JP4260245B2 - Method for preventing degradation of reduced nicotinamide adenine dinucleotides and reagent for preventing degradation - Google Patents

Description

【０００５】
従来、これらの試薬は、酵素等を含むものについてはその保存性を考慮して凍結乾燥の状態で供給され、使用時に緩衝液等で溶解して用いるようになっていた。しかしながら、近年はその調製の手間を省くために、当初から溶液状態のいわゆる液状試薬が広く普及してきた。特に、液状試薬の場合には、そこに含まれる酵素等の各組成成分の安定化が重要である。当然、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類もその対象であり、安定化方法に関する報告も多い。例えば、ホウ酸を添加する方法（特開昭６２−１９８６９７号公報）やアルカリ金属を添加する方法（特開平７−２２９１９２号公報）等が開示されている。
【０００６】
補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の溶液での安定性は、一般に還元型がアルカリ性溶液中で安定であり、酸化型は酸性溶液中で安定であることが知られている。実際に、還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を利用した測定試薬で、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）や還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を含有する溶液が液状試薬であればそのｐＨはアルカリ性のものが多く、その他の組成成分の組み合わせが工夫されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、本発明者が見いだしたところによれば、例えば、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）が安定なアルカリ性の条件下において、共存する酵素活性が低下しないにもかかわらず、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の含量のみが極端に低下するという問題が発生することがある。生理活性物質測定系において、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の含量が低下すると目的とする生理活性物質の正確な測定値が得られなくなってしまう。その一般的な原因を本発明者が探求したところ、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）を分解する夾雑物質が、種々のルートから測定系に混入してくることが分かった。
【０００８】
生体試料中の生理活性物質測定方法において、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を用いる測定系では酵素反応を利用するので、多くの場合、補酵素と酵素とを共存させる。補酵素と共存させる酵素は、動物組織や細菌等から精製された標品である場合がほとんどである。補酵素と共存させる酵素中にＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の含量を低下させ、本来の反応を阻害する物質が夾雑酵素として存在していると、生理活性物質を測定する場合に、正確な値が得られないことになる。
例えば、試薬の性能評価において、その試薬の測定上限の性能を評価する目的で、測定対象の生理活性物質が極端に高値の検体を測定する場合がある。通常の生体試料（血清等）それ自体では測定上限を評価するための検体としては十分ではないので、目的の生理活性物質を添加して人為的に高値となるように検体を調製するか、あるいは目的に合う市販の管理血清を検体として使用することになる。特に市販の管理血清は、目的物質のみならず同時に数種類の生理活性物質を有しているものが一般的である。また、その調製は、ベースとなる血清に動物組織や細菌等から精製された標品を測定目的物質として添加する。ここで、添加された標品中にＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の含量を低下させ、反応の場で酵素反応を阻害する物質が夾雑していた場合には、目的の生理活性物質の正確な測定値が得られないこととなる。
【０００９】
本発明者は、後述する参考例１に示すように、自動分析機によるＧＰＴ測定において、反応を阻害する夾雑物質を含む検体及び夾雑物質を含まない検体（添加されたＧＰＴは同程度の活性のもの）を同一の液状試薬で測定した。その結果、夾雑物質含有検体では、直線性が１０００ｕ／ｌ程度までしか認められないが、夾雑物質不含検体では直線性が２０００ｕ／ｌ程度まで認められた。このことは、本来なら、高値検体として測定されなければならない検体において、反応を阻害する夾雑物質が存在する場合には、所望の値が得られないことを示している。測定物質の正確な値が得られないと、生理活性物質を各種疾病の診断の指標としている医療分野に与える影響は甚大である。
【００１０】
補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を利用した酵素法による生理活性物質測定は、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の変化量を波長３４０ｎｍの吸光度変化量として検出して測定する。更に詳述すれば、自動分析機においては、酵素反応によるＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の吸光度の減少を利用して、あらかじめ設定した測光時間時間内で、一定の間隔で測定された吸光度から反応の速度（傾き）を求め、更に単位時間当たりの吸光度の減少速度を求め、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の分子吸光係数から生理活性物質の値を算出する。又は、標準液を用いる場合は、標準液と検体との吸光度の差により目的の生理活性物質の値を算出する。ここでＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）の存在量が保存中の含量の低下によって不足していたり、反応の場に共存する夾雑物質により酵素反応が阻害を受けると、正確な反応速度や、吸光度が得られないため、算出された値も不正確となる。
【００１１】
本発明者は上記のようなニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含んだ測定系において、従来使用されてきた凍結乾燥品の試薬ではなく、近年使用されるようになった液状試薬を用いた場合に、反応阻害が生じる点に着目し、その原因を追求した。その主要因は、吸光度変化の指標となるＮＡＤＨが夾雑物質として存在するヌクレオチドピロフォスファターゼにより、ＮＭＮＨ（還元型ニコチンアミドモノヌクレオチド）へ分解されることにあると考えられる。ＮＭＮＨもＮＡＤＨと同様に３４０ｎｍに最大吸収をもつため、吸収特性の面からは区別することができない。更に、ＮＭＮＨは、各種脱水素酵素とは反応しないために、本来所望の酵素反応が阻害を受けてしまうことも判明した。
【００１２】
この点に関して、後述する参考例２に示すように、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類と動物由来の酵素とを含む液状試薬を保存した場合に、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）が経時的に分解されＮＭＮＨが生成することを確認した。また、前記参考例１のＧＰＴ測定例においても、夾雑物質含有検体と、安定な液状試薬として供給されている弱アルカリ性のＮＡＤＨ含有液状試薬（ｐＨ９．２）とを共存させておくと、経時的にＮＡＤＨが分解されてＮＭＮＨが生成することが確認された。
【００１３】
更に、参考例１において、自動分析機の測定で得られる一定間隔で測定された吸光度変化（いわゆるタイムコース）をグラフ化すると、ＧＰＴの反応阻害が生じる夾雑物質含有検体と、反応阻害が生じない夾雑物質不含検体では明らかに差があった。すなわち、ＧＰＴの反応阻害が生じない夾雑物質不含検体では、酵素反応が終了した時点での吸光度が一定であったのに対して、反応阻害が生じる夾雑物質含有検体では、希釈列が高濃度になるほど反応終了時の吸光度が上昇していった。反応終了時の吸光度の上昇は、希釈列が高濃度になるに従って、ＮＡＤＨが分解して生じるＮＭＮＨの生成量が多くなることを示している。
【００１４】
夾雑物質として存在すると思われるヌクレオチドピロフォスファターゼの反応の至適ｐＨは、弱アルカリ性にあると考えられる。すなわち、従来の凍結乾燥品から液状試薬に移行し、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の安定化のために、ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）を含む溶液のｐＨがアルカリ性になったことにより、従来には全く予期することができなかった前記のような新たな問題が発生しているのである。
【００１５】
従って、本発明の目的は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類含有液状試薬が関与する測定系において、その液状試薬の他の成分や検体中に存在する夾雑物質による前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類からニコチンアミドモノヌクレオチドへの分解を有効に防止する手段を提供することにある。例えば、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を安定に供給することができる条件下、例えばアルカリ性の環境で、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが、精製された各種酵素と共存した場合の含量低下や、目的の生理活性物質である酵素標品が高濃度で添加された検体（例えば、市販管理血清）を測定する場合に、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止し、且つ、その酵素測定系での主要酵素反応の反応阻害を起こさずに、目的とする生理活性物質を正確に測定する手段を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む液状試薬と、検体とを、ｐＨ値が７．５〜１１の条件下で接触させる測定系に、キレート剤を共存させることを特徴とする、夾雑物質の干渉作用による前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類から還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへの分解を防止する方法に関する。
また、本発明は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類と、その還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへ分解する夾雑物質とを含み、ｐＨ値が７．５〜１１の液状試薬に、キレート剤を共存させることを特徴とする、前記夾雑物質の干渉作用による前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類から還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへの分解を防止する方法にも関する。
更に、本明細書では、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類とキレート剤とを含み、ｐＨ値が７．５〜１１である液状試薬を開示する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳述する。
本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む任意の液状試薬に適用することができる。すなわち、任意の「生理活性物質」の測定に用いる液状試薬、特に生体試料（例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、細胞もしくは組織抽出液、唾液、汗）に存在する臨床検査の対象となる任意の物質、例えば、各種の酵素の測定に用いる液状試薬に適用することができる。測定対象物質としては、例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、α−オキシ酪酸脱水素酵素（ＨＢＤ）、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）、尿素窒素（ＵＮ）、又はクレアチニン（ＣＲＥ）などを挙げることができる。いずれの項目もニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を利用した測定系で測定することが可能なため、本発明を好適に適用することができる。
【００１８】
ここで「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む液状試薬」とは、測定に使用するまで、夾雑物質を含む酵素や他の添加成分と共に比較的長期間にわたって保存される保存用液体試薬を意味するだけでなく、保存時には、夾雑物質を含む酵素や他の添加成分と共存しないが、測定時に、夾雑物質を含む検体とアルカリ性条件下で（例えば、２試薬系測定試薬など多試薬系測定試薬の第１試薬と）接触する液状試薬も含まれる。
【００１９】
本発明は、ｐＨがアルカリ性に維持された液状試薬に適用する。具体的にはｐＨ７．５〜１１（好ましくは８．５〜１０）の範囲である。
ｐＨ値が７．５より低いと還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の保存安定性が不十分であったり、またｐＨ値が１１より高いと反応の雰囲気調整が難しくなったり、分析装置への影響等が懸念され好ましくない。
【００２０】
本発明で用いることのできるキレート剤は、金属イオンに配位し、水溶性キレート化合物を与える多座配位子であり、具体的には、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸塩（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸塩（ＧＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＰＯ）、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩（ＥＤＤＰ）、ヘキサメチレンジアミン四酢酸塩（ＨＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン−ビス（メチレンホスホン酸）（ＥＤＤＰＯ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（ＮＴＰＯ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）等及びこれらの塩を挙げることができる。
【００２１】
本発明方法においては、前記のキレート剤を液状試薬に添加するか、あるいは酵素反応測定時にその測定系に単独で添加することもできる。例えば、保存用液状試薬中に夾雑物質が存在する場合には、保存用液状試薬中に前記キレート剤を添加する必要がある。また、保存用液状試薬中には夾雑物質が存在せず、酵素反応の実施時に、例えば、検体に含まれている夾雑物質が測定系に混入してくる場合には、前記キレート剤を、保存用液状試薬に予め含有させておくこともできるし、保存用試薬とは別に、前記キレート剤を、その測定系に添加することもできる。特に、２試薬系測定試薬などの場合には、第１試薬と検体とをアルカリ性条件下で一定時間接触させてから、その混合液を第２試薬と中性条件下で接触させ、酵素反応を実施する場合が多い。従って、夾雑物質が検体に含まれている場合には、少なくともアルカリ性条件下での第１試薬との接触時にキレート剤を存在させる必要があり、キレート剤を予め保存用液状試薬（例えば、保存用液状第１試薬）に含有させておくか、あるいはキレート剤を別途、検体と共に反応系に添加することもできる。
【００２２】
本発明において使用するキレート剤の濃度は、夾雑物質（おそらくヌクレオチドピロフォスファターゼ）によって還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が還元型ニコチンアミドモノヌクレオチドへ分解されることを実質的に防止することのできる濃度である。個々の測定系や液状試薬におけるキレート剤の濃度は、本発明が適用される測定系や液状試薬において夾雑物質として共存するヌクレオチドピロフォスファターゼの由来や共存量に依存するため、適用される測定系や液状試薬に使用されるキレート剤の種類に基づいて、当業者が適宜決定することができる。
【００２３】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類と前記に示したキレート剤の組合せとしては、特に限定されないが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む溶液の環境において、夾雑物質（おそらく、ヌクレオチドピロフォスファターゼ）によるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止する効果のあるキレート剤を適宜選択して使用することができる。また、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止するために上記のキレート剤を数種混合して添加することもできる。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を分解する夾雑物質（おそらく、ヌクレオチドピロフォスファターゼ）の由来によって分解反応の至適ｐＨは異なり、また防止効果のあるキレート剤の種類も異なる。従って、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の種類とその環境及び夾雑物質（おそらく、ヌクレオチドピロフォスファターゼ）の由来により、効果のあるキレート剤の一種類又は数種類を選択し、具体的な添加量も、使用する個々の測定系に応じて適宜決定することができる。
【００２４】
例えば、安定化された液状試薬を用いるＧＰＴ測定系において、使用するＮＡＤＨを含む溶液のｐＨは、一般にアルカリ性である。更に、ＮＡＤＨを利用するＧＰＴの測定は、ほとんどの場合ＬＤＨを共役酵素としている。従って、液状試薬の場合、ＮＡＤＨはアルカリ性の条件下でＬＤＨと長期間（例えば半年以上）共存することとなる。この場合、ＮＡＤＨと共存させるＬＤＨは、その由来が動物組織や細菌である。動物組織や細菌から精製されたＬＤＨ中にヌクレオチドピロフォスファターゼが夾雑酵素として存在していた場合には、ＮＡＤＨ溶液の長期間の保存中にＮＡＤＨが分解されＮＭＮＨが生成される。ＮＭＮＨはＮＡＤＨと同様に３４０ｎｍに吸収があるために吸光度上では区別することができないので見かけ上ＮＡＤＨの量が維持されているように見えてしまう。この試薬でＧＰＴ活性の測定を行うと、実際のＮＡＤＨ量が少ないために、所望の測定値が得られない。そこで、夾雑物質（おそらく、ヌクレオチドピロフォスファターゼ）が共存しているＮＡＤＨ溶液中にキレート剤としてＥＤＴＡ・２Ｎａを添加するとＮＡＤＨの分解反応を防止することができる。この時のＥＤＴＡ・２Ｎａ添加濃度は０．１ｍｍｏｌ／ｌ以上で夾雑物質による反応阻害を防止する効果があり、特に１〜５０ｍｍｏｌ／ｌが好ましい。５０ｍｍｏｌ／ｌを超えると、ＮＡＤＨの分解反応の防止には効果があるものの、主要酵素反応であるＧＰＴの反応が影響を受け、ＧＰＴ活性値が低くなる傾向があるため好ましくない。
【００２５】
また例えば、ＬＤＨ測定系において検体としてＬＤＨ測定系に阻害を与える市販の直線性管理用血清を使用する場合、液状試薬でありそのｐＨがアルカリであるＮＡＤＨを含む測定用試薬にキレート剤としてＥＤＴＡ・２Ｎａを添加すると阻害を防止することができる。この時のＥＤＴＡ・２Ｎａ添加濃度は０．１ｍｍｏｌ／ｌ以上で夾雑物質による反応阻害を防止する効果があり、特に１〜５０ｍｍｏｌ／ｌが好ましい。５０ｍｍｏｌ／ｌを超えるとＮＡＤＨの分解反応の防止には効果があるものの、ＬＤＨの反応が影響を受け、ＬＤＨ活性値が低くなる傾向があるため好ましくない。
【００２６】
また、本発明においては、前記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の溶液中に、前記のキレート剤の他に、必要により、生理活性物質測定用試薬に一般に添加される成分、例えばアジ化物等の防腐剤、及び界面活性剤等を適宜添加することができる。すでに、本発明は安定化されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含む液状試薬で用いる方法であるため、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を含有している溶液中には安定化のためにさまざまな添加物が添加されている。
【００２７】
生理活性物質測定用試薬として凍結乾燥品の試薬が用いられていた頃とは異なり、最近では当初から溶液状態で供給される液状試薬の必要性が増し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が、安定化された液状試薬で供給されるようになった。ところが、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を安定化し、液状試薬の形で供給しなければならなくなったため、溶液の環境が凍結乾燥品が主流だった頃とは異なっている。そのために、以前にはなかった不都合が生じることになった。
【００２８】
本発明は、液状試薬が主流になったことを契機として明らかになった問題点に着目し、その解決方法として見いだしたものである。液状試薬になったことがきっかけとなり夾雑酵素によってニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解が生じてしまう場合がある事実にはこれまで着目されていなかった。そこで、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が分解する原因を解明し、原因となる夾雑物質の影響を回避する方法を見いだしたことで、生理活性物質を正確に測定することが可能になった。液状試薬で提供される生体試料液中の生理活性物質測定用試薬に、安定化の目的ではなく、夾雑物質の影響の回避の目的でキレート剤を添加することは従来にはなかった手法である。
【００２９】
【作用】
本発明によるキレート剤の添加でニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止する機構は、キレート剤の添加によるヌクレオチドピロフォスファターゼの反応阻害によるものと考えられる。ヌクレオチドピロフォスファターゼは、２分子のリボヌクレオチドが結合したピロリン酸の部分のエステル結合に作用する加水分解酵素であり、ＮＡＤＨを基質とした場合、ＮＡＤＨをＮＭＮＨに分解しＡＭＰ（アデノシン一リン酸）が生成する。ヌクレオチドピロフォスファターゼは、その由来により反応の至適ｐＨが異なり、また夾雑酵素として精製された酵素標品に混在している場合、その混在量も様々である。
本発明による作用機構の詳細は、現在のところ完全には明らかではないが、本発明によるキレート剤の添加によって還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類の分解を防止することができたことから、夾雑酵素（おそらくヌクレオチドピロフォスファターゼ）が金属要求酵素であるものと考えられる。実際に、植物、腎・肝の細胞顆粒・膜、蛇毒又は細菌等のヌクレオチドピロフォスファターゼが報告されており、それぞれ性質が異なり、基質特異性、至適ｐＨ、及び金属要求性等は様々である。
【００３０】
また、ヌクレオチドピロフォスファターゼは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類だけではなく、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰＧ）等が共存した場合でも、一定の条件が整えば反応が進行し、反応阻害を起こす可能性が充分考えられる。従って、補酵素等にニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類を利用する酵素反応以外の場合でも、前記のようなリボヌクレオチドが結合した構造をもつ基質（補酵素）が関与する測定系又はその測定系に用いる液状試薬においても、ヌクレオチドピロフォスファターゼの反応阻害としてキレート剤を添加する方法は有効である。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例及び参考例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ＧＰＴ測定におけるＥＤＴＡ・２Ｎａ添加効果》
（１）対照試験
以下に示したＧＰＴ測定用液状試薬を用い、ＧＰＴの反応阻害が生じる市販の管理血清（商品名：ハイレベルチェック・Ｅ；国際試薬社製）を検体として用いた。具体的には、前記管理血清を生理食塩水で希釈して１０段階希釈列（１／１０〜１０／１０）検体を調製した（１０／１０は非希釈検体）。日立７１５０型自動分析機により、検体（１５μｌ）と以下に示す試薬１（３００μｌ）を混合し、３７℃で５分間加温した後、試薬２（１００μｌ）を添加した。
下記のパラメータにより、試薬２の添加時から１分間経過後から５分間経過後までの４分間にわたり、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでの吸光度変化を測定し、１分間当たりの吸光度の減少速度を求め、ＮＡＤＨの分子吸光係数（ε）からＧＰＴ活性値を下記式より算出した。また、検体の代わりに生理食塩水を使用してコントロール試験を行った。なお、試薬１及び試薬２に含まれるＧＴＡ緩衝液は、β，β’−ジメチルグルタル酸、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールの等モル濃度溶液をＨＣｌあるいはＮａＯＨで所望のｐＨに調製した緩衝液である。
【００３２】
使用した液状試薬の組成、測定パラメータ及びＧＰＴ活性値の計算式は以下のとおりである。
（ａ）試薬１（ｐＨ９．０）
ＧＴＡ緩衝液 ２０ｍｍｏｌ／ｌ
Ｌ−アラニン ２００ｍｍｏｌ／ｌ
ＮＡＤＨ ０．２５ｍｍｏｌ／ｌ
ＬＤＨ ５０００ｕ／ｌ
（ｂ）試薬２（ｐＨ ６．０）
ＧＴＡ緩衝液 １００ｍｍｏｌ／ｌ
Ｌ−アラニン １０００ｍｍｏｌ／ｌ
α−ケトグルタル酸 ６０ｍｍｏｌ／ｌ
【００３３】
（ｃ）測定パラメータ（日立７１５０型）
ＡＳＳＡＹ ＣＯＤＥ ［ＲＡＴＥ Ａ］：［３０−５０］
ＳＡＭＰＬＥ ＶＯＬＵＭＥ ［１５］
Ｒ１ ＶＯＬＵＭＥ ［３００］
Ｒ２ ＶＯＬＵＭＥ ［１００］
ＷＡＶＥ ＬＥＮＧＴＨ ［４０５］［３４０］
ＡＢＳ．ＬＩＭＩＴ（INC／DEC） ［４０００］［ＤＥＣＲＥＡＳＥ］
（ｄ）ＧＰＴ活性値の計算式：
ＧＰＴ活性値（ｕ／ｌ）＝（ΔＥ／ε）×（Ｖ／ｖ）×１０³
上記の式にて、ΔＥは１分間当たりの吸光度変化量であり、εは分子吸光係数（６．３）であり、Ｖは全反応液量であり、そしてｖは試料液量である。
【００３４】
（２）本発明試薬による試験
本発明試薬として、上記の試薬１にＥＤＴＡ・２Ｎａを１ｍｍｏｌ／ｌの量で添加した試薬を調製し、同一の検体（１０段階希釈列及びコントロール試験としての生理食塩水）について対照試薬での測定と同様の操作で測定し、ＧＰＴ活性値を求めた。
【００３５】
（３）結果
それらの結果を、表１、並びに図１（対照試験）及び図２（本発明）に示す。
【表１】

