007】
したがって、従来の螢光法のように高価かつ大がかりな光学系を用いる必要がなく、安価かつ簡単な構成で核酸を検出することができる。そして、加える基質の量を適宜加減することにより、水素イオンの増加または減少量を調整することができ、高感度検出が可能になる。
【0008】
また、上記核酸の検出方法においては、プローブ核酸をナイロンなどの樹脂製メンブレン上に固定し、これにターゲット核酸を加えるようにしているので、樹脂製メンブレンを取り替えるだけで、二次元pH分布測定装置のセンサ面については再利用が可能である。したがって、ランニングコストが安くなる。
【0009】
さらに、上記核酸の検出方法においては、水素イオンを二次元pH分布測定装置のセンサ面によって検出するようにしており、その経時変化を把握することができる。
【0010】
なお、前記プローブ核酸とターゲット核酸の組み合わせとしては、
プローブDNAとターゲットDNA
プローブRNAとターゲットRNA
プローブDNAとターゲットRNA
プローブRNAとターゲットDNA
がある。
【0011】
そして、上記核酸の検出方法において、請求項2に記載してあるように、単鎖状のターゲット核酸を酵素、好ましくは酸化還元酵素によって予め標識処理しておいてもよい。
【0012】
また、上記核酸の検出方法において、請求項3または4に記載してあるように、センサ面上にプローブ核酸を直に固定し、このプローブ核酸にターゲット核酸を試料として加えるようにしてもよい。
【0013】
さらに、上記核酸の検出方法において、請求項6に記載してあるように、複合体に基質を加える際、補酵素、補欠分子または金属イオンなどのコファクターも加えるようにしてもよい。
【0014】
【発明の実施の形態】
この発明の実施の形態を、図面を参照しながら説明する。図1および図2は、この発明の第1の実施の形態を示す。まず、図1は、この発明の核酸の検出方法を実施するための装置の一例を示すもので、この図において、1は二次元pH分布測定装置、2はこの装置の上部に形成される平面視矩形状のセンサ面で、例えば2cm×2cm程度の大きさを有し、複数のpHセンサ素子2aよりなり、pHの二次元分布を検出できるように構成されている。この二次元pH分布測定装置としては、例えば特開平10−332423号公報に示すように、特に、図6に示すようなCCDを用いたpHの二次元分布を測定する二次元pH分布測定装置(化学CCD装置)がある。この化学CCD装置は、水素イオン濃度(pH)に対応して深さを変化するように構成されたポテンシャル井戸をセンサ素子として複数個二次元的に配置し、これらのポテンシャル井戸に電荷を注入して、pHの大きさをこのポテンシャル井戸の大きさに応じた電荷に変換するように構成したものである。
【0015】
そして、図1において、3は化学CCD装置1からの出力信号を処理し、画像出力することができるコンピュータなどの画像出力装置で、センサ面2におけるpH分布を二次元的に表示するカラーディスプレイ4を備えている。
【0016】
次に、上記化学CCD装置1を用いた核酸の検出方法の一例を、プローブDNAとターゲットDNAとの組み合わせを例に挙げて、図2をも参照しながら説明する。なお、図1の矢印Xは、処理プロセスの進行方向を示している。
【0017】
まず、プローブDNA(固相プローブ)5とするDNAをPCR増幅して採取する(図2中の符号A参照)。
【0018】
前記増幅された複数の互いに異なるプローブDNA5を、マイクロアレイヤー(スポッター)を用いてナイロンメンブレン6上にプロットし、UVクロスリンカーで固定する(図2中の符号B参照)。ここで用いるナイロンメンブレン6は、例えば厚み数十〜数百μmで、センサ面2とほぼ同じ大きさである。そして、複数のプローブDNA5を固定したナイロンメンブレン6を化学CCD装置1のセンサ面2上に載置する(図2中の符号D参照)。この場合、ナイロンメンブレン6上に設けられた複数のプローブDNA5の載置位置は、画像出力装置3のメモリ内にデータとして記憶しておく。なお、4aは、センサ面2を構成する複数のセンサ素子に対応する位置を示しており、この各位置に対応するようにプローブDNA5が位置している。
【0019】
一方、ターゲットDNA(液相プローブ)8は、二重らせん構造のDNA7を熱またはアルカリ処理して単鎖状とするか、あるいは、直接単鎖状のDNAを化学合成して作成する。その前後のいずれかにおいて標識処理を行う。具体的には、二重らせん構造のDNA7にポリメラーゼ反応を利用してビオチンなどのリンク剤9が結合したヌクレオチドを取り込ませて標識処理した後、熱またはアルカリで処理して単鎖状のターゲットDNA8とする。あるいは、単鎖状のDNAを化学合成する際に末端をビオチンまたはジゴキシゲニンなどのリンク剤9によって標識処理しターゲットDNA8とする。あるいは、二重らせん構造のDNA7を熱またはアルカリで処理して単鎖状のターゲットDNA8とし、各ターゲットDNA8の末端をビオチンまたはジゴキシゲニンなどのリンク剤9によって標識処理し(図2中の符号C参照)、これを試料とする。
【0020】
前記標識処理したターゲットDNA8を試料としてナイロンメンブレン6上に供給して、プローブDNAとターゲットDNAとをハイブリダイゼーション操作を行う(図2中の符号D参照)。このとき、いくつかのターゲットDNA8は、プローブDNA5とハイブリダイズし、複合体10を形成する。そして、洗浄液によってナイロンメンブレン6上を洗浄し、プローブDNA5と複合体10を形成しなかったターゲットDNA8’を除去する(図2中の符号D参照)。
【0021】
次いで、ビオチン化酵素(好ましくはビオチン化ベルオキシダーゼ)あるいはアビジン、ビオチン化酵素(好ましくはビオチン化ベルオキシダーゼ)を用いたABC法により、あるいは、酵素標識抗ジゴキシゲニン抗体(好ましくは抗ジゴキシゲニン−ポリペルオキシダーゼ抗体)を用いた方法により、前記プローブDNA5とターゲットDNA8との複合体10を、例えばペルオキシダーゼやグルコースオキシダーゼなどの酸化還元酵素11で標識処理する(図2中の符号E参照)。なお、符号11’は余剰の酸化還元酵素である。
【0022】
そして、前記酸化還元酵素11によって標識処理した複合体10に、例えば過酸化水素とフェノール誘導体あるいはグルコースなどの基質12を加え、酸化還元酵素と基質(必要によっては補酵素や金属イオンなどのコファクター)とによって酸化還元反応を起こさせる(図2中の符号F参照)。そして、この酸化還元反応によってH+ イオン13が生じ、このH+ イオン13は、センサ面2によって検出される。化学CCD装置1では、センサ面2における各センサ素子におけるpHに関連した信号が1次データとして画像出力装置3に送られ、これを二次元情報に変換することにより、ディスプレイ4上において,pHが変化した場所の色が変化してカラー表示され、コンピュータ処理により、ターゲットDNA8の塩基配列などが判断できる。また、複合体10となったDNAの位置を目視によっても確認することができ、試料中に含まれるターゲットDNA8を確認することができる。なお、図2において、4aはpHが変化した部分を示し、また、12’は余剰の基質を示している。
【0023】
上述のように、この発明の核酸の検出方法においては、従来の螢光法のように高価かつ大がかりな光学系を用いる必要がなく、安価かつ簡単な構成で核酸を検出することができる。そして、加える基質の量を適宜加減することにより、H+ イオン13の発生量を調整することができ、高感度検出が可能になる。
【0024】
また、上記核酸の検出方法においては、プローブDNA5をナイロンメンブレン6上に固定し、これにターゲットDNA8を加えるようにしているので、ナイロンメンブレン6を取り替えるだけで、センサ面2、すなわち、化学CCD装置1については再利用が可能である。したがって、ランニングコストが安くなる。
【0025】
さらに、上記核酸の検出方法においては、pH変化を化学CCD装置1のセンサ面2によって検出するようにしており、その経時変化を把握することができる。
【0026】
図3は、この発明の第2の実施の形態を示し、この実施の形態においては、プローブDNA5を化学CCD装置1のセンサ面2上に直接固定している。この第2の実施の形態におけるプローブDNA5の採取方法や固定方法やその後の処理は、第1の実施の形態における方法および処理と同様であるので、その詳細な説明を省略する。なお、図中の6bはセンサ面2を構成する複数のセンサ素子に対応する固定位置を示している。
【0027】
上述の第1および第2の実施の形態においては、複合体10を酸化還元酵素11によって標識処理していたが、これに代えて、図4に示す実施の形態のように、ターゲットDNA8を酸化還元酵素11によって標識処理してもよい。
【0028】
上述の実施の形態は、いずれもDNAについての検出方法であったが、この発明の核酸の検出方法は、RNAについても同様に適用することができ、この場合、RNAを逆転写反応を行ってターゲットDNAやプローブDNAを形成すればよく、後の操作は、上記各実施の形態と同様である。また、RNAをプローブRNAとしてナイロンメンブレン6上あるいはセンサ面2上に固定することもできる。
【0029】