【００３６】
【実施例２】
《ＬＤＨ測定におけるＮＴＡ添加効果》
（１）対照試薬
以下に示した組成のＬＤＨ測定用液状試薬を用い、ＬＤＨの反応阻害が生じる市販の管理血清（商品名：ハイレベルチェック・Ｅ；国際試薬社製）を検体として用いた。具体的には、前記管理血清を生理食塩水で希釈して１０段階希釈列を調製した（１０／１０は非希釈検体）。日立７１７０型自動分析機により、検体（１０μｌ）と以下に示す試薬１（１８０μｌ）とを混合し、３７℃で５分間加温した後、試薬２（９０μｌ）を添加した。下記のパラメータにより、試薬２の添加時から１分間経過後から５分間後まで４分間にわたり、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでの吸光度変化を測定し、１分間当たりの吸光度の減少速度を求め、ＮＡＤＨの分子吸光係数（ε）からＬＤＨ活性値を下記式より算出した。また、前記検体の代わりに生理食塩水を使用してコントロール試験を行った。
【００３７】
使用した液状試薬の組成、測定パラメータ及びＬＤＨ活性値の計算式は以下のとおりである。
（ａ）試薬１（ｐＨ９．０）
ＧＴＡ緩衝液 ２０ｍｍｏｌ／ｌ
ＮＡＤＨ ０．３ｍｍｏｌ／ｌ
（ｂ）試薬２（ｐＨ６．０）
ＧＴＡ緩衝液 １００ｍｍｏｌ／ｌ
ピルビン酸リチウム塩 ６ｍｍｏｌ／ｌ
【００３８】
（ｃ）測定パラメータ（日立７１７０型）
分析法／測光ポイント ［レートＡ］［１０］［２０］［３４］
波長（副／主） ［４０５］［３４０］
検体量（標準） ［１０］
試薬分注量（Ｒ１） ［１８０］
試薬分注量（Ｒ３） ［９０］
反応限界吸光度 ［４０００］
（試薬２は、パラメータ上では自動分析機の特性上「Ｒ３」で表されている）
（ｄ）ＬＤＨ活性値の計算式
ＬＤＨ活性値（ｕ／ｌ）＝（ΔＥ／ε）×（Ｖ／ｖ）×１０³
上記の式にて、ΔＥは１分間当たりの吸光度変化量であり、εは分子吸光係数（６．３）であり、Ｖは全反応液量であり、そしてｖは試料液量である。
【００３９】
（２）本発明試薬による試験
本発明試薬として、上記の試薬１にＮＴＡを１０ｍｍｏｌ／ｌの量で添加した試薬を調製し、同一の検体（１０段階希釈列及びコントロール試験としての生理食塩水）について対照試薬での測定と同様の操作で測定し、ＬＤＨ活性値を求めた。
【００４０】
（３）結果
それらの結果を、表２（試薬２の添加から１分間経過後から４分後までの３分間の測定に基づく）、並びに図３（対照試験）及び図４（本発明）に示す。
【表２】

【００４１】
【参考例１】
（１）ＧＰＴの測定
自動分析機によるＧＰＴの測定において、同一の液状試薬を用いて、反応を阻害する夾雑物質を含む検体及び反応を阻害する夾雑物質を含まない検体を以下に示すＧＰＴ測定用試薬で測定し、以下に示す計算式でＧＰＴの活性値を求めた。
豚心臓由来ＧＰＴ（ベーリンガーマンハイム社）を生理食塩水に溶かし、３０００ｕ／ｌとしたものを標準（夾雑物質不含検体）とした。これに夾雑物質を含む豚腎臓由来γ−ＧＴＰ（シグマ社）を４０００ｕ／ｌとなるよう添加したものを夾雑物質含有検体とした。なお、夾雑物質含有検体及び夾雑物質不含検体のいずれにおいても、添加されたＧＰＴの活性は、同程度の活性であった。
各検体を、実施例１（１）に記載の方法と同様に、生理食塩水で希釈して１０段階希釈列（１／１０〜１０／１０）検体を調製した（１０／１０は非希釈検体）。日立７０７０型自動分析機により、検体（１５μｌ）と試薬１（３００μｌ）とを混合し、３７℃で５分間加温した後、試薬２（１００μｌ）を添加した。下記のパラメータにより、試薬２の添加時から１分間経過後から５分間後まで４分間にわたり、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでの吸光度変化を測定し、１分間当たりの吸光度の減少速度を求め、ＮＡＤＨの分子吸光係数（ε）からＧＰＴ活性値を下記式より算出した。また、前記検体の代わりに生理食塩水を使用してコントロール試験を行った。
【００４２】
使用した液状試薬の組成、測定パラメータ及びＧＰＴ活性値の計算式は以下のとおりである。
（ａ）試薬１（ｐＨ９．０）
ＧＴＡ緩衝液 ２０ｍｍｏｌ／ｌ
Ｌ−アラニン ２００ｍｍｏｌ／ｌ
ＮＡＤＨ ０．３５ｍｍｏｌ／ｌ
ＬＤＨ ５０００ｕ／ｌ
（ｂ）試薬２（ｐＨ６．０）
ＧＴＡ緩衝液 １００ｍｍｏｌ／ｌ
Ｌ−アラニン １０００ｍｍｏｌ／ｌ
α−ケトグルタル酸 ６０ｍｍｏｌ／ｌ
【００４３】
（ｃ）測定パラメータ（日立７０７０型）
分析法 ［レートＡ］［１０］［２０］［３４］
測光ポイント ［１９］−［３１］
波長（副／主） ［４０５］［３４０］
反応限界吸光度 ［４０００］［減少］
検体量（標準） ［１０］
試薬分注量 第１試薬 ［３００］
試薬分注量 第３試薬 ［１００］
（試薬２は、パラメータ上では自動分析機の特性上第３試薬で表されている）
【００４４】
（ａ）ＧＰＴ活性値の計算式
ＧＰＴ活性値（ｕ／ｌ）＝（ΔＥ／ε）×（Ｖ／ｖ）×１０³
上記の式にて、ΔＥは１分間当たりの吸光度変化量であり、εは分子吸光係数（８．３）であり、Ｖは全反応液量であり、そしてｖは試料液量である。
【００４５】
結果を表３に示す。
【表３】

【００４６】
夾雑物質含有検体では、直線性の１０段階希釈列で直線性が１０００ｕ／ｌ程度までしか認められないが、夾雑物質不含検体では直線性が２０００ｕ／ｌ程度まで認められる。
【００４７】
（２）ＮＡＤＨからＮＭＮＨへの分解
前記参考例１（１）において使用した夾雑物質含有検体を、ＮＡＤＨ含有液状試薬（０．３ｍｍｏｌ／ｌのＮＡＤＨを含む３０ｍｍｏｌ／ｌのＧＴＡ緩衝液：ｐＨ＝９．２）と共存させておいた場合の経時変化を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により確認した。ＨＰＬＣ測定条件は以下のとおりである。

結果を図５に示す。図５において、曲線１は、ＮＡＤＨ含有液状試薬と夾雑物質含有検体とを共存させない場合であり、曲線２は、ＮＡＤＨ含有液状試薬と夾雑物質含有検体を混合した直後の場合であり、曲線３は、混合から２時間後の場合であり、曲線４は、混合から６時間後の場合であり、そして曲線５は、混合から１０時間後の場合である。また、図５の横軸の時間（分）は、ＨＰＬＣにおける溶出の時間である。
【００４８】
（３）吸光度変化（タイムコース）
前記参考例１（１）において使用した夾雑物質含有検体及び夾雑物質不含検体のそれぞれの１０段階希釈列（１／１０〜１０／１０）検体について実施例１（１）に記載の操作と同様の操作を行った。
結果を示す図６（夾雑物質含有検体）及び図７（夾雑物質不含検体）から明らかなように、夾雑物質不含検体では、酵素反応が終了した時点での吸光度が一定であったが、夾雑物質含有検体では、希釈列が高濃度になるほど反応終了時の吸光度が上昇していった。反応終了時の吸光度の上昇は、希釈列が高濃度になるほど、ＮＡＤＨが分解して生じるＮＭＮＨの生成量が多いことを示している。
【００４９】
【参考例２】
《保存液状試薬におけるＮＡＤＨからＮＭＮＨへの分解》
３０ｍｍｏｌ／ｌのＧＴＡ緩衝液（ｐＨ９．２）に０．３ｍｍｏｌ／ｌのＮＡＤＨを溶解し、豚心臓由来ＬＤＨの３ロット（ロットＡ，ロットＢ，ロットＣ）をそれぞれ２．５ｍｇ／ｍｌ（ＬＤＨ活性として約１０００ｕ／ｍｌ相当）の量で添加した溶液を２５℃で一週間放置した後、ＮＭＮＨの生成量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により前記参考例１と同じ条件下で測定した。結果を表４に示す。ＮＭＮＨの生成量は、ＨＰＬＣで得られたＮＡＤＨのピーク面積に対するＮＭＮＨのピーク面積の割合で示した。
【００５０】
【表４】

【００５１】
【発明の効果】
本発明により、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類含有液状試薬が関与する測定系において、その液状試薬の他の成分又は検体中に存在する夾雑物質による前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類からニコチンアミドモノヌクレオチドへの分解を有効に防止することができる。例えば、補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類と共に夾雑物質を含む保存用液状試薬において、その液状試薬の保存中に前記補酵素が夾雑物により分解されることを防止することができる。また、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類含有液状試薬が関与する測定系において、検体由来の夾雑物により補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類が分解され、測定系の反応から不正確な測定値が誘導されることを防止することもできる。更に、本発明により、生理活性物質を測定する液状試薬で、測定系での主要酵素反応が阻害されることなく目的の生理活性物質を正確に測定することができ、長期間安定で且つ正確な測定値が得られる液状試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本明細書の実施例１において実施したＧＰＴ測定におけるＥＤＴＡ・２Ｎａ添加の効果を示す実験における対照試験の結果（タイムコース）を示すグラフである。
【図２】本明細書の実施例１において実施したＧＰＴ測定におけるＥＤＴＡ・２Ｎａ添加の効果を示す実験における本発明の結果（タイムコース）を示すグラフである。
【図３】本明細書の実施例２において実施したＬＤＨ測定におけるＮＴＡ添加の効果を示す実験における対照試験の結果（タイムコース）を示すグラフである。
【図４】本明細書の実施例２において実施したＬＤＨ測定におけるＮＴＡ添加の効果を示す実験における本発明の結果（タイムコース）を示すグラフである。
【図５】本明細書の参考例１において得られたＧＰＴ測定の反応の場においてＮＭＮＨが生成していることがＨＰＬＣにより確認された結果を示すグラフである。
【図６】本明細書の参考例１のＧＰＴ測定において、夾雑物質含有検体を測定した場合のタイムコースを示すグラフである。
【図７】本明細書の参考例１のＧＰＴ測定において、夾雑物質不含検体を測定した場合のタイムコースを示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for preventing degradation of reduced nicotinamide adenine dinucleotides and a reagent for preventing degradation. According to the prevention method of the present invention, in a measurement system involving a liquid reagent containing reduced nicotinamide adenine dinucleotides, the reduced nicotinamide adenine di by the other components of the liquid reagent or contaminants present in the specimen. Degradation from nucleotides to nicotinamide mononucleotide can be effectively prevented.
[0002]
[Prior art]
In the medical field, it is necessary to accurately diagnose a disease in order to perform appropriate treatment. Numerous physiologically active substances in biological samples such as aspartate aminotransferase (GOT), alanine aminotransferase (GPT), lactate dehydrogenase (LDH), α-oxybutyrate dehydrogenase (HBD), free fatty acid (NEFA) ), Urea nitrogen (UN), creatinine (CRE) and the like are desired to be measured quickly and easily, and various test methods, reagents and analytical instruments have been developed. In recent years, it has become a mainstream to process a large number of specimens in a short time and automatically obtain measurement results, and high performance is required in both the inspection apparatus and the reagent. Actually, measurement by an automatic analyzer is the mainstream in measurements at hospitals and inspection centers.
[0003]
All the physiologically active substances in the biological sample can be measured using an enzyme reaction. Measurement methods using enzyme reactions include (1) a method for measuring the amount of product produced under certain measurement conditions, (2) a method for measuring the amount of change in coenzyme, and (3) a decrease in substrate. Can be roughly divided into three methods. In particular, the method (2) for measuring the amount of change in coenzyme is widely used, and nicotinamide adenine dinucleotides, that is, reduced nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter sometimes referred to as NADH) is used as the coenzyme. Alternatively, reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (hereinafter sometimes referred to as NADPH) and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (hereinafter referred to as NAD).⁺Or oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (hereinafter NADP)⁺In many cases, reaction systems using various dehydrogenases are used. The basic reaction formula is as follows.
[0004]
[Chemical 1]