上記実施の形態においては、pHの変化を化学CCD装置1によって検出するようにしていたが、この発明はこれに限られるものではなく、種々の二次元pH分布測定装置を用いることができる。例えば、特開平8−213580号公報や特開平8−320305号公報などに記載されている二次元pH分布測定装置や、特公平5−33445号公報に記載されているCMOS型センサ、あるいは、プローブDNA5の数が少ない場合には、実開平4−24061号公報に記載されているISFETアレイを用いることができる。さらに、Sensors and Actuators B61(1999)154−162に記載されているように、複数のセンサ電極を設け、各電極に電圧を加えてピロール付加したプローブDNAを、各電極に固定するようにしてもよい。この場合、電極の横にpHセンサを設ける必要がある。
【0030】
また、基質12と酸化還元反応を起こす酸化還元酵素11として、グルコースディヒドロゲナーゼなどの脱水素酵素を用いてもよく、さらに、複合体10に基質12を加える際、NAD、NADP、NADH、NADPHなどの補酵素も加えるようにしてもよい。
【0031】
さらに、ナイロンメンブレン6に代えて、ニトロセルロースのような他の樹脂製メンブレンを用いるようにしてもよい。
【0032】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明の核酸の検出方法によれば、DNAなどの核酸を高感度かつ迅速にしかも安価な構成によって測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】 この発明の核酸の検出方法を実施する装置の全体構成を概略的に示す図である。
【図2】 前記核酸の検出方法における操作手順の一例を説明するための図である。
【図3】 この発明の他の実施の形態を示す図である。
【図4】 この発明の核酸の検出方法における操作手順の他の例を説明するための図である。
【符号の説明】
1…二次元pH分布測定装置、2…センサ面、5…プローブ核酸、6…樹脂製メンブレン、8…ターゲット核酸、10…複合体、11…酵素、12…基質、13…水素イオン。
Claims (6)
- 複数のプローブ核酸を固定した樹脂製メンブレンを二次元pH分布測定装置のセンサ面上に載置し、単鎖状のターゲット核酸を試料としてメンブレン上に供給して、プローブ核酸とターゲット核酸とをハイブリダイズさせ、そのとき生ずるプローブ核酸とターゲット核酸との複合体を基質と反応して水素イオンを増加または減少させる酵素によって標識処理し、この標識処理した複合体に前記基質を加えて、前記酵素と前記基質とによって反応を起こさせ、この反応によって増加または減少する水素イオンを前記センサ面によって検出するようにしたことを特徴とする核酸の検出方法。
- 複数のプローブ核酸を固定した樹脂製メンブレンを二次元pH分布測定装置のセンサ面上に載置し、基質と反応して水素イオンを増加または減少させる酵素によって標識処理した単鎖状のターゲット核酸を試料としてメンブレン上に供給して、プローブ核酸とターゲット核酸とをハイブリダイズさせ、そのとき生ずるプローブ核酸とターゲット核酸との複合体に前記基質を加えて、前記酵素と前記基質とによる反応を起こさせ、この反応によって増加または減少する水素イオンを前記センサ面によって検出するようにしたことを特徴とする核酸の検出方法。
- 複数のプローブ核酸を二次元pH分布測定装置のセンサ面上に固定し、単鎖状のターゲット核酸を試料としてセンサ面上に供給して、プローブ核酸とターゲット核酸とをハイブリダイズさせ、そのとき生ずるプローブ核酸とターゲット核酸との複合体を基質と反応して水素イオンを増加または減少させる酵素によって標識処理し、この標識処理した複合体に前記基質を加えて、前記酵素と前記基質とによる反応を起こさせ、この反応によって増加または減少する水素イオンを前記センサ面によって検出するようにしたことを特徴とする核酸の検出方法。
- 複数のプローブ核酸を二次元pH分布測定装置のセンサ面上に固定し、基質と反応して水素イオンを増加または減少させる酵素によって標識処理した単鎖状のターゲット核酸を試料としてセンサ面上に供給して、プローブ核酸とターゲット核酸とをハイブリダイズさせ、そのとき生ずるプローブ核酸とターゲット核酸との複合体に前記基質を加えて、前記酵素と前記基質とによる反応を起こさせ、この反応によって増加または減少する水素イオンを前記センサ面によって検出するようにしたことを特徴とする核酸の検出方法。
- 酵素が酸化還元酵素である請求項1〜4のいずれかに記載の核酸の検出方法。
- 複合体に基質を加える際、補酵素、補欠分子または金属イオンなどのコファクターも加えるようにした請求項1〜5のいずれかに記載の核酸の検出方法。
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