[0005]
Conventionally, those reagents containing enzymes and the like have been supplied in a lyophilized state in consideration of their preservability, and have been used after being dissolved in a buffer solution or the like at the time of use. However, in recent years, so-called liquid reagents in a solution state have been widely spread from the beginning in order to save the labor of preparation. In particular, in the case of a liquid reagent, stabilization of each composition component such as an enzyme contained therein is important. Of course, the coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide is also the object, and there are many reports on the stabilization method. For example, a method of adding boric acid (Japanese Patent Laid-Open No. 62-198697), a method of adding an alkali metal (Japanese Patent Laid-Open No. 7-229192), and the like are disclosed.
[0006]
As for the stability of the coenzyme nicotinamide adenine dinucleotides in solution, it is generally known that the reduced form is stable in an alkaline solution and the oxidized form is stable in an acidic solution. Actually, it is a measurement reagent using reduced nicotinamide adenine dinucleotides, and a solution containing reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) or reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) is a liquid reagent. If present, the pH is often alkaline, and combinations of other components are devised.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, the present inventors have found that, for example, under the alkaline conditions where NADH (or NADPH) is stable, only the content of NADH (or NADPH) is present even though the coexisting enzyme activity does not decrease. The problem of extreme degradation may occur. In the physiologically active substance measurement system, if the NADH (or NADPH) content decreases, an accurate measured value of the desired physiologically active substance cannot be obtained. When the present inventor searched for the general cause, it was found that a contaminant that decomposes NADH (or NADPH) enters the measurement system from various routes.
[0008]
In a method for measuring a physiologically active substance in a biological sample, an enzyme reaction is used in a measurement system using a coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide, and in many cases, a coenzyme and an enzyme are allowed to coexist. In most cases, the enzyme coexisting with the coenzyme is a preparation purified from animal tissues or bacteria. If the NADH (or NADPH) content in the enzyme coexisting with the coenzyme is reduced and a substance that inhibits the original reaction is present as a contaminating enzyme, an accurate value can be obtained when measuring a physiologically active substance. It will not be possible.
For example, in the performance evaluation of a reagent, in order to evaluate the performance of the reagent at the upper limit of measurement, a sample having an extremely high value for the physiologically active substance to be measured may be measured. A normal biological sample (such as serum) itself is not sufficient as a sample for evaluating the upper limit of measurement, so add a target physiologically active substance and prepare a sample to be artificially high, or A commercially available control serum suitable for the purpose will be used as a specimen. Particularly, commercially available control serum generally has not only the target substance but also several kinds of physiologically active substances at the same time. In preparation thereof, a standard purified from animal tissue or bacteria is added as a measurement target substance to the serum as a base. Here, if the NADH (or NADPH) content is reduced in the added sample and a substance that inhibits the enzyme reaction is contaminated in the reaction field, an accurate measurement value of the target physiologically active substance Will not be obtained.
[0009]
As shown in Reference Example 1 to be described later, the present inventor, in GPT measurement by an automatic analyzer, a specimen containing a contaminant substance that inhibits the reaction and a specimen that does not contain a contaminant substance (the added GPT has the same activity). Were measured with the same liquid reagent. As a result, the linearity was observed only up to about 1000 u / l in the contaminant-containing sample, whereas the linearity was observed up to about 2000 u / l in the contaminant-free sample. This indicates that a desired value cannot be obtained when a contaminant that inhibits the reaction is present in a sample that should be measured as a high-value sample. If an accurate value of the measurement substance cannot be obtained, the influence on the medical field in which a physiologically active substance is used as an index for diagnosis of various diseases is enormous.
[0010]
The measurement of the physiologically active substance by the enzyme method using the coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide is performed by detecting the amount of change in the coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide as the amount of change in absorbance at a wavelength of 340 nm. More specifically, the automatic analyzer uses the decrease in NADH (or NADPH) absorbance due to the enzyme reaction to measure the reaction rate from the absorbance measured at regular intervals within a preset photometric time. (Slope) is determined, the rate of decrease in absorbance per unit time is determined, and the value of the physiologically active substance is calculated from the molecular extinction coefficient of NADH (or NADPH). Alternatively, when a standard solution is used, the value of the target physiologically active substance is calculated from the difference in absorbance between the standard solution and the sample. Here, if the abundance of NADH (or NADPH) is insufficient due to a decrease in the content during storage, or if the enzyme reaction is inhibited by contaminants that coexist in the reaction field, an accurate reaction rate and absorbance can be obtained. As a result, the calculated value is also inaccurate.
[0011]
In the measurement system containing nicotinamide adenine dinucleotides as described above, the present inventor used a liquid reagent that has recently been used instead of the conventionally used lyophilized reagent. Focusing on the point of reaction inhibition, the cause was pursued. The main factor is considered to be that NADH, which is an indicator of absorbance change, is decomposed into NMNH (reduced nicotinamide mononucleotide) by nucleotide pyrophosphatase present as a contaminant. Since NMNH also has a maximum absorption at 340 nm like NADH, it cannot be distinguished from the aspect of absorption characteristics. Furthermore, since NMNH does not react with various dehydrogenases, it has been found that originally desired enzyme reaction is inhibited.
[0012]
In this regard, as shown in Reference Example 2 described later, when a liquid reagent containing reduced nicotinamide adenine dinucleotides and an animal-derived enzyme is stored, NADH (or NADPH) is decomposed over time and NMNH. Was confirmed to be generated. In the GPT measurement example of Reference Example 1 described above, if a contaminant-containing specimen and a weakly alkaline NADH-containing liquid reagent (pH 9.2) supplied as a stable liquid reagent are allowed to coexist, It was confirmed that NADH was decomposed to produce NMNH.
[0013]
Further, in Reference Example 1, when the change in absorbance (so-called time course) measured at regular intervals obtained by measurement with an automatic analyzer is graphed, a sample containing a contaminant that causes GPT reaction inhibition and no reaction inhibition occur. There was a clear difference between the samples without contaminants. That is, the absorbance at the time of completion of the enzyme reaction was constant in the sample containing no contaminant that did not inhibit the reaction of GPT, whereas the dilution column had a high concentration in the sample containing the contaminant that caused the reaction inhibition. The absorbance at the end of the reaction increased as. The increase in absorbance at the end of the reaction indicates that the amount of NMNH produced by the decomposition of NADH increases as the dilution column becomes higher in concentration.
[0014]
The optimum pH for the reaction of nucleotide pyrophosphatase that appears to be a contaminant is considered to be weakly alkaline. That is, the conventional lyophilized product has been transferred to a liquid reagent, and the solution containing NADH (or NADPH) has become alkaline for the purpose of stabilizing reduced nicotinamide adenine dinucleotides. A new problem as described above has occurred that could not be expected at all.
[0015]
Therefore, an object of the present invention is to provide the reduced nicotinamide adenine dinucleotide by a contaminant present in other components of the liquid reagent or the sample in a measurement system involving a reduced nicotinamide adenine dinucleotide-containing liquid reagent. It is an object to provide a means for effectively preventing degradation of nicotinamide to nicotinamide mononucleotide. For example, under conditions where reduced nicotinamide adenine dinucleotides can be stably supplied, for example, in an alkaline environment, NADH or NADPH coexists with various purified enzymes, and the desired physiological activity When measuring a specimen (for example, commercially available control serum) to which an enzyme preparation as a substance is added at a high concentration, the degradation of the coenzyme nicotinamide adenine dinucleotides is prevented, and the main in the enzyme measurement system An object of the present invention is to provide a means for accurately measuring a target physiologically active substance without causing an inhibition of an enzyme reaction.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
  The present invention is characterized in that a chelating agent is allowed to coexist in a measurement system in which a liquid reagent containing reduced nicotinamide adenine dinucleotides and a specimen are brought into contact under a pH value of 7.5 to 11. And a method for preventing degradation of the reduced nicotinamide adenine dinucleotides to reduced nicotinamide mononucleotide by the interference action of contaminants.
  The present invention also includes reduced nicotinamide adenine dinucleotides and a contaminant that decomposes the reduced nicotinamide adenine dinucleotides into reduced nicotinamide mononucleotide, and has a pH value of 7.5 to 11. The present invention also relates to a method for preventing degradation of the reduced nicotinamide adenine dinucleotides from the reduced nicotinamide adenine dinucleotides to reduced nicotinamide mononucleotides due to the interference action of the contaminant, wherein a chelating agent is allowed to coexist in a liquid reagent.
  In addition, bookIn the statementIs a liquid reagent containing reduced nicotinamide adenine dinucleotides and a chelating agent and having a pH value of 7.5 to 11To disclose.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is described in detail below.
The present invention can be applied to any liquid reagent containing nicotinamide adenine dinucleotides. That is, the subject of a clinical test that is present in a liquid reagent used for measuring any “physiologically active substance”, particularly a biological sample (eg, blood, serum, plasma, urine, spinal fluid, cell or tissue extract, saliva, sweat) It can be applied to a liquid reagent used for measuring various substances such as various enzymes. Examples of substances to be measured include aspartate aminotransferase (GOT), alanine aminotransferase (GPT), lactate dehydrogenase (LDH), α-oxybutyrate dehydrogenase (HBD), free fatty acid (NEFA), urea nitrogen (UN) or creatinine (CRE). Since any item can be measured by a measurement system using nicotinamide adenine dinucleotides, the present invention can be preferably applied.
[0018]
Here, “a liquid reagent containing nicotinamide adenine dinucleotide” only means a liquid reagent for storage that is stored for a relatively long period of time together with enzymes and other additive components including contaminants until it is used for measurement. In addition, during storage, it does not coexist with enzymes and other additive components containing contaminants, but during measurement, the sample containing contaminants and alkaline conditions (for example, the second reagent of a multi-reagent measurement reagent such as a two-reagent measurement reagent) Also included are liquid reagents that come into contact with one reagent.
[0019]
The present invention is applied to a liquid reagent whose pH is maintained alkaline. Specifically, the pH is in the range of 7.5 to 11 (preferably 8.5 to 10).
When the pH value is lower than 7.5, the storage stability of the reduced nicotinamide adenine dinucleotides is insufficient, and when the pH value is higher than 11, it is difficult to adjust the reaction atmosphere, and the influence on the analyzer Etc. are unfavorable.
[0020]
The chelating agent that can be used in the present invention is a polydentate ligand that coordinates to a metal ion and gives a water-soluble chelate compound. Specifically, ethylenediaminetetraacetate (EDTA), trans-1,2 -Diaminocyclohexane tetraacetate (CyDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), glycol etherdiaminetetraacetate (GEDTA), triethylenetetraminehexaacetic acid (TTHA), ethylenediaminediacetic acid (EDDA), ethylenediaminetetrakis (methylenephosphonic acid) (EDTPO), ethylenediamine dipropionate hydrochloride (EDDP), hexamethylenediaminetetraacetate (HDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), ethylenediamine-bis (methylenephosphonic acid) (EDDPO), nitrilotriacetic acid (N A), nitrilotris (methylene phosphonic acid) (NTPO), nitrilotriacetic propionic acid (NTP), dihydroxyethylglycine (DHEG), can be cited such as iminodiacetic acid (IDA) and salts thereof.
[0021]
In the method of the present invention, the above-mentioned chelating agent can be added to the liquid reagent, or can be added alone to the measurement system at the time of enzyme reaction measurement. For example, when a contaminant is present in the storage liquid reagent, it is necessary to add the chelating agent to the storage liquid reagent. In addition, no contaminants are present in the liquid reagent for storage, and when the enzyme reaction is performed, for example, when contaminants contained in the sample are mixed into the measurement system, the chelating agent should be stored. In addition to the preserving reagent, the chelating agent can be added to the measurement system. In particular, in the case of a two-reagent measurement reagent or the like, the first reagent and the sample are brought into contact with each other for a certain period of time under alkaline conditions, and then the mixed solution is brought into contact with the second reagent under neutral conditions to perform an enzyme reaction. Often implemented. Therefore, when a contaminant is contained in the sample, it is necessary to make the chelating agent exist at least at the time of contact with the first reagent under alkaline conditions. The liquid first reagent) may be contained, or a chelating agent may be added separately to the reaction system together with the specimen.
[0022]
The concentration of the chelating agent used in the present invention is a concentration that can substantially prevent degradation of reduced nicotinamide adenine dinucleotides into reduced nicotinamide mononucleotide by a contaminant (probably nucleotide pyrophosphatase). It is. The concentration of the chelating agent in each measurement system or liquid reagent depends on the origin and the amount of nucleotide pyrophosphatase coexisting as a contaminant in the measurement system or liquid reagent to which the present invention is applied. Those skilled in the art can appropriately determine the type of chelating agent used in the liquid reagent.
[0023]
The combination of nicotinamide adenine dinucleotides and the chelating agent shown above is not particularly limited, but in the environment of a solution containing nicotinamide adenine dinucleotides, nicotinamide adenine dinucleotide by a contaminant (probably nucleotide pyrophosphatase). A chelating agent having an effect of preventing the degradation of nucleotides can be appropriately selected and used. Moreover, in order to prevent decomposition | disassembly of nicotinamide adenine dinucleotide, several types of said chelating agents can also be mixed and added. The optimum pH of the degradation reaction varies depending on the origin of a contaminant (probably nucleotide pyrophosphatase) that degrades nicotinamide adenine dinucleotides, and the type of chelating agent that has a preventive effect also varies. Therefore, depending on the type of nicotinamide adenine dinucleotide, its environment and the origin of the contaminant (probably nucleotide pyrophosphatase), one or several effective chelating agents are selected, and specific addition amounts are also used. It can be determined appropriately according to the individual measurement system.
[0024]
For example, in a GPT measurement system using a stabilized liquid reagent, the pH of a solution containing NADH to be used is generally alkaline. Furthermore, in most cases, the measurement of GPT using NADH uses LDH as a conjugate enzyme. Therefore, in the case of a liquid reagent, NADH coexists with LDH for a long time (for example, more than half a year) under alkaline conditions. In this case, LDH coexisting with NADH is derived from animal tissues or bacteria. When nucleotide pyrophosphatase is present as a contaminating enzyme in LDH purified from animal tissues or bacteria, NADH is decomposed and NMNH is produced during long-term storage of the NADH solution. Since NMNH has an absorption at 340 nm like NADH, it cannot be distinguished in terms of absorbance, so it seems that the amount of NADH is apparently maintained. When GPT activity is measured using this reagent, the desired measured value cannot be obtained because the actual NADH amount is small. Thus, the addition of EDTA · 2Na as a chelating agent to the NADH solution coexisting with a contaminant (probably nucleotide pyrophosphatase) can prevent the NADH decomposition reaction. The concentration of EDTA · 2Na added at this time is 0.1 mmol / l or more, which has the effect of preventing reaction inhibition by contaminants, and is particularly preferably 1 to 50 mmol / l. If it exceeds 50 mmol / l, it is effective in preventing the NADH decomposition reaction, but the GPT reaction, which is the main enzyme reaction, is affected, and the GPT activity value tends to be low.
[0025]
In addition, for example, when using a commercially available linearity control serum that inhibits the LDH measurement system as a sample in the LDH measurement system, a liquid reagent that has an alkaline pH of NADH is used as a chelating agent. Inhibition can be prevented by adding 2Na. The concentration of EDTA · 2Na added at this time is 0.1 mmol / l or more, which has the effect of preventing reaction inhibition by contaminants, and is particularly preferably 1 to 50 mmol / l. If it exceeds 50 mmol / l, it is effective in preventing the decomposition reaction of NADH, but the reaction of LDH is affected and the LDH activity value tends to be low.
[0026]
Further, in the present invention, in addition to the chelating agent, if necessary, a component generally added to a reagent for measuring a physiologically active substance, for example, a preservative such as an azide, in the nicotinamide adenine dinucleotide solution. , And surfactants can be added as appropriate. Already, since the present invention is a method for use with a liquid reagent containing stabilized nicotinamide adenine dinucleotides, various additives for stabilization are contained in a solution containing nicotinamide adenine dinucleotides. Is added.
[0027]
Unlike the days when lyophilized reagents were used as reagents for measuring physiologically active substances, the need for liquid reagents supplied in solution from the beginning has increased recently, and nicotinamide adenine dinucleotides have been stabilized. The liquid reagent is supplied. However, since the nicotinamide adenine dinucleotides have to be stabilized and supplied in the form of a liquid reagent, the environment of the solution is different from when lyophilized products were mainstream. This resulted in inconveniences that did not exist before.
[0028]
This invention pays attention to the problem which became clear when liquid reagent became mainstream, and discovered as a solution. Until now, no attention has been paid to the fact that nicotinamide adenine dinucleotides may be decomposed by contaminating enzymes triggered by becoming a liquid reagent. Therefore, by elucidating the cause of degradation of nicotinamide adenine dinucleotides and finding a method for avoiding the influence of the causative contaminants, it has become possible to accurately measure physiologically active substances. It is an unprecedented technique to add a chelating agent to a biologically active substance measurement reagent in a biological sample solution provided as a liquid reagent not for the purpose of stabilization but for the purpose of avoiding the influence of contaminants. .
[0029]
[Action]
The mechanism for preventing the degradation of nicotinamide adenine dinucleotides by the addition of the chelating agent according to the present invention is considered to be due to the inhibition of the reaction of nucleotide pyrophosphatase by the addition of the chelating agent. Nucleotide pyrophosphatase is a hydrolase that acts on the ester bond of the pyrophosphate moiety to which two molecules of ribonucleotide are bound. When NADH is used as a substrate, NADH is decomposed into NMNH and AMP (adenosine monophosphate) is converted into AMP (adenosine monophosphate). Generate. Nucleotide pyrophosphatase differs in the optimum pH of the reaction depending on its origin, and when it is mixed in an enzyme preparation purified as a contaminating enzyme, the amount of the mixture varies.
Although details of the mechanism of action according to the present invention are not completely clear at present, the degradation of reduced nicotinamide adenine dinucleotides could be prevented by the addition of the chelating agent according to the present invention. (Probably nucleotide pyrophosphatase) is thought to be a metal-requiring enzyme. In fact, nucleotide pyrophosphatases such as plant, kidney / liver cell granule / membrane, snake venom or bacteria have been reported, each with different properties, various substrate specificity, optimum pH, metal requirements, etc. .
[0030]
Nucleotide pyrophosphatase can react when not only nicotinamide adenine dinucleotides, but also flavin adenine dinucleotide (FAD), uridine diphosphate glucose (UDPG), etc. co-exist with certain conditions. The possibility of causing reaction inhibition is fully considered. Therefore, even in cases other than enzymatic reactions that utilize nicotinamide adenine dinucleotides as coenzymes, etc., they are used in measurement systems involving such substrates (coenzymes) having a structure to which ribonucleotides are bound or the measurement systems thereof. Even in a liquid reagent, a method of adding a chelating agent is effective for inhibiting the reaction of nucleotide pyrophosphatase.
[0031]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example and a reference example demonstrate this invention concretely, these do not limit the scope of the present invention.
[Example 1]
<Effect of adding EDTA / 2Na in GPT measurement>
(1) Control test
Using the following liquid reagent for GPT measurement, commercially available control serum (trade name: High Level Check E; manufactured by Kokusai Reagent Co., Ltd.) that inhibits GPT reaction was used as a sample. Specifically, the control serum was diluted with physiological saline to prepare a 10-stage dilution row (1/10 to 10/10) specimen (10/10 is an undiluted specimen). The specimen (15 μl) and the reagent 1 (300 μl) shown below were mixed using a Hitachi 7150 automatic analyzer, heated at 37 ° C. for 5 minutes, and then reagent 2 (100 μl) was added.
The change in absorbance at the main wavelength of 340 nm and the sub-wavelength of 405 nm was measured over 4 minutes from the time of addition of reagent 2 to 5 minutes after the addition of reagent 2, and the rate of decrease in absorbance per minute was measured. The GPT activity value was calculated from the following formula from the molecular absorption coefficient (ε) of NADH. In addition, a control test was performed using physiological saline instead of the specimen. The GTA buffer contained in Reagent 1 and Reagent 2 is an equimolar concentration of β, β′-dimethylglutaric acid, tris (hydroxymethylamino) methane, 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol. A buffer prepared by adjusting the solution to the desired pH with HCl or NaOH.
[0032]
The composition of the liquid reagent used, the measurement parameters, and the formula for calculating the GPT activity value are as follows.
(A) Reagent 1 (pH 9.0)
GTA buffer 20 mmol / l
L-alanine 200 mmol / l
NADH 0.25 mmol / l
LDH 5000u / l
(B) Reagent 2 (pH 6.0)
GTA buffer solution 100 mmol / l
L-alanine 1000 mmol / l
α-ketoglutaric acid 60 mmol / l
[0033]
(C) Measurement parameter (Hitachi 7150 type)
ASSAY CODE [RATE A]: [30-50]
SAMPLE VOLUME [15]
R1 VOLUME [300]
R2 VOLUME [100]
WAVE LENGTH [405] [340]
ABS. LIMIT (INC / DEC) [4000] [DECREASE]
(D) Formula for calculating GPT activity value:
GPT activity value (u / l) = (ΔE / ε) × (V / v) × 10^Three
In the above formula, ΔE is the change in absorbance per minute, ε is the molecular extinction coefficient (6.3), V is the total reaction volume, and v is the sample volume.
[0034]
(2) Test with the reagent of the present invention
As a reagent of the present invention, a reagent prepared by adding EDTA · 2Na to the above-mentioned reagent 1 in an amount of 1 mmol / l is prepared, and the same specimen (10-step dilution column and physiological saline as a control test) is measured with a control reagent. And the GPT activity value was determined.
[0035]
(3) Results
The results are shown in Table 1 and FIG. 1 (control test) and FIG. 2 (invention).
[Table 1]

[0036]
[Example 2]
<< NTA addition effect in LDH measurement >>
(1) Control reagent
Using a liquid reagent for LDH measurement having the composition shown below, a commercially available control serum (trade name: High Level Check E; manufactured by Kokusai Reagent Co., Ltd.) that causes LDH reaction inhibition was used as a sample. Specifically, the control serum was diluted with physiological saline to prepare a 10-stage dilution series (10/10 is an undiluted sample). The specimen (10 μl) and the following reagent 1 (180 μl) were mixed with a Hitachi 7170 automatic analyzer, heated at 37 ° C. for 5 minutes, and then reagent 2 (90 μl) was added. According to the following parameters, the change in absorbance at the main wavelength of 340 nm and the sub wavelength of 405 nm was measured over 4 minutes from 1 minute to 5 minutes after the addition of the reagent 2, and the rate of decrease in absorbance per minute was determined. The LDH activity value was calculated from the following formula from the molecular extinction coefficient (ε) of NADH. Further, a control test was performed using physiological saline instead of the specimen.
[0037]
The composition of the liquid reagent used, the measurement parameters, and the formula for calculating the LDH activity value are as follows.
(A) Reagent 1 (pH 9.0)
GTA buffer 20 mmol / l
NADH 0.3 mmol / l
(B) Reagent 2 (pH 6.0)
GTA buffer solution 100 mmol / l
Pyruvate lithium salt 6mmol / l
[0038]
(C) Measurement parameter (Hitachi 7170)
Analysis method / photometry point [Rate A] [10] [20] [34]
Wavelength (Sub / Main) [405] [340]
Sample volume (standard) [10]
Reagent dispensing volume (R1) [180]
Reagent dispensing volume (R3) [90]
Reaction limit absorbance [4000]
(Reagent 2 is represented by “R3” in the characteristics of the automatic analyzer on the parameters)
(D) Formula for calculating LDH activity value
LDH activity value (u / l) = (ΔE / ε) × (V / v) × 10^Three
In the above formula, ΔE is the change in absorbance per minute, ε is the molecular extinction coefficient (6.3), V is the total reaction volume, and v is the sample volume.
[0039]
(2) Test with the reagent of the present invention
As a reagent of the present invention, a reagent prepared by adding NTA to the above-mentioned reagent 1 in an amount of 10 mmol / l is prepared, and the same sample (10-step dilution column and physiological saline as a control test) is measured in the same manner as the control reagent. The LDH activity value was determined by the above procedure.
[0040]
(3) Results
The results are shown in Table 2 (based on a 3 minute measurement from 1 minute to 4 minutes after addition of reagent 2), as well as in FIG. 3 (control study) and FIG. 4 (invention).
[Table 2]

[0041]
[Reference Example 1]
(1) GPT measurement
In the measurement of GPT with an automatic analyzer, the same liquid reagent is used to measure a sample containing a contaminant that inhibits the reaction and a sample that does not contain a contaminant that inhibits the reaction using the following GPT measurement reagents. The activity value of GPT was determined by the calculation formula shown below.
Porcine heart-derived GPT (Boehringer Mannheim) was dissolved in physiological saline to give 3000 u / l as a standard (contaminant-free specimen). A sample containing a contaminating substance was prepared by adding pig kidney-derived γ-GTP (Sigma) containing a contaminating substance to 4000 u / l. Note that the activity of the added GPT was comparable in both the contaminant-containing specimen and the contaminant-free specimen.
Each sample was diluted with physiological saline in the same manner as described in Example 1 (1) to prepare a 10-stage dilution column (1/10 to 10/10) (10/10 is an undiluted sample) ). The specimen (15 μl) and reagent 1 (300 μl) were mixed with a Hitachi 7070 automatic analyzer, heated at 37 ° C. for 5 minutes, and then reagent 2 (100 μl) was added. According to the following parameters, the change in absorbance at the main wavelength of 340 nm and the sub wavelength of 405 nm was measured over 4 minutes from 1 minute to 5 minutes after the addition of the reagent 2, and the rate of decrease in absorbance per minute was determined. The GPT activity value was calculated from the following formula from the molecular extinction coefficient (ε) of NADH. Further, a control test was performed using physiological saline instead of the specimen.
[0042]
The composition of the liquid reagent used, the measurement parameters, and the formula for calculating the GPT activity value are as follows.
(A) Reagent 1 (pH 9.0)
GTA buffer 20 mmol / l
L-alanine 200 mmol / l
NADH 0.35 mmol / l
LDH 5000u / l
(B) Reagent 2 (pH 6.0)
GTA buffer solution 100 mmol / l
L-alanine 1000 mmol / l
α-ketoglutaric acid 60 mmol / l
[0043]
(C) Measurement parameter (Hitachi 7070)
Analytical method [Rate A] [10] [20] [34]
Metering point [19]-[31]
Wavelength (Sub / Main) [405] [340]
Reaction limit absorbance [4000] [decrease]
Sample volume (standard) [10]
Reagent dispensing volume 1st reagent [300]
Reagent dispensing volume 3rd reagent [100]
(Reagent 2 is represented by the third reagent in terms of the characteristics of the automatic analyzer in terms of parameters)
[0044]
(A) Formula for calculating GPT activity value
GPT activity value (u / l) = (ΔE / ε) × (V / v) × 10^Three
In the above equation, ΔE is the amount of change in absorbance per minute, ε is the molecular extinction coefficient (8.3), V is the total reaction volume, and v is the sample volume.
[0045]
The results are shown in Table 3.
[Table 3]

[0046]
In the contaminant-containing sample, linearity is observed only up to about 1000 u / l in a linear 10-step dilution series, whereas in the contaminant-free sample, linearity is observed up to about 2000 u / l.
[0047]
(2) Degradation of NADH to NMNH
The contaminant-containing specimen used in Reference Example 1 (1) was allowed to coexist with a NADH-containing liquid reagent (30 mmol / l GTA buffer containing 0.3 mmol / l NADH: pH = 9.2). The change with time was confirmed by high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC measurement conditions are as follows.

The results are shown in FIG. In FIG. 5, curve 1 is the case where the NADH-containing liquid reagent and the contaminant-containing sample do not coexist, curve 2 is the case immediately after mixing the NADH-containing liquid reagent and the contaminant-containing sample, and curve 3 is , 2 hours after mixing, curve 4 is 6 hours after mixing, and curve 5 is 10 hours after mixing. Further, the time (minutes) on the horizontal axis in FIG. 5 is the time of elution in HPLC.
[0048]
(3) Absorbance change (time course)
Similar to the operation described in Example 1 (1) for the 10-stage dilution series (1/10 to 10/10) of the contaminant-containing specimen and the contaminant-free specimen used in Reference Example 1 (1). Was performed.
As is clear from FIG. 6 (contaminant-containing sample) and FIG. 7 (contaminant-free sample) showing the results, in the contaminant-free sample, the absorbance at the time of completion of the enzyme reaction was constant. In the sample containing contaminants, the absorbance at the end of the reaction increased as the dilution series increased in concentration. The increase in absorbance at the end of the reaction indicates that the higher the concentration in the dilution column, the greater the amount of NMNH produced by NADH decomposition.
[0049]
[Reference Example 2]
<< Degradation of NADH to NMNH in preservative liquid reagent >>
0.3 mmol / l NADH was dissolved in 30 mmol / l GTA buffer (pH 9.2), and 3 lots (lot A, lot B, lot C) of pig heart-derived LDH were each 2.5 mg / ml (LDH The solution added in an amount of about 1000 u / ml as activity) was allowed to stand at 25 ° C. for one week, and then the amount of NMNH produced was measured under the same conditions as in Reference Example 1 by high performance liquid chromatography (HPLC). The results are shown in Table 4. The amount of NMNH produced was expressed as the ratio of the peak area of NMNH to the peak area of NADH obtained by HPLC.
[0050]
[Table 4]

[0051]
【The invention's effect】
According to the present invention, in a measurement system involving a liquid reagent containing reduced nicotinamide adenine dinucleotides, nicotinamide from the reduced nicotinamide adenine dinucleotides due to other components present in the liquid reagent or contaminants present in the sample. Degradation into mononucleotides can be effectively prevented. For example, in a liquid reagent for storage containing a coexisting substance together with the coenzyme nicotinamide adenine dinucleotides, the coenzyme can be prevented from being decomposed by impurities during storage of the liquid reagent. In a measurement system involving a liquid reagent containing reduced nicotinamide adenine dinucleotides, coenzyme nicotinamide adenine dinucleotides are decomposed by contaminants derived from the sample, and inaccurate measurement values are derived from the reaction of the measurement system. It can also be prevented. Furthermore, according to the present invention, a liquid reagent for measuring a physiologically active substance can accurately measure the target physiologically active substance without inhibiting the main enzyme reaction in the measurement system, and is stable and accurate for a long time. A liquid reagent capable of obtaining a measured value can be provided.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the results (time course) of a control test in an experiment showing the effect of EDTA · 2Na addition in GPT measurement performed in Example 1 of the present specification.
FIG. 2 is a graph showing the results (time course) of the present invention in an experiment showing the effect of addition of EDTA · 2Na in the GPT measurement performed in Example 1 of the present specification.
FIG. 3 is a graph showing the results (time course) of a control test in an experiment showing the effect of NTA addition in the LDH measurement performed in Example 2 of the present specification.
FIG. 4 is a graph showing the results (time course) of the present invention in an experiment showing the effect of NTA addition in the LDH measurement performed in Example 2 of the present specification.
FIG. 5 is a graph showing a result of confirming by HPLC that NMNH is generated in the reaction field of GPT measurement obtained in Reference Example 1 of the present specification.
FIG. 6 is a graph showing a time course when a contaminant-containing specimen is measured in the GPT measurement of Reference Example 1 of the present specification.
FIG. 7 is a graph showing a time course when a contaminant-free specimen is measured in the GPT measurement of Reference Example 1 of the present specification.

Claims (2)

A liquid reagent containing a reduced nicotinamide adenine dinucleotides, and analyte, pH value in the measurement system for under conditions of 7.5 to 11, characterized in that the coexistence of a chelating agent, reduced nicotinamide A method for preventing degradation of reduced nicotinamide adenine dinucleotides to reduced nicotinamide mononucleotides due to an interference action of a contaminant that degrades amide adenine dinucleotides to reduced nicotinamide mononucleotide.   A chelating agent containing a reduced nicotinamide adenine dinucleotide and a contaminant that decomposes the reduced nicotinamide adenine dinucleotide into reduced nicotinamide mononucleotide, and having a pH value of 7.5 to 11 A method for preventing degradation of the reduced nicotinamide adenine dinucleotides to reduced nicotinamide mononucleotide due to the interference action of the contaminant.

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